KR20210016511A - 입양 세포 요법 및 암 백신을 위한 종양 특이적 면역 세포를 대상체로부터 단리하는 방법 - Google Patents

입양 세포 요법 및 암 백신을 위한 종양 특이적 면역 세포를 대상체로부터 단리하는 방법 Download PDF

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기어 에스. 디제레가
홀리 마울하르트
마이클 발테조르
샘 캠벨
찰스 제이. 디시듀
윌리엄 존스턴
매튜 맥클로레이
제임스 베르코
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크리티테크, 인크.
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Abstract

악성 종양에 걸려 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터의 종양 특이적 면역 세포의 단리 방법, 및 입양 세포 요법 및 이러한 단리된 면역 세포의 입양 세포 요법 및 암 백신을 위한 용도가 개시된다.

Description

입양 세포 요법 및 암 백신을 위한 종양 특이적 면역 세포를 대상체로부터 단리하는 방법
본 발명은 일반적으로 암의 치료 및/또는 예방 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 생체내 종양 특이적 면역 세포의 생산을 유도하기 위해 악성 종양에 탁산 입자 조성물의 국소 투여 및 입양 세포 요법 및 암 백신을 위한 상기 세포의 분리에 관한 것이다.
매년 전세계적으로 수백만 명의 환자가 암 진단을 받고 있으며, 매년 수백만 명이 암 또는 암 관련 합병증으로 사망한다. 암의 위험은 나이가 들어가면서 크게 증가하고, 선진국에서 많은 암이 더 흔하게 발생하며, 세계적으로도 기대 수명의 증가에 따라 암 발병율이 증가하고 있다. 최신의 치료법에는 항종양제의 정맥내 주입 (Ⅳ) 주사와 같은 전신 치료가 포함된다. 그러나, 이러한 치료법은 일반적으로 전신 독성으로 인해 환자에게 원치 않는 유의한 부작용이 있으며, 항종양제는 일반적으로 체내 반감기가 짧기 때문에 종양 부위에 오래 머무르지 않는다.
관련 출원
본 출원은 2019년 3월 22일에 제출된 미국 가출원 일련 번호 62/822506; 2018년 3월 31일에 제출된 62/678470; 2018년 10월 3일에 제출된 62/740489; 및 2018년 12월 13일에 제출된 62/779327에 대한 우선권을 주장하며, 이들 각각은 전문이 본원에 참조문헌으로 통합된다.
본 발명의 일 양태에서, 본원에서는 악성 종양에 걸린 대상체로부터의 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 방법으로서, (a) 생체내에서 암 특이적 면역 세포의 생성을 유도하기 위해 종양에 탁산 입자를 포함하는 조성물을 하나 이상의 개별 투여로 국소적으로 투여하는 단계; 및 (b) 대상체의 혈액 및/또는 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하고, 이로써 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하고, 종양 특이적 면역 세포는 악성 종양에 대한 특이성을 갖는, 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 단리 단계 (b)는 투여 단계 (a) 이후 적어도 10일, 또는 적어도 28일째 발생한다. 일부 구현예에서, 단리 단계 (b)는 투여 단계 (a) 이후 60일 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 수지상 세포, CD45+ 세포, 림프구, 백혈구, 대식세포, M1 대식세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, 또는 자연 살상 (NK) 세포 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 악성 종양은 육종, 암종, 림프종, 고형 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 복강내 장기 종양, 뇌종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 피부 종양, 피부 전이, 림포이드, 위장 종양, 폐 종양, 골 종양, 흑색종, 망막모세포종 또는 신장 종양 또는 이들의 전이성 종양을 포함한다.
일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 대상체의 혈액으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 혈액으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 4% 내지 약 15%를 차지한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 3% 내지 약 10%를 차지한다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 면역 세포의 대조군 집단에서보다 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 더 큰 세포 집단 및 골수 유래된 억압인자 세포 (MDSC)의 더 작은 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포 집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 투여 단계 (a) 이전에 대상체의 혈액으로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체의 혈액으로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다. 다른 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체의 혈액으로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 (a)에서 조성물의 국소 투여는 2회 이상의 개별 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 1(a)에서 조성물의 국소 투여는 적어도 2주 동안 주 1회 투여의 2회 이상의 개별 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 1(a)에서 조성물의 국소 투여는 적어도 1주 동안 주 2회 투여의 2회 이상의 개별 투여를 포함하고, 여기서 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1일 간격을 둔다. 일부 구현예에서, 단리 단계 (b)는 단계 (a)에서 각각의 개별 투여 이후에 반복되고, 각각의 반복된 단리 단계로부터 획득되는 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 풀링된다.
일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 농축되고/거나, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 증식된다. 다른 구현예에서, 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되고/거나 또는 저장된다. 일부 구현예에서, 농축된 종양 특이적 면역 세포 집단의 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45+ 세포 및 M1 대식세포, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 생체외에서 변형된다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 변형되어 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하고, 변형 단계는 세포를 항체에 노출시키는 것, 세포를 펩티드에 노출시키는 것, 세포를 생물학적 반응 개질제에 노출시키는 것, 세포를 사이토카인 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 성장인자 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 항원에 노출시키는 것, 세포를 RNA 또는 소간섭 RNA에 노출시키는 것, 세포를 전체 세포 용출물과 공동배양하는 것, 세포를 인공 항원 제시 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 다른 유형의 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 유전적으로 조작하는 것, 세포의 유전자 전사를 상향조절하는 것, 세포의 유전자 전사를 하향조절하는 것, 렌티바이러스성 벡터를 세포 내로 형질감염시키는 것, 플라스미드 DNA를 세포 내로 형질감염시키는 것, mRNA를 세포 내로 핵형질감염시키는 것, 레트로바이러스성 벡터를 통해 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 유전자로 세포를 형질도입시키는 것, 및/또는 유전자 녹아웃 또는 CRISPR 방법에 의해 세포의 유전자를 유전적으로 불활성화하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되고/거나 저장된다.
일부 구현예에서, 국소 투여된 조성물의 탁산 입자는 0.1 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1.2 마이크론의 평균 입자 크기(수)를 갖는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 0.1 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1.2 마이크론의 평균 입자 크기(수)를 갖는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 적어도 18 m2/g, 20 m2/g, 25 m2/g, 30 m2/g, 32 m2/g, 34 m2/g 또는 35 m2/g; 또는 약 18 m2/g 내지 약 60 m2/g 또는 약 18 m2/g 내지 약 50 m2/g의 특이 표면적 (SSA)를 갖는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 0.05 g/cm3 내지 0.15 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)를 갖는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 단량체, 중합체 (또는 생체적합성 중합체), 단백질, 계면활성제 또는 알부민에 결합되거나, 이로 피막화되거나, 이로 코팅되지 않는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 단량체, 중합체 (또는 생체적합성 중합체), 단백질, 계면활성제 또는 알부민에 결합되거나, 이로 피막화되거나, 이로 코팅되지 않는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자, 도세탁셀 입자, 카바지탁셀 입자 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 국소 투여는 국소 투여, 폐 투여, 종양내 주사 투여, 복강내 주사 투여, 방광내 점적 투여 (방광), 또는 종양 주변의 조직 내로 직접 주사, 또는 이들의 조합에 의한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에서는 담체 및 단리된 종양 특이적 면역 세포, 농축된 종양 특이적 면역 세포, 증식된 종양 특이적 면역 세포, 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포 및/또는 상기 기술된 방법에 의해 획득된 개질된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 포함하는 세포 조성물이 개시된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에서는 악성 종양을 갖고 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단을 포함하는 세포 조성물로서, 대상체로부터 얻은 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 악성 종양 유형에 특이적인 세포 조성물이 개시된다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 면역 세포의 대조군 집단과 비교하여, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 농도가 증진된다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 면역 세포 집단은 탁산 입자를 포함하는 조성물을 종양에 국소 투여하기 이전에 대상체로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체으로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 4% 내지 약 15%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 3% 내지 약 10%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 면역 치료제 또는 체크 포인트 억제제와 같은 하나 이상의 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 동결된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에서는 암 또는 전이성 암에 걸린 대상체에서 암 또는 전이성 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 치료는 자가유래성 치료이다. 다른 구현예에서, 치료는 동종유래성 치료이다. 일부 구현예에서, 세포 조성물의 투여는 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합에 의한다. 일부 구현예에서, 암 또는 전이성 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에서는 본원에 개시된 세포 조성물을 포함하는, 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 백신이 개시된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본원에서는 대상체에서 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 방법으로서, 본원에 개시된 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 백신은 자가유래성 백신이다. 다른 구현예에서, 백신은 동종유래성 백신이다. 일부 구현예에서, 백신의 투여는 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합에 의한다. 일부 구현예에서, 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형이다.
또한, 본원에서는 다음의 구현예 1 내지 91이 개시된다.
구현예 1은 악성 종양에 걸린 대상체로부터의 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 방법으로서, (a) 생체내에서 암 특이적 면역 세포의 생성을 유도하기 위해 종양에 탁산 입자를 포함하는 조성물을 하나 이상의 개별 투여로 국소적으로 투여하는 단계; 및 (b) 대상체의 혈액 및/또는 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하고, 이로써 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하고, 종양 특이적 면역 세포는 악성 종양에 대한 특이성을 갖는, 방법이다.
구현예 2는 구현예 1의 방법으로서, 단리 단계 1(b)는 투여 단계 1(a) 이후 적어도 10일, 또는 적어도 28일째 발생하는, 방법이다.
구현예 3은 구현예 2의 방법으로서, 단리 단계 1(b)는 투여 단계 1(a) 이후 60일 이내에 발생하는, 방법이다.
구현예 4는 구현예 1 내지 3 중 어느 하나의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 수지상 세포, CD45+ 세포, 림프구, 백혈구, 대식세포, M1 대식세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, 또는 자연 살상 (NK) 세포 중 적어도 하나를 포함하는, 방법이다.
구현예 5는 구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 방법으로서, 악성 종양은 육종, 암종, 림프종, 고형 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 복강내 장기 종양, 뇌종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 피부 종양, 피부 전이, 림포이드, 위장 종양, 폐 종양, 골 종양, 흑색종, 망막모세포종 또는 신장 종양 또는 이들의 전이성 종양을 포함하는, 방법이다.
구현예 6은 구현예 1 내지 5 중 어느 하나의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 대상체의 혈액으로부터 단리되는, 방법이다.
구현예 7은 구현예 6의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 혈액으로부터 단리되는, 방법이다.
구현예 8은 구현예 6 또는 7의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법이다.
구현예 9는 구현예 8의 방법으로서, CD4+ T 세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 4% 내지 약 15%를 차지하는, 방법이다.
구현예 10은 구현예 8 또는 9의 방법으로서, CD8+ T 세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 3% 내지 약 10%를 차지하는, 방법이다.
구현예 11은 구현예 6 내지 10 중 어느 하나의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 면역 세포의 대조군 집단에서보다 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 더 큰 세포 집단 및 골수 유래된 억압인자 세포 (MDSC)의 더 작은 세포 집단을 포함하는, 방법이다.
구현예 12는 구현예 11의 방법으로서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포의 집단을 포함하는, 방법이다.
구현예 13은 구현예 11 또는 12의 방법으로서, 면역 세포의 대조군 집단은 투여 단계 1(a) 이전에 대상체의 혈액으로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 방법이다.
구현예 14는 구현예 11 또는 12의 방법으로서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체의 혈액으로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함하는, 방법이다.
구현예 15는 구현예 11 또는 12의 방법으로서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체의 혈액으로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함하는, 방법이다.
구현예 16은 구현예 1 내지 15 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 1(a)에서 조성물의 국소 투여는 2회 이상의 개별 투여를 포함하는, 방법이다.
구현예 17은 구현예 16의 방법으로서, 단계 1(a)에서 조성물의 국소 투여는 적어도 2주 동안 주 1회 투여의 2회 이상의 개별 투여를 포함하는, 방법이다.
구현예 18은 구현예 16의 방법으로서, 단계 1(a)에서 조성물의 국소 투여는 적어도 1주 동안 주 2회 투여의 2회 이상 개별 투여를 포함하고, 여기서 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1일 간격을 두는, 방법이다.
구현예 19는 구현예 1 내지 18 중 어느 하나의 방법으로서, 단리 단계 1(b)는 단계 1(a)에서 각각의 개별 투여 이후에 반복되고, 각각의 반복된 단리 단계로부터 획득되는 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 풀링되는, 방법이다.
구현예 20은 구현예 1 내지 19 중 어느 하나의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 농축되고/거나, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 증식되는, 방법이다.
구현예 21은 구현예 1 내지 20 중 어느 하나의 방법으로서, 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되는, 방법이다.
구현예 22는 구현예 1 내지 21 중 어느 하나의 방법으로서, 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 저장되는, 방법이다.
구현예 23은 구현예 1 내지 22 중 어느 하나의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축되고, 농축된 종양 특이적 면역 세포 집단의 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45+ 세포 및 M1 대식세포, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법이다.
구현예 24는 구현예 1 내지 23 중 어느 하나의 방법으로서, 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 생체외에서 변형되는, 방법이다.
구현예 25는 구현예 24의 방법으로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 변형되어 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하고, 변형 단계는 세포를 항체에 노출시키는 것, 세포를 펩티드에 노출시키는 것, 세포를 생물학적 반응 개질제에 노출시키는 것, 세포를 사이토카인 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 성장인자 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 항원에 노출시키는 것, 세포를 RNA 또는 소간섭 RNA에 노출시키는 것, 세포를 전체 세포 용출물과 공동배양하는 것, 세포를 인공 항원 제시 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 다른 유형의 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 유전적으로 조작하는 것, 세포의 유전자 전사를 상향조절하는 것, 세포의 유전자 전사를 하향조절하는 것, 렌티바이러스성 벡터를 세포 내로 형질감염시키는 것, 플라스미드 DNA를 세포 내로 형질감염시키는 것, mRNA를 세포 내로 핵형질감염시키는 것, 레트로바이러스성 벡터를 통해 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 유전자로 세포를 형질도입시키는 것, 및/또는 유전자 녹아웃 또는 CRISPR 방법에 의해 세포의 유전자를 유전적으로 불활성화하는 것을 포함하는, 방법이다.
구현예 26은 구현예 24 또는 25의 방법으로서, 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되는, 방법이다.
구현예 27은 구현예 24 내지 26 중 어느 하나의 방법으로서, 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 저장되는, 방법이다.
구현예 28은 구현예 1 내지 27 중 어느 하나의 방법으로서, 탁산 입자는 0.1 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1.2 마이크론의 평균 입자 크기(수)를 갖는, 방법이다.
구현예 29는 구현예 1 내지 28 중 어느 하나의 방법으로서, 탁산 입자는 탁산을 적어도 95% 포함하는, 방법이다.
구현예 30은 구현예 1 내지 29 중 어느 하나의 방법으로서, 탁산 입자는 적어도 18 m2/g, 20 m2/g, 25 m2/g, 30 m2/g, 32 m2/g, 34 m2/g 또는 35 m2/g; 또는 약 18 m2/g 내지 약 60 m2/g 또는 약 18 m2/g 내지 약 50 m2/g의 특이 표면적 (SSA)를 갖는, 방법이다.
구현예 31은 구현예 1 내지 30 중 어느 하나의 방법으로서, 탁산 입자는 0.05 g/cm3 내지 0.15 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)를 갖는, 방법이다.
구현예 32는 구현예 1 내지 31 중 어느 하나의 방법으로서, 탁산 입자가 단량체, 중합체 (또는 생체적합성 중합체), 단백질, 계면활성제 또는 알부민에 결합되거나, 이로 피막화되거나, 이로 코팅되지 않는, 방법이다.
구현예 33은 탁산 입자가 결정질 형태인, 구현예 1 내지 32 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 34는 탁산 입자가 파클리탁셀 입자, 도세탁셀 입자, 카바지탁셀 입자 또는 이들의 조합을 포함하는, 구현예 1 또는 33 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 35는 탁산 입자가 파클리탁셀 입자를 포함하는, 구현예 34의 방법이다.
구현예 36은 탁산 입자가 도세탁셀 입자인, 구현예 34의 방법이다.
구현예 37은 구현예 1 내지 36 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물의 국소 투여는 국소 투여, 폐 투여, 종양내 주사 투여, 복강내 주사 투여, 방광내 점적 투여 (방광), 또는 종양 주변의 조직 내로 직접 주사, 또는 이들의 조합에 의하는, 방법이다.
구현예 38은 구현예 37의 방법으로서, 조성물의 국소 투여는 조성물이 대상체의 환부에 국부적으로 적용되는 국부 투여이고, 종양은 피부 악성 종양인, 방법이다.
구현예 39는 피부 악성 종양이 피부암을 포함하는, 구현예 38의 방법이다.
구현예 40은 피부암은 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 또는 카포시 육종인, 구현예 39의 방법이다.
구현예 41은 피부 악성 종양이 피부 전이를 포함하는, 구현예 39의 방법이다.
구현예 42는 구현예 41의 방법으로서, 피부 전이가 폐암, 유방암, 결장암, 구강암, 난소암, 신장암, 식도암, 위암, 간암 및/또는 카포시 육종으로부터 나오는, 방법이다.
구현예 43은 구현예 38 내지 42 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물은 액체 또는 반-고체 담체를 추가로 포함하고, 탁산 입자는 담체에 분산되어 있는, 방법이다.
구현예 44는 조성물이 무수성 및 소수성인, 구현예 43의 방법이다.
구현예 45는 조성물이 탄화수소를 포함하는, 구현예 44의 방법이다.
구현예 46은 구현예 45의 방법으로서, 탄화수소는 바셀린, 미네랄 오일 또는 파라핀 왁스, 또는 이들의 혼합물인, 방법이다.
구현예 47은 구현예 44 내지 46 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물은 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체를 추가로 포함하는, 방법이다.
구현예 48은 구현예 47의 방법으로서, 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체의 농도는 조성물의 5 내지 24 중량%인, 방법이다.
구현예 49는 휘발성 실리콘 유체가 사이클로메티콘인, 구현예 4 또는 48의 방법이다.
구현예 50은 사이클로메티콘이 사이클로펜타실록산인, 구현예 49의 방법이다.
구현예 51은 구현예 43 내지 50 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물은 휘발성 C1-C4 지방족 알코올을 함유하지 않고/거나, 추가적인 침투 증강제를 함유하지 않고/거나, 추가적인 휘발성 용매를 함유하지 않고/거나, 계면활성제를 함유하지 않고/거나, 단백질을 함유하지 않고/거나, 알부민을 함유하지 않는, 방법이다.
구현예 52는 구현예 38 내지 51 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물에서 탁산 입자의 농도는 약 0.1 내지 약 5 중량%인, 방법이다.
구현예 53은 구현예 37의 방법으로서, 국소 투여는 조성물이 흡입되는 폐 투여에 의하고, 종양은 폐 종양인, 방법이다.
구현예 54는 구현예 53의 방법으로서, 폐 투여는 분무화를 포함하고, 분무화는 조성물의 에어로졸 비말의 폐 전달을 유도하는, 방법이다.
구현예 55는 구현예 54의 방법으로서, 에어로졸 비말은 약 0.5 μm 내지 약 6 μm 직경, 또는 약 1 μm 내지 약 3 μm 직경, 또는 약 2 μm 내지 약 3 μm 직경의 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD)을 갖는, 방법이다.
구현예 56은 구현예 37의 방법으로서, 국소 투여는 조성물이 종양 내로 직접 주사되는 종양내 주사 투여에 의하는, 방법이다.
구현예 57은 구현예 56의 방법으로서, 종양은 육종, 암종, 림프종, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 뇌종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 피부 종양, 피부 전이, 림포이드, 위장 종양 및/또는 신장 종양인, 방법이다.
구현예 58은 구현예 37의 방법으로서, 국소 투여는 조성물이 복강 내로 주사되는 복강내 주사 투여에 의하고, 종양은 복강내 장기 종양인, 방법이다.
구현예 59는 복강내 장기 종양이 난소 종양인, 구현예 58의 방법이다.
구현예 60은 구현예 37의 방법으로서, 국소 투여는 조성물이 방광 내로 점적주입되는 방광내 점적 투여 (방광)에 의하는, 방법이다.
구현예 61은 구현예 53 내지 60 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물은 액체 담체를 추가로 포함하고, 탁산 입자는 담체에 분산되어 있는, 방법이다.
구현예 62는 액체 담체가 수용성 담체인, 구현예 61의 방법이다.
구현예 63은 수용성 담체가 0.9% 식염수 용액인, 구현예 62의 방법이다.
구현예 64는 수용성 담체가 계면활성제를 포함하는, 구현예 62 또는 63의 방법이다.
구현예 65는 계면활성제가 폴리소르베이트인, 구현예 64의 방법이다.
구현예 66은 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80이고, 폴리소르베이트 80은 약 0.01 부피% 내지 약 1 부피%의 농도로 수용성 담체에 존재하는, 구현예 65의 방법이다.
구현예 67은 구현예 53 내지 66 중 어느 하나의 방법으로서, 조성물 중 탁산 입자의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 또는 약 6 mg/mL 내지 약 20 mg/mL인, 방법이다.
구현예 68은 담체 및 구현예 1 내지 67 중 어느 하나의 방법에 의해 획득되는 단리된 종양 특이적 면역 세포, 농축된 종양 특이적 면역 세포, 증식된 종양 특이적 면역 세포, 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포 및/또는 개질된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 포함하는 세포 조성물이다.
구현예 69는 악성 종양을 갖고 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단을 포함하는 세포 조성물로서, 대상체로부터 얻은 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 악성 종양 유형에 특이적인, 세포 조성물이다.
구현예 70은 구현예 69의 세포 조성물로서, 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 면역 세포의 대조군 집단과 비교하여, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 농도가 증진되는, 세포 조성물이다.
구현예 71은 구현예 70의 세포 조성물로서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포의 집단을 포함하는, 세포 조성물이다.
구현예 72는 구현예 70 또는 71의 세포 조성물로서, 대조군 면역 세포 집단은 탁산 입자를 포함하는 조성물을 종양에 국소 투여하기 이전에 대상체로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 세포 조성물이다.
구현예 73은 구현예 70 또는 71의 세포 조성물로서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 세포 조성물이다.
구현예 74는 구현예 70 또는 71의 세포 조성물로서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 세포 조성물이다.
구현예 75는 구현예 69 내지 74 중 어느 하나의 세포 조성물로서, 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 4% 내지 약 15%의 CD4+ T 세포를 포함하는, 세포 조성물이다.
구현예 76은 구현예 69 내지 75 중 어느 하나의 세포 조성물로서, 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 3% 내지 약 10%의 CD8+ T 세포를 포함하는, 세포 조성물이다.
구현예 77은 담체를 추가로 포함하는 구현예 69 내지 76 중 어느 하나의 세포 조성물이다.
구현예 78은 하나 이상의 치료제를 추가로 포함하는 구현예 69 내지 77 중 어느 하나의 세포 조성물이다.
구현예 79는 치료제가 면역치료제 또는 체크포인트 저해제인, 구현예 78의 방법이다.
구현예 80은 세포 조성물이 동결되는 구현예 69 내지 79 중 어느 하나의 세포 조성물이다.
구현예 81은 암 또는 전이성 암에 걸린 대상체에서 암 또는 전이성 암을 치료하는 방법으로서, 구현예 68 내지 80 중 어느 하나의 세포 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 82는 치료가 자가유래성 치료인, 구현예 81의 방법이다.
구현예 83은 치료가 동종유래성 치료인, 구현예 81의 방법이다.
구현예 84는 구현예 81 내지 83 중 어느 하나의 방법으로서, 세포 조성물의 투여는 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합에 의하는, 방법이다.
구현예 85는 구현예 81 내지 84 중 어느 하나의 방법으로서, 암 또는 전이성 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형인, 방법이다.
구현예 86은 구현예 68 내지 80 중 어느 하나의 세포 조성물을 포함하는, 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 백신이다.
구현예 87은 대상체에서 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 방법으로서, 구현예 86의 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이다.
구현예 88은 백신이 자가유래성 백신인, 구현예 87의 방법이다.
구현예 89는 백신이 동종유래성 백신인, 구현예 87의 방법이다.
구현예 90은 구현예 86 내지 89 중 어느 하나의 방법으로서, 백신의 투여는 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합에 의하는, 방법이다.
구현예 91은 구현예 87 내지 90 중 어느 하나의 방법으로서, 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형인, 방법이다.
본원에 사용된 용어 "악성 종양"은 보통 낭종 또는 약체 영역을 포함하지 않고, 세포가 분열해야 하는 것보다 많이 분열할 때 발생하거나, 죽어야 할 때 죽지 않는 하나 이상의 비정상 조직 덩어리를 의미한다.
면역 세포와 관련하여 본원에 사용되는 용어 "종양 특이적"은 하나 이상의 특이적인 악성 종양 항원을 식별하는 면역 세포를 의미한다. 종양 특이적 면역 세포는 특이적 악성 종양의 환경과 직접 또는 간접 접촉한 이후에 변화를 겪고, 이는 면역 세포가 물질을 만들거나 생산하거나, 그렇지 않으면 불가능한 구조적 변화를 겪도록 하는 면역 세포이다. 종양 특이적 면역 세포가 활성화되어 특이적 종양 세포를 공격하고, 이로써 종양 특이적 활성을 갖는다. 예를 들어, 신장 종양의 환경과 접촉한 면역 세포가 활성화되어 신장 종양 세포를 공격할 것이고, 방광 종양의 환경과 접촉한 면역 세포가 활성화되어 방광 종양 세포를 공격할 것이다.
본원에 사용된 용어 "소수성"은 실온에서 물에 10 mg/mL 이하의 용해도를 갖는 화합물, 조성물 또는 담체를 기술한다.
본원에 사용된 용어 "휘발성"은 실온에서 10 Pa 이상의 증기압을 갖는 화합물, 조성물 또는 담체를 기술한다.
본원에 사용된 용어 "비-휘발성"은 실온에서 10 Pa 미만의 증기압을 갖는 화합물, 조성물 또는 담체를 기술한다.
본 발명의 조성물 또는 담체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "무수"는 3 부피% 미만, 2 부피% 미만, 1 부피% 미만, 또는 0 부피%의 물이 조성물 또는 담체에 존재하는 것을 의미한다. 이것은 소량의 물 (예를 들어, 조성물 또는 담체의 임의의 성분에 내재적으로 함유된 물, 대기로부터 수축된 물 등)이 존재하는 것을 설명할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "피부" 또는 "피부"는 표피 및/또는 진피를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "피부 종양"은 양성 피부 종양 및 악성 피부 종양을 포함하는 고형 종양을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "피부 악성 종양" 또는 "악성 피부 종양"은 피부암 및 피부 전이를 포함하는 암성 피부 종양을 포함하는 고형 종양을 의미한다.
피부 종양 또는 피부 악성 종양의 "환부"는 본원에 사용된 바, 피부 종양 또는 피부 악성 종양이 피부의 최외곽 표면 또는 피부 표면 바로 아래에 보이는 피부의 적어도 일부 (상피/진피를 포함함)를 의미하고, 가시적으로 검출가능하지 않은 전임상 병변을 포함할 수 있는 피부 종양 또는 피부 악성 종양에 근접한 피부 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "피부 (피부) 전이" 또는 "피부 (피부) 전이" (복수형)는 암 종양의 원발성 성장으로부터 나온 신체의 또 다른 위치에서의 이차적 성장 (악성 종양)으로서 피부의 악성 종양의 소견을 의미한다. 원발성 종양으로부터의 확산은 림프계 또는 혈액 순환계를 통하거나 다른 수단을 통해 이루어질 수 있다.
암의 치료 및/또는 종양의 치료와 관련하여 본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료하는" 또는 "치료"는 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 의미한다: (a) 종양 크기를 감소시키는 것; (b) 종양 성장을 감소시키는 것; (c) 종양을 제거하는 것; (d) 전이의 발달 및/또는 확산을 감소시키거나, 제한하거나, 전이를 제거하는 것; (e) 암의 부분적 또는 완전한 완화를 획득하는 것.
본원에 사용된 용어 "대상체" 또는 "환자"는 척추동물을 의미한다. 일부 구현예에서, 척추 동물은 포유동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 포유동물은 인간을 비롯한 영장류일 수 있다.
용어 "실온" (RT)은 본원에 사용된 바와 같이, 15 내지 30℃또는 20 내지 25℃를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "침투 증강제" 또는 "피부 침투 증강제"는 피부 (표피 및 진피) 내로의 약물 흡수를 촉진시키는 화합물 또는 물질 또는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "계면활성제"또는 "표면 활성제"는 물의 표면 장력을 낮추거나 두 개의 비혼화성 물질 사이의 계면 장력을 감소시키는 능력을 나타내는 화합물 또는 물질 또는 물질을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 달리 문맥상 명백하게 진술되지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "및"은 달리 명시적으로 진술되지 않는 한 "또는"과 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 언급된 측정 단위의 +/- 5% (5%)를 의미한다.
본 출원에 대해, 하나 이상의 소수 이하 자릿수를 갖는 수치는 표준 반올림 지침을 사용하여 가장 근접한 정수로 반올림될 수 있고, 즉 반올림되는 숫자가 5, 6, 7, 8, 또는 9인 경우 반올림되고; 반올림되는 숫자가 0, 1, 2, 3, 또는 4인 경우 반내림된다. 예를 들어, 3.7은 4로 반올림될 수 있다.
달리 문맥상 명백하게 요구되지 않는 한, 상세한 설명 및 청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함한다", "포함하는" 등은 배타적 또는 철저한 관점과는 상반되는 포괄적인 또는 개방형 관점인 것으로; 다시 말해서, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 관점으로 해석되어야 한다. 단수형 또는 복수형 수를 사용하는 단어는 또한 각각 복수형 및 단수형 수를 포함한다. 또한, 본 출원에서 사용될 때, "본원에서(여기서)", "상기" 및 "하기"의 단어, 및 유사한 의미의 단어는, 본 출원의 임의의 특정한 부분이 아닌 전체로서의 본 출원을 말할 것이다. 상기 조성물 및 이의 사용 방법은 본 명세서 전반에 걸쳐 개시된 임의의 성분 또는 단계를 "포함"하거나, "이로 필수적으로 구성"되거나, "구성"될 수 있다.
본 명세서에 논의된 임의의 구현예는 본 발명의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 또한 역으로도 실행될 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물을 사용하여 본 발명의 방법을 달성할 수 있다.
본 발명의 구현예의 설명은 철저하거나, 개시된 정확한 형태로 본 발명을 제한하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 구체적인 구현예 및 이에 대한 실시예가 본원에 설명할 목적으로 기재되어 있지만, 당업자가 인식할 바와 같이 본 발명의 범주 내에서 다양한 등가의 변형이 가능하다.
본원에서는 악성 종양에 걸린 대상체로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 방법이 개시된다. 본 방법은 (a) 생체내에서 대상체의 종양 특이적 면역 세포의 생산을 유도하기 위해 종양에 탁산 입자를 포함하는 조성물을 하나 이상의 개별 투여로 국소적으로 투여하는 단계; 및 (b) 대상체의 혈액 및/또는 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하고, 이로써 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 특이적 면역 세포는 악성 종양에 대한 특이성을 갖는다.
본 발명자들은 대상체의 악성 종양에 탁산 입자를 포함하는 조성물을 국소 투여 (예를 들어, 국소 투여, 폐 투여, 종양내 주사 투여, 복강내 주사 투여, 방광내 점적 투여)하는 것이 대상체의 내인성 면역계를 자극하고, (1) 생체내 면역 세포의 생산, 및 (2) 이러한 면역 세포의 혈액계 내로 및 종양 부위 주변으로 침투를 유도하는 것을 발견하였다. 하기 실시예 10에 개시된 연구는 이들 면역 세포가 대상체의 악성 종양 유형에 대해 종양 특이적인 것을 보여주었다. 따라서, 이러한 종양 특이적 면역 세포를 대상체의 혈액 및/또는 종양 조직으로부터 단리함으로써, 이들은 입양 세포 요법으로서 이를 다시 대상체 또는 동일한 유형의 악성 종양에 걸린 환자에게 투여함으로써 특정한 유형의 악성 종양의 치료에 유용하다. 또한, 이러한 종양 특이적 면역 세포는 특정한 유형의 악성 종양의 발생 또는 재발을 방지할 백신에 유용하다. 종양 특이적 면역 세포는 수지상 세포, CD45+ 세포, 대식세포, M1 대식세포, 림프구, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, 또는 자연 살상 (NK) 세포 중 적어도 하나를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 면역 세포의 대조군 집단과 비교하여, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 농도가 증진된다.
임의의 특정한 메카니즘에 제한되지 않고, 이러한 효과는 예를 들어 림프구가 Ⅳ 화학요법의 부가된 관련 독성 없이도 악성 종양에 대한 선천적 뿐만 아니라 적응적 면역학적 반응 둘 다를 활성화하기에 충분한 시간을 제공하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어 임의의 특정한 메커니즘에 제한되지 않고, 탁산 입자의 국소 투여에 의한 국소 종양 세포 살상은 항원 제시 세포에 의해 식별되는 종양 세포 항원을 방출한다. 이어서, 활성화된 항원 제시 세포는 환자의 혈관계 전체에 걸쳐 순환하는 T 세포, B 세포 및 다른 종양 살상 세포에 종양 특이적 항원을 제시할 뿐만 아니라 종양을 포함하는 조직에 진입할 수 있다. 따라서, 탁산 입자는 대상체의 면역 반응을 자극하고 생체내에서 종양 특이적 면역 세포의 생성을 증진시키는 아쥬반트로서 작용한다. 탁산의 국소 농도는 장기간 (예를 들어, 적어도 10일 또는 적어도 28일) 동안 종양 부위에서 상승된 상태로 유지되며, 이는 종양이 국소 종양 세포를 죽이기 위해 탁산에 노출될 수 있는 충분한 시간을 제공한다. 탁산 입자의 국소 투여에 의한 면역계의 이러한 자극은 환자의 순환 혈액에서 수반되는 높은 수준의 탁산을 생성하지 않고도 발생한다. 따라서, 입자 탁산의 국소 투여는 림프구와 같은 백혈구 수의 감소를 포함하는 골수에서의 조혈 작용을 감소시키지 않는다. 골수 억제는 Ⅳ가 주어질 때 순환하는 탁산의 높은 농도로 인해 탁산의 공통적인 부작용이다.
임의의 특정한 메커니즘에 제한되지 않고, 본원에 개시된 방법은 항원 제시 세포의 한 유형인 수지상 세포의 활성화를 통해 국소의 면역학적 반응을 자극하기 위해 장기간 동안 충분한 탁산 농도를 생성할 수 있다. 수지상 세포의 활성화는 이들이 풍부하게 발견되는 피부 또는 폐에서 가장 현저하게 발생할 수 있다. 예를 들어, 피부 종양에 탁산 입자의 국소 투여는 탁산의 종양 세포 내로의 진입을 야기하여, 분열 주기 동안 이들을 죽이고 면역 인식에 더욱 접근 가능하게 한다. 이 영역에서 수지상 세포는 종양 항원에 대한 접근 증가에 의해 활성화될 것이고, 후속적으로 림프구에 항원을 제공할 것이다. 다음으로 림프구는 환자의 전신을 순환하여 종양 세포의 세포 표면 항원에 특이적인 체액 매개인자를 생성한다.
본원에서는 악성 종양을 갖고 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단을 포함하는, 입양 세포 요법 및 백신용 세포 조성물로서, 대상체로부터 획득된 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 악성 종양 유형에 특이적인, 세포 조성물이 개시된다. 이들 세포 조성물 및 백신을 사용하는 방법도 본원에 개시되어 있다.
I. 대상체로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 방법
본원에서는 악성 종양에 걸린 대상체로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 방법이 개시된다. 본 방법은 (a) 생체내에서 대상체의 종양 특이적 면역 세포의 생산을 유도하기 위해 종양에 탁산 입자를 포함하는 조성물을 하나 이상의 개별 투여로 국소적으로 투여하는 단계; 및 (b) 대상체의 혈액 및/또는 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하고, 이로써 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 종양 특이적 면역 세포는 악성 종양에 대한 특이성을 갖는다.
단계 (a)에서 조성물의 국소 투여는 1회 이상 또는 2회 이상의 개별 투여로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 14일째 또는 적어도 이들 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 2 내지 12주, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 12, 3 내지 11, 3 내지 10, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 12, 4 내지 11, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 12, 5 내지 11, 5 내지 10, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 11, 6 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 6 내지 7, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 8 내지 9, 9 내지 12, 9 내지 11, 9 내지 10, 10 내지 12, 10 내지 11, 11 내지 12, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 5, 3 내지 4, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상의 개별 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 적어도 2주 동안 주 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1주 동안 주 2회 투여되고, 여기서 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1일 간격을 둔다. 일부 구현예에서, 방법은 종양의 제거 (박멸)를 유도한다. 일부 구현예에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 이상의 개별 투여로 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 7회 이상의 개별 투여로 투여된다.
단리 단계 (b)는 투여 단계 (a) 이후 종양 특이적 세포가 대상체에서 생체내에서 생성되기에 충분한 시간에 발생할 수 있으며, 이는 투여 단계 이후 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56일째 또는 그 이상일 수 있다. 하나 이상의 투여 단계가 투여될 때, 단리 단계는 투여 단계 중 어느 하나 이후에 발생할 수 있거나, 최종 투여 단계 이후에 발생할 수 있다. 일부 구현예에서, 단리 단계는 투여 단계 또는 최종 투여 단계 이후 30일, 35일, 40일, 45일, 50일, 55일, 60일, 65일, 70일, 75일, 80일, 85일, 90일, 95일, 100일, 105일, 110일, 115일 이내 또는 120일 이내에 발생한다. 일부 구현예에서, 단리 단계는 각각의 개별 투여 단계 이후에 반복되고, 각각의 반복된 단리 단계로부터 얻은 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 풀링될 수 있다.
악성 종양은 육종, 암종, 림프종, 고형 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 복강내 장기 종양, 뇌종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 피부 종양, 피부 전이, 림포이드, 위장 종양, 폐 종양, 골 종양, 흑색종, 망막모세포종 또는 신장 종양 또는 이들의 전이성 종양일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 수지상 세포, CD45+ 세포, 림프구, 백혈구, 대식세포, M1 대식세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및/또는 자연 살상 (NK) 세포 중 적어도 하나를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 대상체의 혈액으로부터 단리된다. 면역 세포는 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법 및 기법에 의해 혈액으로부터 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 혈액으로부터 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 4% 내지 약 15%를 차지한다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 25%, 또는 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 15%, 또는 약 4% 내지 약 50%, 또는 약 4% 내지 약 40%, 또는 약 4% 내지 약 30%, 또는 약 4% 내지 약 25%, 또는 약 4% 내지 약 20%, 또는 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%, 또는 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 10% 내지 약 15%를 차지한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 3% 내지 약 10%를 차지한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포는 약 1% 내지 약 50%, 또는 약 1% 내지 약 40%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 25%, 또는 약 1% 내지 약 20%, 또는 약 1% 내지 약 15%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 3% 내지 약 50%, 또는 약 3% 내지 약 40%, 또는 약 3% 내지 약 30%, 또는 약 3% 내지 약 25%, 또는 약 3% 내지 약 20%, 또는 약 3% 내지 약 15%, 또는 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%, 또는 약 10% 내지 약 30%, 또는 약 10% 내지 약 25%, 또는 약 10% 내지 약 20%, 또는 약 10% 내지 약 15%를 차지한다. 일부 구현예에서, 혈액으로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 면역 세포의 대조군 집단에서보다 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 더 큰 세포 집단 및 골수 유래된 억압인자 세포 (MDSC)의 더 작은 세포 집단을 포함한다. 하기 실시예 10에 개시된 연구는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 유의한 증가, 그리고 유세포 분석에 의해 확인되는 바와 같이 혈액에서 채취된 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단 대 대조군 면역 세포 집단에서 MDSC를 감소시키는 추세를 보여준다. 면역 세포의 대조군 집단은 투여 단계 이전에 대상체의 혈액으로부터 분리되거나; 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체의 혈액으로부터 분리되거나; 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체의 혈액에서 분리된다. 일부 구현예에서, 대조군 면역 세포 집단은 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포를 포함하거나, 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 분리된다. 면역 세포는 조직을 외과적으로 제거하고 제거된 조직으로부터 세포를 분리하는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법 및 기법에 의해 조직으로부터 단리될 수 있다. 수술 기법에는 생검이 포함될 수 있다. 세포는 당업자에게 공지된 방법 및 기법에 의해 외과적으로 제거된 조직으로부터 분리될 수 있으며, 이의 예는 세포 현탁액 기법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 분리되는 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 M1 대식세포를 포함한다. 일부 구현예에서, M1 대식세포는 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 20% 내지 약 40%를 차지한다.
단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 농축되고/거나, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 증식될 수 있다. 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되고/거나, 저장될 수 있다. 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축될 수 있고, 여기서 농축된 종양 특이적 면역 세포 집단의 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45+ 세포 및 M1 대식세포, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 생체외에서 변형될 수 있다. 변형 방법은 세포를 항체에 노출시키는 것, 세포를 펩티드에 노출시키는 것, 세포를 생물학적 반응 개질제에 노출시키는 것, 세포를 사이토카인 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 성장인자 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 항원에 노출시키는 것, 세포를 RNA 또는 소간섭 RNA에 노출시키는 것, 세포를 전체 세포 용출물과 공동배양하는 것, 세포를 인공 항원 제시 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 다른 유형의 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 유전적으로 조작하는 것, 세포의 유전자 전사를 상향조절하는 것, 세포의 유전자 전사를 하향조절하는 것, 렌티바이러스성 벡터를 세포 내로 형질감염시키는 것, 플라스미드 DNA를 세포 내로 형질감염시키는 것, mRNA를 세포 내로 핵형질감염시키는 것, 레트로바이러스성 벡터를 통해 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 유전자로 세포를 형질도입시키는 것, 및/또는 유전자 녹아웃 또는 CRISPR 방법에 의해 세포의 유전자를 유전적으로 불활성화하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되고/거나 저장된다.
Ⅱ. 세포 조성물, 암 백신 및 이의 사용 방법
본원에서는 본원에 개시된 바와 같이 악성 종양에 걸린 대상체로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 임의의 방법에 의해 획득되는 단리된 종양 특이적 면역 세포, 농축된 종양 특이적 면역 세포, 증식된 종양 특이적 면역 세포, 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포 및/또는 개질된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 포함하는 세포 조성물이 개시된다.
또한, 본원에서는 악성 종양에 걸리고, 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단을 포함하는 세포 조성물로서, 대상체로부터 얻은 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 악성 종양 유형에 특이적인, 세포 조성물이 개시된다.
세포 조성물은 담체를 추가로 포함할 수 있다. 세포 조성물은 세포 현탁액일 수 있다. 담체는 액체 (유체) 담체, 예컨대 수용성 담체일 수 있다. 적합한 수용성 담체의 비제한적인 예는 주사 USP용 멸균수와 같은 물; 주사 USP용 0.9% 염화나트륨과 같은 0.9% 식염수 용액 (정상 식염수); 주사 USP용 5% 덱스트로스와 같은 덱스트로스 용액; 및 주사 USP용 락토스 첨가한 링거액을 포함한다. 비-수용성계 액체 담체 및 다른 수용성계 액체 담체가 사용될 수 있다. 담체는 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 주사, 주입 또는 다른 투여 경로에 의해 대상체에게 투여하기에 적합한 것일 수 있다. 담체는 임의의 다른 유형의 액체, 예컨대 에멀젼 또는 유동성 반-고체일 수 있다. 유동성 반-고체의 비제한적인 예는 겔 및 열경화성 겔을 포함한다. 담체를 포함하는 세포 조성물은 예컨대 주입 투여를 위해, 희석제로 추가로 희석될 수있다. 적합한 희석제는 수용성 유체와 같은 유체일 수 있다. 적합한 수용성 희석제의 비제한적인 예는 주사 USP용 멸균수와 같은 물; 주사 USP용 0.9% 염화나트륨과 같은 0.9% 식염수 용액 (정상 식염수); 주사 USP용 5% 덱스트로스와 같은 덱스트로스 용액; 및 주사 USP용 락토스 첨가한 링거액을 포함한다. 주사, 주입 또는 다른 투여 경로에 의해 투여하는데 적합한 다른 액체 및 수용성계 희석제가 사용될 수 있고, 선택적으로 염, 완충제 및/또는 다른 부형제를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 희석제는 멸균된다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 무균이다. 일부 구현예에서, 운반체는 자연에서 발견되는 물질로만 구성되지 않는다. 일부 구현예에서, 담체는 혈액이 아니다.
세포 조성물은 악성 종양에 걸리고, 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 면역 세포의 대조군 집단과 비교하여 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 농도가 증진된다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포의 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 대조군 면역 세포 집단은 탁산 입자를 포함하는 조성물을 종양에 국소 투여하기 이전에 대상체로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체으로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 대조군 집단은 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체로부터 단리된 면역 세포 집단을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 4% 내지 약 15%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 3% 내지 약 10%의 CD8+ T 세포를 포함한다.
세포 조성물은 면역치료제 또는 체크포인트 저해제를 포함하나 이에 한정되지 않는 하나 이상의 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 세포 조성물은 암 및 전이성 암의 치료를 위한 입양 세포 요법에 사용될 수 있다. 본원에서는 암 또는 전이성 암에 걸린 대상체에서 암 또는 전이성 암을 치료하는 방법으로서, 대상체에게 본원에 기재된 세포 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 치료는 자가유래성 치료이다. 다른 구현예에서, 치료는 동종유래성 치료이다. 세포 조성물은 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는 방법에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 또는 전이성 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형이다.
본원에서는 본원에 개시된 세포 조성물 중 임의의 하나를 포함하는, 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 백신이 개시된다.
본원에서는 대상체에서 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 방법으로서, 본원에 개시된 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 개시된다. 일부 구현예에서, 백신은 자가유래성 백신이다. 다른 구현예에서, 백신은 동종유래성 백신이다. 백신은 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 암 또는 전이성 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형이다. 일부 구현예에서, 암은 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형이다.
Ⅲ. 탁산 입자
탁산은 일반적으로 실온에서 물에 10 mg/mL 이하의 용해도를 갖는 난용성 화합물이다. 탁산은 항종양제 및 화학치료제로서 널리 사용된다. 본원에 사용된 용어 "탁산"은 파클리탁셀 (I), 도세탁셀 (Ⅱ), 카바지탁셀 (Ⅲ) 및 임의의 다른 탁산 또는 탁산 유도체를 포함하며, 이의 비제한적인 예는 탁솔 B (세팔로만닌), 탁솔 C, 탁솔 D, 탁솔 E, 탁솔 F, 탁솔 G, 탁사디엔, 박카틴 Ⅲ, 10-탈아세틸박카틴, 탁스키닌 A, 브레비폴리올 및 탁수스핀 D이며, 또한 탁산의 약제학적으로 허용가능한 염도 포함한다.
(I) 파클리탁셀
Figure pct00001
(Ⅱ) 도세탁셀
Figure pct00002
(Ⅲ) 카바지탁셀
Figure pct00003
파클리탁셀 및 도세탁셀 활성 약제학적 성분 (API)은 Phyton Biotech LLC (캐나다 밴쿠버 소재)로부터 시판되어 입수가능하다. 도세탁셀 API는 무수, 무-용매를 기준으로 하여 계산된 90% 이상 또는 95% 이상, 또는 97.5% 이상의 도세탁셀을 함유한다. 파클리탁셀 API는 무수, 무-용매 기준으로 계산된 90% 이상, 또는 95% 이상, 또는 97% 이상의 파클리탁셀을 함유한다. 일부 구현예에서, 파클리탁셀 API 및 도세탁셀 API는 USP 및/또는 EP 등급이다. 파클리탁셀 API는 반합성 화학 공정 또는 천연 공급원 예컨대 식물 세포 발효 또는 추출로부터 제조될 수 있다. 파클리탁셀은 때로 상표명 TAXOL®로 지칭되기도 하지만, 이것은 TAXOL®이 정맥내 주입 전에 적합한 비경구 유체로 희석하기 위한 폴리옥시에틸화된 피마자유 및 에탄올 중의 파클리탁셀 용액의 상표명이기 때문에 잘못된 명칭이다. 탁산 API는 탁산 입자를 제조하는데 사용될 수 있다. 탁산 입자는 파클리탁셀 입자, 도세탁셀 입자 또는 카바지탁셀 입자 또는 탁산의 약제학적으로 허용 가능한 염의 입자를 포함하는 다른 탁산 유도체의 입자일 수 있다.
탁산 입자는, 직경이 약 0.1 마이크론 내지 약 5 마이크론 (약 100 nm 내지 약 5000 nm)인 평균 입자 크기 (수)를 갖는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 고형의 코팅되지 않은 (말끔한) 개별 입자이다. 탁산 입자는 전신 순환에 의해 종양에서 운반될 수는 없지만 약물의 가용화 및 방출을 증진시키기 위해 고특이적 표면적으로 인해 유익이 되는 크기 범위에 있다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 임의의 물질에 결합되지 않는다. 일부 구현예에서, 물질도 탁산 입자의 표면 상에 전혀 흡수되거나, 흡착되지 않는다. 일부 구현예에서, 탁산 또는 탁산 입자는 임의의 물질 내에 피막화되거나, 함유되거나, 봉입되거나 포매되지 않는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 임의의 물질로 코팅되지 않는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 탁산을 함유하는 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 미세구체 또는 리포좀이 아니다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 단량체, 중합체 (또는 생체적합성 중합체), 단백질, 계면활성제 또는 알부민에 결합되거나, 이로 피막화되거나, 이로 코팅되지 않는다. 일부 구현예에서, 단량체, 중합체 (또는 생체적합성 중합체), 단백질, 계면활성제 또는 알부민은 탁산 입자의 표면 상에 흡수되거나, 흡착되지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물 및 탁산 입자는 알부민을 배제한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 결정질 형태이다. 다른 구현예에서, 탁산 입자는 무정질 형태 또는 결정질 및 무정질 형태 둘 다의 조합물로 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 탁산 입자는 탁산의 제조 동안 전형적으로 발견되는 미량의 불순물 및 부산물을 함유한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 탁산을 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 포함하는데, 이는 탁산 입자가 실질적으로 순수한 탁산으로 구성되거나, 이로 필수적으로 구성되는 것을 의미한다.
일부 구현예에서, 탁산 입자는 단백질 (예를 들어, 알부민), 단량체, 중합체, 생체적합성 중합체 및/또는 계면활성제와 같은 물질로 코팅되거나, 결합된다. 일부 구현예에서, 단백질 (예를 들어, 알부민), 단량체, 중합체, 생체적합성 중합체 또는 계면활성제와 같은 물질이 탁산 입자의 표면 상에 흡착되거나, 흡수된다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 단백질 (예를 들어, 알부민), 단량체, 중합체, 생체적합성 중합체 또는 계면활성제와 같은 물질 내에 피막화되거나, 포함되거나, 봉입되거나, 포매된다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 탁산을 함유하는 마이크로에멀젼, 나노에멀젼, 미세구체 또는 리포좀이다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 응집되지 않은 개별 입자이고, 비공유 상호작용, 반데르발 힘, 친수성 또는 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 쿨롱 힘, 분산 물질과의 상호작용 또는 작용기를 통한 상호작용과 같은 상호작용 힘에 의해 함께 결합된 복수의 탁산 입자의 군집이 아니다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 함께 융합하여 더 큰 개별 탁산 입자를 형성하는 더 작은 입자의 응집에 의해 형성되는 개별 탁산 입자이며, 이들 모두는 탁산 입자의 프로세싱 동안 발생한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 비공유 상호작용, 반데르발 힘, 친수성 또는 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 쿨롱 힘, 분산 물질과의 상호작용 또는 작용기를 통한 상호작용과 같은 상호작용 힘에 의해 함께 결합된 탁산 입자의 군집 또는 응집체이다.
탁산 입자(파클리탁셀 입자, 도세탁셀 입자 또는 카바지탁셀 입자을 포함하나 이에 한정되지 않음)는 0.1 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 2 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1.2 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1 마이크론 미만 또는 0.1 마이크론 내지 0.9 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 0.8 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 0.7 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 2 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 1.2 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 1 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 1 마이크론 미만 또는 0.2 마이크론 내지 0.9 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 0.8 마이크론 또는 0.2 마이크론 내지 0.7 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 2 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 1.2 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 1 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 1 마이크론 미만 또는 0.3 마이크론 내지 0.9 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 0.8 마이크론 또는 0.3 마이크론 내지 0.7 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 2 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1.2 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1 마이크론 미만 또는 0.4 마이크론 내지 0.9 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 0.8 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 0.7 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 2 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 1.2 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 1 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 1 마이크론 미만 또는 0.5 마이크론 내지 0.9 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 0.8 마이크론 또는 0.5 마이크론 내지 0.7 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 2 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 1.2 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 1 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 1 마이크론 미만 또는 0.6 마이크론 내지 0.9 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 0.8 마이크론 또는 0.6 마이크론 내지 0.7 마이크론의 평균 입자 크기(수)를 갖을 수 있다. 탁산 입자는 전신 순환에 의해 종양에서 운반될 수는 없지만 약물의 가용화 및 방출을 증진시키기 위해 고특이적 표면적으로 인해 유익이 되는 크기 범위에 있다.
탁산 입자의 입자 크기는 입자 크기 분석기 장비에 의해서 결정될 수 있고, 측정은 수 분포 (수)를 기준로 한 평균 직경으로서 표현된다. 적합한 입자 크기 분석기 장비는 광 차단의 분석 기법을 채용하는 것으로서, 포토존 또는 단일 입자 광학 감지(SPOS)로도 지칭된다. 적합한 광 차단 입자 크기 분석기 장비는 입자 크기분석 시스템사 (미국 플로리다주 포트 리치 소재)로부터 입수가능한 아큐사이저780 SIS와 같은 아큐사이저이다. 또 다른 적합한 입자 크기 분석기 장비는 시마주 SALD-7101과 같은 레이저 회절을 채용하는 것이다.
탁산 입자는 당업계에 공지된 다양한 입자 크기 감소 방법 및 장비를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 통상적인 입자 크기-감소 방법, 예컨대 습식 또는 건식 밀링, 미세화, 붕해 및 미분화를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 다른 방법은 "압축된 항-용매에 의한 침전"(PCA), 예컨대 초임계 이산화탄소에 의한 침전을 포함한다. 다양한 구현예에서, 탁산 입자는 모두가 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 US 5874029, US 5833891, US 6113795, US 7744923, US 8778181, US 9233348; 미국 특허출원 US 2015/0375153, US 2016/0354336, US 2016/0374953; 및 국제특허출원 WO 2016/197091, WO 2016/197100 및 WO 2016/197101에 개시되어 있는 PCA 방법에 의해 제조된다.
초임계 이산화탄소를 사용하는 PCA 입자 크기 감소 방법에서, 초임계 이산화탄소 (항-용매) 및 용매, 예를 들어 아세톤 또는 에탄올이 채용되어 코팅되지 않은 탁산 입자를 잘 특성화된 입자 크기 분포 내에 0.1 내지 5 마이크론 정도로 작게 생성한다. 이산화탄소 및 용매는 프로세싱 동안 제거되고 (최대 0.5% 잔존 용매가 남을 수 있음), 탁산 입자를 분말로서 남긴다. 안정성 연구는 파클리탁셀 입자 분말이 실온에서 최대 59개월 동안 그리고 가속화된 조건 (40℃/75% 상대 습도) 하에서 최대 6개월 동안 저장될 때 바이알 용량 형태에서 안정한 것을 보여준다.
다양한 초임계 이산화탄소 입자 크기 감소 방법에 의해 생산된 탁산 입자는 물리적 충격 또는 마쇄, 예를 들어 습식 또는 건식 분쇄, 미세화, 붕해, 절삭, 미세유체화 또는 분말화를 사용한 통상적인 입자 크기 감소 방법에 의해 생산된 탁산 입자 비교하여 독특한 물리적 특징을 가질 수 있다. 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 공보 2016/0374953에 개시된 바와 같이, 이러한 독특한 특징은 0.05 g/cm3 내지 0.15 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음) 및 적어도 18 m2/g의 특이 표면적(SSA)의 탁산 (예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀) 입자를 포함하며, 이는 미국 특허 공보 2016/0374953에 기재되고 하기에 기술된 초임계 이산화탄소 입자 크기 감소 방법에 의해 생산된다. 이러한 벌크 밀도 범위는 일반적으로 통상적인 수단에 의해 생산된 탁산 입자의 벌크 밀도보다 낮고, SSA는 일반적으로 통상적인 수단에 의해 생산된 탁산 입자의 SSA보다 더 높다. 이러한 독특한 특징은 통상적인 수단에 의해 생산된 탁산과 비교하여 물/메탄올 매질 중의 용해 속도에서의 유의한 증가를 초래한다. 본원에 사용된 바와 같이, "특이 표면적" (SSA)은 다음의 방법에 의해 브루나우어-엠메트-텔러 ("BET") 등온으로 측정된 바와 같은 탁산의 단위 질량 당 탁산 입자의 총 표면적이다: 200 내지 300 mg의 기지의 질량의 분석물을 30 mL 시료 튜브에 첨가한다. 다음으로 로딩된 튜브를 Porous Materials Inc.의 SORPTOMETER®, 모델 BET-202A에 올린다. 다음으로 BETWIN® 소프트웨어 패키지를 사용하여 자동화된 테스트를 수행하고, 후속적으로 각 시료의 표면적을 계산한다. 당업자라면 이해될 바와 같이, "탁산 입자"는 응집된 탁산 입자 및 응집되지 않은 탁산 입자 둘 다를 포함하고, SSA는 그램 단위로 결정되기 때문에 조성물에서 응집된 및 응집되지 않은 탁산 입자 둘 다를 고려한다. 본원에서 응집된 탁산 입자는 함께 융합하여 더 큰 개별 탁산 입자를 형성하는 더 작은 입자의 응집에 의해 형성되는 개별 탁산 입자로서 정의되고, 이들 모두는 탁산 입자의 프로세싱 동안 발생한다. BET 특이 표면적 테스트 절차는 미국 약전 및 유럽 약전 둘 다에 포함된 공인된 방법이다. 벌크 밀도 측정은 탁산 입자를 실온에서 태핑하지 않고 눈금 실린더에 붓고, 질량 및 부피를 측정하고, 벌크 밀도를 계산함으로써 시행 될 수 있다.
미국 특허 공보 2016/0374953에 개시된 바와 같이, 연구는 실온에서 60분 동안 600 RPM에서 5 mm 볼 크기를 사용하는 Deco-PBM-V-0.41 볼 분쇄기에서 파클리탁셀을 분쇄함으로써 생성된 파클리탁셀 입자에 대해 15.0 m2/g의 SSA 및 0.31 g/cm3의 벌크 밀도를 보여주었다. 또한 미국 특허 공보 2016/0374953에 개시된 바와 같이, 많은 파클리탁셀 입자는 다음의 방법을 사용하는 초임계 이산화탄소 방법에 의해 생산될 때, 37.7 m2/g의 SSA 및 0.085 g/cm3의 벌크 밀도를 가졌다: 65 mg/mL의 파클리탁셀 용액을 아세톤에서 제조하였다.　 BETE 마이크로휠® 안개 노즐 (BETE Fog Nozzle, Inc.) 및 음파 프로브 (Qsonica, 모델 번호 Q700)를 약 8 mm 이격된 결정화 체임버 내에 배치하였다.　 대략 100 nm 구멍을 갖는 스테인레스강 메쉬 필터를 결정화 체임버에 부착하여 침전된 파클리탁셀 입자를 수집하였다.　 초임계 이산화탄소를 제조 장비의 결정화 체임버에 두었고, 약 38
Figure pct00004
및 24 kg/시간의 유속에서 대략 1200 psi로 만들었다. 음파 프로브를 20 kHz의 주파수에서 총 출력의 60%로 조정하였다.　 파클리탁셀을 함유하는 아세톤 용액을 대략 36시간 동안 4.5 mL/분의 유속으로 노즐을 통해 펌핑하였다.　 상기에 기재된 초임계 이산화탄소 방법에 의해 생산된 추가적인 많은 파클리탁셀 입자는 다음의 SSA 값을 가졌다: 22.27 m2/g, 23.90 m2/g, 26.19 m2/g, 30.02 m2/g, 31.16 m2/g, 31.70 m2/g, 32.59 m2/g, 33.82 m2/g, 35.90 m2/g, 38.22 m2/g 및 38.52 m2/g.
미국 특허 공보 2016/0374953에 개시된 바와 같이, 연구는 실온에서 60분 동안 600 RPM에서 5 mm 볼 크기를 사용하는 Deco-PBM-V-0.41 볼 분쇄기에서 도세탁셀을 분쇄함으로써 생성된 도세탁셀 입자에 대해 15.2 m2/g의 SSA 및 0.44 g/cm3의 벌크 밀도를 보여주었다. 또한 미국 특허 공보 2016/0374953에 개시된 바와 같이, 많은 도세탁셀 입자는 다음의 방법을 사용하는 초임계 이산화탄소 방법에 의해 생산될 때, 44.2 m2/g의 SSA 및 0.079 g/cm3의 벌크 밀도를 가졌다: 79.32 mg/mL의 도세탁셀 용액을 에탄올에서 제조하였다.　 노즐 및 음파 프로브는 가압 체임버 내에 약 9 mm 이격되어 위치되었다.　 대략 100 nm 구멍을 갖는 스테인레스강 메쉬 필터를 가압 체임버에 부착하여 침전된 도세탁셀 입자를 수집하였다.　 초임계 이산화탄소를 제조 장비의 가압 체임버에 두었고, 약 38℃ 및 68 slpm의 유속에서 대략 1200 psi로 만들었다.　 음파 프로브를 20 kHz의 주파수에서 총 출력의 60%로 조정하였다.　 도세탁셀을 함유하는 에탄올 용액을 대략 95분 동안 2 mL/분의 유속으로 노즐을 통해 펌핑하였다.　 다음으로, 침전된 도세탁셀 응집된 입자 및 더 작은 도세탁셀 입자를, 혼합물을 스테인레스강 메쉬 필터를 통해 펌핑하면서 초임계 이산화탄소로부터 수집하였다.　 도세탁셀 입자를 함유하는 필터를 개방하고, 생성된 산물을 필터로부터 수집하였다.
미국 특허 공보 2016/0374953에 개시된 바와 같이, 용해 연구는 실온에서 60분 동안 600 RPM에서 5 mm 볼 크기를 사용하는 Deco-PBM-V-0.41 볼 분쇄기에서 파클리탁셀 및 도세탁셀을 분쇄함으로써 제조된 파클리탁셀 및 도세탁셀 입자와 비교하여, 미국 특허 공보 2016/0374953에 기술된 초임계 이산화탄소 방법에 의해 제조된 파클리탁셀 및 도세탁셀 입자의 메탄올/물 매질 중의 용해 속도가 증가된 것을 보여주었다. 용해 속도를 결정하는 데 사용되는 절차는 다음과 같다. 파클리탁셀의 경우, 대략 50 mg의 물질을, 대략 1시간 동안 바이알에서 물질 및 비드를 회전시킴으로써 대략 1.5 그램의 1 mm 유리 비드 상에 코팅하였다. 비드를 스테인레스강 메쉬 용기로 이전시키고, 37℃, pH 7의 메탄올/물 50/50 (v/v) 매질 및 75 rpm에서 작동하는 USP 장치 Ⅱ (패들)를 포함하는 용해조에 배치하였다. 10, 20, 30, 60, 및 90분째, 5 mL 분량을 덜어내어, 0.22 μm 필터를 통해 여과하고, 227 nm에서 UV/VIS 분광광도계 상에서 분석하였다. 시료의 흡광도 값을 용해 매질에서 제조된 표준 용액의 흡광도 값과 비교하여 용해된 물질의 양을 결정하였다. 도세탁셀의 경우, 대략 50 mg의 물질을, 37℃, pH 7의 메탄올/물 15/85 (v/v) 매질 및 75 rpm에서 작동하는 USP 장치 Ⅱ (패들)을 포함하는 용해조에 직접 배치하였다. 5, 15, 30, 60, 120 및 225분째, 5 mL 분량을 덜어내어, 0.22 μm 필터를 통해 여과하고, 232 nm에서 UV/VIS 분광광도계 상에서 분석하였다. 시료의 흡광도 값을 용해 매질에서 제조된 표준 용액의 흡광도 값과 비교하여 용해된 물질의 양을 결정하였다. 파클리탁셀의 경우, 용해 속도는 분쇄에 의해 제조된 입자에 대해 30분 동안 32%가 용해된 것에 비해 초임계 이산화탄소 방법으로 제조된 입자에 대해서는 30분 동안 47%가 용해되었다. 도세탁셀의 경우, 용해 속도는 분쇄에 의해 제조된 입자에 대해 30분 동안 9%가 용해된 것에 비해 초임계 이산화탄소 방법으로 제조된 입자에 대해서는 30분 동안 27%가 용해되었다.
일부 구현예에서, 탁산 입자는 적어도 10, 적어도 12, 적어도 14, 적어도 16, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34 또는 적어도 35 m2/g의 SSA를 갖는다. 일 구현예에서, 탁산 입자는 약 10 m2/g 내지 약 50 m2/g의 SSA를 갖는다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 약 0.050 g/cm3 내지 약 0.20 g/cm3의 벌크 밀도를 갖는다.
추가의 구현예에서, 탁산 입자는 다음의 SSA를 갖는다:
(a) 16 m2/g 내지 31 m2/g 또는 32 m2/g 내지 40 m2/g;
(b) 16 m2/g 내지 30 m2/g 또는 32 m2/g 내지 40 m2/g;
(c) 16 m2/g 내지 29 m2/g 또는 32 m2/g 내지 40 m2/g;
(d) 17 m2/g 내지 31 m2/g 또는 32 m2/g 내지 40 m2/g;
(e) 17 m2/g 내지 30 m2/g 또는 32 m2/g 내지 40 m2/g;
(f) 17 m2/g 내지 29 m2/g 또는 32 m2/g 내지 40 m2/g;
(g) 16 m2/g 내지 31 m2/g 또는 33 m2/g 내지 40 m2/g;
(h) 16 m2/g 내지 30 m2/g 또는 33 m2/g 내지 40 m2/g;
(i) 16 m2/g 내지 29 m2/g 또는 33 m2/g 내지 40 m2/g;
(j) 17 m2/g 내지 31 m2/g 또는 33 m2/g 내지 40 m2/g;
(k) 17 m2/g 내지 30 m2/g 또는 33 m2/g 내지 40 m2/g;
(l) 17 m2/g 내지 29 m2/g 또는 33 m2/g 내지 40 m2/g;
(m) 16 m2/g 내지 31 m2/g 또는 ≥ 32 m2/g;
(h) 17 m2/g 내지 31 m2/g 또는 ≥ 32 m2/g;
(i) 16 m2/g 내지 30 m2/g 또는 ≥ 32 m2/g;
(j) 17 m2/g 내지 30 m2/g 또는 ≥ 32 m2/g;
(k) 16 m2/g 내지 29 m2/g 또는 ≥ 32 m2/g;
(l) 17 m2/g 내지 29 m2/g 또는 ≥ 32 m2/g;
(m) 16 m2/g 내지 31 m2/g 또는 ≥ 33 m2/g;
(n) 17 m2/g 내지 31 m2/g 또는 ≥ 33 m2/g;
(o) 16 m2/g 내지 30 m2/g 또는 ≥ 33 m2/g;
(p) 17 m2/g 내지 30 m2/g 또는 ≥ 33 m2/g;
(q) 16 m2/g 내지 29 m2/g 또는 ≥ 33 m2/g; 또는
(r) 17 m2/g 내지 29 m2/g 또는 ≥ 33 m2/g;
일부 구현예에서, 탁산 입자는 함께 융합하여 더 큰 개별 탁산 입자를 형성하는 더 작은 입자의 응집에 의해 형성되는 응집된 입자이며, 이들 모두는 입자의 프로세싱 동안 발생한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 함께 융합하여 더 큰 개별 탁산 입자를 형성하는 더 작은 입자의 응집에 의해 형성되고, 이들 모두는 입자의 프로세싱 동안 발생한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 응집되지 않은 개별 입자이고, 비공유 상호작용, 반데르발 힘, 친수성 또는 소수성 상호작용, 정전기적 상호작용, 쿨롱 힘, 분산 물질과의 상호작용 또는 작용기를 통한 상호작용과 같은 상호작용 힘에 의해 함께 결합된 복수의 탁산 입자의 군집이 아니다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 응집된 및 응집되지 않은 입자 둘 다를 포함한다.
일부 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자이고, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34 또는 적어도 35 m2/g의 SSA를 갖는다. 다른 구현예에서, 파클리탁셀 입자는 18 m2/g 내지 50 m2/g 또는 20 m2/g 내지 50 m2/g 또는 22 m2/g 내지 50 m2/g 또는 25 m2/g 내지 50 m2/g 또는 26 m2/g to 50 m2/g 또는 30 m2/g 내지 50 m2/g, or 35 m2/g 내지 50 m2/g 또는 18 m2/g 내지 45 m2/g 또는 20 m2/g 내지 45 m2/g 또는 22 m2/g 내지 45 m2/g 또는 25 m2/g 내지 45 m2/g 또는 26 m2/g 내지 45 m2/g 또는 30 m2/g 내지 45 m2/g 또는 35 m2/g 내지 45 m2/g 또는 18 m2/g 내지 40 m2/g 또는 20 m2/g 내지 40 m2/g 또는 22 m2/g 내지 40 m2/g 또는 25 m2/g 내지 40 m2/g 또는 26 m2/g 내지 40 m2/g 또는 30 m2/g 내지 40 m2/g 또는 35 m2/g 내지 40 m2/g의 SSA를 갖는다.
일부 구현예에서, 파클리탁셀 입자는 0.05 g/cm3 내지 0.15 g/cm3 또는 0.05 g/cm3 내지 0.20 g/cm3의 벌크 밀도(태핑되지 않음)를 갖는다.
일부 구현예에서, 파클리탁셀 입자는 75 RPM, 37°C에서, 그리고 pH 7에서 작동하는 USP Ⅱ 패들 장치에서 50% 메탄올/50% 물 (v/v)의 용액에서 30분 이하 동안 용해되는 적어도 40 중량%의 용해 속도를 갖는다.
일부 구현예에서, 탁산 입자는 도세탁셀 입자이고, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41 또는 적어도 42 m2/g의 SSA를 갖는다. 다른 구현예에서, 도세탁셀 입자는 18 m2/g 내지 60 m2/g 또는 22 m2/g 내지 60 m2/g 또는 25 m2/g 내지 60 m2/g 또는 30 m2/g 내지 60 m2/g 또는 40 m2/g 내지 60 m2/g 또는 18 m2/g 내지 50 m2/g 또는 22 m2/g 내지 50 m2/g 또는 25 m2/g 내지 50 m2/g 또는 26 m2/g 내지 50 m2/g 또는 30 m2/g 내지 50 m2/g 또는 35 m2/g 내지 50 m2/g 또는 40 m2/g 내지 50 m2/g의 SSA를 갖는다.
일부 구현예에서, 도세탁셀 입자는 0.05 g/cm3 내지 0.15 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)를 갖는다.
일부 구현예에서, 도세탁셀 입자는 75 RPM, 37℃에서, 그리고 pH 7에서 작동하는 USP Ⅱ 패들 장치에서 15% 메탄올/85% 물 (v/v)의 용액에서 30분 이하 동안 용해되는 적어도 20 중량%의 용해 속도를 갖는다.
Ⅳ. 탁산 입자 조성물 및 국소 투여 방법
국소 투여에 유용한 조성물은 본원에서 및 본 발명 전반에 걸쳐 설명된 탁산 입자를 포함하는 조성물이고, 다양한 유형의 국소 투여, 즉 국소 투여, 폐 투여, 종양내 (IT) 주사, 방광내 점적 투여 (발광), 복강내 (IP) 주사 또는 종양 주변의 조직 내로 직접 주사 또는 이들의 조합에 적합한 조성물이다. 조성물은 현탁액일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 담체를 포함하고, 여기서 탁산 입자는 담체 내에 분산되어 담체가 연속된 상이고 탁산 입자가 분산된 (현탁된) 상이 된다. 탁산 입자는 조성물 및/또는 담체에 완벽하게 분산되거나, 부분적으로 분산되고, 부분적으로 용해될 수 있지만, 탁산 입자가 조성물 및/또는 담체에 완벽하게 용해될 수는 없다.
조성물은 2회 이상의 개별 투여로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 14일째 또는 적어도 이들 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 2 내지 12주, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 12, 3 내지 11, 3 내지 10, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 12, 4 내지 11, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 12, 5 내지 11, 5 내지 10, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 11, 6 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 6 내지 7, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 8 내지 9, 9 내지 12, 9 내지 11, 9 내지 10, 10 내지 12, 10 내지 11, 11 내지 12, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 5, 3 내지 4, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상의 개별 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 적어도 2주 동안 주 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1주 동안 주 2회 투여되고, 여기서 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1일 간격을 둔다. 일부 구현예에서, 방법은 종양의 제거 (박멸)를 유도한다. 일부 구현예에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 이상의 개별 투여로 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 7회 이상의 개별 투여로 투여된다.
A. 국소 적용을 위한 탁산 입자 조성물
국소 적용을 위한 조성물은 탁산 입자를 포함한다. 탁산 입자는 국소 조성물에 분산 (현탁)될 수 있다. 국소 조성물은 국소 전달에 적합한 임의의 조성물일 수 있다. 국소 조성물은 소수성 조성물일 수 있다. 국소 조성물은 무수성, 친수성 조성물 또는 무수의 소수성 조성물을 포함할 수 있는 무수 조성물일 수 있다. 무수의 친수성 조성물의 비제한적인 예는 폴리올, 글리콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜, PEG) 및/또는 폴록사머를 기초으로 하는 조성물을 포함한다. 국소 조성물은 비-무수성, 예컨대 수용성계 조성물일 수 있다. 국소 조성물은 멸균될 수 있거나, 자자보존될 수 있거나, 방부제를 포함할 수 있다.
국소 조성물은 국소 전달에 적합한 다양한 형태로 제형화될 수 있다. 비제한적인 예로는 반-고체 조성물, 로션, 액체 현탁액, 에멀전, 크림, 겔, 연고, 페이스트, 에어로졸 스프레이, 에어로졸 폼, 비-에어로졸 스프레이, 비-에어로졸 폼, 필름 및 시트가 포함된다. 반-고체 조성물은 연고, 페이스트 및 크림을 포함한다. 국소 조성물은 거즈, 붕대 또는 다른 피부 드레싱 물질에 함침될 수 있다. 일부 구현예에서, 국소 조성물은 반-고체 조성물이다. 일부 구현예에서, 국소 조성물은 연고이다. 다른 구현예에서, 국소 조성물은 겔이다. 또 다른 구현예에서, 국소 조성물은 액체 현탁액이다. 일부 구현예에서, 국소 조성물은 스프레이가 아니며 분사가능하지 않다.
일부 구현예에서, 국소 조성물은 중합체/공중합체 또는 생체적합성 중합체/공중합체가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 단백질이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 알부민이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 히알루론산이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 히알루론산과 탁산의 컨쥬게이트가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 히알루론산과 파클리탁셀의 컨쥬게이트가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 폴록사머, 폴리음이온, 폴리양이온, 개질된 폴리음이온, 개질된 폴리양이온, 키토산, 키토산 유도체, 금속 이온, 나노벡터, 폴리감마-글루탐산 (PGA), 폴리아크릴산 (PAA), 알긴산 (ALG), 비타민 E-TPGS, 디메틸 이소소르비드 (DMI), 메톡시 PEG 350, 시트르산, 항-VEGF 항체, 에틸셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리무수물, 폴리하이드록시산, 폴리포스파젠, 폴리오르토에스테르, 폴리에스테르, 폴리아미드, 다당류, 폴리단백질, 스티렌-이소부틸렌-스티렌 (SIBS), 폴리무수물 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(비스(P-카르복시 펜옥시)프로판-세박산, 폴리(d,l-락트산) (PLA), 폴리(d,l-락트산-코-글리콜산) (PLAGA) 및/또는 폴리(D, L-락트-코-글리콜산 (PLGA)이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다.
국소 조성물은 국소 제품에 적합한 임의의 패키지 구성으로 포장될 수 있다. 비제한적인 예에는 병, 펌프가 있는 병, 토틀, 튜브 (알루미늄, 플라스틱 또는 라미네이트), 통, 비-에어로졸 펌프 스프레이, 에어로졸 용기, 파우치 및 패킷이 포함된다. 단일 용량 또는 다중 용량 투여를 위해 패키지를 구성할 수 있다.
적합한 국소 조성물의 비-제한적인 예는 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 WO 2017/049083에 개시되어 있다.
1. 소수성 국소 조성물
일부 구현예에서, 국소 조성물은 소수성 조성물이다. 본 발명의 목적으로, 소수성 조성물은 조성물 중 소수성 성분의 총량이 조성물 중 비-소수성 성분의 총량보다 큰 조성물이다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 무수성이다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 소수성 담체를 포함한다.
소수성 담체는 식물, 동물, 파라핀계 및/또는 합성 유래 공급원으로부터의 물질을 포함할 수 있다. 소수성 물질은 일반적으로 물에 대한 친화성이없고 물에 반발하는 물질로 알려져 있다. 소수성 담체는 국소 조성물의 연속된 상일 수 있고, 탁산 입자는 분산된 상일 수 있다. 다양한 구현예에서, 소수성 담체는 비-극성 및/또는 비-휘발성이다. 소수성 담체의 비제한적인 예로는 지방, 버터, 그리스, 왁스, 용매 및 오일; 미네랄 오일; 식물성 오일; 바셀린; 물에 불용성 유기 에스테르 및 트리글리세리드; 및 플루오르화된 화합물이 포함된다. 소수성 담체는 또한 실리콘 물질을 포함할 수 있다. 실리콘 물질은 폴리디알킬실록산계 화합물로서 정의되며, 중합체, 엘라스토머 (가교형 실리콘) 및 접착제 (분지형 실리콘)를 포함한다. 실리콘 재료의 비제한적인 예는 디메티콘 (폴리디메틸실록산), 디메티콘 코폴리올, 사이클로메티콘, 시메 티콘, ST-엘라스토머 10 (다우 코닝사)과 같은 실리콘 엘라스토머, 실리콘 오일, 실리콘 중합체, 휘발성 실리콘 유체 및 실리콘 왁스를 포함한다. 일부 구현예에서, 소수성 담체는 실리콘 물질을 포함하지 않는다. 식물 유래 물질은 아라키스 (땅콩) 오일, 발사믹 페루 오일, 카르나우바 왁스, 칸델라 왁스, 피마자유, 수소화된 피마자유, 코코아 버터, 코코넛 오일, 옥수수유, 면화 종자유, 호호바유, 마카다미아 종자유, 올리브 오일, 오렌지 오일, 오렌지 왁스, 팜커널 오일, 평지씨 오일, 잇꽃 오일, 참깨 종자유, 시어 버터, 콩기름, 해바라기 종자유, 티트리 오일, 식물성 오일 및 수소화된 식물성 오일을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 동물 유래 물질의 비제한적인 예는 밀랍 (황색 왁스 및 백색 왁스), 대구 간유, 에뮤 오일, 라드, 밍크 오일, 상어 간유, 스쿠알란, 스쿠알렌 및 톨로우를 포함한다. 파라핀계 물질의 비제한적인 예는 이소파라핀, 미세결정질 왁스, 중질 미네랄 오일, 경질 미네랄 오일, 오조케라이트, 바셀린, 화이트 바셀린 및 파라핀 왁스를 포함한다. 유기 에스테르 및 트리글리세리드의 비제한적인 예는 C12-15 알킬 벤조에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, 중간 트리글리세리드, 모노- 및 디글리세리드, 트리라우린 및 트리하이드록시스테아린을 포함한다. 플루오르화된 화합물의 비제한적인 예는 솔베이 스페셜티 폴리머사로부터 입수가능한 FOMBLIN®HC04와 같은 퍼플루오로폴리에테르 (PFPE)이다. 소수성 담체는 약제학적 등급의 소수성 물질을 포함할 수 있다.
다양한 구현예에서, 소수성 담체는 바셀린, 미네랄 오일 또는 파라핀 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 바셀린은 석유로부터 얻은 반-고체 포화 탄화수소의 정제된 혼합물이며, 색상이 짙은 황색부터 옅은 황색까지 다양하다. 화이트 바셀린은 전체적으로 또는 거의 탈색되며, 색상이 크림색부터 눈 백색까지 다양하다. 바셀린은 상이한 녹는점, 점도 및 경도 특징을 가지고 있다. 바셀린은 또한 항산화제와 같은 안정화제를 함유할 수 있다. 바셀린의 약제학적 등급은 바셀린 USP 및 화이트 바셀린 USP를 포함한다. 미네랄 오일은 석유로부터 얻은 액체 탄화수소의 혼합물이다. 미네랄 오일은 경질 미네랄 오일, 중질 미네랄 오일 및 매우 중질 미네랄 오일과 같은 다양한 점도 등급으로 입수가능하다. 경질 미네랄 오일은 40℃에서 33.5 센티스토크 이하의 동점도를 갖는다. 중질 미네랄 오일은 40℃에서 34.5 센티스토크 이하의 동점도를 갖는다. 약제학적 등급의 미네랄 오일은 중질 미네랄 오일인 미네랄 오일 USP 및 경질 미네랄 오일인 라이트 미네랄 오일 NF를 포함한다. 일부 구현예에서, 미네랄 오일은 중질 미네랄 오일이다. 파라핀 왁스는 바셀린으로부터 얻은 고체 탄화수소의 정제된 혼합물이다. 또한 이는 피셔-트롭쉬 공정에 의해 일산화탄소 및 수소로부터 합성적으로 유도될 수 있으며, 이는 촉매적으로 파라핀 탄화수소의 혼합물로 전환된다. 파라핀 왁스는 항산화제를 함유할 수 있다. 파라핀 왁스의 약제학적 등급은 파라핀 NF 및 합성 파라핀 NF를 포함한다.
일부 구현예에서, 소수성 조성물 중 소수성 담체의 농도는 총 조성물 무게의 10 중량%보다 크다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물 중 소수성 담체의 농도는 총 조성물 무게의 15 중량%, 20 중량%, 또는 25 중량%, 또는 30% 중량%, 또는 35 중량%, 또는 40 중량%, 또는 45 중량%, 또는 50 중량%, 또는 55 중량%, 또는 60 중량%, 또는 65 중량%, 또는 70 중량%, 또는 75 중량%, 또는 80 중량%, 또는 82 중량%, 또는 85 중량%, 또는 87 중량%, 또는 90 중량%보다 크다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물 중 소수성 담체의 농도는 총 조성물 무게의 10 중량% 내지 95 중량%보다 크다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물 중 소수성 담체의 농도는 총 조성물 무게의 11 중량% 내지 95 중량％, 또는 12 중량％ 내지 95 중량％, 또는 13 중량％ 내지 95 중량％, 또는 14 중량％ 내지 95 중량％, 또는 15 중량％ 내지 95 중량％, 또는 16 중량％ 내지 95 중량％, 또는 17 중량％ 내지 95 중량％, 또는 18 중량％ 내지 95 중량％, 또는 19 중량％ 내지 95 중량％, 또는 20 중량％ 내지 95 중량%보다 크다. 바람직한 구현예에서, 소수성 조성물 중 소수성 담체는 소수성 조성물의 50% 초과이다.
소수성 조성물은 소수성 담체를 포함하고, 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체를 추가로 포함할 수 있다. 휘발성 실리콘 오일로도 알려진 휘발성 실리콘 유체는 고리상 또는 선형일 수 있는 휘발성 액체 폴리실록산이다. 이들은 실온에서 액체이다. 휘발성 실리콘 유체는 소수성 물질이다. 선형의 휘발성 실리콘 유체는 폴리디메틸실록산, 헥사메틸디실록산 및 옥타메틸트리실록산을 포함하고, 다우 코닝사로부터 상표명 다우 코닝 Q7-9180 실리콘 유체 0.65 cSt 및 다우 코닝 Q7-9180 실리콘 유체 1.0 cSt으로 각각 시판되어 입수가능하다. 고리상 휘발성 실리콘 유체는 일반적으로 사이클로메티콘으로 알려져 있다. 사이클로메티콘은 화학식 (Ⅳ)의 반복 단위를 함유하는 완전히 메틸화된 고리상 실록산
(Ⅳ) [-(CH3)2SiO-] n
여기서 n은 3, 4, 5, 6 또는 7이고, 또는 이들의 혼합물이다. 사이클로메티콘은 투명한 무색의 휘발성 액체 실리콘 유체이다. 사이클로메티콘은 연화제 특성을 갖고, 피부가 덜 기름지게 만들어서 오일계 제품의 촉감을 개선하도록 돕는다. 약제학적 등급의 사이클로메티콘은 사이클로메티콘 NF를 포함한다. 사이클로메티콘 NF는 n 이 4 (사이클로테트라실록산), 5 (사이클로펜타실록산) 또는 6 (사이클로헥사실록산)인 화학식 (Ⅳ); 또는 이의 혼합물로 나타낸다. 데카메틸사이클로펜타실록산, 사이클로메티콘 D5 또는 사이클로메티콘 5로도 알려진 사이클로펜타실록산은 n 이 5 (오량체)인 화학식 (Ⅳ)로 표시되는 사이클로메티콘이지만, 다른 고리상 사슬 길이의 사이클로메티콘 중 하나 이상을 소량 (일반적으로 1% 미만) 함유할 수 있다. 사이클로펜타실록산은 약제학적 등급으로 사이클로메티콘 NF로서 입수가능하다. 사이클로메티콘은 상표명 다우 코닝 ST-사이클로메티콘 5-NF, 다우 코닝 ST-사이클로메티콘 56-NF 및 XIAMETER PMX-0245으로 다우 코닝사로부터 시판되어 입수가능하다. 또한 이것은 스펙트럼 케미칼 Mfg로부터 시판되어 입수가능하다. 사이클로펜타실록산은 25℃에서 증기압이 약 20 내지 약 27 Pa이다.
일 구현예에서, 소수성 조성물 중 사이클로메티콘의 농도는 25 중량％ 미만이다. 또 다른 구현예에서, 소수성 조성물 중 사이클로메티콘은 5 내지 24 중량％의 농도이다. 또 다른 구현예에서, 사이클로메티콘의 농도는 5 내지 20 중량％이다. 또 다른 구현예에서, 사이클로메티콘의 농도는 5 내지 18 중량％이다. 또 다른 구현예에서, 사이클로메티콘의 농도는 13 중량％이다. 다양한 구현예에서, 사이클로메티콘의 농도는 총 조성물 중량의 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 15, 15.5, 16, 16.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 19.5, 20, 20.5, 21, 21.5, 22, 22.5, 23, 23.5 또는 24 중량％ 또는 이에서 도출가능한 임의의 백분율일 수 있다. 일부 구현예에서, 휘발성 실리콘 유체는 사이클로메티콘이다. 일부 구현예에서, 사이클로메티콘은 사이클로펜타실록산이다.
소수성 조성물은 소수성 담체 및 휘발성 실리콘 유체의 혼합물 내에서 탁산 입자의 현탁액일 수 있다. 탁산 입자는 소수성 조성물에 완벽하게 분산되거나, 부분적으로 분산되고, 부분적으로 용해될 수 있지만, 탁산 입자는 소수성 조성물에 완벽하게 용해될 수는 없다. 소수성 담체는 소수성 조성물의 연속된 상일 수 있고, 탁산 입자는 분산된 상일 수 있다. 따라서, 소수성 조성물은 적어도 2개의 상, 연속된 소수성 담체상 및 분산된 (현탁된) 탁산 입자상을 포함할 수 있다. 휘발성 실리콘 유체는 연속된 상 내에서 가용화되고/거나 분산될 수 있다.
일부 구현예에서, 소수성 조성물은 추가적인 침투 증강제가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 라우로카프람이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (DGME)가 없거나, 이를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 이소프로필 미리스테이트가 없거나, 이를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물은 알파 토코페롤이 없거나, 이를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물은 추가적인 휘발성 용매 또는 화합물이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 임의의 알코올 또는 C1-C4 지방족 알코올이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 알코올 또는 C1-C5 지방족 알코올이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물은 계면활성제가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물은 중합체/공중합체 (또는 생분해성 중합체/공중합체)가 없거나, 이를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물은 폴록사머, 스티렌-이소부틸렌-스티렌 (SIBS), 폴리무수물 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리(비스(P-카르복시펜옥시)프로판-세박산 및/또는 폴리(D, L 락트산-코-글리콜산 (PLGA)이 없거나, 이를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 소수성 조성물은 반-고체 조성물이다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 연고이다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 연고를 포함하는 반-고체 조성물이고, 2분의 평형 시간으로 5 rpm에서 SC4-14 스핀들 및 6R 체임버를 갖는 작은 시료 어댑터를 사용한 브룩필드 RV 점도계에 의해 실온에서 측정되는 바와 같이 12,500 cps 내지 247,500 cps, 또는 25,000 cps 내지 150,000 cps의 점도를 갖는다. 소수성, 반-고체 조성물의 점도 측정을 수행하는 대안의 방법은 헬리패스가 켜진 헬리패스 스탠드 상의 브룩필드 RV 점도계를 실온에서 45초 동안 10 RPM의 T-E 스핀들로 사용하는 것이다. 일부 구현예에서, 소수성 조성물은 연고를 포함하여 반-고체 조성물이고, 헬리패스가 켜진 헬리패스 스탠드 상의 브룩필드 RV 점도계를 실온에서 45초 동안 10 RPM의 T-E 스핀들로 사용하여 25,000 cps 내지 500,000 cps, 또는 25,000 cps 내지 400,000 cps, 또는 25,000 cps 내지 350,000 cps, 또는 25,000 cps 내지 300,000 cps, 또는 50,000 cps 내지 500,000 cps, 또는 50,000 cps 내지 400,000 cps, 또는 50,000 cps 내지 350,000 cps, 또는 50,000 cps 내지 300,000 cps, 또는 75,000 cps 내지 500,000 cps, 또는 75,000 cps 내지 400,000 cps, 또는 75,000 cps 내지 350,000 cps, 또는 75,000 cps 내지 300,000 cps, 또는 100,000 cps 내지 500,000 cps, 또는 100,000 cps 내지 400,000 cps, 또는 100,000 cps 내지 350,000 cps, 또는 100,000 cps 또는 300,000 cps의 점도를 갖는다.
2. 수용성계 국소 조성물
수용성계 국소 조성물은 탁산 입자 및 수용성 담체를 포함한다. 수용성 조성물은 수용성 담체에서의 탁산 입자의 분산액 (현탁액)이다. 탁산 입자는 완벽하게 분산되고, 부분적으로 분산되고, 부분적으로 용해될 수 있지만, 수용성 담체에 완벽하게 용해되지는 않는다. 수용성계 조성물은 물이 주요 성분 (50% 초과)인 조성물이다. 수용성 담체는 단일상 수용액, 및 수중유 및 유중수 에멀젼과 같은 다중상 수용성계 에멀젼을 포함할 수 있다. 수용성 담체의 비제한적인 예는 물 및 완충 용액을 포함한다.
국소 수용성계 조성물의 비제한적인 예는 국제특허출원 WO 2017/049083에 개시된 바와 같이, 폴록사머 407, 사차 암모늄 화합물 및/또는 가교된 아크릴산 중합체를 포함하는 수용성 담체 (예를 들어, 물)를 포함한다. 사차 암모늄 화합물의 비제한적인 예는 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤제토늄 클로라이드를 포함한다. 가교된 아크릴산 중합체의 비제한적인 예는 카보머 (INCI 명칭), 아크릴레이트 공중합체 (INCI 명칭), 아크릴레이트/C 10-30 알킬 아크릴레이트 교차중합체 (INCI 명칭), 아크릴레이트 교차중합체-4 (INCI 명칭) 및 폴리아크릴레이트-1 교차중합체 (INCI 명칭)을 포함한다.
3. 국소 조성물을 위한 추가적인 성분 및 부형제
국소 조성물은 국소 조성물에 사용하는데 적합한 기능성 성분을 추가로 포함할 수 있다. 비제한적인 예는 흡수제, 산성화제, 항균제, 항산화제, 결합제, 살생물제, 완충제, 증량제, 결정 성장 저해제, 킬레이팅제, 착색제, 탈취제, 에멀젼 안정화제, 필름 형성제, 방향제, 습윤제, 용해제, 효소제, 불투명화제, 산화제, pH 조절제, 가소제, 방부제, 환원제, 피부 컨디셔닝 연화제, 피부 컨디셔닝 보습제, 습윤제, 계면활성제, 유화제, 세척제, 발포제, 하이드로토프, 용매, 현탁제, 점도 조절제 (유동학 개질제), 점도 증가제 (증점제) 및 추진제를 포함한다. 본원에 기술된 기능성 성분의 예시의 목록 및 단행본은 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제 화장품 성분 사전 및 핸드북 (INCI) 판, 제 12판, 2008에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 국소 조성물은 침투 증강제를 포함한다. 다른 구현예에서, 국소 조성물은 추가적인 침투 증강제가 없거나, 이를 포함하지 않는다. 용어 "침투 증강제"는 피부를 통한 약물 흡수를 촉진시키는 화합물 또는 물질 또는 물질을 설명하는데 사용되어 왔다. 이들 화합물 또는 물질 또는 물질은 피부의 투과성에 직접적인 영향을 미치거나, 침투제의 열역학적 활성을 증가시킴으로써 경피 흡수를 증강시키고, 이로써 확산 종의 효과적인 탈출 경향 및 농도 구배를 증가시킬 수 있다. 이러한 증강제의 주요한 효과는 각질층의 수화 정도를 증가시키거나 지질단백질 매트릭스를 파괴하는 것이고, 순수 결과는 약물 (침투제) 확산에 대한 저항성 감소이다 (Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., 2013). 피부 투과 증강제의 비제한적인 예는 올레일 알코올, 이소프로필 미리스테이트, 상표명 ARLASOLVE DMI로 시판되는 디메틸 이소소르비드 (DMI) 및 상표명 TRANSCUTOL P로 시판되는 디에틸렌 글리콜 모노에틸에테르 (DGME)를 포함한다. 피부 침투 증강제의 다른 예는 본원에 참고문헌으로 통합되는, "Skin Penetration Enhancers Cited in the Technical Literature", Osborne, David W., and Henke, Jill J., Pharmaceutical Technology, pages 58-66, November 1997에서 찾아볼 수 있다. 이러한 예는 지방족 알코올, 예컨대 지방족 알코올, 데칸올, 라우릴 알코올 (도데칸올), 리놀레닐 알코올, 네롤리돌, 1-노난올, n-옥탄올, 올레일 알코올, 지방산 에스테르, 부틸아세테이트, 세틸락테이트, 데실 N,N-디메틸아미노아세테이트, 데실 N,N- 디메틸아미노 이소프로피오네이트, 디에틸렌글리콜 올레에이트, 디에틸 세바케이트, 디에틸숙시네이트, 디이소프로필 세바케이트, 도데실 N,N- 디메틸아미노 아세테이트, 도데실 (N,N- 디메틸아미노)-부티레이트, 도데실 N,N-디메틸아미노 이소프로피오네이트, 도데실 2-(디메틸아미노)프로피오네이트, EO-5-올레일 에스테르, 에틸 아세테이트, 에틸아세토 아세테이트, 에틸 프로피오네이트, 글리세롤 모노에테르, 글리세롤 모노라우레이트, 글리세롤 모노올레에이트, 글리세롤 모노리놀레에이트, 이소프로필 이소스테아레이트, 이소프로필 리놀레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 이소프로필 미리스테이트/지방산 모노글리세리드 조합물, 이소프로필 미리스테이트/에탄올/L-락트산 (87 : 10 : 3) 조합물, 이소프로필 팔미테이트, 메틸 아세테이트, 메틸 카프레이트, 메틸 라우레이트, 메틸 프로피오네이트, 메틸 발레레이트, 1-모노카프로일 글리세롤, 모노글리세리드 (중간 사슬 길이), 니코틴성 에스테르 (벤질), 옥틸 아세테이트, 옥틸 N,N -디메틸아미노 아세테이트, 올레일 올레에이트, n -펜틸 N- 아세틸프로리네이트, 프로필렌 글리콜 모노라우레이트, 소르비탄 디라우레이트, 소르비탄 디올레에이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리올레에이트, 슈크로스 코코넛 지방산 에스테르 혼합물, 슈크로스 모노라우레이트, 슈크로스 모노올레에이트 및 테트라데실 N,N-디메 아미노 아세테이트; 지방산 예컨대 알칸산, 카프르산, 이산, 에틸옥타데칸산, 헥산산, 젖산, 라우르산, 리놀에라드산, 리놀레산, 리놀렌산, 네오데칸산, 올레산, 팔미트산, 펠라곤산, 프로피온산 및 백센산; 지방산 알코올 에테르, 예컨대 α-모노글리세릴 에테르, EO-2-올레일 에테르, EO-5-올레일 에테르, EO-10-올레일 에테르 및 폴리글리세롤 및 알코올의 에테르 유도체 (1-O-도데실-3-O-메틸-2-O-(2',3'-디하이드록시프로필) 글리세롤); 생물학적 제제, 예컨대 L-α-아미노산, 레시틴, 인지질, 사포닌/인지질, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로콜레이트 및 나트륨 타우로글리코콜레이트; 효소, 예컨대 산 포스파타제, 칼로나제, 오르겔라제, 파파인, 포스포리파제 A-2, 포스포리파제 C 및 트리아실글리세롤 하이드롤라제; 아민 및 아미드, 예컨대 아세트아미드 유도체, 비고리상 아미드, N-아다만틸 n-알칸아미드, 클로피브르산 아미드, N,N- 디도데실 아세트아미드, 디-2-에틸헥실아민, 디에틸메틸 벤즈아미드, N,N- 디에틸-m-톨루아미드, N-디메틸-m-톨루아미드, 에토멘 S12 [비스-(2-하이드록시에틸)올레일아민], 헥사메틸렌 라우르아미드, 라우릴-아민(도데실아민), 옥틸 아미드, 올레일아민, 불포화 고리상 우레아 및 우레아; 착화제, 예컨대 β- 및 γ-사이클로덱스트린 착물, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 리포좀, 나프탈렌 디아미드 디이미드 및 나프탈렌 디에스테르 디이미드; 거대고리, 예컨대 거대고리상 락톤, 케톤 및 무수물 (최적의 고리 16개) 및 불포화 고리상 우레아; 고전적인 계면활성제, 예컨대 브리즈 30, 브리즈 35, 브리즈 36T, 브리즈 52, 브리즈 56, 브리즈 58, 브리즈 72, 브리즈 76, 브리즈 78, 브리즈 92, 브리즈 96, 브리즈 98, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 엠피콜 ML26/F, HCO-60 계면활성제, 하이드록시폴리에톡시도데칸, 이온성 계면활성제 (ROONa, ROSO3Na, RNH3Cl, R = 8 내지 16), 라우로일 사르코신, 비이온성 계면활성제, 논옥시놀, 옥토옥시놀, 페닐설포네이트 CA, 플루로닉 F68, 플루로닉 F 127, 플루로닉 L62, 폴리올레에이트 (비이온성 계면활성제), 레우오팔 HV 10, 소듐 라우레이트, 소듐 라우릴 설페이트 (소듐 도데실설페이트), 소듐 올레에이트, 소르비탄 디라우레이트, 소르비탄 디올레에이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 트리라우레이트, 소르비탄 트리올레 에이트, 스판 20, 스판 40, 스판 85, 신페로닉 NP, 트리톤 X-100, 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 80 및 트윈 85; N- 메틸피롤리돈 및 관련 화합물, 예컨대 N-고리헥실-2-피롤리돈, 1-부틸-3-도데실-2-피롤리돈, 1,3-디메틸-2-이미다졸리키논, 1,5 디메틸-2-피롤리돈, 4, 4-디메틸-2-운데실-2-옥사졸린, 1-에틸-2-피롤리돈, 1-헥실-4-메틸옥시카르보닐-2-피롤리돈, 1-헥실-2-피롤리돈, 1-(2-하이드록시에틸)피롤리디논, 3-하이드록시-N-메틸-2-피롤리디논, 1-이소프로필-2-운데실-2-이미다졸린, 1-라우릴-4-메틸옥시카르보닐-2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈, 폴리(N-비닐피롤리돈), 피로글루탐산 에스테르 및 2-피롤리돈(2-피롤리디논); 이온성 화합물, 예컨대 아스코르베이트, 양극 성 양이온 및 음이온, 칼슘 티오글리콜 레이트, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 3,5-디요오도살리실레이트 소듐, 라우로일 콜린 요오다이드, 5-메톡시살리실레이트 소듐, 모노알킬 포스페이트, 2-PAM 클로라이드, 4-PAM 클로라이드 (N-메틸 피콜리늄 클로라이드), 소듐 카르복실레이트 및 소듐 히알루로네이트; 디메틸 석폭사이드 및 관련 화합물, 예컨대 고리상 설폭사이드, 데실메틸 설폭사이드, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 및 2-하이드록시 운데실 메틸 설폭사이드; 용매 및 관련 화합물, 예컨대 아세톤, n-알칸 (7 내지 16개의 사슬 길이), 사이클로헥실-1,1- 디메틸에탄올, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 에탄올, 에탄올/d-리모넨 조합물, 2-에틸-1,3-헥산디올, 에톡시디글리콜 (트랜스쿠톨), 글리세롤, 글리콜, 라우릴 클로라이드, 리모넨, N-메틸포름아미드, 2-페닐에탄올, 3-페닐-1-프로판올, 3-페닐-2-프로펜-1-올, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에스테르, 폴리프로필렌 글리콜, 1차 알코올 (트리데칸올), 프로필렌 글리콜, 스쿠알렌, 트리아세틴, 트리클로로에탄올, 트리플루오로에탄올, 트리메틸렌 글리콜 및 자일 렌; 아존 및 관련 화합물, 예컨대 N-아세틸-헥사하이드로-2- 옥소-1H-아제핀, N-알킬-디하이드로-1,4-옥사제핀-5,7-디온, N-알킬몰포린-2,3-디온, N-알칼몰포린-3,5- 디온, 아자사이클로알칸 유도체 (-케톤, -티온), 아자사이클로알케논 유도체, 1-[2-(데실티오)에틸]아자사이클로펜탄-2-온 (HPE-101), N- (2,2-디하이드록시에틸)도데실아민, 1-도데칸오일헥사하이드로-1-H-아제핀, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온 (AZONE 또는 라우로카프람), N-도데실디에탄올아민, N-도데실-헥사하이드로-2-티오-1H-아제핀, N- 도데실-N-(2-메톡시에틸)아세트아미드, N-도데실-N-(2-메톡시에틸)이소부티르아미드, N-도데실-피페리딘-2-티온, N-도데실-2-피페리디논, N-도데실 피롤리딘-3,5-디온, N-도데실 피롤리 -2-티온, N-도데실-2-피롤리돈, 1-파메실아자사이클로헵탄-2-온, 1-파메실아자사이클로펜탄-2-온, 1-제라닐아자사이클로헵탄-2-온, 1-제라닐아자사이클로펜탄-2-온, 헥사하이드로-2-옥소-아제핀-1-아세트산 에스테르, N-(2-하이드록시에틸)-2-피롤리돈, 1-라우릴아자사이클로헵탄, 2-(1-노닐)-1,3-디옥솔란, 1-N-옥틸아자사이클로펜탄-2-온, N-(1-옥소도데실)-헥사하이드로-1H-아제핀, N-(1-옥소도데실)-몰폴린, 1-옥소하이드로카빌-치환된 아자사이클로헥산, N-(1-옥소테트라데실)-헥사하이드로-2-옥소-1H-아제핀 및 N-(1-티오도데실)-몰포린; 기카, 예컨대 지방족 티올, 알킬 N, N-디알킬-치환된 아미노 아세테이트, 아니스 오일, 항콜린성 제제 전처리, 아스카리돌, 이중상 기 유도체, 비사보롤, 카다몬 오일, 1-카르 본, 체노포듐 (70% 아스카리돌), 체노포듐 오일, 1,8 시네올 (유칼립톨), 대구 간유 (지방산 추출물), 4-데실옥사졸리딘-2-온, 디사이클로헥실메틸아민 옥사이드, 디에틸 헥사데실포스포네이트, 디에틸 헥사데실포스포르아미데이트, N, N-디메틸 도데실아민-N-옥사이드, 4, 4-디메틸-2-운데실-2-옥사 졸린, N-도데칸오일-L-아미노산 메틸 에스테르, 1,3-디옥사사이클로알칸 (SEPA), 디티오트레이톨, 유칼립톨 (시네올), 유칼립투스 오일, 유젠올, 허브 추출물, 락탐 N-아세트산 에스테르, N-하이드록시에탈라세아미드, N-하이드록시에틸아세트아미드, 2-하이드록시-3-올레오일 옥시-1-피로 글루타밀옥시프로판, 멘톨, 멘톤, 몰포린 유도체, N-옥사이드, 네롤리돌, 옥틸-
Figure pct00005
-D-(티오)글루코피 라노시드, 옥사졸리디논, 피페라진 유도체, 극성 지질, 폴리디메틸실록산, 폴리[2-(메틸설피닐)에틸 아크릴레이트], 폴리로탁산, 폴리비닐벤질디메틸알 암모늄 클로라이드, 폴리(N-비닐-N-메틸 아세트 아미드), 소듐 피로글루타미네이트, 테르펜 및 아자사이클로 고리 화합물, 비타민 E (α-토코페롤), 비타민 E TPGS 및 일랑일랑 오일을 포함한다. 상기에 나열되지 않은 침투 증강제의 추가적인 예는 "약제학적 부형제의 핸드북", 제 5판, Pharmaceutical Press, 2006에서 찾아볼 수 있고, 글리코퓨롤, 라놀린, 경질 미네랄 오일, 미리스트산, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 및 티몰을 포함할 수 있다. 침투 증강제의 다른 예는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 디에틸렌 글리콜, 모노에틸 에테르, 시트르산, 숙신산, 보라지 오일, 테트라하이드로피페린 (THP), 메탄올, 에탄올, 프로판올, 옥탄올, 벤질 알코올, 미리스틸 알코올, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올 및 폴리에틸렌 글리콜 모노라우레이트를 포함한다.
일부 구현예에서, 국소 조성물은 알코올, C1-C4 지방족 알코올 및/또는 C1-C5 지방족 알코올을 포함한다. 다른 구현예에서, 소수성 조성물은 C1-C4 지방족 알코올 및/또는 C1-C5 지방족 알코올이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 국소 조성물은 휘발성 용매를 포함한다. 다른 구현예에서, 국소 조성물은 휘발성 용매가 없거나, 이를 포함하지 않는다. 휘발성 용매는 "비산" 용매로도 알려져 있다. 휘발성 용매의 비제한적인 예는 휘발성 알코올, 예컨대 C1 내지 C4 지방족 알코올; C1 내지 C5 알코올; 및 휘발성 C1 내지 C4 지방족 케톤, 예컨대 아세톤을 포함한다.
일부 구현예에서, 국소 조성물은 계면활성제를 포함한다. 다른 구현예에서, 국소 조성물은 계면활성제가 없거나, 이를 포함하지 않는다. 용어 "계면활성제" 또는 "표면 활성제"는 물의 표면 장력을 낮추거나 2개의 비혼화성 물질 사이의 계면 장력을 감소시키는 능력을 나타내는 화합물 또는 물질 또는 물질을 의미하며, 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양극성 및/또는 인지질 계면활성제를 포함한다. 계면활성제의 비제한적인 예는 본원에 참고문헌으로 통합되는 맥쿠천 에멀전화제 및 세제, 2001 북아메리카 개정판, The Manufacturing Confectioner Publishing Co.에서, 또한 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제 화장품 성분 사전 및 핸드북 (INCI), 제 12판, 2008에서 찾아볼 수 있다. 이러한 예는 다음을 포함하나 이제 한정되지는 않는다: 블록 중합체, 예로 폴록사머 124; 에톡실화된 알코올, 예로 세테트-2, 세테아레스-20, 라우레스-3; 에톡실화된 지방 에스테르 및 오일, 예로 PEG-40 수소화된 피마자유, PEG-36 피마자유, PEG-150 디스테아레이트; 글리세롤 에스테르, 예로 폴리글리세 릴-3 디이소스테아레이트, 글리세릴 스테아레이트; 글리콜 에스테르, PEG-12 디올레에이트, LEXEMUL P; 포스페이트 에스테르, 예로 세틸 포스페이트; 중합체 계면활성제, 예로 PVM/MA 공중합체, 아크릴레이트/C10-30 알킬 아크릴레이트 교차 중합체; 사차 계면활성제, 예로 세트리모늄 클로라이드; 실리콘계 계면활성제, 예로 PEG/PPG-20/6 디메티콘; 소르비탄 유도체, 예로 소르비탄 스테아레이트, 폴리소르베이트 80; 슈크로스 및 포도당 에스테르 및 유도체, 예로 PEG-20 메틸글루코스 세스퀴스테아레이트; 및 알콜의 설페이트, 예로 소듐 라우릴 설페이트. 보다 일반적으로, 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 비이온성, 양극성과 같은 이온성 유형에 의해 분류될 수 있다. 이들은 또한 블록 중합체, 에톡실화된 알코올, 에톡실화된 지방산 에스테르 및 오일, 글리세롤 에스테르, 글리콜 에스테르, 포스페이트 에스테르, 중합체성 계면활성제, 사차 계면활성제, 실리콘계 계면활성제, 소르비탄 유도체, 슈크로스 및 포도당 에스테르 및 유도체 및 알코올의 설페이트과 같은 화학 구조에 의해 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, 국소 조성물은 알부민과 같은 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 국소 조성물은 알부민과 같은 단백질이 없거나, 이를 포함하지 않는다.
일 구현예에서, 국소 조성물은 소수성 담체, 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체 및 탁산 입자를 포함하는 소수성 조성물이며, 탁산 입자의 평균 입자 크기 (수)는 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론이다. 추가의 구현예에서, 소수성 담체는 바셀린, 미네랄 오일 또는 파라핀 왁스 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 추가의 구현예에서, 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체는 조성물의 5 내지 25 중량％ 농도의 사이클로메티콘이다. 추가의 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자이다.
4. 탁산 입자 국소 조성물에서 탁산 입자의 농도
국소 조성물 중의 탁산 입자의 농도 또는 양은 조성물이 악성 종양에 국소 투여될 때 대상체에서 생체내 면역학적 반응을 자극하기 위한 "유효량"이다. 탁산 입자의 농도는 총 조성물 중량의 0.05 내지 10 중량%일 수 있거나, 탁산 입자의 농도는 0.05 내지 5 중량%일 수 있거나, 탁산 입자의 농도는 0.1 내지 5 중량%일 수 있거나, 탁산 입자의 농도는 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.75, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.25, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.75, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.25, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.75, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.25, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.75, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.25, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.75, 4.8, 4.9, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 중량% 또는 이에서 도출가능한 임의의 백분율일 수 있다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 나노입자, 도세탁셀 나노입자 또는 카바지탁셀 나노입자이다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자이다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 조성물 중 약 0.05 내지 약 3 중량% 미만, 또는 약 0.05 내지 약 2 중량% 미만, 또는 약 0.05 내지 약 1 중량% 미만, 또는 약 0.05 내지 약 0.3 중량% 미만, 또는 약 0.05 내지 약 0.2 중량% 미만, 또는 약 0.05 내지 약 0.15 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 5 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 4 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 3 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 2 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 1 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 0.3 중량% 미만, 또는 약 0.1 내지 약 0.2 중량% 미만, 또는 약 0.15 내지 약 5 중량% 미만, 또는 약 0.15 내지 약 4 중량% 미만, 또는 약 0.15 내지 약 3 중량% 미만, 또는 약 0.15 내지 약 2 중량% 미만, 또는 약 0.15 내지 약 1 중량% 미만, 또는 약 0.15 내지 약 0.3 중량% 미만, 또는 약 0.3 내지 약 5 중량% 미만, 또는 약 0.3 내지 약 4 중량% 미만, 또는 약 0.3 내지 약 3 중량% 미만, 또는 약 0.3 내지 약 2 중량% 미만, 또는 약 0.3 내지 약 1 중량% 미만, 또는 약 1 내지 약 5 중량% 미만, 또는 약 1 내지 약 4 중량% 미만, 또는 약 1 내지 약 3 중량% 미만, 또는 약 1 내지 약 2 중량% 미만, 또는 약 0.2 내지 약 0.4 중량% 미만, 또는 약 0.5 내지 약 1.5 중량% 미만, 또는 약 1.5 내지 약 2.5 중량% 미만, 또는 약 2 내지 약 5 중량% 미만, 또는 약 2 내지 약 4 중량% 미만, 또는 약 2 내지 약 3 중량% 미만, 또는 약 0.2 내지 약 0.4 중량% 미만, 또는 약 0.5 내지 약 1.5 중량% 미만, 또는 약 1.5 내지 약 2.5 중량% 미만의 농도일 수 있다. 다른 구현예에서, 탁산 입자의 농도는 1 중량％의 80 내지 120% (즉, 0.8 내지 1.2 중량％), 또는 0.05 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.1 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.15 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.2 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.25 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.3 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.35 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.4 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.45 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.5 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.55 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.6 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.65 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.7 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.75 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.8 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.85 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.9 중량％의 80 내지 120%, 또는 0.95 중량％의 80 내지 120%, 또는 1.5 중량％의 80 내지 120%, 또는 2 중량％의 80 내지 120%, 또는 2.5 중량％의 80 내지 120%, 또는 3 중량％의 80 내지 120%, 또는 4 중량％의 80 내지 120%, 또는 5 중량%의 80 내지 120%이다.
B. 폐 투여, 종양내 (IT) 주사, 복강내 (IP) 주사, 방광내 점적주입 (방광) 및/또는 조직 내로 직접 주사를 위한 탁산 조성물
폐 투여, 종양내 (IT) 주사 및/또는 복강내 (IP) 주사, 방광내 점적주입 (방광) 및/또는 전립선 조직, 방광 조직 및 신장 조직과 같은 종양 주변의 조직 내로 직접 주사에 적합한 조성물은 탁산을 포함하고, 하기에 설명된다. 조성물은 담체를 추가로 포함할 수 있다. 조성물은 무수성일 수 있고, 무수성 담체를 포함한다. 담체는 액체 (유체) 담체, 예컨대 수용성 담체일 수 있다. 적합한 수용성 담체의 비제한적인 예는 주사 USP용 멸균수와 같은 물; 주사 USP용 0.9% 염화나트륨과 같은 0.9% 식염수 용액 (정상 식염수); 주사 USP용 5% 덱스트로스와 같은 덱스트로스 용액; 및 주사 USP용 락토스 첨가한 링거액을 포함한다. 비-수용성계 액체 담체 및 다른 수용성계 액체 담체가 사용될 수 있다. 담체는 약제학적으로 허용가능한 담체, 즉 주사, 폐 투여 또는 다른 투여 경로에 의해 대상체에게 투여에 적합한 것일 수 있다. 담체는 임의의 다른 유형의 액체, 예컨대 에멀젼 또는 유동성 반-고체일 수 있다. 유동성 반-고체의 비제한적인 예는 겔 및 열경화성 겔을 포함한다. 본 조성물은 현탁액, 즉 현탁액 용량 형태 조성물일 수 있고, 탁산 입자는 연속된 담체 및/또는 희석제 내에 분산 (현탁)된다. 탁산 입자는 완벽하게 분산되고, 부분적으로 분산되고, 부분적으로 용해될 수 있지만, 담체에 완벽하게 용해되지는 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 연속된 담체 내에 분산된 탁산 입자의 현탁액이다. 바람직한 구현예에서, 담체는 약제학적으로 허용가능한 담체이다. 다른 구현예에서, 조성물은 무균성이다. 다양한 구현예에서, 조성물은 탁산 입자 및 액체 담체를 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나, 구성되며, 여기서 조성물은 액체 담체 내에 분산된 탁산 입자의 현탁액이다. 일부 구현예에서, 조성물은 탁산 및 담체로 필수적으로 구성되거나 구성되며, 여기서 담체는 수용성 담체이고, 조성물은 현탁액이다.
탁산 입자와 담체의 조성물은 제공된 그대로 투여될 수 있다. 선택적으로, 탁산 입자와 담체의 조성물은 탁산 입자의 원하는 농도 (용량)을 달성하기 위해 조성물을 희석하는데 적합한 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 희석제로서 작용할 수 있고; 또 다른 방식을 언급하면, 조성물 중 담체의 양은 조성물 중의 탁산 입자의 원하는 농도를 제공하고, 추가의 희석은 필요하지 않다. 적합한 희석제는 수용성 유체와 같은 유체일 수 있다. 적합한 수용성 희석제의 비제한적인 예는 주사 USP용 멸균수와 같은 물; 주사 USP용 0.9% 염화나트륨과 같은 0.9% 식염수 용액 (정상 식염수); 주사 USP용 5% 덱스트로스와 같은 덱스트로스 용액; 및 주사 USP용 락토스 첨가한 링거액을 포함한다. 주사로 투여하는데 적합한 다른 액체 및 수용성계 희석제가 사용될 수 있고, 선택적으로 염, 완충제 및/또는 다른 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 희석제는 멸균된다. 본 조성물은 탁산 입자의 원하는 농도 용량을 제공하는 비율로 희석제로 희석될 수 있다. 예를 들어, 조성물 대 희석제의 부피 비율은 1:1 내지 1:100 v/v의 범위 또는 다른 적합한 비율일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 탁산 입자, 담체, 및 희석제를 포함하고, 여기서 담체 및 희석제는 혼합물을 형성하고, 조성물은 담체/희석제 혼합물에 분산된 탁산 입자의 현탁액이다. 일부 구현예에서, 담체/희석제 혼합물은 연속된 상이고, 탁산 입자는 분산된 상이다.
본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 기능성 성분 예컨대 완충액, 염, 삼투 제제, 계면활성제, 점도 개질제, 유동학 개질제, 현탁화제, pH 조정제, 예컨대 알칼리화제 또는 산성화제, 긴장성 조정제, 보존제, 사차 암모늄 화합물, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는 항미생물제, 진통제, 산화방지제, 거품제거제, 알코올, 킬레이팅제 및/또는 착색제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 탁산 입자 및 물, 염, 계면활성제 및 선택적으로 완충제를 포함하는 담체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 담체는 수용성 담체이고, 계면활성제를 포함하며, 여기서 계면활성제의 농도는 w/w 또는 w/v 기준으로 1% 이하이고; 다른 구현예에서, 계면활성제는 0.5% 미만, 0.25% 미만, 0.1% 미만, 또는 약 0.1%이다. 다른 구현예에서, 수용성 담체는 계면활성제 GELUCIRE® (모노-, 디- 및 트리글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르로 구성된 폴리에틸렌 글리콜 글리세리드) 및/또는 CREMOPHOR® (폴리에톡실화된 피마자유)를 제외한다. 일부 구현예에서, 조성물 또는 담체는 중합체, 단백질 (예컨대, 알부민), 폴리에톡실화된 피마자유 및/또는 모노-, 디- 및 트리글리세리드 및 폴리에틸렌 글리콜의 모노- 및 디에스테르로 구성된 폴리에틸렌 글리콜 글리세리를 제외한다.
본 조성물, 담체 및/또는 희석제는 하나 이상의 계면활성제를 포함할 수 있다. 적합한 계면활성제는 예로서 이에 한정되지 않고 폴리소르베이트, 라우릴 설페이트, 아세틸화된 모노글리세리드, 디아세틸화된 모노글리세리드 및 폴록사머, 예컨대 폴록사머 407을 포함한다. 폴리소르베이트는 소르비톨 및 이의 무수물의 각각 몰에에 대해 대략 20, 5 또는 4 몰의 에틸렌 옥사이드와 공중합된 소르비톨 및 이의 무수물의 일련의 부분 지방산 에스테르인 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이다. 폴리소르베이트의 비제한적인 예는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 21, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 61, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 81, 폴리소르베이트 85 및 폴리소르베이트 120이다. 대략 20 몰의 에틸렌 옥사이드를 함유하는 폴리소르베이트는 친수성 비이온성 계면활성제이다. 대략 20 몰의 에틸렌 옥사이드를 함유하는 폴리소르베이트의 예는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85 및 폴리소르베이트 120을 포함한다. 폴리소르베이트는 상표명 TWEEN??으로 크로다사로부터 시판되어 입수가능하다. 폴리소르베이트의 수 지정은 TWEEN의 수 지정에 해당하며, 예를 들어, 폴리소르베이트 20은 트윈 20, 폴리소르베이트 40은 트윈 40, 폴리소르베이트 60은 트윈 60, 폴리소르베이트 80은 트윈 80 등이다. 폴리소르베이트의 USP/NF 등급은 폴리소르베이트 20 NF, 폴리소르베이트 40 NF, 폴리소르베이트 60 NF 및 폴리소르베이트 80 NF를 포함한다. 폴리소르베이트는 PhEur 등급 (유럽 약전), BP 등급 및 JP 등급으로도 입수가능하다. 용어 "폴리소르베이트"은 비독점적인 명칭이다. 폴리소르베이트 20의 화학명은 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노라우레이트이다. 폴리소르베이트 40의 화학명은 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노팔미테이트이다. 폴리소르베이트 60의 화학명은 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노스테아레이트이다. 폴리소르베이트 80의 화학명은 폴리옥시에틸렌 20 소르비탄 모노올레에이트이다. 일부 구현예에서, 본 조성물, 담체 및/또는 희석제는 폴리소르베이트의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 조성물, 담체 및/또는 희석제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60, 폴리소르베이트 65, 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 85 및/또는 폴리소르베이트 120을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 40, 폴리소르베이트 60 및/또는 폴리소르베이트 80을 포함한다. 일 구현예에서, 본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 탁산 입자, 담체 및 선택적으로 희석제를 포함하고, 여기서 담체 및/또는 희석제는 물 및 폴리소르베이트를 포함한다. 일 구현예에서, 본 조성물은 탁산 입자의 현탁액이고, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80이다. 다른 구현예에서, 폴리소르베이트 또는 폴리소르베이트 80은 약 0.01 부피% 내지 약 1.5 부피%의 농도로 조성물, 담체 및/또는 희석제에 존재한다. 본 발명자들은 놀랍게도, 인용된 매우 소량의 폴리소르베이트 80이 탁산 입자 및 수용성 담체 (예컨대, 식염수 용액)의 계면에서 표면 장력을 감소시키는 것을 발견하였다. 이들 구현예는 전형적으로 조성물의 사용 시간 근처에서 제형화된다. 일부 구현예에서, 입자는 폴리소르베이트 또는 폴리소르베이트 80으로 코팅될 수 있다. 다른 구현예에서, 입자는 폴리소르베이트 또는 폴리소르베이트 80으로 코팅되지 않는다. 다양한 다른 구현예에서, 폴리소르베이트 또는 폴리소르베이트 80은 다음 범위의 농도로 조성물, 담체 및/또는 희석제에 존재한다: 약 0.01 부피% 내지 약 1 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.5 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.4 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.35 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.3 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.25 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.2 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.15 부피%, 약 0.01 부피% 내지 약 0.1 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 1 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.5 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.4 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.35 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.3 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.25 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.2 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.15 부피%, 약 0.05 부피% 내지 약 0.1 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 1 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.5 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.4 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.35 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.3 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.25 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.2 부피%, 약 0.1 부피% 내지 약 0.15 부피%, 약 0.2 부피% 내지 약 1 부피%, 약 0.2 부피% 내지 약 0.5 부피%, 약 0.2 부피% 내지 약 0.4 부피%, 약 0.2 부피% 내지 약 0.35 부피%, 약 0.2 부피% 내지 약 0.3 부피%, 약 0.2 부피% 내지 약 0.25 부피%, 약 0.3 부피% 내지 약 1 부피%, 약 0.3 부피% 내지 약 0.5 부피%, 약 0.3 부피% 내지 약 0.4 부피%, 약 0.3 부피% 내지 약 0.35 부피%, 약 0.01 부피%, 약 0.05 부피%, 약 0.1 부피%, 약 0.15 부피%, 약 0.16 부피%, 약 0.2 부피%, 약 0.25 부피%, 약 0.3 부피%, 약 0.35부피%, 약 0.4 부피%, 약 0.45 부피%, 약 0.5 부피% 또는 약 1 부피%.
본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 하나 이상의 긴장성 조정제를 포함할 수 있다. 적합한 긴장성 조정제는 예로서 이에 한정되지 않고, 하나 이상의 무기 염, 전해질, 염화나트륨, 염화칼륨, 인산나트륨, 인산칼륨, 황산나트륨, 황산칼륨, 중탄산나트륨 및 중탄산칼륨 및 알칼리토금속 염, 예컨대 알칼리토금속 무기 염, 예로 칼슘 염, 및 마그네슘 염, 만니톨, 덱스트로스, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 하나 이상의 완충제를 포함한다. 적합한 완충제는 예로서 이에 한정되지 않고, 이염기성 인산나트륨, 일염기성 인산나트륨, 시트르산, 소듐 시트레이트, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄, 비스(2-하이드록시에틸)이미노트리스-(하이드록시메틸)메탄 및 탄산수소나트륨 및 당업자에게 공지된 기타를 포함한다. 완충제는 일반적으로 복강내 용도를 위해 pH를 바람직한 범위로 조정하는데 사용된다. 일반적으로 pH 약 5 내지 9, 5 내지 8, 6 내지 7.4, 6.5 내지 7.5, 또는 6.9 내지 7.4가 바람직하다.
본 조성물, 담체 및/또는 희석제는 하나 이상의 윤활제를 포함할 수 있다. 윤활제는 점막, 예컨대 본원의 복막 및 장기를 감싸는 막을 덮는 수딩 필름을 형성하는 제제이다. 윤활제는 가벼운 통증 및 염증을 경감시킬 수 있고, 때로 점막보호제로 언급된다. 적합한 윤활제는 본원에 기재된 또 다른 중합체성 윤활제와 함께 사용될 때, 약 0.2 내지 약 2.5% 범위의 셀룰로스 유도체, 예컨대 카르복시메틸셀룰로스 소듐, 하이드록시에틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 및 메틸셀룰로스; 약 0.01%의 젤라틴; 약 0.05 내지 약 1%의 폴리올, 예컨대 약 0.05 내지 약 1%의 글리세린, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 400 및 프로필렌 글리콜; 약 0.1 내지 약 4%의 폴리비닐 알코올; 약 0.1 내지 약 2%의 포비돈; 및 약 0.1%의 덱스트란 70을 포함한다.
본 조성물, 담체 및/또는 희석제는 pH를 조정하기 위해 하나 이상의 알칼리화제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "알칼리화제"는 알칼리성 매질을 제공하는데 사용된 화합물을 의미하도록 의도된다. 이러한 화합물은, 예로서 이에 한정되지 않고, 암모니아 용액, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 및 수산화나트륨 및 당업자에게 공지된 기타를 포함한다.
본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 pH를 조정하기 위해 하나 이상의 산성화제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "산성화제"는 산성 매질을 제공하는데 사용된 화합물을 의미하도록 의도된다. 이러한 화합물, 예로서 이에 한정되지 않고, 아세트산, 아미노산, 시트르산, 질산, 푸마르산 및 다른 알파 하이드록시산, 염산, 아스코르브산, 질산 및 당업자에게 공지된 기타를 포함한다.
본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 하나 이상의 거품제거제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "거품제거제"는 충전 조성물의 표면 상에 형성되는 발포를 방지하거나 이의 양을 감소시키는 화합물 또는 화합물들을 의미하도록 의도된다. 적합한 거품제거제는 예로서 이에 한정되지 않고, 디메티콘, 시메티콘, 옥톡시놀 및 당업자에게 공지된 기타를 포함한다.
본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 현탁액의 점도를 증가시키거나 감소시키는 하나 이상의 점도 개질제를 포함할 수 있다. 적합한 점도 개질제는 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 만니톨, 폴리비닐피롤리돈, 가교결합된 아크릴산 중합체, 예컨대 카보머 및 당업자에게 공지된 다른 것을 포함한다. 본 조성물, 담체, 및/또는 희석제는 디바이스, 예컨대 주입 바늘 또는 튜브를 통해 적절하게 흐를 수 있도록 조성물의 유동 특성을 변형시키기 위한 유동학 개질제를 추가로 포함할 수 있다. 점도 및 유동학 개질제의 비제한적인 예는 "Rheology Modifiers Handbook - Practical Use and Application" Braun, William Andrew Publishing, 2000에서 찾아볼 수 있다.
폐 투여, 종양내 주사, 복강내 주사, 방광내 점적주입 또는 조직 내로 직접 주사를 위한 국소 조성물 중의 탁산 입자의 농도 또는 양은 조성물이 국소 투여될 때 대상체에서 생체내 면역학적 반응을 자극하기 위한 "유효량"에 있다. 일 구현예에서, 조성물 중의 탁산 입자의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL이다. 다양한 추가의 구현예에서, 조성물 중의 탁산 입자의 농도는 다음의 범위 약 0.5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 75 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 50 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 30 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 25 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 25 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 약 2 mg/mL 내지 약 5 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 1 mg/mL 내지 약 2 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 0.5 mg/mL 내지 약 1 mg/mL, 약 0.1 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 약 3 mg/mL 내지 약 8 mg/mL 또는 약 4 mg/mL 내지 약 6 mg/mL이거나; 적어도 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 61, 65, 70, 75 또는 100 mg/mL이거나; 약 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 61, 65, 70, 75 또는 100 mg/mL이다. 탁산 입자는 투여된 유일한 치료제일 수 있거나, 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다.
다양한 구현예에서, 조성물은 탁산 입자 (파클리탁셀 입자 또는 도세탁셀 입자), 담체 및 희석제를 포함하며, 조성물 (담체 및 희석제를 포함함) 중 탁산 입자의 농도는 다음의 범위이다: 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 5 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 15 mg/mL, 약 6 mg/mL 내지 약 10 mg/mL, 약 10 mg/mL 내지 약 20 mg/mL, 또는 약 10 mg/mL 내지 약 15 mg/mL; 또는 약 6 mg/mL, 약 10 mg/mL 또는 약 15 mg/mL. 추가의 구현예에서, 담체는 약 0.9% 염화나트륨 용액과 같은 식염수 용액일 수 있는 수용성 담체이고, 희석제는 약 0.9% 염화나트륨 용액과 같은 식염수일 수 있는 수용성 희석제이다. 추가의 구현예에서, 수용성 담체는 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 80을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 중합체/공중합체 또는 생체적합성 중합체/공중합체가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물은 단백질이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 알부민이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 히알루론산이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 히알루론산과 탁산의 컨쥬게이트가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 히알루론산과 파클리탁셀의 컨쥬게이트가 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다. 본 발명의 일부 양태에서, 조성물은 폴록사머, 폴리음이온, 폴리양이온, 개질된 폴리음이온, 개질된 폴리양이온, 키토산, 키토산 유도체, 금속 이온, 나노벡터, 폴리감마-글루탐산 (PGA), 폴리아크릴산 (PAA), 알긴산 (ALG), 비타민 E-TPGS, 디메틸 이소소르비드 (DMI), 메톡시 PEG 350, 시트르산, 항-VEGF 항체, 에틸셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리무수물, 폴리하이드록시산, 폴리포스파젠, 폴리오르토에스테르, 폴리에스테르, 폴리아미드, 다당류, 폴리단백질, 스티렌-이소부틸렌-스티렌 (SIBS), 폴리무수물 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리(비스(P-카르복시 펜옥시)프로판-세박산, 폴리(d,l-락트산) (PLA), 폴리(d,l-락트산-코-글리콜산) (PLAGA) 및/또는 폴리(D,L-락트-코-글리콜산 (PLGA)이 없거나, 이를 포함하거나 함유하지 않는다.
일 구현예에서, 폐 투여, 종양내 주사 및/또는 복강내 주사에 적합한 조성물은 탁산 입자 및 액체 담체를 포함하고, 여기서 탁산 입자는 평균 입자 크기 (수)가 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론이다. 추가의 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자이다. 추가의 바람직한 구현예에서, 액체 담체는 수용성 담체이다.
C. 탁산 입자 조성물의 국소 투여 방법
대상체에게 탁산 입자 조성물의 투여는 국소 투여를 통해 이루어진다. 탁산 입자를 포함하는 조성물의 직접 종양에 국소 투여는 국소 적용, 폐 투여, 종양내 주사, 종양 주위 주사, 방광내 점적주입 (방광) 및 복강내 주사를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본원 및 본 발명 전반에 걸쳐 기술된 국소 투여를 위한 조성물은 다양한 유형의 국소 투여, 즉 국소 적용, 폐 투여, 종양내 주사 및 복강내 주사에 사용하는데 적합한 조성물이다.
조성물은 단일 용량의 단일 투여 (주기)로 또는 단일 용량의 2회 이상의 개별 투여 (2회 이상 주기)로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 14일째 또는 적어도 이들 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 2 내지 12주, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 12, 3 내지 11, 3 내지 10, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 3 내지 4, 4 내지 12, 4 내지 11, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 4 내지 5, 5 내지 12, 5 내지 11, 5 내지 10, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 5 내지 6, 6 내지 12, 6 내지 11, 6 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 6 내지 7, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 7 내지 8, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 8 내지 9, 9 내지 12, 9 내지 11, 9 내지 10, 10 내지 12, 10 내지 11, 11 내지 12, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12주 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 2 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 3, 3 내지 5, 3 내지 4, 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상의 개별 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 적어도 2주 동안 주 1회 투여된다. 다른 구현예에서, 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1주 동안 주 2회 투여되고, 여기서 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1일 간격을 둔다. 일부 구현예에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6회 또는 그 이상의 개별 투여로 투여된다. 다른 구현예에서, 조성물은 7회 이상의 개별 투여로 투여된다. 일부 구현예에서, 방법은 종양의 제거 (박멸)를 유도한다.
1. 탁산 입자 조성물의 국소 적용 방법
일부 구현예에서, 탁산 입자 조성물의 국소 투여는 이에 의해 조성물이 대상체의 환부에 국소적으로 적용되는 국소 투여이고, 여기서 고형 종양은 피부 악성 종양이다. 피부 악성 종양은 피부암 또는 피부 전이일 수 있다. 일부 구현예에서, 종양은 대상체의 신체에서 유일한 암이다. 다른 구현예에서, 대상체는 또한 신체의 다른 곳에 암을 갖는다. 피부 종양 또는 피부 악성 종양의 "환부"는 피부 악성 종양이 피부의 최외곽 표면 또는 피부 표면 바로 아래에 보이는 피부의 적어도 일부 (상피/진피를 포함함)를 포함할 수 있고, 가시적으로 검출가능하지 않은 전임상 병변을 포함할 수 있는 피부 악성 종양에 근접한 피부 영역을 포함할 수 있다. 피부 악성 종양은 피부암 또는 피부 전이일 수 있다. 일부 구현예에서, 피부 악성 종양은 피부 전이이다. 다른 구현예에서, 피부 악성 종양은 피부암이다. 피부 전이는 다양한 원발성 암, 예컨대 다음의 원발성 암의 비제한적인 예로부터 나올 수 있다: 유방암, 폐암, 비암, 부비동암, 후두암, 구강, 결장암 (대장암), 직장암, 위암, 난소암, 고환암, 방광암, 전립선 암, 자궁 경부암, 질암, 갑상샘 암, 자궁 내막암, 신장암, 식도암, 췌장암, 간암, 흑색종 및 카포시 육종 (AIDS 관련 카포시 육종을 포함함). 일부 구현예에서, 피부 전이는 폐암, 유방암, 결장암, 구강암, 난소암, 신장암, 식도암, 위암 또는 간암으로부터 나온다. 일부 구현예에서, 피부 전이는 유방암으로부터 나온다. 피부암의 비제한적인 예는 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 및 카포시 육종을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 추가적인 피부 지향 요법, 예컨대 전기화학 요법 (ECT), 광역학 요법 (PDT), 방사선 요법 (RT) 또는 병변내 요법 (ILT)을 포함하지 않는다.
피부 전이의 환부에 국소적으로 적용되는 조성물의 양은 환부의 크기 및 조성물 중 탁산 입자의 농도에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 환부를 완전히 피복하도록대략 다임의 두께로 적용될 수 있다. 적용될 조성물의 양을 결정하기 위한 또 다른 적합한 방법은 "핑거-팁 유닛" (FTU) 접근법이다. 하나의 FTU는 성인의 손가락 끝을 따라 표준 튜브로부터 짜낸 국소 성분의 양이다 (튜브가 표준 5 mm 노즐을 갖는 것으로 가정함). 손가락 끝은 손가락 말단부터 손가락의 첫 주름까지이다. 조성물은 장갑을 낀 손 또는 주걱 또는 다른 국소 투여 수단으로 적용될 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 온전한 피부 커버링 (상피/진피 커버링)을 갖는 피부 악성 종양에 적용된다. 일부 구현예에서, 조성물은 피부 악성 종양 병변이 피부 표면에 있거나 피부 커버링이 저하되고 피부 악성 병변이 노출되는 궤양성 영역에 적용된다. 환부는 물 (및 필요한 경우 연성 비누)로 가만히 세척하고 적용 전에 건조될 수 있다. 일단 조성물이 적용되면, 적용 부위는 TEGADERM® 또는 SOLOSITE®와 같은 폐쇄성 드레싱으로 도포될 수 있다. 조성물의 용량은 달라질 수 있지만, 일반적으로 상태가 개선되거나 제거될 때까지 매일 거의 동일한 시간에 매일 1회, 2회 또는 3회 적용을 포함할 수 있다.
2. 탁산 입자 조성물의 폐 투여 방법
일부 구현예에서, 국소 투여는 탁산 입자 조성물이 흡입되는 폐 투여이고, 고형 종양은 폐 종양이다. 일부 구현예에서, 대상체는 신체의 다른 영역에서 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 폐 종양은 중피종이다. 악성 폐 종양은 폐 내에 존재하는 임의의 종양이며, 원발성 또는 전이성 폐 종양일 수 있다. 악성 폐 종양의 비제한적 예는 소세포 폐 암종 (SCLC) 및 비소세포 폐 암종 (NSCLC)을 포함한다. 일 구현예에서, 악성 폐 종양은 SCLC이다. 또 다른 구현예에서, 악성 폐 종양은 NSCLC이다. 본 발명의 방법에 따른 탁산 입자의 폐 투여는 폐에서 탁산의 체류 시간이 임의의 다른 탁산 제형물을 사용하여 이전에 가능했던 것보다 훨씬 더 긴 것으로 밝혀졌다. 다음의 실시예에 나타낸 바와 같이, 탁산은 투여 이후 적어도 96시간 (4일) 또는 적어도 336시간 (14일) 동안 대상체의 폐 조직에서 검출가능한 상태로 유지된다. 다양한 추가의 구현예에서, 탁산은 대상체의 폐 조직에서 투여 이후 적어도 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312, 324 또는 336시간 동안 검출가능한 상태로 유지된다. 일부 구현예에서, 암성 폐 질환은 신체에서 유일한 암이다. 일부 구현예에서, 대상체는 신체의 다른 영역에서 암성 폐 질환 및 암을 갖는다.
본 발명의 일 특정한 구현예에서, 폐 투여는 탁산 입자를 포함하는 조성물의 흡입, 예컨대 비강, 구강 흡입 또는 둘 다를 포함한다. 본 구현예에서, 탁산 입자를 포함하는 조성물은 에어로졸 (즉, 기체성 매질에서 탁산 입자의 안정한 분산액 또는 현탁액의 액체 비말)로 제형화될 수 있다. 에어로졸 조성물로서 전달된 탁산 입자는 중력 침강, 관성 충돌 및/또는 확산에 의해 기도에 침착될 수 있다. 가압식 정량 투약 흡입기 (pMDI), 분무기 및 연무 흡입기를 포함하나 이에 한정되지 않는 에어로졸을 생성하기 위한 임의의 적합한 장치가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 건조 분말 형태일 수 있고, 건조 분말 흡입기 (DPI)에 사용될 수 있다. 약물 입자는 전형적으로 DPI 장치에서 캡슐에 배치된다. 작동 시, 캡슐이 파열되고 건조 분말의 구름이 방출된다. 약물 분말은 원하는 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD)으로 조정될 수 있지만 가장 일반적인 관행은 작은 약물 분말을 폐 전달을 위한 락토스와 같은 담체와 배합하는 것이다. 약물 입자는 정적 접착에 의해 락토스 입자에 부착된다. 폐 전달용 락토스는 약 2.5 마이크론과 같은 원하는 MMAD로 크기가 정해질 수 있다. 만니톨과 같은 다른 당도 사용될 수 있다.
일 특정한 구현예에서, 방법은 분무화를 통해 에어로졸화된 탁산 입자를 포함하는 조성물의 흡입을 포함한다. 분무기는 일반적으로 압축된 공기 또는 초음파 전력을 사용하여 에어로졸 입자를 포함하는 조성물의 흡입가능한 에어로졸 비말을 생성한다. 본 구현예에서, 분무화는 탁산 입자를 포함하는 조성물의 에어로졸 비말의 대상체에 대한 폐 전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자이다. 적합한 분무기는 호스피탁 압축된 공기 제트 분무기이다.
또 다른 구현예에서, 방법은 pMDI를 통해 에어로졸화된 탁산 입자를 포함하는 조성물의 흡입을 포함하고, 탁산 입자를 포함하는 조성물은 적합한 추진제 시스템 (계량 밸브로 밀봉된 가압 용기에 적어도 하나의 액화 기체를 함유하는 하이드로플루오로알칸 (HFA)을 포함하나 이에 한정되지 않음)에 현탁된다. 밸브의 작동은 탁산 입자를 포함하는 조성물의 계량된 용량의 에어로졸 스프레이의 전달을 초래한다. 일부 구현예에서, 탁산 입자는 파클리탁셀 입자이다.
탁산 입자를 포함하는 조성물은 투여를 위해 에어로졸화되는 구현예에서, 탁산 입자를 포함하는 조성물의 에어로졸 비말의 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD)은 본원에 개시된 방법에 사용하는데 적합한 임의의 직경일 수 있다. 일 구현예에서, 에어로졸 비말은 약 0.5 μm 내지 약 6 μm 직경의 MMAD를 갖는다. 다양한 추가의 구현예에서, 에어로졸 비말은 약 0.5 μm 내지 약 5.5 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 5 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 4.5 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 4 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 3.5 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 3 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 2.5 μm 직경, 약 0.5 μm 내지 약 2 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 5.5 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 5 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 4.5 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 4 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 3.5 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 3 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 2.5 μm 직경, 약 1 μm 내지 약 2 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 5.5 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 5 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 4.5 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 4 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 3.5 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 3 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 2.5 μm 직경, 약 1.5 μm 내지 약 2 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 5.5 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 5 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 4.5 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 4 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 3.5 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 3 μm 직경, 약 2 μm 내지 약 2.5 μm 직경의 MMDA를 갖는다. 일부 구현예에서, 에어로졸 비말은 약 0.5 μm 내지 약 6 μm 직경, 또는 약 1 μm 내지 약 3 μm 직경, 또는 약 2 μm 내지 약 3 μm 직경의 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD)을 갖는다. 에어로졸 방울의 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD) 및 기하학적 표준 편차 (GSD)를 측정하는데 적합한 장비는 머서 스타일 케스케이드 충격기는 7 단계 에어로졸 샘플러이다.
3. 탁산 입자 조성물의 종양내 (IT) 주사 방법
일부 구현예에서, 탁산 입자 조성물의 국소 투여는 조성물이 고형 종양 내로 직접 주사되는 종양내 주사이다. 본원에 사용된 "고형 종양"은 보통 낭종 또는 액체 영역을 포함하지 않는 비정상적인 조직 덩어리이다. 고형 종양은 양성 (암이 아님) 또는 악성 (암)일 수 있다. 다른 유형의 고형 종양은 이들을 형성하는 세포의 유형으로 명명된다. 고형 악성 종양의 예는 육종, 암종 및 림프종이다. 일 특정한 구현예에서, 고형 종양은 악성 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 악성 고형 종양은 대상체의 신체에서 유일한 암이다. 다른 구현예에서, 대상체는 신체의 다른 영역에서 악성 고형 종양 및 암을 갖는다.
본원에 사용된 "종양 내로 직접 주사되는" 또는 "종양내 주사 (IT)"는 현탁액과 같은 조성물의 일부 또는 전부가 종양 덩어리 내로 주사되는 것을 의미한다. 당업자에 의해 이해될 바와 같이, 이러한 직접 주사는 조성물 또는 이의 현탁액의 양이 너무 많아서 고형 종양 덩어리 내로 모두 직접 주사될 수 없으면, 고형 종양 주변 상에 ("종양 주위로") 현탁액 예를 들어 약물과 같은 조성물의 일부 부분의 주사를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 조성물 또는 이의 현탁액은 전부가 고형 종양 덩어리 내로 주사된다. 또 다른 구현예에서, 조성물 또는 이의 현탁액은 종양 주변의 조직 내로 (종양 주위로) 주사된다. 본원에 사용된 종양은 뼈 및 연조직 전이를 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 덩어리 및 종양 전이 둘 다를 포함한다.
종양 내로 탁산 입자의 조성물의 종양내 주사는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다. 비제한적인 구현예에서, 주사는 자기 공명 촬영 - 직장통과 초음파 융합 (MR-TRUS) 유도 (예를 들어 전립선 종양 주사용) 또는 내시경 초음파 유도된 미세바늘 주사 (EUS-FNI)를 통해 수행될 수 있다. 적합한 종양내 주사 방법 및 조성물은 본원에 참고문헌으로 통합되는 국제특허출원 PCT/US17/25718에 개시되어 있다.
다양한 구현예에서, 고형 종양은 육종, 암종 및 림프종, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 폐 종양, 피부 종양, 림포이드, 위장 종양 또는 신장 종양으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 고형 종양은 전립선 종양이고, 화학치료제 입자는 파클리탁셀 또는 도세탁셀 입자이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 고형 종양은 난소 종양이고, 화학치료제 입자는 파클리탁셀 또는 도세탁셀 입자이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 고형 종양은 유방 종양이고, 화학치료제 입자는 도세탁셀 입자이다. 또 다른 특정한 구현예에서, 고형 종양은 췌장 종양이고, 화학치료제 입자는 파클리탁셀 또는 도세탁셀 입자이다. 임의의 이들 구현예에서, 종양은 예를 들어 샘암종일 수 있다.
4. 탁산 입자 조성물의 복강내 (IP) 주사 방법
일부 구현예에서, 탁산 입자 조성물의 국소 투여는 조성물이 복강 내로 주사되는 복강내 주사 투여이고, 종양은 복강내 장기 종양이다. 복강내 장기는 위, 회장, 공장, 횡단 결장, 맹장, 에스자형 결장, 비장, 간, 췌장 말단, 십이지장의 처음 5 센티미터 및 직장의 상위 삼분의 일 부분 을 포함한다. 여성에서는, 복강이 개방되고 생식 기관과 소통하기 때문에 (난관이 이러한 소통을 촉진함), 자궁, 난소, 나팔관 및 생식선 혈관은 모두 복강내에 있으며 본 발명의 목적으로 복강내 장기로서 포함된다.
종양 내로 탁산 조성물의 복강내 주사는 당업자에게 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 달성될 수 있다. 적합한 복강내 주사 방법 및 조성물은 본원에 참고문헌으로 통합되는 미국 특허 8221779에 개시되어 있다. 복강내 주사에 적합한 방법은 주사기를 통한 주사, 포트를 통한 주입 및 외과적 투여를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
부 구현예에서, 악성 고형 종양은 난소암, 자궁암, 위암, 결장암, 비장암, 간암, 대장암 및/또는 췌장암이다. 일부 구현예에서, 종양은 난소 종양이다.
도 1은 제형 F1 내지 F7에 대해 표피 내로 시험관내 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다.
도 2는 제형 F6* (반복 분석) 및 F8 내지 F13에 대해 표피 내로 시험관내 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다.
도 3은 제형 F1 내지 F7에 대해 진피 내로 시험관내 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다.
도 4는 제형 F6* (반복 분석) 및 F8 내지 F13에 대해 진피 내로 시험관내 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다.
도 5는 피부 전이 연구에서 기준선 (1일)에 4기 유방암에 걸린 여성의 가슴 상에서 피부 전이성 병변의 사진을 나타낸다.
도 6은 피부 전이 연구에서 국소 치료 동안 8일째 4기 유방암에 걸린 여성의 가슴 상에서 피부 전이성 병변의 사진을 나타낸다.
도 7은 피부 전이 연구에서 국소 치료 동안 15일째 4기 유방암에 걸린 여성의 가슴 상에서 피부 전이성 병변의 사진을 나타낸다.
도 8a는 피부 전이 연구의 연구 종결 시 국소 치료 동안 29일째 4기 유방암에 걸린 여성의 가슴 상에서 피부 전이성 병변의 사진을 나타낸다.
도 8b는 피부 전이 연구에서 국소 치료가 종결되고 2주 이후 43일째 4기 유방암에 걸린 여성의 가슴 상에서 피부 전이성 병변의 사진을 나타낸다.
도 9는 흡입 연구로부터의 6.0 mg/mL 나노입자 파클리탁셀 (nPac) 제형물의 공기역학적 직경의 플롯을 나타낸다.
도 10은 흡입 연구로부터의 20.0 mg/mL 나노입자 파클리탁셀 (nPac) 제형물의 공기역학적 직경의 플롯을 나타낸다.
도 11은 흡입 연구로부터 시간 경과 시 파클리탁셀의 혈장 수준의 그래프를 나타낸다.
도 12는 흡입 연구로부터 시간 경과 시 파클리탁셀의 폐 조직 수준의 그래프를 나타낸다.
도 13은 흡입 연구로부터 시간 경과 시 동물 체중의 그래프를 나타낸다.
도 14는 흡입 연구로부터 시간 경과 시 동물 체중 변화의 그래프를 나타낸다.
도 15는 흡입 연구로부터 시간 경과 시 파클리탁셀의 혈장 수준의 그래프를 나타낸다.
도 16은 흡입 연구로부터 시간 경과 시 파클리탁셀의 폐 조직 수준의 그래프를 나타낸다.
도 17은 동소이식 폐암 연구로부터 시간 경과 시 동물 체중의 그래프를 나타낸다.
도 18은 동소이식 폐암 연구로부터 시간 경과 시 동물 체중 변화의 그래프를 나타낸다.
도 19는 동소이식 폐암 연구로부터 동물 폐 무게의 플롯을 나타낸다.
도 20은 동소이식 폐암 연구로부터 동물 폐 대 체중 비율의 플롯을 나타낸다.
도 21은 동소이식 폐암 연구로부터 동물 폐 대 뇌 무게 비율의 플롯을 나타낸다.
도 22는 동소이식 폐암 연구로부터 평균 종양 면적의 그래프를 나타낸다.
도 23은 동소이식 폐암 연구로부터 평균 종양 면적의 플롯을 나타낸다.
도 24는 동소이식 폐암 연구로부터 종양 퇴행의 플롯을 나타낸다.
도 25는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리의 주요 특징. (2×).
도 26은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 미분화된 세포의 주요 특징.
도 27은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 미분화된 세포의 주요 특징.
도 28은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐포 공간 내의 덩어리를 나타내는 폐 종양 덩어리 내의 미분화된 세포의 주요 특징. a(20×).
도 29는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 초기 세포의 주요 특징. b(10×).
도 30은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 초기 세포의 주요 특징. b(20×).
도 31은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 초기 세포의 주요 특징. b(40×).
도 32는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 초기 세포의 주요 특징. b(40×).
도 33은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0 세기관지의 현미경 사진을 나타낸다. 세기관지 내에 나타나는 미분화된 세포의 주요 특징. c(20×).
도 34는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0 샘의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 선포 샘 분화의 주요 특징. d(10×).
도 35는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 1006 (대조군), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0 샘의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리 내의 선포 샘 분화의 주요 특징. d(20×).
도 36은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2001 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-2, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 세기관지 아래를 누르고 혈관내 침범의 증거를 보여주지 않는 폐 종양 덩어리의 주요 특징. (2×).
도 37은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2001 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-2, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 세기관지 아래를 누르고 혈관내 침범의 증거를 보여주지 않는 폐 종양 덩어리의 주요 특징. (4×).
도 38은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2001 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-2, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 세기관지 아래를 누르는 폐 종양 덩어리의 주요 특징. (10×).
도 39는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2003 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-1, 초기-1, 퇴행-1의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (4×).
도 40은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2003 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-1, 초기-1, 퇴행-1의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (10×).
도 41은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2003 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-1, 초기-1, 퇴행-1의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (20×).
도 42는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2003 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-1, 초기-1, 퇴행-1의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. 가장자리를 따라 림프구와 대식세포를 유의한다. 1(40×).
도 43은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2003 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-1, 초기-1, 퇴행-1의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. 가장자리를 따라 림프구와 대식세포를 유의한다. 2(40×).
도 44는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2003 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-1, 초기-1, 퇴행-1의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. 더 큰 거품과 색소가 있는 대식세포를 유의한다. 2, 2×(40×).
도 45는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2010 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리의 주요 특징. (2×).
도 46은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2010 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리의 주요 특징. (20×).
도 47은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 2010 (Ⅳ 아브락산®), 샘암종-3, 초기-1, 퇴행-0의 현미경 사진을 나타낸다. 폐 종양 덩어리의 주요 특징. 가장자리를 따라 대식세포의 세심한 증거를 유의한다. (40×).
도 48은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 4009 (IH nPac 1× 높음), 샘암종-0, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 완벽한 퇴행을 거친 폐 종양 덩어리의 특징. (2×).
도 49는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 4009 (IH nPac 1× 높음), 샘암종-0, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 완벽한 퇴행을 거친 폐 종양 덩어리의 특징. 간질 섬유증을 유의한다. (10×).
도 50은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 4009 (IH nPac 1× 높음), 샘암종-0, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 완벽한 퇴행을 거친 폐 종양 덩어리의 특징. 간질 섬유증 및 가장자리를 따라 림프구 및 대식세포를 유의한다. (40×).
도 51은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 5010 (IH nPac 2× 낮음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-3의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (2×).
도 52는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 5010 (IH nPac 2× 낮음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-3의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (10×).
도 53은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 5010 (IH nPac 2× 낮음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-3의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (20×).
도 54는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 5010 (IH nPac 2× 낮음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-3의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (40×).
도 55는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 6005 (IH nPac 2× 높음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. (2×).
도 56은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 6005 (IH nPac 2× 높음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. 간질 섬유증 및 가장자리를 따라 림프구 및 대식세포를 유의한다. (10×).
도 57은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 6005 (IH nPac 2× 높음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 퇴행을 거치는 폐 종양 덩어리의 특징. 가장자리를 따라 림프구와 대식세포를 유의한다. (20×).
도 58은 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 6005 (IH nPac 2× 높음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 가장자리를 따라 림프구와 대식세포를 유의한다. (40×).
도 59는 H & E 염색된 동소이식 폐암 조직 슬라이드 - 6005 (IH nPac 2× 높음), 샘암종-1, 초기-0, 퇴행-4의 현미경 사진을 나타낸다. 폐포 내에서 잔류 종양 세포의 중심 영역의 존재 여부를 유의한다. 2(40×).
도 60은 동소이식 폐암 조직 슬라이드 (대조군)의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. 상단 행: H & E 염색된 절편. 하단 행: 케라틴 또는 CD11b로의 면역조직화학적 염색.
도 61은 동소이식 폐암 조직 슬라이드 (Ⅳ 아브락산®)의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. 상단 행: H & E 염색된 절편. 하단 행: 케라틴 또는 CD11b로의 면역조직화학적 염색.
도 62는 동소이식 폐암 조직 슬라이드 (흡입된 nPac)의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. H & E 염색, 트리크롬, 케라틴 및 CD11b로의 다양한 염색.
도 63은 TLS의 존재를 보여주는 동소이식 폐암 조직 슬라이드의 현미경 사진을 나타낸다.
도 64는 방광암 이종이식 연구로부터 시간 경과 시 평균 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 화살표는 투여 지점을 나타낸다.
도 65는 방광암 이종이식 연구로부터 운반체 3주기에 대한 시간 경과 시 개별 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 투여 지점을 나타낸다.
도 66은 방광암 이종이식 연구로부터의 도세탁셀 Ⅳ 3주기에 대한 시간 경과 시 개별 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 투여 지점을 나타낸다.
도 67은 방광암 이종이식 연구로부터 나노입자 도세탁셀 (nDoce) IT 1주기에 대한 시간 경과 시 개별 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 단일 투여 지점을 나타낸다.
도 68은 방광암 이종이식 연구로부터 nDoce IT 2주기에 대한 시간 경과 시 개별 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 투여 지점을 나타낸다.
도 69는 방광암 이종이식 연구로부터 nDoce IT 3주기에 대한 시간 경과 시 개별 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 투여 지점을 나타낸다.
도 70은 방광암 이종이식 연구로부터 1일 치료 시 종양 부피와 비교하여 연구 종료 시 종양 부피의 산점도를 나타낸다.
도 71은 방광암 이종이식 연구로부터 시간 경과 시 평균 체중의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 화살표는 투여 지점을 나타낸다.
도 72는 방광암 이종이식 연구로부터의 각각의 투여군에 대한 61일째 평균 종양 부피의 그래프를 나타낸다.
도 73은 방광암 이종이식 연구로부터의 종양 이식 27일, 40일 및 61일 이후에 각각의 투여군으로부터의 동물 사진을 나타낸다.
도 74는 방광암 이종이식 연구로부터의 nDoce 1주기, 2주기 및 3주기에 대한 종양 조직에서 도세탁셀 농도의 그래프를 나타낸다.
도 75는 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT 운반체 대조군의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 2.52×.
도 76은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT 운반체 대조군의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 77은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT 운반체 대조군의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 25.2×.
도 78은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - Ⅳ 도세탁셀 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 2.52×.
도 79는 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - Ⅳ 도세탁셀 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 80은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - Ⅳ 도세탁셀 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 25.2×.
도 81은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT nDoce 2주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 2.52×.
도 82는 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT nDoce 2주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 83은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT nDoce 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 2.52×.
도 84는 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT nDoce 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 2.52×.
도 85는 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT nDoce 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 25.2×.
도 86은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT 운반체 대조군 3주기 F4/80 염색의 현미경 사진을 나타낸다. 배율 2.52×.
도 87은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - Ⅳ 도세탁셀 3주기 F4/80 염색의 현미경 사진을 나타낸다. 배율 2.52×.
도 88은 방광암 이종이식 조직 슬라이드 - IT nDoce 3주기 F4/80의 현미경 사진을 나타낸다. 배율 2.52×.
도 89는 방광암 이종이식 조직 슬라이드의 대조군 사례의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. H & E 염색 및 CD68 염색.
도 90은 방광암 이종이식 조직 슬라이드의 IT nDoce 사례의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. 상단 행: 1주기 nDoce (1×). 두 번째 열: 2주기의 nDoce 처리 (2×). 세 번째 열: 2주기의 nDoce 처리 (2×). 네 번째 열: 3주기의 nDoce 처리 (2×).
도 91은 미처리된 암컷 래트로부터의 신장 세포 샘암종 이종이식 조직 슬라이드의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 92는 암컷 래트로부터의 신장 세포 샘암종 이종이식 조직 슬라이드 - 운반체 대조군 (IT) 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 93은 암컷 래트로부터의 신장 세포 샘암종 이종이식 조직 슬라이드 - 도세탁셀 용액 (Ⅳ) 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 94는 암컷 래트로부터의 신장 세포 샘암종 이종이식 조직 슬라이드 - nDoce (IT) 3주기의 현미경 사진을 나타낸다. H&E. 배율 6.3×.
도 95는 신장 세포 샘암종 이종이식 조직 슬라이드의 대조군 사례의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. 상단 행: H & E 염색된 절편. 하단 행: 면역조직화학적 염색.
도 96은 신장 세포 샘암종 이종이식 조직 슬라이드의 IT nDoce 사례의 다양한 현미경 사진을 나타낸다. 상단 행: 1주기 nDoce (1×). 두 번째 행: 1주기 nDoce (1×). 세 번째 행: 2주기 nDoce (2×). 네 번째 행: 2주기 nDoce (2×). 다섯 번째 행: 3주기 nDoce (3×).
도 97은 신장 세포 샘암종 이종이식 연구로부터의 nPac 래트 실험군의 시간 경과 시 평균 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 투여 지점을 나타낸다.
도 98은 신장 세포 샘암종 이종이식 연구로부터의 nDoce 래트 실험군의 시간 경과 시 평균 종양 부피의 그래프를 나타낸다. x 축 상의 삼각형은 투여 지점을 나타낸다.
도 99는 마우스에서 36 mg/kg nPac 투약된 IP로부터의 복막액 및 혈장에서 시간 경과 시 파클리탁셀 농도의 그래프를 나타낸다.
도 100은 마우스에서 36 mg/kg nDoce 투약된 IP로부터의 복막액 및 혈장에서 시간 경과 시 도세탁셀 농도의 그래프를 나타낸다.
도 101은 마우스에서 36 mg/kg 아브락산® 및 탁솔® 투약된 IP로부터의 혈장에서 시간 경과 시 파클리탁셀 농도의 그래프를 나타낸다.
도 102는 마우스에서 36 mg/kg 아브락산® 및 탁솔® 투약된 IP로부터의 복막액에서 시간 경과 시 파클리탁셀 농도의 그래프를 나타낸다.
도 103은 렌카 유전적 동계 이종이식 연구로부터의 실험군 1 내지 7에 대한 평균 종양 부피 결과의 그래프를 나타낸다.
도 104는 렌카 유전적 동계 이종이식 연구로부터의 실험군 1 내지 7에 대한 34일째 평균 종양 부피 결과의 그래프를 나타낸다.
도 105는 렌카 유전적 동계 이종이식 연구로부터의 실험군 8 내지 10에 대한 이식 12일 내지 20일 (+/- 1) 이후에 평균 종양 부피 결과의 그래프를 나타낸다.
도 106은 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 생존 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 CD45+ 세포의 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 107은 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 CD45+ 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 CD4+ T 세포의 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 108은 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 CD45+ 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 CD8+ T 세포의 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 109는 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 CD45+ 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 MDSC 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 110은 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 CD45+ 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 Treg 세포의 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 111은 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 CD45+ 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 M1 대식세포의 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 112는 렌카 유전적 동계 이종이식 연구에서 유세포　분석에 의해 결정되는 바와 같이, 총 CD45+ 세포의 백분율로서 표현되는 각각의 동물 및 각각의 제형 투여에 대한 혈액에서 M2 대식세포의 백분율의 그래프를 나타낸다.
실시예
본 발명은 구체적인 실시예를 통해 보다 자세하게 설명될 것이다. 다음의 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 본 발명을 임의의 방식으로도 제한하려는 것은 아니다. 당업자는 필수적으로 동일한 결과를 수득하도록 변경되거나 변형될 수 있는 다양한 비임계 파라미터를 쉽게 인식할 것이다.
실시예 1 - 파클리탁셀 입자의 입자 크기, SSA 및 벌크 밀도 분석
표 1 (실시예 2) 및 표 7 (실시예 3)에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트의 입자 크기는 아큐사이저 780을 사용하여 다음의 입자 크기 방법에 의해 분석되었다:
장비 파라미터: 최대 농도: 9000개 입자/mL, 용기 번호: 1, 센서 범위: 요약, 하한 검출 한계: 0.5 μm, 유속: 30 mL/분, 분석 풀 번호: 4, 풀 간격: 1초, 풀 부피: 10 mL, 용기 부피: 1 mL, 프라임 부피: 1 mL, 제 1 풀 포함: 선택하지 않음.
시료준비: 파클리탁셀 입자 API의 스쿠프를 깨끗한 20 mL 바이알에 넣고 대략 3 mL의 여과된 (0.22 μm) 0.1 중량％ SDS 용액을 첨가하여 API를 적신 다음 바이알의 잔여부를 SDS 용액으로 채웠다. 5 내지 10분 동안 볼텍싱하고, 1분 동안 물 수조에서 초음파 처리하였다.
방법: 여과된 (0.22 μm) 0.1 중량％ SDS 용액으로 플라스틱 병을 채우고, 배경을 분석 하였다. 소량의 파클리탁셀 입자 시료 현탁액, < 100 μL를 교반하면서 0.1 중량％ SDS 용액의 병에 피펫팅하고; 아큐사이저 유입 튜브를 병에 넣고 장비를 통해 시료를 전개하였다. 필요에 따라 SDS 용액 또는 파클리탁셀 시료 현탁액을 추가하여 원하는 6000 내지 8000개 입자 계수의 원하는 전개 농도에 도달하였다.
입자 크기 결과 (수-가중된 차등 분포를 기초로 함): 표 1에 열거된 공식에 사용된 파클리탁셀 입자 로트: 평균: 0.861 μm. 표 7에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트: 평균: 0.83 ㎛.
표 1 및 표 7에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트의 특이 표면적 (SSA)을 상기 기술된 브루나우어-엠메트-텔러 ("BET") 등온 방법에 의해 분석하였다. 표 1에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트의 SSA는 41.24 m2/g이었다. 표 7에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트의 SSA는 26.72 m2/g이었다.
표 1에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)는 0.05 g/m3이었다. 표 7에 열거된 제형에 사용된 파클리탁셀 입자 로트의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)는 0.09 g/m3이었다.
실시예 2 - 소수성 담체를 갖는 파클리탁셀 입자의 무수 소수성 국소 조성물
소수성 담체를 갖는 파클리탁셀 입자의 무수 소수성 국소 조성물이 표 1에 열거되어 있다.
Figure pct00006
F4 내지 F13을 제조하는 절차: 사이클로메티콘 (또는 미네랄 오일 (F4) 또는 폼블린 (F7))의 일부로 파클리탁셀 입자의 슬러리를 제조하였다. 바셀린을 52 ± 3
Figure pct00007
로 가열하고 남은 성분을 첨가하고 용융되어 균질해질 때까지 혼합하였다. 파클리탁셀 슬러리를 첨가하고 균질해질 때까지 혼합하였다. 혼합하고 배치를 35
Figure pct00008
이하로 냉각시켰다. 연고가 형성되었다.
무수 소수성 국소 조성물에서 입자의 입자 크기 분석
장비: 아큐사이저 모델 770/770A:
장비 파라미터: 센서: LE 0.5 μm 내지 400 μm, 센서 범위: 요약, 하한 검출 한계: 0.5 μm, 수집 시간: 60초, 채널 번호: 128, 용기 유체 부피: 100 mL, 유속: 60 mL/분, 최대 일치율: 8000개 입자/mL, 시료 용기: 아큐사이저 용기, 시료 계산: 없음, 전압 검출기: 10 V 초과, 입자 농도 계산: 없음, 농도 범위 : 5000 내지 8000개 입자/mL, 자동 데이터 저장: 선택, 배경 차감: 있음, 자동주기의 수: 1.
시료 준비: 섬광 바이알 내에 시료 제형물의 분량을 첨가하였다. 주걱을 사용하여 바이알의 내벽을 따라 시료를 도말하였다. 바이알에 ISOPAR-G?? (C10 내지 11 이소파라핀) 용액 중에 약 20 mL의 2% 레시틴을 첨가하였다. 바이알을 1분 동안 초음파 처리하였다. 시료가 용액에 적절히 분산된 것을 확인하였다.
방법: 시료 용기를 ISOPAR-G 용액에 여과된 (0.22 μm) 2% 레시틴을 채우고, 배경을 분석하였다. 피펫을 사용하여, 준비된 시료의 일부를 교반하면서 용기로 이전시켰다. 5000 내지 8000개 입자/mL의 일치 수준을 제공하기 위해 필요에 따라 시료를 희석시키거나, 용기에 첨가하였다. 장비를 통해 분석을 시작하고 분석을 위해 일치 수준이 5000 내지 8000개 입자/mL임을 확인하였다.
입자 크기 분석의 결과는 하기 표 2 및 표 3에 나타낸다.
Figure pct00009
Figure pct00010
시험관내 피부 침투 확산 연구
프란츠 확산 셀 시스템을 사용하여 온전한 인간 사체 피부 내로 및 이를 통해 제형 F1 내지 F13의 시험관내 피부 투과의 속도 및 정도를 결정하는 연구가 시행되었다. 파클리탁셀의 농도는 다양한 시점에서 확산 셀의 수용체 체임버에서 측정되었다. 확산 연구의 결론에 따라, 피부를 테이프로 벗겨내고 표피 및 진피 층으로 분리하였다. 표피 및 진피 조직의 파클리탁셀을 추출 용매를 사용하여 추출하고 또한 분석하였다.
분석 방법: 파클리탁셀을 분석하기 위해 질량 분광분석법 (MS)이 개발되었다. MS 조건은 하기 표 4와 같았다.
Figure pct00011
프란츠 확산 셀 (FDC) 연구 - 방법론
피부 준비: 온전한 인간 시체 피부는 뉴욕 소방관 조직 은행 (NFFTB)으로부터 구입하였다. 피부를 윗등으로부터 수집하였고, 조직 은행에 의해 ~ 500 μm의 두께로 절단되었다. 조직 은행로부터 피부를 수령한 이후, 피부를 실험일 아침까지 -20℃에서 동결 보관하였다. 사용 전에, 피부를 냉동고에서 꺼내서 실온에서 완전히 해동시켰다. 이어서, 피부를 PBS 수조에 잠시 담가서 잔류 동결 보호제 및 방부제를 제거하였다. 실험 동안 시각적으로 온전한 피부 영역만을 사용하였다. 각각의 연구에 대해, 2개의 별개의 공여자가 사용되었고, 각각의 공여자는 상응하는 3개의 복제물을 가졌다.
수용체 유체 준비: 예비 용해도 데이터의 결과에 기초하여, pH 7.4 및 4 중량% 하이드록실 프로필 베타 사이클로덱스트린 (HPBCD)에서 96 중량% 포스페이트 완충 식염수 ("PBS")의 수용체 유체가 선택되었다. 수용체 유체 (~ 0.4 μg/mL)에서 활성 물질의 용해도는 연구 동안 싱크 조건을 유지하기에 적합한 것으로 나타났다. 진공을 당기면서 ZapCapTM CR 0.2 μm 막을 통해 수용체 유체를 여과시킴으로써 수용체 유체를 탈기시켰다. 여과된 수용체 유체를 진공을 유지하면서 추가적인 20분 동안 교반하여 완벽한 탈기를 보장하였다.
확산 셀 조립: 시체 피부를 냉동고에서 꺼내어 30분 동안 생체-안전성 후드에서 해동시켰다. 포장을 열기 전에 피부를 철저하게 해동시켰다. 시체 피부를 포장에서 제거하고 각질층이 위로 향하게 하여 생체-안전성 후드 카운터탑에 배치하였다. 피부를 김 와이프로 가볍게 두드린 다음, 신선한 PBS를 분사하고, 다시 건조시켰다. 이 과정을 3번 더 반복하여 피부 상에 존재하는 임의의 잔류물을 제거하였다. 이어서, 수용체 웰을 탈기 된 수용체 유체로 충전시켰다. 테프론 코팅된 교반 막대를 각각의 수용체 웰에 첨가하였다. 해동된 시체 피부를 검사하고, 두께가 균일하고 표면에 가시적 손상이 없는 영역만 사용하였다. 피부를 ~ 2 cm × 2 cm 사각형으로 절단하였다. 피부 조각은 공여자 웰 상에 각질층 (SC)이 위로 향하게 중앙에 배치되었다. 피부가 중앙에 있고, 가장자리는 평평하게 두었다. 다음으로 공여체 및 수용체 웰을 정렬하고, 클램프로 고정하였다. 필요한 곳에는 추가적인 수용체 유체를 첨가하였다. 존재하는 임의의 기포는 셀을 기울여서 제거되고, 공기가 시료 포트를 따라 빠져나갔다. 다음으로, 확산 셀을 교반 건조 블록 가열기에 두어 수용체 유체로부터 20분 동안 재수화하였다. 블록 가열기는 연속적 교반을 하면서 실험 내내 32℃로 유지되었다. 피부를 20분 동안 수화시키고 각각의 피부 절편의 장벽 특성을 시험하였다. 일단 막 특성 검토 연구가 완료되면, 전체 수용체 체임버 부피가 수용체 유체로 대체되었다.
제형물 적용 절차: 제형물은 피부 각질층에 적용되었다. 본 연구에는 1회 투약 요법이 사용되었다. 테스트 항목은 양호한 도구인 니키료TM 피펫터를 사용하여 10 μL 용량으로 피부에 적용되었다. 다음으로, 제형물을 유리 막대를 사용하여 피부 표면에 걸쳐 도포하였다. 실험 동안 세포를 덮어두지 않은 채로 방치하였다. 세포 당 파클리탁셀의 이론적인 용량은 하기 표 5에 나타낸다.
Figure pct00012
수용체 유체의 시료화: 3, 6, 12 및 24시간째, 눈금 표시된 해밀턴 유형 주입 주사기를 사용하여 300 ㎕의 시료 분량을 수용체 웰로부터 얻었다. 300 ㎕ 시료 분량을 대체하기 위해 신선한 수용체 배지를 첨가하였다.
테이프 탈락 및 열 분할: 24시간째, 피부가 PBS/에탄올 적신 킴와이프TM를 사용하여 닦았다. 잔류 제형물을 닦아내고 킴와이프TM로 피부를 건조시킨 이후, 각질층을 3회 테이프로 탈락시켰고, 각각의 테이프 탈락은 셀로판 테이프를 균일한 압력으로 피부에 적용하고 테이프를 벗겨내는 것으로 구성되었다. 테이프 스트립을 수집하고 추후 분석을 위해 동결시켰다. 처음 3개의 테이프 스트립은 각질층의 최상층을 제거하고, 추가의 피부 세척 단계로서 작용한다. 활성 물질은 전형적으로 이 영역에서 완전히 흡수된 것으로 고려되지 않는다. 이러한 테이프 스트립은 보통 단지 질량 측정 검정법을 위해 분석된다. 피부를 테이프로 탈락시킨 이후, 각 조각의 표피를 집게 또는 주걱을 사용하여 기저 피부 조직으로부터 분리하였다. 표피 및 진피 조직을 수집하고 4 mL 보로실리케이트 유리 바이알에 넣었다. 모든 피부 조각을 분리한 이후, 추출 용매의 분량을 유리 바이알에 첨가하였다. 이 과정은 2 mL의 DMSO를 바이알에 첨가하고 32℃에서 24시간 동안 배양하는 것으로 구성되었다. 추출 시간이 끝난 이후, 추출액의 300 μL 시료 분량을 수집하고 여과하였다.
시료 분석: 시료 분량을 상기 기재된 바와 같은 분석 방법을 사용하여 파클리탁셀에 대해 분석하였다.
결과:
하기 표 6의 결과는 제형물 F1 내지 F13에 대해 다양한 시점 (경피 플럭스)에서 수용체 유체 중 파클리탁셀 (μg/cm2)의 전달된 용량 및 24시간 경과 이후 표피 및 진피 내로 전달된 (침투) 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 보여준다. 도 1은 제형 F1 내지 F7에 대해 표피로 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다. 도 2는 제형 F6* (반복 분석) 및 F8 내지 F13에 대해 표피로 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다. 도 3은 제형 F1 내지 F7에 대해 진피로 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다. 도 4는 제형 F6* (반복 분석) 및 F8 내지 F13에 대해 진피로 전달된 파클리탁셀 (μg/cm2)의 농도를 그래프로 나타낸다.
참조: 제형 F1 내지 F6은 하나의 시험관내 연구로 시험되었으며, 제형 F6* 및 F8 내지 F13은 상이한 시체 피부 로트를 사용하여 별도의 제 2 시험관내 연구로 시험되었다. 제 2 연구에서 제형 F6의 분석을 반복하여 (F6*로서 표시됨) 제 2 연구에서는 다른 제형과 함께 평가하여 비교할 수 있다.
Figure pct00013
표 6의 결과에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 피부를 통한 파클리탁셀의 경피 플럭스 (표피 및 진피)는 무시할만한 양, 즉 0.01 μg/cm2 미만이었다. 표 6 및 도 1, 도 2, 도 3 및 도 4의 결과에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 파클리탁셀의 피부 내로의 침투 (표피 및 진피)는 수용성 제형물이 피부 침투 증강제 DGME (TRANSCUTOL P)를 함유하더라도 수용성 제형물 (F1 내지 F3)보다 무수 소수성 제형물 (F4 내지 F13)을 사용하여 훨씬 더 높았다. 결과는 또한 사이클로메티콘을 갖는 무수 소수성 제형물이 사이클로메티콘이 없는 무수 소수성 제형물보다 더 큰 피부 침투 (표피 및 진피)를 나타냄을 보여준다. 추가적으로, 결과는 사이클로메티콘을 함유하는 무수 소수성 제형물에 다른 피부 침투 증강제의 첨가가 이들 조성물의 피부 침투 (표피 및 진피)에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 보여준다.
실시예 3 - 피부 전이에 대한 1상/2상 용량 상승, 안전성, 내약성 및 효능 연구
표 7에 나타낸 다음의 연고 제형물을 피부 전이 연구에 사용하기 위해 제조하였다.
Figure pct00014
표 7에 열거된 파클리탁셀 입자를 함유하는 제형을 각각 6 kg 배치 크기로 제조하였다. 다음으로, 제형을 15 gm 라미네이트 튜브에 포장하였다.
로트 F14, F15 및 F16의 제조 공정은 다음과 같다: 바셀린, 미네랄 오일, 파라핀 왁스 및 사이클로메티콘의 일부를 용기에 첨가하고, 프로펠러 믹서로 용융되어 균질해질 때까지 혼합하면서 52 ± 3℃로 가열하였다. 파클리탁셀 나노입자를 사이클로메티콘의 또 다른 부분을 함유하는 용기에 첨가하고, 먼저 주걱으로 혼합하여 나노입자를 적신 다음, 용기를 얼음물 수조에 유지하면서 균질한 슬러리가 얻어질 때까지 S25-25G 분산 도구를 갖는 IKA 울트라 튜랙스 호모지나이저로 혼합하였다. 다음으로, 슬러리를 프로펠러 믹서로 혼합하면서 바셀린/파라핀 왁스 용기에 첨가하고, 이어서 사이클로메티콘의 남은 부분으로 헹구고 52 ± 3℃에서 배치가 시각적으로 균질해질 때까지 혼합하였다. 다음으로, 배치를 실버슨 호모지나이저를 사용하여 균질화하였다. 이후, 균질한 연고가 형성될 때까지 배치를 프로펠러 믹서로 혼합하고, 35℃이하로 냉각시켰다.
로트 F17에 대한 제조 공정은 다음과 같다: 바셀린 및 파라핀 왁스를 용기에 첨가하고, 프로펠러 믹서로 용융되어 균질해질 때까지 혼합하면서 52 ± 3℃로 가열하였다. 파클리탁셀 나노입자를 사이클로메티콘 및 미네랄 오일의 일부분을 함유하는 용기에 첨가하고, 먼저 주걱으로 혼합하여 나노입자를 적신 다음, 용기를 얼음물 수조에 유지하면서 균질한 슬러리가 얻어질 때까지 S25-25G 분산 도구를 갖는 IKA 울트라 튜랙스 호모지나이저로 혼합하였다. 다음으로, 슬러리를 프로펠러 믹서로 혼합하면서 바셀린/파라핀 왁스 용기에 첨가하고, 이어서 미네랄 오일의 남은 부분으로 헹구고 52 ± 3℃에서 배치가 시각적으로 균질해질 때까지 혼합하였다. 다음으로, 배치를 실버슨 호모지나이저를 사용하여 균질화하였다. 이후, 균질한 연고가 형성될 때까지 배치를 프로펠러 믹서로 혼합하고, 35℃이하로 냉각시켰다.
표 7의 각 제형에 대한 화학적 및 물리적 분석 결과는 25℃에서 T = 0, 1개월 및 3개월에 대해 표 8 내지 표 11에 나타낸다.
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
상기 표 7, F14 (0.15%), F16 (1.0%) 및 F17 (2.0%)에서 3가지 제형물은 인간에서 피부 전이에 대해 FDA 승인된 1상/2상 용량 상승, 안전성, 내약성 및 효능 연구에 사용되었다. 연구는 현재 진행 중이다. 이것은 표 7로부터의 3가지 제형물의 안전성, 내약성 및 예비적 효능을 평가하는 1상/2상 공개 라벨 용량 상승 연구이었다: 비-흑색종 피부 전이에 28일 동안 매일 2회 국소적으로 적용된 F14 (0.15%), F16 (1.0%) 및 F17 (2.0%).
적어도 하나의 적격한 병변을 포함하는 몸통 또는 말단에서 50 cm2의 치료 영역은 측정가능한 종양의 RECIST (버전 1.1) 정의 (가장 긴 직경이 10 mm 이상)에 의해 기준선에서 결정되었다. 치료 영역 내의 모든 병변을 캘리퍼로 측정하여 적격성을 검증하였다. 장갑을 착용한 손을 사용하여, 대상체들은 28일 동안 매일 거의 동일한 시간에 매일 2회 50 cm2 처리 영역에 제형물의 한 손가락 끝 단위 (FTU)를 적용하였다. FTU는 성인의 말단 피부 주름부터 집게 손가락 끝까지 적용되는, 5 mm 직경 노즐을 갖는 튜브로부터 나온 연고 제형물의 양으로서 정의된다. 대상체들은 1일째 병원에 용량 적용 훈련 및 첫 번째 치료 적용의 관찰을 위해 참석하였다. 추가적인 방문은 8, 15, 29 및 43일째 이루어졌다. 최종 방문은 부작용을 검토하기 위해 마지막 연구 약물 용량 이후 30일째 이루어졌다. 연구 참여는 용량 증가 단계와 용량 확장 단계로 구분된다.
용량 증가 단계: 용량 증가 단계 동안, 연구는 표준 3 + 3 용량 상승 설계를 따르고, 제형물 F14 (0.15%)로의 치료를 시작하는 3명 대상체의 첫 번째 집단이 있었다. 안전성 모니터링 위원회는 3명 대상체의 집단 각각에서 마지막 대상체가 15일의 치료를 완료한 이후 모든 이용가능한 데이터를 검토하여 용량 증가가 계속될 수 있는지 여부를 결정하였다.
용량 확장 단계: 용량 확장 단계에서, 용량 증가 단계에서 결정된 용량 수준에서 추가적인 대상체가 최대 12명의 총 대상체가 되도록 등록되었다. 용량 확장 단계의 대상체는 동일한 방문일에 병원에 참석하였고 상기 용량 증가 단계와 동일한 평가를 받았다.
목표: 본 연구의 일차 목표는 제형물의 예비적 안전성 및 내약성을 결정하는 것이었다. 이차 목표는 제형물의 예비적 효능을 결정하고, 치료 영역에서의 통증의 잠재적 감소를 연구하며, 전이성 병변에 적용된 제제의 약동학을 설명하는 것이었다.
인구 집단: 비-흑색종 피부 전이가 있는 18세 이상인 최소 2명에서 최대 24명의 남성 및 여성 인간 대상체.
일차 종결점: 부작용, 연구실 평가의 변화, 신체 검사 결과 및 활력 징후에 의해 입증된 안전성 및 내약성.
이차 종결점: 효능에 대한 다음의 이차 종결점의 목적으로, 적격한 병변이 측정가능한 종양의 RECIST (버전 1.1) 정의 (가장 긴 직경이 10 mm 이상)에 의해 기준선에서 결정되었다 (EISENHAUER et al. New response evaluation criteria in solid tumors: 개정된 RECIST 지침 (버전 1.1). European Journal of Cancer. 2009; 45; 228-247).
객관적 종양 반응은 기준선과 43일째 사이의 치료 영역 내의 적격한 종양 직경의 총합 차이로 정의된다 (즉, 용량 요법에 따라 용량 증가 및 확장 단계에서 마지막 용량 후 14일째). 모든 방문에서 종양 표면적 및 반응을 평가하였다. 국립 건강 연구소 (NIH)에서 제공하는 보정된 그리드 측정 시스템 (ImageJ 프리웨어)을 사용하여 표면적의 변화를 평가하였다. 병변을 측정하고 ImageJ를 사용하여 분석하였다.
객관적인 임상 반응은 완전 임상 반응 (CR) + 부분 반응 (PR)을 갖는 대상체로서 정의되고, 제형물로의 마지막 치료 후 14일째 완전 임상 반응 또는 부분 반응을 달성한 환자의 백분율로서 추가로 정의되며, 마지막 치료 후 14일째 치료 영역 내에서 적격한 표적 병변의 가장 긴 직경의 합의 변화로서 측정된다. 처리에 대한 반응은 처리후 총 직경을 처리전 총 직경으로 나눈 함수로 평가되었다.
최고의 전반적 반응은 연구 치료의 개시로부터 치료 종료까지, 즉 43일째에 기록된 최고의 반응으로서 정의된다.
완전 임상 반응 (CR)은 치료 영역 내의 적격한 병변(들)에서 임의의 검출가능한 잔류 질환의 부재로서 정의되고; 부분 반응 (PR)은 기준선과 비교하여 치료 영역 내의 적격한 병변의 직경의 합에서 적어도 30% 감소하고; 진행성 질환 (PD)은 치료 영역 내에서 적격한 병변(들)의 직경의 합이 적어도 20% 증가하며, 연구 상의 가장 작은 합계를 기준으로 한다. 또한, 합계는 적어도 5 mm 이상의 절대 증가를 입증해야 한다. 안정한 질환 (SD)은 PR 또는 PD로 정의된 것 사이의 적격한 병변 직경의 합으로서 정의된다.
이 연구에 참여하는 동안 새로운 비-표적 병변의 출현은 진행성 질환을 구성하지 않는다.
치료 영역에서의 통증은 수치 등급 척도 (NRS-11)에 의해 측정될 것이다. 통증의 변화는 기준선부터 43일째까지 분석될 것이다.
Tmax, Cmax, AUC에 의해 결정된 전신 노출.
예비 결과: 진행 중인 연구의 예비 결과는 4기 유방암에 걸린 여성의 가슴 상에서 피부 전이성 병변의 사진을 포함된다. 유방암에 대해 nab-파클리탁셀로의 Ⅳ 요법을 완료한 이후 대상체를 연구에 등록시켰다. 1개월 후, 치료는 제형물 F14 (0.15%)의 국소 적용에 의해 시작되었다. 도 5는 기준선 (1일째)에서 촬영한 사진이며, 궤양성 병변으로부터 응고된 삼출물로 덮인 인덱스 병변 (살표)을 보여준다. 도 6은 동일한 처리 부위 위에 매일 2회 적용된 제형물 F14 (0.15%)의 국소 처리 후 8일째 촬영한 사진이다. 병변의 표면은 표피 손실 및 진피에 한정된 추정 궤양의 영역을 포함한다. 도 7은 동일한 처리 부위 위에 매일 2회 적용된 제형물 F14 (0.15%)의 국소 처리 후 15일째 사진이다. 소량의 오래된 삼출물이 병변의 중간 부분 상에서 관찰될 수 있을 뿐만 아니라, 명백한 표피 궤양이 전혀 관찰되지 않는다. 도 8a는 동일한 처리 부위 위에 매일 2회 적용된 제형물 F14 (0.15%)의 국소 처리 후 29일째 사진이다. 치료 28일 동안, 대상체의 피부 병변은 홍반으로 둘러싸이고, 국소 면역 반응을 나타내는 궤양 없이 확장되었다 (도 8a). 치료 종료 후 11일째, 대상체는 전신적 파클리탁셀로 다시 치료받았다. 전신적 파클리탁셀로 치료한 후 3일째, 연구 치료가 종료되고 2주 후, 대상체의 병변은 도 8b에 도시된 바와 같이 크기 및 부피가 유의하게 감소하였다. 국소 제형물 F14 (0.15%)로의 국소 치료는 피부 병변을 Ⅳ 파클리탁셀에 대한 후속 반응에 민감하게 만들었다. 병변은 궤양의 증거 없이 상피화되는 것으로 보인다. 대조적으로, 궤양성 피부 유방암 전이의 자연적 병력은 일단 표피 표면이 전형적으로 궤양을 유발하는 종양에 의해 침범되면 신속한 확장 및 진피를 통한 추가의 침투이다. 따라서, 피부 전이성 질환에 대한 치료 제형물의 국소 적용은 환자에게 이점을 제공한다.
실시예 4 - 마우스에서 nPac (예로, 본원에 개시된 바와 같은 파클리탁셀 입자, 실시예 4, 6 및 5에 사용된 0.83 마이크론의 평균 입자 크기 (수), 27.9 m 2 /g의 SSA 및 0.0805 g/cm 3 의 벌크 밀도(태핑되지 않음)를 갖는 대략 98%의 파클리탁셀) 흡입 연구 - 저용량 및 고용량
실행 개요
본 연구의 전반적인 목표는 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL의 nPac 현탁 제형물로 수컷 마우스에 대한 코 전용 흡입 노출을 시행하는 것이었다. 래트 흡입 노출을 각각 65분 동안 시행하였다.
6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL의 nPac 현탁 제형물은 의뢰인이 제공한 지침에 따라 제조되었다. 두 개의 호스피탁 압축 공기 제트 분무기는 설치류 흡입 노출 체임버 내로 nPac 제형물의 에어로졸화를 위해 20 psi에서 동시에 사용되었다. 각각의 노출 동안, 에어로졸 농도는 1.0 ± 0.5 L/분의 유속으로 47-mm GF/A 필터 상에 시료화함으로써 동물 호흡 구역으로부터 측정되었다. 입자 크기는 2.0 ± 0.1 L/분의 유속으로 머서 스타일 캐스케이드 충격기를 사용하여 동물 호흡 구역으로부터 에어로졸을 시료링함으로써 측정되었다. 필터를 중력측정으로 분석하여 총 nPac 에어로졸 농도를 결정하고, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 통해 각각의 노출에 대한 파클리탁셀 에어로졸 농도를 결정하였다. 산소 및 온도를 모니터링하고, 흡입 노출 동안 내내 기록하였다.
6.0 mg/mL nPac 제형물로 시행된 흡입 노출에 대한 평균 총 mPac 에어로졸 농도 및 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 7.43% RSD로 0.25 mg/L 및 10.23% RSD로 85.64 μg/L인 것으로 측정되었다. 캐스케이드 충격기를 사용하여 측정된 평균 질량 평균 공기역학적 직경 (기하학적 표준 편차)은 6.0 mg/mL nPac 제형물 에어로졸에 대해 1.8 (2.0) μm이었다. 20.0 mg/mL nPac 제형물로 시행된 흡입 노출에 대한 평균 총 mPac 에어로졸 농도 및 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 10.95%의 RSD로 0.46 mg/L 및 11.99%의 RSD로 262.27 μg/L인 것으로 측정되었다. 캐스케이드 충격기를 사용하여 측정된 평균 질량 평균 공기역학적 직경 (기하학적 표준 편차)은 20.0 mg/mL nPac 제형물 에어로졸에 대해 2.3 (1.9) μm이었다.
0.38 mg/kg 및 1.18 mg/kg의 평균 파클리탁셀의 침착된 용량은 각각 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL nPac제형물에 대한 65분의 노출에 대해 수학식 1을 사용하여 계산되었다.
제형화 및 흡입 노출
제형물 준비
재료
테스트 항목: 흡입 노출에 사용된 테스트 항목은 다음과 같다:
nPac:
특성: nPac (멸균된 나노미립자 파클리탁셀)
설명: 306 mg/바이알로 전달되는 파클리탁셀의 새로운 건조 분말 제형물
운반체
nPac 제형물의 제조에 사용되는 운반체는 다음과 같다:
1% 폴리소르베이트 80 용액
특성: 주사용 0.9% 염화나트륨 중 멸균된 1% 폴리소르베이트 80
설명: 투명한 액체
정상 식염수 희석제
특성: 주사용 멸균된 0.9% 염화나트륨 USP
설명: 투명한 액체
제형화 및 흡입 노출
제형물 준비
6.0 mg/mL의 nPac 제형물을 다음과 같이 제조하였다: 간략하게, 50 mL의 1% 폴리소르베이트 80을 nPac (306 mg)을 포함하는 바이알에 첨가하였다. nPac 바이알에 존재하는 모든 입자를 적시도록 격렬하게 진탕하고, 뒤집었다. 진탕한 직후, 46 mL의 0.9% 염화나트륨 용액을 nPac 바이알에 첨가하고, 바이알을 적어도 1분 동안 진탕하여 충분한 혼합 및 현탁액의 적절한 분산을 만들었다.
6.0 mg/mL 제형물에 대해 상기 기재된 nPac 제형물 절차를, 6.0 mg/mL 제형물에 사용된 46 mL 대신에 10.3 mL의 0.9% 염화나트륨 용액을 nPac 바이알에 첨가한 점을 제외하고 사용하여 20.0 mg/mL nPac 제형물을 제조하였다.
에어로졸화 작업을 위해 분무기에 배치하기 전에 바이알의 임의의 공기/거품을 감소시키기 위해 생성 된 제형물을 5분 이상 그대로 두었다. 6.0 mg/mL의 최종 제형물을 실온에서 유지하고, 재구성 후 2시간 이내에 분무시켰다. 20.0 mg/mL의 최종 제형물을 실온에서 유지하고, 재구성 후 30분 이내에 분무시켰다.
실험적 설계
30마리의 스프라그 달리 래트를 단일 "임상 기준" 용량의 정맥내 아브락산® (파클리탁셀: 목표 용량 5.0 mg/kg)에 노출시키고, 한 번에 코 전용 흡입에 의해 30마리의 스프라그 달리 래트를 nPac (파클리탁셀: 목표 용량 0.37 ng/kg)에 노출시키고, 30마리의 스프라그 달리 래트를 nPac (파클리탁셀: 목표 용량 1.0 mg/kg)에 노출시켰다. 3마리의 동물 (n = 3)을 혈액 (혈장) 및 폐 조직 수집에 대한 노출 후 0.5 (± 10분), 6 (± 10분), 12 (± 10분), 24 (± 30분), 48 (± 30분), 72 (± 30분), 120 (± 30분), 168 (± 30분), 240 (± 30분) 및 336 (± 30분)시간째 안락사시켰다. 각각의 용량 실험군에 대해 노출 후 검출가능한 양의 파클리탁셀의 지속기간을 확인하기 위해 비-구획 분석을 혈장 및 폐 조직 상에서 수행하였다.
노출 시스템
흡입 노출 시스템은 2개의 압축된 공기 제트 분무기 (호스피탁) 및 설치류 코 전용 흡입 노출 체임버로 구성되었다. 노출 산소 수준 (%)은 노출 동안 내내 모니터링되었다. nPac 현탁액 에어로졸은 2개의 호스피탁 압축된 공기 제트 분무기 세트 (최대 40 (± 1)분 동안 사용된 다음, 잔여 노출 지속기간 동안 2개의 압축된 공기 제트 분무기의 제 2 세트로 교체되었음)로 20 psi의 유입 압력에서 생성되었다. 에어로졸은 24 인치 스테인리스 스틸 에어로졸 전달 라인 (직경 1.53 cm)을 통해 코 전용 노출 체임버로 안내되었다.
농도 모니터링
에어로졸 농도 모니터링은 사전 계량된 GF/A 47 mm 필터 상에 에어로졸을 수집함으로써 시행되었다. 설치류 노출 내내 코 전용 노출 체임버의 설치류 호흡 구역으로부터 필터를 시료화하였다. GF/A 필터를 통한 에어로졸 시료화 유속은 1.0 ± 0.5 L/분으로 유지되었다. 13분 후 수집된 마지막 필터를 제외하고 총 6개의 GF/A 필터가 노출 지속기간 내내 10분마다 하나씩 수집되었다. 시료 수집 후, 노출 시스템에서 총 에어로졸 농도를 결정하기 위해 필터를 계량하였다. 필터를 추출하고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석하여 각 필터 상에 수집된 파클리탁셀의 양을 정량화하였다. 필터를 통한 전체 공기 흐름으로 수집된 에어로졸 및 파클리탁셀 에어로졸의 총량을 나누어 각 필터에 대한 총 에어로졸 농도 및 파클리탁셀 에어로졸 농도를 계산하였다. 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도를 사용하여 하기에 나타낸 수학식 1을 사용하여 설치류 폐에 대해 달성된 파클리탁셀의 평균 침착된 용량을 계산하였다.
에어로졸 입자 (비말) 크기 결정
에어로졸의 입자 크기 분포는 머서 스타일의 7 단계 캐스케이드 충격기 (Ntooth Products, Inc., Albuquerque, NM)에 의해 코 전용 노출 체임버의 설치류 호흡 구역으로부터 측정되었다. 입자 크기 분포는 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD) 및 기하학적 표준 편차 (GSD)의 견지에서 결정되었다. 캐스케이드 충격기 시료를 2.0 ± 0.1 L/분의 유속으로 수집하였다.
용량의 결정
침착된 용량은 수학식 1을 사용하여 계산되었다. 이러한 계산에서, 노출로부터 측정된 평균 에어로졸 농도는 래트의 평균 실험군 체중과 함께 사용되었다. 이러한 방식으로, 래트 폐에 침착된 파클리탁셀의 추정량을 측정된 파클리탁셀 에어로졸 농도를 사용하여 계산하였다.
Figure pct00019
여기서
침착된 용량 = (DD) μg/kg
2호흡 분 부피 (RMV) = 0.608 x BW0.852
에어로졸 노출 농도 (AC) = 파클리탁셀 에어로졸 농도 (μg/L)
침착 분율 (DF) = 10%의 가정된 침착 분율
BW = 연구 중인 동물의 평균 체중 (무작위화; 1일째) (kg).
결과
노출 결과
에어로졸 농도 및 입자 크기
코 전용 노출 체임버에서 동물의 호흡 구역으로부터 47-mm GF/A 필터를 사용하여 각각의 nPac 제형물 에어로졸 노출 동안 내내 에어로졸 농도를 모니터링하였다. 각각의 노출 동안 7개의 47-mm GF/A 필터가 시료화되었다. 필터 FS-1 내지 FS-6을 각각 10분 동안 시료화하고, 필터 FS-7을 각각의 저용량 및 고용량 실험군의 경우 5분 동안 시료화하였다. 노출 체임버 상의 동물 호흡 구역으로부터의 머서 스타일 캐스케이드 충격기를 사용하여 입자 크기를 측정하였다. 표 12 및 표 13은 각각 저용량 및 고용량 노출 동안 GF/A 필터를 시료화하여 측정된 총 및 파클리탁셀 에어로졸 농도를 나타낸다.
Figure pct00020
Figure pct00021
각각의 nPac 제형물 에어로졸에 대한 입자 크기 (에어로졸 비말 크기) 분포는 케스케이트 충격기를 사용하여 MMAD (공기역학적 직경에 대한 공기 중의 입자 질량 분포의 중앙값) (GSD; 입자 크기 분포의 가변성을 특성화하기 위해 MMAD 측정을 수반함)의 견지에서 결정되었다. 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL nPac 에어로졸에 대해 MMAD (GSD)는 각각 1.8 (2.0) μm 및 2.3 (1.9) μm인 것으로 결정되었다. 도 9 및 도 10은 각각 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL nPac 제형물 에어로졸에 대한 입자 크기 분포를 나타낸다.
침착된 용량
침착된 파클리탁셀 용량은 각각의 저용량 및 고용량 nPac 제형물에 대해 수학식 1을 사용하여 파클리탁셀 평균 에어로졸 농도, 평균 래트 체중, 10 %의 가정된 침착 분율 및 65분의 노출 지속기간을 기준으로 하여 계산하였다. 표 14는 각각의 노출에 대한 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도, 평균 래트 체중, 노출 시간 및 침착된 용량을 나타낸다. 달성된 평균 설치류 침착 용량은 6.0 mg/kg 및 20.0 mg/kg nPac 제형물 노출에 대해 각각 0.38 mg/kg 및 1.18 mg/kg인 것으로 결정되었다.
Figure pct00022
산소 및 온도
nPac 제형물 에어로졸 노출 동안 내내 산소 및 온도를 모니터링하였다. 기록된 산소 및 온도 범위는 6.0 mg/mL nPac 노출에 대해 각각 19.8% 내지 20.9% 및 20.7°C 내지 20.8°이었다. 20.0 mg/mL nPac 제형물 노출의 경우, 기록된 산소 값은 노출 동안 내내 19.8%이었으며, 온도 범위는 20.7°C 내지 20.8°C이었다.
예비 데이터: 도 11 및 도 12 참조.
실시예 5 - nPac 약동학 연구
실행 개요
90마리의 스프라그 달리 래트를 "임상 기준" 용량의 파클리탁셀, 아브락산® (주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질 결합된 입자, 소위 nab-파클리탁셀)에 정맥내 (Ⅳ) 볼루스 주사에 의해 또는 nPac (파클리탁셀: 목표 용량 0.37 또는 1.0 mg/kg)에 한 번에 코 전용 흡입에 의해 노출시켰다. 3마리의 동물 (n = 3)을 혈액 (혈장) 및 폐 조직 수집을 위해 노출 후 0.5 내지 336시간 동안 10개의 시점에서 안락사시켰다. 각각의 용량 실험군에 대해 노출 후 검출가능한 양의 파클리탁셀의 지속기간을 확인하기 위해 비-구획 분석 (NCA)을 혈장 및 폐 조직 상에서 수행하였다. 모든 실험군으로부터 336시간 시점으로 지정된 동물은 액체 크로마토그래피 - 질량 분광분석법 (LCMS) 분석을 위해 오른쪽 폐를 수집한 반면 왼쪽 폐는 10% 중성 완충 포르말린 (NBF)으로 관류하고 잠재적인 조직병리학을 위해 보유하였다. 비교 조직병리학을 시행하기 위해 3마리의 여분의 동물 (순수 대조군)을 336시간 시점에 안락사시키고, 동일한 방식으로 폐 수집을 수행하였다. 다른 시점 모두에 지정된 동물은 LCMS 분석을 위해 모든 폐를 개별적으로 동결하였다.
저용량 및 고용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 85.64 μg/L 및 262.27 μg/L이었다. 평균 노출 에어로졸 농도는 분무된 흡입 노출에 대해 예상된 목표 에어로졸 농도의 ± 15% 이내이었다. 입자 크기 분포는 캐스케이드 충격기를 사용하여 각각의 nPac 제형물 에어로졸에 대한 MMAD (GSD)의 견지에서 결정되었다. 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL nPac 에어로졸에 대해 MMAD (GSD)는 각각 1.8 (2.0) μm 및 2.3 (1.9) μm인 것으로 결정되었다.
침착된 파클리탁셀 저용량은 파클리탁셀 평균 에어로졸 농도 85.64 μg/L, 평균 0일째 실험군 체중 420.4 g, 가정된 침착 분율 10% 및 노출 지속시간 65분을 기준으로 하여 계산되었고, 달성된 평균 설치류 침착 용량은 저용량 nPac 실험군에 대해 0.38 mg/kg인 것으로 결정되었다. 침착된 파클리탁셀 고용량에 대해 파클리탁셀 평균 에어로졸 농도 262.27 μg/L, 평균 0일째 실험군 체중 420.5 g, 가정된 침착 분율 10% 및 노출 지속시간 65분을 기준으로 하여 계산되었고, 달성된 평균 설치류 침착 용량은 저용량 nPac 실험군에 대해 1.18 mg/kg인 것으로 결정되었다. 기록된 산소 및 온도 범위는 6.0 mg/mL nPac 노출에 대해 각각 19.8% 내지 20.9% 및 20.7℃ 내지 20.8℃이었다. 20.0 mg/mL nPac 제형물 노출의 경우, 기록된 산소 값은 노출 동안 내내 19.8%이었으며, 온도 범위는 20.7℃ 내지 20.8℃이었다.
아브락산® 정맥 주사를 받은 실험군의 경우, 1일째 체중은 386.1 내지 472.8 g 범위이었고, 이로 인해 아브락산® 용량이 2.6 내지 3.2 mg/kg이었으며 평균 실험군 용량은 2.9 mg/kg이었다.
모든 실험군은 연구 과정을 통해 거의 동일한 체중을 늘렸다. 연구 기간 동안 비정상적인 임상 관찰은 주목되지 않았다. 모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 모든 동물은 각 시점에 의도된 윈도우 내에서 안락사되었다.
부검 시, 각 실험군의 동물 중 대략 절반이 폐에 경미한 황갈색 탈색을 가졌다. 이러한 관찰은 종종 흡입 노출과 관련이 있다. 다른 일시적 관찰에는 심장 비대 (동물 #2016) 및 기관기관지 림프절 비대가 포함되었다. 부검 시, 다른 비정상적인 전반적 관찰은 관찰되지 않았다. 조직병리학은 테스트 및 기준 항목 처리된 래트의 폐 및 기관이 정상 한계 내이며 본 연구 조건 하에서 순수 래트의 것과 구별할 수 없음을 보여주었다. 투여 336시간 후 희생 시, 폐에 침착된 외인성 물질에 대한 생리학적 정상 반응으로서 흡입 연구에서 공통적인 대식세포 축적이 본 연구의 경우 조사된 치료 동물의 폐 절편 내에서는 명백하지 않았다.
NCA는 노출 (농도 대 시간 곡선 아래 영역 [AUC]), 최대 농도까지의 시간 (Tmax), 최대 농도 (Cmax) 및 가능한 경우 명백한 최종 반감기 (T1/2)를 정량화하도록 설계되었다.
새로운 nPac 제형물에 대한 가설은 제형물이 폐 조직 내에서 파클리탁셀의 체류를 증가시키고 전신 노출을 감소시킬 수 있는 것이었다. 전신 혈장 내 반감기는 테스트된 제형물/용량에 대해 변하지 않았으며, 흡입에 의해 전달된 nPac 제형물로 폐 조직 내 반감기가 증가하였다.
흡입에 의해 nPac 제형물로서 전달될 때 폐 조직에 대한 노출 (용량 정규화 된 AUC)이 증가하였다.
종합적으로, 데이터는 Ⅳ "임상 기준"과 비교하여 흡입을 통해 전달될 때 폐 조직 내에서 nPac의 유의한 체류를 나타낸다.
목표
본 연구의 목표는 파클리탁셀의 임상 기준 용량과 비교하여 nPac 제형물의 약동학을 결정하는 것이 었다. 흡입에 의해 투약된 nPac을 사용한 러브레이스 생의학적 연구 FY 17-008A (상기 실시예 1)의 파일럿 약동학 (PK) 데이터는 폐 조직에서 168시간 초과의 체류 시간을 나타낸다. 본 연구에서, 정맥내 (Ⅳ) 꼬리 주사을 통해 단일 저용량 또는 고용량 코 전용 흡입 nPac 제형물 또는 단일 임상 기준 용량의 파클리탁셀을 투약한 동물은 0.5 내지 336시간의 시점에서 혈장 및 폐 조직을 평가하였다.
재료 및 방법
테스트 시스템
종/동물주: 스프라그 달리 래트
연구 시작 시 동물의 연령: 8 내지 10주령
연구 시작 시 체중 범위: 345 내지 447 g
연구 상의 수/성별: 95마리 수컷 (90마리의 연구 동물 및 5마리 여분의 동물)
공급처: 챨스리버 연구소 (뉴욕주 킹스턴)
식별: 영구적인 제작자 꼬리 표시
아브락산® 제형물
Ⅳ 제형물에 사용된 임상 기준 물질은 의약품 아브락산® (제조사: 셀젠사, Summit, NJ; 로트 번호 6111880)이었다. 투약 일에 식염수를 사용하여 약물 생성물을 5.0 mg/mL로 재구성하고 (제조사: 백스터 헬스케어사, Deerfield, ll.; 로트 번호 P357889), 제조사의 지침에 따라 보관하였다.
nPac 제형물
저용량 실험군 노출을 위한 6.0 mg/mL nPac 제형물 및 고용량 실험군 노출을 위한 20.0 m/mL nPac 제형물은 의뢰인 권장사항에 따라 준비되었다. 구체적으로, nPac은 1% 폴리소르베이트 80으로 재구성되었다. 모든 입자가 젖을 때까지 바이알을 손으로 진탕하였다. 추가적인 주사용 0.9% 염화나트륨을 (원하는 농도 목표로) 첨가하고, 바이알을 손으로 1분 더 진탕시켰다. 큰 덩어리가 보이지 않고 현탁액이 적절히 분산될 때까지 진탕을 계속하였다. 에어로졸화 작업을 위해 분무기에 배치하기 전에 바이알의 임의의 공기/거품을 감소시키기 위해 생성 된 제형물을 5분 이상 그대로 두었다. 6.0 mg/mL의 최종 제형물을 실온에서 유지하고, 재구성 후 2시간 이내에 분무시켰다. 20.0 mg/mL의 최종 제형물을 실온에서 유지하고, 재구성 후 30분 이내에 분무시켰다.
실험적 설계
표 15에 나타낸 실험군 1의 동물은 단일 "임상 기준" 용량 (제형물 농도: 5 mg/mL, 표적 용량: 체중을 기준으로 5.0 mg/kg, 목표 용량 부피: 250 μL 초과하지 않음)의 아브락산® (주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질 결합된 입자)이 Ⅳ 꼬리 정맥 주사로 투여되었다. 표 15의 실험군 2 및 3의 동물은 아래 연구 설계에 따라 한 번에 코 전용 흡입 (INH)에 의해 nPac 에어로졸 (목표 용량 0.37 또는 1.0 mg/kg)에 노출되었다. 3마리의 동물 (n = 3)을 혈액 (혈장) 및 폐 조직 수집에 대한 노출 후 0.5 (± 10분), 6 (± 10분), 12 (± 10분), 24 (± 30분), 48 (± 30분), 72 (± 30분), 120 (± 30분), 168 (± 30분), 240 (± 30분) 및 336 (± 30분)시간째 안락사시켰다. 각각의 용량 실험군에 대해 노출 후 검출가능한 양의 파클리탁셀의 지속기간을 확인하기 위해 비-구획 분석을 혈장 및 폐 조직 상에서 수행하였다. 모든 실험군으로부터 336시간 시점으로 지정된 동물은 LCMS 분석을 위해 오른쪽 폐를 개별적으로 동결시킨 반면, 왼쪽 폐는 10% 중성 완충 포르말린 (NBF)으로 관류하고 잠재적인 조직병리학을 위해 보유하였다. 비교 조직병리학을 시행하기 위해 3마리 여분의 동물 (순수 대조군)을 또한 336시간 시점에 나란히 안락사시키고, 동일한 방식으로 폐 수집을 수행하였다.
Figure pct00023
축산, 검역 및 연구 과제
수컷 스프라그 달리 래트 (6 내지 8주령)는 챨스리버 연구소 (뉴욕주 킹스턴)으로부터 입수하여 14일 동안 격리시켰다. 검역의 종결 시, 동물의 무게를 측정한 다음 연구에 할당하기 위해 무게를 기준으로 무작위화로 배정하였다. 꼬리 표시 및 케이지 카드로 동물을 확인하였다. 적절한 SOP에 따라 물, 조명, 습도 및 온도 제어를 유지하고 모니터링하였다. 비-노출 시간 동안 래트에게 표준 설치류 식이를 자유롭게 공급하였다.
체중 및 매일 관찰
체중은 무작위로, 연구 전반에 걸쳐 매일, 안락사 시에 수집되었다. 연구 중인 각각의 동물은 비정상, 빈사 또는 사망의 임상적 징후에 대해 비교 의학 동물 자원 (CMAR) 담당자에 의해 매일 2회 관찰되었다.
아브락산® 투여 Ⅳ - 꼬리 정맥 주사
아브락산® (농도: 5 mg/mL, 목표 용량: 체중 기준 5.0 mg/kg, 용량 부피: 250 μL를 초과하지 않음)을 주사를 위한 SOP ACS 1278에 따라 한 번에 Ⅳ 꼬리 정맥 주사로 실험군 1의 동물에게 투여하였다. 설치류 및 기니피그의 진피 투약 및 혈액 채취.
nPac 투여 - 코 전용 에어로졸 노출
컨디셔닝
동물은 SOP TXP 1210 코 전용 흡입 노출을 위한 작은 동물 취급에 따라 최대 70분 동안 코 전용 노출 튜브에 컨디셔닝되었다. 노출 전 3일 동안 3회의 컨디셔닝 세션이 진행되었고, 첫 번째 세션은 30분, 두 번째는 60분 및 세 번째는 70분 동안 지속되었다. 이들은 컨디셔닝 기간 내내 그리고 노출 동안 면밀히 모니터링되어, 순간적인 고통 이상을 경험하지 않도록 보장하였다.
노출 시스템
에어로졸은 20 psi의 분무기 압력에서 두 개의 압축된 공기 제트 호스피탁 분무기로 생성되었다. 저용량 및 고용량 노출에 각각 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL의 nPac 현탁 제형물을 사용하였다. 둘 다의 제형물을 별도로 에어로졸화시켜서, 에어로졸을 전달 라인을 통해 32-포트 코 전용 노출 체임버로 안내하였다. 설치류 흡입 노출은 각각 65분 동안 시행되었다. nPac 현탁액 에어로졸은 두 개의 호스피탁 압축된 공기 제트 분무기 (최대 40 (± 1)분 동안 사용됨) 세트로 생성된 다음, 잔여 노출 지속기간 동안 2개의 호스피탁 분무기의 제 2 세트로 교체되었다. 산소 및 온도를 모니터링하고 각각의 흡입 노출 동안 내내 기록하였다.
농도 모니터링
실시예 4에서와 동일함
입자 크기 결정
실시예 4에서와 동일함
용량의 결정
실시예 4에서와 동일함
안락사 및 부검
동물은 안락사 용액의 복강내 (IP) 주사 (SOP ACS-0334 작은 동물의 안락사에 따름)에 의해 상기 연구 설계의 시점에 안락사시켰다.
336시간 시점 (및 여분의 동물, n = 3)의 경우: 부검 동안, 심장 천자에 의해 혈액 (혈장용)을 K2EDTA 튜브 내에 수집하였다. 전체 폐 무게를 수집하고, 왼쪽 폐를 묶어 중성 완충 포르말린으로 채우고 잠재적인 조직병리학을 위해 보관하였다. 오른쪽 폐엽은 개별적으로 무게를 측정하고, 액체 질소에서 즉시 냉동하며 생체분석적 분석을 위해 -70 내지 -90℃에 보관하였다. 추가적으로, 자격을 갖춘 부검 담당자가 완전한 전반적인 검사를 수행하였다. 신체의 외부 표면, 구멍 및 두개골강, 흉곽 및 복강의 내용물을 검사하였다. 병변을 형태, 정량, 형태, 색상, 경도 및 중증도에 대한 용어집을 사용하여 설명하고 기록하였다.
기타 시점 모두의 경우: 부검 동안, 혈액 (혈장용)을 심장 천공에 의해 K2EDTA 튜브 내에 수집하였다. 전체 폐 무게를 수집하고, 폐엽은 개별적으로 무게를 측정하고, 액체 질소에서 즉시 냉동하며 생체분석적 분석을 위해 -70 내지 -90℃에 보관하였다. 추가적으로, 자격을 갖춘 부검 담당자가 완전한 전반적인 검사를 수행하였다. 신체의 외부 표면, 구멍 및 두개골강, 흉곽 및 복강의 내용물을 검사하였다. 병변을 형태, 정량, 형태, 색상, 경도 및 중증도에 대한 용어집을 사용하여 설명하고 기록하였다.
조직병리학
입수가능한 고정된 조직을 다듬었다. 기도가 있는 전형적인 독성학적 병리학 스타일 절편을 수득하도록 고정된 왼쪽 폐엽을 다듬었다. 조직을 일상적으로 프로세싱하고, 파라핀 포매하고, ~ 4 μm로 절편화하고, 장착하고, 현미경 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색하였다. 결과는 독물학적 병리학에 경험이 있는 한 명의 병리학자가 1 내지 5의 척도로 주관적으로 반 정량적으로 등급을 매겼다 (1 = 최소, 2 = 경증, 3 = 중등, 4 = 현저, 5 = 중증). 프로반티스?? (Instem LSS Ltd., 영국 스태퍼드셔 소재) 컴퓨터 소프트웨어/데이터베이스가 조직병리학 데이터 수집, 보고 및 분석에 사용되었다.
혈액 수집 및 프로세싱
부검 시 수집된 혈액을 4℃에서 10분 동안 최소 1300 g에서 원심분리함으로써 혈장으로 프로세싱하였다. 혈장 시료는 분석 전까지 -70 내지 -90℃에서 보관되었다.
생체분석적 분석
시간의 함수로서 파클리탁셀의 양을 정량하기 위해 액체 크로마토그래피 - 질량 분광분석 (LCMS) 검정법을 통해 전신 혈액 (K2EDTA로부터의 혈장 형태) 및 폐 조직을 검정하였다. 간략하게, 검정법은 파클리탁셀을 정량화하기 위해 초고성능 액체 크로마토그래피 일렬 질량 분광분석 (UPLC-MS/MS) 검정법을 이용한다.
혈장 시료는 단백질 침전 방법을 통해 추출되고, 분리는 역상 크로마토그래피를 통해 달성된다. 매트릭스 기반의 교정 곡선으로 정량화를 수행하였다.
비-구획 분석은 혈장 및 폐 조직 농도로부터의 데이터에 관해 수행되었다. 최소한 Cmax, Tmax, AUC 및 명백한 최종 반감기가 결정되었다. 다른 파라미터는 데이터를 기반으로 하여 결정될 수 있다.
결과
임상 관찰, 생존 및 체중
모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 모든 동물은 각 시점에 의도된 윈도우 내에서 안락사되었다. 연구 기간 동안 비정상적인 임상 관찰은 주목되지 않았다.
도 13 및 도 14는 연구 지속기간에 걸쳐 그리고 1일째부터의 변화 백분율로서 평균 체중을 나타낸다. 모든 실험군은 연구 과정을 통해 거의 동일한 비율로 체중을 늘렸다.
아브락산® Ⅳ 꼬리 정맥 주사
아브락산® 정맥 주사를 받은 실험군의 경우, 1일째 체중은 386.1 내지 472.8 g 범위이었고, 이로 인해 아브락산® 용량이 2.6 내지 3.2 mg/kg이 되었다. 평균 용량 (표준 편차)은 2.9 (0.16) mg/kg이었다. 개별 아브락산® 용량은 표 16에 나타낸다.
Figure pct00024
Figure pct00025
nPac 노출
에어로졸 농도 및 입자 크기
참조: 결과 - 실시예 4의 에어로졸 농도 및 입자 크기.
산소 및 온도
참조: 결과 - 실시예 4의 산소 및 온도.
침착된 용량
참조: 결과 - 실시예 4의 침착된 용량.
부검
모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 부검 시, 각 실험군의 동물은 폐 상에 최소 내지 경미한 황갈색 탈색을 가졌다 (표 17). 이러한 관찰은 종종 흡입 노출과 관련이 있다. 다른 일시적 관찰에는 심장 비대 (동물 #2016) 및 기관기관지 림프절 비대가 포함되었다. 부검 시, 다른 비정상적 전반적 관찰은 관찰되지 않았다.
Figure pct00026
조직병리학
본 연구를 위해 조사된 투여 후 336시간 (~ 14일째)의 희생 동물의 기관 및 왼쪽 폐 내에 유의한 이상이 관찰되지 않았다. 조직은 대조군으로서 사용되는 "예비" 동물과 현미경적으로 구별할 수 없었다.
대식세포 축적은 본 연구를 위해 검사된 치료 동물의 폐 절편 내에서 분명하지 않았다. 폐에 침착된 외인성 물질에 대한 생리학적 정상 반응으로서 폐포 대식세포의 일정 수준의 증가는 흡입 연구에서 매우 공통적이다 (미소 수준은 미처리된 동물에서 비교적 공통적인 관찰일 수도 있음). 본 연구에서 흡입 투약된 동물의 명백한 부재는 조직학적으로 조사된 비교적 늦은 (336시간 또는 ~ 14 일째) 투여 후 시점과 부분적으로 관련될 수 있다.
생체분석 및 PK 모델링
결과는 하기 표 18, 표 19, 표 20 및 도 15 및 도 16에 요약되어 있다. 평균 파클리탁셀 혈장 농도 대 시간 및 평균 파클리탁셀 폐 조직 농도 대 시간 데이터를 상기에 나타낸 바와 같이 모델링하고, 결과를 각각 표 21 및 표 22에 나타낸다.
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
모델링은 각 시점에서 평균 혈장 또는 폐 조직 농도를 기초로 하여 윈논린으로 수행되었다. NCA는 노출 (농도 대 시간 곡선 아래 영역 [AUC]), 최대 농도까지의 시간 (Tmax), 최대 농도 (Cmax) 및 가능한 경우 명백한 최종 반감기 (T1/2)를 정량화하도록 설계되었다.
전신 혈장 내 반감기는 테스트된 제형물/용량에 대해 변하지 않았으며, 흡입에 의해 전달된 nPac 제형물로 폐 조직 내 반감기가 증가하였다. 흡입에 의해 nPac 제형물로서 전달될 때 폐 조직에 대한 노출 (용량 정규화 된 AUC)이 증가하였다.
종합적으로, 데이터는 흡입을 통해 전달될 때 폐 조직 내에서 nPac의 유의한 체류를 나타낸다.
결론
90마리의 스프라그 달리 래트를 "임상 기준" 용량의 파클리탁셀, 아브락산® (주사가능한 현탁액을 위한 파클리탁셀 단백질 결합된 입자)에 정맥내 (Ⅳ) 볼루스 주사에 의해 또는 nPac (파클리탁셀: 목표 용량 0.37 또는 1.0 mg/kg)에 한 번에 코 전용 흡입에 의해 노출시켰다. 3마리의 동물 (n = 3)을 혈액 (혈장) 및 폐 조직 수집을 위해 노출 후 0.5 내지 336시간 동안 10개의 시점에서 안락사시켰다. 각각의 용량 실험군에 대해 노출 후 검출가능한 양의 파클리탁셀의 지속기간을 확인하기 위해 비-구획 분석을 혈장 및 폐 조직 상에서 수행하였다. 모든 실험군으로부터 336시간 시점으로 지정된 동물은 액체 크로마토그래피 - 질량 분광분석법 (LCMS) 분석을 위해 오른쪽 폐를 수집한 반면 왼쪽 폐는 10% 중성 완충 포르말린 (NBF)으로 관류하고 잠재적인 조직병리학을 위해 보유하였다. 비교 조직병리학을 시행하기 위해 3마리 여분의 동물 (순수 대조군)을 또한 336시간 시점에 안락사시키고, 동일한 방식으로 폐 수집을 수행하였다. 다른 시점 모두에 지정된 동물은 LCMS 분석을 위해 모든 폐를 개별적으로 동결하였다.
저용량 및 고용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 85.64 μg/L 및 262.27 μg/L이었다. 평균 노출 에어로졸 농도는 분무된 흡입 노출에 대해 예상된 목표 에어로졸 농도의 ±15% 이내이었다. 입자 크기 분포는 캐스케이드 충격기를 사용하여 각각의 nPac 제형물 에어로졸에 대한 MMAD (GSD)의 견지에서 결정되었다. 6.0 mg/mL 및 20.0 mg/mL nPac 에어로졸에 대해 MMAD (GSD)는 각각 1.8 (2.0) μm 및 2.3 (1.9) μm인 것으로 결정되었다.
침착된 파클리탁셀 용량은 파클리탁셀 평균 에어로졸 농도 85.64 μg/L, 평균 0일째 실험군 체중 420.4 g, 가정된 침착 분율 10% 및 노출 지속시간 65분을 기준으로 하여 계산되었고, 달성된 평균 설치류 침착 용량은 저용량 nPac 실험군에 대해 0.38 mg/kg인 것으로 결정되었다. 침착된 파클리탁셀 고용량에 대해 파클리탁셀 평균 에어로졸 농도 262.27 μg/L, 평균 0일째 실험군 체중 420.5 g, 가정된 침착 분율 10% 및 노출 지속시간 65분을 기준으로 하여 계산되었고, 달성된 평균 설치류 침착 용량은 저용량 nPac 실험군에 대해 1.18 mg/kg인 것으로 결정되었다. 기록된 산소 및 온도 범위는 6.0 mg/mL nPac 노출에 대해 각각 19.8% 내지 20.9% 및 20.7°C 내지 20.8°이었다. 20.0 mg/mL nPac 제형물 노출의 경우, 기록된 산소 값은 노출 동안 내내 19.8%이었으며, 온도 범위는 20.7°C 내지 20.8°C이었다. 아브락산® 정맥 주사를 받은 실험군의 경우, 1일째 체중은 386.1 내지 472.8 g 범위이었고, 이로 인해 아브락산® 용량이 2.6 내지 3.2 mg/kg이었으며, 평균 실험군 용량은 2.9 mg/kg이었다.
모든 실험군은 연구 과정을 통해 거의 동일한 체중을 늘렸다. 연구 기간 동안 비정상적인 임상 관찰은 주목되지 않았다. 모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 모든 동물은 각 시점에 의도된 윈도우 내에서 안락사되었다.
부검 시, 각 실험군의 동물 중 대략 절반이 폐에 경미한 황갈색 탈색을 가졌다. 이러한 관찰은 종종 흡입 노출과 관련이 있다. 다른 일시적 관찰에는 심장 비대 (동물 #2016) 및 기관기관지 림프절 비대가 포함되었다. 부검 시, 다른 비정상적 전반적 관찰은 관찰되지 않았다. 조직병리학은 테스트 및 기준 항목 처리된 래트의 폐 및 기관이 정상 한계 내이며, 본 연구 조건 하에서 순수 래트의 것과 구별할 수 없음을 보여주었다.
NCA는 노출 (농도 대 시간 곡선 아래 영역 [AUC]), 최대 농도까지의 시간 (Tmax), 최대 농도 (Cmax) 및 가능한 경우 명백한 최종 반감기 (T1/2)를 정량화하도록 설계되었다.
새로운 nPac 제형물에 대한 가설은 제형물이 폐 조직 내에서 파클리탁셀의 체류를 증가시키고 전신 노출을 감소시킬 수 있는 것이었다. 전신 혈장 내 반감기는 테스트된 제형물/용량에 대해 변하지 않았으며, 흡입에 의해 전달된 nPac 제형물로 폐 조직 내 반감기가 증가하였다. 흡입에 의해 nPac 제형물로서 전달될 때 폐 조직에 대한 노출 (용량 정규화 된 AUC)이 증가하였다. 종합적으로, 데이터는 Ⅳ "임상 기준"과 비교하여 흡입을 통해 전달될 때 폐 조직 내에서 nPac의 유의한 체류를 나타낸다.
실시예 6- 누드 래트 동소 폐암 모델에서 흡입된 나노미입자 파클리탁셀 (nPac)의 효능 평가 - 연구 FY17-095
실행 개요
127개의 NIH-rnu 누드 래트를 1일째 면역억제를 유도하기 위해 x-선 조사하였다. 0일째 기관내 (IT) 점적주입에 의해 동물에게 Calu3 종양 세포를 투약하였다. 동물은 3주의 성장 기간을 거쳤다. 3주차 동안, 체중 계층화에 의해 동물을 5개의 연구 실험군으로 무작위로 배정하였다. 4주차에 시작하여, 실험군 2의 동물은 22일, 29일 및 36일째 정맥내 (Ⅳ) 투약 (5 mg/kg)에 의해 아브락산®이 매주 1회 투약되었다. 실험군 3 및 4의 동물은 각각 목표 저용량 (0.5 mg/kg) 및 고용량 (1.0 mg/kg)으로 nPac의 흡입 (INH) 투약을 매주 (월요일) 1회 받았다. 실험군 5 및 6의 동물은 각각 저용량 (0.50 mg/kg) 및 고용량 (최대 1.0 mg/kg)으로 nPac의 목표 흡입 투약을 매주 (월요일 및 목요일) 2회 받았다. 실험군 1의 동물을 정상적인 종양 세포 성장의 대조군으로서 처리하지 않은 채로 두었다. 8주차 동안 모든 동물을 괴사시켰다.
모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 모델과 관련된 임상 관찰에는 피부 발진 및 호흡 곤란이 포함되었다. 모든 실험군은 연구 과정 내내 거의 동일한 비율로 체중을 늘렸다.
매주 1회 저용량 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 270.51 μg/L 및 263.56 μg/L이었다. 매주 1회 저용량 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 244.82 μg/L 및 245.76 μg/L이었다.
용량은 평균 에어로졸 파클리탁셀 농도, 가장 최근의 평균 실험군 체중, 10%의 추정된 침착 분율 및 33분 (저용량) 또는 65분 (고용량)의 노출 지속기간을 기준으로 하였다. 치료 4주 동안, 매주 1회 저용량 nPac 실험군 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 달성된 평균 설치류 침착 용량은 각각 0.655 mg/kg 및 0.640 mg/kg (1.28 mg/kg/주)이었다. 매주 1회 고용량 nPac 실험군 및 매주 2회 고용량 nPac 실험군에 대한 달성된 평균 설치류 침착 용량은 각각 1.166 mg/kg 및 1.176 mg/kg (2.352 mg/kg/주)이었다. 아브락산®의 Ⅳ 주사가 투여된 실험군의 경우, 22일, 29일 및 36일째 평균 용량은 각각 4.94, 4.64 및 4.46 mg/kg이었다.
예정된 부검 시, 각 실험군으로부터 대부분의 동물은 폐에 황갈색 결절 및/또는 폐의 적색 또는 황갈색 반점의 탈색을 가졌다. 다른 일시적 관찰에는 한 동물의 복부 탈장과 또 다른 동물의 심낭의 결절이 포함되었다. 부검 시, 다른 비정상적 전반적 관찰은 관찰되지 않았다.
아브락산 처리된 동물의 폐 무게에서, 폐 대 BW 비율과 폐 대 뇌 무게 비율은 미처리된 대조군과 비교하여 유의하게 낮았다. 매주 1회 nPac 고용량 실험군은 아브락산® 실험군과 유사한 무게를 가졌으며, 미처리된 대조군과 비교하여 폐 무게와 폐 대 뇌 비율이 유의하게 낮았다.
조직학적으로, 모든 실험군에서 대부분의 동물의 폐에는 종양 형성의 일부 증거가 포함되었다. 종양 형성은 폐 실질 내에 무작위로 산란된 팽창하는 가변적 크기의 작은 덩어리 및 폐 실질, 작은 기도 및 혈관의 최대 75%를 차지하는 더 큰 증식되어 유착하는 덩어리의 존재를 특징으로 하였다. 더 큰 덩어리는 주로 폐문 영역에 분포되거나 축 방향 기도에 병치되어 있고, 더 작은 덩어리는 일반적으로 말단에 위치하였다.
폐 종양 덩어리의 주요 형태학적 세포 특성은 미분화의 존재부터 폐의 샘암종의 매우 잘 분화된 양상까지 다양하였다. 우세한 종양 세포 유형은 미분화된 샘암종 형태를 나타내었고, 세포는 점막 소포를 닮은 미세한 세포질내 소포를 갖는 다형성, 대형, 역형성, 창백한 양친화성 염색성이었고, 중등도 내지 현저한 핵부동성을 나타내었으며, 개별화되거나 시트상으로 성장하고 샘암종으로의 분화에 대한 분명한 특징이 부족한 것으로 관찰되었다. 그러나, 다른 덩어리 내에서 관찰되거나 이전에 기술된 미분화된 덩어리 내에서 성장하는 세포 형태학적 특징은 더욱 조직화되어 분명한 세엽샘 분화를 보여주는 잘 분화된 폐 샘암종과 부합되었다. 이러한 양친화성 염색 종양 세포는 주로 폐포 격막에 의해 결합되는 것으로 관찰된 둥지 또는 샘 양상으로 배열되었다. 유사분열 양상은 이러한 종양 세포 집단에서 거의 관찰되지 않았다. 이들 덩어리 내에서 덜 빈번하게 관찰되는 것은 소량 내지 중간량의 창백한 호염기성 염색 세포질, 난형 및 가변 소포성 핵 및 중등도 핵부동증을 갖는 초기로 보이는 비교적 작은 원시 종양 세포의 병소 영역이었다. 이들 원시 종양 세포는 무작위로 그리고 시트상으로 성장하는 것으로 관찰되었다. 이러한 호염기성 원시 종양 세포 집단에서 유사분열 양상 및 세포사멸체의 수적 증가가 가장 빈번하게 주목되었다. 간질성 섬유증이 동반된 혼합된 염증성 세포 (우세하게 호산구, 림프구, 거품성 대식세포 및 간헐적인 거대 세포)를 특징으로 하는 염증이 공통적으로 관찰되었다. 유의한 실질 괴사는 드물거나 없었다.
병리학자는 종양 세포의 점진적 손실, 폐 실질의 잔류 섬유증 결합 조직 스캐폴딩으로 종양 세포의 완벽한 손실을 특징으로 하고, 발포성 대식세포의 침범을 수반하는 개별 종양 덩어리의 가장자리의 부채꼴 모양의 존재를 종양 퇴행의 증거인 것으로 고려하였다.
양성 대조군 Grp. 1 및 아브락산® 처리된 비교 Grp. 2과 비교하여, nPac 처리된 실험군 (Grp. 3 내지 6)에서 전반적인 폐 종양 부하의 감소가 존재하였고, 이는 샘암종 종양 덩어리 및 원시 종양 세포 집단의 중증도 감소뿐만 아니라 종양 퇴행의 증거를 특징으로 한다. 다른 치료 관련 병변 또는 소견은 전혀 관찰되지 않았다. 광범위한 단핵 세포의 침윤이 흡입을 통해 nPac가 투여된 동물의 폐에서 관찰되었다. 사용된 모델이 T 세포 결핍이기 때문에, 세포는 B 세포 또는 NK 세포인 것 같다. nPac에 대한 종양의 국소화된 가능한 더 높은 농도 노출이 환경의 변화를 유도하고 폐 내로 단핵 세포 침윤을 가져올 종양을 침범한 것으로 가정한다.
목표
본 연구의 목표는 폐암의 동소 모델에서 종양 부하를 감소시키는데 정맥내 투여된 아브락산®의 임상 기준 용량과 비교하여 흡입된 nPac 제형물의 효능을 평가하는 것이었다.
재료 및 방법
Figure pct00035
아브락산® 제형물
Ⅳ 제형물에 사용된 임상 기준 물질은 의약품 아브락산®이었다. 투약 일에 식염수를 사용하여 약물 생성물을 5.0 mg/mL로 재구성하고, 제조사의 지침에 따라 보관하였다.
nPac 제형물
노출을 위한 20.0 mg/mL nPac 제형물은 의뢰인 권장사항에 따라 준비되었다. 구체적으로, nPac은 1% 폴리소르베이트 80으로 재구성되었다. 모든 입자가 젖을 때까지 바이알을 손으로 진탕하였다. 추가적인 주사용 0.9% 염화나트륨을 (원하는 농도 목표로) 첨가하고, 바이알을 손으로 1분 더 진탕시켰다. 큰 덩어리가 보이지 않고 현탁액이 적절히 분산될 때까지 진탕을 계속하였다.
에어로졸화 작업을 위해 분무기에 배치하기 전에 바이알의 임의의 공기/거품을 감소시키기 위해 생성 된 제형물을 5분 이상 그대로 두었다. 최종 제형물을 실온에서 유지하고, 재구성 후 2시간 이내에 분무시켰다. 최종 20.0 mg/mL를 실온에서 유지하고 재구성 후 30 (+5)분 이내에 분무시켰다.
실험적 설계
127마리의 동물을 연구에 사용하였다. x-선 조사 및 종양 세포의 투여 전에, 7마리 동물을 여분으로 지정하였다 (여분의 동물은 방사선 조사 또는 세포주 주입을 하지 않았음). -1일째, 모든 연구 동물을 x-선 조사하여 면역억제를 유도하였다. 0일째 기관내 (IT) 점적주입에 의해 동물에게 Calu3 종양 세포를 투약하였다. 동물은 3주의 성장 기간을 거쳤다. 셋째 주 동안, 체중 계층화에 의해 동물을 하기 표 23에 개략된 실험군으로 무작위로 배정하였다. 4주차 시작하여, 실험군 2의 동물은 정맥내 (Ⅳ) (5 mg/kg)로 아브락산® 목표 용량이 매주 1회 투약되었다. 실험군 3 및 4의 동물은 각각 저용량 (0.5 mg/kg) 및 고용량 (1.0 mg/kg)으로 nPac의 흡입 (INH) 목표 용량이 매주 (월요일) 1회 투여되었다. 실험군 5 및 6의 동물은 각각 저용량 (0.50 mg/kg) 및 고용량 (최대 1.0 mg/kg)으로 nPac의 흡입 목표 용량이 매주 (월요일 및 목요일) 2회 투여되었다. 실험군 1의 동물을 정상적인 종양 세포 성장의 대조군으로서 처리하지 않은 채로 두었다. 8주차 동안 모든 동물을 괴사시켰다.
Figure pct00036
축산, 검역 및 연구 과제
검역 후 모든 동물의 무게를 측정하고 무작위로 배정하여 체중을 기준으로 7개의 여분을 제거하였다. 1주차부터 3주차까지 동물을 케이지 카드 (LC 번호) 및 꼬리 표시로 식별하였다.
3주차 동안, 치료를 시작하기 전에 동물을 계량하고 체중 계층화에 의해 상기 열거된 실험군 내로 무작위로 배정하여 연구 ID를 할당하였다. 이 시점부터 동물은 케이지 카드와 샤피 테일 표시로 식별되었다.
면역억제 및 방사선 조사
1일째, 동물은 250 kVp, 15 mA 및 100 cm의 광원-대-대상체 거리로 설정된 ~ 500 rad (필립스 RT 250 X-선 요법 유닛, Phillips Medical Systems, Shelton, CT)의 전신 엑스레이 노출을 겪었다. 동물을 파이 조각 당 2 내지 3마리의 파이 체임버 유닛에 두었다. 방사선 조사 과정은 ~ 10 내지 15분이 걸렸다.
종양 세포 이식
0일째, 동물은 IT에 의해 종양 세포 (Calu3)가 투여되었다. 간략하게, 유도 체임버에서 3 내지 5% 이소플루란에 의해 마취된 이후, 동물을 경사진 매달린 점적주입 플랫폼 상에 걸린 상부 절개로 배치하였다. 스타일렛이 후두를 건너 기관 내로 삽입되는 동안 동물의 혀가 조심스럽게 고정되었다. EDTA 현탁액 중의 세포 부피 (목표 용량 부피: 500 μL; 농도: 0.5 mL 당 약 20 x 106개)는 기관내 점적주입을 통해 폐로 전달되었다. 주입 후, 동물의 호흡 및 운동을 주의 깊게 모니터링하였다. 종양 세포 이식에 이어서, 동물은 종양 세포 생착 및 폐암의 발병을 허용하는 처리 전에 대략 3주의 종양 성장 기간을 거쳤다.
Calu3 성장 및 준비
세포 배양 플라스크에서 5% CO2로 37℃에서 Calu3 세포를 성장시켰다. 이들을 80% 충만도가 될 때까지 10% 소태아 혈청 (FBS)을 갖는 로스웰 파크 메모리알 연구소 (RPMI) 1640 배지에서 성장시켰다. 점적주입 일까지 세포를 유지시켰다. 점적주입 전에 이들을 PBS로 세척하여 수확한 다음 트립신을 첨가하여 플라스크로부터 세포를 제거하였다. 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지로 중화시켰다. 다음으로, 이들을 100 × g에서 5분 동안 원심분리하였고, 배지를 제거하고 세포를 450 μL 무혈청 RPMI에서 20 백만개의 세포 농도로 재현탁하였다. 점적주입 전에, 50 μL의 70 μM EDTA를 래트 당 500 μL의 총 IT 용량 부피를 위해 세포 현탁액에 첨가하였다.
체중 및 매일 관찰
체중은 매주 3주차까지 매주, 4주차에 시작하여 연구 종결 시까지 매주 2회, 그리고 부검 시에 무작위로 수집되었다.
연구 중인 각 동물은 비정상, 이환 또는 사망의 임상 징후에 대해 매일 2회 관찰되었다. 기술자는 투약 및 체중 세션 동안 동물을 관찰하였다.
아브락산® 투여 Ⅳ - 꼬리 정맥 주사
22일, 29일 및 36일째 Ⅳ 꼬리 정맥 주사에 의해 실험군 2의 동물에 아브락산® (5 mg/mL, 최대 용량 부피 250 μL)을 투여하였다.
nPac 투여 - 코 전용 에어로졸 노출
컨디셔닝
동물을 최대 70분 동안 코 전용 노출 튜브에 컨디셔닝하였다. 노출 전 3일 동안 3회의 컨디셔닝 세션이 진행되었고, 첫 번째 세션은 30분, 두 번째는 60분 및 세 번째는 70분 동안 지속되었다. 이들은 컨디셔닝 기간 내내 그리고 노출 동안 면밀히 모니터링되어, 순간적인 고통 이상을 경험하지 않도록 보장하였다.
노출 시스템
에어로졸은 20 psi의 분무기 압력에서 두 개의 압축된 공기 제트 호스피탁으로 생성되었다. 저용량 및 고용량 노출에 20.0 mg/mL의 nPac 현탁 제형물을 사용하였다. 에어로졸을 전달 라인을 통해 32-포트 코 전용 노출 체임버로 안내하였다. 설치류 흡입 노출은 33분 또는 65분 동안 시행되었다. nPac 현탁액 에어로졸은 두 개의 호스피탁 압축된 공기 제트 분무기 (최대 40 (± 1)분 동안 사용됨) 세트로 생성된 다음, 잔여 노출 지속기간 동안 2개의 호스피탁 분무기의 제 2 세트로 교체되었다. 산소 및 온도를 모니터링하고, 각각의 흡입 노출 동안 내내 기록하였다.
농도 모니터링
에어로졸 농도 모니터링은 사전 계량된 GF/A 47 mm 필터 상에 에어로졸을 수집함으로써 시행되었다. 각각의 호흡 노출 내내 코 전용 노출 체임버의 동물 호흡 구역으로부터 필터를 시료화하였다. GF/A 필터를 통한 에어로졸 시료화 유속은 1.0 ± 0.5 L/분으로 유지되었다. 마지막 필터를 제외하고 10분마다 각 노출 지속기간 내내 필터를 수집하였다. 저용량 노출 (실험군 3 및 5)이 33분 동안 지속되면, 최종 필터는 13분 후에 수집되고, 고용량 노출 (실험군 4 및 6)은 65분 동안 지속되며, 최종 필터는 15분 후에 수집되었다. 시료 수집 후, 노출 시스템에서 총 에어로졸 농도를 결정하기 위해 필터를 계량하였다.
계량 후, 각 필터를 7 mL 유리 바이알에 넣었다. 유리 바이알의 필터를 추출하고 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 분석하여 필터 상에 수집 된 파클리탁셀의 양을 정량화하였다. 필터를 통한 전체 공기 흐름으로 수집된 에어로졸 및 파클리탁셀 에어로졸의 총량을 나누어 각 필터에 대한 총 에어로졸 농도 및 파클리탁셀 에어로졸 농도를 계산하였다. 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도를 사용하여 하기 용량 결정의 섹션에 나타낸 수학식 1을 사용하여 설치류 폐에 대해 달성된 파클리탁셀의 평균 침착된 용량을 계산하였다.
용량의 결정
침착된 용량은 실시예 4에서와 동일한 수학식 1을 사용하여 계산되었다.
안락사 및 부검
예정된 부검 시, 동물을 바비투레이트계 진정제의 과다 용량의 복강내 주사에 의해 안락사시켰다.
혈액 및 조직 수집
모든 부검에 대해 최종 체중 및 뇌 무게를 수집하였다. 예정된 안락사를 위해, 혈액 (혈장용)을 심장 천공에 의해 K2EDTA 튜브 내에 수집하였다. 폐를 제거하고 무게를 재었다. 기관기관지 림프절인 종양을 포함하는 폐 조직의 절편을 잠재적인 추후 분석을 위해 액체 질소에서 동결하였다. 남은 폐는 잠재적인 조직병리학 위해 고정되었다.
조직병리학
고정된 왼쪽 폐엽을 "빵 덩어리" 방식으로 다듬고, 대안의 절편을 2개의 카세트에 배치하여 각각 왼쪽 폐의 3개의 대표적인 절편을 갖는 2개의 슬라이드를 수득하였다. 조직을 일상적으로 프로세싱하고, 파라핀 포매하고, ~ 4 μm로 절편화하고, 장착하고, 현미경 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색하였다. 결과는 준정량적으로, 주관적으로 등급화하였다.
연구에서 120마리의 처리된 누드 래트 중 60마리로부터 얻은 폐의 절편 (1 내지 4개/동물)을 세로로 트리밍한 후, 광학현미경 평가를 위해 H & E 염색된 유리 슬라이드로 프로세싱하였다.
이러한 검토 동안 현미경적 결과를 기록한 다음 전자 병리 학보고 시스템 (PDS-아센토스-1.2.0, V.1.2)으로 전송하여 폐 부하 특징 데이터의 발병 및 중증도를 요약하고, 결과를 표로 작성하고, 개별 동물 데이터를 생성하였다. 60마리의 누드 래트의 폐를 조직학적으로 검사하였다: 실험군 1 [1001-1010], 실험군 2 [2001-2010], 실험군 3 [3001-3010], 실험군 4 [4001-4010], 실험군 5 [5001-5010] 및 실험군 6 [6001-6010]). 이들 폐에서의 종양 부하의 수준을 평가하기 위해, 조직병리학적 검사 동안 폐를 평가하고 점수를 매겼다. 각각의 누적 폐 부하 특징 진단의 경우: 1) 샘암종 (미분화 및 분화), 2) 원시 종양 세포 (거의 분화되지 않은 다형성 세포) 및 3) 종양 퇴행, 폐가 다음에 제공된 전체 폐 조직의 관여 백분율을 나타내는 4-점 등급화 척도를 사용하여 준정량적으로 등급화되었다: 0 = 증거 없음, 1 = 최소 (관여된 폐 절편의 총 면적의 1 내지 25%), 2 = 경미 (관여된 폐 절편의 총 면적의 ~ 25 내지 50%), 3 = 중등 (관련된 폐 절편의 총 면적의 ~ 50 내지 75%), 4 = 현저 (관련된 폐 절편의 총 면적의 ~ 75 내지 100%).
조직형태계측법
조직형태계측 분석은 각 실험군으로부터 처음 10마리 동물의 고정된 왼쪽 폐엽을 사용하여 수행되었다. 조직을 형태계측법 ("bread slice") 스타일 트리밍을 사용하여 조직을 다듬었다. 간략하게, 트리밍은 폐의 머리뼈 끝에서 2 mm 내지 4 mm의 무작위 지점에서 시작되었다. 각각의 폐 절편은 대략 4 mm 두께로 절단되었다. 홀수 번호의 절편은 카세트 1에서 꼬리가 아래로 향하는 한편, 짝수 번호의 절편은 카세트 2에 배치되었다. 다음으로 조직 절편을 프로세싱하고, 파라핀 포매하고, 4 ㎛로 절편화하고, 검사를 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색하였다. 동물 당 평균 종양 분율을 결정하기 위해 슬라이드 둘 다 (홀수 및 짝수 슬라이스)를 사용하였다.
러브레이스 바이오메디칼사에 의해 지정된 동물로부터의 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색된 폐 조직에 대한 형태계측적 분석을 수행하였다. 하마마추 나노주머TM를 사용하여 전체 슬라이드 (전체 왼쪽 폐의 횡단 절편을 함유하는 동물 당 2개)를 스캔하였다. 스캔은 비지오팜 통합기 시스템 소프트웨어 (VIS, 버전 2017.2.5.3857)로 분석되었다. 종양 영역 분율의 통계적 분석을 그래프패드 프리즘 5 (버전 5.04)에서 수행하였다.
각 슬라이드에 존재하는 종양 영역의 양을 정량화하도록 설계된 전산화된 영상 정량화는 전체 슬라이드 스캔을 사용하여 모든 왼쪽 폐 조직 상에서 수행되었다. 폐 전이의 면적을 정량화하기 위한 비지오팜 어플리케이션을 사용하여 세포 밀도, 염색 강도 및 크기 및 염색 강도를 기준으로 하여 종양 세포를 정상 폐 조직과 구별하였다. 단순한 H & E 염색에 기초한 이러한 정량화는 완벽하지 않을 것으로 언급된다 (즉, 종양 조직의 유형, 괴사성 및 생존가능한 종양 조직을 완전히 구별할 수 없으며, 일부 정상 구조는 종양으로 포함될 수 있음). 이 과정을 H & E 절편에 적용할 때의 가치는 이것이 종양 정량화에 대한 편견 없는 접근법임 점이다. 전체 폐 조각의 면적이 결정되고, 다음으로 전이로 식별된 구조에 의해 점유된 면적이 총 면적의 백분율로 표현된다. 폐외 구조가 배제되고 전체 폐가 포함되도록 입증하기 위해 분석될 영역의 경미한 조정은 수동으로 수행될 수 있다. 모든 실험군에 걸쳐 일관성을 유지하고 편향의 도입 가능성을 제거하기 위해 다른 수동 조작을 피한다. 가능하면, 종양 조직만을 식별하도록 특이적 면역조직화학적 염색의 개발은 이러한 분석의 특이성을 증가시킬 것이다.
혈액 수집 및 프로세싱
부검 시 수집된 혈액을 4℃에서 10분 동안 최소 1300 g에서 원심분리함으로써 혈장으로 프로세싱하였다. 혈장 시료는 분석 또는 의뢰인에게 배송 전까지 -70 내지 -90℃에서 보관되었다.
추가적인 형태학적 및 면역조직 화학적 (IHC) 연구
헤마톡실린 & 에오신, 메이슨의 트리크롬, AE1/AE3 (광범위 케라틴) 및 CD11b (수지상 세포, 자연 살상 세포 및 대식세포)로 준비된 슬라이드를 사용하여 형태학적 및 면역조직화학적 (IHC) 특징을 검토하기 위해 17마리 동물의 하위집합를 선택 하였다. 이러한 하위집합는 대조군 동물 (n = 2) 및 각각의 처리 실험군으로부터의 처리된 동물 (실험군 당 n = 3)을 포함하였다. 래트 폐 블록을 4㎛ 두께로 절편화하고 양으로 하전된 슬라이드 상에 수집하였다.
방법
H & E 및 메이슨의 트리크롬 염색은 표준 프로토콜에 따라 수행되었다. 항-광범위 사이토케라틴 항체 [AE1/AE3]의 경우, 래트 자궁을 대조군으로서 조직 은행으로부터 얻어 절편화하였다. 라이카 본드 자동 면역염색제 및 마우스 항-광범위 사이토케라틴 [AE1/AE3] (Abcam, # ab27988, 로트 번호 GR3209978-1), 4가지 상이한 희석에서의 항체 및 음성 대조군: 일차 항체 없음, 1 : 50, 1 : 100, 1 : 200 및 1 : 400을 사용하여 조직 은행로부터 얻은 포르말린 고정된 파라핀 포매된 (FFPE) 래트 자궁 조직 상에서 최적화를 수행하였다. 라이카 본드 에피토프 복구 완충액 1 (시트레이트 완충액 용액, pH 6.0)을 20분 동안 (ER1 (20)) 및 라이카 본드 에피토프 복구 용액 2 (EDTA 용액, pH 9.0)를 20분 동안 (ER2 (20)) 사용하여 열 유도된 항원 복구를 수행하였다. 비특이적인 배경은 설치류 블록 M (Biocare, # RBM961H, 로트 번호 062117)로 차단되었다.
항-광범위 사이토케라틴 항체 [AE1/AE3]는 마우스-온-마우스 HRP폴리머 (Biocare, # MM620H, 로트 번호 062016)를 사용하여 검출되었고, 3'3-디아미노벤지딘 (DAB; 갈색)으로 시각화되었다. 헤마톡실린 핵 반대염색 (청색)을 적용하였다. 최적화 슬라이드를 조사하고, 시료 슬라이드에 대한 최적의 염색 조건을 ER2 (20)로 1 : 50 희석한 항-광범위 사이토케라틴 항체 [AE1/AE3]로 결정하였다.
항-CD-11b 항체의 경우, 라이카 본드 자동 면역염색제 및 토끼 항-CD11b 항체를 사용하여 4가지의 상이한 희석 및 음성 대조군: 일차 항체 없음, 1 : 250, 1 : 500, 1 : 1000 및 1 : 2000을 사용하여 조직 은행으로부터의 포르말린 고정된 파라핀 포매된 (FFPE) 래트 림프절 조직에 대해 최적화를 수행하였다.
라이카 본드 에피토프 복구 완충액 1 (시트레이트 완충액, pH 6.0)을 20분 동안 (ER1 (20)) 또는 라이카 본드 에피토프 복구 용액 2 (EDTA 용액, pH 9.0)를 20분 동안 (ER2 (20))를 사용하여 열 유도된 항원 복구를 수행하였다.
항-CD11b 항체를 노보카스트라 본드 정제 중합체 검출을 사용하여 검출하고, 3'3-디아미노벤지딘 (DAB; 갈색)으로 시각화하였다. 헤마톡실린 핵 반대염색 (청색)을 적용하였다. 최적화 슬라이드를 조사하고, FFPE 조직에 대한 최적의 염색 조건을 ER2 (20)로 1 : 2000 희석한 항-CD11b로 결정하였다. 래트 림프절 대조군을 래트 폐 시료과 함께 사용하였다.
연구 결과
임상 관찰, 생존 및 체중
모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 모델과 관련된 임상 관찰에는 피부 발진 및 호흡 곤란이 포함되었다. 한 동물은 상복부 탈장이 있는 것으로 관찰되었다. 수의사 권고에 따라, 동물은 흡입 노출을 받지 않는 실험군 1 (미처리된 대조군)으로 전환되었으므로 노출 튜브 제한이 필요하지 않았다.
도 17은 연구 지속기간에 걸쳐 평균 체중을 나타낸다. 도 18은 0일째부터 평균 체중의 변화 백분율을 나타낸다. 모든 실험군은 연구 과정을 통해 거의 동일한 비율로 체중을 늘렸다.
아브락산® Ⅳ 꼬리 정맥 주사
아브락산®의 Ⅳ 주사가 투여된 실험군의 경우, 22일, 29일 및 36일째 평균 용량은 각각 4.94, 4.64 및 4.46 mg/kg이었다.
nPac 노출
에어로졸 농도 및 침착된 용량
총 에어로졸 및 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각의 노출 동안 GF/A 필터의 시료화에 의해 측정되었다. 매주 1회 저용량 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 270.51 μg/L 및 263.56 μg/L이었다. 매주 1회 저용량 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 244.82 μg/L 및 245.76 μg/L이었다. 산소 및 온도 수준은 각각의 노출 동안 내내 모니터링되었다.
용량은 평균 에어로졸 파클리탁셀 농도, 가장 최근의 평균 실험군 체중, 10%의 추정된 침착 분율 및 33분 또는 65분의 노출 지속기간을 기준으로 하였다. 치료 4주 동안, 매주 1회 저용량 nPac 실험군 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 달성된 평균 설치류 침착 용량은 각각 0.655 mg/kg 및 0.640 mg/kg (1.28 mg/kg/주)이었다.
매주 1회 고용량 nPac 실험군 및 매주 2회 고용량 nPac 실험군에 대한 달성된 평균 설치류 침착 용량은 각각 1.166 mg/kg 및 1.176 mg/kg (2.352 mg/kg/주)이었다.
입자 크기 (MMAD 및 GSD)
입자 크기 분포는 캐스케이드 임팩터를 사용하여 각 nPac 제형물 에어로졸에 대한 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD) 및 기하학적 표준 편차 (GSD)로 측정되었다. 20.0 mg/mL nPac 에어로졸의 경우, 평균 MMAD는 2.01 μm이고 GSD는 1.87 인 것으로 결정되었다.
부검 관찰 및 장기 무게
모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 예정된 부검 시, 각 실험군의 동물은 폐 상에서 황갈색 결절 및/또는 폐의 적색 또는 황갈색 반점 탈색을 가졌다. 다른 일시적 관찰에는 한 동물의 복부 탈장과 또 다른 동물의 심장 주위의 결절이 포함되었다. 부검 시, 다른 비정상적 전반적 관찰은 관찰되지 않았다. 한 동물은 부검 당시에 가시적 종양 (결절)이 없었다.
개별 동물 장기 무게 데이터는 도 19, 도 20 및 도 21에 그래프로 나타낸다. 아브락산® 처리된 동물의 폐 무게에서, 폐 대 BW 비율과 폐 대 뇌 무게 비율은 미처리된 대조군과 비교하여 유의하게 낮았다. 매주 1회 nPac 고용량 실험군은 아브락산® 실험군과 유사한 무게를 가졌으며, 미처리된 대조군과 비교하여 폐 무게와 폐 대 뇌 비율이 유의하게 낮았다. 매주 1회 저용량 nPac, 매주 2회 저용량 및 매주 2회 고용량 nPac 실험군은 일반적으로 유사한 평균 폐 무게와 비율을 가졌다.
형태계측법
모든 처리 실험군은 대조군과 비교할 때 평균 폐 종양 분율의 감소를 보여주었지만, 실험군 사이에 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 단면 폐 슬라이드 상에서 검사된 종양 영역에 관해서 Ⅳ 아브락산® 처리 및 임의의 nPac 치료법 사이에 유의한 통계적 차이도 없었다. 이러한 모델의 전형에서와 같이, 종양 분획의 모든 실험군 내에서 동물들 사이에는 넓은 변동성이 있다. 이러한 데이터는 최종 해석을 위한 폐 대 뇌 무게 비율 및 표준 조직병리학을 포함하여 이러한 모델에서 폐 종양 부하의 다른 지표와 함께 고려되어야 한다. 왼쪽 폐엽의 고정된 폐 조직에 대한 형태학적 분석 및 조직병리학적 검사를 수행한 반면, 폐 조직에 대한 다른 분석은 오른쪽 폐엽의 냉동 조직 상에서 수행될 수 있다. 평균 종양 면적은 도 22 및 도 23에 나타낸다.
병리학 결과
확인된 신생물 세포 집단의 슬라이드 검사 결과로서, 병리학자는 다음을 결정하였다: (1) 샘암종 (미분화 및 분화된 세포)의 전체 폐 종양 부하의 중증도가 모든 처리된 실험군 Grp. 2 (1.7), Grp, 3 (1.8), Grp. 4 (1.7), Grp 5 (1.6) 및 Grp 6 (1.6)에서 미처리 대조군 1 (2.1)과 비교하여 약간 감소하였다. (2) 상응하는 대조군 Grp 1 (0.9) 및 Grp 2 (1.0)과 비교하여 Grp. 3 (0.3), Grp. 4 (0.3), Grp 5 (0.2) 및 Grp 6 (0.2)에서 중증도의 감소에 의해 입증된 원시 종양 세포의 감소가 존재하였고, 3) 상응하는 대조군 Grp 1 (0.0) 및 Grp 2 (0.1)과 비교하여 Grp 3 (0.6), Grp 4 (1.0), Grp 5 (0.8) 및 Grp 6 (1.0)에서 종양 퇴행이 존재하였다. 폐 부하 특징 데이터의 발병율 및 중증도는 표 24 및 도 24에 요약되어 있다. 슬라이드의 현미경 사진은 도 25 내지 도 59에 나타낸다.
Figure pct00037
Figure pct00038
도 25 내지 도 59에서 H & E 염색된 폐암 조직 슬라이드 현미경사진의 조직학적 개요
일반적인 관찰:
대조군: 증식하는 세포를 갖는 생존가능한 종양의 확장된 수준 및 면역 세포 침윤은 거의 또는 전혀 없음.
아브락산® Ⅳ: 일부 종양 퇴행과 함께 일부 림프구 반응을 보이는 많은 생존가능한 종양 덩어리.
nPac 매주 1×, 높음: 생존가능한 종양 세포가 거의 남아 있지 않은 폐로부터 종양의 제거. 남은 덩어리는 면역 세포 침윤 및 섬유증인 것으로 보인다.
nPac 매주 2×, 낮음: 대식세포 및 단핵 세포를 포함한 면역 세포 침윤으로 둘러싸인 일부 잔류 종양 결절.
nPac 매주 2×, 높음: 종양을 대체하는 면역 침윤 및 간질 섬유증을 갖는 종양 결절이 거의 없음.
광범위한 단핵구성 종양살상 세포의 침윤은 흡입을 통해 nPac이 투여된 동물의 폐에서 관찰되었다. 사용된 모델이 T 세포 결핍이기 때문에, 세포는 B 세포 또는 NK 세포 또는 둘 다일 수 있다. B 세포는 항체의 생산을 책임지고 항체 의존적 세포 매개된 세포 독성을 통해 종양 세포 살상에 관여 할 수 있다 (항체는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 결합하여 이들 세포의 살상 능력을 증진시킴). NK 세포는 종양 세포의 살상에 결정적인 선천성 림프 세포이다. 종양에 걸린 환자에서, NK 세포 활성은 종양의 성장을 허용하도록 감소된다. T 세포와 함께, NK 세포는 일부 체크포인트 저해제의 표적으로 이들의 활성을 증가시킨다.
촉발성 또는 저해성 신호를 전달할 수 있는 다양한 유형의 표면 수용체의 사용에 의해, NK 세포는 세포가 비정상 (종양 또는 바이러스로 감염됨)이고 세포독성을 통해 제거되어야 하는지 여부를 확인하기 위해 이들의 환경 내의 세포를 모니터링할 수 있다.
NK 세포의 세포독성 및 화학주성은 종양 세포 및 이들의 부산물을 포함한 많은 병리적 과정에 의해 변형될 수 있다. 특정 신호에 반응하여 이들의 기능이 증진되거나 강화된다. 상이한 톨 유사 수용체 (TLR)를 사용함으로써 여러 병원체 연관된 분자적 양상 (PAMP)에 반응하여, NK 세포는 사이토카인 생성 및/또는 세포용해 활성을 증가시킬 수 있다. IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 및 IFN α/β를 포함한 사이토카인은 또한 NK 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. NK 세포는 단지 상이한 종양 세포 표적을 살상할 수 있는 세포용해 효과기인 단순한 세포가 아니며; 오히려 이들은 다양한 환경적 맥락에서 활성을 미세하게 조정할 수 있는 불균질한 집단을 나타낸다.
nPac으로 처리된 동물의 폐에서 종양 부하는 유의하게 감소한 것으로 보이며 아브락산® Ⅳ의 부하보다 낮다. 따라서, nPac 형태로의 파클리탁셀의 국소화된 투여는 추가적인 효능을 제공한다. 이것은 시간 경과 시 화학요법에 더 긴 노출과 종양 부위로의 격렬한 세포 침윤 둘 다로 인할 수 있다. 이러한 후자의 반응은 용량 밀도 (실제 용량 및 용량 빈도)에 의존하는 것으로 보였다.
특이적인 현미경 사진의 관찰:
도 25: 대상체 1006 (대조군) 샘암종-3, 원시-1, 퇴행-0. 저-출력 배율 (2×)은 폐포 공간 내에서 또는 폐포 격막을 라이닝하는 미분화된, 다형성, 대형, 역형성 종양 세포의 일반적인 분포를 보여준다. 대부분의 세포는 샘암종의 특징이 없으며 인접한 종양 시트로 보인다. 많은 세포가 호염기성 염색 세포질을 가지는 반면, 다른 세포는 크고, 역형성이며, 창백한 양친화성 염색을 포함한다. 이미 존재하는 폐포 대식세포 집단의 존재 및 종양 퇴행의 부재를 유의한다.
도 39: 대상체 2003 (Ⅳ 아브락산®) 샘암종-1, 원시-1, 퇴행-1. 저-출력 배율 (4×)은 우세하게 주변에서 종양 덩어리의 일반적인 분포 및 폐포 공간을 채우는 다수의 작은 증식성 종양 덩어리를 보여준다. 종양 세포는 다형성, 대형, 역형성이고, 창백한 양친화성 염색을 가지며, 미분화부터 분화된 샘암종 양상까지 다양하다. 종양 퇴행의 증거는 덩어리 주변에 존재하며 주로 대식세포의 침윤을 특징으로 한다.
도 45: 대상체 2010 (Ⅳ 아브락산®) 샘암종-3, 원시-1, 퇴행-0. 저-출력 배율 (2×)은 주변의 신생물 세포뿐만 아니라 대부분의 폐포 공간을 채우는 큰 증식성 종양 덩어리의 일반적인 분포를 보여준다. 대부분의 종양 세포는 우세하게 창백한 양친화성 염색을 갖는 미분화, 다형성, 대형, 역형성이다. 원시 세포는 더 작고, 난형이며, 가변성 소포 핵과 함께 중등도 내지 현저한 핵부동성인 호염기성 염색 세포질을 갖는다. 염증성 세포 침윤은 우세하게 호중구 및 대식세포이다. 이 영상은 종양 퇴행의 부재를 보여준다.
도 48: 대상체 4009 (IH nPac 1×/주 높음) 샘암종-0, 원시-0, 퇴행-4. 저-출력 배율 (2×)는 이전에 채워진 종양 덩어리의 일반적인 분포, 섬유성 결합 조직의 다수의 작은 영역의 존재, 중앙 콜라겐성 간질 및 섬유 세포가 말단 폐포 공간에서 관찰되고 두꺼운 폐포 격막이 종양 퇴행의 증거를 지지하는 것을 보여준다. 또한, 폐포 공간은 공통적으로 종양 퇴행의 추가적인 증거와로 대식세포 및 림프구의 침윤물로 채워진다.
도 51: 대상체 5010 (IH nPac 2×/주 낮음) 샘암종-1, 원시-0, 퇴행-3. 저-출력 배율 (2×)은 이전에 채워진 종양 덩어리의 일반적인 분포를 보여준다. 퇴행하는 덩어리는 가변적으로 작고, 무작위로 분포한다. 섬유성 결합 조직은 폐포 공간을 채우고/교체하는 것으로 보이며, 샘암종을 퇴행시키는 병소를 제시한다. 급성 괴사, 섬유성 결합 스캐폴딩, 대식세포의 혼합된 세포 침윤, 상피에서의 거대 세포 및 림프구뿐만 아니라 간질 주변은 종양 퇴행의 징후이다.
도 55: 대상체 6005 (IH nPac 2×/주 높음) 샘암종-1, 원시-0, 퇴행-4. 저-출력 배율 (2×)은 폐포 공간을 채우고/교체하는 섬유성 결합 조직의 다수의 작은 영역에서 이전에 채워진 종양 덩어리의 일반적인 분포를 보여주고, 이는 샘암종 세포의 이전의 침윤물의 병소를 제시한다. 종양 퇴행은 이전에 채워진 종양 덩어리의 섬유증, 중앙 콜라겐성 간질 코어 및 폐포 공간을 채우고/대체하는 주변 조직에서 섬유성 결합 조직, 격막의 비대뿐만 아니라 림프구 및 대식세포에 의해 침윤된 폐포 공간을 채우는 섬유세포의 존재에 의해 입증된다.
추가적인 형태학적 및 면역조직화학적 (IHC) 연구의 결과
연구에서 모두 120마리 동물의 H & E 슬라이드를 검토한 후, 치료 실험군에서 가능한 면역 반응이 관찰된 것으로 언급되었다. 이러한 결과를 추가로 조사하기 위해, 추가의 면역조직화학적 평가를 위해 동물의 하위집합를 각 실험군으로부터 선택하였다.
먼저, 모두 120마리의 동물을 검토한 병리학자에 의해 평가된 종양 퇴행의 추세를 17마리 동물의 하위집합를 검토하는 다른 병리학자와 비교하여 시료 크기 간의 유사한 추세를 확인하였다.
모두 120마리 동물에 대한 종양 퇴행 정도의 초기 평가는 전체 폐 조직의 관여 백분율을 나타내는 5-점 척도를 사용하여 준정량적으로 등급화하는 병리학자에 의해 시행되었다. 등급화 시스템은 다음의 등급화 척도를 기준으로 한다: 0 = 증거 없음, 1 = 폐 절편의 총 면적의 1 내지 25%, 2 = 폐 절편의 총 면적의 25 내지 50%, 3 = 폐 절편의 총 면적의 50 내지 75%, 4 = 폐 절편의 총 면적의 75 내지 100%. 이러한 평가는 다음과 같이 점수 매겨진 종양 퇴행으로 표현된 동물의 발병율을 보여준다: 처리하지 않은 대조군 0%, Ⅳ 아브락산® 10%, IH nPac 저용량 매주 1회 55%, IH nPac 저용량 매주 2회 55%, IH nPac 고용량 매주 1회 55% 및 IH nPac 고용량 매주 2회 65%.
유사한 준정량적 등급화 척도 (0 = 증거 없음, 1 = 폐 절편의 총 면적의 1 내지 19%, 2 = 폐 절편의 총 면적의 11 내지 50%, 3 = 폐 절편의 총 면적의 50% 초과, 4 = 완벽한 퇴행)를 사용하여 종양 퇴행을 평가하는 다른 병리학자에 의해 17마리 동물의 하위집합에 대한 검토가 수행되었다. 이러한 평가는 다음과 같이 점수 매겨진 종양 퇴행으로 표현된 동물의 발병율을 보여준다: 처리하지 않은 대조군 0%, Ⅳ 아브락산® 65 내지 69%, IH nPac 저용량 매주 1회 100%, IH nPac 저용량 매주 2회 100%, IH nPac 고용량 매주 1회 100% 및 IH nPac 고용량 매주 2회 100%. 이 검토 (17마리의 동물)는 이전의 검토 (120마리의 동물)와 유사한 양상을 제시하였고, 흡입된 실험군은 종양 퇴행을 갖는 동물의 최고 백분율을 보여주었다.
연구로부터 17마리 동물의 하위집합을 조직학적으로 검토하여, 종양 퇴행 및 면역 반응에 관한 흥미로운 양상이 관찰되었다. 다양한 실험군 중에서 상이한 2개의 주요 특징은 명확하게 종양 퇴행의 존재 및 정도, 그리고 수반되는 면역 반응의 존재 및 강도이었다. 조직학적 검토의 관찰 및 의견은 하기이다.
치료 실험군 없음
관찰: 도 60: 대조군 사례. 상단 행: H & E 염색된 절편. 하단 행: 면역조직화학적 염색.
열 1: (A) 다형성 핵, 유사분열 증가 및 샘 분화의 결핍을 갖는 큰 세포 시트로 구성된 샘암종의 약하게 분화된 영역. 종양 세포의 조밀한 충전 배열, 하부 오른쪽 구석에서 정상 폐 주변으로부터 예리한 구획 및 종양을 둘러싼 섬유성 캡슐의 결핍을 유의한다. (D) A에 나타낸 동일한 영역의 상응하는 케라틴 면역 염색. 이것은 판사이토케라틴으로 암종 세포의 민감하고 특이적인 표지를 나타낸다 (실선 화살표).
열 2: (B) 병소의 흔적 관 형성을 갖는 샘암종 (오른쪽 상단에 점선 화살표). 작은 림프구와 병소 대식세포로 구성된 중앙의 병소의 제한된 면역 세포 성분을 유의한다 (중앙의 실선 화살표). (E) 종양 세포 결절의 말초에서 최소 개수의 NK 세포 및 대식세포를 나타내는 CD11b 염색 (실선 화살표).
열 3: (C) 조밀하게 충전된 작은 성숙 림프구로 구성된 기관지 관련 림프 조직 (BALT)의 병소에 인접하여 성장하는 샘암종 (실선 화살표로 표시됨). BALT와 인접한 정상 기관지 라이닝과 밀접한 관련성을 유의한다 (왼쪽 상단 모서리의 점선 화살표). (F) 케라틴으로 염색된, C에서 보이는 것에 상응하는 병소는 암종 세포에서 양성 염색 및 림프 세포에서 염색 결여를 나타낸다.
주해: 동물 둘 다는 조밀하게 충전된 샘암종의 균일한 성장을 제시하였다. 종양은 종양 퇴행 및 경감되지 않은 종양 세포 성장의 증거없이 주변의 정상 폐 실질과 경계를 이루는 비교적 잘 구획된 경계를 가졌다. 이들 동물의 림프 침윤물은 경미하였고, 3차 림프 구조는 드물었다.
정맥내 (Ⅳ) 아브락산® 양성 치료 대조군
관찰: 도 61: Ⅳ 아브락산® 사례 (2003)는 결절의 말초 방향으로 종양이 점진적으로 더 작은 종양 세포 군집 및 단일 종양 세포로 분리되고, 관련된 면역 세포 침윤물이 증가하는 종양 퇴행을 갖는 샘암종의 결절을 보여준다.
열 1: (A) 침윤성 샘암종 결절의 저-출력 도면 (점선 화살표로 강조됨). 말초에서 종양 세포의 점진적인 분리 및 증가된 면역 세포 반응으로 인해 결절의 불규칙한 말초 경계를 유의한다 (실선 화살표). (D) A에 나타낸 동일한 영역으로부터의 상응하는 케라틴 면역 염색. 이것은 말초 방향으로 점진적으로 더 작은 크기의 종양 세포 결절 (점선 화살표) 및 이들 사이의 개입된 간질의 증가 (실선 화살표)를 분명히 입증한다.
열 2: (B) 영상 A의 영역의 고-출력 도면은 점진적으로 더 작은 종양 세포 군집을 보여준다 (점선 화살표). (E) 분리된 더 작은 종양 세포 결절을 강조하는, D로 나타낸 케라틴 염색된 영역의 고-출력 도면. 종양이 개별 단일 종양 세포 (점선 화살표)로 존재하는 곳에서, 오른쪽 상단 모서리부터 왼쪽 하단 모서리까지 이동하는 종양 세포 군집 크기의 점진적인 감소를 주목한다. 실선 화살표는 면역 세포와 함께 증가된 개입 간질을 강조한다.
열 3: (C) 종양 결절의 중심 내에서 관찰되는 면역 세포 (실선 화살표로 강조됨) (점선 화살표가 종양 세포를 강조함). (F) 영상 A에서 관찰되는 동일한 영역을 강조하는 CD11b-염색된 절편의 저-출력 도면. 이것은 결절 말초에 및 종양 결절 내에 면역 세포 (고체 화살표)의 밀도 증가를 보여준다. 점선 화살표는 CD11b 항체로 표지되지 않은 잔류 암종 세포를 강조한다.
[0024] 주해: 3마리의 동물 모두는 조밀하게 충전된 샘암종의 집합에서 종양 성장을 보였지만, 두 마리의 동물은 종양 퇴행과 호환되는 일부 특징을 보였다. 이러한 퇴행은 주변 정상 폐 실질과 경계를 이루는 불분명한 구획 경계를 갖는 종양 결절의 말초에서 종양 세포 군집의 점진적인 분리 및 손실의 존재를 특징으로 한다. 종양 손실을 보이는 영역의 림프 침윤은 간질에서 림프 침윤물의 증가를 보여주었다.
흡입된 nPac ® 치료 실험군
관찰: 도 62: 흡입된 nPac 사례.
상단 행: 저용량, 1×/주 (LD1×) (사례 3006). (A) 말초에서 종양 세포의 현저한 분리 및 손실을 갖는 결절에서 종양 퇴행을 나타내는 H/E 염색을 나타낸다 (점선 화살표는 잔류 종양을 나타내고, 실선 화살표는 염증이 있는 개입 간질을 나타냄). (B) 케라틴 염색은 림프구 및 대식세포를 갖는 배경 간질로 구성된 종양 손실의 큰 개입 영역 (실선 화살표)을 갖는 잔류 암종 (점선 화살표)을 강조한다. (C) CD11b 면역 염색은 종양 세포 손실 (실선 화살표)이 있는 영역에서 현저한 림프조직세포성 면역 세포 침윤물을 강조한다. 잔여 염색되지 않은 암종은 점선 화살표로 강조된다.
두 번째 행: 저용량, 2×/주 (LD2×) (사례 4009). (D) H/E 염색은 잔류 생존가능한 샘암종을 나타내지 않았다. 이러한 사례는 배경 간질 내에서 작은 림프구와 대식세포의 집합으로 구성된 이와 같은 산란된 병소를 포함하였다. 이들 결절 또는 폐 절편의 다른 곳에서 진단적 생존가능한 종양 세포가 관찰되지 않았다. (E) D와 동일한 영역에서 케라틴 염색은 염색 부족을 나타내어, 잔류 생존가능한 암종이 없고 완벽한 퇴행의 해석을 면역조직화학적으로 지지하였다. (F) CD11b 염색은 이러한 병소가 경미한 내지 중등 정도의 면역 세포 침윤물을 갖음을 보여준다.
세 번째 행: 고용량, 1×/주 (HD1×) (사례 5008). (G) 말초에서 종양 세포의 현저한 분리 및 손실을 갖는 결절에서 종양 퇴행을 나타내는 H/E 염색을 나타낸다 (점선 화살표는 잔류 종양을 나타내고, 실선 화살표는 염증이 있는 개입 간질을 나타냄). (H) 케라틴 염색은 잔류 암종 (점선 화살표) 및 림프구 및 대식세포를 갖는 배경 간질로 구성된 종양 손실의 크고 염색되지 않는 영역 (실선 화살표)을 강조한다. (I) CD11b 면역 염색은 종양 세포 손실 (실선 화살표)이 있는 영역에서 현저한 면역 세포 침윤물을 강조한다. 염색되지 않은 암종의 잔류 영역은 점선 화살표로 강조 표시된다.
네 번째 행: 고용량, 2×/주 (HD2×) (사례 6005). (J) H/E 염색은 호산구성 및 거품성 세포질을 갖는 세포를 포함하는 이러한 집합과 같은 수많은 집합물을 보여주었다 (저-출력). (K) 동일한 영역의 고-출력은 방추사가 붙은 핵 (실선 화살표)을 갖는 세포 및 드문 가능한 관 유사 구조 또는 작은 혈관 (점선 화살표)의 재생을 보여준다. (L) 메이슨 트리크롬 염색은 초기 콜라겐 섬유증 및 조직화와 부합하는 간질의 청색 염색을 보여준다.
다섯 번째 행: 고용량, 2×/주 (HD2×) (사례 6005 계속). (M) 케라틴 염색은 병소 단일 세포 및 관 유사 구조 (점선 화살표)의 표지를 나타낸다. 개입 세포는 케라틴에 대해 음성이다 (실선 화살표). (I) CD11b 면역 염색은 종양 세포 손실 (실선 화살표)이 있는 영역에서 면역 세포 침윤물을 강조한다. 이러한 영상의 배율은 저널에서의 배율과 일치한다.
주해: 12마리 동물 중 한 마리의 동물이 잔류 샘암종을 나타내지 않았으며, 완벽한 반응자 (비-생착 대비)로서 해석되었다. 한 마리 동물은 종양 또는 재생성 작은 혈관 및/또는 재생성/위축성 비-신생물성 폐 실질로서 구별하기 어려운 희귀한 종양 양성 염색 사례를 포함하기 때문에 분류하기 어려운 것으로 나타났다. 이와 같이, 이 두 번째 사례는 확장된 거의 완벽한 반응자로서 해석되었다. 이들 두 사례에서, 이전에 샘암종의 고형 군집을 포함한 것으로 추정되는 영역에서 면역 세포의 산란된 병소가 존재하였다. 한 사례는 메이슨의 트리크롬 염색에 의해 주목된 섬유성 콜라겐의 침착을 갖는 조직화의 증거를 제시하였다. 남은 10마리 동물 모두는 종양 결절의 > 50%에서 종양 퇴행을 나타내는 10마리 동물 중 8마리로 다양한 정도의 외관상 종양 퇴행을 갖는 종양 결절을 제시하였다. 흡입된 nPac 실험군은 잘 정의된 림프성 난포 및 배아 중심 및 난포간 영역 및 부피질 구역이 있는 밀집된 성숙한 림프 세포의 잘 정의된 조직화된 집합과는 다른 림프성 침윤물을 제시하였다. 뿐만 아니라 말초에서 그리고 종양 결절의 중심 내의 병소에 더 작은 조밀한 림프 조직의 집합을 제시하였다.
3차 림프 구조 (TLS)의 관찰
이차 림프 기관은 배아 발생 동안 유전적으로 미리 프로그램된 과정의 일부로서 발생하며, 주로 희귀한 항원 특이적 순수 림프구와 국소 조직으로부터 나온 항원 제시 세포 사이의 상호작용을 위한 위치를 제공하는 적응적 면역 반응을 개시하도록 작용한다. 이차 림프 조직의 기관형성은 또한 3차 림프 구조 (TLS)의 신규 림프 신생 과정 동안 성인기에도 재고될 수 있고, 암을 포함한 다양한 병리학적 병태로 고생하는 염증성 조직에서 형성될 수 있다. 기관지 관련 림프 조직과 같은 점막 관련 림프 조직의 기관 형성은 이러한 예 중 하나이다. 용어 TLS는 단순한 림프구의 군집으로부터 이차 림프 기관을 연상시키는 고도로 정교한 격리된 구조에 이르기까지 다양한 조직화의 구조를 말할 수 있다. 림프절과 TLS의 주목할만한 차이점는 림프절이 피막화되는 경우 TLS가 기관 또는 조직 내에 한정된 면역 및 간질 세포의 회합을 나타내는 것이다.
관찰: 도 63: 치료되는 및 치료되지 않은 사례의 림프 구조.
상단 행: 모낭 증식으로 3차 림프 구조 (TLS)를 보여주는 흡입된 nPac 사례. 고용량, 주당 2×/주 (HD2×) (사례 6007). (A) 2개의 인접한 TLS를 보여주는 H/E 염색 (실선 화살표로 강조됨). 폐에서, 이들은 기관지 관련 림프 조직 (BALT)으로 지칭된다. 이들 TLS의 기관 외양은 현저한 배아 중심을 갖는 림프성 난포, 난포내 영역 및 부피질 구역을 갖는 림프성 난포를 포함하는 뚜렷한 토폴로지를 갖는 조밀한 림프 조직의 잘 구획된 집합으로 구성되는 점을 유의한다. 점선 화살표는 종양 퇴행과 부합하는 불규칙한 말초 경계를 갖는 종양의 인접한 병소를 강조한다. (B) A 영역의 고-출력 영상. 더 작은 TLS에는 현저한 배아 중심을 갖는 림프 난포를 포함한다 (화살표 말단에 창백한 영역). 림프성 난포에서 생식 중심 형성 과정은 난포 림프성 증식으로 지칭되며, 활성화된 림프 조직을 가리키고, 외래 물질 및 종양 잔해를 포함한 다양한 항원에 대한 면역 반응을 일으키는 과정에 있다. 배아 중심은 특징적으로 림프 세포의 명암 구역을 갖는 편광화를 보여준다. 이 영상에서, 배아 중심의 창백한 구역은 인접한 종양 결절을 가리키고 있다. (C) 불규칙한 말초 경계를 갖는 인접한 암종 결절을 보여주는 케라틴 염색. 실선 화살표는 TLS를 나타낸다. 이 조직 절편이 A 및 B에 도시된 H/E 염색된 절편의 조직과 비교하여 파라핀 포매된 조직의 더 깊은 부분으로부터 나왔기 때문에 이러한 TLS는 이 절편에서 더 작게 보인다.
두 번째 행: 대조군 (D), Ⅳ 아브락산® (E) 및 nPac (F) 사례 간의 비교는 상이한 실험군의 종양 결절과 연관된 더 작은 림프 집합의 수 및 밀도의 차이를 설명한다. 이러한 3개의 영상은 모두 동일한 저-출역 배율 (4× 대물 렌즈)이다. (D) 대조군 사례 (1003)는 임의의 구별되는 림프구 집합이 없는 조밀하게 충전된 샘암종 (점선 화살표)을 보여준다. (E) Ⅳ 아브락산® 사례 (2009)는 샘암종의 결절 (점선 화살표) 및 오른쪽 하부에 단 하나의 희귀한 작은 림프 집합 (실선 화살표)을 보여준다. (F) nPac 사례, 고용량 2×/주 (HD2×)는 다수의 작은 림프 세포와 관련된 중소 크기의 집합을 갖는 샘암종 결절을 보여준다 (점선 화살표). 이들은 종양의 주변에 또한 종양 내에서 병소에 배열된다 (실선 화살표).
주해: 흡입된 nPac 실험군은 대조군 및 Ⅳ 아브락산® 실험군과 비교하여 (저-출력 필드 당 1개) TLS의 수 및 밀도의 증가 (저-출력 필드 당 2개)를 나타내었고, 더 많은 TLS는 현저한 배아 중심을 포함하는 난포성 림프 증식으로 크기 증가 및 활성화를 나타내었다.
요약하면, 17마리 동물의 하위 검토는 종양 퇴행 및 면역 반응과 관련하여 여러 흥미로운 양상을 제시하였다. 구체적으로, nPac으로 처리된 모든 동물은 완전한 및/또는 거의 완전한 퇴행을 나타내는 2마리의 동물을 포함하는 종양 퇴행과 호환되는 적어도 일부 특징을 나타내는 한편, 이러한 실험군에서 나머지 10마리 동물 중 8마리는 종양 결절의> 50%에서 종양 퇴행과 호환되는 일부 특징을 나타내었다. 이것은 반응을 보인 동물이 없는 대조군 및 3마리 동물 중 2마리가 종양 결절의 1 내지 10%의 종양 퇴행을 나타낸 Ⅳ 아브락산® 실험군과 비교하여 증가된 반응이었다.
nPac 실험군을 서로 평가하여, 더 높은 용량 및 용량의 빈도 증가 (2×/주 대비 1×/주)는 모두 종양 반응에 미치는 더 큰 효과와 관련이 있었다. 데이터는 종양 퇴행과 면역 기반의 연관성을 지지하며, nPac 실험군은 대조군 및 Ⅳ 아브락산® 실험군과 비교하여 (저-출력 필드 당 1개) TLS의 수 및 밀도의 증가 (저-출력 필드 당 2개)를 나타내었고, 더 많은 TLS는 현저한 배아 중심을 포함하는 난포성 림프 증식으로 크기 증가 및 활성화를 나타내었다. nPac 실험군의 종양 결절 주변 및 종양 결절 내에 면역 세포의 밀도가 더 높았다.
결론
127개의 NIH-rnu 누드 래트를 1일째 면역억제를 유도하기 위해 x-선 조사하였다. 0일째 기관내 (IT) 점적주입에 의해 동물에게 Calu3 종양 세포를 투약하였다. 동물은 3주의 성장 기간을 거쳤다. 셋째 주 동안, 동물들은 체중 계층화에 의해 실험군으로 무작위로 배정되었다. 4주차에 시작하여, 실험군 2의 동물은 22일, 29일 및 36일째 정맥내 (Ⅳ) 투약 (5 mg/kg)에 의해 아브락산®이 매주 1회 투약되었다. 실험군 3 및 4의 동물은 각각 저용량 (0.5 mg/kg) 및 고용량 (1.0 mg/kg)으로 nPac의 흡입 (INH) 용량이 매주 (월요일) 1회 투여되었다. 실험군 5 및 6의 동물은 각각 저용량 (0.50 mg/kg) 및 고용량 (1.0 mg/kg)으로 nPac의 목표 흡입 용량이 매주 (월요일 및 목요일) 2회 투여되었다. 실험군 1의 동물을 정상적인 종양 세포 성장의 대조군으로서 처리하지 않은 채로 두었다. 8주차 동안 모든 동물을 괴사시켰다.
모든 동물은 지정된 부검 시점까지 생존하였다. 모델과 관련된 임상 관찰에는 피부 발진 및 호흡 곤란이 포함되었다. 모든 실험군은 연구 과정을 통해 거의 동일한 비율로 체중을 늘렸다.
매주 1회 저용량 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 270.51 μg/L 및 263.56 μg/L이었다. 매주 1회 저용량 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 흡입 노출 평균 파클리탁셀 에어로졸 농도는 각각 244.82 μg/L 및 245.76 μg/L이었다.
용량은 평균 에어로졸 파클리탁셀 농도, 가장 최근의 평균 실험군 체중, 10%의 추정된 침착 분율 및 33분 또는 65분의 노출 지속기간을 기준으로 하였다. 치료 4주 동안, 매주 1회 저용량 nPac 실험군 및 매주 2회 저용량 nPac 실험군에 대한 달성된 평균 설치류 침착 용량은 각각 0.655 mg/kg 및 0.640 mg/kg (1.28 mg/kg/주)이었다. 매주 1회 고용량 nPac 실험군 및 매주 2회 고용량 nPac 실험군에 대한 달성된 평균 설치류 침착 용량은 각각 1.166 mg/kg 및 1.176 mg/kg (2.352 mg/kg/주)이었다. 아브락산®의 Ⅳ 주사가 투여된 실험군의 경우, 22일, 29일 및 36일째 평균 용량은 각각 4.94, 4.64 및 4.46 mg/kg이었다.
예정된 부검 시, 각 실험군의 동물 대부분은 폐의 황갈색 결절 및/또는 폐의 적색 또는 황갈색 반점 탈색을 가졌다. 다른 일시적 관찰에는 한 동물의 복부 탈장과 또 다른 동물의 심장 주위의 결절이 포함되었다. 부검 시, 다른 비정상적 전반적 관찰은 관찰되지 않았다.
아브락산® 처리된 동물에서, 폐 무게, 폐 대 BW 비율과 폐 대 뇌 무게 비율은 미처리된 대조군과 비교하여 유의하게 낮았다. 매주 1회 nPac 고용량 실험군은 아브락산® 실험군과 유사한 무게를 가졌으며, 미처리된 대조군과 비교하여 폐 무게와 폐 대 뇌 비율이 유의하게 낮았다.
양성 대조군 Grp. 1 및 아브락산® 처리된 비교 Grp. 2와 비교하여, 명백한 부작용 없이 더 낮은 폐/뇌 무게비 및 더 낮은 전체 폐 종양 부하에 의해 측정되는 치료적 효과가 있었다. 흡입된 nPac으로 치료한 폐 종양 부하의 조직학적 분석은 종양 덩어리의 감소, 원시 종양 세포 집단의 감소 및 종양 퇴행의 증가를 보여준다. 광범위한 단핵구성 세포 침윤이 흡입을 통해 nPac이 투여된 동물의 폐에서 관찰되었다. 사용된 모델이 T 세포 결핍이기 때문에, 세포는 B 세포 또는 NK 세포일 가능성이 있다. nPac에 대한 종양의 국소화된 가능한 더 높은 농도 노출이 환경의 변화를 유도하고 폐 내로 단핵 세포 침윤을 가져올 종양을 침범한 것으로 가정한다.
실시예 7. 인간 방광암 (UM-UC-3) 마우스 이종이식 연구
면역저하된 (Hsd: 무흉선 누드-Foxn1nu 누드) 마우스에서 피하 (SC) UM-UC-3 방광암 세포주 (ATCC-CRL-1749) 종양의 성장에서 nDoce (본원에 개시된 바와 같은 나노입자 도세탁셀, 본 실시예에서 사용된 1.078 마이크론의 평균 입자 크기(수), 37.2 m2/g의 SSA 및 0.0723 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)를 갖는 대략 99% 도세탁셀) 현탁액의 매주 1회, 2회, 및 3회 종양내 주사(IT) 투여 (투여주기)의 효과를 평가하기 위한 연구를 시행하였다. 운반체의 종양내 주사 투여 및 도세탁셀 용액의 정맥내 (Ⅳ) 투여가 또한 대조군으로 본 연구에 통합되었다.
종양을 오른쪽 옆구리 내로 1 x 107개 세포 (100μL 부피)로 이식하였다 (매트리겔: BD356234과 PBS 1 : 1). 종양 부피를 캘리퍼로 결정하였다. 수학식: V = (길이 * 너비 * 높이) * ð * 4/3. 동물은 2×/주 무게를 측정하였다. 종양 부피를 종양 이식에 이어서 3일 내지 4일마다 (총 ~ 20회 측정) 그리고 안락사의 일에 결정하였다. 이식 후 2주, 3주 및 4주 그리고 안락사의 일에 종양의 사진 영상을 얻었다. 일단 종양이 3,000 mm3의 크기 또는 유의한 종양 궤양화의 지점까지 도달하면 동물을 안락사시켰다. 안락사 시, 종양을 단리하여 절반으로 분할하였다. 종양의 이분의 일을 -80℃에 보관된 LN2에서 급속 냉동하였고, 후속적으로 분석할 것이다. 종양의 나머지 절반을 포르말린으로 고정시켰다. 2개의 H&E 염색된 슬라이드/종양을 준비하였다 (최대 4개 종양/실험군이 프로세싱됨).
종양 이식 후 18일째, 평균 종양 크기가 50 내지 325 mm3일 때, 동물을 균등한 평균 종양 크기를 갖는 5개의 실험군으로 선별하고, 하기 표 25에 나타낸 바와 같이 처리하였다.
Figure pct00039
Figure pct00040
IT 투여 (운반체/nDoce)의 경우, 주사 (27G, ½" 바늘을 사용함)를 종양 전반에 걸쳐 테스트 제형물의 분포를 최대화하도록 종양 내의 3개 부위에 투여하였다 (40 mg/mL nDoce 스톡 및 25 g 마우스를 기준으로 총 계산된 주사 부피 = 63 μL; 3개 주사 부위에 걸쳐 고르게 분할됨). 제 2 치료 (2주기)는 제 1 치료 (1주기)에 이어서 7일째 이루어졌고, 제 3 치료 (3주기)는 제 1 치료에 이어서 14일째 이루어졌다. 도세탁셀 용액 Ⅳ는 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.
테스트 제형물은 다음과 같이 준비하였다:
운반체 (대조군): 1.5 mL의 정상 식염수 (주사용 0.9% 염화나트륨 USP)로 정상 식염수 (주사용 0.9% 염화나트륨) 재구성 용액 중 1 mL의 1% 폴리소르베이트 80/8% 에탄올을 희석시켰다. 운반체에서 폴리소르베이트 80의 최종 농도는 0.4%이고, 에탄올의 최종 농도는 3.2%이었다.
nDoce 현탁액: 정상 식염수(주사용 0.9% 염화나트륨) 재구성 용액 중 1 mL의 1% 폴리소르베이트 80/8% 에탄올을 nDoce 입자 분말의 바이알 (100 mg/60 cc 바이알) 내에 첨가하였다. nDoce 입자 분말의 평균 입자 크기(수)는 1.0 마이크론이었다. 바이알을 격렬하게 손으로 1분 동안 뒤집으며 진탕하였다. 진탕한 직후, 1.5 mL의 정상 식염수 용액(주사용 0.9% 염화나트륨 USP)을 바이알에 첨가하고, 바이알을 추가 1분 동안 손으로 진탕하여 40 mg/mL 현탁액을 제조하였다. 포집된 공기와 거품을 줄이기 위해 현탁액을 적어도 5분 동안 그대로 두었다.
도세탁셀 용액: 50% 에탄올/50% 폴리소르베이트 80 중 20 mg/mL 도세탁셀 스톡 용액을 제조하였다. 최종 3 mg/mL의 도세탁셀 용액을 준비하기 위해 스톡 용액에 정상 식염수 용액 (주사용 0.9% 염화나트륨)을 첨가하였다. 볼텍싱하여 혼합하였다.
결과:
종양 부피를 연구의 기간 (61일) 동안 2×/주로 결정하였다. 연구 결과는 도 64, 도 65, 도 66, 도 67, 도 68, 도 69, 도 70, 도 71, 도 72 및 도 73에 나타낸다. 도 64에 나타낸 바와 같이, 종양 부피 줄어들었고, 종양은 nDoce IT 2주기 및 nDoce IT 3주기의 용량에 대해 효과적으로 제거되었다. 종양 부피는 nDoce IT 1주기 및 도세탁셀 Ⅳ 3주기의 용량에 대해 초기에 줄어들었으나, 후속적으로 증가되었다. 이러한 관찰은 또한 도 65, 도 66, 도 67, 도 68, 도 69, 도 72 및 도 73에 반영되었다.
도 70의 산점도는 치료 1일째 대 연구 종료 시 (희생 일) 동물 당 종양 부피를 나타낸다. 도 70에서 관찰된 바와 같이, 연구의 종료 시 주어진 동물에서 종양의 부피는 필수적으로 모든 종양이 효과적으로 제거되지 않기 때문에, nDoce IT 2주기 및 nDoce IT 3주기로 처리된 동물에 대해 동일한 동물의 초기 종양 크기에 의존하지 않았다. 그러나, 도세탁셀 Ⅳ 3주기로 처리된 동물의 경우, 연구 종료 시 종양의 부피는 일반적으로 주어진 동물의 초기 종양 부피에 의존적이었고, 즉 초기 종양 부피가 클수록 연구의 종료 시 종양 부피가 더 크다. 도세탁셀 Ⅳ 3주기로의 치료는 작은 종양을 치료하는데 어느 정도 효과적이었지만, 큰 종양을 치료하는데는 매우 효과적이지 않았다. 2주기 또는 3주기 동안 nDoce IT (종양내) 투여는 초기 종양 크기에 무관하게 종양을 효과적으로 치료하였다.
도 71에서 관찰된 바와 같이, 도세탁셀 Ⅳ 3주기로 처리된 동물에 대한 초기 동물 체중 손실은 nDoce IT 1주기, nDoce IT 2주기 및 nDoce IT 3주기로 처리된 동물의 결과보다 일반적으로 더 컸다. 결국 모든 치료에서 체중이 어느 정도까지 회복되었다. 이것은 초기 식욕 상실의 부작용이 nDoce IT 투여보다 도세탁셀 Ⅳ 투여에서 더 큰 것을 시사할 수 있다. 도세탁셀 Ⅳ 3주기로 처리된 동물은 nDoce IT 3주기로 처리된 동물보다 말초 신경병증의 징후가 더 큰 것으로 관찰되었으며, nDoce IT 1주기 또는 2주기로 처리된 동물에서 말초 신경병증의 징후는 관찰되지 않았다.
사망 또는 안락사 일에, 종양 조직 시료를 수집하고, 도세탁셀 분석, 조직학 및 면역조직화학(IHC) 관찰을 위해 LN2에서 냉동하였다. Ⅳ 도세탁셀 대조군에서, (측정된 7개 중) 단지 1개 종양이 검정의 정량화의 한계 (1 ng/g)를 초과하는 도세탁셀 수준을 가졌다. 측정가능한 수준의 도세탁셀은 IT nDoce 실험군으로부터의 모든 종양에서 발견되었으며, nDoce 3주기 실험군은 종양에 남아있는 도세탁셀 농도가 가장 높은 경향이 있다 (도 74 참조). 조직학 슬라이드, H&E 염색의 현미경 사진은 도 75 내지 도 85에 나타낸다. F4/80 항체 염색으로 염색된 IHC 슬라이드의 현미경 사진을 도 86, 도 87 및 도 88에 나타낸다.
추가적인 H&E 및 면역조직화학 (IHC) 평가를 포르말린-고정된 조직 상에서 시행하였고, 도 89 및 도 90에 나타낸다.
도 75 내지 도 85에서의 현미경 사진의 조직학적 개요
일반적인 관찰:
대조군: 증식하는 세포를 갖는 생존가능한 종양의 확장된 수준 및 면역 세포 침윤은 거의 또는 전혀 없고, 때로 대식세포가 주목됨.
도세탁셀 용액: 일부 종양 괴사와 함께 일부 대식세포 및 때로 림프구성 반응을 갖는 다수의 생존가능한 종양 덩어리.
nDoce 2주기: 일부 남아있는 고립된 종양 세포, 관찰된 피부 손상, 상처/섬유증의 작은 영역, 대식세포와 단핵 세포를 포함하는 면역 세포 침윤물.
nDoce 3주기: 일부 남아있는 고립된 종양 세포, 관찰된 피부 손상, 상처/섬유증의 작은 영역, 대식세포와 단핵 세포를 포함하는 면역 세포 침윤물.
광범위한 단핵구성 세포 침윤이 nDoce의 종양내 주사가 투여된 동물의 피하 공간의 종양 이식 부위에서 관찰되었다. 주기 횟수가 증가하면서 종양 반응이 증가하지만, 누드 마우스 옆구리에 주사하기 위한 작은 공간과 얕은 영역 (예를 들어, 종양을 단단히 둘러싼 피부에 대해 밀착된 종양)으로 인해 일부 피부 손상이 있을 수 있다. 사용된 모델이 T 세포 결핍이기 때문에, 림프구성 세포는 B 세포 또는 NK 세포일 가능성이 있다. B 세포는 세포독성의 생성을 책임진다 (항체는 Fc 수용체를 발현하는 세포에 결합하여 이들 세포의 살상 능력을 증진함). NK 세포는 종양 세포의 살상에 결정적인 선천성 림프 세포이다. 종양에 걸린 환자에서, NK 세포 활성은 종양의 성장을 허용하도록 감소된다. T 세포와 함께, NK 세포는 일부 체크포인트 저해제의 표적으로 이들의 활성을 증가시킨다. 제공된 모든 조직학적 시료에서, 대식세포가 종양에 존재했지만, 그 수는 유의하게 증가하는 것으로 보이지 않았다.
촉발성 또는 저해성 신호를 전달할 수 있는 다양한 유형의 표면 수용체의 사용에 의해, NK 세포는 세포가 비정상 (종양 또는 바이러스로 감염됨)이고 세포독성을 통해 제거되어야 하는지 여부를 확인하기 위해 이들의 환경 내의 세포를 모니터링할 수 있다. NK 세포의 세포독성 및 화학주성은 종양 세포 및 이들의 부산물을 포함한 많은 병리적 과정에 의해 변형될 수 있다. 특정 신호에 반응하여 이들의 기능이 증진되거나 강화된다. 상이한 톨 유사 수용체 (TLR)를 사용함으로써 여러 병원체 연관된 분자적 양상 (PAMP)에 반응하여, NK 세포는 사이토카인 생성 및/또는 세포용해 활성을 증가시킬 수 있다. IL-2, IL-15, IL-12, IL-18 및 IFN α/
Figure pct00041
를 포함한 사이토카인은 또한 NK 세포의 활성을 변형시킬 수 있다. NK 세포는 단지 상이한 종양 세포 표적을 살상할 수 있는 세포용해 효과기인 단순한 세포가 아니며; 오히려 이들은 다양한 환경적 맥락에서 활성을 미세하게 조정할 수 있는 불균질한 집단을 나타낸다.
종양 부하는 nDoce로 처리된 동물에서 이종이식 주사 부위에서 유의하게 감소되고, 종양내 주사가 정맥내 도세탁셀보다 더 효과적이다. 따라서, nDoce 형태의 도세탁셀의 국소화된 투여는 추가적인 효력을 제공한다. 이것은 시간 경과 시 화학요법에 더 긴 노출과 종양 부위로의 격렬한 세포 침윤 둘 다로 인할 수 있다. 이러한 후자의 반응은 용량 밀도 (실제 용량 및 용량 빈도)에 의존하는 것으로 보였다. 해부학적으로, 대식세포는 종양 내에서 더 깊이 이동하는 간질 전반에 걸쳐 빈도가 감소하면서 종양의 가장자리에서 많은 수로 존재한다.
도 86, 도 87 및 도 88의 면역조직화학 개요
도 86: 생존가능한 종양 세포의 방대한 시트 및 단핵구성 면역 세포가 없음 (갈색 염색 없음).
도 87: 방대한 수의 생존가능한 종양 세포 중에서 종양 세포 파괴가 거의 없고 소수의 산란된 단핵구성 면역 세포.
도 88: 사실상 종양 세포가 남아있지 않고, 구별된 양상으로 조직화된 방대한 수의 단핵구성 면역 세포 (대부분 대식세포 같음).
추가적인 H&E 및 면역조직화학적 (IHC) 평가 (도 89 및 도 90 참조)
종양 조직을 H&E 및 IHC 염색 이전에 고정하였다. 방광 조직 절편을 탈파라핀화하고, 표준 H&E 및 IHC 염색으로 프로세싱하였다. 치료 실험군 당 적어도 4개의 종양을 프로세싱하였다.
관찰: 도 89: 대조군 사례.
상단 행: H & E 염색된 절편 (A 내지 C): (A) 밀집된 큰 다형성 종양 세포의 시트로 구성된 방광 암종. (B) 현저한 핵소체를 갖는 큰 종양 세포 (실선 화살표) 및 유사분열 양상의 현저한 증가 (점선 화살표)를 나타내는 고-출력 도면. (C) 혼합된 퇴행성 종양 세포 (점선 화살표) 및 영상의 하단 및 상단에서의 인접한 생존가능한 암종 (실선 화살표)을 갖는 지도상 종양 세포 괴사의 병소를 나타내는 저-출력 도면.
하단 행: IT 운반체 (D) 및 Ⅳ 도세탁셀 (E 및 F): (D) IT 운반체 사례 (사례 A3). 영상의 하단 절반에서 광범위한 괴사(점선 화살표) 및 상단 왼쪽에서 생존가능한 암종 (실선 화살표)을 나타내는 H&E 염색된 절편. (E) Ⅳ 도세탁셀(사례 B1). 대조군 및 IT 운반체 사례와 유사하게 보이는 영상의 오른쪽 상단 부분에서 생존가능한 암종을 나타내는 H&E 염색된 절편 (실선 화살표). 종양을 둘러싸는 피막이 없는 왼쪽 하부의 비-신생물 지방 조직의 예리한 구획을 유의한다 (점선 화살표). 지방은 희박한 면역 세포 침윤물을 포함하였다. (F) Ⅳ 도세탁셀 (사례 B1). CD68 염색은 영상의 하단 절반에서 주변 간질에서 경미한 대식세포 침윤물을 강조한다 (점선 화살표). 생존가능한 암종이 영상의 상단에 있다 (실선 화살표).
관찰: 도 90 종양내 nDoce 사례(포함된 모든 실험군으로부터의 대표적인 영상: 1주기, 2주기 및 3주기).
상단 행: 1주기 nDoce (1×) (사례 C4). (A) 비-생존가능 괴사성 물질 (점선 화살표)의 균질한 호산구성 염색으로 구성되는 광범위한 지도상 종양 세포 괴사를 나타내는 저-출력 H/E 염색. 괴사는 영상의 오른쪽 상단에서의 피복된 마우스 피부 표면 (2개의 실선 화살표)으로부터 왼쪽 하단 모서리에서의 병소의 생존가능한 암종 (단일 실선 화살표)까지 걸쳐있다. (B) 왼쪽에서 생존가능한 암종 (실선 화살표) 및 오른쪽에서 괴사(점선 화살표)의 고-출력 도면. (C) 주변의 비-신생물성 지방 조직에서 경미한 대식세포 침윤물 (실선 화살표)을 나타내는 CD68 면역조직화학적 염색.
두 번째 행: 2주기의 nDoce 처리 (2×) (사례 D2). (D) 최대 크기 2 mm로 측정된 3차 림프 구조 (TLS)를 나타내는 저-출력 도면 (실선 화살표). 잘 구획된 TLS 경계 및 면역 세포 침윤물이 있는 주변 조직으로부터의 구획을 유의한다. 피복하는 궤양성 피부를 유의한다 (점선 화살표). (E) CD45R 면역염색 (B 세포 마커)은 TLS 전체에 걸친 광범위한 염색을 보여주고, TLS에서 대부분의 림프구가 B 세포임을 검증한다. B 세포 림프성 난포 (실선 화살표) 내의 조직화 및 난포간 "T 세포" 구역을 나타내는 병소의 염색되지 않는 영역 (점선 화살표)을 유의한다. (F) 동일한 TLS의 고-출력 도면. 림프성 난포 중 하나에 형성되는 골수동 (점선 화살표)과 배아 중심 (실선 화살표)을 포함하는 넓은 영역을 갖는 TLS의 조직화를 유의한다.
세 번째 행: 2주기의 nDoce 처리 (2×) (사례 D2), 계속됨. (G) 배아 중심의 고-출력 도면. 작은 성숙한 림프구, 중간 크기의 중심세포 및 때로 더 큰 중심모세포 (실선 화살표)의 혼합된 집단으로 구성된 배아 중심에서의 다형성 림프 집단을 유의한다. 이것을 작은 성숙한 림프구 (점선 화살표)의 인접한 균질 집단과 비교한다. (G) 동일한 사례는 왼쪽에 궤양성 피부가 있는 별도의 영역 (점선 화살표) 및 오른쪽에 괴사 조직 (실선 화살표)을 나타낸다. 생존가능한 암종은 없다. (H) 진단적 생존가능한 암종이 없는 균질한 호산구성 무정질 괴사 물질을 나타내는 괴사 영역의 고-출력 도면.
네 번째 행: 3주기의 nDoce 처리 (3×) (사례 D2). (J) 기저 괴사 (점선 화살표)를 갖는 상단에서의 궤양성 피부 표면을 나타내는 저-출력 도면. 영상의 오른쪽 하부 부분에서 인접한 TLS를 유의한다 (실선 화살표). (J) TLS에서 B 세포의 조밀한 집단 (실선 화살표)을 나타내는 CD45R-면역염색된 절편의 저-출력 도면. (H) 진단적 생존가능한 암종 세포가 없는 무정질 괴사 물질을 나타내는 피부 궤양 아래의 괴사 영역의 고-출력 도면.
조직병리학:
미처리된 대조군: 부검 일에, 미처리된 대조군 동물의 종양 부피를 측정하고, 이어서 종양 부위 조직을 절제하고, 대략 절반의 종양을 도세탁셀 함량에 대해서 처리하고, 절반을 조직학적 분석을 위해서 보존하였다. 미처리된 대조군 종양은 슬라이드에서 최대 15 mm로 측정된 침윤성 암종의 광범위한 확산성 증식을 포함하고, 밀집된 종양 세포 시트로 구성되었다 (도 89 - 슬라이드 A). 종양 세포는 소포성 염색질 및 현저한 호산구성 핵소체를 갖는 다형성 핵을 가져서 컸다. 종양 세포는 중간 정도의 양의 약간 호산구성 세포질을 가졌고, 이들은 매우 증가된 유사 분열 활성을 나타내었다 (10 고-출력 필드 당 122개 유사 분열 [400× hpf])(도 89 - 슬라이드 B). 개별적으로 괴사성 또는 세포사멸 종양 세포가 종양 내에 존재하였고, 전반적으로 종양 면적의 5 내지 10%를 점유한 응고성 종양 세포 괴사의 산란된 영역이 존재하였다. 괴사의 병소는 균질한 호산구성 괴사 잔해로 구성되었고, 이것은 혼합된 퇴행성 종양 세포의 영역을 포함하였다 (도 89 - 슬라이드 C). 종양 내에 상당한 림프 침윤물은 없었으며, 구체적으로 종양 조직 또는 주변의 비-신생물성 간질 조직에는 구별된 작은 림프 집합 또는 3차 림프 구조 (TLS)가 없었다. 주변 간질은 반점으로 보이는 경미한 면역 세포 침윤물을 함유하였다. CD68 (대식세포의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 증가된 세포 잔해를 함유하는 영역에서 대식세포의 농도 증가와 부합하는, 종양 괴사의 병소 내의 염색의 밀도 증가를 갖는 종양 내부 및 주변의 경미한 대식세포 침윤물을 강조하였다.
미처리된 종양내 운반체 실험군: 부검 일에, 이들 IT 운반체 동물의 종양 부피를 측정하고, 이어서 종양 부위 조직을 절제하고, 대략 절반의 종양을 도세탁셀 함량에 대해서 처리하고, 절반을 조직학적 분석을 위해서 보존하였다. 종양내 운반체의 두 사례는 형태학적 및 면역조직화학적 수준에서 유사한 결과를 보여주었으며, 둘 다는 상기에 언급된 대조군 사례에서 관찰되는 것과 유사한 형태학적 및 면역조직화학적 외관을 가졌다. 구체적으로, 둘 다의 사례는 대조군 사례에서 관찰되는 것과 동일한 외관을 갖는 큰 암종 세포의 확장된 시트를 포함하였다. 생존가능한 종양을 각각 이들 두 사례의 슬라이드 상에서 최대 12 내지 24 mm의 최대 치수로 측정하였다. 둘 다의 사례는 또한 지도상 괴사 영역을 포함하였고, 이것은 종양 영역의 50% 초과를 점유하는 한 사례에서 상당히 광범위하였다 (사례 A3)(도 89 슬라이드 D). 존재하는 곳에서, 경미한 면역 세포 침윤물을 함유하였지만, 둘 다의 경우 평가를 위한 비-신생물 조직은 매우 제한적이었다. TLS가 존재하지 않았다.
정맥내 도세탁셀: 부검 일에, Ⅳ 도세탁셀 동물의 종양 부피를 측정하고, 이어서 종양 부위 조직을 절제하고, 대략 절반의 종양을 도세탁셀 함량에 대해서 처리하고, 절반을 조직학적 분석을 위해서 보존하였다. Ⅳ 도세탁셀의 두 사례는 형태학적 및 면역조직화학적 수준에서 유사한 결과를 보여주었으며, 둘 다는 상기에 언급된 대조군 사례 및 IT 운반체 두 사례에서 관찰되는 것과 유사한 형태학적 및 면역조직화학적 외관을 가졌다. 구체적으로, 두 사례 모두 큰 살아있는 암종 세포의 시트를 함유하였고, 두 경구 각각에서 종양 영역의 11 내지 50% (사례 B1) 및 50 내지 90% (사례 B3)를 차지하는 지리적 종양 세포 괴사의 산재된 영역을 함유하였다(하기 표 29; 도 89 - 슬라이드 E 및 도 89 - 슬라이드 F 참조). 둘 다의 사례는 슬라이드 상에서 최대 치수가 10 mm 초과 (11 mm 및 15 mm)로 측정된 종양 덩어리를 가졌다 (하기 표 26 참조). 주변 간질 조직은 경미한 면역 세포 침윤물을 함유하였다. TLS가 존재하지 않았다.
종양내 nDoce 1주기: 이 실험군의 모두 3마리의 동물은 대조군, IT 비히클군 및 Ⅳ 도세탁셀군에서 인지되는 것과 유사한 다형성 세포로 구성된 잔존 암종을 함유하였다. 그러나, 잔류 암종의 양은 이 실험군 내에서 극적으로 달라졌다. 구체적으로, 3개의 사례 중 두 사례 (사례 C1 및 C6)는 슬라이드 상에서 최대 치수가 16 mm 및 19 mm로 측정된 과도한 잔류 생존가능한 암종을 함유하였다. 이들 두 사례는 또한 종양 영역의 11 내지 50%를 점유하는 지도상 괴사를 가졌다. 이들 두 사례 중 하나 (사례 C1)는 경미한 면역 세포 침윤물을 갖는 적은 양의 비-신생물 조직을 함유하였다. 나머지 사례는 주변의 면역 세포 침윤물을 평가하기 위해서 존재하는 임의의 비-신생물 조직을 갖지 않았다 (사례 C6). 대조적으로, 세 번째 사례 (사례 C4) 는 종양의 50 내지 90%의 괴사를 나타내었고, 이러한 사례에서는 슬라이드 상에 최대 단면 치수가 2.5 mm로 측정된 잔류 생존가능한 암종의 작은 병소만 존재하였다 (도 90 - 슬라이드 A 및 도 90 - 슬라이드 B). 이러한 동일한 사례에서 주변 비-신생물 간질은 경미한 면역 세포 침윤물을 함유하였다 (도 90 - 슬라이드 C). 또한, 더 깊은 면역조직화학-염색된 절편에서 TLS가 인접한 비-신생물 지방 조직에서 주목되었다. TLS는 최대 치수에서 대략 1 mm로 측정되었으며, 림프성 난포 및 넓은 영역으로의 조직화를 나타내는 작은 성숙한 림프구의 조밀하고 잘 구획된 집합으로 구성되었다. CD45R에 대한 염색은 TLS에서 대부분의 림프구가 B-세포였고, 이들은 TLS 내에서 B-세포 여포로 조직화되었음을 나타냈다. 미처리 및 운반체 대조군에서와 같이, 부검 일에 이들 동물의 종양 부피를 측정하고, 이어서 종양 부위 조직을 절제하고, 대략 절반의 종양을 도세탁셀 함량에 대해서 처리하고, 절반을 조직학적 분석을 위해서 보존하였다.
종양내 nDoce 2주기: 이 실험군의 5마리 동물 중 4마리는 조직학적 분석을 위해 보존된 종양 부위 조직 전부를 가졌다. 이 실험군에서 5마리의 동물 중 2마리(사례 D2 및 D8)는 잔류 생존가능한 암종을 함유하지 않았고, 이들 동물은 또한 과도한 지도상 종양 괴사를 나타내었다 (100% 종양 괴사; 도 90 - 슬라이드 H 및 도 90 - 슬라이드 I). 나머지 3마리의 동물 중 2마리(사례 D4 및 D6)에서 또한 광범위한 괴사(종양의 90% 초과)가 존재하였고, 두 사례 모두에서 탈락된 종양 세포의 단지 희귀하고 작은 수집물 만이 존재하였고, 이들 중 가장 큰 것은 각각의 사례에서 최대 0.1 mm로 측정되었다. 이러한 희귀하고 작은 탈락된 종양 세포 군집의 중요성은 확실하지 않았고, 이의 외관 및 조직의 가장자리 및 괴사의 가장자리에 인접한 탈락된 병소를 고려할 때, 절편화의 인공물이 배제될 수 없었다. 이러한 4개의 사례 각각에서 단일 TLS가 존재하였다. TLS 중 3개는 1 mm, 1mm 및 2 mm로 측정된 한편, 4번째는 0.1 mm로 측정되었다 (사례 D8). TLS는 비-신생물 조직 내에서 구별되어 위치하였고, 일반적으로 괴사성 물질 근처에 또는 바로 인접하여 존재하였다 (도 90 - 슬라이드 D). TLS는 잘 구획되었지만, 섬유질 피막은 결여되었다. TLS의 내부 토폴로지는 다양한 성숙 정도를 나타내었지만, 보다 성숙해 보이는 TLS에서 이차 림프 기관과 명확히 유사하였고, 이들 중 일부는 가시적 핵소체가 없는 균질한 작은 성숙한 림프구로 구성된 말초에 배치된 림프성 난포로 확장되는 골수동이 있는 넓은 영역을 가졌다 (도 90 - 슬라이드 F 및 도 90 - 슬라이드 G). 난포간 영역은 또한 면역모세포와 부합하는 일시적 큰 림프 세포와 함께 유사하게 보이는 작은 성숙한 림프구를 포함하였다. 국소적으로, 일부 림프성 난포는 작은 성숙한 림프구, 중간 크기의 중심세포 및 중심모세포와 부합하는 큰 세포를 포함하는 다형성 림프 집단으로 구성된 배아 중심을 포함하였다 (도 90 - 슬라이드 G). 일시적 유형체 대식세포도 배아 중심에서 주목되었다. CD45R에 대한 면역조직화학적 염색은 TLS에서 B 세포의 강한 염색을 보여주었다. 구체적으로, 이러한 결과는 배아 중심을 포함하여 림프성 난포의 B 세포를 강조하였고, 난포내 림프 세포 (T 세포 영역)에서 염색의 부재를 보여주었다 (도 90 - 슬라이드 E). 이 실험군의 다섯 번째 사례 (사례 D9)는 최대 치수에서 8 mm로 측정되고, 종양 영역의 5 내지 10%의 괴사도 나타내는 생존가능한 암종의 잔류 병소를 포함하였다. 이러한 동물은 조직학적 분석을 위해 보존된 대략 50%의 종양 부위 조직 및 도세탁셀 함량에 대해 분석되는 50%를 가졌다. CD68에 대한 염색은 이 실험군에서 5개 사례 중 1개 (사례 D2)에서 중등도 대식세포 침윤물을 나타내었고, 잔여 4개의 사례 (사례 D4, D6, D8 및 D9)에서 경미한 대식세포 침윤물을 나타내었다.
종양내 nDoce 3주기: 이 실험군에서 3마리 동물 (E1, E7, E9)은 잔류 진단적 생존가능한 침윤성 암종 결절을 전혀 함유하지 않았고, 3개의 사례 모두가 또한 광범위한 괴사를 입증하였다 (도 90 - 슬라이드 L). 이 실험군의 5마리 동물 중 4마리는 조직학적 분석을 위해 보존된 종양 부위 조직 전부를 가졌다. 이들 동물 중 2마리 (E1 및 E7)에서 큰 피부 궤양 영역이 존재하였고, 주변은 비-신생물 섬유성 지방 및 근육 조직으로 확장된 괴사 영역이 존재하였다. 이것은 유사상피종 증식의 영역뿐만 아니라 근육 세포의 퇴행성 변화를 포함하는 주변 표피 라이닝의 재생 변화와 연관되었다. 유사하게, 괴사 내에 그리고 이와 인접하여 섬유모세포 및 내피 세포를 포함하는 재생성 큰 간질 세포가 존재하였다. 또한 퇴행성 핵을 갖는 괴사에서 희귀한 혼합된 단일한 큰 세포가 존재하였다. 이들 희귀한 세포는 괴사의 과정 중이거나 완별하게 괴사된 것으로 보이며, 이들이 희귀한 죽어가는 종양 세포를 나타낼 수 있음을 확실하게 배제하기는 어려웠지만, 이들은 또한 반응성/재생성 간질 세포 또는 퇴행하는 근육 세포를 나타낼 수 있었고, 이 절편의 다른 곳에서 명백한 근육 세포가 유사한 퇴행성 핵 특징을 보여주기 때문이다. 이와 같이, 이들 희귀한 세포의 정확한 중요성은 확실하지 않았지만, 이들은 응집성 결절을 형성하지 않았고, 이들은 죽어가거나 괴사한 것으로 보였다. 판사이토케라틴 (AE1/AE3) 면역염색을 수행하여 이들 세포를 추가로 평가하였지만; 것은 일부 더 큰 세포의 표지의 결여를 나타낸 반면, 일부 영역에서 결정적 평가를 어렵게 하는 과도한 배경 염색이 존재하였다. 또한, 본 연구에서 수행된 판사이토케라틴 전체는 대조군 사례에서 민감도의 부족으로 신뢰할 수 없었다. 이와 같이, 최신 케라틴 염색을 사용한 이들 절편의 결정적 평가는 신뢰할 수 없었고, 이것은 현재 보류 중인 또 다른 케라틴 면역염색 (케라틴 7)으로 염색된 슬라이드를 검토하기 위해서 연기될 것이다. 3개 사례 모두는 또한 단일의 잘 형성된 TLS를 함유하였고, 이들은 3마리의 동물에서 최대 치수가 0.8 mm, 1.5 mm 및 2 mm인 것으로 측정되었다. 이 실험군에서 TLS (도 90 - 슬라이드 J 및 도 90 - 슬라이드 K)는 상기 nDoce 2주기 실험군에 기재된 것과 유사한 범위의 성숙 및 CD45R 염색 양상을 가졌다. 구체적으로, TLS는 잘 구획되었고, 괴사 및 궤양 근처에 위치하였다. 이 실험군의 TLS는 CD45R을 강력하게 발현하는 B 세포로 구성된 림프성 난포로의 내부 조직화를 보여주었고, 이들 림프성 난포 중 일부는 배아 중심을 포함하였다. CD68 염색은 3마리 동물 모두에서 중등도 대식세포 침윤물을 강조하였다.
하기 표 26 및 표 27은 슬라이드 상에서 밀리미터 단위로 측정된 바와 같이, 생존가능한 암종의 최대 단면 치수를 반영한다.
Figure pct00042
Figure pct00043
표 26은 6개의 실험군에서 잔류 종양의 크기 범위를 나타낸다. 표 27은 이러한 데이터를 축약하여 3개의 비-nDoce 실험군(총 5마리 동물)과 3개의 nDoce 실험군(총 11마리 동물)에서 잔류 암종 결절의 크기를 직접 비교한다. 5마리의 비-nDoce 동물 모두는 10 mm 초과로 측정된 잔류 생존가능한 암종 결절을 가졌다. 대조적으로, IT nDoce로 치료된 동물 중 절반 미만 (5/11)이 측정할 슬라이드에 진단적 잔류 생존가능한 암종이 전혀 없었다 (완벽한 퇴행). 잔류 생존가능한 암종을 갖는 IT nDoce 실험군에서 남아있는 5마리의 동물 중 2마리에서, 이것은 희귀한 작은 종양 세포 집합으로 구성되고, 여기서 종양은 최대 치수가 최대 0.1 mm로 측정되었다. 이러한 사례에서 소량의 종양의 유의성은 특별하지 않았는데, 탈락된 병소 및 작은 크기는 또한 절편 인공물의 가능성을 상승시켰기 때문이다. 제 3 사례에서 잔류 종양은 2.5 mm로 측정되었고, 나머지 3개 사례에서, 종양은 슬라이드 상에서 최대 수치가 8 mm, 16 mm 및 19 mm로 측정되었다.
잔류 침윤성 암종이 없는 사례 백분율 및 슬라이드 상의 잔류 생존가능한 암종 결절의 크기에 관하여 3개 IT nDoce 실험군의 비교는 표 28에 나타낸다.
Figure pct00044
IT nDoce의 주기의 수가 1주기부터 3주기로 점진적으로 증가하면서, 잔류 암종이 없는 사례의 백분율이 증가하였다. 구체적으로, IT nDoce 1주기 실험군은 완벽한 퇴행이 있는 사례 0% (0/3)를 가졌지만, 이들 사례 중 하나는 슬라이드 상에서 단지 2.5 mm로 측정된 반면, 나머지 2개는 16 및 19 mm로 측정되었다. 대조적으로, 2주기의 nDoce가 제공된 실험군은 사례의 40% (2/5)에서 완벽한 퇴행을 가졌다. 그러나, 잔류 생존가능한 암종을 갖는 이 실험군에서 나머지 3개의 사례에서, 이것은 극히 최소한이었고, 군집은 인공물을 가능하게 나타낼 수 있는 최대 0.1 mm로 측정되었다. 마지막으로, 3주기가 제공된 실험군은 동물 중 100% (3/3)에서 완벽한 퇴행을 가졌고, IT nDoce 3주기군에서 3개의 사례에서는 잔류 생존가능한 암종이 전혀 측정되지 않았다.
괴사를 나타내는 조직의 백분율을 표 29에 나타낸다.
Figure pct00045
본 연구에서 16마리 동물 모두는 지도상 종양 세포 괴사를 포함하였고, 비-nDoce-처리 사례에서 이것은 50 내지 90%의 종양 괴사를 갖는 2개의 사례를 포함하였다. 그러나, 전반적인 종양 세포 괴사 정도는 비-nDoce-처리 실험군에서보다 nDoce-처리 실험군에서 유의하게 더 컸다. 구체적으로, 11마리의 nDoce-처리된 동물 중 5마리는 100% 종양 세포 괴사 (완전한 퇴행)을 나타내었고, 나머지 6마리 동물 중 2마리는 90% 초과의 종양 세포 퇴행을 나타내었다. 대조적으로, 5마리의 비-nDoce-처리된 동물은 90% 초과의 종양 세포 괴사를 전혀 나타내지 않았다.
준정량적으로 등급화된 CD68을 사용한 H&E 및 면역조직화학적 염색에 기초한 주변 비-신생물 조직에서의 대식세포 침윤물 밀도를 표 30에 나타낸다.
Figure pct00046
모든 동물에서 주변 비-신생물 조직에서의 대식세포 침윤 강도는 현저하지 않았지만; 비-nDoce-처리된 실험군은 nDoce-처리 실험군과 비교할 때, 후자는 중등도의 대식세포 침윤물을 갖는 사례가 있었지만, 비-nDoce-처리 실험군에서는 이것이 관찰되지 않았다. *IT nDoce-처리된 1주기 실험군에서 하나의 사례는 평가를 위한 주변 비-신생물 조직을 포함하지 않았다.
적어도 하나의 TLS를 함유하는 각 실험군에서 사례의 수를 표 31에 나타낸다.
Figure pct00047
비-nDoce-처리된 실험군에서 5개의 사례는 TLS를 전혀 함유하지 않았다. 그러나, nDoce-처리 실험군에서 11마리 동물 중 8마리는 TLS를 함유하였고, 이들 8개 사례 중 하나를 제외하고 모두에서, TLS는 최대 치수가 적어도 1 mm인 것으로 측정되었다. 특히 중요하게도, TLS의 존재 또는 부재는 잔존 암종의 존재 또는 부재와 밀접하게 관련되었다. 구체적으로, 진단적 잔류 암종이 없거나 (5개 사례) 또는 2.5 mm 이하로 측정된 잔류 암종 (3개 사례)을 갖는 모든 경우는 또한 TLS를 함유하였고, 이들은 TLS를 함유한 유일한 사례이었다. 대조적으로, 슬라이드에서 적어도 8mm로 측정된 잔존 암종이 있는 나머지 사례는 모두 TLS를 함유하지 않았다.
부검 부피 대 슬라이드 상에서 측정된 최대 종양 크기의 비교를 표 32에 나타낸다.
Figure pct00048
부검 시 종양 부위 부피를 슬라이드 상의 최대 암종 길이와 비교할 때, 상이한 치료군 중에서 슬라이드 상의 종양 길이에서 관찰되는 추세는 또한 부검 종양 부피에서 관찰되었는데, 이는 슬라이드 상의 종양 측정이 상이한 동물에서 치료에 대한 상이한 반응의 예시적인 평가임을 지지한다 (표 32 참고). 작은 부피의 종양 부위가 부검 시 기록되고 암종이 없거나 최소한의 암종이 현미경 검사에서 관찰되는 동물에서, 부검 시 주목된 작은 부피는 우세하게 또는 전체적으로 괴사성 또는 섬유성 조직으로 인한 것일 수 있었다. 대안적으로, 1 내지 2 mm TLS가 또한 부검 시에 종양 부위에서 검출되었고, 이의 측정은 기록된 종양 부위 부피의 일부에 기여했을 수 있다.
논의:
방광 암종 연구로부터의 16마리 마우스의 하위집합의 형태학적 및 면역조직화학 특징은 종양내 nDoce의 일반적인 안정성 및 효능을 평가하는 것을 목표로 하였다. 16마리 동물의 최신 하위세트는 1마리의 미처리된 대조군 동물, 종양내 운반체가 제공된 2마리 동물, 정맥내 도세탁셀 (3주기)로 처리된 2마리 동물 및 종양내 nDoce로 처리된 11마리 동물을 포함하였다. nDoce 실험군을 투여된 주기의 수를 기준으로 하여 3개 실험군으로 나누었다: 실험군 1 (1주기, 3마리 동물); 실험군 2 (2주기, 5마리 동물); 및 실험군 3 (3주기, 3마리 동물).
다양한 실험군 중에서 상이한 2개의 주요 특징은 종양 퇴행의 존재 및 정도 그리고 3차 림프 응집물의 존재였다. 구체적으로, 종양내 nDoce 실험군에서 대부분의 동물에서 유의한 종양 퇴행이 있는 반면, 다른 실험군에서는 어느 동물에서도 명백한 종양 퇴행이 없었다. 이러한 결과를 반영하여, 유의한 퇴행을 갖는 nDoce 실험군의 모든 동물은 TLS를 함유한 반면, 명백한 퇴행 없이 지속되는 종양을 갖는 동물은 TLS를 함유하지 않았다.
이러한 현미경 검토에서, 슬라이드 상에서 잔류 생존가능한 암종 최대 치수를 사용하여 상이한 실험군에서의 반응 정도를 비교하였다. 부검 시 상응하는 최대 종양 길이는 비교를 위해 입수가능하지 않았지만; 부검 시 종양 부피는 입수가능하였다. 부검 시 종양 부피를 슬라이드 상의 종양 길이와 비교할 때, 상이한 치료군 중에서 슬라이드 상의 종양 길이에서 관찰되는 추세는 또한 부검 종양 부피에서 관찰되었는데, 이는 슬라이드 상의 종양 측정이 상이한 동물에서 치료에 대한 상이한 반응을 비교하기 위해 사용되는 예시적인 척도임을 지지한다 (표 32 참고). 비-nDoce 실험군에서, 5마리 동물 모두는 슬라이드 상에서 최대 치수가 적어도 11 mm (범위: 11 mm 내지 24 mm)로 측정된 과도한 잔류 생존가능한 암종을 함유하였다. 대조적으로, IT nDoce로 처리된 동물 중 절반 미만 (5/11)이 측정할 슬라이드 상에 진단적 잔류 생존가능한 암종을 갖지 않았다 (완벽한 퇴행). 잔류 생존가능한 암종을 갖는 IT nDoce 실험군에서 남아있는 5마리의 동물 중 2마리에서, 이것은 희귀한 작은 종양 세포 집합으로 구성되고, 여기서 종양은 최대 치수가 최대 0.1 mm로 측정되었다. 이러한 사례 둘 다에서 소량의 종양의 유의성은 특별하지 않았는데, 그 이유는 탈락된 국지화 및 작은 크기는 또한 절편 인공물의 가능성을 상승시켜서 이러한 사례에서 위양성 소견을 생성하였기 때문이다. 제 3 사례에서 잔류 종양은 2.5 mm로 측정되었고, 나머지 3개 사례에서, 종양은 슬라이드 상에서 최대 수치가 8 mm, 16 mm 및 19 mm로 측정되었다 (표 26 및 표 27).
본 연구에서 16마리 동물 모두는 종양 영역의 적어도 5%를 나타내는 지도상 종양 세포 괴사 영역을 포함하였다. 그러나, 모든 사례를 두 개의 실험으로 합칠 때, 종양 세포 괴사 정도는 비-nDoce 실험군에서보다 nDoce 실험군에서 유의하게 더 컸다. 구체적으로, 11마리 nDoce동물 중 5마리는 100% 종양 세포 괴사 (완벽한 퇴행)을 나타내었고, 이 실험군에서 나머지 6마리 동물 중 2마리는 90% 초과의 종양 세포 퇴행을 나타내었다. 대조적으로, 5마리의 비-nDoce 동물은 90% 초과의 종양 세포 괴사를 전혀 나타내지 않았다. 구체적으로, 비-nDoce 실험군에서, 5개 사례 중 3개 사례는 50% 미만의 괴사를 보인 반면, 비-nDoce 사례에서 5개 사례 중 2개는 50 내지 90%의 종양 괴사를 나타내었다 (표 29).
3개의 nDoce 실험군(1주기, 2주기, 3주기)을 다함께 비교할 때, IT nDoce의 주기의 수가 1주기부터 3주기로 점진적으로 증가하는 것은 잔류 암종이 존재하지 않는 사례의 백분율 증가와 관련되는 것으로 주목되었다. 구체적으로, IT nDoce 1주기 실험군은 완벽한 퇴행이 있는 사례 0% (0/3)를 가졌지만, 이들 사례 중 하나에서 잔류 생존가능한 암종 결정이 슬라이드 상에서 단지 2.5 mm로 측정된 반면, 나머지 2개는 슬라이드 상에서 16 및 19 mm로 측정되는 잔류 생존가능한 암종을 가졌다. 대조적으로, 2주기가 제공된 실험군은 5개 사례 중 2개 (40%)에서 완벽한 퇴행을 가졌다. 또한, 잔류 생존가능한 암종을 갖는 이 실험군에서 나머지 3개의 사례 중 2개에서, 잔류 암종의 크기는 극히 최소한이었고, 군집은 최대 치수가 최대 0.1 mm인 것으로 측정되었다. 이들 2마리의 동물에서 작은 군집의 말단 및 탈락된 병소를 고려할 때, 이들은 이들 2마리의 동물에서 위양성을 유도하는 절편화의 인공물을 가능하게 나타낼 수 있었고, 이 사례에서 완벽한 퇴행율은 2기가 제공된 실험군에서 4/5(80%)일 수 있었다. 2주기 실험군의 마지막 동물은 8 mm로 측정된 잔류 암종을 가졌다. 마지막으로, 3주기의 nDoc가 제공된 실험군은 동물 중 100% (3/3)에서 완벽한 퇴행을 가졌고, IT nDoce 3주기 실험군에서 3개의 사례에서 잔류 생존가능한 암종이 전혀 측정되지 않았다 (표 28).
본 연구에서 또 다른 놀라운 발견은 모든 nDoce 동물에서 치료에 대한 유의한 반응을 나타내는 3차 림프 구조(TLS)의 존재이었다. 구체적으로, TLS는 8마리 동물에서 발견되었고, 이들 모두는 nDoce 실험군에 있었다. TLS를 함유한 이들 8마리의 동물은 잔류 생존가능한 암종이 없는 5마리의 동물; 최대 0.1 mm로 측정된 암종의 희귀한 탈락된 군집을 갖는 2마리의 동물 및 2.5 mm로 측정된 잔류 암종 병소을 갖는 동물을 포함하였다. 모두 적어도 8 mm로 측정된 잔류 암종을 가졌던 남은 동물은 TLS를 전혀 갖지 않았다. 이러한 결과는 TLS의 존재 및 치료법에 대한 유의한 종양 반응 사이의 매우 강한 상관 관계를 입증하였다. 또한, TLS는 IT nDoce가 투여된 동물에서만 관찰되었고, 해당 실험군 내에서 3주기의 nDoce를 제공받은 3마리 동물 모두를 포함하여 11마리 동물 중 8마리에 TLS가 존재하였다.
본 연구에서 TLS의 크기는 0.1 내지 최대 2 mm 범위이었지만, 8개 TLS 중 7개는 최대 치수가 적어도 1 mm이고 2개는 최대 2 mm로 측정되었다. 이러한 크기를 감안할 때, 이들 동물 대부분의 TLS는 염색 된 슬라이드의 육안 검사를 통해 구별된 결절로 쉽게 인식되었으며, 다시 이들은 생체내 상태에서 촉진될 수 있었다. 모든 TLS는 잘 구획되엇고, 잘 형성된 피막은 부족하였다. 이들은 CD45R로 강하게 표지된 성숙한 B 세포 및 개입 난포간 "T 세포 영역" 뿐만 아니라 골수동 영역으로 구성된 잘 형성된 말초 림프성 난포를 갖는 가장 성숙한 TLS로 다양한 성숙 단계를 보여주었다. TLS 중 일부는 배아 중심을 포함하는 림프성 난포에 의한 활성화의 증거를 보여주었다.
마지막으로, 비-신생물 조직에서 치료법에 대한 종양 반응의 정도와 일반적으로 상관되는 관련된 대식세포 침윤물이 있었다. 특히, 비-nDoce 실험군의 모든 동물은 경미한 대식세포 침윤물을 가졌던 반면, nDoce 실험군은 경미한 및 중등도의 면역 세포 침윤물을 갖는 사례를 포함하였다. 중등도의 면역 세포 침윤물을 갖는 4개의 사례 모두는 완벽한 종양 퇴행을 보였으며, 이는 3주기의 IT nDoce가 제공된 실험군에서 3마리 동물 모두를 포함하였다.
결론:
결론적으로, 방광 암종 코호트로부터 16마리의 마우스 하위집합에 대해 수행된 이 연구는 IT nDoce로 치료된 11마리 동물 중 5마리 (완벽한 종양 퇴행을 나타냄)와 IT nDoce 요법과 종양 퇴행 사이에 강한 연관성을 보여주었고, 이 실험군에서 추가 3마리의 동물은 최대 정도로 0.1 mm, 0.1 mm 및 2.5 mm로 측정된 최소 잔류 종양을 가졌다. 또한, IT nDoce 주기를 증가시키면 (1주기부터 3주기로 이동), 3주기 실험군의 3마리 동물 모두에서 종양 퇴행 정도가 더 커져서 완벽한 종양 퇴행을 나타내었다. 또한, 3차 림프 구조 (TLS)는 유의한 종양 반응을 나타내는 8마리 동물 모두에서 관찰된 반면, TLS가 유의한 종양 반응을 나타내지 않은 동물에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는, IT nDoce가 제공된 동물에서, 종양에 미치는 국소 약물 효과와 숙주 동물의 면역계 사이에 유의한 상호작용이 존재하여 종양에 인접한 강력한 국소 TLS의 형성을 유도하고, 이에 따라 적응성 면역 및 체액성 면역의 신속한 피드백 루프를 설정하며, 이것이 상당한 종양 퇴행에 추가로 기여하는 것을 시사한다.
실시예 8 - 인간 신장 세포 샘암종의 래트 이종이식 모델에서 약물 효능 연구
비-GLP 연구는 인간 신장 세포 샘암종의 래트 이종이식 모델에서 종양내 주사로 투여된 nPac (나노입자 파클리탁셀) 현탁액 및 nDoce (나노입자 도세탁셀) 현탁액의 약물 효능을 결정하기 위해 시행되었다.
목표
본 연구의 목표는 인간 신장 세포 암종 (786-O 세포주) (ATCC®CRL-1932??)의 스프라그 달리 Rag2; Il2rg null (SRG®) 래트 이종이식 모델에서 일정 기간 동안 종양내 (IT) 주사로 투여된 nPac (나노입자 파클리탁셀) 및 nDoce (나노입자 도세탁셀)의 잠재적인 효능을 조사하는 것이었다. 5주 내지 7주령의 SRG 래트에게 컬트렉스®에서의 5백만개의 786-O 세포를 피하 접종하여 종양 이종이식을 발생시켰다. 일단 종양 부피가 150 내지 300 mm3에 도달하면, 래트를 테스트 항목, 양성 대조군 (파클리탁셀 및 도세탁셀; 정맥내 (Ⅳ) 투여됨) 및 운반체 대조군 (IT 투여됨)으로 구성된 치료 실험군 (IT 투여됨) 으로 선착순 등록하고, 다음으로 종양 성장 또는 퇴행에 대해 모니터링하였다.
세포 배양
세포주: 786-O 세포주 (ATCC®CRL-1932TM). 세포를 액체 질소에 저장하였다. 해동 시, 세포를 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 세포가 이식을 위해 준비된 이후, 주입될 때까지 얼음 위에서 유지되었다.
세포 배양 조건: 세포를 37℃, 5% CO2에서 조직 배양 처리된 플라스크 상에서 RPMI 1640 (집코사 # 410491-01) + 10% FBS로 배양 하였다. 접종 전에 세포를 2 내지 3주 동안 증식시켰다. 세포 해동, 배양 및 계대는 ATCC (www.atcc.org/Products/All/CRL-1932.aspx)에 의해 수행되었다.
세포 접종: 래트 당 5 × 106개 세포; 피하 왼쪽 옆구리, 등 측면.
접종 운반체: 50% 컬트렉스 BME 유형 3 (트레비겐사 # 3632-001-02; 생체내 종양 성장을 위해 제형화된 매트리겔®과 같은 기저막 매트릭스 유형) 50% 배지의 총 부피 0.5 mL. 세포 현탁액은 5 mg/mL 컬트렉스의 최종 농도를 위해 10 mg/mL 컬트렉스와 1 : 1로 혼합되었다. 최종 접종 부피는 500 μL이다.
테스트 항목의 준비 (nPac 및 nDoce 현탁액)
약물: 60 mL 바이알에 306 mg nPac (나노입자 파클리탁셀 분말, 본 실시예에 사용된 0.878 마이크론의 평균 입자 크기 (수), 26.7 m2/g의 SSA 및 0.0763 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)을 갖는 대략 98% 파클리탁셀); 및 60 mL 바이알에 100 mg nDoce (나노입자 도세탁셀 분말, 본 실시예에 사용된 1.078 마이크론의 평균 입자 크기 (수), 37.2 m2/g의 SSA 및 0.0723 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)을 갖는 대략 99% 도세탁셀).
nPac 현탁액 (최종 농도: 정상 식염수 용액에서 20 mg/mL nPac 및 0.32% 폴리소르베이트 80 - 최종 부피: 바이알 당 15.3 mL)의 경우:
멸균 18 게이지 이상의 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여, 5.0 mL의 멸균 1% 폴리소르베이트 80 재구성 용액을 60 mL nPac 분말 바이알 (306 mg nPac 분말을 포함함) 내에 첨가하였다.
바이알을 뒤집으며 격렬하게 손으로 진탕하여 바이알 및 마개 내부에 부착된 입자 모두가 적셔진 것을 확인하였다.
1분 동안 계속 진탕하여 큰 입자 덩어리가 있는지 현탁액을 조사하였다.
진탕 직후, 멸균 18 게이지 이상의 바늘을 있는 멸균 주사기를 사용하여 10.3 mL의 일반 식염수 용액 (주사용 0.9% 염화나트륨 용액)을 바이알에 첨가하고 추가 1분 동안 바이알을 손으로 진탕하였다. 큰 가시적 덩어리가 있는지 현탁액을 정기적으로 검사하였다. 존재할 경우, 현탁액이 적절히 분산될 때까지 손으로 계속 혼합하였다.
혼합한 후, 포집된 공기와 거품을 줄이기 위해 현탁액을 적어도 5분 동안 그대로 두었다.
nDoce 현탁액 (최종 농도: 정상 식염수 용액에서 20 mg/mL nDoce 및 0.20% 폴리소르베이트 80 및 1.6% 에탄올 - 최종 부피: 바이알 당 5 mL)의 경우:
멸균 18 게이지 이상의 바늘이 있는 멸균 주사기를 사용하여, 1 mL의 멸균 1% 폴리소르베이트 80/8% 에탄올 재구성 용액을 60 mL nDoce 분말 바이알 (100 mg nDoce 분말을 포함함) 내에 첨가하였다.
바이알을 뒤집으며 격렬하게 손으로 진탕하여 바이알 및 마개 내부에 부착된 입자 모두가 적셔진 것을 확인하였다.
1분 동안 계속 진탕하여 큰 입자 덩어리가 있는지 현탁액을 조사하였다.
진탕 직후, 멸균 18 게이지 이상의 바늘을 있는 멸균 주사기를 사용하여 4 mL의 일반 식염수 용액 (주사용 0.9% 염화나트륨)을 바이알에 첨가하고 추가 1분 동안 바이알을 손으로 진탕하였다. 큰 가시적 덩어리가 있는지 여부를 현탁액을 정기적으로 검사하였다. 존재할 경우, 현탁액이 적절히 분산될 때까지 손으로 계속 혼합하였다.
혼합한 후, 포집된 공기와 거품을 줄이기 위해 현탁액을 적어도 5분 동안 그대로 두었다.
종양내 (IT) 운반체 (최종 농도: 정상 식염수 용액에서 0.2% 폴리소르베이트 80 및 1.6% 에탄올): 1 mL의 1% 폴리소르베이트/8% 에탄올 재구성 용액 각각을 4 mL의 정상 식염수 용액 (주사용 0.9% 염화나트륨 용액)으로 희석하였다.
양성 대조군 제형물의 제조
약물: 도세탁셀: CAS 114977-28-5 및 파클리탁셀: CAS 33069-62-4. 순도 > 97%
도세탁셀 용액의 경우: 50% 에탄올: 50% 폴리소르베이트 80에서의 20 g/mL의 도세탁셀 용액을 제조하였다. 볼텍싱하여 혼합하였다. 도세탁셀의 3 mg/mL 용액으로 희석하기 위해 정상 식염수 용액을 첨가하였다.
파클리탁셀 용액: 벌크 파클리탁셀을 사용하여 50%의 6 mg/mL 제형물을 제조하였다.
에탄올: 50% 크레모포 EL. 필요에 따라 볼텍싱하여 혼합하였다. 파클리탁셀의 3 mg/mL 용액으로 희석하기 위해 정상 식염수 용액을 첨가 하였다. 볼텍싱하여 혼합하였다.
테스트 시스템
종/동물 주: 래트 (Rattus norvegicus)/Rag2-i-; 스프라그 달리 배경 (SRG®) 상의 112rg-i-.
동물 수/대략적인 연령 및 체중: 60마리의 건강한 래트 (수컷 30마리와 암컷 30마리)를 이 연구에 배정하고 이종이식 발생에 사용하였다. 필요한 종양 부피에 도달할 때 종양을 갖는 동물 중 적어도 54마리 전부를 처리를 위해 등록하였다 (수컷 27마리 및 암컷 27마리). 이들 동물들에게 동일한 일에 교대 배치로 786-0 세포를 접종하여 동물 이용가능성을 기다렸다. 동물은 연구 개시 시 대략 5 내지 7주령이었다. 대략적인 무게는 150 내지 275 g이었다. 종양 크기가 150 내지 300 mm3에 도달했을 때를 등록 기준으로 하여 동물을 처리 실험군에 등록하였다.
치료 실험군, 용량 수준 및 치료 요법의 조직화
하기 표 33은 연구 실험군 배열을 제시한다.
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치료 요법:
부피가 150 내지 300 mm3 에 도달한 종양이 발생시킨 모든 래트를 치료에 등록하였다. 종양이 > 150 mm3일 때 접종 7일 이후에 모든 처리가 시작될 것이다.
실험군 3, 4 및 5 래트는 nPac, 실험군 7, 8 및 9 래트는 nDoce가 투여되었다. 실험군 3 및 7은 병기결정 일에만 IT 주사가 투여되었으며, 실험군 4 및 8은 병기결정 일 및 처리 개시 후 7일째 IT 주사가 주어졌으며, 실험군 5 및 9는 병기결정 일 및 치료 개시 후 7일 및 14일째 IT 주사가 주어졌다. 양성 대조군 테스트 항목 (파클리탁셀 및 도세탁셀)을 병기결정 일, 치료 개시 후 7일 및 14일째 실험군 2 (파클리탁셀) 및 실험군 6 (도세탁셀) 래트에게 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내 투여하였다. 운반체 대조군은 실험군 1 동물에거 병기결정 일, 치료 개시 후 7일 및 14일째 IT 주사에 의해 투여되었다.
투여 방법:
테스트항목 및 운반체는 투약 실험군에 따라 멸균 주사 바늘 및 주사기로 IT 주사 또는 Ⅳ 주사에 의해 투여되었다. 모든 Ⅳ 주사는 27G 바늘을 사용하여 투여되었다.
종양이 온전할 때 6회 주사 및 궤양성 종양의 경우 3회 주사로 IT 주사를 종양 전체에 걸쳐 분포시켰다. 모든 투약 일 동안 종양 당 IT 주사 횟수는 미가공 데이터에 기록되었다.
용량 부피는 운반체, nPac 및 nDoce의 경우 1 mL/kg 그리고 파클리탁셀 및 도세탁셀의 경우 1.67 mg/kg이었다. 실험군 6의 경우, 도세탁셀의 용량을 2.5 mL/kg으로 변경하고 용량 부피는 0.835 mL/kg으로 감소시켰다. 용량 투여 시, nPac 및 nDoce 바이알은 현탁액의 균일성을 보장하기 위해 용량 제거 직전에 5 내지 10회 가만히 뒤집었다.
멸균 18 게이지* 바늘 또는 더 큰 구멍이 있는 멸균 주사기를 사용하여 바이알을 뒤집고, 바늘을 뒤집힌 바이알의 격막에 삽입하였다. 필요한 현탁액 양을 조금만 빼내고, 바이알로부터 바늘을 제거하고 원하는 양으로 조정하였다. 바늘을 다시 닫았다. *비고: IT 주사의 경우 27G 바늘을 투여에 사용하였다.
IT 주사를 종양 전체에 걸쳐 Z 양상 (상단, 대각선을 가로질러, 다음에 하단을 가로질러)으로 투여하고 투약 시점(들)에 이어서 각각을 역전시켰다. 주사 후 TA의 누출을 최소화하기 위해 주사 바늘을 아래로 향하게 주사하였다. 또한 주사 후 TA 누출을 최소화하기 위해 바늘 진입 전에 및 주사 동안 피부를 약간 잡아당겼다. IT 주사 투여 양상이 모든 동물 및 투약 일에 부합되는지 확인하려고 노력하였다.
nPac은 재구성 후 1시간 이내에, nDoce은 24 시간 이내에 사용하였다. 양성 대조군 및 도세탁셀을 실온에서 유지시키고, 제형화 8시간 이내에 사용하였던 한편, 파클리탁셀은 재구성 후 따뜻한 물에 유지시키고 20분 이내에 사용하였다.
관찰:
개별 체중: 접종 시점부터 매주 3회 (M, W, F).
개별 종양 부피: 동물은 종양 접종 후 다음날부터 매일 촉진되었다. 디지탈 캘리퍼로 종양 길이 및 너비를 측정하고 종양 부피가 50 mm3에 도달했을 때 시작하여 기록하였고, 이 시점에서 종양은 매주 3회 (M, W, F) 그리고 부검 시에 측정되었다. 종양 부피 (mm3)는 = (L x W2)/2로서 계산되었으며, 여기서 'L'은 가장 큰 직경이다.
종양 촬영: 모든 종양의 사진은 치료 개시 전 병기결정 일, 치료 개시 후 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일째 촬영되었다. 연구 종료 전에 종결점에 도달한 동물을 포함하여 모든 래트의 부검 시에 추가적인 종양 사진을 또한 촬영하였다. 모든 사진은 동물 ID, 연구 날째 및 날짜를 나타내는 사진 태그와 함께 동물의 앞뒤 방향으로 촬영될 것이다.
분석을 위한 혈액 시료 수집: 연구 종료 시, 즉 치료 개시 후 50일째 모든 처리된 동물의 꼬리 또는 경정맥으로부터 200 내지 250 uL의 혈액을 수집하였다.
예정된 부검: 모든 동물은 치료 개시 후 50일째 부검을 계획하였다. 0일은 종양 접종 일이었다.
해부 병리학:
육안 검사: 치료 개시 후 50일째 자발적으로 죽거나, 극단에서 또는 예정된 부검 시 안락사된 모든 동물에 대해 부검이 시행되었다. 극단에서 또는 연구 종료 시 안락사된 동물은 이산화탄소 흡입에 의해 안락사되었다. 부검에는 외부 표면, 모든 구멍 및 내장을 포함한 흉부, 복부 및 골반강의 검사가 포함되었다. 부검 시, 최종 체중 및 신체 상태 점수를 수집하였다.
조직 수집: 일차 종양 (접종 부위) - 절제 전에 최종 종양 측정을 시행하였다. 절제 후 종양의 무게를 측정하였다. 각각의 종양의 대략 1/2 (시각적 평가를 기준으로 함)을 드라이아이스 상의 2-메틸부탄에서 급속 동결시키고, 가능하면 급속 동결되기 전에 종양 조각을 무게 측정하였다. 나머지는 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 등록 부피에 도달하지 않은 동물로부터 또한 종양을 수집하였다. 이차 종양 - 가시적 종양을 가진 임의의 기관을 수집하여 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다. 포르말린 고정된 조직을 실온에서 보관하였다. 동결된 조직을 -80℃에서 보관하였다. 모든 조직은 최대 3개월 동안 보관되었다. 모든 종양의 사진; 존재하는 경우 1차 및 2차 사진을 촬영하였다.
현미경 검사: 10% NBF로 고정된 조직을 파라핀에 포매하였다. 각각의 종양을 2 내지 3개의 조각으로 자르고, 포매하여 절편화하였다. 각각의 종양에 대해, 3개의 슬라이드를 제조하고 H & E로 염색하였다. 미처리된 운반체 대조군 (IT) 3주기, 도세탁셀 (Ⅳ) 3주기 및 nDoce (IT) 3주기에 대해 암컷 래트로부터의 예비 조직학 슬라이드의 현미경 사진은 도 91. 도 92, 도 93 및 도 94에 각각 나타낸다.
추가적인 H&E 및 면역조직화학 (IHC) 평가를 도세탁셀 실험군의 동물로부터의 포르말린-고정된 조직 상에서 시행하였고, 도 95 및 도 96에 나타낸다.
도 92, 도 93 및 도 94의 현미경 사진의 조직학 개요.
운반체 대조군 (IT) 3주기, 도 92: 현미경 사진은 세포외 매트릭스에 의해 둘러싸인 다중-/이중핵 종양 세포의 "패킷"을 나타낸다.
도세탁셀 (Ⅳ) 3주기, 도 93: 현미경 사진은 운반체 대조군에서 보이는 생존가능한 신장 세포 암종의 형태학적으로 유사한 "패킷"을 나타낸다: 차이 없음.
nDoce (IT) 3주기, 도 94: 현미경 사진은 종양 세포에 대한 강력한 면역 반응을 나타내는 단핵 세포 밴드를 나타낸다. 일부 죽은 종양 또는 죽어가는 종양이 존재하고, 세포성 "유령" (단핵 면역 세포 밴드의 왼쪽에 도시됨)을 특징으로 한다. 단핵 세포 밴드의 오른쪽에는 단핵 면역 세포의 "살포"에 의해 덮힌 "유령"이 있다.
도세탁셀 실험군의 추가적인 H & E 및 면역조직화학적 (IHC) 평가
관찰: 도 95: 대조군 사례. 상단 행: H & E 염색된 절편. 하단 행: 면역조직화학적 염색.
열 1: (A) 다형성 핵 및 가시적 핵소체을 갖는 큰 종양 세포의 밀착된 응집성 군집 및 코드로 구성된 신장 세포 암종. 산란된 작은 혈관을 포함하는 최소 개입 간질을 유의한다 (왼쪽 하단의 점선 화살표). 영상 상단에 다핵성 암종 세포를 유의한다 (실선 화살표). (D) A에 나타낸 동일한 종양 상에서 수행된 케라틴 (AE1/AE3) 면역염색.
열 2: (B) 균일하게 균질한 무정질 호산구성 물질로 구성된 종양 세포 괴사의 병소 영역 (점선 화살표). 주변 생존가능한 암종 세포으로부터 예리한 구획을 갖는 이러한 병소의 구별된 특성을 유의한다 (실선 화살표). 이것은 대조군에서 괴사의 전형적인 외관이었다. 이것은 종양의 중앙 영역에 존재하였고 종양 면적의 5% 미만을 점유하였다. (E) 영상 B에 나타낸 동일한 영역을 강조하는 CD68 염색 (대식세포 마커). 이것은 생존가능한 암종 (실선 화살표)에서 제한된 수의 대식세포 및 괴사의 병소에서 현저하게 증가된 대식세포 (점선 화살표)를 나타낸다. 후자의 결과는 괴사 잔해 포식작용의 특징적인 대식세포 기능을 설명한다.
열 3: (C) 종양 주위의 둘러싼 비-신생물 간질에서 제한된 수의 작은 림프구 (점선 화살표). 오른쪽 상단 모서리에 암종을 유의한다 (실선 화살표). 대조군에서, 전형적으로 종양 자체 내에 림프구가 거의 없었으며, 종양 주위의 연조직은 일반적으로 경미한 림프 침윤물을 함유하였다. (F) CD11b로 염색된 C에서 보이는 것에 상응하는 병소는 림프 세포에서 양성 염색을 나타낸다 (점선 화살표). 오른쪽 상단 모서리에 암종을 유의한다 (실선 화살표).
주해: 두 대조군 사례는 형태학적 및 면역조직화학적 수준에서 유사한 결과를 입증하였다. 둘 다는 조밀한 침윤성 암종 결절을 함유하고 있으며, 이로 인해 잘 형성된 별도의 섬유성 피막이 없이 주변 정상 간질 조직으로부터 예리하게 구획된다. 종양 결절 내에서 암종 세포는 작은 조직화된 군집 및 종양 세포의 코드 내로 배열되고, 압축된 작은 혈관을 함유하는 최소량의 개입 간질과 함께 매우 밀집되었다 (도 95 - 슬라이드 A). 종양 세포는 100× 배율로 (10× 접안 렌즈 및 10× 대물 렌즈)에서 명확하게 볼 수 있는 소포성 크로마틴 및 현저한 호산구성 핵소체를 갖는 다형성 핵을 갖고 컸다. 핵에는 둥글고, 방추사가 붙은 형태가 포함되어 있으며, 산란된 다핵성 거대 종양 세포가 존재하였다 (도 95 - 슬라이드 A). 종양 세포는 풍부한 양의 약간 호산구성 맑은 세포질을 가졌으며, 유사분열 활성의 증가를 보여주었다 (10개의 고출력 필드 당 13개의 유사분열 [400× hpf]). 응집된 종양 세포 괴사의 산란된 별도의 병소가 존재하였고, 이들은 종양 결절의 중앙 부분 내에서 더 빈번하였다 (도 95 - 슬라이드 B). 괴사의 병소는 주변의 생존가능한 종양 세포로부터 비교적 잘 구획된 균질한 호산구성 괴사 잔해로 구성되었다. 괴사의 병소는 종양 세포 면적의 5% 미만을 차지하였다. 판사이토케라틴 (AE1/AE3)에 대한 면역조직화학적 염색은 종양 세포를 강조하고, 세포질 및 막 병소화를 나타냈다 (도 95 - 슬라이드 D). 케라틴 표지는 강력하고 민감하고 특이적이며, 양성 염색된 종양 세포와 음성 염색된 주변 비-암종 조직 사이의 예리한 구획을 가졌다. 두 대조군 동물 중 어느 하나에서 주목된 명백한 종양 퇴행은 없었다. 종양 내에 유의한 림프 침윤물은 없었으며, 구체적으로 종양 조직 또는 주변의 비-신생물성 간질 조직에는 구별된 작은 림프 집합 또는 3차 림프 구조 (TLS)가 없었다. 주변 간질은 주로 단일 세포로 배열된 산란된 작은 림프구로 구성된 고르지 않은 경미한 림프 침윤 물을 함유하였다 (도 95 - 슬라이드 C). CD11b (NK 세포 및 조직구의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 주변의 비-신생물 간질에서 경미한 면역 세포 침윤물을 강조하였지만 (도 95 - 슬라이드 F), 종양 내에 유의한 림프 구성요소는 없었다. CD68 (대식세포의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 증가된 세포성 잔해를 함유하는 영역에서 증가된 대식세포와 부합하는, 종양 괴사의 병소 내에서 염색 밀도 증가를 갖는 종양 내부 및 주변의 경미한 대식세포 침윤물을 강조하였다 (도 95 - 슬라이드 E).
관찰: 도 96. 종양내 nDoce 사례 (포함된 모든 실험군으로부터의 대표적인 영상: 1주기, 2주기 및 3주기).
상단 행: 1주기 nDoce (1×) (사례 750-258). (A) 비-생존가능 괴사성 물질의 균질한 호산구성 염색으로 구성되는 광범위한 지도상 종양 세포 괴사를 나타내는 저-출력 H & E 염색 (실선 화살표). 괴사성 잔해의 진한 밴드로 구성된 중앙 수직선 구획 및 혼합된 면역 세포를 유의한다 (점선 화살표). (B) 구획선의 고-출력 도면. 면역 세포의 조밀한 집합 및 혼합된 잔해 (오른쪽에 점선 화살표)를 유의한다. 영상의 왼쪽에는 생존가능한 종양 세포가 없는 광범위한 괴사성 물질이 있다 (실선 화살표). (C) 영상 A의 왼쪽 절반에 해당하는 괴사의 중앙 부분의 고-출력 도면. 실선 화살표는 괴사성 종양 세포의 유령 윤곽을 가리킨다. 점선 화살표는 퇴행하는 작은 혈관을 강조한다.
두 번째 행: 1주기 nDoce (1×) (사례 750-258). 각 영상는 상기의 H & E 영상에 해당한다. (D) 영상 A에서 보이는 영역의 CD11b 면역 염색. 이것은 괴사성 잔해 및 면역 세포 침윤물의 중앙 밴드에서 면역 세포의 조밀한 집합을 강조한다. 이러한 염색은 오른쪽에서 주변 조직의 면역 세포 반응을 강조하지만, 왼쪽에서 종양 괴사의 중앙 영역에 더 적은 정도의 염증이 있다. (E) 케라틴 염색은 B에서 보이는 동일한 영역을 나타낸다. 이것은 염색의 완전한 부재를 나타내며, 따라서 이 영역에서 잔류 생존가능한 암종에 대한 강력한 면역조직화학적 지지로 해석된다. (F) 영상 C에 나타낸 괴사의 중앙 영역으로부터의 케라틴 염색. 이것은 괴사성 유령 세포 윤곽에서 퇴행성 케라틴 필라멘트의 케라틴 표지를 나타내며 (실선 화살표), 이는 생존가능한 암종이 후속적으로 완벽한 퇴행 및 괴사를 거치는 가설을 지지하고, 그러나 이러한 영역에는 잔류 생존가능한 종양 세포가 존재하지 않는다 (상기 H & E 영상에서 최고로 인식되는 생존가능한 핵의 결여).
세 번째 행: 2주기 nDoce (2×) (사례 748-827). (G) 광범위한 괴사성 물질 (점선 화살표)로 둘러싸인 생존가능한 암종 (실선 화살표)의 0.9 mm 잔류 병소를 나타내는 H & E 염색. (H) 유지된 핵을 갖는 생존가능한 종양 세포를 나타내는 고-출력에서의 암종의 동일한 병소 (실선 화살표). 생존가능한 종양 세포의 왼쪽 하부 모서리 (점선 화살표)를 향한 점진적인 손실에 유의한다. (I) 생존가능한 종양의 선도하는 가장자리 (실선 화살표) 및 종양 세포 사멸의 인접한 구역을 도시하는 동일한 병소의 고-출력 도면. 여기서, 세포 사멸의 진행 단계에서 종양 세포의 잔해는 점진적인 핵 손실 및 구별된 세포질 막 윤곽의 손실 (점선 화살표)에 의해 입증된다.
네 번째 행: 2주기 nDoce (2×) (사례 748-827). 각 영상는 상기의 H & E 영상에 해당한다. (J) 영상의 왼쪽 상단에서 잔류 생존가능한 암종의 병소로의 케라틴 염색의 저-출력 도면 (실선 화살표). 이 병소를 둘러싼 것은 괴사성 물질의 정도를 나타내는 케라틴 염색의 결여이다 (점선 화살표). (K) 케라틴 항체로 강하게 표지된 생존가능한 핵 형성된 암종 세포 (실산 화살표) 및 케라틴 염색에 대해 음성인 주변 괴사성 조직 (점선 화살표)을 나타내는 동일한 케라틴 염색된 종양의 고-출력 도면. (L) 동일한 영역의 케라틴 염색으로, 오른쪽 상단 (실선 화살표)에서 생존가능한 핵 형성된 케라틴-양성 암종 세포부터 왼쪽 하단 모서리 (대시 화살표)로 향한 다양한 괴사 단계의 종양 세포로의 점진적인 전이를 나타낸다. 후자는 잔류 퇴행성 종양 세포 케라틴 중간 필라멘트의 케라틴 표지를 나타내는 종양 세포의 무핵 유령 윤곽을 포함하지만, 이들 세포는 생존가능하지 않다. 이것은 생존가능한 암종을 둘러싼 괴사성 물질이 치료 후에 후속적으로 사멸한 생존가능한 암종을 미리 포함하였던 인상을 지지한다.
다섯 번째 행: 3주기 nDoce (3×) (사례 748-822). (M) 왼쪽에 괴사성 잔해 및 혼합된 면역 세포 (점선 화살표)에 의해 왼쪽의 퇴행성 섬유지방 조직의 주변 구역으로부터 구획되는 오른쪽에 조밀한 무정질 괴사 (실선 화살표)를 나타내는 저-출력 H & E 염색된 절편. (N) 생존가능한 핵 형성된 암종 세포를 나타내지 않는 괴사성 영역의 고-출력 도면 (실선 화살표). (O) 영상 N에서 동일한 영역의 케라틴 염색된 절편, 염색의 완벽한 부재 (실선 화살표)를 나타내므로, 치료법 후 이 영역에서 잔류 암종의 부재를 추가로 지지한다.
주해:
종양내 nDoce 1주기:
이 실험군에서 3마리 동물 중 2마리는 잔류 생존가능한 침윤성 암종을 함유하였다. H & E 스테인드 슬라이드 상에서 측정하였을 때, 이것은 대조군, IT 운반체 및 Ⅳ 도세탁셀 실험군과 비교하여 (대부분이 슬라이드 상의 최대 단면 치수가 15 mm에 근접하는 9 내지 15 mm 범위), 유의하게 크기가 더 작았다 (슬라이드 상의 최대 단면 치수가 최대 5 mm). 존재하는 경우, 이들 2개의 IT nPac 사례에서 종양 세포의 형태는 상기 언급된 비-IT 도세탁셀 실험군에서 관찰되는 것과 필수적으로 동일하였다. IT nDoce 사례 둘 다는 주변 괴사의 평가를 위해 비-생존 종양 또는 비-신생물 간질이 충분하지 않았지만, 이들 중 하나는 제출된 조직의 < 5%를 차지하는 국소 말초 괴사성 테두리를 가졌다. 대조군과 유사하게, 주변의 비-신생물 간질 조직에서 이들 종양과 관련된 경미한 면역 세포 침윤물 만이 존재하고 (평가가능한 경우), 이는 CD11b 면역염색에 의해 강조되었다. 3차 림프 구조 (TLS)는 검사된 절편에서 주목되지 않았다. 이 실험군의 세 번째 동물은 생존가능한 침윤성 암종 및 광범위한 지도상 종양 세포 응집성 괴사를 전혀 나타내지 않았다. 광범위한 괴사의 영역은 주변의 간질 섬유성, 지방 및 골격근 조직과 혼합되었다. 영역에서는 무정질 괴사와 인접한 퇴행성 섬유지방 조직 사이에 구획선 생겼는데, 이것은 조밀한 괴사 전해 및 혼합된 면역 세포의 밴드로 구성되었다 (도 96 - 슬라이드 A 및 B). H & E 염색된 절편 검사에서 진단적 생존가능한 종양 세포는 관찰되지 않았지만 (도 96 - 슬라이드 B); 무정질 괴사성 물질의 중앙 부분에는 핵 괴사성 종양 세포의 유령 윤곽이 주목되는 작은 영역이 있었다 (도 96 - 슬라이드 C). 이것은 또한 괴사성 세포 윤곽에서 케라틴 항체가 퇴행성 케라틴 필라멘트를 표지하는 케라틴 염색된 절편에서 강조되었다 (도 96 - 슬라이드 F). 또한, 퇴행성 및 괴사성 섬유지방 조직 내에 매우 국소적으로, 이 동물의 케라틴 염색된 절편은 퇴행성 케라틴 중간 필라멘트의 조직구 포식과 부합하는 것으로 보이는 병소 세포질 표지를 나타냈다. 중요하게도, 케라틴 염색은 생존가능한 암종 세포의 별도의 세포질 막 표지를 나타내지 않았고, 케라틴 표지된 진단적 생존가능한 종양 세포의 부착성 집합을 나타내지 않았다. 일부 영역에는 이영양성 석회화를 제시하는, 작은 균질한 구조 내에 국소적으로 응집되는 과립상 청색 물질이 풍부하였다. 이 과립상 물질은 명확하게 식별하기가 어려웠으며, 감별 진단에는 과립상 괴사 잔해와 칼슘, 퇴행성 골격근 섬유 및 나노입자가 포함되었다. 비-신생물 조직에서 적당한 대식세포 침윤물에 의해 강조된 완벽한 종양 퇴행을 갖는 동물에서 CD11b에 대한 면역조직화학적 염색 및 CD11b 염색은 또한 잔해 및 혼합된 염증의 구역을 강조하였다 (도 96 - 슬라이드 D). CD68 (대식세포의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 적당한 대식세포 침윤물을 강조하였다. 3마리 동물 중에서 TLS는 주목되지 않았다.
종양내 nDoce 2주기:
이 실험군에서 3마리 동물 중 2마리 (750-254 및 748-827)는 잔류 생존가능한 침윤성 암종을 함유하였다. H & E 스테인드 슬라이드 상에서 측정하였을 때, 이것은 대조군, IT 운반체 및 Ⅳ 도세탁셀 실험군과 비교하여 (대부분이 슬라이드 상의 최대 단면 치수가 15 mm에 근접하는 9 내지 15 mm 범위), 유의하게 크기가 더 작았다 (슬라이드 상의 최대 단면 치수가 각각 3 mm 및 0.9 mm). 잔류 암종을 갖는 IT nDoce 사례에서, 잔류 생존가능한 침윤성 암종의 작은 병소를 둘러싼 광범위한 지도상 종양 세포 괴사가 있었다 (도 96 - 슬라이드 G, H 및 I). 더 작은 이들 잔류 종양으로부터 H & E 염색 및 케라틴 염색된 절편의 고-출력 검사는 생존가능한 암종 세포부터 괴사성 암종 세포로의 점진적인 전이를 나타내었고, 후자는 팬사이토케라틴 면역 염색으로 잔류 퇴화성 케라틴 중간 필라멘트의 표지에 의해 확인되었다 (도 96 - 슬라이드 I 및 L). 잔류 암종을 갖는 동물 둘 다에서, CD11b에 대한 면역조직화학적 염색은 괴사 조직에서 적당한 면역 세포 침윤물을 강조하였다. CD68 (대식세포의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 둘 다의 사례에서 괴사 영역 내에 적당한 대식세포 침윤물을 강조하였다. 이 실험군의 세 번째 사례 (748-826)는 H & E 또는 케라틴 염색된 절편 상에 기록된 잔류 생존가능한 침윤성 암종이 없는 광범위한 지도상 종양 세포 응집성 괴사를 보여주었다. CD11b에 대한 면역조직화학적 염색은 고르지 않은 중간 면역 세포 침윤을 강조하였다. CD68 (대식세포의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 고르지 않은 적당한 대식세포 침윤을 강조했다. 3마리 동물 중에서 TLS는 주목되지 않았다.
종양내 nDoce 3주기:
이 실험군의 둘 다의 사례 (748-797 및 748-822)는 H & E 또는 케라틴 염색된 절편 상에 기록된 잔류 생존가능한 침윤성 암종이 없는 광범위한 지도상 종양 세포 응집성 괴사를 보여주었다 (도 96 - 슬라이드 M 내지 O). CD11b에 대한 면역조직화학적 염색은 2마리 동물의 괴사 조직에서 각각 적당한 및 현저한 면역 세포 침윤물을 강조하였다. CD68 (대식세포의 마커)에 대한 면역조직화학적 염색은 이들 두 사례에서 괴사 영역 내에 적당한 및 현저한 대식세포 침윤물을 강조하였다. 이들 2마리 동물 중 어느 하나도 TLS가 언급되지 않았다.
비고: nDoce 처리 실험군의 동물은 종양 내에 남아있는 나노입자 침착물에 기인한 백색 "석회화된"영역을 가진 종양을 가졌다.
추가적인 관찰: (도면 없음)
IT nDoce 운반체 실험군: 종양내 운반체의 두 사례는 형태학적 및 면역조직화학적 수준에서 유사한 결과를 보여주었으며, 둘 다는 필수적으로 대조군에서 관찰되는 것과 동일한 형태학적 및 면역 조직화학적 외관을 가졌다.
Ⅳ 도세탁셀: 종양내 Ⅳ 도세탁셀의 두 사례는 형태학적 및 면역조직화학적 수준에서 유사한 결과를 보여주었으며, 둘 다는 필수적으로 대조군 및 IT 운반체 실험군에서 관찰되는 것과 동일한 형태학적 및 면역조직화학적 외관을 가졌다.
파클리탁셀 실험군 및 도세탁셀 실험군의 종양 부피 결과:
동물의 무게를 측정하고, 디지탈 캘리퍼로 종양 길이 및 너비를 58일 동안 매주 3회 및 부검 시에 측정하였다. 종양 부피 (V)는 다음과 같이 계산되었다: V (mm3) = ((L * W2))/2
여기서 L은 가장 큰 직경이고, W는 종양의 너비 (mm)이다. 종양 부피 및 체중의 통계적 분석을 위해 Study Log®를 사용하였다.
파클리탁셀 실험군에 대한 평균 종양 부피 결과는 도 97에 나타낸다. 도세탁셀 실험군에 대한 평균 종양 부피 결과는 도 98에 나타낸다. 도면에서 관찰될 수 있는 바와 같이, IT nPac 및 IT nDoce 둘 다는 효과적으로 종양을 치료한다.
도세탁셀 실험군의 종양 부피 결과와 관련하여, 접종 후 2일째 수컷 및 암컷 모두의 첫 번째 측정가능한 종양이 관찰되었다.
미처리 및 운반체 대조군 처리된 종양은 처리 내내 계속 성장하였으며, 암컷 래트의 최종 부피는 56563 내지 10,0003 미만이었다. Ⅳ 도세탁셀 처리는 운반체 대조군과 비교하여 부분적 종양 성장 억제를 유도하였다.
nDoce 전달된 IT는 운반체 및 다른 모든 치료와 비교하여 가장 효과적인 치료이었다. 대부분의 동물에서, 종양이 IT nDoce의 1, 2 또는 3주기로 처리된 종양은 원래의 종양 부위에 괴사성 조직만 남아 완벽하게 퇴행된 것으로 보였다.
부검 시, nDoce 처리 실험군의 동물은 종양 내에 남아있는 나노입자 침착물에 기인한 백색 "석회화된"영역을 가진 종양을 가졌다.
도세탁셀 실험군 결과:
조직에서의 도세탁셀 농도: 도세탁셀의 종양 조직 농도는 중수화된 유사체 도세탁셀-d9를 내부 표준으로서 사용하는 LC-MS/MS 분석에 의해 결정되었다. 프로타제에 의해 이전에 개발 된 방법을 사용하여, 도세탁셀의 농도를 1/x2 가중한 선형 회귀를 사용하여 분석물 농도 대비 피크 면적 비율 (분석물 대 내부 표준)을 플롯팅하여 제작된 교정 곡선으로부터 얻었다. 종양 조직에서 도세탁셀의 명목상 농도 범위는 1.00 내지 2,000 ng/g이었다. 래트 대조군 종양 조직 균질물에서 준비된 교정 곡선을 각각의 분석 전개의 시작 및 종결 시 분석하였다. 두 세트의 품질 관리 (QC) 시료를 4개의 농도 수준 (낮음, 중간-1, 중간-2 및 높음)으로 준비하고 검정법의 신뢰도를 보장하는데 사용하였다.
Ⅳ 도세탁셀 (5 내지 2.5 mg/kg)의 매주 3주기의 마지막 이후 38일째 평가된 4마리 동물 중 하나는 21.8 ng/g의 검출가능한 (LOQ = 1.00 ng/g) 도세탁셀 수준을 가졌다. nDoce QWX1 실험군의 3마리 동물 모두는 처리 후 51일째 659 ng/g 내지 1.4 × 105 ng/g 범위의 검출가능한 도세탁셀 수준을 가졌다. nDoce QWX2 실험군으로부터 2마리의 동물이 평가되었고, 처리 후 44일째 2.49 및 5.26 μg/g 수준을 가지고 있었다. nDoce QWX3 실험군에서는 분석에 사용가능한 종양이 없기 때문에 분석이 수행되지 않았다.
동물: 처리 기간 내내, 모든 실험군의 동물은 일부를 제외하고 미처리된 동물 및 운반체 대조군과 비교하여 비교적 정상적인 체중 증가를 나타내었다. nDoce QWX1가 투여된 1마리 동물은 치료 9일째 체중 감량이 있었다. 보충에도 불구하고, 동물은 체중 감량이 계속되었고 치료 16일째 안락사되어 체중 감량 종결점에 도달하였다. nDoce QWX3가 투여된 1마리 동물은 보충에도 불구하고 유의하게 체중이 감량되었고, 치료 39일째 종결점에 도달하였다.
다른 관찰에는 궤양 및 명백한 말초 신경병증이 포함된다. nDoce가 투여된 모든 동물은 종양의 표면에 궤양 또는 병변을 나타내었다. 이러한 병변은 건조하고 딱딱한 조직의 부위인 "딱지"로 설명되었다. 대부분의 경우 상처는 온전하게 남았다. nDoce QWX3가 투여된 1마리 동물은 처리 후 35일째 사지 허약 및 이동성 제한을 보여주었다. 개입으로, 허약은 동물이 연구에 남아있을 정도로 충분히 안정화되었다. 그러나, 종양 표면의> 50%를 차지하는 궤양화로 인해 49일째 동물을 안락사시켰다.
6개 실험군에서 잔류 종양의 크기 범위 (슬라이드 상에서 밀리미터로 측정된 생존가능한 암종의 최대 단면 치수)는 표 34에 나타낸다.
Figure pct00050
표 34에서 3개의 비-nDoce 실험군(총 6마리 동물)에서 잔류 암종 결절의 크기를 3개의 nDoce 실험군 (총 8마리 동물)과 직접 비교하는 데이타의 축약은 표 35에 나타낸다.
Figure pct00051
Ⅳ 도세탁셀 동물 둘 다를 포함하여 6마리의 비-nDoce 동물 중 5마리는 10 mm보다 큰 잔류 생존가능한 암종 결절을 가졌으며, 이들 중 대부분은 15 mm에 근접하였다. 잔여 비-nDoce 동물은 최대 치수 9 mm로 측정되는 생존가능한 암종을 가졌다. 대조적으로, IT nDoce로 처리된 동물 중 절반 (4/8)이 측정할 슬라이드 상에 잔류 생존가능한 암종을 갖지 않았다. 생존가능한 암종을 갖는 IT nDoce 실험군의 잔여 4마리 동물은 슬라이드 상에서 최대 치수가 5 mm 이하인 생존가능한 암종 결절을 가졌다. 이것은 종양이 0.9 mm로 측정된 경우가 포함되었으며 현미경 검사에 종양이 전체적으로 측정된 때는 분명하지 않았다.
잔류 침윤성 암종이 없는 사례의 백분율 및 잔류 생존가능성 암종 결절의 크기에 관한 3개의 IT nDoce 실험군의 비교는 표 36에 나타낸다.
Figure pct00052
IT nDoce 1 및 2주기 실험군 둘 다는 잔류 생존가능한 암종이 없는 1/3의 사례를 보인 반면, IT nDoce 3주기 실험군은 생존가능한 침윤성 암종이 없는 2/2의 사례를 가졌다. 잔류 생존가능한 암종 중에서 IT nDoce 주기 수의 점진적인 증가는 잔류 생존가능한 암종 결절의 크기 감소와 관련이 있다. 구체적으로, 잔류 생존가능한 암종 결절은 IT nDoce 1주기 실험군에서 4 mm 및 5 mm로 측정되었고 IT nDoce 2주기 실험군에서 결절은 0.9 mm 및 3 mm로 측정되었다. IT nDoce 3주기 실험군에서 두 사례는 측정할 잔류 생존가능한 암종은 없었다.
괴사를 나타내는 조직의 백분율은 표 37에 나타낸다.
Figure pct00053
비-nDoce 실험군의 모두 6마리 동물은 <5%의 괴사를 보였다. 이것은 종양 영역의 5% 미만을 차지하는, 종양에서 작은 괴사의 국소적 작은 구별된 병소로 구성되며, 종양 결절의 중앙 부분 내에 있었으며, 이는 혈액 공급을 증가시키는 종양으로 인해 저산소 혈증에 이차적일 수 있음을 시사한다. 8마리의 nDoce 동물 중 4마리가 종양의 완벽한 괴사를 보였다. 잔류 암종을 갖는 4마리 nDoce 동물 중 2마리가 주변 조직에 광범위한 괴사 (> 조직의 50%)를 나타내었다. * 이들 중 하나가 제출된 조직 영역의 < 5%를 차지하는 괴사의 병소 테두리를 포함하였지만, 잔류 암종을 갖는 남은 2마리의 nDoce 동물은 괴사의 최종 평가를 위한 충분한 주변 조직을 가지지 않았다.
준정량적으로 등급화된 CD11b로의 H/E 및 면역조직화학적 염색의 평가에 기초한 림프조직구성 침윤물 밀도는 표 38에 나타낸다.
Figure pct00054
비-nDoce 실험군의 모두 6마리 동물은 경미한 면역 세포 침윤물을 포함하였고, 이것은 종양 내에서 유의한 면역 세포 침윤물이 없이 종양 주위의 비-신생물 간질에 존재하였다. 대조적으로, nDoce 실험군의 8마리 동물 중 7마리는 적당한 면역 세포 침윤물을 포함한 반면, 남은 동물은 현저한 면역 세포 침윤물을 가졌다. 이것은 IT nDoce 처리된 동물에서 증가된 괴사의 양과 관련이 있었다.
도세탁셀 실험군 결과에 대한 논의:
종양내 nDoce의 효능을 평가할 목표로 신장 세포 암종 연구로부터 14마리 암컷 래트 하위집합의 형태학적 및 면역조직화학적 특징에 관한 검토를 시행하였다 ® (총 연구는 30마리의 동물을 포함함). 14마리 동물의 최신 하위집합은 두 개의 대조군, 종양 운반체가 주어진 2마리 동물, 정맥내 도세탁셀 (3주기)로 처리된 2마리 동물 및 종양내 nDoce 처리된 8마리 동물을 포함하였다. nDoce 실험군을 투여된 주기의 수를 기준으로 하여 3개 실험군으로 나누었다: 실험군 1 (1주기, 3마리 동물); 실험군 2 (2주기, 3마리 동물); 및 실험군 3 (3주기, 2마리 동물).
다양한 실험군 중에서 상이한 2개의 주요 특징은 종양 퇴행의 존재 및 정도이었다. 다른 실험군의 모든 동물에서 종양 퇴행이 부재한 반면, 종양내 nDoce 실험군의 모든 동물에서 종양 퇴행은 현저하였다.
비-nDoce 실험군의 6마리 동물 (즉, 대조군, IT 운반체 및 Ⅳ 도세탁셀 실험군) 모두는 잔류 생존가능한 종양을 가졌다. 이것은 침윤성 암종의 조밀한 결절로 구성되었고, 이로 인해 주변 정상 간질 조직으로부터 예리하게 구획된다. 암종 세포는 다함께 밀집되었고, 응집성 종양 세포 괴사의 산란된 별도의 병소가 존재하는 한편, 이들은 크기가 작았고, 6마리 동물 각각에서 전체적으로 종양 면적의 < 5%를 차지하였으며, 종양 결절의 중앙 부분 내에 있었다. 이러한 관찰은 이들 괴사 영역이 혈액 공급을 증가시키는 종양으로 인해 저산소 혈증에 이차적일 수 있음을 시사한다 (표 37). 케라틴 염색은 종양 세포의 강력하고 민감하며 특이적인 염색을 보여주었다. 염색된 슬라이드 상에서 측정된 생존가능한 종양 결절의 최대 치수는 이들 6마리 동물에서 9 내지 15 mm의 범위였으며 많은 경우 이것은 15 mm에 근접하였다 (표 27 및 도 28). 슬라이드 상의 이러한 종양 크기는 총 해부 시점에서 수행된 종양 측정에 상응하였다.
대조적으로, H & E 및 케라틴 염색된 절편의 평가에 의해 결정되는, 종양내 nDoce 처리된 동물의 8마리 동물 중 4마리는 잔류 생존가능한 종양이 없었다 (완벽한 반응). 남은 4마리의 동물에서, 염색된 슬라이드 상에서 측정된 바 잔류 생존가능한 종양은 비 nDoce 실험군에서 관찰된 것보다 현저하게 작았다 (표 34 및 표 35). 구체적으로, IT nDoce 처리된 이들 4마리 동물에서 잔류 생존가능한 종양 결절의 크기는 최대 치수가 0.9 mm 내지 5 mm이었다 (표 36). 이들 동물 중 3마리에서, 슬라이드 상에서 측정된 종양 크기는 총 해부 시점에서 시행된 종양 크기 측정과 상관되었다. 0.9 mm의 침윤성 암종 병소를 가진 잔여 동물에서, 이것은 광범위한 괴사 사이에 존재했으며, 총 해부 시점에는 분명하지 않았다.
8마리의 nDoce 동물 중 6마리에서, 인접한 괴사성 골격근 및 일부 동물에서 섬유 조직으로 확장하는 것이 광범위한 종양 세포의 응집성 괴사가 있었다. 또한, 괴사 영역 내에서 국소적으로 괴사성, 비-생존 유령 종양 세포 윤곽의 케라틴 염색이 있었고, 죽은 종양 세포로부터의 케라틴 중간 필라멘트의 퇴행성 표지와 부합하였다. 이것은 이들 영역이 이전에 치료법에 완벽히 반응한 생존가능한 암종을 포함하였음을 추가로 지지하였다. 나머지 두 동물의 슬라이드에는 괴사 평가를 위한 주변 조직이 매우 제한되어 있었지만 이들 중 하나는 한 영역에 괴사의 병소적 말초 테두리를 포함하였다.
비-nDoce 실험군 내에서 균일하게 경미한 면역 세포의 침윤물이 있었고, 이는 주로 종양 주변의 비-신생물 조직에서 관찰되었다. 유의한 종양내 면역 세포 침윤물은 없었다. 대조적으로, 종양 nDoce 실험군은 경미한 면역 세포 침윤물을 갖는 두 사례, 적당한 면역 세포 침윤물 갖는 다섯 사례 및 괴사 영역 내에 현저한 면역 세포의 침윤물을 갖는 단일 사례를 포함하였다 (표 38). 비-nDoce 실험군과 마찬가지로 유의한 종양내 림프 침윤은 없었다. 본 연구 실험군의 14마리 동물 중 어느 것에서도 진단적 3차 림프 구조 (TLS)가 없었다.
요약하면, 본 검토는 30마리의 암컷 동물을 포함하는 연구로부터 나온 14마리의 암컷 동물로 제한되었지만, 종양내 nDoce 실험군이 비-nDoce 실험군과 비교될 때 치료법에 대한 종양 반응의 유형 및 정도에서 현저한 차이가 주목되었다. 6마리 비-nDoce 실험군 동물은 종양 퇴행의 명백한 증거를 전혀 보여주지 않았고, 모두는 슬라이드 상에 측정된 바 9 내지 15 mm의 크기 범위를 갖는 잔류 생존가능한 암종 결절을 가졌다. 그러나, 종양내 nDoce 실험군의 8마리 동물 모두는 종양 반응의 증거를 보여주었고, 광범위한 괴사가 평가를 위한 충분한 주변 조직을 갖는 모두 6마리의 동물에서 주목되었다. 종양 반응에는 H & E 및 케라틴 염색된 절편의 검사에서 결정적인 잔류 생존가능한 암종이 부족한 것으로 입증된 바와 같이, 이 실험군의 절반 (4/8)은 완벽한 퇴행을 포함한 한편, 나머지 4마리의 동물은 국소적으로 작은 잔류 생존가능한 암종 결절을 포함하였고, 가장 큰 것은 5 mm, 가장 작은 것은 0.9 mm이었다. 잔류 암종을 갖는 이들 4마리 동물 중 2마리에서, 평가를 위해 슬라이드 상에 충분한 주변 조직이 존재하였고, 이것은 광범위한 괴사를 나타내었다. 유사하게, 이것은 비-nDoce 실험군에서 면역 세포 침윤물 정도는 경미한 반면, nDoce 실험군에서는 경미한 내지 현저한 범위이었으며 이는 종양 반응의 정도 및 결과적인 괴사 잔해와 연관됨을 시사한다.
3개의 IT nDoce 실험군을 서로 비교할 때, 동물이 종양내 nDoce 치료법의 주기 증가로 인해, 더 큰 종양 반응 정도를 보이는 점이 주목된다. 구체적으로, IT nDoce의 1주기가 투여된 실험군에서 3마리 동물 중에서, 1마리가 완벽한 반응을 나타낸 반면, 남은 2마리 동물은 4 및 5 mm로 측정된 잔류 결절을 가지고 있었다. IT nDoce의 2주기가 투여된 실험군에서 3마리 동물 중 1마리가 완벽한 반응을 나타낸 반면, 남은 2마리 동물은 0.9 및 3 mm로 측정된 잔류 결절이 있었다. 마지막으로 IT nDoce의 3주기가 투여된 실험군에서 둘 다의 동물은 치료법에 완벽한 반응을 나타내었다 (표 36).
결론적으로, 종양내 nDoce로 처리된 본 연구에서 신장 세포 암종을 갖는 8마리 동물은 완벽한 종양 퇴행의 50% 비율뿐만 아니라 잔여 4마리 동물에서 잔류 종양 크기의 현저한 감소를 포함하는 주목할만한 조직학적 반응을 나타내었다. 관련된 광범위한 괴사 및 면역 반응 증가가 nDoce 실험군에서 주목되었고, 괴사 영역에서 무핵 비-생존 유령 종양 세포 윤곽의 케라틴 표지의 병소 영역은 이들 영역이 치료법에 완벽하게 반응하였던 생존가능한 암종을 포함하였음을 추가로 지지하였다. 대조적으로, 비-nDoce 처리된 실험군에서 이러한 종양 퇴행이 없었다. 또한, 1 내지 3주기의 종양내 nDoce의 주기 증가는 IT nDoce 코호트에서 점진적으로 더 큰 종양 퇴행 정도 및 점진적으로 더 높은 완벽한 퇴행의 비율을 유도하였다.
실시예 9 - 마우스에서 nPac, nDoce 및 탁솔®의 약동학적 비교 연구
마우스에서 약동학 연구는 복강 내로 이들 입자의 현탁액을 주사한 후 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 지속적인 방출을 제공하도록 의도된 독특한 서브마이크론 입자로부터 파클리탁셀 및 도세탁셀의 방출 속도를 평가하기 위해 시행하였다. 복막 액으로 방출되는 약물의 양을 시판되는 파클리탁셀 (일반명 탁솔®)의 용액 제형물과 비교하였다.
nPac (파클리탁셀, 본 실시예에 사용된 0.878 마이크론의 평균 입자 크기 (수), 26.7 m2/g의 SSA 및 0.0763 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)을 갖는 대략 98% 파클리탁셀); 및 nDoce (도세탁셀 입자, 본 실시예에 사용된 0.921 마이크론의 평균 입자 크기 (수), 23.9 m2/g의 SSA 및 0.0991 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)을 갖는 대략 99% 도세탁셀)가 아세톤에 용해된 파클리탁셀 또는 에탄올에 용해된 도세탁셀로부터의 초임계 침전에 의해 이들 용액이 초임계 이산화탄소 내로 주입될 때 제조되었다. 음파 에너지를 사용한 강렬한 혼합은 유기 용매를 매우 빠르게 제거하여 매우 높은 특이 표면적을 갖는 순수한 파클리탁셀 또는 순수한 도세탁셀의 독특한 서브마이크론 입자의 신속한 침전을 유도하였다. 이들 입자의 증진된 특이 표면적과 고유한 특성은 복막 액에 주입될 때 이러한 입자에서 약물 방출 속도를 조정하는 데 사용되었다.
파클리탁셀 입자 또는 도세탁셀 입자의 투약 현탁액을 2 mg/mL로 제조하고, 암컷 Balb/c 마우스에 36 mg/kg의 복강내 주사로 투여하였다. 유사하게, 파클리탁셀 (일반명 탁솔®)의 2 mg/mL 용액을 36 mg/kg의 복강내 주사로 암컷 Balb/c 마우스에 투여하였다. 파클리탁셀 또는 도세탁셀 입자를 투약한 마우스의 경우, 18개의 수집 지점 각각에서 3마리의 마우스로부터 복막 액 및 혈액 시료를 수집하였다. 혈액 시료는 심장 천자에 의해 이소플루란 마취 하에 수집되었다. 복강을 노출하기 위해 마우스의 복강을 열어 복막 액 시료를 수집하였다. 수집 시점은 0시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일, 49일, 56일, 70일, 84일째이었다.
일반명 탁솔® 투약된 암컷 Balb/c 마우스는 시료 수집 시간이 단축된 것을 제외하고는 정확히 동일한 방식으로 처리되었다. 일반명 탁솔® 처리된 마우스는 0시간, 3시간, 6시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일 및 14일째 수집된 혈액 및 복막 액 시료를 가졌다.
모든 혈장 및 복막 액 시료는 검증된 LCMSMS 테스트 방법을 사용하여 검정되었다. 이러한 연구에 대한 결과는 도 99, 도 100, 도 101 및 도 102에 포함되어 있다. 비고: 도 101 및 도 102는 또한 36 mg/kg의 아브락산® IP 용량을 포함한다.
실시예 10 - 마우스에서 Renca-e237 유전적 동계 이종이식 연구
이 연구의 목적은 완전히 온전한 면역계를 가진 암컷 BALb/c 마우스를 사용하여 일차 및 이차 종양 접종이 있는 Renca 유전적 동계 신장 암종 모델에서 nDoce (나노입자 도세탁셀)의 종양내 용량 투여를 평가하는 것이었다. 추가적인 마우스 실험군을 사용하여 nDoce가 원발성 종양 부위로부터 이격되어 이식된 이차 종양에 미치는 능력과 운반체 또는 Ⅳ 도세탁셀로의 치료를 비교하였다. 표 39의 스케줄을 따랐다.
Figure pct00055
Renca는 신장 피질 샘암종으로서 자발적으로 발생한 마우스 종양에서 유래된 세포주이다. Renca 종양의 성장 양상은 인간 성인 신장 세포 암종의 성장 양상을 정확하게 모방한다.
연구는 다음의 실험군으로 구성되었다.
실험군 1: 치료 없음
실험군 2: IT 운반체 (대조군)
실험군 3: Ⅳ 도세탁셀
실험군 4: IT/PT nDoce (nDoce-1) 30 mg/kg (종양내 용량의 절반 (IT)/종양 주변 용량의 절반 (PT))
실험군 5: IT nDoce (nDoce-1) 30 mg/kg (종양내 전체 용량)
실험군 6: IT/PT nDoce (nDoce-2) 60 mg/kg (종양내 용량의 절반/종양 주변 용량의 절반)
실험군 7: IT nDoce (n-Doce-2) 60 mg/kg (종양내 전체 용량)
실험군 8: IT 운반체/15일째 5 x 105개 Renca 세포
실험군 9: IT 도세탁셀/15일째 5 x 105개 Renca 세포
실험군 10: IT nDoce (nDoce-1) 30 mg/kg / 15일째 5 × 105개 Renca 세포
모든 치료는 같은 날 개시되었다. IT 운반체 및 nDoce는 매주 3회 주기로 투여되었다. Ⅳ 도세탁셀은 1일째 (10 mg/kg) 및 11일째 (5 mg/kg)에 투여되었다 (전신 독성으로 인해 투여 스케쥴이 변경됨).
재료 및 투약:
"도세탁셀" = 7.5% 에탄올 중 도세탁셀 : 식염수 용액 중 7.5% 폴리소르베이트 80 (탁소테르® 주사) .
nDoce 분말 = 나노입자 도세탁셀 분말(1.078 마이크론의 평균 입자 크기(수), 37.2 m2/g의 SSA 및 0.0723 g/cm3의 벌크 밀도(태핑되지 않음)를 갖는 대략 99% 도세탁셀).
nDoce-1 = 0.11% 폴리소르베이트 80 중 11 mg/mL nDoce 분말의 현탁액 : 식염수 중 0.88% 에탄올.
nDoce-2 = 0.22% 폴리소르베이트 80에 22 mg/mL nDoce 분말의 현탁액 : 식염수 중 1.76% 에탄올.
운반체 = 0.22% 폴리소르베이트 80 : 식염수 중 1.76% 에탄올.
도세탁셀의 투약 = 10 mL/kg (0.200 mL/20 g 마우스), 체중에 맞게 이에 따라 부피가 조정되었다.
운반체의 투약 = 0.05 mL/마우스, 체중에 맞게 부피가 조정되지 않았다.
nDoce-1의 투약 = 0.05 mL/마우스, 체중에 맞게 부피가 조정되지 않았고, 18 g 동물을 기준으로 30 mg/kg이 된다.
nDoce-2의 투약 = 0.05 mL/마우스, 체중에 맞게 부피가 조정되지 않았고, 18 g 동물을 기준으로 60 mg/kg이 된다.
절차: 222마리 CR 암컷 BALb/c 마우스에 0% 매트리겔 중 5 × 105개 Renca 종양 세포를 피하로 (SC)옆구리에 주사하였다. 세포 주사 부피: 0.1 mL/마우스. 시작 일에 연령: 8 내지 12주. 종양이 평균 크기가 40 내지 60 mm³에 도달했을 때 쌍 매칭이 수행되었고, 치료가 시작되었다. 실험군 8 내지 10에서; 치료 개시 후 15일째 반대쪽 (왼쪽) 옆구리에 제 2 세포 주사를 수행하였다. 체중: 5/2 다음 끝까지 tiwk. 캘리퍼 측정: 끝까지 tiwk. 실험군 8 내지 10에 대해 이중 캘리퍼 측정이 수행되었다. 30% 초과 체중 감소의 단일 관찰 또는> 25% 체중 감소의 3회 연속적 측정을 갖는 모든 개별 동물을 안락사시켰다. 평균 체중 감소가 > 20% 또는> 10% 사망률을 갖는 실험군은 투약을 중단하였다. 실험군은 안락사되지 않고, 회복이 허용되었다. > 20%의 체중 감소를 갖는 실험군 내에서, 개별 체중 감소 종결점에 도달한 개체를 안락사시켰다. 실험군 치료와 관련된 체중 감소가 원래 체중의 10% 이내로 회복된 때, 더 낮은 용량 또는 덜 빈번한 투약 스케줄로 투약을 재개하였다. 미처리 체중% 회복에 대한 예외는 사례별로 허용되었다.
종결점: 실험군 1번 내지 7: 종결점 TGI. 동물은 실험군으로서 모니터링되었다. 실험의 종결점은 2000 mm3 또는 45일 또는 동물이 안락사 판단기준 (체중, 종양 크기 또는 궤양)에 도달한 시점 중 먼저 도래한 시점의 대조군의 평균 종양 무게이었다. 종결점에 도달하면 모든 동물을 안락사시켰다. 종양 부피 및 체중은 미처리된 운반체 대조군 및 Ⅳ 도세탁셀 실험군 평균 종양 부피가 > 2000 mm3 인 시점에서 34일 동안 내내 수집되었다. 실험군 1, 2, 3, 4 및 6의 모든 동물을 34일째 희생시키고 말초 혈액 및 종양 조직을 유세포　분석 및 조직병리학을 위해 수집하였다. 실험군 5 및 7의 동물은 IT nDoce 치료에서 종양 진행을 추적하기 위해 46일 동안 내내 연구에 남겨두었다.
종결점: 실험군 8 내지 10: 실험의 종결점은 2000 mm3 또는 치료 개시 후 45일째 또는 동물이 안락사 판단기준 (체중, 종양 크기 또는 궤양)에 도달한 시점의 조합된 평균 종양 무게이었다. 종결점에 도달하면 모든 동물을 안락사시켰다. 비고: 운반체 및 Ⅳ 도세탁셀 동물은 종양 부피가 2000 mm3 이상에 도달하기 때문에 34 내지 36일째 희생되었다.
시료화 지침: 시점: 종결점에서.
동물: 실험군 2 내지 7: 모든 동물 (대조군의 종양 무게가 2000 mm3에 도달할 때). 실험군 8 내지 10: 모든 동물 (대조군 8의 조합된 종양 무게가 2000 mm3에 도달할 때).
혈액 수집: 이소플루란 마취 하에 최종 심장 천자에 의해 전체 부피 혈액을 수집하였다. 프로세싱된 혈액: 전혈: 항응고제 - K2EDTA, 보존 - 4℃ 냉각, 배송 조건 - 4℃ (젖은 얼음). 유세포　분석을 위해 CRL-NC에 유지된다. 하기 표 40의 흐름 패널을 참조한다.
장기 수집: 종양 (2개 부분으로 분할됨). 제 1부: 보존 - 24시간 동안 포르말린, 다음으로 70% EtOH로 전달, 배송 조건 - 실온. IHC 염색을 위해 실험실로 보냈다. 제 2부: 보존 - 단일 세포 현탁액으로 처리, 운송 조건 - 4℃ (젖은 얼음). 유세포　분석을 위해 CRL-NC에 유지된다. 하기 표 40의 흐름 패널을 참조한다. 실험군 2 내지 10에서 조기 안락사를 위한 종양 보존: 유방 지방 패드 영역 (머리)부터 바로 과거 종양 (꼬리)까지 절제된 종양 및 주변 영역. 이 부위에는 사타구니 림프절이 포함되었다. 이 시료를 머리부터 꼬리까지 4 mm마다 절편화하고, 순서대로 레이블이 달린 별도의 카세트에 동봉하였다.
유세포　분석을 통해 분석을 위해 말초 혈액 및 종양 조직을 수집하였다. 분석된 세포 유형에는 T 세포: CD4+, CD8+ (종양 억제); Treg (종양 촉진); M1 대식세포 (종양 억제); M2 대식세포 (종양 촉진); 및 M2 대식세포 (종양 촉진)를 포함하였다. 흐름 패널은 하기 표 40에 나타낸다.
Figure pct00056
결과:
실험군 1 내지 7에 대한 종양 부피 결과는 도 103 및 도 104에 나타낸다. 운반체과 비교하여 Ⅳ 도세탁셀로의 종양 부피의 차이는 없었다. IT nDoce 치료는 운반체 및 Ⅳ 도세탁셀과 비교하여 종양 부피가 현저히 낮추었다. nDoce 용량 (30 mg/kg 대 60 mg/kg) 또는 투약 (종양내 대 종양내/종양 주위) 사이의 차이는 없었다. nDoce를 사용하면 연구 종료 (46일째)까지 종양 부피 감소가 유지되었으며, 이는 nDoce 저장소가 최종 투여 후> 20일 동안 종양 부피를 지속적으로 감소시켰음을 입증한다.
실험군 8 내지 10에 대한 이식 12일 내지 20일 (+/- 1) 이후에 평균 종양 부피 결과는 도 105에 나타낸다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, 치료되지 않은 이차 종양은 운반체 또는 Ⅳ 도세탁셀로 치료된 원발성 종양보다 초기 성장률이 낮고 IT nDoce로 치료된 원발성 종양과 유사한 비율을 갖는다. 따라서, 원발성 종양에 대한 IT nDoce 투여는 치료되지 않은 이차 종양의 성장률을 감소시킨다.
다양한 실험군 및 개별 동물의 혈액에 대한 유세포 분석 결과가 하기 표 41에 요약되어 있다. 다양한 실험군 및 개별 동물의 종양 조직에 대한 유세포 분석 결과가 하기 표 42에 요약되어 있다.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
표 41 (혈액에 대한 유세포 분석 결과)에서 CD45+ 세포는 총 살아있는 세포 집단의 약 90% 내지 약 99%를 차지한다. CD4+ T 세포는 총 면역 세포 집단의 약 4% 내지 약 15%를 차지한다. CD8+ T 세포는 총 면역 세포 집단의 약 3% 내지 약 10%를 차지한다.
표 42 (종양 조직에 대한 유세포 분석 결과)에서 CD45+ 세포는 총 살아있는 세포 집단의 약 60% 내지 약 90%를 차지한다. M1 대식세포는 총 면역 세포 집단의 약 20% 내지 약 40%를 차지한다.
혈액에서 면역 세포 집단의 분석은 도 106 내지도 112에 나타낸다. 도면에서 볼 수 있는 바와 같이, IT nDoce 치료에 대해 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 유의한 증가 및 MDSC 감소의 추세가 나타난다.
결론적으로, 이러한 데이터는 도 105에 나타낸 바와 같이, IT nDoce를 원발성 Renca 종양에 투여한 후 생체내에서 생성된 면역 세포가 미처리된 이차 Renca 종양의 성장 속도를 감소시키기 때문에 Renca 종양에 특이적인 종양 특이적 면역 세포임을 가리킨다. 역으로, 대조군 및 Ⅳ 도세탁셀 용량 이전에 존재했거나 이후에 생체내에서 생성되었을 수 있는 면역 세포는 도 105에 나타낸 바와 같이 투여가 이차 Renca 종양의 성장 속도를 감소시키지 않았기 때문에 Renca 종양에 대해 종양 특이적이 아니다.

Claims (91)

  1. 악성 종양에 걸린 대상체로부터 종양 특이적 면역 세포를 단리하는 방법으로서,
    (a) 생체내에서 암 특이적 면역 세포의 생성을 유도하기 위해 상기 종양에 탁산 입자를 포함하는 조성물을 하나 이상의 개별 투여로 국소적으로 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 종양 특이적 면역 세포를 상기 대상체의 혈액 및/또는 상기 대상체의 종양 부위 또는 이의 주변의 조직으로부터 단리하고, 이로써 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 제공하는 단계를 포함하고,
    상기 종양 특이적 면역 세포는 상기 악성 종양에 대한 특이성을 갖는, 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단리 단계 1(b)는 상기 투여 단계 1(a) 이후 적어도 10일 또는 적어도 28일째 발생하는, 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 단리 단계 1(b)는 상기 투여 단계 1(a) 이후 60일 이내에 발생하는, 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 수지상 세포, CD45+ 세포, 림프구, 백혈구, 대식세포, M1 대식세포, T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, 또는 자연 살상 (NK) 세포 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 악성 종양은 육종, 암종, 림프종, 고형 종양, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 복강내 장기 종양, 뇌종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 피부 종양, 피부 전이, 림포이드, 위장 종양, 폐 종양, 골 종양, 흑색종, 망막모세포종 또는 신장 종양 또는 이들의 전이성 종양을 포함하는, 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 상기 대상체의 혈액으로부터 단리되는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 성분채집술 또는 백혈구 성분채집술에 의해 상기 혈액으로부터 단리되는, 방법.
  8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 CD4+ T 세포는 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 4% 내지 약 15%를 차지하는, 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포는 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단의 약 3% 내지 약 10%를 차지하는, 방법.
  11. 제 6항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 면역 세포의 대조군 집단에서보다 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 더 큰 세포 집단 및 골수 유래된 억압인자 세포 (MDSC)의 더 작은 세포 집단을 포함하는, 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포의 집단을 포함하는, 방법.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 투여 단계 1(a) 이전에 상기 대상체의 혈액으로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 방법.
  14. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체의 혈액으로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 방법.
  15. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체의 혈액으로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 1(a)에서 상기 조성물의 국소 투여는 2회 이상의 개별 투여를 포함하는, 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 상기 단계 1(a)에서 상기 조성물의 국소 투여는 적어도 2주 동안 주 1회 투여의 2회 이상의 개별 투여를 포함하는, 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 상기 단계 1(a)에서 상기 조성물의 국소 투여는 적어도 1주 동안 주 2회 투여의 2회 이상 개별 투여를 포함하고, 상기 2회 이상의 개별 투여는 적어도 1일 간격을 두는, 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리 단계 1(b)는 상기 단계 1(a)에서의 각각의 개별 투여 이후에 반복되고, 각각의 반복된 단리 단계로부터 획득된 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 풀링되는, 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 농축되고/거나, 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하도록 생체외에서 증식되는, 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 상기 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되는, 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 상기 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 저장되는, 방법.
  23. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 농축되고, 상기 농축된 종양 특이적 면역 세포 집단의 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD45+ 세포 및 M1 대식세포, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 상기 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 생체외에서 변형되는, 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단, 상기 증식된 종양 특이적 면역 세포의 집단 및/또는 상기 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포의 집단이 변형되어 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 생산하고, 상기 변형 단계는 세포를 항체에 노출시키는 것, 세포를 펩티드에 노출시키는 것, 세포를 생물학적 반응 개질제에 노출시키는 것, 세포를 사이토카인 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 성장인자 또는 이의 유사체에 노출시키는 것, 세포를 항원에 노출시키는 것, 세포를 RNA 또는 소간섭 RNA에 노출시키는 것, 세포를 전체 세포 용출물과 공동배양하는 것, 세포를 인공 항원 제시 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 다른 유형의 세포와 공동 배양하는 것, 세포를 유전적으로 조작하는 것, 세포의 유전자 전사를 상향조절하는 것, 세포의 유전자 전사를 하향조절하는 것, 렌티바이러스성 벡터를 세포 내로 형질감염시키는 것, 플라스미드 DNA를 세포 내로 형질감염시키는 것, mRNA를 세포 내로 핵형질감염시키는 것, 레트로바이러스성 벡터를 통해 조작된 키메라 항원 수용체 (CAR)를 인코딩하는 유전자로 세포를 형질도입시키는 것, 및/또는 유전자 녹아웃 또는 CRISPR 방법에 의해 세포의 유전자를 유전적으로 불활성화하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 제 24항 또는 제 25항에 있어서, 상기 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 동결되는, 방법.
  27. 제 24항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단은 보관되는, 방법.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 0.1 마이크론 내지 5 마이크론 또는 0.1 마이크론 내지 1.5 마이크론 또는 0.4 마이크론 내지 1.2 마이크론의 평균 입자 크기(수)를 갖는, 방법.
  29. 제 1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 탁산을 적어도 95% 포함하는, 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 적어도 18 m2/g, 20 m2/g, 25 m2/g, 30 m2/g, 32 m2/g, 34 m2/g 또는 35 m2/g; 또는 약 18 m2/g 내지 약 60 m2/g 또는 약 18 m2/g 내지 약 50 m2/g의 특이 표면적 (SSA)를 갖는, 방법.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 0.05 g/cm3 내지 0.15 g/cm3의 벌크 밀도 (태핑되지 않음)를 갖는, 방법.
  32. 제 1항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 단량체, 중합체 (또는 생체적합성 중합체), 단백질, 표면활성제 또는 알부민에 결합되거나, 이로 피막화되거나, 이로 코팅되지 않는, 방법.
  33. 제 1항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 결정질 형태인, 방법.
  34. 제 1항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 탁산 입자는 파클리탁셀 입자, 도세탁셀 입자, 카바지탁셀 입자 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 탁산 입자는 파클리탁셀 입자를 포함하는, 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 상기 탁산 입자는 도세탁셀 입자를 포함하는, 방법.
  37. 제 1항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 국소 투여는 국소 투여, 폐 투여, 종양내 주사 투여, 복강내 주사 투여, 방광내 점적 투여 (방광) 또는 종양 주변의 조직 내로 직접 주사, 또는 이들의 조합에 의하는, 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 조성물의 국소 투여는 상기 조성물이 상기 대상체의 환부에 국소적으로 적용되는 국소 투여이고, 상기 종양은 피부 악성 종양인, 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 피부 악성 종양은 피부암을 포함하는, 방법.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 피부암은 흑색종, 기저 세포 암종, 편평 세포 암종 또는 카포시 육종인, 방법.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 피부 악성 종양은 피부 전이를 포함하는, 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 피부 전이는 폐암, 유방암, 결장암, 구강암, 난소암, 신장암, 식도암, 위암, 간암 및/또는 카포시 육종으로부터 나오는, 방법.
  43. 제 38항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 액체 또는 반-고체 담체를 추가로 포함하고, 탁산 입자는 상기 담체에 분산되어 있는, 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 조성물은 무수성 및 소수성인, 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 조성물은 탄화수소를 포함하는, 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 탄화수소는 바셀린, 미네랄 오일 또는 파라핀 왁스, 또는 이들의 혼합물인, 방법.
  47. 제 44항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체를 추가로 포함하는, 방법.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 하나 이상의 휘발성 실리콘 유체의 농도는 상기 조성물의 5 내지 24 중량%인, 방법.
  49. 제 4항 또는 제 48항에 있어서, 상기 휘발성 실리콘 유체가 사이클로메티콘인, 방법.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 사이클로메티콘은 사이클로펜타실록산인, 방법.
  51. 제 43항 내지 제 50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 휘발성 C1-C4 지방족 알코올을 함유하지 않고/거나, 추가적인 침투 증강제를 함유하지 않고/거나, 추가적인 휘발성 용매를 함유하지 않고/거나, 표면활성제를 함유하지 않고/거나, 단백질을 함유하지 않고/거나, 알부민을 함유하지 않는, 방법.
  52. 제 38항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 탁산 입자의 농도는 약 0.1 내지 약 5 중량%인, 방법.
  53. 제 37항에 있어서, 상기 국소 투여는 상기 조성물이 흡입되는 폐 투여에 의하고, 상기 종양은 폐 종양인, 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 폐 투여는 분무화를 포함하고, 상기 분무화는 상기 조성물의 에어로졸 비말의 폐 전달을 유도하는, 방법.
  55. 제 54항에 있어서, 상기 에어로졸 비말은 약 0.5 μm 내지 약 6 μm 직경, 또는 약 1 μm 내지 약 3 μm 직경, 또는 약 2 μm 내지 약 3 μm 직경의 질량 평균 공기역학적 직경 (MMAD)을 갖는, 방법.
  56. 제 37항에 있어서, 상기 국소 투여는 상기 조성물이 종양 내로 직접 주사되는 종양내 주사 투여에 의하는, 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 상기 종양은 육종, 암종, 림프종, 유방 종양, 전립선 종양, 두경부 종양, 뇌종양, 교모세포종, 방광 종양, 췌장 종양, 간 종양, 난소 종양, 결장직장 종양, 피부 종양, 피부 전이, 림포이드, 위장 종양 및/또는 신장 종양인, 방법.
  58. 제 37항에 있어서, 상기 국소 투여는 상기 조성물은 복강 내로 주사되는 복강내 주사 투여에 의하고, 상기 종양은 복강내 장기 종양인, 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 상기 복강내 장기 종양은 난소 종양인, 방법.
  60. 제 37항에 있어서, 상기 국소 투여는 상기 조성물이 방광 내로 점적주입되는 방광내 점적 투여 (방광)에 의하는, 방법.
  61. 제 53항 내지 제 60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 액체 담체를 추가로 포함하고, 상기 탁산 입자는 상기 담체에 분산되는, 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 상기 액체 담체는 수용성 담체인, 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 상기 수용성 담체는 0.9% 식염수 용액인, 방법.
  64. 제 62항 또는 제 63항에 있어서, 상기 수용성 담체는 계면활성제를 포함하는, 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 상기 계면활성제는 폴리소르베이트인, 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 상기 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80이고, 상기 폴리소르베이트 80은 약 0.01 부피% 내지 약 1 부피%의 농도로 상기 수용성 담체에 존재하는, 방법.
  67. 제 53항 내지 제 66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 탁산 입자의 농도는 약 0.1 mg/mL 내지 약 40 mg/mL 또는 약 6 mg/mL 내지 약 20 mg/mL인, 방법.
  68. 담체 및 제 1항 내지 제 67항 중 어느 하나의 방법에 의해 획득되는 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포, 상기 농축된 종양 특이적 면역 세포, 상기 증식된 종양 특이적 면역 세포, 상기 증식된 농축된 종양 특이적 면역 세포 및/또는 상기 변형된 종양 특이적 면역 세포의 집단을 포함하는 세포 조성물.
  69. 악성 종양에 걸려 탁산 입자를 포함하는 조성물을 악성 종양에 국소 투여한 대상체로부터 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단을 포함하는 세포 조성물로서, 상기 대상체로부터 얻은 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 상기 악성 종양 유형에 특이적인, 세포 조성물.
  70. 제 69항에 있어서, 상기 단리된 종양 특이적 면역 세포 집단은 면역 세포의 대조군 집단과 비교하여, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 농도가 증진되는, 세포 조성물.
  71. 제 70항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 악성 종양 유형에 특이적이지 않은 면역 세포의 집단을 포함하는, 세포 조성물.
  72. 제 70항 또는 제 71항에 있어서, 상기 대조군 면역 세포 집단은 상기 탁산 입자를 포함하는 조성물을 상기 종양에 국소 투여하기 이전에 상기 대상체로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 세포 조성물.
  73. 제 70항 또는 제 71항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 악성 종양 유형을 갖고 탁산 조성물의 정맥내 (Ⅳ) 투여를 받은 대상체로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 세포 조성물.
  74. 제 70항 또는 제 71항에 있어서, 상기 면역 세포의 대조군 집단은 상기 악성 종양 유형을 갖지 않는 대상체로부터 단리되는 면역 세포 집단을 포함하는, 세포 조성물.
  75. 제 69항 내지 제 74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 4% 내지 약 15%의 CD4+ T 세포를 포함하는, 세포 조성물.
  76. 제 69항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 특이적 면역 세포 집단은 약 3% 내지 약 10%의 CD8+ T 세포를 포함하는, 세포 조성물.
  77. 제 69항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 담체를 추가로 포함하는, 세포 조성물.
  78. 제 69항 내지 제 77 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 추가로 포함하는, 세포 조성물.
  79. 제 78항에 있어서, 상기 치료제는 면역치료제 또는 체크포인트 저해제인, 세포 조성물.
  80. 제 69항 내지 제 79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 조성물은 동결되는, 세포 조성물.
  81. 암 또는 전이성 암에 걸린 대상체에서 암 또는 전이성 암을 치료하는 방법으로서, 제 68항 내지 제 80항 중 어느 한 항의 세포 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  82. 제 81항에 있어서, 상기 치료는 자가유래성 치료인, 방법.
  83. 제 81항에 있어서, 상기 치료는 동종유래성 치료인, 방법.
  84. 제 81항 내지 제 83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 조성물의 투여는 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합에 의하는, 방법.
  85. 제 81항 내지 제 84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 또는 전이성 암은 상기 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 상기 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형인, 방법.
  86. 제 68항 내지 제 80항 중 어느 한 항의 세포 조성물을 포함하는, 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 백신.
  87. 대상체에서 암을 예방하거나 암의 재발을 예방하는 방법으로서, 제 86항의 백신을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 상기 백신은 자가유래성 백신인, 방법.
  89. 제 87항에 있어서, 상기 백신은 동종유래성 백신인, 방법.
  90. 제 86항 내지 제 89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백신의 투여는 정맥내 투여, 정맥내 주사, 정맥내 주입/관류/볼루스, 동맥내 주사, 동맥내 주입/관류, 볼루스, 림프내 주입, 결절내 주입, 복강내 주입, 근육내 주사, 피하 주사, 방광내 점적주입, 종양내 주사, 종양주위 주사, 폐 투여, 국소 투여, 또는 이들의 조합에 의하는, 방법.
  91. 제 87항 내지 제 90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 상기 탁산 입자를 포함하는 조성물이 국소 투여되는 상기 악성 종양과 동일한 악성 종양 유형인, 방법.
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