JP2016533344A - 無担体生物活性タンパク質ナノ構造体 - Google Patents

無担体生物活性タンパク質ナノ構造体 Download PDF

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Abstract

本発明は、インビトロおよびインビボで有効かつ効率的にタンパク質を送達するための組成物および方法を提供する。ある面において、タンパク質は互いに可逆的に架橋しているおよび／または官能基で修飾され、ポリマー系またはシリカ系ナノシェルによりプロテアーゼ分解から保護されている。

Description

関連出願
本出願は２０１３年９月２７日出願の米国仮出願６１／８８３,５０３号の３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１１９(ｅ)の下の利益を主張し、当該出願を引用によりその全体を本明細書に包含させる。
発明の分野
ある態様において、本発明は組織および細胞への無担体生物活性治療用タンパク質の送達に関する。
発明の背景
抗体、サイトカイン、増殖因子およびワクチンのようなタンパク質治療剤は、例えば、癌、糖尿病および心血管疾患を含む多様な疾患の処置のための重要な治療剤である。このクラスのタンパク質治療剤は、世界の製薬業によって、ここ数年急速に開発されている。タンパク質治療剤は、小分子薬物と比較して特異性および効力が高いとの利点を有する。しかしながら、タンパク質治療剤の使用は、その本質的な不安定性、免疫原性および短半減期の結果として制約されている。
これらの制限に取り組むために、一般に二つの試みがある。一つは治療用タンパク質の遺伝子融合であり、もう一つはタンパク質治療剤の送達のための加工担体(engineered carrier)の使用である。加工担体を用いて、タンパク質はカプセル封入／吸着または接合により充填される。タンパク質のリポソームまたはナノ粒子中／上へのカプセル封入または吸着は一般的に非効率的である。タンパク質の非タンパク質への結合は一般的にその生物学的に活性を低減させる。それゆえに、両者の試みは問題を含む。
発明の要約
本発明はとりわけ、生物活性(例えば、完全に生物学的に活性な)タンパク質の効率的送達のための方法および組成物を提供する。ここに提供する種々の態様は、少なくとも一部、分解可能リンカーを介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋したタンパク質(例えば、治療用タンパク質)が、生物活性タンパク質として担体を用いず(例えば、アルブミンまたは他の担体を用いず)インビボで送達できることを示す、驚くべき結果に基づく。ここに記載する種々の他の面は、少なくとも一部、官能基で可逆的に修飾され、かつポリマー系ナノシェル(polymer-based nanoshell)によりさらに分解から保護されたタンパク質が、無傷の、完全に生物学的に活性なタンパク質としてインビボで送達できることを示す、驚くべき結果に基づく。ここに提供する方法を使用して、タンパク質は高い取り込み効率(例えば、約９０％を超える)および高いタンパク質薬物負荷効率(例えば、約８０％を超える)で送達系に取り込まれ得る。これらの効率は過去に達成されていたものよりはるかに高い。
本発明のある面は、単分散した複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルを含む組成物を提供し、ここで、該ナノゲルのタンパク質は分解可能リンカーを介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋し、かつ該ナノゲルのタンパク質はポリマーに架橋している。ある態様において、該ポリマーはナノゲルの表面に架橋する(そして、それゆえに、表面接合と考えられる − 例えば、図９Ａ参照)。
ある態様において、ナノ構造体(例えば、ナノゲル)は(ａ)分解可能リンカー(例えば、ジスルフィドリンカー)を介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋した１種以上の生物学的に活性なタンパク質および(ｂ)ナノゲルの表面露出タンパク質に架橋したポリマー(例えば、分解可能リンカーを介して可逆的かつ共有結合的に架橋)を含む、これらからなる、または実質的にこれらからなる。ある態様において、互いに架橋しているタンパク質の重量パーセンテージはナノゲルの７５％ｗ／ｗを超える(例えば、８０％、８５％または９０％ｗ／ｗを超える)。
ナノゲルが、互いに同じサイズ(例えば、直径)を有するならば、多数のナノゲルが組成物(例えば、水性または他の液体組成物)中に“単分散”していると考えられる。多数のナノゲルは、当該多数のナノゲルのサイズの違いが５％〜１０％を超えないならば、互いに同じサイズと考えられ得る。ある態様において、多数のナノゲルは、当該多数のナノゲルのサイズの違いが５％、６％、７％、８％、９％または１０％を超えないならば、互いに同じサイズと考えられ得る。ある態様において、多数のナノゲルは、当該多数のナノゲルのサイズの違いが５％未満(例えば、４％、３％、２％または１％)であるならば、互いに同じサイズと考えられ得る。
本発明の他の面は、ポリマーおよび少なくとも７５％ｗ／ｗの分解可能リンカーを介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋するタンパク質を含むナノゲルを提供する。ある態様において、分解可能リンカーは、例えば、ジスルフィドリンカー(例えば、式Ｉ)のような、酸化還元応答性リンカーである。
本発明のさらに別の面は、複数の無担体生物活性タンパク質ナノゲルの製造法を提供し、該方法は(ａ)タンパク質と分解可能リンカー(例えば、ジスルフィドリンカー)を、該分解可能リンカーを介して該タンパク質が互いに可逆性共有結合架橋することを可能にする条件下で接触させ、それにより複数のタンパク質ナノゲルを産生し、そして(ｂ)該タンパク質ナノゲルとポリマー(例えば、ポリエチレングリコール)を、該ポリマーと該タンパク質ナノゲルのタンパク質の架橋を可能にする条件下で接触させ、それにより複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルを製造することを含む。
ある態様において、(ａ)の条件は、タンパク質と分解可能リンカーを、水性緩衝液中、４℃から２５℃の温度で接触させることを含む。ある態様において、(ａ)の条件は、タンパク質と分解可能リンカーを、水性緩衝液中、３０分から１時間接触させることを含む。ある態様において、(ｂ)の条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、水性緩衝液中、４℃から２５℃の温度で接触させることを含む。ある態様において、(ｂ)の条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、水性緩衝液中、３０分から１時間接触させることを含む。ある態様において、水性緩衝液はリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)を含む。
ある態様において、(ａ)の条件は、タンパク質と分解可能リンカーを、３０℃を超える温度で接触させることを含まない。ある態様において、(ｂ)の条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、３０℃を超える温度で接触させることを含まない。
ある態様において、(ａ)の条件は、タンパク質と分解可能リンカーを、有機溶媒(例えば、アルコール)中で接触させることを含まない。ある態様において、(ｂ)の条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、有機溶媒中で接触させることを含まない。
ある態様において、タンパク質はサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である。例えば、タンパク質はサイトカインであり得る。ある態様において、サイトカインはＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃである。ある態様において、サイトカインはＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＳＡである。
ある態様において、分解可能リンカーは酸化還元応答性リンカーである。ある態様において、酸化還元応答性リンカーはジスルフィド結合を含む。ある態様において、分解可能リンカーは式Ｉを含むかまたはそれからなる。
ある態様において、ポリマーは親水性ポリマーである。ある態様において、親水性ポリマーはポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む。例えば、親水性ポリマーは４アームＰＥＧ−ＮＨ２ポリマーであり得る。
ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズは直径１００nm未満である。例えば、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズは直径５０〜６０nmであり得る。ある態様において、ここに提供する多数のタンパク質ナノゲルは類似する乾燥サイズである(例えば、互いの直径の１％、２％、３％、４％、５％または１０％以内)。
ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的粒径は直径１００nm未満である。例えば、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的粒径は直径８０〜９０nmであり得る。ある態様において、ここに提供する多数のタンパク質ナノゲルは類似する流体力学的粒径である(例えば、互いの直径の１％、２％、３％、４％、５％または１０％以内)。
ある態様において、水性緩衝液中のタンパク質の濃度は１０mg／mL〜５０mg／mL(例えば、１０mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mL、４０mg／mL、４５mg／mLまたは５０mg／mL)である。
ある態様において、複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルは単分散した多数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルである。
ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルはアルブミンを含まない。
ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質(例えば、生物活性タンパク質、架橋しているタンパク質)の重量パーセンテージは少なくとも７５％である。ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージは少なくとも８０％である。ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージは少なくとも８５％である。ある態様において、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージは少なくとも９０％である。
本発明のある面は、対象にここに提供する組成物またはナノゲルのいずれか一つを投与することを含む、インビボでタンパク質を送達する方法を提供する。
ある態様において、対象は疾患を有する。ある態様において、疾患は癌、糖尿病、自己免疫性疾患または心血管疾患である。
ある態様において、タンパク質は生理的条件下、その天然立体構造でナノゲルから放出され、生物学的に活性である。ある態様において、放出されたタンパク質の比活性は他のタンパク質と分解可能リンカーを介して架橋する前の該タンパク質の比活性の少なくとも５０％(例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)である。
本発明のある面は、分解可能リンカーを介して重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質である。このようなタンパク質はここでは可逆的修飾タンパク質と考える。
ある態様において、重合可能官能基はシランおよび／または架橋可能ポリマーを含む。ある態様において、架橋可能ポリマーはポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)を含む。ある態様において、タンパク質は分解可能リンカーを介してシランに可逆的に結合している。
ある態様において、本発明のタンパク質はサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である。ある態様において、サイトカインはＩＬ−２である。
ある態様において、分解可能リンカーはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。ある態様において、分解可能リンカーは酸化還元応答性リンカーである。ある態様において、酸化還元応答性リンカーはジスルフィド結合を含む。
本発明の他の面は、ここに記載するいずれかの多数の可逆的修飾タンパク質を提供する。
ある態様において、このような多数の可逆的修飾タンパク質は架橋されている。
本発明のさらに他の面は、ポリマーおよび少なくとも５０％ｗ／ｗの分解可能リンカーを介して重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含むナノ構造体を提供する。“ｗ／ｗ”はここではタンパク質の重量対ナノ構造体(例えば、ナノゲル)の重量を意味する。
ある態様において、重合可能官能基はシランおよび／または架橋可能ポリマーを含む。ある態様において、架橋可能ポリマーはポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)を含む。
ある態様において、ナノ構造体は少なくとも７５％ｗ／ｗの重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含む。ある態様において、ナノ構造体は少なくとも８０％ｗ／ｗの重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含む。ここでまた考慮されるのは約５０％ｗ／ｗ〜約９０％ｗ／ｗの重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含むナノ構造体である。例えば、ある態様において、ナノ構造体は約５０％ｗ／ｗ、約５５％ｗ／ｗ、約６０％ｗ／ｗ、約６５％ｗ／ｗ、約７０％ｗ／ｗ、約７５％ｗ／ｗ、約８０％ｗ／ｗ、約８５％ｗ／ｗまたは約９０％ｗ／ｗの重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を有し得る。
ある態様において、タンパク質はサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である。ある態様において、サイトカインはＩＬ−２である。
ある態様において、ナノ構造体はその表面上に反応性基を含む。ある態様において、反応性基はマレイミド、ローダミンまたはＩＲ７８３反応性基である。
ある態様において、ナノ構造体は担体細胞に結合されている。ある態様において、担体細胞は有核担体細胞である。ある態様において、有核担体細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。
ある態様において、ナノ構造体は直径２０〜５００nmである。ある態様において、ナノ構造体は直径１００〜３００nmである。
ある態様において、分解可能リンカーはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。ある態様において、分解可能リンカーは酸化還元応答性リンカーである。ある態様において、酸化還元応答性リンカーはジスルフィド結合を含む。
本発明のさらに別の面は、ナノ構造体の製造法を提供し、該方法は、タンパク質を分解可能リンカーおよび重合可能官能基で修飾し、該重合可能官能基と架橋剤および可溶性フッ化物を重合させることを含む。
ある態様において、重合可能官能基はシランおよび／または架橋可能ポリマーを含む。ある態様において、架橋可能ポリマーはポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)を含む。
ある態様において、可溶性フッ化物はフッ化ナトリウムである。ある態様において、可溶性フッ化物はフッ化カリウムである。
ある態様において、タンパク質はサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である。ある態様において、サイトカインはＩＬ−２である。
ある態様において、分解可能リンカーはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。ある態様において、分解可能リンカーは酸化還元応答性リンカーである。ある態様において、酸化還元応答性リンカーはジスルフィド結合を含む。
ある態様において、ナノ構造体は直径２０〜５００nmである。ある態様において、ナノ構造体は直径１００〜３００nmである。
ある態様において、本方法はさらにナノ構造体の表面を反応性基で修飾することを含む。ある態様において、反応性基はマレイミド、ローダミンまたはＩＲ７８３反応性基である。
ある態様において、本方法はさらにナノ構造体を担体細胞に結合させることを含む。ある態様において、担体細胞は有核担体細胞である。ある態様において、有核担体細胞はＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である。
本発明のさらなる面は、対象にここに提供するナノ構造体のいずれかを投与することを含む、インビボでタンパク質を送達する方法を提供する。ある態様において、本方法は、対象にシランに分解可能リンカーを介して可逆的に結合したタンパク質を含むナノ構造体を投与することを含む。
ある態様において、対象は、ある状態または疾患を有する。ある態様において、状態または疾患は癌、糖尿病、自己免疫性疾患または心血管疾患である。
ある態様において、タンパク質は、生理的条件下、その天然立体構造でナノ構造体から放出され、生物学的に活性である。
本発明はまた、式Ｉ
を含むまたはこれからなるリンカーも提供する。
本発明はまた、式II
を含む、可逆的修飾タンパク質接合体も提供する。
またここで提供されるのは、式III
を含む、可逆的修飾タンパク質接合体である。
リンカーは、興味のあるタンパク質に、末端アミンまたは内部アミンのようなアミン基で接合し得る。内部アミンは、リシンアミンのような側鎖アミンを含む。
本発明は、さらに、式III
を含むタンパク質接合体を提供し、ここで、タンパク質は、例えば、ＩＬ−２のようなサイトカインである。意外なことに、高い取り込み効率(例えば、＞約９０％)および高いタンパク質薬物負荷効率(例えば、＞約８０％)のシリカ系ナノ構造体が、シランで可逆的修飾されたタンパク質の重合により形成される。それゆえに、ここに提供されるのは、式IIIのタンパク質接合体と、例えば、シラン−ＰＥＧ−シランポリマーのような架橋剤の重合により形成されるナノ構造体である。
標的癌治療のための、表面接合インターロイキン−２(ＩＬ−２)充填ナノカプセル(ＮＣ)で加工したＴリンパ球の模式図を示す。
ＩＬ２−シリカＮＣの合成および表面官能化の例の模式図を示す。
ＩＬ２−ｆｃ−シランの合成(図３Ａ)およびＭＡＬＤＩマススペクトル(図３Ｂ)の例を示す。ＩＬ２−シリカＮＣの動的光散乱(ＤＬＳ)(図３Ｃ)および走査電子顕微鏡法(ＳＥＭ)(図３Ｄ)解析も示す。ＩＬ−２−Ｆｃは、マウス野生型ＩＬ−２のＣ末端がマウスＩｇＧ２ａ Ｆｃドメインに結合した二価融合タンパク質である。
ＩＬ２−ｆｃ−シリカＮＣにおけるＩＬ２−ｆｃの取り込み効率および負荷効率を示す。取り込み効率[ａ]＝ＩＬ２−ｆｃ−ＮＣ中の接合したＩＬ２−ｆｃ／反応に添加した総ＩＬ２−ｆｃ；負荷[ｂ]＝接合したＩＬ２−ｆｃの質量／ＩＬ２−ｆｃ−ＮＣの総質量。 タンパク質−シリカＮＣが、生理的条件下で、取り込んだタンパク質を、その元の形態で放出できることを示す。 種々のｐＨの緩衝液中、３７℃で４８時間インキュベートしたＩＬ−２−ｆｃ−ＮＣからのＩＬ−２−ｆｃの動態を示す。
マレイミド−チオールカップリング反応によるマレイミド官能化ＩＬ−２−ｆｃ−シリカＮＣのエフェクターＴ細胞表面への化学接合の模式図を示す。 表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣを有するＴ細胞のフローサイトメトリー解析を示す。 遊離ＩＬ２−ｆｃまたはＩＬ２−ｆｃ−ＮＣを用いるインビトロＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖アッセイを示す。
インビボＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖試験のタイムラインを示す。 ルシフェラーゼ発現Ｐｍｅｌ−１黒色腫特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の養子移入を受けたＢ１６Ｆ１０黒色腫の確立された肺転移を有するマウスの画像を示す。Ｔ細胞増殖は、バイオルミネセンス造影により経時的に追跡した。 養子移入６日後の鼠径リンパ節における養子移入Ｔ細胞の頻度のフローサイトメトリー解析を示す。
可逆的修飾タンパク質を用いて構築した多様な構造の模式図を示す。
タンパク質−ＰＥＧナノゲル(ＮＧ)の製造の模式図を示す。図８Ａは、ＰＥＧポリマー鎖の末端にＮＨＳエステルを有する４アームＰＥＧ−リンカー−１を形成するために、リンカー−１と反応させた、４アームＰＥＧ−ＮＨ２を示す。図８Ｂは、ＩＬ−２−ＰＥＧナノゲルを形成する複数アミン基を有する、タンパク質(例えば、ＩＬ−２)により架橋された４アームＰＥＧ−リンカー−１を示す。
共有結合的に互いに架橋したタンパク質ナノゲルの製造法の一例の模式図を示す。 タンパク質ナノゲルを細胞表面に結合させる方法および無傷の生物活性タンパク質の放出の一例の模式図を示す。
サイズ排除カラムを備えたＨＰＬＣ(図１０Ａ)；透過電子顕微鏡法(図１０Ｂ)；ならびにナノゲルのサイズおよび形態学の動的光散乱(図１０Ｃ)特徴付けを用いる共有結合的に架橋したタンパク質ナノゲルの解析を示す。
タンパク質ナノゲルから無傷の生物活性タンパク質を放出する機構の模式図を示す。 タンパク質ナノゲルからのＩＬ−２−Ｆｃの放出動態のグラフを示す。 サイズ排除カラムを備えたＨＰＬＣで検証した、ＩＬ２−Ｆｃのグルタチオン(ＧＳＨ)促進された放出を示す。 マトリックス支援レーザー脱離イオン化法のマススペクトルで解析した、放出されたＩＬ２−Ｆｃおよび天然ＩＬ２−Ｆｃを示す。
他のタンパク質ナノゲルの形成を示す。サイズ排除カラムを備えたＨＰＬＣを用いるヒトＩＬ−１５スーパーアゴニスト(ｈＩＬ−１５Ｓａ)ナノゲル(図１２Ａ)および天然マウスＩＬ−２(ｍＩＬ−２)ナノゲル(図１２Ｂ)の解析を示す。
タンパク質濃度が高すぎる(≧５０mg／mL)ときのナノゲルの代わりにバルクゲルを含むバイアルの画像を示す。
表面接合タンパク質ナノゲルを有するＴ細胞の共焦点顕微鏡像を示す。 種々の量でのＩＬ−２−ＦｃナノゲルのＴ細胞表面への制御された接合のフローサイトメトリーグラフを示す。
インビボＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖を示す。図１５Ａは、リンパ球枯渇させ、各群において、さらなる処置を伴わず、または遊離ＩＬ２−Ｆｃもしくは表面接合ＩＬ２−Ｆｃナノゲルと共にルシフェラーゼ発現Ｐｍｅｌ−１黒色腫特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の養子移入を受けたＢ１６Ｆ１０黒色腫の、確立された肺転移を有するマウスの経時変化を示す。図１５Ｂは、経時的Ｔ細胞増殖のバイオルミネセンス像を示す。図１５Ｃは、マウスの全身のバイオルミネセンスシグナルを定量するグラフを示す。
養子移入１２日後(１２日目)にフローサイトメトリーで解析した、鼠径リンパ節(左)および血液(右)における養子移入Ｔ細胞および内因性Ｔ細胞の頻度を示す。
肺における転移腫瘍の阻害を示す。図１７Ａは、各群から採取した肺の代表的画像を示す。図１７Ｂは、肺における腫瘍小結節(手動で計数)の数のグラフを示す。図１７Ｃは、肺転移の重症度についてグレード分けした肺組織切片の組織画像を示す。図１７Ｄは、各群の平均グレードのグラフを示す。
発明の詳細な記載
養子Ｔ細胞療法を含む癌免疫療法は、癌細胞を攻撃するのに対象自体の免疫系を利用するため、癌の処置のための有望な戦略である。それにも関わらず、この試みの主な制限は、移植Ｔリンパ球の生存率および機能の急速な低減である。腫瘍内で高い数の生存可能腫瘍特異的細胞毒性Ｔリンパ球を維持するために、免疫賦活剤と移入細胞の共投与が必要である。全身性に高投与量で与えたとき、これらの薬剤は、移入(すなわち、ドナー)細胞のインビボ生存能を増強し、移入細胞の治療的機能を改善し、それゆえに、癌に対する全体的に改善された有効性がもたらされるが、しかし、このような薬剤の高投与量は、また命を脅かす副作用も起こし得る。例えば、アジュバントとしてのインターロイキン−２(ＩＬ−２)の使用は、ＩＬ−２が移入Ｔ細胞への重要なアジュバントシグナルを提供する場所である黒色腫の養子Ｔ細胞療法を大きく助けるが、また、重度の用量制限的炎症毒性を誘発し、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を増殖させる。移入細胞に対するアジュバント活性に焦点を絞った一つの試みは、移入細胞を遺伝子加工して、それら自体の支持因子を分泌させることである。遺伝子加工したＴリンパ球の大規模産生のための技術的課題および困難ならびに高い費用が、今日まで、この方法の臨床適用の可能性を著しく制限している。
ある面において、生物活性タンパク質(例えば、ＩＬ−２のようなアジュバント)を、治療用細胞の原形質膜上にタンパク質負荷無担体ナノ構造体またはタンパク質負荷シリカ系ナノ構造体を化学接合させることにより、直接、治療用細胞に単純、安全かつ効率的に送達することを可能にし、インビボで被移入細胞の連続的疑似自己分泌刺激を可能にする技術基盤がここに提供される。ある態様において、本発明のタンパク質は分解可能リンカーを介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋して、生理的条件下および所望により還元剤(例えば、グルタチオン)存在下、ナノ構造体から無傷の生物活性タンパク質が放出されるように、ナノ構造体を形成する。他の態様において、本発明のタンパク質は、生理的条件下および所望により還元剤(例えば、グルタチオン)存在下、無傷の生物学的に活性タンパク質がナノ構造体から放出されるように、可逆的に修飾され、かつシリカ系ナノ構造体に“収容”されている。驚くべきことに、本発明のナノ構造体(例えば、無担体ナノゲルおよび／またはシリカ系ナノ構造体)は、負荷タンパク質のプロテアーゼ分解を阻止し、その持続的局所放出を可能にし、それにより細胞毒性Ｔ細胞の増殖を促進し、ある種のタンパク質(例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５)の高用量による全身毒性を回避する。意外なことに、細胞あたり最適数のナノ構造体が接合したＴ細胞は、その細胞機能ならびに癌への指向性および殺細胞能力を維持する。それゆえに、本発明の組成物および方法は、ある態様において、インビボでＴ細胞増殖を増大させ、アジュバント薬物の全身副作用を最小化することができる。
前記に加えて、本発明は、さらに、養子移入された細胞に対するアジュバント効果以外の目的のために、他のタンパク質治療剤を含む、他のナノ構造体を意図する。当業者は、ここに提供するとおり、本発明が広い適用を有することを容易に認識する。
ある態様において、本発明のタンパク質ナノ構造体のタンパク質は、生理的条件下、リンカーが分解し、無傷の生物活性タンパク質を放出するように、分解可能リンカー(例えば、ジスルフィドリンカー)を介して互いに可逆的に結合している。他の態様において、ナノ構造体のタンパク質は、生理的条件下、リンカーが分解し、無傷の生物活性タンパク質を放出するように、分解可能リンカーを介して官能基に可逆的に結合している。いずれの場合も、タンパク質は、下記のとおり可逆的に修飾されていると考えられる。
“他のタンパク質に可逆的に結合”しているタンパク質は、ここでは、分解可能リンカーを介して他のタンパク質に結合(例えば、共有結合的に結合)しているタンパク質をいう。このようなタンパク質は、分解可能リンカーを介して、互いに結合(例えば、架橋)していると考えられる。ある態様において、ナノ構造体(例えば、ナノゲル)は単一(例えば、単一タイプの)生物活性タンパク質(例えば、ＩＬ−２、またはＩＬ−２−Ｆｃ)を含み、他の態様において、ナノ構造体は１種を超える(例えば、２種、３種、４種、５種またはそれ以上)生物活性タンパク質(例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５(またはＩＬ−１５ＳＡ)のような異なるタンパク質の組み合わせ)を含む。例えば、タンパク質ナノゲルは、タンパク質Ａがタンパク質Ａに結合し、タンパク質Ａがタンパク質Ｂに結合しおよび／またはタンパク質Ｂがタンパク質Ｂに結合する、タンパク質Ａとタンパク質Ｂの組み合わせを含んでよい。
“官能基に可逆的に結合”したタンパク質または“可逆的修飾”されているタンパク質は、ここでは、分解可能リンカーを介して官能基に結合(例えば、共有結合的に結合)しているタンパク質をいう。このようなタンパク質は、ここでは“タンパク質接合体”または“可逆的修飾タンパク質接合体”と呼んでよく − これらの用語はここでは交換可能に使用され得る。タンパク質およびポリマーは、各々可逆性リンカー(例えば、ジスルフィドリンカーのような分解可能リンカー)を介してタンパク質が結合できる官能基を含むことは理解されるべきである。ここで提供するタンパク質接合体および可逆的修飾タンパク質の例は、他のタンパク質に(例えば、分解可能リンカーを介して)可逆的に結合しているタンパク質、ポリマーに可逆的に結合しているタンパク質および他の官能基に可逆的に結合しているタンパク質を含むが、これらに限定されない。用語“タンパク質”は融合タンパク質を含むと理解されるべきである。
ここに提供する分解可能リンカーは、ある態様において、タンパク質を変性させることなく、中性ｐＨ(例えば、約６〜約８または約７)でタンパク質と反応できる、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む。ある態様において、分解可能リンカーは、還元剤(例えば、グルタチオン、ＧＳＨ)の存在下、生理的条件下(例えば、２０〜４０℃および／またはｐＨ６〜８)で分解し、それにより可逆的に結合していた化合物から無傷タンパク質を放出することを意味する、“酸化還元応答性”リンカーである。本記載に従って使用するための分解可能リンカーの例は、次のとおりである。
式Ｉのリンカーは、還元剤の存在下で開裂するジスルフィドを含む。例えば、生理的条件下、式Ｉのリンカーのジスルフィド結合はグルタチオンにより開裂される。
タンパク質は、任意の末端または内部−ＮＨ２官能基(例えば、リシンの側鎖)を介して分解可能リンカーに結合(例えば、共有結合的に結合)し得る。それゆえに、式Ｉの分解可能リンカーでのタンパク質の可逆性修飾中に形成される中間体種は次のものである。
ここに提供する可逆的修飾タンパク質は、ある態様において、タンパク質−親水性ポリマー接合体(例えば、ＰＥＧで可逆的修飾；図７Ａ)、タンパク質−疎水性ポリマー接合体(例えば、ＰＬＡまたはＰＬＧＡで可逆的修飾；図７Ｂ)、バルク架橋タンパク質ヒドロゲル(図７Ｃ)、架橋タンパク質ナノゲル粒子(図７Ｄ)、種々のシェル材料のタンパク質ナノカプセル(例えば、シリカ；図７Ｅ)、タンパク質−接合ナノ粒子(例えば、リポソーム、ミセル、重合ナノ粒子、無機ナノ粒子；図７Ｆ)を含むが、これらに限定されない種々のナノ構造体に成形され得るかまたは自己集合し得る。同様に、ここに提供する互いに架橋したタンパク質は、ある態様において、タンパク質ナノ構造体に成形され得るかまたは自己集合し得る(例えば、図９Ａ)。
ある態様において、本発明のタンパク質ナノ構造体(例えば、タンパク質−ポリマーナノゲルを含むタンパク質ナノゲル)は、担体タンパク質または他の担体分子を含まない。例えば、ある態様において、タンパク質ナノ構造体はアルブミン(例えば、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ))を含まない。担体タンパク質は、一般的に種々の分子の拡散および／または輸送を促進する。ここで使用する用語“担体タンパク質”は、タンパク質ナノ構造体の生物活性タンパク質に悪影響を及ぼさないタンパク質をいうことは理解されるべきである。ある態様において、担体タンパク質は不活性タンパク質である。それゆえに、ある態様において、担体タンパク質は生物学的に活性ではない。本発明のナノ構造体は、ある態様において、インビボで細胞および組織へのおよびその中への輸送を促進するための担体タンパク質または他の担体分子を必要としない。
本発明のナノゲルは、ある態様において、分解可能リンカー(例えば、ジスルフィドリンカー)を介して互いに結合した１種以上(例えば、２種、３種、４種、５種またはそれ以上の)治療用タンパク質(例えば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５(またはＩＬ１５−ＳＡ))を含むことは理解されるべきである。このようなナノゲルは、アルブミンのような不活性担体タンパク質を含まない。
本記載に従って使用するタンパク質の例は、抗体、一本鎖抗体、抗体フラグメント、酵素、補助因子、受容体、リガンド、転写因子および他の制御性因子、ある抗原(下記)、サイトカイン、ケモカインなどを含むが、これらに限定されない。これらのタンパク質は天然に存在してもしなくてもよい。他のタンパク質が意図され、本記載に従って使用し得る。タンパク質のいずれかを、酸化還元応答性(例えば、ジスルフィド)を介してシラン基で可逆的修飾し、例えば、シリカ系ナノ構造体を形成できる。
ある態様において、本記載のタンパク質は免疫賦活性タンパク質である。ここで使用する、免疫賦活性タンパク質は、それを単独でまたは他のタンパク質もしくは薬剤と組み合わせて投与する対象における免疫応答を刺激する(既存免疫応答の増強を含む)、タンパク質である。本記載に従って使用し得る免疫賦活性タンパク質の例は、抗原、アジュバント(例えば、フラゲリン、ムラミルジペプチド)、インターロイキン(例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５(または例えば、ＩＬ−１５ＳＡのようなこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／変異体形態)、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＦＮ−アルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３−リガンド)を含むサイトカインおよび免疫賦活性抗体(例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３またはこれらの分子の一本鎖／抗体フラグメント)を含むが、これらに限定されない。他の免疫賦活性タンパク質が意図され、本記載に従って使用され得る。
ある態様において、本記載のタンパク質は抗原である。本記載に従って使用し得る抗原の例は、癌抗原、自己抗原、微生物抗原、アレルゲンおよび環境的抗原を含むが、これらに限定されない。他のタンパク質抗原が意図され、本記載に従って使用され得る。
ある態様において、本記載のタンパク質は癌抗原である。癌抗原は、癌細胞により優先的に発現される(すなわち、非癌細胞よりも高いレベルで癌細胞に発現される)抗原であり、ある場合、これは癌細胞によってのみ発現される。癌抗原は、癌細胞内にまたは癌細胞の表面上に発現され得る。本記載に従って使用し得る癌抗原は、MART-1/Melan-A、gp100、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質(ADAbp)、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原(CRC)--C017-1A/GA733、癌胎児性抗原(CEA)、CAP-1、CAP-2、etv6、AML1、前立腺特異的抗原(PSA)、PSA-1、PSA-2、PSA-3、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖およびCD20を含むが、これらに限定されない。癌抗原は、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(MAGE-B4)、MAGE-C1、MAGE-C2、MAGE-C3、MAGE-C4およびMAGE-C5からなる群から選択され得る。癌抗原は、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8およびGAGE-9からなる群から選択され得る。癌抗原はBAGE、RAGE、LAGE-1、NAG、GnT-V、MUM-1、CDK4、チロシナーゼ、p53、MUCファミリー、HER2/neu、p21ras、RCAS1、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、p120ctn、gp100Pmel117、PRAME、NY-ESO-1、cdc27、大腸腺腫症タンパク質(APC)、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、p15、gp75、GM2ガングリオシド、GD2ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のSmadファミリー、lmp-1、P1A、EBVコード化核抗原(EBNA)−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、ＳＳＸ−１、SSX-4、SSX-5、SCP-1およびCT-7、CD20およびc-erbB-2からなる群から選択され得る。他の癌抗原が意図され、本明細書の記載に従って使用され得る。
ある態様において、本発明のタンパク質は、ベバシズマブ(アバスチン(登録商標))、トラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標))、アレムツズマブ(キャンパス(登録商標)、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病に適応)、ゲムツズマブ(マイロターグ(登録商標)、hP67.6、抗ＣＤ３３、急性骨髄球性白血病のような白血病に適応)、リツキシマブ(リツキサン(登録商標))、トシツモマブ(ベキサール(登録商標)、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性腫瘍に適応)、MDX-210(HER-2/neu癌遺伝子タンパク質生成物および免疫グロブリンＧ(ＩｇＧ)のＩ型Ｆｃ受容体(ＦｃガンマＲＩ)に同時に結合する二重特異性抗体)、オレゴボマブ(OVAREX(登録商標)、卵巣癌に適応)、エドレコロマブ(PANOREX(登録商標))、ダクリズマブ(ゼナパックス(登録商標))、パリビズマブ(シナジス(登録商標)、ＲＳＶ感染のような呼吸器状態に適応)、イブリツモマブチウキセタン(ゼヴァリン(登録商標)、非ホジキンリンパ腫に適応)、セツキシマブ(アービタックス(登録商標))、MDX-447、MDX-22、MDX-220(抗TAG-72)、IOR-C5、IOR-T6(抗CD1)、IOR EGF/R3、celogovab(ONCOSCINT(登録商標) OV103)、エピラツズマブ(LYMPHOCIDE(登録商標))、ペムツモマブ(THERAGYN(登録商標))および神経膠腫ｂ−Ｈ(脳の癌、黒色腫に適応)を含むが、これらに限定されない、抗体または抗体フラグメントである。他の抗体および抗体フラグメントが意図され、本記載に従って使用され得る。
本発明のタンパク質は、タンパク質と適合する二成分溶媒中で修飾し得る。例えば、ある態様において、二成分溶媒は、水性緩衝液と、リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)およびジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)のような水混和性有機溶媒を含み、分解可能リンカーでタンパク質を可逆的に修飾するために使用される。水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)対有機相(例えば、ＤＭＳＯ)の比は、約５０：１〜約２０：１の範囲内であり得る。ある態様において、無機相対有機相の比は約３０：１〜約２０：１または約２５：１である(例えば、５００μL：２０μL)。ある態様において、有機溶媒は二成分緩衝液の総体積または二成分緩衝液を含む反応の５％未満である。
ここで使用する“重合可能官能基”は、化学反応して、ポリマー鎖またはネットワークを形成できる原子および結合の基をいう。“ポリマー”は、反復単位または異なる反復単位の混合物の鎖またはネットワークをいう。ここで使用する、ポリマーは、それ自体官能基である。本記載に従って使用するための重合可能官能基の例は、シラン、エチレンオキシド、乳酸、ラクチド、グリコール酸、Ｎ−(２−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、シリカ、ポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)、ポリグルタミン酸、ポリリシン、シクロデキストリンおよびデキストラン・キトサンを含むが、これらに限定されない。他の重合可能官能基が意図され、本記載に従って使用し得る。しかしながら、ここで使用する“ポリマー”は、タンパク質ではない(非タンパク質である)、ペプチドではない(非ペプチドである)またはアミノ酸ではない(非アミノ酸である)ことは理解されるべきである。
用語“ポリマー”が“コポリマー”を含むことは理解されるべきである。すなわち、ポリマーは、短いポリマーまたはコポリマーを含む、異なる官能基の混合物(例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン)を含み得る。官能基は、一般にタンパク質適合性、中性条件下で重合化される。それゆえに、ある態様において、官能基の重合化は、少なくとも一部、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の水溶液中で起こる。例えば、官能基の重合化は、ｐＨ６、ｐＨ６.５、ｐＨ７、ｐＨ７.５またはｐＨ８で起こり得る。ある態様において、官能基の重合化は約ｐＨ７で起こる。
ある態様において、重合反応は、フッ化ナトリウム、フッ化カリウムまたは任意の他の可溶性フッ化物により触媒される。
タンパク質に可逆的に結合できるおよび／またはナノ構造体(例えば、ナノカプセル、ナノゲル、ヒドロゲル)の形成に使用できるポリマーの例は、脂肪族ポリエステル、ポリ(乳酸)(ＰＬＡ)、ポリ(グリコール酸)(ＰＧＡ)、乳酸とグリコール酸のコポリマー(ＰＬＧＡ)、ポリカプロラクトン(ＰＣＬ)、ポリ酸無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリウレタン、ポリ(酪酸)、ポリ(吉草酸)およびポリ(ラクチド−コ−カプロラクトン)および天然ポリマー、例えばアルギネートおよびデキストランおよびセルロースを含む他の多糖、コラーゲン、例えばアルキル、アルキレンのような化学基の置換、付加、ヒドロキシル化、酸化および当業者が日常的に行う他の修飾を含むその化学誘導体、アルブミンおよび他の親水性タンパク質、ゼインおよび他のプロラミンおよび疎水性タンパク質、それらのコポリマーおよび混合物を含むが、これらに限定されない。一般に、これらの物質は、インビボで酵素加水分解または水への暴露により、表面浸食またはバルク浸食により分解する。他のポリマーが意図され、本記載にて従って使用され得る。
本発明のある面において、タンパク質は、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)のような親水性ポリマーに可逆的に結合する(図７Ａおよび図９Ａ〜９Ｂ)。
本発明の他の面において、タンパク質は、例えば、ポリ乳酸(ＰＬＡ)および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)のような疎水性ポリマーに可逆的に結合する。これらのタンパク質−疎水性ポリマー接合体は、ある態様において、ナノ粒子に自己集合できる(図７Ｂおよび７Ｆ)。
本発明のタンパク質接合体は、ある態様において、架橋してハイドロゲルネットワーク(図７Ｃ)、ナノゲル粒子(図７Ｄ)またはタンパク質ナノゲル(図９Ａ)を形成でき、これら全てここでは“ナノ構造体”と考えられる。
ここで使用するタンパク質“ナノ構造体”は、ポリマー系またはシリカ、ナノシェル内に包まれた、多数の架橋タンパク質接合体(例えば、官能基またはポリマーに分解可能リンカーを介して可逆的に結合したまたは“可逆的修飾”されたタンパク質)をいう(図７Ｅ)。ナノシェルは、ある態様において、タンパク質接合体の官能基(例えば、シラン)と架橋剤(例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン)、触媒(例えば、ＮａＦ)存在下の重合により形成される。タンパク質ナノ構造体の例は、分解可能リンカーを介して互いに架橋(例えば、可逆的におよび共有結合的に互いに架橋)した多数のタンパク質をいう、“タンパク質ナノゲル”である(例えば、図９Ａ参照)。ある態様において、ナノゲルのタンパク質は、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)のような親水性ポリマー；例えば、図９Ａ参照)に架橋(例えば、可逆的におよび共有結合的に互いに架橋)する。ポリマーは、ある態様において、ナノゲルの表面(例えば、ナノゲルの表面に露出したタンパク質)に架橋し得る。
タンパク質ナノゲルのサイズは、その“乾燥サイズ”に基づくおよびその“流体力学的粒径”に基づく、少なくとも二通りで測定され得る。タンパク質ナノゲルの“乾燥サイズ”は、乾燥固体としてのナノゲルの直径をいう。タンパク質ナノゲルの“流体力学的粒径”は、水和ゲルとしてのナノゲル(例えば、水性緩衝液中のナノゲル)の直径をいう。ナノゲルの乾燥サイズは、例えば、透過電子顕微鏡法により測定でき、一方ナノゲルの流体力学的粒径は、例えば、動的光散乱により測定できる。
ある態様において、ナノゲルの乾燥サイズは１００nm未満である。ある態様において、ナノゲルの乾燥サイズは９５nm未満、９０nm未満、８５nm未満、８０nm未満、７５nm未満、７０nm未満、６５nm未満または６０nm未満である。ある態様において、ナノゲルの乾燥サイズは４０〜９０nm、４０〜８０nm、４０〜７０nm、４０〜６０nm、５０〜９０nm、６０〜８０nm、５０〜７０nmまたは５０〜６０nmである。ある態様において、ナノゲルの乾燥サイズは４０nm、４５nm、５０nm、５５nm、６０nm、６５nm、７０nm、７５nm、８０nm、８５nm、９０nmまたは９５nmである。
ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均乾燥サイズは１００nm未満である。ある態様において、このような複数集合体内のナノ構造体の平均乾燥サイズの違いは、５％または１０％を超えない。ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均乾燥サイズは９５nm未満、９０nm未満、８５nm未満、８０nm未満、７５nm未満、７０nm未満、６５nm未満または６０nm未満である。ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均乾燥サイズは４０〜９０nm、４０〜８０nm、４０〜７０nm、４０〜６０nm、５０〜９０nm、６０〜８０nm、５０〜７０nmまたは５０〜６０nmである。ある態様において、ナノゲルの乾燥サイズは４０nm、４５nm、５０nm、５５nm、６０nm、６５nm、７０nm、７５nm、８０nm、８５nm、９０nmまたは９５nmである。
ある態様において、ナノゲルの流体力学的粒径は１００nm未満である。ある態様において、ナノゲルの乾燥サイズは９５nm未満、９０nm未満、８０nm未満、８５nm未満または７５nm未満である。ある態様において、ナノゲルの流体力学的粒径は７０〜９０nm、７０〜８５nm、７０〜８０nm、７５〜９０nm、７５〜８５nm、７５〜８０nm、８０〜９０nm、８０〜８５nmまたは８５〜９０nmである。ある態様において、ナノゲルの流体力学的粒径は７０nm、７５nm、８０nm、８５nm、９０nmまたは９５nmである。ある態様において、ナノゲルの流体力学的粒径は８０nm、８１nm、８２nm、８３nm、８４nm、８５nm、８６nm、８７nm、８８nm、８９nmまたは９０nmである。
ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均流体力学的粒径は１００nm未満である。ある態様において、このような多数のナノ構造体の平均流体力学的粒径の違いは、５％または１０％を超えない。ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均流体力学的粒径は９５nm未満、９０nm未満、８０nm未満、８５nm未満または７５nm未満である。ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均流体力学的粒径は７０〜９０nm、７０〜８５nm、７０〜８０nm、７５〜９０nm、７５〜８５nm、７５〜８０nm、８０〜９０nm、８０〜８５nmまたは８５〜９０nmである。ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均流体力学的粒径は７０nm、７５nm、８０nm、８５nm、９０nmまたは９５nmである。ある態様において、複数のナノ構造体内のナノ構造体(例えば、ナノゲル)の平均流体力学的粒径は８０nm、８１nm、８２nm、８３nm、８４nm、８５nm、８６nm、８７nm、８８nm、８９nmまたは９０nmである。
ある態様において、ナノ構造体は、凍結乾燥形態のような乾燥した固形で提供される。他の態様において、ナノ構造体は、水溶液または他の液体溶液中のような水和物の形で提供される。
ナノ構造体は、ある態様において、実質的に球状のナノカプセルまたはナノ粒子である。ある態様において、ナノ構造体の直径は１〜１０００ナノメートル(nm)範囲である。ある態様において、直径は２０〜７５０nmまたは２０〜５００nmまたは２０〜２５０nmのサイズの範囲である。ある態様において、直径は５０〜７５０nmまたは５０〜５００nmまたは５０〜２５０nmまたは約１００〜３００nmのサイズの範囲である。ある態様において、直径は約１００nm、約１５０nm、約２００nm、約２５０nmまたは約３００nmである。
ここで記載する、ナノ構造体は、細胞担体(例えば、Ｔ細胞)上の反応性基と反応するために、外部表面上に１個以上の反応性基を含むように修飾または合成し得る。これらのナノ構造体反応性基は、チオール反応性マレイミド頭部基、ハロアセチル(例えば、ヨードアセチル)基、イミドエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ピリジルジスルフィド基などを含むが、これらに限定されない。これらの反応性基は担体細胞表面上の基と反応し、そして、それゆえに、ナノ構造体が細胞表面と結合する。表面がこの方法で修飾されたとき、ナノ構造体は、“相補的”反応性基(すなわち、ナノ構造体上の反応性基と反応する反応性基)を有する特異的担体細胞とともに使用することが意図されることは理解されよう。ある態様において、ナノ構造体は、細胞表面を構成する脂質二重層に統合されない。一般的に、ナノ構造体は担体細胞により貪食(または内部移行)されない。
ある態様において、ナノ構造体はその表面上に抗体または抗体フラグメントを含まず、他方、他の態様においては含む。ある態様において、ナノ構造体は、Ｔ細胞表面部分(または他の抗体または抗体フラグメントのようなＴ細胞表面を被覆する外来性部分)に特異的な抗体または抗体フラグメントを含まず、他方、他の態様においては含む。それゆえに、ある態様において、ナノ構造体それら自体、担体細胞への単なる結合により担体細胞活性化を刺激しない。他の態様において、しかしながら、ナノ構造体は、担体細胞への結合により担体細胞活性化を刺激する(例えば、ナノ構造体の結合が、細胞表面部分の架橋を誘発し、これが担体細胞を活性化する)。
ナノ構造体は共有結合的に接合(またはここで交換可能に使用されている用語である接続または結合)してよく、またはそれらは担体細胞に非共有結合的に接合してよい。共有結合的接合は、一般的にナノ構造体と担体細胞の間のより安定な(そしてそれゆえにより長期の)会合を提供する。共有結合的接合は、ある態様において、またインビボで、安定性を、そしてそれゆえに、薬剤のより持続性の局在的送達も提供できる。非共有結合的接合は、細胞表面および／または細胞膜の脂質二重層への吸収を含むが、これに限定されない。
ある場合、共有結合的結合は、担体細胞を最初にマレイミド含有ナノ構造体とインキュベートして細胞表面に接合させ、続いてインサイチュでチオール終端ポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)でペグ化して、粒子の残存マレイミド基をキャップし、細胞の粒子介在架橋を回避する、二段階法で達成できる。
担体細胞
担体細胞は、ナノ構造体が接合され、インビボに投与したとき、好ましくは標的部位にホーミングする細胞である。適当な標的細胞は、該ナノ構造体を顕著に貪食しない以外、そのホーミング能、その細胞表面表現型(ナノ粒子との接合のため)およびその運搬能に基づき選択する。ここに記載するある態様において、Ｔ細胞は適当な担体細胞である。Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞であり得る。他の適当な細胞は、マウス細胞系譜マーカー陰性、Ｓｃａ−１陽性およびｃ−ｋｉｔ陽性細胞およびそのヒト対応物を含むが、これらに限定されない、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞および造血前駆細胞を含む。Ｔ細胞、Ｂ細胞および造血前駆細胞の表面上に相当量の遊離チオール(−ＳＨ)基が存在し(データは示していない)、それによりナノカプセルのこのような細胞への接合が促進される。
担体細胞は、ある態様において、血管から血管外遊出でき(特に静脈内注射により投与されたとき)、それにより標的組織または臓器に入る。赤血球は、一般的に血流から出られない。従って、担体細胞の重要な一つのクラスは有核担体細胞を含む。それゆえに、ある態様において、担体細胞は赤血球ではない。他の態様において、担体細胞は赤血球である。
本記載のある態様は、単離担体細胞に関係する。単離担体細胞は、天然に存在する環境から分離されている細胞である(すなわち、それらはインビボで存在しない)。インビトロでのＴ細胞は単離細胞の一例である。担体細胞をそのインビボ環境から単離し、本記載のナノ構造体に接合し、次いでインビボに再導入し得ることは理解されるべきである。このような担体細胞は、なお単離細胞であると考えられる。
担体細胞は、ある態様において、処置する対象に対して自己である。他の態様において、担体細胞は非自己である(その場合でもＭＨＣ適合細胞が好ましい)。
担体細胞は、一般的に投与(または、ある場合再注入)後、インビボで、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日またはそれ以上の半減期を有する。
担体細胞は、ある態様において、遺伝子加工して、同時刺激分子またはキメラ受容体を含む受容体を含むが、これらに限定されない１種以上の因子を発現させ得る。他の態様において、担体細胞は遺伝子加工されない。ある態様において、担体細胞は単離され、天然に存在する(すなわち、それらは遺伝子的にも他の点でも操作されていない)。
性質および機能によって、担体細胞は、ある態様において、ナノ構造体との接合前に操作される。担体細胞は、しかしながら、ナノ構造体の接合を促進するために表面修飾される必要はない。態様のいくつかにおいて、それどころか、担体細胞表面上に通常存在する反応性基を、細胞表面上に反応性基または他の構成要素を取り込むことなく、使用する。その結果、そのような担体細胞は、ナノ構造体と接合するために、とりわけ、表面上に、抗体または抗体フラグメントのような外来性構成要素が存在することを必要としない。
このような操作はまた、Ｔ細胞に対して日常的に実施されているような、担体細胞の活性化も含み得る。担体細胞は、ある態様において、ナノ構造体との混合前にインビトロで増殖および／または活性化(またはここで交換可能に使用される用語である刺激)させ得る。増殖および活性化プロトコールは担体細胞型により変わるが、１種以上のサイトカインとのインキュベーション、１種以上の細胞型とのインキュベーションおよび１種以上の抗原とのインキュベーションを含み得る。担体細胞がＴ細胞であるならば、Ｔ細胞をＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５スーパーアゴニスト、同時刺激分子、例えばＢ７、Ｂ７.２、ＣＤ４０、細胞表面受容体に対する抗体を含む種々のＴ細胞表面分子に対する抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体などとインキュベートすることにより、活性化を実施し得る。ある態様において、担体細胞、より具体的にはＴ細胞は、細胞表面上を外来性抗体で被覆されていない(すなわち、細胞は、投与前にインビトロで抗体または抗体フラグメントで被覆されていない)。
増殖は、トリチウム標識チミジンのような放射標識ヌクレオチドの取り込みを含む増殖アッセイにより測定し得る。活性化は、とりわけ、ＩＬ−２、ガンマ−ＩＦＮ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＴＮＦのようなサイトカインの産生により測定し得る。増殖および活性化を測定する他の方法は、当分野で知られ、本記載に従って使用され得る。
担体細胞を、富化し、それゆえにそのような細胞を多数、小体積で投与するためにおよび／または他の、望ましくない可能性のある、細胞を投与組成物から除去するために、対象への投与前に選択し得る。選択は、例えば、当分野で知られるカラムまたはプレートを利用する富化プロトコールを含む、陽性または陰性選択を含み得る。
Ｔ細胞およびＢ細胞を対象の末梢血から採取し得る。
造血前駆細胞は、臍帯血、骨髄、動員末梢血および、ある場合、分化胚性幹細胞を含むが、これらに限定されない多数の源から得ることができる。
造血前駆細胞は当分野で特徴付けされている。ヒトにおけるこのような細胞は、一般に、最小限ＣＤ３４＋表現型を有するが、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８ｌｏ／ｎｅｇ、ＣＤ３３−および／またはｃ−ｋｉｔ／ＣＤ１１７＋であってもよい。それらは、また細胞系譜特異的マーカーを発現しないとして特徴付けられる。それらは、骨髄、臍帯血または末梢血から、親和性カラム、磁気ビーズ、蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)、それらのある組み合わせなどを使用して採取できる。これらの細胞は、移入後、１種以上の造血細胞系譜を再増殖させる能力を有する。好ましくは、これらの細胞は、一個を超える細胞系譜、さらに好ましくは全細胞系譜を再増殖させる。ここで使用する細胞系譜の再増殖または集合は、幹細胞の子孫が、対象においてその細胞系譜の構築に貢献するような、幹細胞の１種以上の細胞系譜への分化をいう。しかしながら、全細胞系譜区画が移入細胞に由来する必要はないが、しかしながらある場合これが起こり得る。
単離幹細胞を、細胞表面マーカーを含むが、これに限定されない１種以上のマーカーに従い、異種性細胞集団を分画することにより得ることができる。
担体細胞は、哺乳動物細胞(例えば、ヒト細胞)のような真核細胞であり得る。あるいは、非哺乳動物細胞であり得る。さらに別の態様において、担体細胞は原核細胞(例えば、細菌細胞)であり得る。数種の細菌細胞型が特に興味深い。例えば、弱毒化サルモネラ・チフィリウムが、経口ワクチン送達用ベクターの候補として研究中であり(Xiang et al., Immunol Rev 222:117, 2008; およびIweala et al., J Immunol 183(4):2252, 2009)、加工大腸菌が貧酸素化腫瘍への特異的ホーミングが可能であることが示されている(Cheong et al., Science 314(5803):1308, 2006)。細菌は、経口投与および治療剤が腸管および腸管関連リンパ系組織を標的とする能力のような新規投与法および組織部位ターゲティングの可能性を提供する。このような微生物ベクターは、既製のすぐに使える細胞−ナノ粒子系を創製する点で、自己宿主細胞と比較して利益をもたらす。微生物への粒子接合は、哺乳動物細胞について記載したのと同じ一連の化学戦略を使用して達成できる。ある場合、微生物の鞭毛コートの一過性除去(例えば、Rosu et al., J Bacteriol 188(14):5196, 2006に記載のような単純な機械的分断による)を使用して、微生物細胞体への粒子の最適接合を達成できる。
方法
ここに提供されるのは、ナノ構造体の製造法である。ナノ構造体の例は、無傷の生物活性タンパク質を含むが、担体(例えば、アルブミン、ＢＳＡ)を含まないタンパク質ナノゲルのようなタンパク質ナノゲルである。ある態様において、無担体生物活性タンパク質ナノゲルの製造法は、タンパク質と分解可能リンカーを、該分解可能リンカーを介してタンパク質が互いに可逆性共有結合架橋することを可能とする条件下で接触させ、それにより無担体生物活性タンパク質ナノゲルを製造することを含む。ある態様において、本方法は、さらに該タンパク質ナノゲルとポリマーを、該ポリマーと該タンパク質ナノゲルのタンパク質の架橋を可能とする条件下で接触させ、それにより無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルを製造することを含む。ある態様において、複数のタンパク質ナノゲルまたは複数のタンパク質−ポリマーナノゲルを製造する。
一般的に、分解可能リンカーを介してタンパク質が互いに可逆性共有結合架橋することを可能とする条件は、タンパク質と分解可能リンカーを４℃から２５℃の温度(例えば、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃)で接触させることを含む。ある態様において、タンパク質を、分解可能リンカーと、水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)中、４℃から２５℃の温度(例えば、室温)でインキュベートする。ある態様において、タンパク質を、分解可能リンカーと、水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)中、３０℃を越えない温度でインキュベートする。ある態様において、分解可能リンカーを介してタンパク質が互いに可逆性共有結合架橋することを可能とする条件は、タンパク質と分解可能リンカーを、３０分〜２時間または３０分〜１時間(例えば、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分または６０分)接触させることを含む。ある態様において、タンパク質を、分解可能リンカーと、水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)中、３０分〜２時間または３０分〜１時間インキュベートする。
ある態様において、水性緩衝液中のタンパク質の濃度は１０mg／mL〜５０mg／mLである。例えば、水性緩衝液中のタンパク質の濃度は、１０mg／mL、１５mg／mL、２０mg／mL、２５mg／mL、３０mg／mL、３５mg／mL、４０mg／mL、４５mg／mLまたは５０mg／mL(タンパク質／水性緩衝液)であり得る。
ある態様において、無担体生物活性タンパク質ナノゲルまたはタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージは少なくとも７５％ｗ／ｗである。例えば、無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージは少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも８５％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗまたは少なくとも９５％ｗ／ｗである。ある態様において、無担体生物活性タンパク質ナノゲルまたはタンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージは７５％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗ、８０％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗまたは８５％ｗ／ｗ〜９０％ｗ／ｗである。
ポリマーのタンパク質ナノゲルのタンパク質への架橋を可能にする条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、４℃から２５℃の温度(例えば、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃または２５℃)で接触させることを含む。ある態様において、タンパク質ナノゲルを、ポリマーと、水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)中、４℃から２５℃の温度(例えば、室温)でインキュベートする。ある態様において、タンパク質ナノゲルを、ポリマーと、水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)中、３０℃を越えない温度でインキュベートする。ある態様において、ポリマーのタンパク質ナノゲルのタンパク質への架橋を可能にする条件は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、３０分〜２時間または３０分〜１時間(例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０分)接触させることを含む。ある態様において、タンパク質ナノゲルを、ポリマーと、水性緩衝液(例えば、ＰＢＳ)中、３０分〜２時間または３０分〜１時間接触させる。
ある態様において、本発明の方法は、タンパク質と分解可能リンカーを、有機溶媒(例えば、エタノールまたはイソプロパノールのようなアルコール)の存在下で接触させることを明確に除外する。ある態様において、本発明の方法は、タンパク質ナノゲルとポリマーを、有機溶媒(例えば、エタノールまたはイソプロパノールのようなアルコール)の存在下で接触させることを明確に除外する。有機溶媒は、タンパク質の生物活性に悪影響を及ぼし得る。
本発明の他のナノ構造体の製造法は、タンパク質を分解可能リンカーおよび重合可能官能基で修飾し、該重合可能官能基を架橋剤および可溶性フッ化物と重合させることを含み得る。
本発明のタンパク質は、例えば、酸化還元応答性リンカーのような分解可能リンカーで修飾するかまたはそれに接合することが可能である。修飾は、ある態様において、共有結合的修飾であり得る。図３Ａはタンパク質修飾スキームの一例を説明する。この例において、タンパク質を、分解可能リンカーを介して、シランに共有結合的に接合する。
重合可能官能基を、可溶性フッ化物触媒の存在下、架橋剤と重合化させ得る。ある態様において、架橋剤はポリマー(例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン)である。ある態様において、可溶性フッ化物はフッ化ナトリウムである。ある態様において、可溶性フッ化物はフッ化カリウムである。
本発明はまた、タンパク質接合体およびナノ構造体をインビボで対象に投与する方法も提供する。
本発明の方法は、事実上、ここで考慮されるタンパク質の送達により利益を受ける可能性のあるあらゆるタイプの対象で実施できる。ヒト対象が、ある態様において好ましい対象である。対象はまた、家で飼うペット(例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、フェレット)、家畜(例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリおよび他の家禽類)、サラブレッド馬のようなウマ、実験動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ)などのような動物も含む。対象はまた魚類および他の水生動物種も含む。
タンパク質接合体を送達する対象は、正常なまたは健常な対象であってよい。あるいは、１種以上の特定のタンパク質の送達により診断できるまたは利益を受け得る状態を有していても、発症する危険性を有していてもよい。
このような状態は癌(例えば、固形腫瘍癌)、自己免疫性障害、アレルギーまたはアレルギー状態、喘息、移植片拒絶などを含む。
本発明により包含させる種々の状態を診断するための検査は当分野で知られ、通常の医師は精通している。これらの臨床検査は、顕微鏡的分析、培養依存性試験(例えば培養物)および核酸検出試験を含むが、これらに限定されない。これらは、湿式マウント、染色増強顕微鏡法、免疫顕微鏡法(例えば、ＦＩＳＨ)、ハイブリダイゼーション顕微鏡法、粒子凝集、酵素結合免疫吸着検定法、尿スクリーニング検査、ＤＮＡプローブハイブリダイゼーション、血清検査などを含む。医師は、一般にまた完全な病歴を聴取し、上に挙げた臨床検査に加えて、完全な身体検査も行う。
癌を有する対象は、検出可能な癌細胞を有する対象である。癌を発症する危険性のある対象は、癌を発症する確率が、通常より高い対象である。これらの対象は、例えば、癌を発症する高い可能性と関係することが示されている遺伝子異常を有する対象、癌に対する家系的素因を有する対象、タバコ、アスベストまたは他の化学毒素のような癌原因子(例えば、発癌物質)に曝されている対象および以前癌を処置し、見かけ上寛解した対象である。
癌
本発明は、例えば、固形腫瘍癌を含む、癌を有するまたは癌を発症する危険性のある対象への、可逆的修飾タンパク質接合体および／またはタンパク質ナノ構造体の投与を意図する。癌は癌腫、肉腫または黒色腫であり得る。癌は、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、頸部癌、絨毛癌、ＣＮＳ癌、結腸および直腸癌、腎臓または腎臓細胞癌、喉頭癌、肝臓癌、小細胞肺癌、非小細胞性肺癌(ＮＳＣＬＣ、腺癌、巨(または燕麦)細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む)、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌(基底細胞癌および扁平上皮細胞癌を含む)、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、直腸癌、呼吸器系の癌および泌尿器系の癌を含むが、これらに限定されない。他の癌が知られ、ここで考慮される。
肉腫は、骨(骨肉腫)および軟組織(線維肉腫)に生じる稀な間葉性新生物である。肉腫は、脂肪肉腫(粘液性脂肪肉腫および多形性脂肪肉腫を含む)、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍(別名悪性シュワン腫、神経線維肉腫または神経原性肉腫)、ユーイング腫瘍(骨のユーイング肉腫、骨外性(すなわち、骨ではない)ユーイング肉腫および原始神経外胚葉性腫瘍を含む)、滑膜肉腫、管肉腫、血管、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、類腱腫(別名侵襲性線維腫症)、隆起性皮膚線維肉腫(ＤＦＳＰ)、悪性線維性組織球腫(ＭＦＨ)、血管外皮腫、悪性間葉腫、肺胞軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、線維増生小細胞腫瘍、消化器間質腫瘍(ＧＩＳＴ)(ＧＩ間質肉腫としても知られる)および軟骨肉腫を含むが、これらに限定されない。
黒色腫は、皮膚および他の臓器のメラニン細胞系から生じる腫瘍である。黒色腫の例は、悪性黒子由来黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節性黒色腫および末端黒子型黒色腫を含むが、これらに限定されない。
癌は固形腫瘍リンパ腫であり得る。例はホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫およびＢ細胞リンパ腫を含む。
癌は、限定しないが、骨の癌、脳の癌、乳癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内腫瘍、黒色腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞性肺癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫または横紋筋肉腫であり得る。
組成物
タンパク質ナノ構造体(例えば、タンパク質ナノゲル)を含む、医薬組成物を含む組成物が、ここで提供される。組成物を、薬学的に許容される量および薬学的に許容される組成物で対象に投与できる。用語“薬学的に許容される”は、活性成分(例えば、ナノ構造体の生物活性タンパク質)の生物活性の有効性を妨害しない、非毒性物質を意味する。このような組成物は、ある態様において、塩、緩衝剤、防腐剤および所望により他の治療剤を含み得る。
医薬組成物はまた、ある態様において、適当な防腐剤を含み得る。
医薬組成物は、ある態様において、単位用量形態で提供され、医薬業界で周知の方法のいずれかにより製造し得る。
非経腸投与に適する医薬組成物当は、ある態様において、ナノ構造体の無菌水性または非水性製剤を含み、これは、ある態様において、レシピエント対象の血液と等張である。この製剤は、既知法により製剤し得る。無菌注射用製剤はまた非毒性の非経腸に許容される希釈剤または溶媒中の無菌注射用溶液または懸濁液であり得る。
本発明の医薬組成物は、ある態様において、注射または長時間にわたるゆっくりした点滴を含む、慣用の経路により投与する。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内、腫瘍内または経皮であり得る。
本発明の医薬組成物を、ある態様において、有効量で投与する。“有効量”は、単独でまたは追加の投与量および／または他の治療剤と共に、所望の応答(例えば、インビボでの疑似自己分泌刺激、Ｔ細胞増殖増強およびアジュバント薬物の全身副作用最小化)を生じる、ここに提供するナノ構造体のいずれかの量である。
本発明の医薬組成物は、ある態様において、無菌であってよく、対象(例えば、ヒト対象)に投与するのに適する用量または総投与量の単位で所望の応答を生じるための、有効量のナノ構造体(例えば、ナノゲル)を、単独でまたは他の薬剤と共に含む。応答は、例えば、ナノ構造体組成物の生理学的効果の決定により測定できる。
対象に投与する組成物の用量は、種々のパラメータに従い、特に使用する投与方法および対象の状態に従い、選択し得る。他の因子は、所望の処置期間である。対象の応答が適用した初期用量で不十分であったならば、対象／患者耐容性から許容される限り、高用量(または異なる、より局所的な送達経路による、効果の点でより高い用量)を用い得る。
実施例１
癌処置のための養子Ｔ細胞療法において、アジュバントサイトカイン薬物であるＩＬ−２は、ドナーＴ細胞に重要なアジュバントシグナルを提供するが、また重度の用量規制炎症性毒性を誘発し、制御性Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ)を増殖させる。ここに提供されるのは、最小毒性で安全かつ効率的にＩＬ−２を治療用細胞に向かわせる、送達法である。
図１は、タンパク質−シリカナノカプセル(ＮＣ)の製造法の一例を記載する。重合可能シラン基を、最初に酸化還元応答性リンカー(式Ｉ)を介してＩＬ−２と接合させて、ＩＬ−２−シラン(図２、Ｉ)を製造した。この修飾したＩＬ−２をさらに(３−アミノプロピル)トリエトキシシランと反応させて、該タンパク質表面上の重合可能シラン基でＩＬ−２を官能化した。その後、シラン基を、架橋剤(例えば、シラン−ＰＥＧ−シラン、図２、II)と共にＮａＦにより触媒される重合化に付して、該タンパク質が生理的条件で分解するのを効率的に保護する分解可能シリカナノカプセル(ＮＣ)に包まれたタンパク質をもたらした。生理的条件でのシリカＮＣの溶解およびタンパク質とシラン基の間のリンカーの開裂により、タンパク質がその元の形態で放出される(図４Ｂ)。
方法
２１.８μL ＤＭＳＯに溶解した式Ｉのリンカー(１０９μg、５０当量のタンパク質)を、４７８μL ＰＢＳ緩衝液中のＩＬ−２−ｆｃ(５００μg)溶液に溶解した。混合物を４℃で３時間回転させた。修飾したＩＬ−２−ｆｃを、ミリポアアミコンウルトラ遠心式フィルター(分子量カットオフ＝１０,０００Da)を使用してＰＢＳ(１５mL×３)で洗浄した。５００μL ＰＢＳ中の精製したＩＬ−２−ｆｃ−リンカー接合体を、(３−アミノプロピル)トリエトキシシラン(５５.２μg、５０当量のタンパク質)と混合し、４℃で３時間回転させた。得られたシラン官能化ＩＬ−２−ｆｃを、ミリポアアミコンウルトラ遠心式フィルターを使用してＰＢＳ(１５mL×３)で洗浄して、未反応小分子を除去した。５００μLに溶解したＩＬ２−ｆｃ−シランをシラン−ＰＥＧ−シラン(１００μg、図２、II)と混合し、続いてフッ化ナトリウム(２００μg)を添加した。混合物を４℃で一夜撹拌した。得られたＩＬ−２−ｆｃ−シリカＮＣを、超遠心フィルターを使用してＰＢＳ(１５mL×３)で洗浄した。ＩＬ−２−ｆｃの取り込み効率を、ＮＣを遠沈させ、ＥＬＩＳＡキットを使用して上清中のＩＬ−２濃度を測定することにより決定した。最終ＩＬ−２−ｆｃ−ＮＣ中のＩＬ−２−ｆｃの負荷を、ＩＬ−２−ｆｃの取り込み効率に基づき、全シラン−ＰＥＧ−シランが反応し、最終ＮＣ中にあると仮定して計算した。
シラン基のＩＬ−２への接合の成功は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法(ＭＡＬＤＩ)解析により示された(図３Ｂ)。ＩＬ−２の修飾の程度は、増加した分子量の計算により決定できる。結果は、ＩＬ−２の約１６個のリシン残基が、シラン基と共有結合的に結合したことを示す(図３Ｂ)。製造したＩＬ−２−シリカＮＣは、動的光散乱(ＤＬＳ)および走査型電子顕微鏡(ＳＥＭ)特徴付け(図３Ｃおよび３Ｄ)の両者により示されるとおり、直径２２２.５±５.２nmであった。非常に高い取り込み効率(例えば、９５.５％)および高いタンパク質薬物負荷(例えば、８４.０％)が、この可逆性共有結合的修飾法を使用して達成された(図４Ａ)。比較して、従来技術のカプセル封入法は、一般的に１０％未満の取り込み効率と約１％の薬物負荷に終わる。
ＩＬ−２−シリカＮＣからのＩＬ−２の誘発された放出は、ＩＬ−２−シリカＮＣを、種々のｐＨの緩衝液中、３７℃でインキュベートし、還元剤、ジチオスレイトール(ＤＴＴ)添加時または非添加時のＩＬ−２の放出動態を解析することにより確認した。ｐＨ７.４で、１０mM ＤＴＴの添加は、還元剤非存在下の放出に対して、４８時間インキュベーションで２.６倍速いＩＬ−２放出を生じ、ＩＬ−２の酸化還元応答性放出を証明した(図４Ｃ)。ＮＣを、シリカシェルの分解を促進するｐＨ９.０の緩衝液でインキュベートしたとき、ＩＬ−２の放出は加速された(図４Ｃ)。これらの知見は、ＩＬ−２が効果的に還元剤開裂可能結合で接合し、シリカシェルにより保護されたことを証明する。
養子移入されたＴ細胞を特異的かつ効率的に刺激するために、ＩＬ−２−シリカＮＣを、ドナー細胞の原形質膜上に直接接合し、インビボでの移入細胞の連続的疑似自己分泌刺激を可能とした(図１)。シリカＮＣは、プロテアーゼによるＩＬ−２の分解を阻止し、生理的条件下で、傍観者Ｔ細胞を活性化することなくまたはＴｒｅｇを増幅することなく、特異的に細胞毒性Ｔ細胞を増幅するためにＩＬ−２の持続性局所放出を可能にし、そうして高用量ＩＬ−２の重篤な全身毒性を避ける。ＩＬ−２−シリカＮＣを、最初にシラン化学を使用してマレイミド基で官能化した(図２、III)。マレイミド官能化ＩＬ−２−シリカＮＣを、次いで、マレイミド−チオール反応により、養子移入されたＴ細胞の表面に共有結合的に結合させた(図５Ａ)。ＮＣの残存マレイミド基をチオール終端ポリエチレングリコール(ＰＥＧ−ＳＨ、Ｍｗ＝５kDa)のインサイチュ接合により失活させた(図５Ａ)。細胞表面接合の成功は、表面に結合した蛍光色素標識ＩＬ−２−シリカＮＣを有するＴ細胞のフローサイトメトリー解析により証明された(図５Ａ)。
表面に結合したＩＬ−２−シリカＮＣがインビトロで生物活性を保持し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を増殖させるＩＬ−２を放出できたか否かを評価するために、マウスの脾臓細胞由来の精製ＣＤ８＋ Ｔ細胞を遊離ＩＬ−２またはＩＬ−２が等量のＩＬ−２−シリカＮＣの接合体で処理し、１：１比のＣＤ３ＣＤ２８ビーズと共培養した。細胞増殖を手動計数およびフローサイトメトリーによるカルボキシフルオレセイン(ＣＦＳＥ)希釈の分析の両者でモニターした(図５Ｃおよび５Ｄ)。試験した２濃度で(３.０μg／mLまたは７.５μg／mL)、表面に結合したＩＬ−２−シリカＮＣは、３日目まで遊離ＩＬ−２と同等レベルのＴ細胞増殖を誘発する。
インビボでの刺激性ＩＬ−２−シリカＮＣの可能性のある機能的影響をさらに試験するために、Ｐｍｅｌ−１黒色腫特異的Ｔ細胞の応答を、インビボで、マウス転移肺腫瘍モデルにおけるＢ１６Ｆ１０腫瘍の養子移入処置の間に評価した。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を尾静脈を介して注入して、肺転移を６日で確立させた。次いで、動物はリンパ球枯渇させ、各群において、さらなる処置を伴わず、または遊離ＩＬ−２もしくは表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣと共にルシフェラーゼ発現Ｐｍｅｌ−１黒色腫特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の養子移入を受けた。Ｔ細胞増殖は、バイオルミネセンス造影により経時的に追跡した。養子移入され、さらなるアジュバント支持を受けない細胞は、腫瘍含有レシピエントにおい持続性が低レベルであることが示され、これはさらなる刺激または腫瘍免疫抑制からの保護の欠如により予測されるとおり、６日にわたり徐々に減少した(図６Ｂ)。古典的全身性ＩＬ−２治療と比較した表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣにより達成される刺激の相対的効力を評価するために、可溶性ＩＬ−２注射後のＴ細胞増殖を、表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣを用いたＴ細胞と比較した(ＩＬ−２の総量は同等)。表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣを有するＴ細胞は、可溶性ＩＬ−２注射したＴ細胞と比較して、４日目および６日目に高レベルで増殖した(図６Ｂ)。養子移入後６日目の鼠径リンパ節からプールしたＴ細胞のフローサイトメトリー解析は、腫瘍特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度(ｐｍｅｌ−１ Ｔ細胞はＴｈｙｌ.１を発現)が、可溶性ＩＬ−２を用いたＴ細胞と比較して、表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣを用いたＴ細胞を受けたマウスで約５倍高いことを確認した(図６Ｂ)。可溶性ＩＬ−２は、Ｔ細胞単独の注射と比較して、Ｔ細胞増殖の増強を示さなかった。それゆえに、表面接合ＩＬ−２−シリカＮＣは、可溶性ＩＬ−２と比較して、腫瘍担持マウスにおけるＴ細胞の、増強され、かつより持続性の増殖をもたらした。
実施例２
リンカー−１を、最初に４アームＰＥＧポリマー鎖の末端に接合した(図８Ａ)。ＰＢＳ緩衝液中の４アームＰＥＧ−リンカー−１とＩＬ−２−ｆｃのその後の架橋反応により、生理的条件で該タンパク質を分解から効率的に保護するタンパク質−ＰＥＧナノゲル粒子形成(図８Ｂ)に至った。生理的条件でのタンパク質とＰＥＧの間のリンカーの還元剤依存的開裂により、タンパク質はその元の形態に放出される。
方法
図８Ａ：４アームＰＥＧ−リンカー−１の合成。３００μL テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)に溶解した４アームＰＥＧ−ＮＨ２(１０mg)を、リンカー−１(１７.４mg、４０当量)およびトリエチルアミン(５μL)の８００μL ＴＨＦ溶液に滴下した。混合物を、さらに室温で一夜撹拌した。４アームＰＥＧ−リンカー−１を透析により精製した(分子量カットオフ＝３,０００Da)。
図８Ｂ：ＩＬ２−ｆｃ−ＰＥＧナノゲル粒子形成。ＩＬ−２−ｆｃ(５０μg)を、１００μL ＰＢＳ緩衝液中で４アームＰＥＧ−リンカー−１(１５μg、３当量)と混合し、４℃で一夜回転させた。得られたＩＬ２−ｆｃ−ＰＥＧナノゲルを、ミリポアアミコンウルトラ遠心式フィルター(分子量カットオフ＝１００、０００Da)を使用してＰＢＳ(１５mL×３)で洗浄して、未反応ＩＬ−２−ｆｃまたは４アームＰＥＧ−リンカー−１を除去した。ＩＬ−２−ｆｃの取り込み効率を、ナノゲルを遠沈させ、上清中のＩＬ−２−ｆｃ濃度を測定することにより決定した。最終ＩＬ２−ｆｃ−ＰＥＧナノゲル(ＮＧ)におけるＩＬ−２−ｆｃの負荷を、ＩＬ−２−ｆｃの取り込み効率に基づき、全４アームＰＥＧ−リンカー−１が反応し、最終ナノゲルにあると仮定して、計算した。
ＩＬ２−ｆｃ−ＰＥＧナノゲル粒子の形成をＤＬＳ測定により証明した。このように製造されたＩＬ２−ｆｃ−ＰＥＧナノゲルは、直径２２６.８±８.４nmであった。
実施例３
タンパク質ナノゲル(ＮＧ)の製剤および特徴付け
図９に示すように、ＩＬ２−Ｆｃ(１００μg)を、１０μLのリン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)中でジスルフィド架橋剤(４.３６μg、１０当量)と混合し、室温で１時間(ｈ)撹拌した。得られたＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを、ミリポアアミコンウルトラ遠心式フィルター(分子量カットオフ＝１００,０００Da)を使用してＰＢＳ(０.４mL×３)で洗浄し、未反応ＩＬ２−Ｆｃおよび／または未反応ジスルフィド架橋剤を除去した。ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを、ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルと４アームＰＥＧ１０ｋ−ＮＨ２を１００μL ＰＢＳ緩衝液中で混合することによりペグ化した(図９Ａ；５０μg、５当量)。混合物を室温で０.５時間インキュベートした。ペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを超遠心フィルターで洗浄した。ＩＬ２−Ｆｃの取り込み効率を、ペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを遠沈させ、上清中のＩＬ２−Ｆｃの濃度を測定することにより決定した。
ペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを、サイズ排除カラムを備えたＨＰＬＣで分析した(図１０Ａ)。遊離ＩＬ２−Ｆｃと比較して、ピークのシフトは、はるかに大きい分子量を有する架橋タンパク質の形成を示唆する。ペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルをさらに透過電子顕微鏡法(ＴＥＭ；図１０Ｂ)および動的光散乱(ＤＬＳ；図１０Ｃ)で分析して、ナノゲルのサイズおよび形態学を特徴付けした。図１０ＢのＴＥＭ像は、乾燥固体としてのペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルのサイズが直径〜５０〜６０nmであることを示す。ＰＢＳ溶液中のペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルのＤＬＳ特徴付けは、ナノゲルの流体力学的粒径が〜８５.６nmであることを示す。乾燥固体としてのサイズと比較して流体力学的粒径が大きいのは、ペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲル上の表面ＰＥＧの水和が原因である。
ペグ化ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルは、生理的条件で無傷ＩＬ２−Ｆｃを放出できる。図１１Ａは、これには縛られないが、タンパク質分子上に化学残基を残すことなく、ＩＬ２−ＦｃがＮＧから放出される機構を要約する。図１１Ｂは、完全ロズウェルパーク記念研究所(ＲＰＭＩ)培地(インビトロでのＴ細胞用培地)におけるＬ２−Ｆｃの制御持続性放出を示す。生理的条件における還元剤であるグルタチオン(ＧＳＨ)を添加したとき、放出動態は加速された。放出された混合物もまた図１１Ｃに示すようにＨＰＬＣで特徴付けした。架橋ＩＬ２−Ｆｃ ＮＧのピークは低下したが、遊離ＩＬ２−Ｆｃのピークは経時的に増加した。放出されたＩＬ２−Ｆｃをまたマトリックス支援レーザー脱離イオン化法(ＭＡＬＤＩ)質量分析でも分析し、放出されたＩＬ２−Ｆｃが天然ＩＬ２−Ｆｃと同じ分子量を有することを証明し、ＩＬ２−Ｆｃ分子に化学残基が残存していないことを示した。
類似のタンパク質ナノゲルを、ＩＬ−２−Ｆｃ以外の治療用タンパク質を使用して製剤できる。例えば、ヒトＩＬ−１５スーパーアゴニスト(ｈＩＬ−１５Ｓａ)架橋および天然マウスＩＬ−２(ｍＩＬ−２)架橋ナノゲルは、図１２におけるＨＰＬＣ曲線により表される。
５０mg／mLより高いタンパク質濃度で、ナノゲルの代わりにバルクゲルが形成された(図１３)。
実施例４
癌に対する養子細胞療法のためにＴ細胞を増強するための、タンパク質ナノゲルを使用するサイトカインの無担体送達
癌免疫療法のための養子Ｔ細胞移入(ＡＣＴ)における本発明のタンパク質ナノゲルの適用を示すために、ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを使用してインビボで養子移入されたＴ細胞を特異的に増殖させるためにＩＬ２−Ｆｃを送達した。ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルは、接合によりＴ細胞表面に十分量のサイトカインを送達するための効率の高い方法を提供する。ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルをジスルフィド架橋剤で表面修飾し(Nat. Med. 16, 1035-1041, 2010、ここに引用により包含させる；図９)、次いでエフェクターＴ細胞の表面に接合させた。図１４Ａに示すように、ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルは、Ｔ細胞の表面に接合できる。Ｔ細胞に添加するＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルの量を調節することにより、蛍光標識ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを使用するフローサイトメトリー解析により証明されるとおり、Ｔ細胞表面密度が十分に制御できた(図１４Ｂ)。
表面接合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを伴うＰｍｅｌ−１黒色腫特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の確立された肺転移を有するマウスに養子移入した。移入Ｔ細胞のインビボ増殖を、バイオルミネセンス造影を使用して経時的にモニターした。表面接合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを伴うＣＤ８＋ Ｔ細胞は、Ｔ細胞のみの対照または全身性に投与された遊離ＩＬ２−Ｆｃを伴うＴ細胞と比較して、インビボ増殖の増加を示した(図１５Ａ−１５Ｂ)。
鼠径リンパ節および血液における養子移入Ｔ細胞および内因性Ｔ細胞の頻度を、養子移入後１２日目にフローサイトメトリーで分析した。Ｐｍｅｌ−１＋全身性ＩＬ２−Ｆｃ群と比較して、接合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを伴うＴ細胞は、ＬＮおよび血液で移入ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度がそれぞれ４.８倍および２.０倍増加した。しかしながら、全身性ＩＬ２−Ｆｃは、鼠径リンパ節および血液の両者で内因性ＣＤ８＋ Ｔ細胞を非特異的に増殖させた(図１６)。
養子細胞移入の処置の有効性を評価するために、肺の全てを採取した。肺の腫瘍小結節数を数えることにより、接合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを有するＴ細胞で処置したマウスの有する腫瘍の数が最少であることが示され(図１７Ａ〜１７Ｂ)、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫の肺転移に対する有効性の改善に至る、接合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルによる養子移入Ｔ細胞の特異的増幅が示された。有効性結果をさらに組織学的分析で確認し、接合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルを伴うＴ細胞で処置したマウスがまた最低グレードの肺腫瘍負荷を有した(図１７Ｃ〜１７Ｄ)。
Ｔ細胞表面結合ＩＬ２−Ｆｃ架橋ナノゲルは、インビボでの無傷ＩＬ２−Ｆｃの持続性放出による、養子移入Ｔ細胞の持続性の特異的増殖を、そして、それゆえに、癌に対する養子Ｔ細胞療法の有効性の改善を提供する。
本明細書および特許請求の範囲で使用する単数表現は、明らかに反する指示がない限り、“少なくとも一つ”を意味する。
１個以上の要素の一覧と関連して本明細書および特許請求の範囲で使用する用語“少なくとも１個”は、要素の一覧における任意の１個以上の要素から選択される少なくとも１個の要素を意味するが、要素の一覧内に具体的に挙げられたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、要素の一覧の要素の任意の組み合わせを除外しないと解釈すべきである。この定義はまた、所望により用語“少なくとも１個”が付された要素の一覧内に具体的に同定された要素以外の要素が、具体的に指定されている要素と関係しても無関係でも、存在してよいことを可能にする。それゆえに、非限定的例として、“ＡおよびＢの少なくとも１個”(または、同等に、“ＡまたはＢの少なくとも１個”または同等に“Ａおよび／またはＢの少なくとも１個”)は、一つの態様において、所望により１個超を含む少なくとも１個のＡが存在し、Ｂが存在しない(そして所望によりＢ以外の要素を含む)ことをいい、他の態様において、所望により１個超を含む少なくとも１個のＢが存在し、Ａが存在しない(そして所望によりＡ以外の要素を含む)ことをいい、さらに別の態様において、所望により１個超を含む少なくとも１個のＡおよび所望により１個超を含む少なくとも１個のＢを含む(そして所望により他の要素を含む)ことをいうことができる。
本明細書および特許請求の範囲で使用する用語“および／または”は、そのように結合された要素、すなわち、ある場合には接続的に存在し、他の場合には離接的に存在する要素の“いずれかまたは両方”を意味すると理解すべきである。“および／または”を用いて挙げられた複数要素は、同じように、すなわち、このように結合された“１個以上の”要素と解釈すべきである。“および／または”の句により具体的に指定された要素以外の他の要素は、具体的に指定されている要素と関係しても無関係でも、所望により存在してよい。それゆえに、非限定的例として、“Ａおよび／またはＢ”は、“含む”のような開放端の用語と組み合わせて使用されたとき、一つの態様において、Ａのみ(所望によりＢ以外の要素を含む)、他の態様において、Ｂのみ(所望によりＡ以外の要素を含む)、さらに別の態様において、ＡおよびＢの両者(所望により他の要素を含む)をいうことができる。
１個を超える工程または行為を含む、ここで請求するあらゆる方法において、明らかに異なる指示がない限り、これらの工程または行為の順番は、該方法の工程または行為が引用されている順番に必ずしも制限されないことも理解すべきである。
ここに開示する全ての引用文献(例えば、公表された雑誌論文、書籍など)、特許および特許出願は、各々が引用された主題に関して、またある場合には、文献の全てに関して、引用することによりここに包含させる。
特許請求の範囲ならびに上記記載において、“含む”、“包含する”、“担持する”、“有する”、“含有する”、“関与する”、“保持する”、“構成される”などのような全ての経過句は(transitional phrase)、末端解放型であり、すなわち、含むけれども、限定されないことを意味すると理解すべきである。経過句“からなる”および“本質的にからなる”のみが、米国特許審査マニュアルのセクション２１１１.０３に示されるように、それぞれ閉鎖型または半閉鎖型経過である。

Claims (107)

  1. 複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルを製造する方法であって、
    (ａ)タンパク質と分解可能リンカーを、該分解可能リンカーを介してタンパク質が互いに可逆性共有結合架橋することを可能とする条件下で接触させ、それにより複数のタンパク質ナノゲルを産生し；そして
    (ｂ)該タンパク質ナノゲルとポリマーを、該ポリマーと該タンパク質ナノゲルのタンパク質の架橋を可能とする条件下で接触させ、それにより複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルを製造する
    ことを含む、方法。
  2. (ａ)の条件が、タンパク質と分解可能リンカーを、水性緩衝液中、４℃から２５℃の温度で接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
  3. (ａ)の条件が、タンパク質と分解可能リンカーを、水性緩衝液中、３０分から１時間接触させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. (ｂ)の条件が、タンパク質ナノゲルとポリマーを、水性緩衝液中、４℃から２５℃の温度で接触させることを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. (ｂ)の条件が、タンパク質ナノゲルとポリマーを、水性緩衝液中、３０分から１時間接触させることを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. (ａ)の条件が、タンパク質と分解可能リンカーを、３０℃を超える温度で接触させることを含まない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. (ｂ)の条件が、タンパク質ナノゲルとポリマーを、３０℃を超える温度で接触させることを含まない、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. (ａ)の条件が、タンパク質と分解可能リンカーを、有機溶媒中で接触させることを含まない、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. (ｂ)の条件が、タンパク質ナノゲルとポリマーを、有機溶媒中で接触させることを含まない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
  10. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
  11. タンパク質がサイトカインである、請求項１０に記載の方法。
  12. サイトカインがＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃである、請求項１１に記載の方法。
  13. サイトカインがＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＳＡである、請求項１１に記載の方法。
  14. 分解可能リンカーがジスルフィド結合を含む酸化還元応答性リンカーである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. ポリマーが親水性ポリマーである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
  16. 親水性ポリマーがポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. ポリマーが４アームＰＥＧ−ＮＨ２ポリマーである、請求項１６に記載の方法。
  18. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズが直径１００nm未満である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
  19. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズが直径５０〜６０nmである、請求項１８に記載の方法。
  20. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的粒径が直径１００nm未満である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
  21. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的粒径が直径８０〜９０nmである、請求項１９に記載の方法。
  22. 水性緩衝液中のタンパク質の濃度が１０mg／mL〜５０mg／mLである、請求項２〜２１のいずれかに記載の方法。
  23. 複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルが単分散した複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルである、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
  24. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルがアルブミンを含まない、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
  25. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも７５％である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
  26. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも８０％である、請求項２５に記載の方法。
  27. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも８５％である、請求項２６に記載の方法。
  28. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも９０％である、請求項２７に記載の方法。
  29. 単分散した複数の無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルを含む組成物であって、ここで、該ナノゲルのタンパク質が分解可能リンカーを介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋し、かつ該ナノゲルのタンパク質がポリマーに架橋している、組成物。
  30. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である、請求項２９に記載の組成物。
  31. タンパク質がサイトカインである、請求項３０に記載の組成物。
  32. サイトカインがＩＬ−２またはＩＬ−２−Ｆｃである、請求項３１に記載の組成物。
  33. サイトカインがＩＬ−１５またはＩＬ−１５ＳＡである、請求項３１に記載の組成物。
  34. 分解可能リンカーがジスルフィド結合を含む酸化還元応答性リンカーである、請求項１〜３２のいずれかに記載の組成物。
  35. ポリマーが親水性ポリマーである、請求項１〜３４のいずれかに記載の組成物。
  36. 親水性ポリマーがポリエチレングリコール(ＰＥＧ)を含む、請求項３５に記載の組成物。
  37. ポリマーが４アームＰＥＧ−ＮＨ２ポリマーである、請求項３６に記載の組成物。
  38. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズが直径１００nm未満である、請求項１〜３７のいずれかに記載の組成物。
  39. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの乾燥サイズが直径５０〜６０nmである、請求項３８に記載の組成物。
  40. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的粒径が直径１００nm未満である、請求項１〜３９のいずれかに記載の組成物。
  41. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルの流体力学的粒径が直径８０〜９０nmである、請求項４０に記載の組成物。
  42. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲルがアルブミンを含まない、請求項１〜４１のいずれかに記載の組成物。
  43. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも７５％である、請求項１〜４２のいずれかに記載の組成物。
  44. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも８０％である、請求項４３に記載の組成物。
  45. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも８５％である、請求項４４に記載の組成物。
  46. 無担体生物活性タンパク質−ポリマーナノゲル中のタンパク質の重量パーセンテージが少なくとも９０％である、請求項４５に記載の組成物。
  47. ポリマーおよび少なくとも７５％ｗ／ｗの分解可能リンカーを介して互いに可逆的かつ共有結合的に架橋したタンパク質を含む、ナノゲル。
  48. 対象に請求項２９〜４６のいずれかに記載の組成物または請求項４７に記載のナノゲルを投与することを含む、インビボでタンパク質を送達する方法。
  49. 対象が疾患を有する、請求項４８に記載の方法。
  50. 疾患が癌、糖尿病、自己免疫性疾患または心血管疾患である、請求項４９に記載の方法。
  51. タンパク質が、生理的条件下、ナノゲルからその天然立体構造で放出され、生物学的に活性である、請求項４８〜５０のいずれかに記載の方法。
  52. シランに分解可能リンカーを介して可逆的に結合した、タンパク質。
  53. 重合可能官能基に分解可能リンカーを介して可逆的に結合した、タンパク質。
  54. 重合可能官能基がシランおよび／または架橋可能ポリマーを含む、請求項５３に記載のタンパク質。
  55. 架橋可能ポリマーがポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)を含む、請求項５４に記載のタンパク質。
  56. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である、請求項５２〜５５のいずれかに記載のタンパク質。
  57. サイトカインがＩＬ−２である、請求項５６に記載のタンパク質。
  58. 分解可能リンカーがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、請求項５２〜５７のいずれかに記載のタンパク質。
  59. 分解可能リンカーが酸化還元応答性リンカーである、請求項５２〜５８のいずれかに記載のタンパク質。
  60. 酸化還元応答性リンカーがジスルフィド結合を含む、請求項５９に記載のタンパク質。
  61. ジスルフィド結合を含む酸化還元応答性リンカーを介してシランに可逆的に結合した、サイトカイン。
  62. ＩＬ−２である、請求項６１に記載のサイトカイン。
  63. 式III
    (ここで、タンパク質はＩＬ−２である)
    を含む、タンパク質接合体。
  64. 請求項５２〜６３のいずれかに記載の多数のタンパク質。
  65. タンパク質が架橋している、請求項６４に記載の多数のタンパク質。
  66. ポリマーおよび少なくとも５０％ｗ／ｗの分解可能リンカーを介して重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含む、ナノ構造体。
  67. 重合可能官能基がシランおよび／または架橋可能ポリマーを含む、請求項６６に記載のナノ構造体。
  68. 架橋可能ポリマーがポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)を含む、請求項６７に記載のナノ構造体。
  69. 少なくとも７５％ｗ／ｗの重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含む、請求項６６〜６８のいずれかに記載のナノ構造体。
  70. 少なくとも８０％ｗ／ｗの重合可能官能基に可逆的に結合したタンパク質を含む、請求項６９に記載のナノ構造体。
  71. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である、請求項６６〜７０のいずれかに記載のナノ構造体。
  72. サイトカインがＩＬ−２である、請求項７１に記載のナノ構造体。
  73. ナノ構造体がその表面に反応性基を含む、請求項６６〜７２のいずれかに記載のナノ構造体。
  74. 反応性基がマレイミド、ローダミンまたはＩＲ７８３反応性基である、請求項７３に記載のナノ構造体。
  75. ナノ構造体が担体細胞に結合している、請求項７３または７４に記載のナノ構造体。
  76. 担体細胞が有核担体細胞である、請求項７５に記載のナノ構造体。
  77. 有核担体細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である、請求項７６に記載のナノ構造体。
  78. ナノ構造体が直径２０〜５００nmである、請求項６６〜７７のいずれかに記載のナノ構造体。
  79. 直径１００〜３００nmである、請求項７８に記載のナノ構造体。
  80. 分解可能リンカーがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、請求項６６〜７９のいずれかに記載のナノ構造体。
  81. 分解可能リンカーが酸化還元応答性リンカーである、請求項６６〜８０のいずれかに記載のナノ構造体。
  82. 酸化還元応答性リンカーがジスルフィド結合を含む、請求項８１に記載のナノ構造体。
  83. ナノ構造体の製造法であって、
    タンパク質を分解可能リンカーおよび重合可能官能基で修飾し；そして
    該重合可能官能基と架橋剤および可溶性フッ化物を重合させる、
    ことを含む、方法。
  84. 重合可能官能基がシランおよび／または架橋可能ポリマーを含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 架橋可能ポリマーがポリ(エチレンオキシド)、ポリ乳酸および／またはポリ(乳酸−コ−グリコール酸)を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 可溶性フッ化物がフッ化ナトリウムまたはフッ化カリウムである、請求項８３〜８５のいずれかに記載の方法。
  87. タンパク質がサイトカイン、増殖因子、抗体または抗原である、請求項８３〜８６のいずれかに記載の方法。
  88. サイトカインがＩＬ−２である、請求項８７に記載の方法。
  89. 分解可能リンカーがＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む、請求項８３〜８８のいずれかに記載の方法。
  90. 分解可能リンカーが酸化還元応答性リンカーである、請求項８３〜８９のいずれかに記載の方法。
  91. 酸化還元応答性リンカーがジスルフィド結合を含む、請求項９０に記載の方法。
  92. ナノ構造体が直径２０〜５００nmである、請求項８３〜９１のいずれかに記載の方法。
  93. ナノ構造体が直径１００〜３００nmである、請求項９２に記載の方法。
  94. さらにナノ構造体の表面を反応性基で修飾することを含む、請求項８３〜９３のいずれかに記載の方法。
  95. 反応性基がマレイミド、ローダミンまたはＩＲ７８３反応性基である、請求項９４に記載の方法。
  96. さらにナノ構造体を担体細胞に結合させることを含む、請求項９４または９５に記載の方法。
  97. 担体細胞が有核担体細胞である、請求項９６に記載の方法。
  98. 有核担体細胞がＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞である、請求項９７に記載の方法。
  99. インビボでタンパク質を送達する方法であって、
    対象に請求項８３〜９８のいずれかに記載のナノ構造体を投与することを含む、方法。
  100. 対象が疾患を有する、請求項９９に記載の方法。
  101. 疾患が癌、糖尿病、自己免疫性疾患または心血管疾患である、請求項１００に記載の方法。
  102. タンパク質が、生理的条件下、その天然立体構造でナノ構造体から放出され、生物学的に活性である、請求項９９〜１０１のいずれかに記載の方法。
  103. インビボでタンパク質を送達する方法であって、
    対象にシランに分解可能リンカーを介して可逆的に結合したタンパク質を含むナノ構造体を投与することを含む、方法。
  104. 式Ｉ
    を含む、リンカー。
  105. 式II
    を含む、タンパク質接合体。
  106. 式III
    を含む、タンパク質接合体。
  107. 請求項４７に記載のナノゲルを含む、医薬組成物。
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