JP2018510891A

JP2018510891A - 抗菌性インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物抽出物及びその使用

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Publication number: JP2018510891A
Application number: JP2017552867A
Authority: JP
Inventors: フィリップ・アンドレ; ローラン・シャンタラ; イン−ク・リン
Original assignee: ガルデルマ・ソシエテ・アノニム
Priority date: 2015-04-09
Filing date: 2016-04-08
Publication date: 2018-04-19
Also published as: US10668120B2; EP3280428A1; US20180110819A1; WO2016162490A1

Abstract

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌を阻害するための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を含む医薬組成物又は化粧料組成物、及び有効量のインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を、それを必要とする細胞に接触させる工程を含む、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌を阻害する方法が記述される。

Description

本発明は、抗菌性インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物抽出物及びその使用、特に黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（S. aureus）の過剰コロニー形成（ハイパーコロナイゼーション）又は感染により引き起こされる皮膚疾患又は状態を処置するためのものに関する。

インジゴナチュラリス（Indigo Naturalis）は、バフィカカンサス・クッシア（Baphicacanthus cusia）等のインジゴ含有植物の葉から得られる、濃い青色の粉末である。インジゴナチュラリスは、解熱、抗炎症、抗ウイルス、抗菌、及び解毒用途に用いられる、何世紀も続く中国の漢方薬である。

Finn, R.K. Theory of Agar Diffusion Methods for Bioassay. Anal Chem. 1959, 31, 975-977

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）を含む黄色ブドウ球菌によって引き起こされる皮膚疾患又は状態を処置するのに有用な抗菌性インジゴナチュラリス抽出物を開発することが、常に望ましい。

処置することができる病理又は皮膚状態は：膿痂疹（とびひ）、毛嚢炎、せつ（フルンケル）、癰、重複感染した皮膚疾患、及び過剰コロニー形成された皮膚状態を含む表在性皮膚感染症であり、アトピー性皮膚炎及び皮膚バリアが変化する他の状態を含む。

本発明は、本発明中に言及される細菌を阻害するするための、及び該細菌により引き起こされる皮膚疾患を処置するための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物、及び前記インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を含む医薬組成物又は化粧料組成物に関する。

一施態様において、本発明は、枯草菌（Bacillus subtilis）、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermis）、肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、及び緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）から成る群から選択される細菌を阻害するための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を提供する。好ましくは、細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である。

いくつかの実施態様において、本発明は、前述の細菌の1以上により引き起こされる皮膚疾患の処置における使用のための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を提供する。別の態様において、本発明は、枯草菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌から成る群から選択される細菌を阻害するための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を含む医薬組成物又は化粧料組成物を提供する。好ましくは、細菌はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌である。

特定の実施態様において、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、インジルビン（indirubin）を、抽出物の少なくとも65% w/w、好ましくは抽出物の65%〜90% w/wの量で含む。

いくつかの実施態様において、本発明は、前記細菌の1種以上により引き起こされる皮膚疾患を処置するために用いられる、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を含む医薬組成物又は化粧料組成物を提供する。

別の態様において、本発明は、有効量のインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を、それを必要とする細胞に接触させる（インビトロ又はインビボを含む）工程を含む、枯草菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌から成る群から選択される細菌を阻害するための方法を提供する。

いくつかの実施態様において、本発明は、有効量のインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、枯草菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌から成る群から選択される1種以上の細菌により引き起こされる皮膚疾患を処置するための方法を提供する。

別の態様において、本発明は、枯草菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌から成る群から選択される細菌を阻害するための医薬の調製における、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の使用を提供する。

いくつかの実施態様において、組成物は、前記細菌の1種以上により引き起こされる皮膚疾患を処置するために用いられる。

いくつかの実施態様において、黄色ブドウ球菌は、市中感染型のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）、B群レンサ球菌、C群レンサ球菌、及びG群レンサ球菌から成る群から選択されてもよく、これらを試験した。

インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、出発材料としてのインジゴナチュラリス又はインジゴ産生若しくはインジゴ含有植物から得られる任意の抽出物を含む。

本願明細書において何らかの先行技術文献（刊行物）が参照される場合、そのような参照は、その刊行物が当該分野の一般常識の一部を形成しているということの承認を構成しないことが理解されるべきである。

インジゴナチュラリスは、青黛（Qingdai）としても知られ、インジゴフェラ・ティンクトリア（Indigofera tinctoria）L.、バフィカカンサス・クッシア (Nees) Bremek（異名ストロビランテス・クッシア（Strobilanthes cusia） (Nees)）、ペルシカリア・ティンクトリア（Persicaria tinctoria） (Aiton) Spach.（異名ポリゴヌム・ティンクトリウム（Polygonum tinctorium） Aiton、Ｐ．ティンクトリウム Lour.）、イサティス・ティンクトリア（Isatis tinctoria） L.（異名イサティス・インジゴティカ（Isatis indigotica） Fort.）、及びＳ．フォルモサヌス（formosanus）を含む1種以上の植物より、例えば植物の葉又は茎より得られ、葉及び/又は茎は、収穫及び回収の後に、発酵により処理されてもよい。青黛とは、インジゴナチュラリスの現行名である。インジゴナチュラリスは、通常は濃い青色の粉末である。インジゴ含有又はインジゴ産生植物から、NaOH又はKOHの水性溶液を用いて得られ、アルカロイド（その中にはインジゴ及びインジルビンが存在する）を含むおよそ5〜15%の有機化合物、並びに炭酸カルシウム及び水酸化カルシウム等の85〜95%の無機化合物の混合物に相当する。

本願明細書において用いられるインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、インジゴナチュラリスからの抽出物、又は1種以上のインジゴ含有植物若しくはインジゴ産生植物の葉及び/若しくは茎（若しくはその一部）からの抽出物を指し、抽出は、有機溶媒及び/若しくは非有機溶媒、又はこれらの組合せを用いて行ってもよい。抽出物は、（インジゴナチュラリス中に存在するよりも高いw/wパーセンテージを有する）強化（濃縮）成分、例えばトリプタントリン、イサチン（isatin）、インジルビン、インジゴ、又はチンダイノンを含んでもよい。抽出物は、固体、液体、又はその間の任意の形態（例えば半固体）であってよい。

特定の実施態様において、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、インジルビンが強化されており、例えば抽出物は、インジルビンを抽出物の少なくとも65%、例えば、抽出物の65%〜90% w/wの量で含有してもよい。抽出物は、インジゴを、抽出物の0.1%〜15% w/wの量でさらに含有してもよい。また、抽出物は、トリプタントリン及び/又はチンダイノンも、各々0.1〜5% w/wの量で含んでもよい。

インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物の一例は、酢酸エチル抽出物（EA-抽出物）であり、本発明の実施例1のように調製してもよい。抽出物中の各成分の含有量は変動し得る。一例として、抽出物は、インジルビンを抽出物の少なくとも65% w/w、例えば、抽出物の65%〜90% w/wの量で含有してもよい。抽出物は、インジゴを、抽出物の0.5%〜15% w/wの量でさらに含有してもよい。また、抽出物は、トリプタントリン及び/又はチンダイノンも、それぞれ0.1〜5% w/wの量で含んでもよい。

インジゴナチュラリス抽出物のさらなる例は、油抽出物、特にオリーブ油抽出物である。油抽出物は、US 8,784,905号特許に開示されている方法により調製することができる。より具体的には、インジゴナチュラリスの油抽出物は、インジゴナチュラリス粉末を加熱しながら油で抽出する工程を含み、場合によりその後にろ過による精製処理を行う方法により得られる、インジゴナチュラリスの油抽出生成物である。より好ましくは、前記方法において、油抽出生成物は、精製処理が低減されたインジゴ含有量を有する後に、得られる。前記方法において、インジゴナチュラリス粉末を抽出する工程は、より好ましくは155℃を超えない上昇させた温度で行い、好ましくは100℃〜155℃の範囲の温度で行う。前記方法において用いられる油は、好ましくは、植物油、動物油、鉱油、及びこれらの組合せから成る群から選択される。より好ましくは、油は植物油であり、オリーブ油、綿実油、ゴマ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、コムギ胚芽油、ダイズ油、ホホバ油、月見草油、ヤシ油、パーム油、スイートアーモンド油、アロエ油、アンズ核油、アボカド油、ルリジサ種子油（borage oil）、麻種子（ヘンプシード）油、マカデミアナッツ油、ローズヒップ油、ペカン油、ヘーゼルナッツ油、サザンカ油、コメヌカ油、シアバター、コーン油、ツバキ油、ブドウ種子油、カノラ油、ヒマシ油、及びこれらの組合せから成る群から選択することができる。抽出物中の各成分の含有量は変動し得る。一例として、抽出物は、インジルビンを抽出されたアルカロイドの総量の少なくとも65% w/w、例えば、抽出されたアルカロイドの総量の65%〜90% w/wの量で含有してもよい。抽出物は、インジゴを、抽出されたアルカロイドの総量の0.1%〜15% w/wの量でさらに含有してもよい。また、抽出物は、トリプタントリン及び/又はチンダイノンも、抽出されたアルカロイドの総量の各々0.1〜5% w/wの量で含有してもよい。

インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物の別の例は、以下の：
a) 抽出工程：インジゴナチュラリス、又はインジゴフェラ・ティンクトリア L.、バフィカカンサス・クッシア (Nees) Bremek（異名ストロビランテス・クッシア (Nees)）、ペルシカリア・ティンクトリア (Aiton) Spach.（異名ポリゴヌム・ティンクトリウム Aiton、Ｐ．ティンクトリウム Lour.）、及びイサティス・ティンクトリア L.（異名イサティス・インジゴティカ Fort.）、及び/又はストロビランテス・フォルモサヌスから成る群から好ましくは選択される、1種以上のインジゴ含有植物若しくはインジゴ産生植物の葉及び/若しくは茎を、第一の極性溶媒又は中程度の極性溶媒を用いて抽出し、抽出の混合物を得る工程；
b) 濾過工程：抽出の混合物を濾過して濾液を得る工程；
c) 濃縮工程：濾液を濃縮して粗抽出物を得る工程；
d) 洗浄工程：粗抽出物を、無極性溶媒と場合により第二の極性溶媒とで洗浄して、洗浄混合物を得る工程；並びに
e) 濾過工程：洗浄混合物を濾過し、場合により例えば従来技術の乾燥方法による乾燥工程の後に、精製抽出物を得る工程
を含む方法により調製される抽出物である。

特定の実施態様において、濃縮工程c)から得られた粗抽出物は、精製抽出物を得るまで、以下の手順に少なくとも1サイクル供される：粗抽出物を溶媒により洗浄し（工程d)）、濾過して（工程(e)）精製抽出物を生成し、場合により続いて乾燥工程を行う。特定の実施態様によれば、洗浄工程d)及び濾過工程e)を1サイクルのみ行って精製抽出物を得る。1より多いサイクルを適用する場合、洗浄のために同一の又は異なる溶媒を用いることができる。さらに、粗抽出物を溶媒を用いて還流下で洗浄することができ、混合物を室温まで冷却してその後に濾過し、精製抽出物を生成することができ、場合により続いて乾燥工程を行う。

好ましい実施態様において、2回のサイクルを行う。特に、濃縮工程c)により得られた粗抽出物を、無極性溶媒、好ましくはヘキサンで洗浄し（工程d）、濾過し（工程e）、場合によりその後に乾燥工程を行う。ヘキサン抽出物を、その後有機極性溶媒、好ましくはエタノールにより洗浄し（工程d）、その後濾過して（工程e）、精製抽出物を得、場合により続いて乾燥工程を行う。

場合により、微粉化工程を工程e)の後に行い、それにより25〜35 μmの間、好ましくは約30 μmの粒径を有する精製抽出物を提供する。

別の好ましい実施態様において、精製抽出物が最後の工程において微粉化される場合、得られる粒子の99%が30 μm以下である。

好ましい実施態様において、精製抽出物を、以下から成る工程を含む方法により調製してもよい：a) (i)抽出溶媒、すなわち極性又は中程度に極性の溶媒（例えばアルコール又は酢酸エチル）を、インジゴナチュラリス粉末に加えて混合物を生成する工程；(ii)混合物を一定時間（例えば30分間、1時間、2時間）加熱及び攪拌する工程；b) (iii)加熱した混合物を熱い間に濾過して不溶性の副生成物を取り除き、濾液を生成する工程；c) (iv)濾液を濃縮して粗抽出物を生成する工程；d) (v)洗浄溶媒（例えば水、非極性及び/若しくは極性溶媒又はこれらの混合物）を粗抽出物に加えて洗浄混合物を生成する工程；(vi)洗浄混合物を一定時間（例えば30分間、1時間、2時間）加熱及び攪拌する工程；e) (vii)洗浄混合物を、例えば室温（例えば18〜35℃）で濾過して精製抽出物を回収する工程；場合により(viii)精製抽出物中のインジルビンの量（% w/w）が、HPLC法により測定して、55% (w/w)より多く、好ましくは65% (w/w)より多くなるまで、工程(v)〜(vii)を繰り返す工程、及び場合により(ix)従来の方法（例えば風乾、凍結乾燥）に従って残渣を乾燥して乾燥抽出物を得る工程。工程(v)及び(viii)中の洗浄溶媒は、同一であっても異なっていてもよい。

より好ましい実施態様において、精製抽出物は：
a) インジゴナチュラリスを、エタノールを用いて還流で2〜8時間、抽出する工程、
b) 混合物を65℃以上の温度で濾過して濾液を得る工程、
c) 濾液を濃縮して粗抽出物を得、溶媒及び溶媒に依然として存在している最後の成分を完全に取り除くために前記粗抽出物を場合により（水を加えて）濾過し、乾燥させる工程、
d) (i)粗抽出物を、ヘキサンで、50℃以上の温度で15〜60分間洗浄する工程、
(ii)工程d) (i)で得られた混合物を室温で濾過して生成物を得、これを場合によりエタノール及び水ですすぐ工程
(iii)工程d) (ii)で得られた生成物を、エタノールを用いて還流で洗浄する工程、及び
e) 工程d)で得られた洗浄混合物を室温で濾過し、生じた生成物を80℃未満の温度で乾燥させて抽出物を得、これを場合により微粉化する工程
を含む方法により調製される。

別の好ましい実施態様において、最後の工程で精製抽出物が微粉化される場合、粒径はおよそ99%が25〜35 μmの範囲、好ましくは約30 μmである。

本願明細書において用いられる「約」又は「およそ」は、当業者に理解されるものであり、用いられる文脈においてある程度変動する。それが用いられる文脈から考えて当業者に明確でない用語の使用がある場合、「約」又は「およそ」は、特定の用語の最大プラス又はマイナス20%、好ましくは10%を意味する。

本願明細書において用いられる用語「精製抽出物」は、前記精製抽出物を調製するための方法において用いられた水及び/又は溶媒を10% (w/w)未満含有する、固体、半固体、又は油性の抽出物を指す。精製抽出物は、より好ましくは、青黛又はインジゴナチュラリスと比較して、アルカロイド（その中にはインジゴ、インジルビン、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンが存在する）を含む、好ましくはインジルビンが強化された、増加した有効成分の量を特徴とする。より具体的には、本発明に係る精製抽出物は、少なくとも60%、又はより好ましくは65% (w/w)より多い、インジゴ、インジルビン、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンを含む有効成分を含有する。

本願明細書において用いられる用語「粗抽出物」は、精製抽出物を調製するための方法において用いられた水及び/又は溶媒を15% (w/w)未満（例えば5〜15%、5〜10%）含有する、固体、半固体、又は油性の抽出物を指す。粗抽出物は、精製抽出物ほどは青黛又はインジゴナチュラリスと比較してインジルビンが強化されていない。粗抽出物は、本発明に係る濃縮工程c)により得られる。濃縮工程は、より具体的には、方法中で用いられた水及び/又は溶媒を取り除き、それにより、インジゴ、インジルビン、トリプタントリン、及び/又はチンダイノンを含む、抽出物中に存在する有効成分を濃縮するように、濾液を（例えば減圧の）濃縮器に送液することにより行われる。

本願明細書において用いられる「1サイクル」は、連続して1回行われる、洗浄工程d)及び濾過工程e)の2つの工程を指す。本願明細書において用いられる「2サイクル」は、連続して2回行われる、洗浄工程d)及び濾過工程e)の2つの工程を指す。

特定の実施態様によれば、本発明に係るインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、上で規定した油抽出物であるか、又は、工程(a)〜(e)を含み、上述の特定の実施態様の1つを場合により含む、上で詳述した方法により得られる、インジゴ産生植物の抽出物である。

本願明細書において用いられる、1種以上の前述の細菌により引き起こされる皮膚疾患は、前記細菌の1種以上の正常な皮膚への、又は例えば湿疹/皮膚炎又は傷からの損傷した皮膚への侵入により引き起こされる状態又は疾患を指す。

本願明細書において用いられる、有効量は、概して患者に治療的有用性（例えば、1種以上の前述の細菌により引き起こされる皮膚の疾患、障害、又は症状の改善、緩和、又は治癒）をもたらすインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物の用量レベル；又は細菌の生育を阻害するか又は細菌を殺す、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物の用量レベルを指す。

本発明は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌を阻害するための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を含む組成物を提供する。インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、1以上の前述の細菌により引き起こされる皮膚疾患を処置するために、好ましくは前記皮膚疾患を局所的に処置するために、用いてもよい。インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、さらなる製剤化を行うことなく用いられてもよいし、又は抽出物を含む医薬組成物若しくは化粧料組成物に含まれてもよい。

抽出物は、インジルビンを、抽出物の少なくとも65% w/w、例えば、抽出物の65%〜90% w/wの量で含んでもよい。抽出物は、インジゴを、抽出物の0.1%〜15% w/wの量でさらに含んでもよく、また、別のさらなる実施態様において、抽出物は、インジゴを抽出物の0.1%〜15% w/wの量で、並びにトリプタントリン及び/又はチンダイノンを各々抽出物の0.1〜5% w/wの量で、含んでもよい。

本発明の組成物、方法、又は使用は、単独で（すなわち現在の処置の代替で）用いてもよいし、又は現在の処置と組み合わせて用いて、これらの有効性を改善してもよい。

一実施態様において、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、唯一の有効成分として（例えば単独療法として）用いられる。この実施態様によれば、組成物は、好ましくはインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を唯一の有効成分として含む。

別の実施態様において、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物は、少なくとも1つの他の治療法と組み合わせて用いることができる。

医薬組成物は、当業者に周知の技術を用いて局所又は経口投与のための適切な剤形に製剤化されてもよい。医薬組成物は、製剤の分野で広く採用されているもの等の医薬的に許容される担体を追加的に含むことができる。例えば、医薬的に許容される担体には、以下の剤の1種以上を含んでもよい：オリーブ油、オリーブ油（精製）、綿実油、ゴマ油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、コムギ胚芽油、ダイズ油、ホホバ油、月見草油、ヤシ油、パーム油、スイートアーモンド油、アロエ油、アンズ核油、アボカド油、ルリジサ種子油、麻種子油、マカデミアナッツ油、ローズヒップ油、ペカン油、ヘーゼルナッツ油、サザンカ油、コメヌカ油、シアバター、コーン油、ツバキ油、ブドウ種子油、カノラ油、ヒマシ油、及びこれらの組合せ等の溶媒、好ましくはオリーブ油（精製）、乳化剤、懸濁化剤、分解剤、結合剤、賦形剤、安定化剤、キレート剤、希釈剤、ゲル化剤、増粘剤、例えばミツロウ及び/又はワセリン、防腐剤、滑沢剤、吸収遅延化剤、リポソーム、抗酸化剤、例えばブチルヒドロキシトルエン又はブチルヒドロキシアニソール等。医薬組成物に適した局所製剤は、エマルション、ゲル、軟膏、クリーム、パッチ、塗布剤（embrocation）、エアロゾル、スプレー、ローション、セラム、ペースト、フォーム、又は滴下剤（drop）であってもよい。いくつかの実施態様において、医薬組成物は、本発明に係る抽出物と、当該分野で周知かつ一般的に用いられるもの等のベースとを混合することにより、外用剤に製剤化される。

特定の実施態様によれば、本発明の組成物、方法、又は使用は、細菌により引き起こされる皮膚疾患の局所的処置に適している。

いくつかの実施態様において、本発明に係る医薬組成物の用量及び投与の頻度は、以下の因子に応じて変動し得る：処置する疾患の重症度、投与の経路、並びに処置する対象の体重、年齢、身体状態、及び応答。さらなる又は追加的な実施態様において、抽出物の量は、約0.001〜約1000 mg/体重（kg）/日（体重1kg当たり1日のmg）、例えば、約0.01〜約500、300、又は100 mg/体重（kg）/日の範囲である。さらなる又は追加的な実施態様において、投与は、毎日、又はさらには必要であれば1日複数回行うことができる。例として、本発明の抽出物を、週に1回、2回、3回、4回、5回、若しくは6回、若しくはそれ以上、又は1日1回、2回、3回、若しくは4回、若しくはそれ以上、投与することができる。処置の継続期間は、変動してもよく、疾患の重症度に依存する。例えば、1週間〜数ヶ月間（例えば2、3、4、5、6、又は7週間から12、18、24、30、又は36週間）、続いてもよい。

また、本発明は、抽出物を含む化粧料組成物も提供する。組成物は、化粧料的又は皮膚科学的に許容される担体又は媒体を含む、局所適用に適応した形態で存在してもよい。「化粧料的又は皮膚科学的に許容される」とは、毒性、不耐容（過敏症）、不安定性、アレルギー反応等の危険をもたらすことのない、皮膚又はヒトの皮膚付属器と接触する使用に適した媒体を意味する。化粧料組成物において、抽出物は、1種以上の化粧料的又は皮膚科学的に許容される溶媒、例えば水、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシ化若しくはプロポキシ化ジグリコール、環状ポリオール、ワセリン、植物油、又はこれらの溶媒の任意の混合物に予め可溶化されていてもよい。

本発明に係る組成物は、組成物1g当たり0.001〜10 mg、例えば0.01〜1 mgの1種以上の有効成分を含有してもよい。

また、本発明は、有効量のインジゴナチュラリス若しくはインジゴ産生植物抽出物、又はトリプタントリン、イサチン、及びこれらの誘導体から成る群から選択される化合物を、それを必要とする細胞に接触させることにより、枯草菌、黄色ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、及び緑膿菌から成る群から選択される細菌を阻害するための方法も提供する。さらに、本発明は、有効量のインジゴナチュラリス若しくはインジゴ産生植物又はトリプタントリン、イサチン、及びこれらの誘導体から成る群から選択される化合物を、それを必要とする対象に投与することによる、前述の細菌の1種以上により引き起こされる皮膚疾患の処置の方法を提供する。上述の抽出物及び組成物は、疾患又は状態の処置又は緩和に用いることができる。処置とは、対象を苦しめている病的状態に関連する症状の少なくとも緩和を意味し、ここで緩和は、広義の意味で用いられ、処置する病的状態に関連する変数（パラメーター）、例えば症状、の大きさ（重大さ）を少なくとも低減することを指す。また、そのようなものとして、処置には、病的状態、又は少なくともそれに関連する症状が完全に阻害されて、例えば発生が防止され又は停止され、例えば終結され、宿主がもはやその病的状態、又は少なくともその病的状態を特徴付ける症状に罹患していない、状況も含まれる。そのようなものとして、処置には、疾患状態を治癒することと管理することの両方が含まれる。したがって、上述の抽出物及び組成物は、1種以上の前述の細菌により引き起こされる皮膚の処置又は緩和において用いることができる。

抽出物及び組成物の有効性は、疾患又は障害の処置におけるこれらの活性に関するインビボモデル、例えばヒトでの治験により評価することができる。

本願の新規の特徴は、添付の特許請求の範囲において入念に（精密に）説明される。本願の特徴及び利点についてのより良い理解は、本願の原理を利用する例示的実施態様を説明する、以下の詳細な説明を参照することにより得られる。

本発明の実施態様を本願明細書で示し説明してきたが、そのような実施態様は、例としてのみ提供される。上述の実施態様は両立できる場合は組み合わせてもよく、本願明細書に記述される本発明の実施態様の様々な代替を、本発明の実施の際に採用してもよいことが、理解されるべきである。当業者であれば、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び置換が可能であることを理解する。以下の請求項が、本発明の態様の範囲を規定すること、及びこれらの請求項の範囲内の方法及び構造並びにこれらと同等のものが、その対象となることが意図される。

本願明細書において何らかの先行技術文献（刊行物）を参照する場合、そのような参照は、その刊行物が当該分野の一般常識の一部を形成しているという承認を構成しないことが理解されるべきである。特許、特許出願、記事、書籍、取扱説明書、及び論文を含むがこれに限定されない、本発明において引用される全ての文書又は文書の一部分は、いかなる目的においても、その全体が参照により本願明細書に明確に包含される。

本願明細書の百分率（パーセンテージ）は、別段の定めが無い限り、抽出物の質量に対する質量により表される。

本発明のさらなる態様及び利点を、以下の例示的実験の項において開示する。

「１．調製例」
「1.1 インジゴ産生植物の調製（実施例1）」
Ｓ．フォルモサヌスを台湾の新北市三峡（Sansia）にて収穫した。収穫したＳ．フォルモサヌスの葉を、葉が微生物の働きによって分解されるまで、水に数日間浸漬した。その後、石灰を懸濁液に加えてインジゴナチュラリスを沈殿させた。

「1.2 Ｓ．フォルモサヌス及びインジゴナチュラリスの酢酸エチル（EA）抽出物の調製（実施例2）」
Ｓ．フォルモサヌスの葉を、オーブン（40℃）で3日間乾燥させた。25 gの乾燥Ｓ．フォルモサヌス葉を、300 mLのEAを用いて40℃で1時間抽出した。インジゴナチュラリス（25 g）も同じ手順によりにより抽出した。その後、2つのサンプル中のEA抽出可能な化合物を、15℃での遠心分離（12,000 x g、20分間）により残渣から分離した。上清を回収し、減圧下で蒸発乾固させ、バイオアッセイ用に-20℃で保存した。

「1.3. 精製されたインジゴナチュラリス抽出物の調製」
実施例3:
以下の調製物中で用いた青黛は、Delong Pharmaceuticalより得られる（インジゴ2.62%及びインジルビン0.284%（実施例7Aに示すHPLC法）及びトリプタントリン0.0046%。

500 gの青黛を、10 L酢酸エチル中に懸濁した。混合物を還流中で2時間攪拌し、その後75℃で濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、暗色の固体を得た。粗抽出物を250 mLヘキサン中で攪拌し、1時間加熱還流した。室温まで冷却した後、懸濁液を濾過し、暗色の残渣を得た。

0.50gの暗色の残渣を25 mLヘキサン中で再度1時間還流、室温まで冷却し、続いて濾過して暗赤色の固体452 mgとして精製抽出物を得た。HPLC：62.9%インジルビン、12.9%インジゴ、及び0.53%トリプタントリン。

実施例4:
実施例1で使用した500 gの青黛を10 Lアルコール（エタノール）中に懸濁した。混合物を還流中で2時間攪拌し、その後75℃で濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、暗色の固体を得、これを260 mLヘキサン中で攪拌し、1時間加熱還流した。室温まで冷却したら、懸濁液を濾過し、暗色の残渣を得た。

0.80 gの暗色の残渣を24 mLアルコール（エタノール）中でさらに1時間還流し、次いで室温まで冷却し、続いて濾過して暗赤色の固体（538 mg）として精製抽出物を得た。HPLC：83.6%インジルビン、6.35%インジゴ、及び0.75%トリプタントリン。

実施例5:
実施例1で使用した500 gの青黛を10 L酢酸エチル中に懸濁した。混合物を還流中で2時間攪拌し、その後熱いうちに濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、暗色の固体を得た。粗抽出物を250 mLヘキサン中で攪拌し、1時間加熱還流した。室温まで冷却後、懸濁液を濾過し、暗色の残渣を得た。

0.75gの暗色の残渣を22.5 mLエタノール中で1時間還流し、室温まで冷却し、続いて濾過して暗赤色の固体（538 mg）として精製抽出物を得た。HPLC：77.9%インジルビン、15.9%インジゴ、及び0.56%トリプタントリン。

実施例6:
実施例1で使用した500 gの青黛を2.1LのDMF中に懸濁した。混合物を50℃で40分間攪拌した。20℃まで冷却したら、懸濁液を濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、暗色の固体を得、これを130 mLヘキサン中で攪拌し、1時間加熱還流した。20℃まで冷却したら、懸濁液を濾過し、暗色の残渣を得た。

1.56gの暗色の残渣を46.8 mlエタノールで洗浄し、1時間加熱還流し、その後20℃まで冷却し、続いて濾過して精製抽出物（766 mg）を得た。HPLC：66.3%インジルビン、9.76%インジゴ。

実施例7:
実施例1で使用した500 gの青黛を3 LのDMF中に懸濁した。混合物を30℃で1時間攪拌し、その後濾過した。濾液を減圧下で濃縮し、暗色の固体を得、これを230 mLヘキサン中で攪拌し、1時間加熱還流した。20℃まで冷却したら、懸濁液を濾過し、暗色の残渣を得た。

1.96 gの暗色の残渣を59 mLの85%エタノール（85%アルコール水溶液）で洗浄し、1時間加熱還流し、続いて熱いうちに濾過して精製抽出物（1.02 g）を得た。HPLC：69.4%インジルビン、18.7%インジゴ、及び0.62%トリプタントリン。

実施例8:
100 gの青黛を2 Lのエタノール92%（92%水性エタノール）で2時間還流条件下で抽出した。完了したら、混合物を熱いうちにAF6フィルター（Buchner）で濾過して、濾液として暗い青〜赤色の溶液を得た。この濾液を真空下で減圧乾固し、2.4 gの乾燥残渣を得た。この残渣を還流下で120 mLのヘキサンで1時間洗浄した。完了したら、混合物を室温まで2時間冷却し、その後真空下で濾過して312.9mgの暗赤色の精製抽出物を得た。

この精製抽出物の280 mgを、15 mLのエタノール92%（92%水性エタノール）で1時間還流下で洗浄した。完了したら、溶液を室温まで冷却し、その後濾過して、オーブン（80℃）での1時間30分の乾燥の後に、159 mgの暗赤/バーガンディ色の精製抽出物を得た（0.18%）；HPLC：82.31%インジルビン、8.99%インジゴ、及び0.81%トリプタントリン。

実施例9：微粉化工程
前述の実施例において得られた精製されたインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物の微粉化工程を、以下の設備を用いて行う：
-マイクロナイザー：螺旋状ジェット式Mill Diameter 200
-フィーダー：この設備は、投与量の粉末をマイクロナイザーに供給するために用いられる。投与量は、2つのスクリューによって作られる。このシステムにより、流れを規則的にすることができる。

微粉化は、空気の噴射により粉末の粒を投射する工程から成る。粒同士の接触により、粒が破裂する。

以下の微粉化のパラメータが、微粉化中に記録される：
-リング圧力：6 bar
-インジェクタ圧力：3 bar
-粉末フィードの流量：25 kg/h

マイクロナイザーは、円筒状の囲いを与える−囲いの周りの穴は空気の注入のためである。

粉体がマイクロナイザー内に導入される；粒は空気の噴射により推進される。粒は、良好な大きさになったら、マイクロナイザーの中央に集められ、吸い込まれる。異物粒子や設備の破片によるコンタミネーションを避けるために、追加の篩別（篩：700 μm）を行う。

本工程は、微粉化の後かつ包装の前に手動で行う。

得られた均一な生成物の粒度分析的解析を、粒度分布（particular size distribution）（PSD）法に従って行った［分析的仕様：D99≦30 μm］。

「２．インジゴナチュラリス抽出物の抗菌活性」
(1) 実験の項
（化学物質及び微生物株）
使用した化学物質は、分析グレードであり、BD Diagnostics（スパークス、メリーランド州、米国）、Sigma-Aldrich（セントルイス、ミズーリ州、米国）、Merck（ダルムシュタット、ドイツ）、及びRoth（カールスルーエ、ドイツ）より購入した。抗菌活性は、ヒト病原体、例えばＫ．ニューモニエ ATCC 13883、緑膿菌 ATCC 27853、黄色ブドウ球菌 ATCC 6538、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA） ATCC 43300、及び肺炎レンサ球菌 ATCC 33400（表１）を含む、広範囲の細菌に対して試験した。試験した微生物株は、American Type Culture Collection（ATCC；マナサス、バージニア州、米国）より購入した。これらの株を培養するために使用した培地は、ATCCウェブサイト（http://www.atcc.org）の推奨培地リストに従って調製した。

（寒天拡散アッセイ）
新鮮な前培養液を得るために、試験株をまず250 mlの三角フラスコ中の60 mlの培地中で培養した。種々の細菌株についての培地及びインキュベーション温度を、表１に要約する。インキュベーションは、振盪（180 rpm）を伴う好気条件下で行い、試験株の生育は、600 nmでの光学密度（OD）を測定することにより決定した。対数増殖期にある培養液（OD_600nmが0.5〜0.8に達する；1 cmの光路長で）を、OD_600nm＝0.1まで希釈し、直ちに続く抗菌アッセイに使用した。EA抽出物の抗菌活性は、Finnにより記述される寒天拡散アッセイ[Finn, R.K. Theory of Agar Diffusion Methods for Bioassay. Anal Chem. 1959, 31, 975-977]により試験した。生物活性化合物を含むディスク（直径6mm）（ディスク当たり10、25、50、又は100 μg)を、試験株を播種した寒天プレート上に置いた。生物活性化合物の抗菌活性は3重で試験した。至適温度での24時間のインキュベーション（表１参照）の後、阻害ゾーンの直径（阻害ゾーンの直径−ディスクの直径)をmmで測定した。内部対照には、真正の抗生物質（カナマイシン、ペニシリン、及び試験細菌株に対するテトラサイクリン）を使用した。

（統計解析）
全ての実験を少なくとも3回繰り返した。データを平均値±標準偏差として表した。

(2) インジゴナチュラリスEA-抽出物の抗菌活性（実施例2)
この試験では、寒天拡散アッセイを利用してインジゴナチュラリスEA-抽出物（ディスク当たり0〜4 mgの範囲の実施例2)の抗菌作用を評価した。なぜならば、(1)試験した微生物の一部は液体培地中で均一に生育することができなかった；(2)インジゴナチュラリス抽出物の色が濃い青色であったからである。これらの条件により、マイクロタイタープレートアッセイはこの試験には不適当であった。

グラム陽性細菌の5つの株、グラム陰性細菌の3つの株を抗菌アッセイに使用した（表１）。これらの中で、黄色ブドウ球菌 ATCC 6538、MRSA ATCC 43300、肺炎レンサ球菌 ATCC 33400、Ｋ．ニューモニエ ATCC 13883、及び緑膿菌 ATCC 27853は、ヒトの病原菌である。加えて、表皮ブドウ球菌 ATCC 12228は、皮膚の日和見病原菌である。

表２は、インジゴナチュラリスEA-抽出物（実施例2）の試験細菌に対する生育阻害活性を示す。結果により、インジゴナチュラリスEA-抽出物が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、及びMRSAに対して有意な阻害作用を有することが明らかになった。それにも関わらず、他のグラム陽性及びグラム陰性の種においては、インジゴナチュラリスEA-抽出物の存在下（ディスク当たり＜4 mg）で阻害作用は見られなかった。さらに、上記3つのブドウ球菌（スタフィロコッカス）属の株に対するインジゴナチュラリスEA-抽出物の阻害活性は、用量依存的に変動した（表２）。

データの結果は、インジゴナチュラリスEA-抽出物が黄色ブドウ球菌、MRSA、及び表皮ブドウ球菌を有意に阻害できることを示している。

(3) 複数の黄色ブドウ球菌株に対するインジゴナチュラリス抽出物の抗菌活性
市中感染型のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む複数のブドウ球菌、化膿レンサ球菌、B群レンサ球菌、C群レンサ球菌、及びG群レンサ球菌を試験した。全ての単離株は、外来患者の皮膚感染より入手した。抗生物質のMICを、微量液体希釈手法により決定した。インジゴナチュラリス抽出物の活性を、プロトコールNFT 72-150に由来する方法（干渉基質無しで）により試験した。使用した培地は、HClでpHをpH 4に調整した、非緩衝0.9%生理食塩水であった。インジゴナチュラリス抽出物のMBCは、0.9%の生理食塩水（pH 4）中、20℃での5分間の接触後に、開始時の細菌濃度から5 log以上の低下（初期接種の99.999%殺菌）をもたらした化合物の最低濃度として規定した。

Claims

メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む、黄色ブドウ球菌の阻害における使用のための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物。
1以上の前記細菌により引き起こされる皮膚疾患を局所的に処置するための、請求項１に記載のインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物。
インジルビンを抽出物の少なくとも65% w/w、好ましくは抽出物の65%〜90% w/wの量で含む、請求項１又は２に記載のインジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物。
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌を含む、黄色ブドウ球菌の阻害における使用のための、インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物を含む医薬組成物又は化粧料組成物。
皮膚疾患を局所的に処置するための、請求項４に記載の医薬組成物又は化粧料組成物。
インジゴナチュラリス又はインジゴ産生植物の抽出物が、インジルビンを抽出物の少なくとも65% w/w、好ましくは抽出物の65%〜90% w/wの量で含む、請求項４又は５に記載の医薬組成物又は化粧料組成物。