JP2018519801A - 幹細胞における遺伝子編集のための最適化crispr/cas9システムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年3月11日に出願された米国仮特許出願第62/159,785号明細書;2015年9月18日に出願された米国仮特許出願第62/220,648号明細書;2015年10月21日に出願された米国仮特許出願第62/244,577号明細書;および2016年1月15日に出願された米国仮特許出願第62/279,020号明細書の優先権を主張するものであり、これら各々の内容全体は、本明細書に参照により明示的に援用される。
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これは、その内容全体が、本明細書に参照により援用される。前記ASCIIコピーは、2016年5月6日に作製され、2016−05−06_126454−00520_ST25.txtと命名され、サイズは1.07メガバイトである。
用語「生存能力」は、本明細書の用法では、例えば、CRISPR/Cas9システムへの曝露後に、幹細胞が、生存し、それ自体を維持し、かつ/またはその潜在力を回復する能力を指す。一実施形態では、生存幹細胞は、細胞培養物中に維持することができる。
幹細胞、例えば、本明細書に記載される幹細胞は、例えば、生体外または生体内で最適化もしくは操作することができる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、幹細胞の最適化もしくは操作によって、CRISPR/Cas媒介性遺伝子編集または調節のための、細胞の維持、持続、もしくは調節が可能になると考えられる。例えば、幹細胞、例えば、造血幹/前駆細胞(HSC)の最適化もしくは操作によって、細胞適合性、機能性、自己再生、生着能を維持するか、または例えば、細胞死機構、例えば、オートファジー、アポトーシス、壊死、アポネクローシス、フェロトーシス、エリプトーシス、アノイキス、もしくは細胞老化などを介した細胞死を阻止することができる。
本明細書に記載される幹細胞は、例えば、細胞生存を促進し、CRISPR/Cas9構成要素と細胞の接触に対する応答(例えば、CRISPR/Cas9構成要素によりトリガーされるシグナル伝達事象(例えば、自然免疫応答)または遺伝子編集事象に応答した)を引き起こし得る細胞死を阻止するために、1つまたは複数の幹細胞生存能力エンハンサー(例えば、アリール炭化水素受容体(AhR)アンタゴニスト、自然免疫応答アンタゴニスト、もしくはその他の本明細書に記載の幹細胞生存能力エンハンサー)と接触させることができる。
一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、アリール炭化水素受容体(AhR)アンタゴニストである。アリール炭化水素受容体(AhR)は、2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ジオキシン(TCDDもしくはジオキシン)およびその他のポリ塩化ビフェニルなどの環境有害物質に対する応答を媒介する転写因子であり、幹細胞の増殖および分化に関与している(例えば、Thurmond et al.(1999)Toxicol.Appl.Pharmacol.158:33−40;Singh et al.(2009)Biochem.Pharmacol.77,577−587;Esser(2012)Arch.Toxicol.86:1323−1329を参照のこと)。これまでに複数のAhRアンタゴニストが同定されている。
別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、自然免疫応答アンタゴニストである。用語「自然免疫応答アンタゴニスト」は、本明細書の用法では、幹細胞の自然免疫応答(例えば、Cas9システムの1つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触(例えば、電気穿孔による)に応答した)を阻害する分子を指す。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の自然免疫応答(例えば、Cas9システムの1つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触(例えば、電気穿孔による)に応答した)が起こるのに必要なシグナル伝達事象を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の細胞死(例えば、プログラム細胞死)を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のプログラム細胞死(例えば、Cas9システムの1つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触に応答した)を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プログラム細胞死シグナル伝達事象(例えば、Cas9システムの1つまたは複数の構成要素と幹細胞の接触に応答した)が細胞に起こるのに必要なシグナル伝達事象を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞における老化を阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞の分化を阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のアポトーシスを阻害する。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞のオートファジーを阻害する。いくつかの実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、幹細胞生存能力エンハンサーによる処理なしの標的組織への幹細胞の内植の頻度と比較して、標的組織への幹細胞の内植の頻度を増加する。
特定の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、UM171、UM729、および16,16−ジメチルプロスタグランジンE2からなる群から選択される。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、UM171((1r,4r)−N1−(2−ベンジル−7−(2−メチル−2H−テトラゾール−5−イル)−9H−ピリミド[4,5−b]インドール−4−イル)シクロヘキサン−1,4−ジアミン;CAS No.1448724−09−1;例えば、Fares et al.(2014)Science 345(6203):1509−1512を参照のこと)である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、UM729(メチル4−((3−(ピペリジン−1−イル)プロピル)アミノ)−9H−ピリミド[4,5−b]インドール−7−カルボキシレート;CAS No.1448723−60−1;例えば、Fares et al.(2014)Science 345(6203):1509−1512を参照のこと)である。また別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、16,16−ジメチルプロスタグランジンE2(9−オキソ−11α,15R−ジヒドロキシ−16,16−ジメチル−プロスタ−5Z,13E−ジエン−1−オイン酸;dmPGE2;CAS No.39746−25−3)である。一実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、プロスタグランジンE2(PGE2)である。別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、MG132である。また別の実施形態では、幹細胞生存能力エンハンサーは、SB431542である。
幹細胞を取得、作製、および/または単離した後、但しCRISPR/Cas9構成要素(例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸)と細胞を接触させる前に、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、1つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。さらに、CRISPR/Cas9構成要素と細胞を接触させた後、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、1つまたは複数のサイトカインを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。
幹細胞を取得、作製、および/または単離した後、但しCRISPR/Cas9構成要素(例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸)と細胞を接触させる前に、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、1つまたは複数のシグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。さらに、CRISPR/Cas9構成要素と細胞を接触させた後、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、1つまたは複数のシグナル伝達アクチベーターまたはレプレッサーを含有する培地中で幹細胞を培養することができる。
骨髄微小環境における血管内皮細胞および間質細胞は、特定の幹細胞、例えば、HSC上のコグネイト受容体に結合する膜結合Notchリガンド(デルタ様リガンド[DLL]およびジャグド(Jagged)[JAG])を産生する。Notchリガンドは、幹細胞(例えば、HSC)上のNotch1、Notch2受容体との結合について競合し、様々なNotchリガンドの相対結合が、幹細胞(例えば、HSC)自己再生、維持、増殖、および分化を均衡させる。例えば、JAG1は、生体内での恒常的かつ再生的造血のために必要であることが明らかにされている(Poulos et al.(2013)Cell Reports 4(5):1022−1034)。プラスチック製培養プレートに固定化したNotchリガンドデルタ様リガンド1(DLL1)(Immobilized Delta−1ext−IgG)と臍帯血HSCの共培養は、CD34+細胞の拡大を支持し、同種異系二重臍帯血移植臨床試験において安全であることが証明されている(Delaney et al.(2010)Nature Medicine 16:232−6)。
トランスフォーミング成長因子β(TGFβ)は、HSCの休眠および冬眠を調節する造血幹/前駆細胞ニッチ中に存在する成長因子である(Yamzaki,2009,Blood,113:1250−1255)。TGFβは、骨髄中の血管近傍の非髄鞘形成シュワン(Schwann)細胞によって産生され(Yamazaki et al.,2011,Cell,147:1146−1158)、これは、HSC休眠の調節が、血管(内皮)ニッチ内で起こることを示している。ゼブラフィッシュ胚をTGFβシグナル伝達の小分子阻害剤(SB431542)で処理すると、血管周囲ニッチ内のHSC増殖を促進することが判明している(Tamplin et al.,2014,Cell,160:241−252)。従って、中和抗体または小分子阻害剤、例えば、SB431542でTGFβシグナル伝達をブロックすることは、外来核酸、例えば、Cas9mRNAまたはgRNAへの曝露時に、幹細胞、例えば、HSCの増殖能力を維持するための戦略である。あるいは、外来核酸への短時間の曝露による細胞死を阻止するために、遺伝毒性ストレスへの曝露直後の幹細胞(例えば、HSC)とTGFβの接触によって、ストレス幹細胞を強制的に冬眠させることができる。
CXCR4は、リンパ球およびHSCの細胞表面上に存在するケモカイン受容体である。間質由来因子−1(SDF1またはCXCL12)は、CXCR4に結合するリガンドであり、骨髄中および他の組織中の細胞により産生される。細胞は、ケモカイン勾配に沿って下方に遊走するため、SDF1/CXCR4シグナル伝達軸は、骨髄中のHSC局在化および保持、ならびに末梢血および他の組織中への遊走を調節する。SDF1/CXR4ケモカイン軸を利用するHSCの遊走を調節するための小分子が開発されている。例えば、dmPGE2の使用は、CXCR4の発現を上方制御して、移植時に骨髄への臍帯血細胞のホーミングおよび保持を増大する(Cutler et al.,2013,Blood,122(17):3074−3081)。別の例として、プレリキシフロル(AMD3100)、すなわち、CXCR4とSDF1の結合を破断するCXCR4アンタゴニストは、同種異系またはオートロガス移植における収集および使用のために、骨髄から血液へのHSCの動員を促進する。CXCR4シグナル伝達が細胞周期進行および生存に特定の役割を果たすとすれば、幹細胞におけるCXCR4シグナル伝達の例えば生体外での操作を用いて、幹細胞死(例えば、アポトーシス)を阻止すると共に、細胞周期進行および増殖を調節することができる。
標準Wnt経路阻害剤DKK1の過剰発現は、生体内での造血再構成を低減することができる(Fleming et al.,2008,Cell Stem Cell,2(3):274−283)。標準WntリガンドWnt3aの欠失は、HSCの自己再生および再構成能も低減することができる。これらの知見は、HSC自己再生および維持における標準Wntシグナル伝達の特定の役割を示すものである。反対に、非標準的Wntシグナル伝達(例えば、Wnt5aリガンド)は、HSCにおける標準Wntシグナル伝達を阻害し、HSCの生体外増殖をブロックすると共に、再増殖能を増大することができる(Nemeth et al.,2007,Proceedings of the National Academy of Sciences,104(39):15436−41)。
幹細胞を取得、作製、および/または単離した後、但しCRISPR/Cas9構成要素(例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸)と細胞を接触させる前に、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、1つまたは複数の細胞死の阻害剤を含有する培地中で幹細胞を培養することができる。さらに、CRISPR/Cas9構成要素と細胞を接触させた後、例えば、幹細胞生存能力エンハンサーに加えて、1つまたは複数の細胞死の阻害剤を含有する培地中で幹細胞を培養することができる。
細胞表面抗原または選択マーカーを発現する修飾幹細胞の精製は、CRISPR/Cas9構成要素、例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸が、細胞に、例えば、生体外で送達されたことを保証する手段を提供し得る。また、標的化細胞による細胞表面抗原の発現は、修飾幹細胞を生体内で追跡することも可能にする。
本明細書に記載される方法は、所望の特性を有する修飾幹細胞を選択もしくは拡大することができるか、または不要な特性(例えば、白血病性形質転換)を有する修飾幹細胞を排除することができるように、幹細胞の調節を生体内または生体外で可能にする。
本明細書に記載されるように、幹細胞は、CRISPR/Cas9構成要素、例えば、Cas9分子、gRNA分子、またはその両方、および任意選択的に供与体テンプレート核酸との接触前、接触後、またはその両方のいずれかに培養することができる。一実施形態では、幹細胞は、内皮細胞、例えば、ヒト内皮細胞(例えば、VeraVec(商標)、血管周囲内皮、またはその他の内皮細胞)と共培養する。別の実施形態では、幹細胞は、間葉系間質細胞、例えば、ヒト間葉系間質細胞と共培養する。一実施形態では、内皮または間葉系共培養細胞は、幹細胞のNotch、Wnt、TGFβ、および/またはCXCR4シグナル伝達を活性化または抑制する1つまたは複数の膜結合リガンドを発現するように遺伝子修飾されている。一実施形態では、幹細胞は、2−D培養システム中に培養する。別の実施形態では、幹細胞は、3−D培養システム中に培養する。例えば、幹細胞は、幹または前駆細胞、例えば、HSCを培養するために設計されたシステム(例えば、NANEX(商標)拡大プレート、AK−ポリファイバー)中に培養することができる。一実施形態では、幹細胞は、例えば、細胞培養容器を低酸素チャンバー内に配置することにより、低酸素増殖条件下で培養する。例えば、低酸素チャンバーの酸素圧は、10%〜0.1%のO2、例えば5%〜0.5%のO2、例えば10%以下、8%以下、5%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0.5%以下、または0.2%以下のO2の範囲であってよい。一実施形態では、幹細胞は、少なくとも1、2、3、4、5、6、または7日間培養する。一実施形態では、幹細胞は、移植前に、内皮または間質支持細胞から精製する。
ウイルス−宿主共進化の間に、mRNAのキャッピングを模倣するウイルスRNAキャッピングは進化して、ウイルスRNAが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした(例えば、Delcroy et al.(2012)Nature Reviews Microbiology 10:51−65を参照のこと)。幹細胞(例えば、HSC)内のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖RNAの存在を感知する(Kajaste−Rudnitski and Naldini(2015)Human Gene Therapy 26:201−9)。初期実験の結果から、GFPmRNA単独で電気穿孔された細胞と比較して、非修飾(例えば、5’キャップもしくは3’ポリA−テールなしで合成されたgRNA)gRNA分子およびCas9mRNAと共に電気穿孔されたヒトHSCは、細胞寿命、増殖能、または複能性の低減(例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化能)を招くことが立証された。細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の幹細胞感知および自然免疫応答の誘導、ならびにこれに続くプログラム細胞死の誘導および増殖および分化能の喪失によるものであった可能性がある。外来核酸に対する細胞の自然免疫応答を回避するために、mRNAを模倣するようにgRNA分子を修飾すること(例えば、5’キャップおよび3’ポリAテールの付加)によって、細胞における自然免疫応答、細胞におけるインターフェロン応答、細胞老化、または外来核酸の感知に関連するプログラム細胞死を阻止することができる。
本明細書に記載される方法および組成物は、疾患、例えば、本明細書に記載の疾患を治療または予防する治療法、例えば、1回療法または複数回投与療法を提供する。一部の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、細胞、例えば、本明細書に記載される細胞を例えば、生体外または生体内で改変する。疾患に関連するあらゆる型の細胞を本明細書に記載の方法で改変することができる。例えば、細胞は、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、造血幹/前駆細胞(HSC)、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞である。別の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、遺伝子、例えば、本明細書に記載される遺伝子を、例えばCRISPR/Cas媒介性遺伝子編集によって改変する。細胞または遺伝子の改変(例えば、修正、ノックアウト、ノックイン、ノックダウン、または活性化)は、疾患の発症前または疾患の発症後に実施することができる。本明細書に記載される方法により治療または予防することができる例示的な疾患として、限定はしないが、表4に列記する疾患が挙げられる。本明細書に記載される方法により改変することができる例示的な遺伝子として、限定はしないが、表4に列記する遺伝子が挙げられる。
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子における標的位置(例えば、標的突然変異位置)を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、HDRにより、遺伝子における1つまたは複数の突然変異を修復(例えば、修正)することによって達成することができる。この手法では、突然変異対立遺伝子を修正して、野生型の状態に戻す。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子における突然変異の修正が、野生型遺伝子活性を回復すると考えられる。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子における標的位置(例えば、標的ノックアウト位置または標的ノックダウン位置)を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、以下:(1)遺伝子のノックアウト:(a)遺伝子の初期コード領域近傍もしくは初期コード領域内の1つまたは複数のヌクレオチドの挿入もしくは欠失(例えば、NHEJ媒介性挿入もしくは欠失)、または(b)上記遺伝子の少なくとも一部を含むゲノム配列の欠失(例えば、NHEJ媒介性欠失)によって、あるいは(2)遺伝子のプロモーター領域の標的化により、酵素的に不活性なCas9(eiCas9)分子またはeiCas9融合タンパク質(例えば、転写レプレッサーに融合した)で媒介される遺伝子をノックダウンすることによって達成することができる。
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子における標的位置(例えば、標的ノックイン位置)を改変する方法が開示される。標的位置の改変は、例えば、遺伝子配列、例えば本明細書に記載の遺伝子(例えば、本明細書に記載の遺伝子の少なくとも一部をコードするcDNA)を、例えばHDRにより、ノックインすることによって達成することができる。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子配列のノックインが、野生型遺伝子活性を回復すると考えられる。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
本明細書には、遺伝子、例えば、本明細書に記載の遺伝子を活性化する方法が開示される。遺伝子の活性化は、遺伝子のプロモーター領域の標的化により、酵素的に不活性なCas9(eiCas9)分子またはeiCas9融合タンパク質(例えば、転写アクチベーターに融合した)により媒介され得る。理論による拘束は望まないが、一実施形態では、本明細書に記載の遺伝子の活性化が、野生型遺伝子活性を回復すると考えられる。本明細書に記載される方法は、あらゆる細胞型、例えば、本明細書に記載の細胞型で実施することができる。
1つまたは複数の同じ細胞における2つ以上の遺伝子の改変は、本明細書では「多重化」と呼ぶ。多重化は、1つまたは複数の同じ細胞における少なくとも2つの遺伝子の修飾を構成する。
gRNA分子は、この用語の本明細書の用法では、標的核酸へのgRNA分子/Cas9分子複合体の特異的ターゲティングまたはホーミングを促進する核酸である。gRNA分子は、単分子(単一のRNA分子を有する)(例えば、キメラもしくはモジュラー(2つ以上、典型的には2つの個別のRNA分子を含む)であってよい。本明細書で提供されるgRNA分子は、標的ドメインと完全もしくは部分的に相補的な核酸配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される標的化ドメインを含む。特定の実施形態では、gRNA分子は、例えば、第1の相補性ドメイン、結合ドメイン、第2の相補性ドメイン、隣接ドメイン、テールドメイン、および5’伸長ドメインをはじめとする1つまたは複数の追加ドメインをさらに含む。これらのドメインの各々については、以下にさらに詳しく述べる。gRNAについてさらなる詳細は、国際公開第2015/048577号パンフレット(その内容は、参照により本明細書に明示的に援用する)の「gRNA分子」と題するセクションIに記載されている。特定の実施形態では、gRNA分子中の1つまたは複数のドメインは、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.アウレウス(S.aureus)またはS.サーモフィルス(S.thermophilus)に由来する天然に存在する配列と同一の、またはそれと配列相同性を有するアミノ酸配列を含む。
標的化ドメイン(あるいは、ガイド配列または相補性領域と呼ばれることもある)は、標的核酸配列、例えば、標的遺伝子中の標的核酸配列と相補性な、または部分的に相補的な核酸配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。標的化ドメインの全部もしくは一部が相補的であるか、または部分的に相補的である、標的遺伝子、例えば、HBB中の核酸配列は、本明細書では標的ドメインと呼ぶ。特定の実施形態では、標的ドメインは、標的遺伝子、例えば、HBB内の標的位置を含む。他の実施形態では、標的位置は、標的ドメインの外部(すなわち、その上流もしくは下流)にある。特定の実施形態では、標的ドメインは、全体が標的遺伝子内に、例えば、コード領域、イントロン、またはエキソン内に位置する。他の実施形態では、標的ドメインの全部または一部は、標的遺伝子の外部、例えば、制御領域または非コード領域に位置する。
第1および第2の相補性(それぞれ、crRNA由来のヘアピン配列およびtracrRNA由来のヘアピン配列と呼ばれることもある)ドメインは、互いに完全または部分的に相補的である。特定の実施形態では、相補性の程度は、2つのドメインが少なくともいくつかの生理学的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分である。特定の実施形態では、第1および第2の相補性ドメイン同士の相補性の程度は、gRNAの他の特性と共に、Cas9分子の標的核酸への標的化を可能にする上で十分である。
サブドメインは、4〜9、例えば、4、5、6、7、8または9ヌクレオチド長である。
単分子またはキメラgRNA中では、連結ドメインは、第1および第2の相補性ドメインの間に配置されて、これらを結合する働きをする。特定の実施形態では、連結ドメインの一部は、crRNA由来領域から、別の部分は、tracrRNA由来領域からのものである。
一実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーgRNAは、5’伸長ドメイン、すなわち、第2の相補性ドメインの5’側に1つまたは複数の追加ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、5’伸長ドメインは、2〜10以上、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、または2〜4ヌクレオチド長であり、これらの実施形態のいくつかでは、5’伸長ドメインは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチド長以上である。
特定の実施形態では、隣接ドメインは、5〜20ヌクレオチド長、例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド長である。これらの実施形態のいくつかでは、隣接ドメインは、6+/−2、7+/−2、8+/−2、9+/−2、10+/−2、11+/−2、12+/−2、13+/−2、14+/−2、14+/−2、16+/−2、17+/−2、18+/−2、19+/−2、または20+/−2ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、隣接ドメインは、5〜20、7〜18、9〜16、または10〜14ヌクレオチド長である。
多様なテールドメインが、本明細書に開示されるgRNA分子での使用に好適である。
特定の実施形態では、テールドメインは、生体外または生体内転写法に関連する、3’末端のヌクレオチドを含む。gRNAの生体外転写のためにT7プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、DNAテンプレートの3’末端の前に存在する、任意のヌクレオチドであってもよい。生体内転写のためにU6プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、UUUUUU配列であってもよい。転写のためにH1プロモーターが使用される場合、これらのヌクレオチドは、UUUU配列であってもよい。交互の(alternate)pol−IIIプロモーターが利用される場合、これらのヌクレオチドは、例えば、pol−IIIプロモーターの終結シグナルに応じて様々な数のウラシル塩基であってもよいし、または交互の(alternate)塩基を含んでもよい。特定の実施形態では、隣接およびテールドメインは、一緒に、配列番号33、34、35、36、または38に記載される配列を含むか、これから構成されるか、またはほぼこれから構成される。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるgRNAは、5’[標的化ドメイン]−[第1の相補性ドメイン]−[連結ドメイン]−[第2の相補性ドメイン]−[隣接ドメイン]−[テールドメイン]−3’の構造を有し、
式中、
標的化ドメインは、コアドメインおよび任意選択的に二次ドメインを含み、10〜50ヌクレオチド長であり;
第1の相補性ドメインは、5〜25ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第1の相補性ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有し;
連結ドメインは、1〜5ヌクレオチド長であり;
第2の相補性ドメインは、5〜27ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照の第2の相補性ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有し;
隣接ドメインは、5〜20ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照隣接相補性ドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有し;
および
テールドメインは非存在であり、またはヌクレオチド配列は、1〜50ヌクレオチド長であり、特定の実施形態では、本明細書で開示される参照テールドメインと、少なくとも50、60、70、80、85、90、または95%の相同性を有する。
式中、
(a)隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドを含み;
(b)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドがあり;または
(c)第1の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドがある。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるモジュラーgRNAは、好ましくは、5’から3方向に以下;例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドを含む標的化ドメイン;第1の相補性ドメインを含む第1鎖と;好ましくは、5’から3方向に以下:任意選択的に5’伸長ドメイン;第2の相補性ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインを含む第2鎖とを含み、
式中、
(a)隣接およびテールドメインは、一緒になって、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドを含み;
(b)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドがあり;または
(c)第1の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’側に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドがある。
本明細書に記載のgRNAに使用するための標的ドメインを選択し、デザインし、検証する方法が本明細書に提供される。gRNAへの組み込みのための例示的な標的化ドメインもまた、本明細書で提供される。
1.
gRNA対は、DNA上で、PAM上が外側を向き、D10A Cas9ニッカーゼによる切断が、5’オーバーハングをもたらすような配向であるべきである。
2.
二重ニッカーゼ対による切断が、妥当な出現頻度で全介在配列の欠失をもたらすという仮説。しかし、二重ニッカーゼ対による切断はまた、gRNA分子の1つのみの部位にインデル変異をもたらし得る。候補ペア構成要素は、1つのgRNA分子の標的部位にインデル変異を引き起こす場合と比較して、全配列をいかに効率的に除去するかについて試験され得る。
多様な生物種のCas9分子が、本明細書に記載される方法および組成物で使用され得る。ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)およびスタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)Cas9分子が、本明細書の開示の多くの対象である一方で、本明細書で列挙されるその他の生物種からの、それに由来する、またはそのCas9タンパク質をベースとする、Cas9分子もまた使用され得る。これらは、例えば、アシドボラクス・アベナエ(Acidovorax avenae)、アクチノバチルス・プルロニューモニアエ(Actinobacillus pleuropneumoniae)、アクチノバチルス・サクシノゲネス(Actinobacillus succinogenes)、アクチノバチルス・スイス(Actinobacillus suis)、アクチノミセス属(Actinomyces)種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス(cycliphilus denitrificans)、アミノモナス・パウシボランス(Aminomonas paucivorans)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・スミシイ(Bacillus smithii)、バチルス・チューリンギエンシス(Bacillus thuringiensis)、バクテロイデス属(Bacteroides)種、ブラストピレルラ・マリナ(Blastopirellula marina)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)種、ブレビバチルス・ラテロスポラス(Brevibacillus laterosporus)、カンピロバクター・コリ(Campylobacter coli)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、カンピロバクター・ラリ(Campylobacter lari)、カンジダツス・プニセイスピリルム(Candidatus Puniceispirillum)、クロストリジウム・セルロリチカム(Clostridium cellulolyticum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コリネバクテリウム・アクコレンス(Corynebacterium accolens)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diphtheria)、コリネバクテリウム・マトルコチイ(Corynebacterium matruchotii)、ディノロセオバクター・シバエ(Dinoroseobacter shibae)、ユウバクテリウム・ドリクム(Eubacterium dolichum)、ガンマプロテオバクテリア綱(gammaproteobacterium)、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス(Gluconacetobacter diazotrophicus)、ヘモフィルス・パラインフルエンザエ(Haemophilus parainfluenzae)、ヘモフィルス・スプトラム(Haemophilus sputorum)、ヘリコバクター・カナデンシス(Helicobacter canadensis)、ヘリコバクター・シナエディ(Helicobacter cinaedi)、ヘリコバクター・ムステラエ(Helicobacter mustelae)、イリオバクター・ポリトロパス(Ilyobacter polytropus)、キンゲラ・キンガエ(Kingella kingae)、ラクトバチルス・クリスパータス(Lactobacillus crispatus)、リステリア・イバノビイ(Listeria ivanovii)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、リステリア科(Listeriaceae)細菌、メチロシスチス科(Methylocystis)種、メチロシナス・トリコスポリウム(Methylosinus trichosporium)、モビルンカス・ムリエリス(Mobiluncus mulieris)、ナイセリア・バシリフォルミス(Neisseria bacilliformis)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、ナイセリア・フラベッセンス(Neisseria flavescens)、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア・メニンジチディス(Neisseria meningitidis)、ナイセリア属(Neisseria)種、ナイセリア・ワズワーシイ(Neisseria wadsworthii)、ニトロソモナス属(Nitrosomonas)種、パルビバクラム・ラバメンチボランス(Parvibaculum lavamentivorans)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス(Phascolarctobacterium succinatutens)、ラルストニア・シジジイ(Ralstonia syzygii)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、ロドブラム属(Rhodovulum)種、シモンシエラ・ムエレリ(Simonsiella muelleri)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)種、スポロラクトバチルス・ビネア(Sporolactobacillus vineae)、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス(Staphylococcus lugdunensis)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)種、サブドリグラヌルム属(Subdoligranulum)種、チストレラ・モビリス(Tistrella mobilis)、トレポネーマ属(Treponema)種、またはベルミネフロバクター・エイセニア(Verminephrobacter eiseniae)からのCas9分子を含む。例示的Cas9オーソログのアミノ酸配列は、配列番号304〜386に記載されている。
結晶構造は、2つの異なる天然細菌Cas9分子(Jinek et al.2014)について、およびガイドRNAがあるS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9(例えば、crRNAとtracrRNAの合成融合物)(Nishimasu et al.2014;およびAnders 2014)について評価された。
特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、HNH様ドメインおよびRuvC様ドメインを含み、これらの特定の実施形態では、切断活性は、RuvC様ドメインおよびHNH様ドメインに依存する。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、RuvC様ドメインおよびHNH様ドメインのドメインの1つまたは複数を含み得る。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、例えば、以下に記載されるRuvC様ドメイン、および/または例えば、以下に記載されるHNH様ドメインなどのHNH様ドメインなどのRuvC様ドメインを含む。
特定の実施形態では、RuvC様ドメインは、例えば、標的核酸分子の非相補鎖などの一本鎖を切断する。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、2つ以上のRuvC様ドメイン(例えば、1、2、3つ以上のRuvC様ドメイン)を含み得る。特定の実施形態では、RuvC様ドメインは、少なくとも5、6、7、8アミノ酸長であるが、20、19、18、17、16または15アミノ酸長以下である。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、例えば、約15アミノ酸長などの約10〜20個のアミノ酸のN末端RuvC様ドメインを含む。
いくつかの天然Cas9分子は、2つ以上のRuvC様ドメインを含み、切断はN末端RuvC様ドメインに依存する。したがって、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、N末端RuvC様ドメインを含み得る。代表的なN末端RuvC様ドメインは、以下に記載される。
D−X1−G−X2−X3−X4−X5−G−X6−X7−X8−X9(配列番号8)
のアミノ酸配列を含む、N末端RuvC様ドメインを含み、
式中、
X1は、I、V、M、L、およびTから選択され(例えば、I、V、およびLから選択され);
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およびIから選択され);
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択され;
X4は、S、Y、N、およびF(例えば、S)から選択され;
X5は、V、I、L、C、T、およびFから選択され(例えば、V、I、およびLから選択され);
X6は、W、F、V、Y、S、およびL(例えば、W)から選択され;
X7は、A、S、C、V、およびGから選択され(例えば、AおよびSから選択され);
X8は、V、I、L、A、M、およびHから選択され(例えば、V、I、M、およびLから選択され);
X9は、任意のアミノ酸から選択され、または不在である(例えば、T、V、I、L、Δ、F、S、A、Y、M、およびRから選択され、または、例えば、T、V、I、L、およびΔから選択される)。
D−X1−G−X2−X3−S−X5−G−X6−X7−X8−X9(配列番号9)
のアミノ酸配列を含む、N末端RuvC様ドメインを含み、
式中、
X1は、I、V、M、LおよびTから選択され(例えば、I、V、およびLから選択され);
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およびIから選択され);
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択され;
X5は、V、I、L、C、T、およびFから選択され(例えば、V、IおよびLから選択され);
X6は、W、F、V、Y、SおよびL(例えば、W)から選択され;
X7は、A、S、C、VおよびGから選択され(例えば、AおよびSから選択され);
X8は、V、I、L、A、MおよびHから選択され(例えば、V、I、MおよびLから選択され);
X9は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在である(例えば、T、V、I、L、Δ、F、S、A、Y、MおよびRから選択されるか、または例えば、T、V、I、L、およびΔから選択される)。
D−I−G−X2−X3−S−V−G−W−A−X8−X9(配列番号10)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
X2は、T、I、V、S、N、Y、E、およびLから選択され(例えば、T、V、およびIから選択され);
X3は、N、S、G、A、D、T、R、M、およびF(例えば、AまたはN)から選択され;
X8は、V、I、L、A、MおよびHから選択され(例えば、V、I、MおよびLから選択され);
X9は、任意のアミノ酸から選択されるか、または非存在であり(例えば、T、V、I、L、Δ、F、S、A、Y、MおよびRから選択されるか、または例えば、T、V、I、L、およびΔから選択される)。
D−I−G−T−N−S−V−G−W−A−V−X(配列番号11)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
Xは、非極性アルキルアミノ酸またはヒドロキシルアミノ酸であり、例えば、Xは、V、I、L、およびTから選択される。
N末端RuvC様ドメインに加えて、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、1つまたは複数の追加的RuvC様ドメインを含み得る。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、2つの追加的RuvC様ドメインを含み得る。好ましくは、追加的RuvC様ドメインは、例えば、15未満のアミノ酸長、例えば、5〜10アミノ酸長、例えば、8アミノ酸長などの少なくとも5アミノ酸長である。
I−X1−X2−E−X3−A−R−E(配列番号12)
のアミノ酸配列を含んでよく、
式中、
X1は、VまたはHであり;
X2は、I、LまたはV(例えば、IまたはV)であり;
X3は、MまたはTである。
I−V−X2−E−M−A−R−E(配列番号13)
のアミノ酸配列を含み、
式中、
X2は、I、LまたはV(例えば、IまたはV)である。
H−H−A−X1−D−A−X2−X3(配列番号14)のアミノ酸配列を含んでもよく、
式中、
X1は、HまたはLであり;
X2は、RまたはVであり;
X3は、EまたはVである。
H−H−A−H−D−A−Y−L(配列番号15)
のアミノ酸配列を含む。
式中、
X1’は、KおよびPから選択され、
X2’はV、L、I、およびF(例えばV、I、およびL)から選択され;
X3’は、G、A、およびS(例えば、G)から選択され;
X4’はL、I、V、およびF(例えば、L)から選択され;
X9’は、D、E、N、およびQから選択され;
Zは、例えば、上述されるような、例えば、5〜12アミノ酸を有するN末端RuvC様ドメインである。
特定の実施形態では、HNH様ドメインは、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖などの一本鎖相補的ドメインを切断する。特定の実施形態では、HNH様ドメインは、少なくとも15、20、または25アミノ酸長であるが、40、35または30以下のアミノ酸長であり、例えば、20〜35アミノ酸長、例えば、25〜30アミノ酸長である。代表的なHNH様ドメインは、以下に記載される。
式中、
X1は、D、E、Q、およびN(例えば、DおよびE)から選択され;
X2は、L、I、R、Q、V、M、およびKから選択され;
X3は、DおよびEから選択され;
X4は、I、V、T、A、およびL(例えば、A、I、およびV)から選択され;
X5は、V、Y、I、L、F、およびW(例えば、V、I、およびL)から選択され;
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、F、およびWから選択され;
X7は、S、A、D、T、およびK(例えば、SおよびA)から選択され;
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から選択され;
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され;
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され;
X11は、D、S、N、R、L、およびT(例えば、D)から選択され;
X12は、D、N、およびSから選択され;
X13は、S、A、T、G、およびR(例えば、S)から選択され;
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、およびF)から選択され;
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択され;
X16は、K、L、R、M、T、およびF(例えば、L、R、およびK)から選択され;
X17は、V、L、I、A、およびTから選択され;
X18は、L、I、V、およびA(例えば、LおよびI)から選択され;
X19は、T、V、C、E、S、およびA(例えば、TおよびV)から選択され;
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびAから選択され;
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され;
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され;
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから選択される。
X1−X2−X3−H−X4−X5−P−X6−S−X8−X9−X10−D−D−S−X14−X15−N−K−V−L−X19−X20−X21−X22−X23−N(配列番号18)
のアミノ酸配列を含むHNH様ドメインを含み、
式中、
X1は、DおよびEから選択され;
X2は、L、I、R、Q、V、M、およびKから選択され;
X3は、DおよびEから選択され;
X4は、I、V、T、A、およびL(例えば、A、I、およびV)から選択され;
X5は、V、Y、I、L、F、およびW(例えば、V、I、およびL)から選択され;
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、F、およびWから選択され;
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から選択され;
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され;
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され;
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、およびF)から選択され;
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択され;
X19は、T、V、C、E、S、およびA(例えば、TおよびV)から選択され;
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびAから選択され;
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され;
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され;
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから選択される。
X1−V−X3−H−I−V−P−X6−S−X8−X9−X10−D−D−S−X14−X15−N−K−V−L−T−X20−X21−X22−X23−N(配列番号19)のアミノ酸配列を含むHNH様ドメインを含む。
式中、
X1は、DおよびEから選択され;
X3は、DおよびEから選択され;
X6は、Q、H、R、K、Y、I、L、およびWから選択され;
X8は、F、L、V、K、Y、M、I、R、A、E、D、およびQ(例えば、F)から選択され;
X9は、L、R、T、I、V、S、C、Y、K、F、およびGから選択され;
X10は、K、Q、Y、T、F、L、W、M、A、E、G、およびSから選択され;
X14は、I、L、F、S、R、Y、Q、W、D、K、およびH(例えば、I、L、およびF)から選択され;
X15は、D、S、I、N、E、A、H、F、L、Q、M、G、Y、およびVから選択され;
X20は、R、F、T、W、E、L、N、C、K、V、S、Q、I、Y、H、およびAから選択され;
X21は、S、P、R、K、N、A、H、Q、G、およびLから選択され;
X22は、D、G、T、N、S、K、A、I、E、L、Q、R、およびYから選択され;
X23は、K、V、A、E、Y、I、C、L、S、T、G、K、M、D、およびFから選択される。
のアミノ酸配列を有するHNH様ドメインを含む。
式中、
X2は、IおよびVから選択され;
X5は、IおよびVから選択され;
X7は、AおよびSから選択され;
X9は、IおよびLから選択され;
X10は、KおよびTから選択され;
X12は、DおよびNから選択され;
X16は、R、K、およびLから選択され;X19は、TおよびVから選択され;
X20は、SおよびRから選択され;
X22は、K、D、およびAから選択され;
X23は、E、K、G、およびNから選択される(例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、本明細書に記載されるようなHNH様ドメインを含み得る)。
L−Y−Y−L−Q−N−G−X1’−D−M−Y−X2’−X3’−X4’−X5’−L−D−I−X6’−X7’−L−S−X8’−Y−Z−N−R−X9’−K−X10’−D−X11’−V−P(配列番号21)
のアミノ酸配列を含む。
式中、
X1’は、KおよびRから選択され;
X2’は、VおよびTから選択され;
X3’は、GおよびDから選択され;
X4’は、E、Q、およびDから選択され;
X5’は、EおよびDから選択され;
X6’は、D、N、およびHから選択され;
X7’は、Y、R、およびNから選択され;
X8’は、Q、D、およびNから選択され;X9’は、GおよびEから選択され;
X10’は、SおよびGから選択され;
X11’は、DおよびNから選択され;および
Zは、例えば、上述されるようなHNH様ドメインである。
特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、標的核酸分子を切断する能力がある。典型的に野性型Cas9分子は、標的核酸分子の双方の鎖を切断する。Cas9分子およびCas9ポリペプチドを遺伝子操作して、ヌクレアーゼ切断(またはその他の性質)を改変して、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を切断する能力を欠く、Cas9分子またはCas9ポリペプチドを提供し得る。標的核酸分子を切断する能力があるCas9分子またはCas9ポリペプチドは、本明細書でeaCas9分子(酵素的に活性なCas9)またはeaCas9ポリペプチドと称される。
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力;
特定の実施形態では2つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力;
エンドヌクレアーゼ活性;
エキソヌクレアーゼ活性;および
ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力。
gRNA分子と相互作用し得るCas9分子またはCas9ポリペプチドは、gRNA分子と協調して、標的ドメイン、および特定の実施形態では、aPAM配列を含む部位に局在する。
配列番号1〜4と、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%の相同性を有し;
比較すると、2、5、10、15、20、30、または40%以下のアミノ酸残基が異なり;
少なくとも1、2、5、10または20個のアミノ酸であるが、100、80、70、60、50、40または30個以下のアミノ酸が異なり;または
本明細書に記載される任意のCas9分子配列、または例えば、本明細書で列挙され、または生物種に由来するCas9分子などの天然Cas9分子配列と同一であるアミノ酸配列を含む(例えば、配列番号1〜4あるいはChylinski 2013またはHou 2013に記載される)。一実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、以下の機能の1つまたは複数を含む:ニッカーゼ活性;二本鎖切断活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;またはgRNA分子と一緒に、標的核酸に局在する能力。
領域1(残基1〜180、または領域1の場合は残基120〜180)
領域2(残基360〜480);
領域3(残基660〜720);
領域4(残基817〜900);および
領域5(残基900〜960)。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1〜180と、少なくとも1、2、5、10または20個のアミノ酸であるが、90、80、70、60、50、40または30個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはリステリア・イノキュア(Listeria innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸1〜180と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120〜180と55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し;
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120〜180と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸であるが、35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸120〜180と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360〜480と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し;
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360〜480と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸であるが、35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸360〜480と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660〜720と55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し;
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660〜720と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸であるが、35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸660〜720と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817〜900と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し;
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817〜900と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸であるが、35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸817〜900と同一である。
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900〜960と50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の相同性を有し;
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)または、L.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900〜960と、少なくとも1、2、または5個のアミノ酸であるが、35、30、25、20または10個以下のアミノ酸が異なり;または
S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)またはL.イノキュア(L.innocua)のCas9のアミノ酸配列のアミノ酸900〜960と同一である。
本明細書に記載されるCas9分子およびCas9ポリペプチドは、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性(例えば、エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性);ヘリカーゼ活性;gRNA分子と機能的に結合する能力;および核酸上の部位を標的化する(またはそれに局在する)能力(例えば、PAM認識および特異性)をはじめとするいくつかの性質のいずれかを有し得る。特定の実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、これらの性質の全てまたは一部を含み得る。典型的な実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、gRNA分子と相互作用し、gRNA分子と協調して核酸中の部位に局在する能力を有する。例えば、PAM特異性、切断活性、またはヘリカーゼ活性などのその他機能は、Cas9分子およびCas9ポリペプチド中でより幅広く変動し得る。
一実施形態では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然Cas9分子と異なる切断特性を含み、例えば、それは最も近い相同性を有する天然Cas9分子と異なる。例えば、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9分子などの天然Cas9分子と、例えば、次のように異なり得る:例えば、天然Cas9分子(例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)のCas9分子)と比較して二本鎖核酸切断(エンドヌクレアーゼおよび/またはエキソヌクレアーゼ活性)の低下または増大を調節するその能力;例えば、天然Cas9分子(例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)のCas9分子)と比較して、核酸分子の非相補鎖または核酸分子の相補鎖などの核酸の一本鎖切断(ニッカーゼ活性)の低下または増大を調節するその能力;または例えば、二本鎖または一本鎖核酸分子などの核酸分子を切断する能力が、除去され得る。
天然起源Cas9分子は、例えば、S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、S.ミュータンス(S.mutans)、およびS.アウレウス(S.aureus)について、上に記載されるPAM認識配列などの特定のPAM配列を認識し得る。
本明細書に記載される遺伝子操作Cas9分子および遺伝子操作Cas9ポリペプチドとしては、例えば、本質的に天然立体配座、Cas9ヌクレアーゼ活性、および/または標的核酸分子認識などの所望のCas9特性をなおも保つ一方で、分子サイズを低下させる欠失を含む、Cas9分子またはCas9ポリペプチドが挙げられる。本明細書で提供されるのは、1つまたは複数の欠失および任意選択的に1つまたは複数のリンカーを含む、Cas9分子またはCas9ポリペプチドであり、リンカーは、欠失側面に位置するアミノ酸残基間に配置される。参照Cas9分子中の適切な欠失を同定する方法、欠失およびリンカーがあるCas9分子を生成する方法、およびこのようなCas9分子を使用する方法は、この文献を検討することにより当業者には明らかであろう。
ニッカーゼ活性、すなわち、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖などの一本鎖を切断する能力;二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の双方の鎖を切断して、二本鎖切断を生成する能力で、一実施形態では、2つのニッカーゼ活性の存在である;エンドヌクレアーゼ活性;エキソヌクレアーゼ活性;ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造を巻き戻す能力;ならびに例えば、標的核酸またはgRNA分子などの核酸分子の認識活性。
Cas9分子の欠失に適する領域は、多様な方法によって同定され得る。様々な細菌種に由来する天然オルソロガスCas9分子は、S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9の結晶構造にモデル化され得て(Nishimasu 2014)、タンパク質の三次元立体構造と比較して、選択されたCas9オルソログ全域の保存レベルが調べられる。例えば、標的核酸分子および/またはgRNAとの境界面などのCas9活性に関与する領域から空間的に遠位に位置する、低保存または非保存領域は、Cas9活性に実質的に影響を及ぼさずまたは低下させない欠失の候補領域またはドメインに相当する。
例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドなどのCas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする核酸は、本明細書で提供される。代表的Cas9分子をコードする核酸またはCas9ポリペプチドは、上述されている(例えば、Cong 2013;Wang 2013;Mali 2013;Jinek 2012を参照されたい)。
本明細書で開示される発明を実施するために、様々なタイプのCas分子またはCasポリペプチドが使用され得る。いくつかの実施形態では、II型CasシステムのCas分子が使用される。その他の実施形態では、その他のCasシステムのCas分子が使用される。例えば、I型またはIII型Cas分子が使用されてもよい。代表的なCas分子(およびCasシステム)は、上述されている(例えば、Haft 2005;Makarova 2011を参照されたい)。代表的なCas分子(およびCasシステム)は、表5にもまた示される。
候補Cas9分子、候補gRNA分子、候補Cas9分子/gRNA分子複合体は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるように評価され得る。例えば、Cas9分子のエンドヌクレアーゼ活性を評価するための例示的な方法は、以前記載されている(Jinek 2012)。本明細書に記載される各方法は、単独で、または候補分子を評価するための1つまたは複数の技術と組み合わせて使用してよい。本明細書に開示される技術は、限定はしないが、Cas9分子/gRNA分子複合体の安定性を決定する方法、安定なCas9分子/gRNA分子複合体を促進する条件を決定する方法、安定なCas9分子/gRNA分子複合体をスクリーニングする方法、安定なCas9分子/gRNA分子複合体を形成するための最適gRNAを同定する方法、ならびに対象に投与するためのCas9/gRNA複合体を選択する方法をはじめとする、様々な方法に使用され得る。
Cas9分子/gRNA分子複合体が、標的核酸を結合および切断する能力は、プラスミド切断アッセイで評価され得る。このアッセイでは、合成または生体外転写gRNA分子が、95℃に加熱して緩慢に室温に冷却することで、反応に先だってプレアニールされる。天然または制限消化直線化プラスミドDNA(300ng(約8nM))が、10mMのMgCl2存在下または不在下において、Cas9プラスミド切断緩衝液(20mMのHEPES pH7.5、150mMのKCl、0.5mMのDTT、0.1mMのEDTA)中の精製Cas9タンパク質分子(50〜500nM)およびgRNA(50〜500nM、1:1)と共に、37℃で60分間インキュベートされる。反応は、5×DNAローディングバッファー(30%グリセロール、1.2%SDS、250mMのEDTA)によって停止され、0.8または1%アガロースゲル電気泳動法によって分離され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。得られた分解産物は、Cas9分子が、双方のDNA鎖を切断するか、または二本鎖の1本のみを切断するかどうかを示す。例えば、直鎖DNA生成物は、双方のDNA鎖の切断を示す。ニックの入った開環状生成物は、二本鎖の1本のみが切断されていることを示す。
Cas9分子の標的DNAへの結合を評価する代表的な方法は、上述されている(Jinek 2012)。
Cas9−gRNAリボ核タンパク質(RNP)複合体の熱安定性は、示差走査型蛍光定量法(DSF)およびその他の技術によって検知することができる。タンパク質の熱安定性は、例えば、gRNAなどの結合RNA分子の添加などの好ましい条件下で増大され得る。従って、Cas9/gRNA複合体の熱安定性に関する情報は、複合体が安定しているかどうかを決定する上で有用である。
DSFは、タンパク質の熱安定性を測定するために用いることができる技術である。このアッセイは、いくつかの方法で適用することができる。例示的なプロトコルとして、限定はしないが、RNP形成のための所望の溶液条件を判定するプロトコル(アッセイ1、以下を参照)、gRNA:Cas9タンパク質の最良の化学量論比を試験するプロトコル(アッセイ2、以下を参照)、Cas9分子、例えば、野生型もしくは突然変異型Cas9分子について有効なgRNA分子をスクリーニングするプロトコル(アッセイ3、以下を参照)、ならびに標的DNAの存在下でRNP形成を調べるプロトコル(アッセイ4)が挙げられる。
RNP複合体を形成するための最良の溶液を判定するために、Cas9の2μM水溶液と10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S−6650)が384ウェルプレート内に分注される。次に、様々なpHの溶液中で希釈された等モル量のgRNA、および塩が添加される。室温で10分間インキュベートし、2000rpmで遠心分離してあらゆる気泡を除去いた後、 Bio−Rad CFX Manager ソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃の温度増大で20℃から90℃への勾配が実行される。
第2のアッセイは、上記アッセイ1からの最適緩衝液中で、様々な濃度のgRNA分子と2uM Cas9を混合して、384ウェルプレート内で、室温で10分間インキュベートすることを含む。等容積の最適緩衝液と10×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S−6650)が添加され、プレートはMicroseal(登録商標)B粘着剤(MSB−1001)で密封される。あらゆる気泡を除去するための2000rpmでの遠心分離に続いて、Bio−Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃の温度増大で20℃から90℃への勾配が実行される。
第3のアッセイでは、対象Cas9分子(例えば、Cas9タンパク質、例えば、Cas9変異タンパク質)を精製する。変異gRNA分子のライブラリーを合成し、20μMの濃度まで再懸濁させる。5×SYPRO Orange(登録商標)(Life Techonologiesカタログ番号S−6650)の存在下で予定緩衝液中に各々1μMの最終濃度で、Cas9分子をgRNA分子と一緒にインキュベートする。室温で10分間インキュベートしてから、2000rpmで2分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Bio−Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃ずつ昇温しながら、20℃から90℃への勾配を実行する。
第4のアッセイでは、次のサンプル:Cas9タンパク質単独、Cas9タンパク質とgRNA、Cas9タンパク質とgRNAおよび標的DNA、ならびにCas9タンパク質と標的DNAを用いて、DSF実験を実施する。構成要素を混合する順序は、反応溶液、Cas9タンパク質、gRNA、DNA、およびSYPRO Orangeの順である。反応溶液は、MgCl2の非存在または存在下で、10mM HEPES pH7.5、100mM NaClを含有する。2000rpmで2分間の遠心分離により気泡を全て除去した後、Bio−Rad CFX Managerソフトウェアと共に、Bio−Rad CFX384(商標)Real−Time System C1000 Touch(商標)サーマルサイクラーを使用して、10秒毎に1℃ずつ昇温しながら、20℃から90℃への勾配を実行する。
標的遺伝子の突然変異は、本明細書で考察されるアプローチの1つを用いて修正することができる。一実施形態では、標的遺伝子中の突然変異は、細胞外供給テンプレート核酸(セクションV.1を参照)を用いた相同組換え修復(HDR)により修正され、これは、本明細書で「遺伝子修正」と呼ばれる。別の実施形態では、標的遺伝子中の突然変異は、本明細書で遺伝子修正と呼ばれる、細胞外供給テンプレート核酸(セクションV.1を参照)を用いずに、相同組換え修復(HDR)により修正される。
本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、HDR媒介性配列改変を用いて、ゲノム中の1または複数個のヌクレオチドの配列を改変および/または修正(例えば、修復または編集)する。理論による拘束は望まないが、標的遺伝子内の標的配列のHDR媒介性改変は、遺伝子修正と呼ばれるプロセスにおいて、細胞外供給供与体テンプレートまたはテンプレート核酸を用いるHDRにより起こると考えられる。例えば、供与体テンプレートまたはテンプレート核酸は、標的配列の改変を可能にする。プラスミド供与体は、相同組換えのためのテンプレートとして使用できると考えられる。さらに、一本鎖供与体テンプレートは、標的配列と供与体テンプレートとの間のHDRの代替(alternate)方法(例えば、一本鎖アニーリング)による標的配列の改変のためのテンプレートとして使用できることも考えられる。供与体テンプレートを用いて実施される標的配列の改変は、Cas9分子による切断に依存する。Cas9による切断は、二本鎖切断または2つの一本鎖切断を含み得る。
鎖の一方における二本鎖切断または一本鎖切断は、改変が所望の領域内で生じる、例えば、突然変異の修正が起こるように、標的位置に十分接近させるべきである。特定の実施形態では、距離は、50、100、200、300、350もしくは400ヌクレオチド以下である。理論による拘束は望まないが、特定の実施形態では、標的位置が、末端切除中にエキソヌクレアーゼ媒介性除去を受ける領域内にあるように、切除は標的位置に十分接近させるべきであると考えられる。標的位置と切断の間の距離が大きすぎると、改変しようとする配列が末端切除に包含されず、従って、改変されない場合がある。というのは、供与体配列(細胞外供給供与体配列または内在性ゲノム供与体配列のいずれも)は、いくつかの実施形態では、末端切除領域内の配列を改変するためだけに使用されるからである。
特定の実施形態では、二本鎖切断は、下で考察されるように、第2のgRNA分子によって配置される追加的二本鎖切断を伴い得る。
相同性アームは、例えば、切除された一本鎖オーバーハングが、供与体テンプレート内の相補的領域を見出すことができるように、末端切除が起こり得る領域と少なくとも同じくらい遠くまで延在すべきである。その全長は、プラスミドサイズまたはウイルスパッケージング限界などのパラメーターによって限定され得る。一実施形態では、相同性アームは、反復エレメント、例えば、Alu反復配列またはLINE反復配列中に延在しない。
[5’相同性アーム]−[置換配列]−[3’相同性アーム]
を含む。
好ましい実施形態では、また、遺伝子変換を介してDNA修復を増大するために、テンプレート核酸は、内在性相同領域である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、二本鎖である。他の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖である。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、一本鎖部分と二本鎖部分を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックおよび/または置換配列の両側に、約50〜100、例えば、55〜95、60〜90、65〜85、または70〜80塩基対の相同性を含む。特定の実施形態では、テンプレート核酸は、ニックもしくは置換配列の5’側、ニックもしくは置換配列の3’側、またはニックもしくは置換配列の5’および3’側の双方に約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100bpの相同性を含む。
相同性アームを含む。
本明細書では、Cas9は、恐らく相同組換え修復(例えば、相同組換え)前または後のいずれかで供与体構築物を切断し、これにより、対象染色体遺伝子座で、考えられる非相同末端結合事象、さらにはDNA配列突然変異を引き起こすと考えられる。従って、Cas9媒介性相同組換え修復前および/または後の供与体配列の切断を回避するために、いくつかの実施形態では、サイレント突然変異が導入された代替バージョンの供与体配列を使用してもよい。これらのサイレント突然変異は、Cas9結合および切断を破壊するが、修復遺伝子のアミノ酸配列は破壊しない。
本明細書に提供される方法の特定の実施形態では、NHEJ媒介性欠失を使用して、標的遺伝子の全部または一部を欠失させる。本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ誘導NHEJはまた、対象遺伝子中の配列を除去する(例えば、欠失させる)のにも使用され得る。
NHEJ媒介インデルを誘導する目的で、gRNAおよびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を生じる特定の実施形態では、例えば、単分子(またはキメラ)またはモジュラーgRNA分子などのgRNAが、1つの二本鎖切断を標的位置のヌクレオチド近傍に配置させるように構成される。一実施形態では、切断部位は、標的位置から0〜30bp(例えば、標的位置から30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1bp未満)離れている。
遺伝子をDNAレベルで変異させることで発現を恒久的に排除するCRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトとは異なり、CRISPR/Casノックダウンは、人工転写因子の使用を通じて、一時的な遺伝子発現低下を可能にする。Cas9分子の双方のDNA切断ドメインで重要な残基を変異させることは(例えば、D10AおよびH840A変異)、触媒能のないCas9(本明細書において「eiCas9」と称され、死滅Cas9またはdCas9分子としてもまた知られている)の生成をもたらす。eiCas9はgRNAと複合体形成して、gRNAの標的化ドメインによって特定化されたDNA配列に局在するが、それは標的DNAを切断しない。eias9と、例えば、転写抑制ドメインなどのエフェクタードメインとの融合は、gRNAによって特定化された任意のDNA部位へのエフェクターの動員を可能にする。eiCas9それ自体は、コード配列中の早期領域に動員された場合に、転写をブロックすることができるが、より堅固な抑制は、転写抑制ドメイン(例えばKRAB、SIDまたはERD)をeiCas9に融合させて(本明細書では「Cas9−受容体」と呼ばれる)、転写抑制ドメインを、標的ノックダウン位置、例えば、開始コドンの配列3’の1000塩基対または遺伝子の開始コドンのプロモーター領域5’の500塩基対内に動員することによって達成され得る。プロモーターのDNAseI高感受性領域(DHS)は、eiCas9タンパク質にアクセスできる可能性が高く、また内在性転写因子のための部位を保有する可能性も高いので、これらの領域を標的化することで、恐らくより効率的な遺伝子抑制または活性化がもたらされ得る。特に遺伝子抑制については、内在性転写因子の結合部位をブロックすることで、遺伝子発現の下方制御を助けることが、本明細書で検討される。特定の実施形態では、1つまたは複数の内在性転写因子の結合をブロックするために、1つまたは複数のeiCas9分子を用いてもよい。いくつかの実施形態では、eiCas9分子をクロマチン改変タンパク質に融合させてもよい。改変クロマチン状態は、標的遺伝子の発現低下をもたらし得る。クロマチン状態を改変するために、1つまたは複数のクロマチン改変タンパク質に融合した1つまたは複数のeiCas9分子を用いてもよい。
一本鎖アニーリング(SSA)は、標的核酸中に存在する2つの反復配列間の二本鎖切断を修復する、別のDNA修復プロセスである。SSA経路によって使用される反復配列は、一般に30ヌクレオチド長を超える。切断末端に切除が生じて、標的核酸の双方の鎖上の反復配列が示される。切除後、反復配列を含有する一本鎖オーバーハングをRPAタンパク質で被覆して、反復配列が、例えばそれ自体などと不適切にアニーリングするのを妨げる。RAD52は、オーバーハング上の反復配列のそれぞれと結合し、配列を整列させて、相補的反復配列のアニーリングを可能にする。アニーリング後、オーバーハングの一本鎖フラップは切断される。新しいDNA合成があらゆるギャップを充填し、ライゲーションがDNA二本鎖を回復させる。プロセッシングの結果として、2つの反復間のDNA配列が欠失する。欠失の長さは、使用される2つの反復の位置、および切除の経路または処理能力をはじめとする、多くの要素に左右され得る。
SSBR(一本鎖切断修復)
ゲノム内の一本鎖切断(SSB)は、上で論じたDSB修復機序とは別個の機序であるSSBR経路によって修復される。SSBR経路は、SSB検出、DNA末端プロセッシング、DNAギャップ充填、およびDNAライゲーションの4つの主要な段階を有する。より詳細な説明は、Caldecott 2008に記載され、概要は本明細書に記載される。
細胞は、MMR、BER、およびNERの3つの切除修復経路を包含する:切除修復経路は、典型的に、DNAの1本鎖上の損傷を認識して、次にエキソ/エンドヌクレアーゼが損傷を除去し、DNAポリメラーゼによって順次充填され、最終的にリガーゼによってシールされる、1〜30ヌクレオチドのギャップを残すという共通の特徴を有する。より詳細な全体像は、Li 2008に記載され、概要は、本明細書で提供される。
塩基切除修復(BER)経路は、細胞周期全体を通じて活性であり;それは、ゲノムからの小型非らせん歪み塩基損傷を除去する主な原因となる。対照的に、関連ヌクレオチド切除修復経路(次のセクションで考察される)は、嵩高いらせん歪み損傷を修復する。より詳細な説明は、Caldecott 2008に記載され、概要は本明細書に記載される。
ヌクレオチド切除修復(NER)は、DNAから嵩高いらせん歪み損傷を除去する重要な切除機序である。NERに関する加的な詳細は、Marteijn et al.2014にあり、概要は本明細書に記載される。広域経路NERは、2つのより小型の経路である、全ゲノムNER(GG−NER)と、転写と共役する修復NER(TC−NER)とを包含する。GG−NERおよびTC−NERは、DNA損傷を認識するために異なる要素を使用する。しかし、それらは、損傷切開、修復、およびライゲーションのための同一機構を利用する。
ICL修復経路と称される専用経路が、鎖間架橋を修復する。異なるDNA鎖中の塩基間の鎖間架橋、または共有結合架橋が、複製または転写中に起こり得る。ICL修復は、具体的には、核酸分解活性、損傷乗り越え合成(TLS)、およびHDRである、複数の修復プロセスの協調を伴う。ヌクレアーゼが、架橋塩基のどちらかの側のICLを切除するように動員される一方で、TLSおよびHDRは、協調して切断された鎖を修復する。ICL修復は、以下の要素を伴い得る:例えば、XPFおよびRAD51Cなどのエンドヌクレアーゼ、RAD51などのエンドヌクレアーゼ、例えば、DNAポリメラーゼζおよびRev1などの損傷乗り越えポリメラーゼ、および例えば、FancJなどのファンコーニ貧血(FA)タンパク質。
哺乳類には、いくつかのその他のDNA修復経路が存在する。
本明細書に記載されるようなgRNA分子を二本鎖切断または一本鎖切断を生成するCas9分子と共に使用して、例えば、標的位置または標的遺伝子シグネチャなどの標的核酸の配列が改変され得る。これらの方法で有用なgRNA分子は、以下に記載される。
a)それは、例えば、二本鎖切断を生じるCas9分子の標的化に際して、二本鎖切断が、(i)標的位置の50、100、150、200、250、300、350,400、450、または500ヌクレオチド以内にあるように、または(ii)十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように配置され得る;
b)それは、例えば、(i)16、(ii)17、(iii)18、(iv)19、(v)20、(vi)21、(vii)22、(viii)23、(ix)24、(x)25、または(xi)26ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも16ヌクレオチドの標的化ドメインを有する;
(c)(i)隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)、テールおよび隣接ドメインからの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む;
(c)(ii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)gRNAの対応する配列からの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある;
(c)(iii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)gRNAの対応する配列からの少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチドなどの第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある;
(c)(iv)テールドメインが、少なくとも10、15、20、25、30、35または40ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールドメインからの少なくとも10、15、20、25、30、35または40個のヌクレオチドを含み;またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み;または
(c)(v)テールドメインが、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールドメインなどの天然起源テールドメインの15、20、25、30、35、40ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含む。
(a)gRNAの片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるCas9分子の標的化に際して、一本鎖切断が、(i)標的位置の50、100、150、200、250、300、350、400、450、または500ヌクレオチド以内にあるように、または(ii)十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る;
(b)片方または双方が、例えば、(i)16、(ii)、17、(iii)18、(iv)19、(v)20、(vi)21、(vii)22、(viii)23、(ix)24、(x)25、または(xi)26ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも16ヌクレオチドの標的化ドメインを有し;
(c)(i)隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールおよび隣接ドメインからの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む;
(c)(ii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)gRNAの対応する配列からの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある;
(c)(iii)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)gRNAの対応する配列からの少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または個の54ヌクレオチドなどの第1の相補性ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある;
(c)(iv)テールドメインが、少なくとも10、15、20、25、30、35または40ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールドメインからの少なくとも10、15、20、25、30、35または40個のヌクレオチドを含み;またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み;または
(c)(v)テールドメインが、例えば、天然S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールドメインなどの天然テールドメインの15、20、25、30、35、40ヌクレオチド、または全ての対応する部分を含む。
a)gRNA分子の片方または双方が、例えば、一本鎖切断を生じるCas9分子の標的化に際して、一本鎖切断が、(i)標的位置の50、100、150、200、250、300、350,400、450、または500ヌクレオチド以内にあるように、または(ii)十分に密接しているので標的位置が末端切除領域内にあるように位置し得る;
b)片方または双方が、例えば、(i)16、(ii)17、(iii)18、(iv)19、(v)20、(vi)21、(vii)22、(viii)23、(ix)24、(x)25、または(xi)26ヌクレオチドの標的化ドメインなどの少なくとも16ヌクレオチドの標的化ドメインを有する;
(c)(i)隣接およびテールドメインは、一緒になって、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールおよび隣接ドメインからの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドを含み、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含む;
(c)(ii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)gRNAの対応する配列からの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドなどの少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53個のヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある;
(c)(iii)第2の相補的ドメインの最後のヌクレオチドの3’に、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)gRNAの対応する配列からの少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54個のヌクレオチドなどの第1の相補的ドメインのその対応するヌクレオチドと相補的な、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドがあり、またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列がある;
(c)(iv)テールドメインが、少なくとも10、15、20、25、30、35または40ヌクレオチド長であり、例えば、それは、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールドメインからの少なくとも10、15、20、25、30、35または40個のヌクレオチドを含み;またはそれと、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個以下のヌクレオチドが異なる配列を含み;または
(c)(v)テールドメインが、例えば、天然起源S.ピオゲネス(S.pyogenes)、S.サーモフィルス(S.thermophilus)、N.メニンジチディス(N.meningitidis)、またはS.アウレウス(S.aureus)テールドメインなどの天然起源テールドメインの15、20、25、30、35、または40個のヌクレオチド、または全ての対応する部分を含む;
(d)gRNAが、標的核酸とハイブリダイズする際に、それらが、0〜50、0〜100、0〜200、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも30または少なくとも50ヌクレオチドによって隔てられるように構成される;
(e)第1のgRNAおよび第2のgRNAによって生成される切断が、異なる鎖上にある;
(f)PAMが外側を向く。
Cas9分子、gRNA分子(例えば、Cas9分子/gRNA分子複合体など)、および任意選択的に供与体テンプレート核酸を使用して、例えば、多種多様な細胞内で標的核酸を編集するために、細胞を操作することができる。しかしながら、幹細胞は、処理するのが特に難しく、Cas9分子およびgRNA分子などの外来分子の導入は、典型的に、非常に高い細胞死率および低い細胞生存率を招く。従って、驚くことに、CRISPR/Cas9構成要素への曝露に応答して、高い幹細胞生存の可能性および低い細胞死率をもたらす方法が、本明細書に開示される。
例えば、Cas9分子およびgRNA分子(例えば、Cas9分子/gRNA分子複合体)などの構成要素、ならびに供与体テンプレート核酸、または3つ全ては、多様な形態で送達、製剤化、または投与することができ、例えば、表6および7を参照されたい。特定の実施形態では、1つのCas9分子と2つ以上(例えば、2、3、4、またはそれ以上)の異なるgRNA分子は、例えば、AAVベクターによって送達される。特定の実施形態では、Cas9分子をコードする配列と、2つ以上(例えば、2、3、4、またはそれ以上)の異なるgRNA分子をコードする配列は、同じ核酸分子、例えば、AAVベクター上に存在する。Cas9分子またはgRNA構成要素が送達され、DNAにコードされる場合、このDNAは、典型的に、発現を実施するための制御領域(例えば、プロモーターを含む)を含むであろう。Cas9分子配列に有用なプロモーターとしては、例えば、CMV、SFFV、EFS、EF−1a、PGK、CAG、およびCBHプロモーター、または血球特異的プロモーターが挙げられる。一実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。別の実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。gRNAの有用なプロモーターとしては、T7、H1、EF−1a、U6、U1、およびtRNAプロモーターが挙げられる。同様のまたは異なる強度を有するプロモーターを選択して、構成要素の発現を調整することができる。Cas9分子をコードする配列は、例えば、SV40NLSなどの核局在化シグナル(NLS)を含んでもよい。一実施形態では、Cas9分子をコードする配列は、少なくとも2つの核局在化シグナルを含む。一実施形態では、Cas9分子またはgRNA分子のプロモーターは、独立して、誘導性、組織特異的、または細胞特異的であってもよい。
Cas9分子(例えば、eaCas9分子)、gRNA分子をコードする核酸、供与体テンプレート核酸、またはそれら(例えば、2つもしくは全て)の任意の組み合わせは、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、対象に、または細胞内に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするDNA、ならびに供与体テンプレート核酸は、例えば、ベクター(例えば、ウイルスまたは非ウイルスベクター)、非ベクターベースの方法(例えば、裸のDNAまたはDNA複合体を使用して)、またはそれらの組み合わせによって、送達することができる。
Cas9分子をコードするRNAおよび/またはgRNA分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、例えば、本明細書に記載される幹細胞などの細胞内に送達され得る。例えば、Cas9をコードするおよび/またはgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee 2012を参照されたい)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。Cas9をコードするRNAおよび/またはgRNAをコードするRNAは、幹細胞(例えば、本明細書に記載される幹細胞)による取り込みを促進する分子)と共役させることができる。
Cas9分子は、当該技術分野で周知の方法によって、または本明細書に記載されるようにして、細胞内に送達され得る。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、byマイクロインジェクション、電気穿孔、一過性細胞圧縮または圧搾(例えば、Lee 2012を参照されたい)、脂質媒介形質移入、ペプチド媒介送達、またはそれらの組み合わせによって送達され得る。送達は、gRNAをコードするDNA、またはgRNAを伴い得る。Cas9タンパク質は、幹細胞(例えば、本明細書に記載される幹細胞)による取り込みを促進する分子と共役させることができる。
全身投与方法としては、経口および非経口経路が挙げられる。非経口経路として、例えば、静脈内、髄内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、鼻内、および腹腔内経路が挙げられる。全身投与される構成要素は、本明細書に記載される細胞、例えば、HSC、または赤血球始原細胞もしくは前駆細胞を標的化するように、修飾または製剤化することもできる。
Casシステムの構成要素、例えば、Cas9分子構成要素およびgRNA分子構成要素の個別の送達、より具体的には、差次的モードによる構成要素の送達は、例えば、組織特異性および安全性を改善することによって、性能を高めることができる。
いくつかの実施形態では、表6に記載される構成要素を細胞に導入した後、これらの細胞を対象に導入する。構成要素を導入する方法は、表7に記載される送達方法のいずれかを含み得る。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、例えば、特にgRNA分子などの核酸中に存在し得るが、例えば、mRNA、RNAi、またはsiRNAなどのその他の形態のRNAにもまた存在し得る。本明細書に記載される「ヌクレオシド」は、5つの炭素砂糖分子(ペントースまたはリボース)またはその誘導体と、1つの有機塩基、プリンまたはピリミジン、またはその誘導体とを含有する化合物と定義される。本明細書に記載される「ヌクレオチド」は、リン酸基をさらに含むヌクレオシドと定義される。
(i)例えば、リン酸ジエステル骨格結合中の非結合リン酸酸素の片方または双方および/または結合リン酸酸素の1つまたは複数の置換などの改変;
(ii)例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシルなどのリボース糖の構成要素の置換などの改変;
(iii)リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる徹底的な置換;
(iv)天然起源核酸塩基の修飾または置換;
(v)リボースリン酸骨格の置換または修飾;
(vi)例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置換または部分のコンジュゲーションなどのオリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の修飾;および
(vii)糖の修飾。
本明細書の用法では、「アルキル」は、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素基を指すことが意図される。アルキル基の例としては、メチル(Me)、エチル(Et)、プロピル(例えば、n−プロピルおよびイソプロピル)、ブチル(例えば、n−ブチル、イソブチル、t−ブチル)、ペンチル(例えば、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル)などが挙げられる。アルキル基は、1〜約20個、2〜約20個、1〜約12個、1〜約8個、1〜約6個、1〜約4個、または1〜約3個の炭素原子を含有し得る。
リン酸基
一実施形態では、修飾ヌクレオチドのリン酸基は、異なる置換基による、1つまたは複数の酸素の置換によって修飾され得る。さらに、例えば、内修飾核酸に存在する修飾ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような修飾リン酸塩による、未修飾リン酸部分の徹底的な置換を含み得る。一実施形態では、リン酸骨格の修飾は、非荷電リンカーまたは非相称の電荷分布がある荷電リンカーのどちらかをもたらす改変を含み得る。
リン酸基は、リン非含有コネクターによって置換され得る。一実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換され得る。
核酸を模倣し得るスキャフォールドもまた構築され得て、その中では、リン酸リンカーおよびリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドサロゲートによって置換される。一実施形態では、核酸塩基は、サロゲート骨格によって係留され得る。例としては、制限なしに、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸(PNA)ヌクレオシドサロゲートが挙げられる。
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、糖類に1つまたは複数の修飾を含み得る。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、いくつかの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で、修飾または置換され得る。一実施形態では、2’ヒドロキシル基の修飾は核酸の安定性を高め得るが、それは、ヒドロキシルが、もはや脱プロトン化して、2’−アルコキシドイオンを形成し得ないためである。2’−アルコキシドは、リンカーリン原子上の分子内求核攻撃によって、分解を触媒し得る。
修飾核酸に組み込まれ得る、本明細書に記載される修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、およびウラシル(U)が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの核酸塩基は、修飾または完全に置換されて、修飾核酸に組み込まれ得る、修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドを提供し得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、プリン、ピリミジン、プリンまたはピリミジンアナログから独立して選択され得る。一実施形態では、核酸塩基としては、例えば、天然に存在する塩基の合成誘導体が挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾ウラシルである。修飾ウラシルを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、プソイドウリジン(ψ)、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザ−ウリジン、6−アザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオ−ウリジン(s2U)、4−チオ−ウリジン(s4U)、4−チオ−プソイドウリジン、2−チオ−プソイドウリジン、5−ヒドロキシ−ウリジン(ho5U)、5−アミノアリル−ウリジン、5−ハロ−ウリジン(例えば、5−ヨード−ウリジンまたは5−ブロモ−ウリジン)、3−メチル−ウリジン(m3U)、5−メトキシ−ウリジン(mo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸(cmo5U)、ウリジン5−オキシ酢酸メチルエステル(mcmo5U)、5−カルボキシメチル−ウリジン(cm5U)、1−カルボキシメチル−プソイドウリジン、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン(chm5U)、5−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル(mchm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−ウリジン(mcm5U)、5−メトキシカルボニルメチル−2−チオ−ウリジン(mcm5s2U)、5−アミノメチル−2−チオ−ウリジン(nm5s2U)、5−メチルアミノメチル−ウリジン(mnm5U)、5−メチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(mnm5s2U)、5−メチルアミノメチル−2−セレン含有−ウリジン(mnm5se2U)、5−カルバモイルメチル−ウリジン(ncm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン(cmnm5U)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウリジン(cmnm5s2U)、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−ウリジン(τcm5U)、1−タウリノメチル−プソイドウリジン、5−タウリノメチル−2−チオ−ウリジン(τm5s2U)、1−タウリノメチル−4−チオ−プソイドウリジン、5−メチル−ウリジン(m5U、すなわち、核酸塩基デオキシチミジン(deoxythymine)を有する)、1−メチル−プソイドウリジン(m1ψ)、5−メチル−2−チオ−ウリジン(m5s2U)、1−メチル−4−チオ−プソイドウリジン(m1s4ψ)、4−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、3−メチル−プソイドウリジン(m3ψ)、2−チオ−1−メチル−プソイドウリジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン(D)、ジヒドロプソイドウリジン、5,6−ジヒドロウリジン、5−メチル−ジヒドロウリジン(m5D)、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、2−メトキシ−ウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−プソイドウリジン、4−メトキシ−2−チオ−プソイドウリジン、N1−メチル−プソイドウリジン、3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)ウリジン(acp3U)、1−メチル−3−(3−アミノ−3−カルボキシプロピル)プソイドウリジン(acp3ψ)、5−(イソペンテニルアミノメチル)ウリジン(inm5U)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2−チオ−ウリジン(inm5s2U)、α−チオ−ウリジン、2’−O−メチル−ウリジン(Um)、5,2’−O−ジメチル−ウリジン(m5Um)、2’−O−メチル−プソイドウリジン(ψm)、2−チオ−2’−O−メチル−ウリジン(s2Um)、5−メトキシカルボニルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(mcm5Um)、5−カルバモイルメチル−2’−O−メチル−ウリジン(ncm5Um)、5−カルボキシメチルアミノメチル−2’−O−メチル−ウリジン(cmnm5Um)、3,2’−O−ジメチル−ウリジン(m3Um)、5−(イソペンテニルアミノメチル)−2’−O−メチル−ウリジン(inm5Um)、1−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、2’−F−アラ−ウリジン、2’−F−ウリジン、2’−OH−アラ−ウリジン、5−(2−カルボメトキシビニル)ウリジン、5−[3−(1−E−プロペニルアミノ)ウリジン、ピラゾロ[3,4−d]ピリミジン、キサンチン、およびヒポキサンチンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾シトシンである。修飾シトシンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、5−アザ−シチジン、6−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、3−メチル−シチジン(m3C)、N4−アセチル−シチジン(act)、5−ホルミル−シチジン(f5C)、N4−メチル−シチジン(m4C)、5−メチル−シチジン(m5C)、5−ハロ−シチジン(例えば、5−ヨード−シチジン)、5−ヒドロキシメチル−シチジン(hm5C)、1−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、2−チオ−シチジン(s2C)、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−プソイドイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−プソイドイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−プソイドイソシチジン、リシジン(k2C)、α−チオ−シチジン、2’−O−メチル−シチジン(Cm)、5,2’−O−ジメチル−シチジン(m5Cm)、N4−アセチル−2’−O−メチル−シチジン(ac4Cm)、N4,2’−O−ジメチル−シチジン(m4Cm)、5−ホルミル−2’−O−メチル−シチジン(f5Cm)、N4,N4,2’−O−トリメチル−シチジン(m4 2Cm)、1−チオ−シチジン、2’−F−アラ−シチジン、2’−F−シチジン、および2’−OH−アラ−シチジンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾アデニンである。修飾アデニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、2−アミノ−プリン、2,6−ジアミノプリン、2−アミノ−6−ハロ−プリン(例えば、2−アミノ−6−クロロ−プリン)、6−ハロ−プリン(例えば、6−クロロ−プリン)、2−アミノ−6−メチル−プリン、8−アジド−アデノシン、7−デアザ−アデノシン、7−デアザ−8−アザ−アデノシン、7−デアザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノ−プリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチル−アデノシン(m1A)、2−メチル−アデノシン(m2A)、N6−メチル−アデノシン(m6A)、2−メチルチオ−N6−メチル−アデノシン(ms2m6A)、N6−イソペンテニル−アデノシン(i6A)、2−メチルチオ−N6−イソペンテニル−アデノシン(ms2i6A)、N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(io6A)、2−メチルチオ−N6−(シス−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン(ms2io6A)、N6−グリシジルカルバモイル(glycinylcarbamoyl)−アデノシン(g6A)、N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(t6A)、N6−メチル−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(m6t6A)、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイル−アデノシン(ms2g6A)、N6,N6−ジメチル−アデノシン(m6 2A)、N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(hn6A)、2−メチルチオ−N6−ヒドロキシノルバリルカルバモイル−アデノシン(ms2hn6A)、N6−アセチル−アデノシン(ac6A)、7−メチル−アデノシン、2−メチルチオ−アデノシン、2−メトキシ−アデノシン、α−チオ−アデノシン、2’−O−メチル−アデノシン(Am)、N6,2’−O−ジメチル−アデノシン(m6Am)、N6−メチル−2’−デオキシアデノシン、N6,N6,2’−O−トリメチル−アデノシン(m6 2Am)、1,2’−O−ジメチル−アデノシン(m1Am)、2’−O−リボシルアデノシン(リン酸塩)(Ar(p))、2−アミノ−N6−メチル−プリン、1−チオ−アデノシン、8−アジド−アデノシン、2’−F−アラ−アデノシン、2’−F−アデノシン、2’−OH−アラ−アデノシン、およびN6−(19−アミノ−ペンタオキサノンアデシル)−アデノシンが挙げられる。
一実施形態では、修飾核酸塩基は、修飾グアニンである。修飾グアニンを有する代表的な核酸塩基およびヌクレオシドとしては、制限なしに、イノシン(I)、1−メチル−イノシン(m1I)、ワイオシン(imG)、メチルワイオシン(mimG)、4−デメチル−ワイオシン(imG−14)、イソワイオシン(imG2)、ウィブトシン(yW)、ペルオキシウィブトシン(o2yW)、ヒドロキシウィブトシン(OHyW)、低修飾ヒドロキシウィブトシン(OHyW*)、7−デアザ−グアノシン、クエオシン(Q)、エポキシクエオシン(oQ)、ガラクトシル−クエオシン(galQ)、マンノシル−クエオシン(manQ)、7−シアノ−7−デアザ−グアノシン(preQ0)、7−アミノメチル−7−デアザ−グアノシン(preQ1)、アルカエオシン(G+)、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン(m7G)、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチル−イノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチル−グアノシン(m’G)、N2−メチル−グアノシン(m2G)、N2,N2−ジメチル−グアノシン(m2 2G)、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,7G)、N2、N2,7−ジメチル−グアノシン(m2,2,7G)、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、N2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシン、α−チオ−グアノシン、2’−O−メチル−グアノシン(Gm)、N2−メチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2Gm)、N2,N2−ジメチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2 2Gm)、1−メチル−2’−O−メチル−グアノシン(m’Gm)、N2,7−ジメチル−2’−O−メチル−グアノシン(m2,7Gm)、2’−O−メチル−イノシン(Im)、1,2’−O−ジメチル−イノシン(m’Im)、O6−フェニル−2’−デオキシイノシン、2’−O−リボシルグアノシン(リン酸塩)(Gr(p))、1−チオ−グアノシン、O6−メチル−グアノシン、O6−メチル−2’−デオキシグアノシン、2’−F−アラ−グアノシン、および2’−F−グアノシンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、修飾核酸は修飾gRNAであり得る。本明細書に記載されるgRNAのいずれでも、このセクションに従って修飾され得るものと理解される。
B1およびB1’の各々は、独立して
各R1は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは6員ヘテロアリールにより置換されたC1〜4アルキルであり;
R2、R2’、およびR3’の各々は、独立して、H、F、OH、もしくはO−C1〜4アルキルであり;
X、YおよびZの各々は、独立して、OまたはSであり;
X’およびY’の各々は、独立して、OまたはCH2である)
を有する。
B1およびB1’の各々は、独立して
各R1は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは6員ヘテロアリールにより置換されたC1〜4アルキルであり;
R2、R2’、およびR3’の各々は、独立して、H、F、OH、もしくはO−C1〜4アルキルであり;
W、X、Y、およびZの各々は、独立して、OまたはSであり;
X’、Y’、およびZ’の各々は、独立して、OまたはCH2である)
を有する。
B1およびB1’の各々は、独立して
各R1は、独立して、任意選択的にフェニルもしくは6員ヘテロアリールにより置換されたC1〜4アルキルであり;
R2、R2’、およびR3’の各々は、独立して、H、F、OH、もしくはO−C1〜4アルキルであり;
V、W、X、Y、およびZの各々は、独立して、OまたはSであり;
W’、X’、Y’、およびZ’の各々は、独立して、OまたはCH2である)
を有する。
n−アミノ(アミノは、例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、またはポリアミノであり得る)が挙げられる。
マイクロRNA(またはmiRNAs)は、天然細胞性19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。それらは、例えば、mRNAの3’UTRなどで、適切なmiRNA結合部位を有する核酸分子に結合し、遺伝子発現を下方制御する。理論による拘束は望まないが、この下方制御は、核酸分子安定性の低下または翻訳阻害のどちらかにより起こると考えられる。例えば、Cas9をコードするmRNAなどの本明細書で開示されるRNA種は、例えば、その3’UTRなどに、miRNA結合部位を含み得る。miRNA結合部位は、選択された細胞型内の発現(expression is)の下方制御を促進するように選択され得る。一例として、肝臓に豊富なマイクロRNAであるmiR−122に対する結合部位の組み込みは、肝臓における対象遺伝子の発現を阻害し得る。
候補gRNAの適合性は、本実施例に記載されるように評価され得る。キメラgRNAについて記載されるが、アプローチはまた、モジュラーgRNAを評価するのにも使用され得る。
各gRNA毎に、1対の重複オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。オリゴヌクレオチドは、アニールされて、長いキメラgRNAの上流U6プロモーターおよび残りの配列を含有する、消化ベクター骨格にライゲートされる。プラスミドは配列確認されて、十分な量の形質移入品質のDNAを生成するために準備される。交互の(Alternate)プロモーターを使用して、生体内転写(例えば、H1プロモーター)または生体外転写(例えば、T7プロモーター)が駆動されてもよい。
各gRNA毎に、単一オリゴヌクレオチドが設計されて入手される。U6プロモーターおよびgRNAスキャフォールド(例えば、第1の相補的ドメイン;連結ドメイン;第2の相補的ドメイン;隣接ドメイン;およびテールドメインをはじめとする、crRNAおよびtracrRNAに由来する配列をはじめとする、標的化ドメイン以外の全てを含む)は、別々にPCR増幅されて、dsDNA分子として精製される。gRNA特異的オリゴヌクレオチドがPCR反応で使用されて、オリゴヌクレオチド中で特定化された標的化ドメインによって連結する、U6およびgRNAスキャフォールドを縫い合わせる。結果として生じるdsDNA分子(STITCHR生成物)は、形質移入のために精製される。交互の(Alternate)プロモーターを使用して、生体内転写(例えば、H1プロモーター)または生体外転写(例えば、T7プロモーター)が駆動されてもよい。任意のgRNAスキャフォールドを使用して、任意の細菌種に由来するCas9と適合性のgRNAが生成されてもよい。
試験される各gRNAは、プラスミド発現Cas9および小量のGFP発現プラスミドと共に、ヒト細胞に形質移入される。予備実験では、これらの細胞は、93T、K562またはU2OSなどの不死化ヒト細胞株であり得る。代案としては、初代ヒト細胞が使用されてもよい。この場合、細胞は、最終的な治療細胞標的(例えば、赤血球系細胞)に関連があってもよい。可能な治療幹細胞集団と類似した初代細胞の使用は、内在性クロマチンおよび遺伝子発現の文脈で、遺伝子標的化比率に関する重要な情報を提供してもよい。
1/2)。T7E1アッセイは、約2〜5%NHEJに至るまで感受性である。
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのNHEJを誘導するgRNAが選択され得る。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
遺伝子標的化効率のさらなる評価のために、最初の試験で最大レベルのNHEJを誘導するgRNAを選択することができる。この場合、細胞は疾病対象に由来し、したがって関連変異を有する。
野生型CCR5遺伝子産物の発現を阻止するように遺伝子修飾されたオートロガスCD34+造血幹/前駆細胞(HSC)は、通常、HIV感染を受けやすいHIVウイルスHSC子孫(例えば、マクロファージおよびCD4Tリンパ球)の侵入を阻止する。臨床的に、CCR5ケモカイン受容体のコード配列に遺伝子変異を含むHSCの移植は、HIV感染を長期間制御することが証明されている(Huetter et al.,New England Journal Of Medicine,2009;360(7):692−698)。CRISPR/Cas9プラットフォームを用いたゲノム編集は、例えば、編集された遺伝子座での遺伝子発現の阻害をもたらし得る標的化切断部位にインデルを生成することによって、内在性遺伝子標的を正確に改変する。この実施例では、セクションII(gRNAをデザインする方法)に記載される基準に基づいて選択された11のS.アウレウス(S.aureus)Cas9gRNA(表10)を用いた遺伝子編集。
この実施例では、CD34+細胞におけるゲノム編集を誘導するために、Cas9と、CCR5遺伝子座を標的化するgRNAとの共送達後のヒト動員末梢血CD34+HSCにおけるゲノム編集を評価した。
この実施例では、小分子細胞生存能力エンハンサーUM171およびヒトサイトカインとの短時間の接触後に、CD34+細胞における遺伝子編集を誘導するために、Cas9と、CXCR4遺伝子座を標的化するgRNAとの共送達後のヒト動員末梢血CD34+HSCにおけるゲノム編集を評価した。この実施例では、CXCR4gRNAと組み合わせたS.ピオゲネス(S.pyogenes)およびS.アウレウス(S.aureus)Cas9変異型を使用した。
野生型CXCR4またはCCR5遺伝子産物の発現を阻止するように遺伝子修飾されたオートロガスCD34+造血幹細胞(HSC、造血幹/前駆細胞もしくはHSCとしても知られる)の移植は、通常HIV感染を受けやすいHIVウイルスHSC子孫(例えば、マクロファージおよびCD4 Tリンパ球)の侵入を妨げる。CRISPR/Cas9プラットフォームを用いた多重ゲノム編集は、2つの異なる切断部位にインデルを生成することによって、2つ以上の内在性遺伝子標的を正確に改変し、複数の編集遺伝子座での遺伝子発現のノックダウンを達成することができる。この実施例では、CD34+細胞において多重遺伝子編集を誘導するために、CXCR4遺伝子座を標的化する1つのgRNAおよびCCR5遺伝子座を標的化する1つのgRNAと、野生型S.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9との共送達後のヒト動員末梢血CD34+HSCにおける多重ゲノム編集を評価した。
ウイルス−宿主共進化の間に、mRNAのキャッピングを模倣するウイルスRNAキャッピングは進化して、ウイルスRNAが、細胞の自然免疫系からの検出を免れることを可能にした(Delcroy et al.,2012,Nature Reviews Microbiology 10:51−65)。造血幹/前駆細胞中のトール様受容体は、自然免疫応答、細胞老化、およびプログラム細胞死を引き起こし得る外来の一本鎖および二本鎖RNAの存在を感知する(Kajaste−Rudnitski and Naldini,2015,Human Gene Therapy,26:201−209)。初期実験の結果から、GFPmRNA単独を用いて電気穿孔された細胞と比較して、非修飾標的特異的gRNAおよびCas9mRNAを用いて電気穿孔されたヒト造血幹/前駆細胞は、細胞寿命、増殖能、複能性の低減(例えば、赤血球分化能の喪失および歪んだ骨髄系分化)を招くことが立証された。この課題に取り組むために、細胞の老化およびアポトーシスは、外来核酸の幹細胞感知および自然免疫応答の誘導、さらにはこれに続くプログラム細胞死の誘導ならびに増殖能および分化能の喪失に起因すると仮定された。
非鎌状βヘモグロビン遺伝子(HBB)を発現するレンチウイルスベクターで遺伝子修飾された、異常ヘモグロビン症(例えば、鎌状赤血球症[SCD]、βサラセミア)に罹患した患者から採取したオートロガスCD34+造血幹細胞(HSC)の移植は、機能性成体型ヒトヘモグロビン(HbA)の発現を回復し、したがって、形質導入CD34+細胞に由来する赤血球系細胞における鎌状ヘモグロビン(HbSS)の形成を阻止すると共に、罹患した患者における臨床的症状を改善することが明らかにされている(Press Release from Bluebird Bio,June 13,2015,“bluebird bio Reports New Beta−thalassemia major and Severe Sickle Cell Disease Data from HGB−205 study at EHA”)。しかしながら、非鎌状βヘモグロビンをコードするトランスジーンを送達しても、原因となる突然変異を修正せず、またはHBBの突然変異型の発現(例えば、鎌状化)を阻止しない。さらに、CD34+細胞のレンチウイルスベクター形質導入は、細胞毎に複数のトランスジーン組み込み部位の発生を招く可能性があり、複数のトランスジーン組み込み部位の長期作用は現在のところ不明である。
この実施例では、HBB遺伝子座を標的化する2つのgRNAとのD10A Cas9ニッカーゼの共送達後に、新しく採取された臍帯血(CB)CD34+HSCにおけるゲノム編集を評価した。次に、編集されたCB CD34+細胞を骨髄系および赤血球系細胞に分化させて、HSCの造血活性を決定した。HBB遺伝子座の標的化破壊をT7E1アッセイおよびDNA配列決定により評価した。
この実施例では、臍帯血(CB)CD34+HSCをS.ピオゲネス(S.pyogenes)野生型Cas9 RNP、N863AニッカーゼRNP、またはHBB遺伝子座を標的化する2つのgRNAと複合体化したD10AニッカーゼRNPと接触させた。遺伝子編集のパーセンテージおよび編集事象のタイプ(例えば、HDR(例えば、遺伝子変換)またはNHEJ)を評価して、NHEJ(例えば、切断後に露出したまま残るDNAの末端、例えば、野生型Cas9切断によりに残る平滑末端、D10Aニッカーゼにより残る5’オーバーハングまたはN863Aニッカーゼ切断により残る3’オーバーハング)よりHDR(例えば、遺伝子変換)を選択するHSCにおける遺伝子編集のための最適なCas9活性(例えば、切断のタイプ、例えば、野生型Cas9からの二本鎖切断またはニッカーゼによる対向DNA鎖でのオフセットニック)を決定する。その他の最適化には、以下が含まれた:1)Cas9タンパク質の毒性を低減するためのCas9タンパク質調製物からのエンドトキシンの除去;2)遺伝子編集を増大するためのCD34+細胞百万個当たり10μgのRNPの使用(実施例10に示すように、5μgのRNPと比較して、新鮮なCB CD34+細胞での遺伝子編集を倍増することが判明した);3)臍帯血(CB)から単離し、凍結保存されたヒトCD34+細胞を試験して、遺伝子編集が、(実施例10に記載されるように、新しく単離されたHSCと比較して)凍結保存による影響を受けなかったことを確認する;ならびに4)CD34+細胞におけるCas9 RNPレベルを経時的に評価して、HSCにおけるCas9RNP安定性を理解する。
gRNAをコードするDNAテンプレートにおけるポリAテールのコード化。
修飾されていない(例えば、ARCAキャップおよびポリAテールなし)Cas9およびgRNAで電気穿孔された成体型ヒト造血幹/前駆細胞(HSC)は、インビトロで転写されたキャップおよびテール付加gRNAで電気穿孔された成体型ヒトHSCと比較して、生存期間、生存能力、および造血能力が低く、しかも、低いパーセンテージの遺伝子編集を有した(図5A〜Cおよび図6A〜G)。ARCAキャップ付きgRNAのインビトロ転写(mMessage Machine(商標)T7 Ultra Transcription Kit,Ambion)の後、gRNAを大腸菌(E.coli)ポリAテールポリメラーゼ(E−PAP)と一緒にインキュベートし、MegaClear(商標)Kit(Ambion)を用いてキャップ/テール付加gRNAをクリーンアップした。E−PAPテール付加反応により付加されたポリAテールは、実験によってまちまちであった。gRNAの3’末端でのポリAテールの長さを標準化するために、特定長さのポリT配列を含有して、特定長さのポリAテールのためのDNAテンプレートが得られるように、gRNAtracrをコードする3’アンチセンスプライマーを改変した。アンチセンスプライマーにより生成されたポリAテールの長さは、10、20、50、および100であった。HBB特異的gRNA(HBB−8(配列番号388)およびHBB−15(配列番号387))をコードするDNAテンプレートは、PCRにより生成してから、ポリAテールはDNAテンプレートでコードされたため、E−PAPテール付加反応を省く1つの変更を加えて、mMessage Machine(商標)T7 Ultra Transcription Kitを用いて、製造者のプロトコルに従い、インビトロで転写した。
造血幹/前駆細胞におけるCas9RNP媒介性遺伝子編集の再現性を決定するために、15人の異なる患者ドナー(すなわち、12人の臍帯血CD34+細胞ドナーおよび3人の成体型動員末梢血CD34+細胞ドナー)から得た凍結保存CD34+細胞を、ヒトサイトカイン(例えば、SCF、TPO、FL、およびIL6)を含むStemspan SFEM培地中に、1μMのSr1と一緒に、またはなしで、48〜72時間かけて解凍した後、HBBを標的化するgRNAと事前に複合体化したS.ピオゲネス(S.pyogenes)Cas9RNP(D10AニッカーゼもしくはWT)(例えば、HBB−8(配列番号388)もしくはHBB−15(配列番号387)gRNAと事前に複合体化したD10Aニッカーゼおよび混合されCD34+細胞に添加された2つの事前に複合体化したRNP)またはAAVS1(sgRNA AAVS1−1(配列番号494)を有するWT Cas9)で電気穿孔した。本実施例に記載する全ての実験について、修飾T7プロモーター、gRNA、およびgRNAの3’側のポリAテール(20A)をコードするPCRテンプレートからgRNAはインビトロで転写された。インビトロ転写プロセスにおいてgRNAの5’末端にARCAキャップを添加した。従って、これらの実験で試験した全てのgRNAは、修飾gRNAである(すなわち、ARCAキャップを有する5’末端およびポリAテールを有する3’末端で修飾されている)。個別の実験で試験される15のドナーCD34+細胞集団について、5つの実験は、WTCas9RNP送達(例えば、sgRNA、AAVS1−1またはHBB−8のいずれか)による遺伝子編集を試験するために実施され、10の実験は、D10Aニッカーゼおよび2gRNA(すなわち、HBB−8およびHBB−15)による遺伝子編集を試験するために実施された。
Cas9RNP接触および遺伝子編集が、HSC生着能にマイナスの影響を与えないことを確認するために、生体内ヒトHSC/マウス異種移植片移植試験を開始したが、そのスキームを図20Aに示す。この実施例では、新鮮な(すなわち、凍結保存していない)ヒト臍帯血CD34+造血幹細胞を、ヒトサイトカイン(例えば、SCF、TPO、FLおよびIL6)ならびにPGE2を含有するStemSpan SFEM中に播種し、予備刺激のために48時間培養した。ヒトCD34+細胞を2つの等しい画分に分割し、細胞(すなわち、1画分)の1/2をD10AニッカーゼCas9RNP(すなわち、sgRNA HBB−8(配列番号388)およびHBB−15(配列番号387)と複合体化したCas9タンパク質で電気穿孔して、さらに48時間培養したが、これにより、生体外での合計時間は4日となった。第2のCD34+細胞画分は、Cas9で処理せずに培養した(非処理対照)。ヒトCD34+細胞注入の1日(約24時間)前に、免疫欠損マウス(すなわち、NOD.Cg−Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ、NOD−scid
IL2Rgammanull、NSG)を20mg/kgのブスルファン(Busulfan)で(i.p.)処置した。ブスルファン処置マウスに細胞を静脈内注入した:グループ1(対照)は、非処理ヒトCD34+細胞を受け(n=5マウス)、細胞の「子孫」用量は、260,000細胞/マウス(対照マウスに対する実日0の細胞用量:320,000/細胞マウス)であった。細胞の「子孫」用量は、2日の予備刺激(2日細胞用量)後だが、対照培養条件(対照グループ)またはCas9RNPでの電気穿孔(RNP処理)のいずれかに曝露する時点の前に計算される細胞数を指す。グループ2マウス(RNP処理、n=7マウス)の各々に、260,000細胞/マウス(対照マウスに対する実日0の細胞用量:240,000細胞/マウス)の細胞の「子孫」用量を移植した。2週間毎に採血し、遺伝子編集事象の検出、ならびにマウス末梢血サンプル中のヒトCD45+血球の存在により示されるヒト細胞生着の検出のために血液をアッセイした。CD34+細胞の移植から12週間後に、各グループからの1/2のマウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、および末梢血を分析のために収集した。残る生存マウスは、CD34+細胞生着および二次CD34+細胞移植の長期追跡のために、さらに1〜4ヶ月にわたって試験を継続した。この特定の試験では、D10A RNP(HBB−8(配列番号388)およびHBB−15(配列番号387))と接触させた細胞における遺伝子編集の評価は、DNA配列決定およびT7E1アッセイ分析により決定される通り、30〜35%の遺伝子編集を示した(図20B)。編集事象のタイプの分析によって、HBB遺伝子座に対する下記サブタイプの遺伝子変化が検出された:14%の欠失、14%の挿入、2%の遺伝子変換(HDR)。RNP処理および対照(非処理)CD34+細胞の赤血球系および骨髄系子孫のCFC分析は、短期コロニー形成能の若干の低下を示したが、この差は統計的に有意ではなかった(図20C)。CFCアッセイから採取した個々のクローンのDNA配列決定分析は、BFU−E/GEMMおよびCFU−GM/Mにおける1対立遺伝子でそれぞれ最大40%および60%の編集(片アレル編集)を示し、両アレル編集は、12.5%の頻度でBFU−E/GEMMに検出された(BFU−E/GEMM総編集:52.5%、CFU−GM/M総編集:60%)(図20C)。造血再構成の動力学を評価するために、6〜12週間の間血液サンプルを収集した。血液サンプルは、マウス末梢血サンプルから抽出されたgDNAからのPCR産物(ヒトHBB特異的PCRプライマーから産生された)のT7E1分析により、遺伝子編集事象について分析した(図20D)。RNP処理ヒトCD34+細胞を移植したマウスの血液中に、ヒト細胞移植時間に対して複数の時点で遺伝子編集が検出された。RNP処理ヒトCD34+細胞を移植したマウスまたは非処理対照ヒトCD34+細胞を移植したマウスの血液中に、複数の時点で、フローサイトメトリーによりヒトCD45+血球も検出された(図20D)。末梢血サンプルは、マウス骨髄中のヒト細胞生着の測定としてのフローサイトメトリーによる、ヒト血球(ヒトCD45+)の検出のためのフローサイトメトリーによっても分析した。マウスおよびヒトCD45+細胞を明瞭に識別するために、血液サンプルをヒトCD45特異的抗体およびマウス特異的CD45抗体で共染色した。血液サンプルはまた、ヒトリンパ球(例えば、CD20、B細胞およびCD3T細胞)、骨髄細胞(例えば、CD14およびCD33)、ならびに赤血球前駆細胞(例えば、CD71)と結合するヒト抗体でも染色した。ヒトCD45+細胞が検出された。マウス血液サンプル中のヒトCD45+細胞ゲート内でリンパ球(CD20B細胞)、骨髄細胞、および赤血球前駆細胞を識別することができた(図20D)。移植から6〜12週間後の末梢血の分析は、RNP処理CD34+細胞を移植したマウスの血液中に最大33.6%のヒトCD45+細胞が検出され、血液サンプル中に検出されたヒトCD45+細胞のレベルは、経時的に増加した(移植から12週間後の生着:対照グループの平均:11%hCD45+、RNP処理グループの平均:18%hCD45+細胞:図20E)ことを示した。重要なことには、これらのデータの統計分析は、RNP処理CD34+細胞と非処理対照CD34+細胞との間に生着のレベルに有意な差を示さなかった(対応のないt検定P値=0.2376)。ヒトCD45+細胞ゲート内の細胞のサブセット分析は、RNP処理CD34+細胞および非処理対照CD34+細胞を移植したマウスの間で、ヒト血球系列分布に有意な差を示さなかった(対応のないt検定)。文献に報告されているデータと一致して、ヒトCD45+ゲート内の細胞のうち平均して約80%のRNP処理:76%、対照82%)は、CD20+B細胞であり、約3%がCD3+T細胞であり、残り15%が赤血球系(非処理グループの:6%およびRNP処理:11%)ならびに骨髄系(非処理対照:9%およびRNP処理:4%)であった(図20E)。
移植から4ヵ月後の長期生着を評価するために(図20〜22に描写する実験のために)、実験1(EXPT1)の試験について残りのマウスを安楽死させた後、遺伝子編集ヒト細胞の生着の分析のために造血臓器を採取した。さらに、第2の実験(EXPT2、図23)をセットアップし、その場合、異なるドナーからのCB CD34+細胞は、StemRegenin−1(SR1)による前処理(これは、CB CD34+細胞拡大のために用いられているが、ここでは、Cas9タンパク質およびgRNA(すなわち、細菌タンパク質および外来核酸)への短時間の曝露後の細胞死を阻止するために使用した)の後に、非処理のまま残すか、または2つの修飾(キャップおよびテール付加)gRNA(HBB−8およびHBB−15)を含むD10ACas9RNAで電気穿孔した。2つの実験:実験1(EXPT1)および実験2(EXPT2)の実験デザインの違いを以下の表18に示す。
Cas9媒介性遺伝子編集後の成体型HSCの生着能を評価するために、修飾(キャップ/テール付加)HBB−8およびHBB−15gRNAを含むD10ACas9RNAで、mPB CD34+細胞を電気穿孔した。mPB CD34+細胞中の総遺伝子編集頻度は、予備注入産物中で約22%であった(図25A)。25mg/kgのブスルファンでコンディショニングした(移植の約24時間前)マウスに、ドナー適合RNP処理および非処理対照mPB CD34+細胞(細胞約百万個/マウス、n=3マウス/グループ)を静脈内注入した。移植から10週間後、末梢血中でヒトCD45+細胞再構成を評価した。いずれのコホートについても、約10%のCD45+細胞が末梢血中に検出されたが、これは、RNP処理および非処理対照成体型CD34+細胞の短期生着に差がないことを示している(図25B〜25D)。ヒトCD45+細胞ゲート内では、リンパ球系(CD20+B細胞)および骨髄系(CD33+顆粒球)の双方が検出され、2つのコホート間で生体内造血に対する系列の寄与に差はなかった。これらのデータから、Cas9媒介性遺伝子編集HSCが、生着および造血再構成能を保持すること、ならびにRNP処理が、ナイーブ非処理ドナー適合対照CD34+細胞と比較して、造血再構成または分化特性を改変しないことが判明した。
ヒトHSCにおける相同組換え修復(HDR)を評価するために、CB CD34+細胞を、D10ARNPと、一本鎖オリゴヌクレオチド供与体修復テンプレート(ssODN)を有するHBB−8およびHBB−15修飾gRNA(キャップ/テール付加)で電気穿孔した。修復テンプレートは、HBB標的部位に対して高い相同性を有し、塩基変化(SNP)が少数であるため、DNA配列決定による遺伝子修飾事象の同定が可能になる。外来核酸、特にDNAが、ヒトCD34+細胞中に自然免疫応答を誘導することが明らかにされていることから、ssODN用量(細胞200,000個当たりのpmol)の範囲を評価し、D10ARNPおよびgRNAとのssODN共送達の毒性と、ssODNなし、5’および3’末端修飾を含まないssODN供与体テンプレート(非修飾ssODN、[NM])、またはホスホロチオエート修飾5’および3’末端を有するssODN供与体テンプレート(「Phx」もしくは「PhTx」)のいずれかを比較する。CD34+細胞に送達されるssODNの量を漸減しても、T7E1エンドヌクレアーゼ分析またはDNA配列決定分析のいずれかにより検出される遺伝子編集は減少しなかった(図26A、26C)。しかしながら、より低い量のssODNに曝露すると、電気穿孔から数日にわたる生存CD34+細胞の数の倍率変化によって示されるように、細胞生存能力が向上した(図26B)。ssODN供与体テンプレートへの’5および3’ホスホロチオエート部分の含有は、遺伝子修飾および総HDR(すなわち、遺伝子修飾および遺伝子変換)のレベルを高めた(図26C、26D)。100pmolの5’および3’ホスホロチオエート修飾ssODN供与体テンプレートならびにD10ARNPおよび2つの修飾gRNAで電気穿孔すると、100pmolの5’および3’非修飾ssODN供与体テンプレートならびにD10ARNPおよび2つの修飾gRNAで細胞を電気穿孔した場合に観察される7%HDRと比較して、HDRは約12%まで増加した。
ヒトCD34+細胞は、特に、トール様受容体(TLR)経路を介した細胞の自然免疫応答を活性化し、従って、プログラム細胞死(例えば、アポトーシスによる)、成長停止またはオートファジーを誘導し得る外来タンパク質および核酸への曝露に起因する、それらの細胞環境中の摂動に感受性であることを考慮して、以下:酸化リン脂質1−パルミトイル−2−アラキドニル−sn−グリセロ−3−ホスホリルクロリン(OxPAPC)、すなわち、TLR経路を阻害することが知られている小分子化合物(例えば、TLR2およびTLR4経路は、それぞれ細菌成分およびLPSによって活性化される);バフィロマイシン、すなわち、細胞ストレス時のアポトーシスまたはオートファジーによる細胞死を阻止する化合物;ラパマイシン(HSCにおけるレンチウイルス遺伝子療法を改善するmTOR阻害剤(例えば、Wang et al.(2014)Blood 124(6):913−23 2014を参照;プロテオソーム阻害剤MG132(例えば、Santoni DiSio et al.(2006)Blood 107(11):4257−4265を参照)、SR−1とUM171、またはUM171単独、すなわち、生存能力のあるヒトCB CD34+細胞を生体外で拡大および維持することが既に立証されている分子(例えば、Fares et al.(2014)Science 345(6203):1509−1512を参照)、またはSR−1とUM171の組み合わせでCD34+細胞を(18時間)前処理した。CB CD34+細胞は、D10ACas9RNP、HBB−8およびHBB−15修飾gRNA、ならびに5’および3’ホスホロチオエート修飾ssODN供与体テンプレートを用いた電気穿孔前に18時間にわたってこれらの幹細胞生存能力エンハンサー(表19)の各々で前処理した。電気穿孔後、これらの幹細胞生存能力エンハンサーを含有するHSC培地中に細胞を播種し、さらに3日間培養した。
最適、最小、および特異的3’末端gRNA修飾を明確にすることができるか否かを決定するために、いくつかの異なる修飾をgRNAのインビトロ転写用のPCR DNAテンプレートに操作により導入して、異なる3’末端を有するgRNAを作製した。3’末端の修飾が異なる全てのgRNAについて、各gRNAをインビトロ転写させた後、インビトロ転写プロセス中に付加されたARCAキャップで5’末端を修飾した。HBB遺伝子座は、gRNA HBB−8が、以下の3’末端修飾:様々な長さ(例えば、2A、5A、10A、15A、20A、および25A)のポリ(A)テール、様々な長さ(例えば、10T、20T)のポリ(T)テール、または様々な長さ(例えば、10G、20G)のポリ(G)テールを有するように修飾された、遺伝子修飾について標的化された。3’末端gRNA修飾の存在は、ゲル電気泳動により、Bioanalyzer(Nanochip(登録商標))を用いて検証した。検証後、gRNAをDSFシフトアッセイでQC分析に付したが、その場合、野生型Cas9タンパク質を様々なgRNAのモル比で複合体化して、Cas9タンパク質が完全に占有されるか、またはgRNAと複合体化されるCas9タンパク質:gRNAの最適モル比(例えば、1:1、1:1.5、1:2など)を決定した。次に、Cas9タンパク質と複合体化したgRNAの3’末端での修飾が異なるCas9RNPで、Amaxa Nucleofectorを用いて、ヒトCB CD34+細胞を電気穿孔した。電気穿孔から3日後、コロニー形成能のCFC分析に細胞を播種することによって、CB CD34+細胞を細胞数の倍率変化について分析して、細胞生存能力、HSC機能性を決定した後、ヒトHBB遺伝子座特異的PCR産物のT7E1アッセイおよびDNA配列決定分析による標的遺伝子座での遺伝子編集の評価のためにサンプルからgDNAを抽出した。この実験では、ポリ(A)テール修飾を有するgRNAは、T7E1アッセイ分析(図29A)およびDNA配列決定分析(図29B)の双方により決定される通り、最も高い遺伝子編集頻度を支持した。DNA配列決定分析は、最適なポリ(A)テール長さが、20Aであることを示した(図29Aおよび29B)。RNP処理細胞のコロニー形成能のCFC分析から、遺伝子編集のレベルとは関係なく、全ての編集された細胞集団は、コロニー形成能を維持することがわかった(図29C)。
効率的な遺伝子編集を達成すると共に、HSC生存能力および機能性を維持するために、5’および3’末端修飾の両方が必要であるか否かを決定するために、D10ACas9変異型タンパク質を修飾HBB−8gRNAまたは修飾HBB−15gRNAのいずれかと複合体化した。RNP複合体を混合し、CB CD34+細胞に電気穿孔(Amaxa Nucleofector)した。電気穿孔から3日後、HBB遺伝子座を分析するためのT7E1アッセイを用いて遺伝子編集についてCD34+細胞を分析し、CFCアッセイを用いて生体外での造血機能性を評価した。5’または3’末端修飾のないgRNAを含有するCas9 RNPで電気穿孔された細胞では、T7E1アッセイ分析により遺伝子編集は全く検出されなかった(図30A、左側パネル)。対照的に、様々な長さ(すなわち、10Aもしくは20A)の5’ARCAキャップ、3’ポリAテールのいずれかの付加、または5’キャップおよび3’
ポリ(A)テールの両方が、HBB遺伝子座で約10%遺伝子編集を支持した。様々な長さ(10Aもしくは20A)の5’ARCAキャップおよび3’ポリAテール末端修飾の組み合わせを含むgRNAを有するRNPを用いて処理した細胞は、増大した遺伝子編集(最大約2.5倍)を示した。全ての細胞について、RNP複合体の使用とは関係なく、造血機能性が維持された(図30B、右側パネル)。
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全本明細書で言及される文献、特許、および特許出願は、あたかも個々の出版物、特許、または特許出願が、具体的にそして個別に、参照により援用されると示されるかのように、その内容全体を参照により本明細書に援用する。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義をはじめとして、本出願が優先される。
当業者は、単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載される本開示の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または見極めることができるであろう。このような同等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。その他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲内である。
Claims (115)
- 移植のための修飾細胞を作製する方法であって、
(a)細胞を、幹細胞生存能力エンハンサーと120時間未満の期間にわたって接触させるステップ、次に、
(b)前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、gRNA分子およびCas9分子と前記細胞を接触させるステップ
を含む方法。 - 細胞において標的核酸を修飾する方法であって、
幹細胞生存能力エンハンサー;
修飾gRNA分子;および
Cas9分子
と前記細胞を接触させるステップ
を含む方法。 - 対象に修飾細胞を移植する方法であって、
幹細胞生存能力エンハンサー;
gRNA分子;および
Cas9分子
と細胞を接触させて、修飾細胞を作製するステップ、ならびに
前記修飾細胞を前記対象に移入するステップ
を含む方法。 - 前記接触ステップが、
(a)前記細胞を前記幹細胞生存能力エンハンサーと120時間未満の期間にわたって接触させるステップ、次に
(b)前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、前記gRNA分子および前記Cas9分子と前記細胞を接触させるステップ
を含む、請求項2または3に記載の方法。 - 前記gRNA分子および前記Cas9分子と前記細胞を接触させるステップが、電気穿孔を用いて実施される、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 電気穿孔の前に、前記細胞を低温ショックに付すステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。
- 電気穿孔後に、前記細胞を低温ショックに付すステップをさらに含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記細胞が、約30℃〜約32℃の温度で低温ショックに付される、請求項6または7に記載の方法。
- 前記120時間未満の期間が、約72時間である、請求項4〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記120時間未満の期間が、約24〜48時間である、請求項1または4〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記120時間未満の期間が、前記細胞の拡大を促進する上で十分に長くない期間である、請求項1または4〜8のいずれか1項に記載の方法。
- (c)前記細胞を前記幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ(b)の後に72時間未満の期間にわたって接触させるステップをさらに含む、請求項1または4〜11のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(b)の後の72時間未満の前記期間が、前記細胞の拡大をもたらす上で十分に長くない期間である、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞は、細胞の集団であり、前記細胞の集団中の細胞の数が、ステップ(b)後の72時間未満の間に5倍以上増加しない、請求項12に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞の集団であり、前記細胞の集団中の細胞の数が、ステップ(b)後の72時間未満の間に2倍以上増加しない、請求項14に記載の方法。
- ステップ(b)後の72時間未満の前記期間が、ステップ(b)後の約24〜約48時間の期間である、請求項12〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記接触ステップの終了から72時間以内にヒト対象に移入される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、前記接触ステップの終了から72時間以内に凍結保存される、請求項1、2、または4〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、前記細胞の分化を阻害し、そのプログラム細胞死を阻害し、その老化を阻害し、その自然免疫応答を阻害する、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、オートファジーまたはアポトーシスを阻害することにより、プログラム細胞死を阻害する、請求項19に記載の方法。
- 前記細胞が、対象の標的組織中に生着する、請求項3または請求項17に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞の集団を含み、前記細胞の少なくとも2%が、前記対象の前記標的組織中に生着する、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が、細胞の集団を含み、前記細胞の少なくとも15%が、前記対象の前記標的組織中に生着する、請求項21に記載の方法。
- 前記細胞が、前記対象の標的組織中に少なくとも16週間生着したままである、請求項21〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的組織が、末梢血、骨髄、または脾臓である、請求項21〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、幹細胞である、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞が、造血幹/前駆細胞(HSC)である、請求項26に記載の方法。
- 前記細胞が、循環血球、動員血球、骨髄細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、複能性前駆細胞、系列特異的前駆細胞、内皮細胞、または間葉系間質細胞からなる群から選択される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 前記接触ステップの前に、前記対象から前記細胞を単離するステップをさらに含む方法。
- ステップ(b)の後に、1つまたは複数のサイトカインを含む培地中で前記細胞を培養するステップをさらに含む、請求項1、4、または12〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のサイトカインが、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、Flt−3リガンド(FL)、インターロイキン−6(IL−6)、およびインターロイキン−11(IL−11)からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
- ステップ(b)の後に、前記細胞を培地中で培養するステップをさらに含み、ここで、前記培地が、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、ノッチ(Notch)シグナル伝達モジュレーター、TGF−βシグナル伝達モジュレーター、インスリン様成長因子結合タンパク質1(IGFBP1)、インスリン様成長因子結合タンパク質2(IGFBP2)、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子2(IGF2)、インスリン様成長因子3(IGF3)、アンジオポエチン(ANG1)、アンジオポエチン様タンパク質(ANGPTL4)、SDF1/CXCR4伝達軸モジュレーター、Wntシグナル伝達モジュレーター、またはこれらの組合せのうちの1つまたは複数を含む、請求項1、4、または12〜16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が、少なくとも1、2、3、4、5、6、または7日間培地中で培養される、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、アリール炭化水素受容体(AhR)アンタゴニストまたは自然免疫応答アンタゴニストである、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記AhRアンタゴニストが、StemRegenin−1(SR1)、LGC0006、α−ナフトフラボン、およびCH−223191からなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記AhRアンタゴニストが、SR1である、請求項35に記載の方法。
- 前記自然免疫応答アンタゴニストが、シクロスポリンA、デキサメタゾン、レスベラトロール(reservatrol)、MyD88阻害ペプチド、Myd88を標的化するRNAi剤、B18R組換えタンパク質、グルココルチコイド、OxPAPC、TLRアンタゴニスト、ラパマイシン、BX795、およびRLRshRNAからなる群から選択される、請求項34に記載の方法。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、MG132、SB431542、UM171、UM729、および16、16−ジメチルプロスタグランジンE2(dmPGE2)からなる群から選択される、請求項1〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 第2のCas9分子と前記細胞を接触させるステップをさらに含む、請求項1〜38のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、酵素的に活性なCas9(eaCas9)である、請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、標的核酸における一本鎖切断を触媒することができる、請求項40に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、標的核酸における二本鎖切断を触媒することができる、請求項40に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、野生型Cas9、ニッカーゼCas9、不活性型Cas9(dCas9)、分割型Cas9、および誘導性Cas9からなる群から選択される、請求項1〜39のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子は、N末端RuvC様ドメイン切断活性を含むが、HNH様ドメイン切断活性はない、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置N863に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、HNH様ドメイン切断活性を含むが、N末端RuvC様ドメイン切断活性はない、請求項1〜41のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置D10に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項46に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、Cas9ポリペプチドである、請求項1〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)Cas9ポリペプチドである、請求項48に記載の方法。
- 前記Cas9ポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9ポリペプチドである、請求項48に記載の方法。
- 前記gRNA分子と前記Cas9ポリペプチドが、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている、請求項48〜50のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Cas9分子が、Cas9ポリペプチドをコードする核酸である、請求項1〜47のいずれか1項に記載の方法。
- 前記gRNA分子が、修飾gRNA分子である、請求項1〜52のいずれか1項に記載の方法。
- 前記修飾gRNA分子が、5’末端キャップ構造を含む、請求項53に記載の方法。
- 前記修復gRNA分子が、3’末端ポリ−Aテールを含む、請求項53または請求項54に記載の方法。
- 前記細胞をテンプレート核酸と接触させるステップをさらに含む、請求項1〜55のいずれか1項に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)である、請求項56に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸が、アデノ関連ウイルス(AAV)または組み込み欠陥ウイルス(ILDV)に存在する、請求項56に記載の方法。
- 前記ssODNが、5’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記ssODNが、3’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記ssODNが、5’ホスホロチオエート修飾と3’ホスホロチオエート修飾を含む、請求項57に記載の方法。
- 前記細胞をトランスジーンと接触させるステップをさらに含み、ここで、前記接触ステップは、前記トランスジーンが、前記幹細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする条件下で行う、請求項1〜61のいずれか1項に記載の方法。
- 前記トランスジーンが、プロモーターとポリ−アデニンテールをさらに含む、請求項62に記載の方法。
- 前記トランスジーンが、化学療法選択マーカー、細胞表面抗原、または自殺遺伝子である遺伝子である、請求項62に記載の方法。
- 前記細胞をeiCas9分子と接触させるステップをさらに含む、請求項1〜64のいずれか1項に記載の方法。
- 前記eiCas9分子が、転写レプレッサーまたは転写アクチベーターと融合される、請求項65に記載の方法。
- 前記gRNA分子が、標的遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む、請求項1〜66のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標的遺伝子が、表4に記載されている、請求項67に記載の方法。
- 移植のための造血幹/前駆細胞(HSC)を作製する方法であって、
(a)HSCを、幹細胞生存能力エンハンサーと72時間未満の期間にわたって接触させるステップ、次に、
(b)前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、修飾gRNA分子およびCas9ポリペプチドで前記HSCを電気穿孔するステップを含み、ここで、前記修飾gRNA分子およびCas9ポリペプチドは、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されており、前記修飾gRNA分子は、3’−O−Me−m7G(5’)ppp(5’)G抗リバースキャップアナログ(ARCA)を含む5’末端修飾と、ポリアデニンテールを含む3’末端修飾とを含む方法。 - ステップ(a)の間に、以下:幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、Flt−3リガンド(FL)、インターロイキン−6(IL−6)、およびインターロイキン−11(IL−11)からなる群から選択される1つまたは複数のサイトカインと前記HSCを接触させるステップをさらに含む、請求項69に記載の方法。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、SR1、dmPGE2、またはSR1とdmPGE2の組み合わせである、請求項69または請求項70に記載の方法。
- 前記Cas9ポリペプチドが、野生型Cas9ポリペプチド、またはストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置D10に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含むCas9ポリペプチドである、請求項69〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 電気穿孔後に低温ショックに付すステップをさらに含む、請求項69〜71のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜73のいずれか1項に記載の方法によって改変される細胞。
- 請求項74に記載の細胞を含む、医薬組成物。
- 対象の疾患を治療または予防する方法であって、修飾細胞または請求項1〜73のいずれか1項に記載の方法により改変された細胞を前記対象に投与するステップを含む方法。
- 幹細胞生存能力エンハンサー;
修飾gRNA分子;および
Cas9分子
を含む幹細胞遺伝子編集システム。 - 幹細胞をさらに含み、ここで、前記幹細胞は、前記修飾gRNA分子と前記Cas9分子を含む、請求項77に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 幹細胞をさらに含み、ここで、前記幹細胞は、幹細胞生存能力エンハンサーを含む、請求項77に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、アリール炭化水素受容体(AhR)アンタゴニストまたは自然免疫応答アンタゴニストからなる群から選択される、請求項77〜79のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記AhRアンタゴニストが、StemRegenin−1(SR1)、AhRA、ジメトキシフラボン、6,2’、4’−トリメトキシフラボン、LGC0006、α−ナフトフラボン、およびCH−223191からなる群から選択される、請求項80に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記AhRアンタゴニストが、SR1である、請求項81に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記自然免疫応答アンタゴニストが、シクロスポリンA、デキサメタゾン、レスベラトロール(resveratrol)、MyD88阻害ペプチド、Myd88を標的化するRNAi剤、B18R組換えタンパク質、グルココルチコイド、OxPAPC、TLRアンタゴニスト、ラパマイシン、BX795、およびRLR阻害剤からなる群から選択される、請求項80に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記幹細胞生存能力エンハンサーが、MG132、SB431542、UM171、UM729、および16,16−ジメチルプロスタグランジンE2(dmPGE2)からなる群から選択される、請求77〜79のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記修飾gRNA分子が、5’末端キャップ構造を含む、請求項77〜84のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記修飾gRNA分子が、3’末端ポリアデニンテールを含む、請求項77〜85のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 第2のCas9分子をさらに含む、請求項77〜86のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、酵素的に活性なCas9(eaCas9)である、請求項77〜87のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記eaCas9分子が、標的核酸における一本鎖切断を触媒することができる、請求項88に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記eaCas9が、前記標的核酸における二本鎖切断を触媒することができる、請求項88に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、野生型Cas9、ニッカーゼCas9、不活性型Cas9(dCas9)、分割型Cas9、および誘導性Cas9からなる群から選択される、請求項77〜90のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、N末端RuvC様ドメイン切断活性を含むが、HNH様ドメイン切断活性はない、請求項77〜89のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置N863に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項92に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、HNH様ドメイン切断活性を含むが、N末端RuvC様ドメイン切断活性はない、請求項77〜89のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9のアミノ酸位置D10に対応するアミノ酸位置にアミノ酸突然変異を含む、請求項94に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、Cas9ポリペプチドである、請求項77〜95のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9ポリペプチドが、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)Cas9ポリペプチドである、請求項96に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9ポリペプチドが、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9ポリペプチドである、請求項96に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記gRNA分子と前記Cas9ポリペプチドが、事前に形成されたリボヌクレオチド複合体中で結合されている、請求項96〜98のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記Cas9分子が、Cas9ポリペプチドをコードする核酸である、請求項77〜95のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- サイトカインをさらに含む、請求項77〜100のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記サイトカインが、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、Flt−3リガンド(FL)、インターロイキン−6(IL−6)、およびインターロイキン−11(IL−11)からなる群から選択される、請求項101に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 以下:塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、血管内皮細胞成長因子(VEGF)、ノッチ(Notch)シグナル伝達モジュレーター、TGF−βシグナル伝達モジュレーター、インスリン様成長因子結合タンパク質1(IGFBP1)、インスリン様成長因子結合タンパク質2(IGFBP2)、インスリン様成長因子1、インスリン様成長因子2(IGF2)、インスリン様成長因子3(IGF3)、アンジオポエチン(ANG1)、アンジオポエチン様タンパク質(ANGPTL4)、SDF1/CXCR4伝達軸モジュレーター、またはWntシグナル伝達モジュレーターのうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項77〜102のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- テンプレート核酸をさらに含む、請求項77〜103のいずれか1項に記載の方法。
- 前記テンプレート核酸が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ssODN)である、請求項104に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記テンプレート核酸が、アデノ関連ウイルス(AAV)または組み込み欠陥ウイルス(ILDV)に存在する、請求項104に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記ssODNが、5’ホスホロチオエート修飾、3’ホスホロチオエート修飾、または5’ホスホロチオエート修飾と3’ホスホロチオエート修飾の両方を含む、請求項105に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記gRNA分子が、標的遺伝子内の標的ドメインと相補的な標的化ドメインを含む、請求項77〜107のいずれか1項に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 前記標的遺伝子が、表4に記載されている、請求項108に記載の幹細胞遺伝子編集システム。
- 標的核酸中に修飾を含む幹細胞であって、前記幹細胞を(a)幹細胞生存能力エンハンサーと120時間未満の期間にわたって接触させた後、(b)前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、gRNA分子およびCas9分子と接触させた、幹細胞。
- 前記幹細胞を(c)前記幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ(b)の後に72時間未満の期間にわたってさらに接触させた、請求項110に記載の標的核酸中に修飾を含む幹細胞。
- ステップ(b)の後の72時間未満の前記期間が、前記幹細胞の拡大をもたらすのに十分に長くない期間である、請求項110に記載の標的核酸中に修飾を含む幹細胞。
- 標的核酸中に修飾を含む幹細胞の集団であって、前記幹細胞の集団を(a)幹細胞生存能力エンハンサーと120時間未満の期間にわたって接触させた後、(b)前記幹細胞生存能力エンハンサーの非存在下で、gRNA分子およびCas9分子と接触させた、幹細胞の集団。
- 前記幹細胞の集団を(c)前記幹細胞生存能力エンハンサーと、ステップ(b)の後に72時間未満の期間にわたってさらに接触させた、請求項113に記載の幹細胞の集団。
- ステップ(b)の後の72時間未満の前記期間が、前記幹細胞の拡大をもたらすのに十分に長くない期間である、請求項113に記載の幹細胞の集団。
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