JP2017520243A - 標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物 - Google Patents

標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

細胞内の１つ以上の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供。かかる方法は、細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程を含み、第１ポリヌクレオチドは、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む。第１ヌクレアーゼ剤は、細胞に導入され、第１ヌクレアーゼ剤は、第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する。第１認識部位の充分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する、第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターが、細胞内に更に導入される。次に、標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドをそのゲノム中に含む少なくとも１つの細胞が同定される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１４年６月６日に出願の米国仮特許出願第６２／００８８３２号、及び２０１４年６月２７日に出願の米国仮特許出願第６２／０１７９１６号の優先権を主張するものであり、これらの全開示内容を参照により本発明に援用する。
（発明の分野）
本発明の方法及び組成物は、分子生物学の分野に関する。具体的には、細胞内の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。
（ＥＦＳウェブによるテキストファイルとして）
配列表の公式なコピーは、ＡＳＣＩＩフォーマットの配列表（２０１５年６月５日作成、５ＫＢのサイズ、４６１００３ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴというファイル名）として、ＥＦＳ−ウェブで電子的に提出し、また本願明細書と共に提出する。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列表は本願明細書の一部をなし、その全開示内容を参照により本発明に援用する。
ゲノム遺伝子座で特定の核酸配列を挿入、削除、置換するように特異的に設計されたターゲッティングベクターを使用した相同組換えは、望ましいゲノム修飾を細胞内において実現する一般的な方法である。標的遺伝子座内若しくはその近傍で、ニック又は二本鎖切断を導入するために特異的に操作されたヌクレアーゼをターゲッティングベクターと組み合わせて用いることにより、標的遺伝子座での相同組換え効率を向上させることができる。
相同組換えを通じた標的修飾方法が、この２０年間非常に進歩したにもかかわらず、ターゲッティングベクターを使用して好ましいターゲッティング効率を実現する、という点で未だ課題が残されている。標的修飾の有効性及び効率を改善する方法に対するニーズが存在する。
細胞内の１つ以上の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物が提供される。
幾つかの実施形態では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法が提供され、当該方法は、（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第１ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第１認識部位の充分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。
幾つかの実施形態では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法は、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結された第１ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、第１ヌクレアーゼ剤が第１ポリヌクレオチド内の第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドを含む第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞は、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む。
一実施形態では、標的遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。他の実施形態では、標的遺伝子座は、細胞内のベクターに位置している。一実施形態では、第１認識部位のニック又は二本鎖切断は、第１選択マーカーの活性を損なわせる。更なる実施形態では、同定する工程（ｃ）は、第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。一実施形態では、第１選択マーカーを含む第１ポリヌクレオチドは、第１標的部位と第２標的部位に隣接している。一実施形態では、同定する工程（ｃ）は、第１及び第２標的部位に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、（ａ）目的の第１ポリヌクレオチドと、（ｂ）細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドであって、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む、前記第２ポリヌクレオチドと、を含む。
一実施形態では、本方法は、（ａ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む細胞に、（ｉ）第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第２ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第２認識部位の充分近傍に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｂ）標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を更に含む。一実施形態では、第２認識部位のニック又は二本鎖切断は、第２選択マーカーの活性を損なわせる。一実施形態では、同定する工程（ｂ）は、第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。一実施形態では、第２選択可能マーカーを含む第２ポリヌクレオチドは、第３標的部位と第４標的部位に隣接している。一実施形態では、同定する工程（ｂ）は、第３及び第４標的部位に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む。
一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、（ａ）目的の第２ポリヌクレオチドと、（ｂ）細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドと、を含み、第３ポリヌクレオチドは、第３ヌクレアーゼ剤のための第３認識部位を含む。一実施形態では、第１ヌクレアーゼ剤は、第２ヌクレアーゼ剤と異なる。一実施形態では、第１選択マーカーは、第２選択マーカーと異なる。一実施形態では、第１及び第３ヌクレアーゼ認識部位は、互いに同一であり、かつ第２ヌクレアーゼ認識部位と異なり、第１及び第３ヌクレアーゼ剤は、互いに同一であり、かつ第２ヌクレアーゼ剤と異なる。一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同一である。一実施形態では、第１、第２又は第３選択マーカーのうちの１つは、抗生物質耐性を付与する。一実施形態では、抗生物質は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む。一実施形態では、第１、第２又は第３選択マーカーのうちの１つは、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、選択マーカーの発現は、細胞に対する毒性を示す。一実施形態では、第１、第２又は第３選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む。一実施形態では、前記細胞は、原核細胞である。一実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。一実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、齧歯動物由来である。一実施形態では、齧歯動物は、ラット又はマウスである。
一実施形態では、細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、造血幹細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、神経幹細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト線維芽細胞である。
一実施形態では、第１ヌクレアーゼ剤と第１ターゲッティングベクターとの併用により、第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす。一実施形態では、第１ターゲッティングベクターのターゲッティング効率は、第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している。
一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、当該核酸は、細胞内で活性な第４プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態では、第１又は第２のヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。
一実施形態では、第１又は第２のヌクレアーゼ剤は、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、（ａ）第１、第２又は第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む。一実施形態では、第１又は第２認識部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している。一実施形態では、目的のゲノム遺伝子座は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、ｇＲＮＡは、（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む。一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含む。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号７又は配列番号８を含む。
一実施形態では、第１、第２及び／又は第３認識部位は、第１、第２又は第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している。一実施形態では、第１標的部位及び第２標的部位は、第１認識部位に直接隣接している。一実施形態では、第１標的部位及び第２標的部位は、第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第３標的部位及び第４標的部位は、第２認識部位に直接隣接している。一実施形態では、第３標的部位及び第４標的部位は、第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。
一実施形態では、第１ホモロジーアームと第２ホモロジーアームの合計は、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第３ホモロジーアームと第４ホモロジーアームの合計は、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である。
一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす。
一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１又は第２挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域は、ヒト由来である。
一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、同定する工程は、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイで実施される。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内の核酸配列に相同又はオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内の核酸配列に相同又はオルソロガスな核酸配列を含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。
幾つかの実施形態では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法は、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸を含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）Ｃａｓタンパク質及び第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードし、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結された、１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第１核酸中の第１ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性をそれによって損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２核酸を含む第１挿入核酸を含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞が、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む。一実施形態では、第１ ｇＲＮＡは、第１挿入核酸とハイブリダイズしない。一実施形態では、目的の標的遺伝子座は、細胞のゲノム中に位置している。他の実施形態では、目的の標的遺伝子座は、細胞内のベクターに位置している。一実施形態では、同定する工程（ｃ）は、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さない、修飾された細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。
一実施形態では、本方法は、（ｄ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞に、（ｉ）修飾された細胞内で活性なプロモーターに各々作動可能に連結された、Ｃａｓタンパク質及び第２ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、Ｃａｓタンパク質が第２核酸を含む第１挿入核酸内の第２ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の核酸と、（ｉｉ）第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３核酸を含む第２挿入核酸を含む第２ターゲッティングベクターであって、第２挿入核酸が、第２標的遺伝子座に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接している、第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｅ）第２標的遺伝子座内に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞を同定する工程であって、第２の修飾された細胞が第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さず、第２及び第３選択マーカーが異なる、工程と、を更に含む。一実施形態では、第１及び第２標的遺伝子座は、各々直接隣接している。他の実施形態では、第１又は第２標的遺伝子座は、第１又は第２ ｇＲＮＡ標的部位から約１０ヌクレオチド〜１４ｋｂ、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、又は約１０ｋｂ〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第２ ｇＲＮＡは、第２挿入核酸とハイブリダイズしない。一実施形態では、同定する工程（ｅ）は、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さない第２の修飾された細胞の同定を可能にする条件下で、修飾された細胞を培養することを含む。
一実施形態では、本方法は、（ｆ）第２標的遺伝子座に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞に、（ｉ）第２の修飾された細胞内で活性なプロモーターに各々作動可能に連結された、Ｃａｓタンパク質及び第３ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第３核酸を含む第２挿入核酸内の第３ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第３選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第４プロモーターに作動可能に連結された第４選択マーカーをコードする第４核酸を含む第３挿入核酸を含む第３ターゲッティングベクターであって、第３挿入核酸が、第３標的遺伝子座に位置する第５及び第６標的部位に対応する第５及び第６ホモロジーアームに隣接している、第３ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｇ）第３標的遺伝子座内に第３挿入核酸を含む第３の修飾された細胞を同定する工程であって、第３の修飾された細胞が第４選択マーカーの活性を有するが、第３選択マーカーの活性を有さず、第３及び第４選択マーカーが異なる、工程と、を更に含む。一実施形態では、第２及び第３標的遺伝子座は、各々直接隣接している。他の実施形態では、第２又は第３標的遺伝子座は、第１又は第２ ｇＲＮＡ標的部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。
一実施形態では、第１、第２、第３又は第４マーカーは、抗生物質耐性を付与する。一実施形態では、抗生物質は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む。一実施形態では、第１、第２、第３又は第４選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む。一実施形態では、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡは、（ｉ）第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位とハイブリダイズするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む。一実施形態では、第１、第２又は第３標的遺伝子座は、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位の近傍に位置し、それにより、ニック又はｇＲＮＡ標的部位の二本鎖切断により、標的遺伝子座でのターゲッティングベクターの相同組換えが促進される。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接している。
一実施形態では、細胞は、原核細胞である。他の実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。一実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、線維芽細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト線維芽細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、齧歯動物由来である。一実施形態では、齧歯動物は、ラット、マウス又はハムスターである。
一実施形態では、真核生物細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、造血幹細胞又はニューロン幹細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。
一実施形態では、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位は、第１、第２又は第３選択マーカーをコードする第１、第２又は第３核酸内のイントロン、エキソン、プロモーター又はプロモーター調節領域に位置している。一実施形態では、第１、第２、又は第３ターゲッティングベクターは、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第１、第２又は第３挿入核酸は、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲である。
一実施形態では、第１、第２又は第３挿入核酸は、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座のゲノム領域を含む。一実施形態では、ゲノム領域は、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む。
一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同じである。一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同じであり、第２及び第４選択マーカーは同じである。一実施形態では、第１及び第３ ｇＲＮＡは同じである。
本発明は更に、細胞内の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物を提供する。かかる方法は、細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程を含み、第１ポリヌクレオチドは、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む。第１ヌクレアーゼ剤は、細胞に導入され、第１ヌクレアーゼ剤は、第１認識部位でのニック又は二本鎖切断を誘導する。第１認識部位の充分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターが、細胞に更に導入される。次に、標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含むものとして、少なくとも１つの細胞が同定される。
本発明はまた、以下の工程を含む細胞内の標的遺伝子座の修飾方法の提供に関する：（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、
（ｂ）細胞に、（ｉ）第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第１ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第１認識部位の充分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。一実施形態では、標的遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。他の実施形態では、標的遺伝子座は、細胞内のベクターに位置している。一実施形態では、第１認識部位のニック又は二本鎖切断は、第１選択マーカーの活性を損なわせる。更なる実施形態では、同定する工程（ｃ）は、第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。一実施形態では、第１選択マーカーを含む第１ポリヌクレオチドは、第１標的部位と第２標的部位に隣接している。一実施形態では、同定する工程（ｃ）は、第１及び第２標的部位に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、（ａ）目的の第１ポリヌクレオチドと、（ｂ）細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドであって、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む、第２ポリヌクレオチドと、を含む。
一実施形態では、本方法は、（ａ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む細胞に、（ｉ）第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第２ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第２認識部位の充分近傍に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｂ）標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を更に含む。一実施形態では、第２認識部位のニック又は二本鎖切断は、第２選択マーカーの活性を損なわせる。一実施形態では、同定する工程（ｂ）は、第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。一実施形態では、第２選択マーカーを含む第２ポリヌクレオチドは、第３標的部位及び第４標的部位に隣接している。一実施形態では、同定する工程（ｂ）は、第３及び第４標的部位に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、（ａ）目的の第２ポリヌクレオチドと、（ｂ）細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドと、を含み、第３ポリヌクレオチドは、第３ヌクレアーゼ剤のための第３認識部位を含む。一実施形態では、第１ヌクレアーゼ剤は、第２ヌクレアーゼ剤と異なる。一実施形態では、第１選択マーカーは、第２選択マーカーと異なる。一実施形態では、第１及び第３ヌクレアーゼ剤認識部位は、互いに同一であり、かつ第２ヌクレアーゼ剤認識部位と異なり、第１及び第３ヌクレアーゼ剤は、互いに同一であり、かつ第２ヌクレアーゼ剤と異なる。一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは、同一である。一実施形態では、第１、第２又は第３選択マーカーのうちの１つは、抗生物質耐性を付与する。一実施形態では、抗生物質は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む。一実施形態では、第１、第２又は第３選択マーカーのうちの１つは、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、当該選択マーカーの発現は、細胞に対する毒性を示す。一実施形態では、第１、第２又は第３選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む。一実施形態では、細胞は、原核細胞である。一実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。一実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、齧歯動物由来である。一実施形態では、齧歯動物は、ラット又はマウスである。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト線維芽細胞である。
一実施形態では、細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、造血幹細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、神経幹細胞である。
一実施形態では、第１ヌクレアーゼ剤と第１ターゲッティングベクターとの併用により、第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす。一実施形態では、第１ターゲッティングベクターのターゲッティング効率は、第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している。
一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼをコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、当該核酸は細胞内で活性な第４プロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡである。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。
一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、（ａ）第１、第２又は第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、第１又は第２認識部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している。一実施形態では、目的のゲノム遺伝子座は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、ｇＲＮＡは、（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む。一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含む。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号７又は配列番号８を含む。一実施形態では、第１、第２及び／又は第３認識部位は、第１、第２又は第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している。一実施形態では、第１標的部位及び第２標的部位は、第１認識部位に直接隣接している。一実施形態では、第１標的部位及び第２標的部位は、第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第３標的部位及び第４標的部位は、第２認識部位に直接隣接している。一実施形態では、第３標的部位及び第４標的部位は、第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第１ホモロジーアームと第２ホモロジーアームの合計は、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第３ホモロジーアームと第４ホモロジーアームの合計は、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１又は第２挿入ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又はＴ細胞受容体α遺伝子座の連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域は、ヒト由来である。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、同定する工程は、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイで実施される。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、細胞内のゲノムの核酸配列に相同又はオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、細胞内のゲノムの核酸配列に相同又はオルソロガスな核酸配列を含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。
マウスの第１４染色体上のＴＣＲα遺伝子座のヘテロ接合の修飾を有する細胞中のゲノムターゲッティングイベントの概略図を提供する。１つの対立遺伝子は、８つのヒト可変（Ｖ）遺伝子セグメントの上流に位置するネオマイシン選択カセットを含むヒト化ＴＣＲα Ａ−ｎｅｏ対立遺伝子であり、６１個のヒト連結（Ｊ）遺伝子セグメントは、ハイグロマイシン選択カセットと、１１個の追加のヒト可変遺伝子セグメントを含む１００ｋｂ超の断片を含む、ヒト化ＴＣＲα対立遺伝子Ｂ−ｈｙｇターゲッティングベクターの標的とされる。対立遺伝子Ｂ−ｈｙｇターゲッティングベクターと、ＴＣＲα Ａ−ｎｅｏ対立遺伝子のネオマイシンカセットを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ペアの２つの単量体を発現するプラスミドと、のエレクトロポレーションにより、５’から３’にかけて、ハイグロマイシンカセット、１９個のヒトＶ遺伝子セグメント、及び内在の定常領域のヌクレオチド配列の上流に位置する６１個のヒトＪ遺伝子セグメントを含む、修飾されたＴＣＲα 遺伝子座（対立遺伝子Ｂ−ｈｙｇ）が生成された。ターゲッティングイベントにより、１００ｋｂを超えるヒトＴＣＲα遺伝子配列がマウスＴＣＲα遺伝子座に正確に挿入された。 マウスの第１４染色体上のＴＣＲα遺伝子座のヘテロ接合の修飾を有する細胞中のゲノムターゲッティングイベントの概略図を提供する。１つの対立遺伝子は、１９個のヒトＶ遺伝子セグメントの上流に位置するハイグロマイシン選択カセットを含むヒト化ＴＣＲαＢ−ｈｙｇ対立遺伝子であり、６１個のヒトＪ遺伝子セグメントは、ネオマイシン選択カセットと、１１個の追加のヒト可変遺伝子セグメントを含む１００ｋｂ超の断片を含む、ヒト化ＴＣＲα対立遺伝子Ｃ−ｎｅｏターゲッティングベクターの標的とされる。対立遺伝子Ｃ−ネオターゲッティングベクターと、ＴＣＲα Ｂ−ｈｙｇ対立遺伝子のハイグロマイシンカセットを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ペアの２つの単量体を発現するプラスミドのエレクトロポレーションにより、５’から３’にかけて、ネオマイシンカセット、３０個のヒトＶ遺伝子セグメント、及び内在の定常領域のヌクレオチド配列の上流に位置する６１個のヒトＪ遺伝子セグメントを含む、修飾されたＴＣＲα遺伝子座（対立遺伝子Ｃ−ネオ）が生成された。ターゲッティングイベントにより、１００ｋｂを超えるヒトＴＣＲα遺伝子配列がマウスＴＣＲα遺伝子座に正確に挿入された。 ｎｅｏｒ（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする）及びｈｙｇｒ（ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードする）の薬剤選択カセットの略図を提供する。ｎｅｏｒを標的とするＮｅｏ−ＺＦＮ（１，２）及びＮｅｏ−ＺＦＮ（３，４）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ、図３Ａ）、並びにｈｙｇｒを標的とするＨｙｇ−ＺＦＮ（１，２）及びＨｙｇ−ＺＦＮ（３，４）ＺＦＮｓ（図３Ｂ）の認識部位（以下に配列を示す）の位置を、各々のホスホトランスフェラーゼのコード配列を表す太い矢印の上下の長方形で示す。
添付の図面を参照しつつ、本発明の幾つかの態様を以下に詳細に説明するが、本発明はそれらの態様が全てではない。実際、これらの発明は多くの異なる形態で実施される可能性があり、本明細書に示す実施形態に限定されるものと解釈すべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、適用される法的要件を満たすように提供されたものである。本明細書では、同様の数字は同様の構成要件を意味する。
本発明の属する技術分野の当業者であれば、上記の説明及び関連する図面に示される教示を利用することにより、本明細書に示される本発明の多くの改良形態及び他の実施形態を想起するであろう。したがって、本発明は、開示される特定の実施形態に限定されるものではなく、その改良形態及び他の実施形態も、添付の特許請求の範囲に含まれることを理解すべきである。本明細書では特定の用語を使用するが、それらは一般的及び記述的な意味において用いられるものであり、限定を目的として用いられるものではない。
Ｉ．概要
本発明は、細胞内の標的遺伝子座（例えば、ゲノム遺伝子座）を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。本方法及び組成物は、ヌクレアーゼ剤及びヌクレアーゼ剤認識部位を用いることにより、標的遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの相同組換えイベントを促進する。本明細書で提供される様々な方法及び組成物は、ヌクレアーゼ剤認識部位を、選択マーカー、リポーター又は外来のタンパク質（例えば、ｅＧＦＰ又はマウス細胞内のヒト配列）をコードするポリヌクレオチド内に戦略的に位置させる。
更に、標的遺伝子座（すなわちゲノム遺伝子座）の目的のポリヌクレオチドの連続的修飾（すなわちタイリング）を可能にする方法が提供される。より詳細に以下で説明するように、標的遺伝子座（すなわちゲノム遺伝子座）中に目的のポリヌクレオチドを連続的にタイリングするために方法が提供され、当該方法では、使用される標的遺伝子座（すなわちゲノム遺伝子座）及び様々なターゲッティングベクターが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を含む第１選択マーカーと、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む第２選択マーカーと、の使用を交替させる。その際、本方法は、新しい認識部位を認識するために操作されたヌクレアーゼ剤の恒常的な供給を必要としない。その代わり、特定の実施形態では、標的とされた連続的なタイリングは、２つのヌクレアーゼ剤及び当該２つのヌクレアーゼ剤が対応する認識部位を必要とするだけである。更に、ヌクレアーゼ剤が外来の配列（すなわち選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の認識部位）を標的とし、いかなる所与の認識部位の有効性及び非特異的な効果もこれまで確認されているため、タイリングプロセスの時間及び対費用効果を増加させつつ、内在のゲノム配列の非特異的な切断を最小化することができる。
ＩＩ．標的組み込みシステム
本発明は、細胞内の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。システムは、ヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ剤のための認識部位、標的遺伝子座、選択マーカー、ターゲッティングベクター及び挿入ポリヌクレオチドを用いる。これらの構成要素の各々を以下に詳述する。
Ａ．ヌクレアーゼ剤及びヌクレアーゼ剤のための認識部位：
用語「ヌクレアーゼ剤のための認識部位」には、ニック又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘導されるＤＮＡ配列が含まれる。ヌクレアーゼ剤のための認識部位は、細胞に内在（又は生来）のものであってもよく、又は当該認識部位は細胞に対して外来のものであってもよい。具体的実施形態では、認識部位は、細胞に対して外来のものであり、ゆえに、細胞のゲノム内で天然に生じない。なお更なる実施形態では、認識部位は、細胞に対して、及び、標的遺伝子座に挿入しようとする目的のポリヌクレオチドに対して外来のものである。更なる実施形態では、外来若しくは内在の認識部位は、宿主細胞のゲノム内に１つだけ存在している。具体的実施形態では、ゲノム内に１つだけ存在する内在若しくは生来の部位が同定される。かかる部位は次に、内在の認識部位でニック又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を設計するのに使用できる。
認識部位の長さは、変化させてもよく、例えば、認識部位は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ペアの場合は約３０〜３６ｂｐ（すなわち各ＺＦＮについて約１５〜１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の場合は約３６ｂｐ、又は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの場合は約２０ｂｐである。
目的の認識部位にニック又は二本鎖切断を誘導するいかなるヌクレアーゼ剤でも、本明細書に開示される方法及び組成物において使用できる。天然に存在するか又は生来のヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤が目的の認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する限り、使用できる。あるいは、修飾された又は操作されたヌクレアーゼ剤を使用できる。「操作されたヌクレアーゼ剤」には、目的の認識部位を特異的に認識し、ニック又は二本鎖切断を誘導するために、その生来の形態から操作された（修飾又は誘導された）ヌクレアーゼ剤が含まれる。このように、操作されたヌクレアーゼ剤は、生来の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、又は、人工的に作製若しくは合成することができる。ヌクレアーゼ剤の修飾は、タンパク質の切断剤のわずか１つのアミノ酸、又は核酸の切断剤の１つのヌクレオチドにおける修飾であってもよい。幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ剤は、認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導し、当該認識部位は、生来の（操作又は修飾されない）ヌクレアーゼ剤によって認識される配列ではなかった。認識部位又は他のＤＮＡにおける、ニック又は二本鎖切断は、本明細書では認識部位又は他のＤＮＡの「カッティング」又は「開裂」と称することもある。
本発明では、例示された認識部位の活性型の変異体及び断片も提供される。かかる活性型の変異体は、所与の認識部位に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有してもよく、その際、活性型の変異体は生物学的活性を保持し、ゆえに、ヌクレアーゼ剤によって認識され、配列特異的な態様で切断されうる。ヌクレアーゼ剤による認識部位の二本鎖切断を測定する分析は、当分野で公知である（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｑＰＣＲ分析、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙ Ｄ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０１０，４７６：２９５〜３０７、全内容を参照により本発明に援用する）。
具体的実施形態では、認識部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内に配置される。かかる位置は、選択マーカーのコード領域内、又は、調節領域の中に位置してもよく、それは選択マーカーの発現に影響する。このように、ヌクレアーゼ剤の認識部位は、選択マーカーのイントロン、プロモーター、エンハンサー、調節領域、又は選択マーカーをコードするポリヌクレオチドのいかなる非タンパク質コード領域にも位置させることができる。具体的実施形態では、認識部位のニック又は二本鎖切断は、選択マーカーの活性を損なわせる。機能性選択マーカーの有無のアッセイ方法は公知である。
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、配列特異的ヌクレアーゼの一種であり、原核若しくは真核生物のゲノムにおける特異的標的配列の二本鎖切断に使用できる。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、生来の若しくは操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター又はその機能性部分を、エンドヌクレアーゼ（例えばＦｏｋＩ）の触媒ドメインに融合させることにより作製される。ユニークな、モジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、潜在的に、いかなる所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計を可能にする。このように、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ剤のＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するために操作することができ、ゆえに、所望する標的配列における二本鎖切断に使用できる。国際公開第２０１０／０７９４３０号、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒら（２０１０）ＰＮＡＳ １０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ ＆ Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８〜４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７〜７６１、Ｌｉら（２０１０）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３〜１４８を参照（これらの全内容を参照により本発明に援用する）。
適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び適切なＴＡＬヌクレアーゼの調製方法が、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５ Ａ１号、同第２０１１／０２６９２３４ Ａ１号、同第２０１１／０１４５９４０ Ａ１号、同第２００３／０２３２４１０ Ａ１号、同第２００５／０２０８４８９ Ａ１号、同第２００５／００２６１５７ Ａ１号、同第２００５／００６４４７４ Ａ１号、同第２００６／０１８８９８７ Ａ１号、及び同第２００６／００６３２３１ Ａ１号で開示される（各々、参照により本発明に援用する）。様々な実施形態では、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、例えば目的の遺伝子座又は目的のゲノム遺伝子座などの標的核酸配列又はその近傍で切断するよう操作され、当該標的核酸配列は、その配列で、又はその近傍で、ターゲッティングベクターによって修飾される。本明細書で提供される様々な方法及び組成物の用途に適するＴＡＬヌクレアーゼとしては、本明細書で記載されるターゲッティングベクターによって修飾される標的核酸配列で、又はその近傍で結合するよう特異的に設計されたものが挙げられる。
一実施形態では、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変性の残基を経て１つの塩基対を認識する３３〜３５のＴＡＬリピートを含む。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、一個のヌクレアーゼと、それに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインとを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、当該一個のヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬ−リピートベースのＤＮＡ結合ドメインと、第２のＴＡＬ−リピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、第１及び第２ＴＡＬ−リピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結し、第１及び第２ＴＡＬ−リピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２〜２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化し、標的配列で二本鎖切断をする活性ヌクレアーゼ剤を形成する。
本明細書に開示される様々な方法及び組成物で使用されるヌクレアーゼ剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を更に含むことができる。一実施形態では、ＺＦＮの各モノマーは、３つ以上のＺｎフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ＺｎフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは、３ｂｐのサブサイトと結合する。他の実施形態では、ＺＦＮは作動可能に独立ヌクレアーゼ剤に結合したＺｎフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。一実施形態では、一個のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、第１ＺＦＮと第２ＺＦＮとを含み、第１ＺＦＮと第２ＺＦＮの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結し、第１及び第２ＺＦＮは、約５〜７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖中の２つの連続する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化し、二本鎖切断をする活性ヌクレアーゼ剤を形成する。例えば、米国特許出願公開第２００６０２４６５６７号、同第２００８０１８２３３２号；、同第２００２００８１６１４号；同第２００３００２１７７６号、国際公開第２００２／０５７３０８Ａ２号、米国特許出願公開第２０１３０１２３４８４号、同第２０１００２９１０４８号、国際公開第２０１１／０１７２９３Ａ２号、及びＧａｊら、（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７〜４０５を参照（各々、参照により本発明に援用する）。
更に他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、メガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存された配列モチーフに基づき４つのファミリーに分類され、当該ファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−Ｈ及びとＨｉｓ−Ｃｙｓ ｂｏｘファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い認識部位、及びそれらのＤＮＡ基質における若干の配列多型の許容性が特徴である。メガヌクレアーゼのドメイン、構造及び機能は公知であり、例えばＧｕｈａｎ及びＭｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３８：１９９〜２４８、Ｌｕｃａｓら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：９６０〜９、Ｊｕｒｉｃａ及びＳｔｏｄｄａｒｄ（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５５：１３０４〜２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ（２００６）Ｑ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３８：４９〜９５及びＭｏｕｒｅら（２００２）Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ ９：７６４を参照。幾つかの例では、天然に生じる変異体及び／又は操作されたメガヌクレアーゼ誘導体が用いられる。動力学、補因子との相互作用、発現、最適条件及び／又は認識部位の特異性の修飾、並びに活性のスクリーニング方法は公知であり、例えば、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：２９５２〜６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １０：８９５〜９０５、Ｇｉｍｂｌｅら（２００３）Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３４：９９３〜１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：３８７０〜９、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２：３１〜４１、Ｒｏｓｅｎら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：４７９１〜８００、Ｃｈａｍｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ及びＺｈａｏ，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３３：ｅ１５４、国際公開第２００５１０５９８９号、同第２００３０７８６１９号、同第２００６０９７８５４号、同第２００６０９７８５３号、同第２００６０９７７８４号、及び同第２００４０３１３４６号を参照。
いかなるメガヌクレアーゼも本発明中に使用でき、限定されないが、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＴｌｉＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃＩＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｂｐＩＰ、Ｉ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ、又はそれらのあらゆる活性型の変異体又は断片が含まれる。
一実施形態では、メガヌクレアーゼは、１２〜４０の塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ゲノム内の１つの完全一致した標的配列を認識する。一実施形態では、メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ホーミングヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼである。一実施形態では、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのホーミングヌクレアーゼ剤は、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ及びＩ−Ｄｍｏｌから選択される。
ヌクレアーゼ剤は制限エンドヌクレアーゼを更に含むことができ、それにはＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型エンドヌクレアーゼが含まれる。Ｉ型及びＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、典型的にはヌクレアーゼ結合部位から離れた様々な位置で切断し、それ（認識部位）は切断部位から何百塩基対も離れることもある。ＩＩ型のシステムでは、制限酵素活性はいかなるメチラーゼ活性からも独立し、典型的には結合部位、又はその近傍の特定の部位で切断がなされる。大部分のＩＩ型酵素は、パリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非パリンドローム認識部位を認識し、認識部位の外側で切断し、ＩＩｂ型酵素は、認識部位の外側の両方の部位で配列を２回切断し、またＩＩｓ型酵素は、非対称の認識部位を認識し、認識部位から約１〜２０ヌクレオチドの定義された距離で１つの側で切断する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は更に、例えばＲＥＢＡＳＥデータベース（ウェブページｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：４１８〜２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３１：１８０５〜１２、及びＢｅｌｆｏｒｔら（２００２）Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ，ｐｐ．７６１〜７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅら（ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）に記載され、分類されている。
様々な方法及び組成物で使用されるヌクレアーゼ剤はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むこともできる。かかるシステムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ剤を使用することができ、若干の例では、それが発現される望ましい細胞型に従いコドン最適化される。システムは更に、コドン最適化されたＣａｓ９と共に機能する融合ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡコンストラクトを使用する。この１つのＲＮＡは、ガイドＲＮＡ又はｇＲＮＡとしばしば称される。ｇＲＮＡの中で、ｃｒＲＮＡ部分は所与の認識部位の「標的配列」として同定され、ｔｒａｃｒＲＮＡは「スキャフォールド」としばしば称される。このシステムは、種々の真核生物及び原核細胞内で機能することが示されている。手短には、標的配列を含む短いＤＮＡ断片が、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入される。ｇＲＮＡ発現プラスミドは、標的配列（幾つかの実施形態では約２０ヌクレオチド）と、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の形態（スキャフォールド）と、細胞内で活性な適切なプロモーターと、真核生物細胞内での適当なプロセシングに必要なエレメントと、を含む。システムの多くは、アニールして二本鎖ＤＮＡを形成し、次にｇＲＮＡ発現プラスミド中にクローニングするための、カスタムメイドの相補的なオリゴＤＮＡに依存する。次にｇＲＮＡ発現カセット及びＣａｓ９発現カセットが細胞に導入される。例えば、Ｍａｌｉ Ｐら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８２３〜６、Ｊｉｎｅｋ ＭらＳｃｉｅｎｃｅ ２０１２ Ａｕｇ １７；３７（６０９６）：８１６〜２１、Ｈｗａｎｇ ＷＹらＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２２７〜９、Ｊｉａｎｇ ＷらＮａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１３ Ｍａｒ；３１（３）：２３３〜９、及びＣｏｎｇ ＬらＳｃｉｅｎｃｅ ２０１３ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９〜２３を参照（各々を参照によって本発明に援用する）。
本明細書に開示される方法及び組成物は、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システム又はかかるシステムの構成要素を利用して、細胞内のゲノムを修飾することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ遺伝子発現に関係するか、又は、その活性を制御する転写物及び他の要素を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型システムでありうる。本明細書に開示される方法及び組成物は、ＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を核酸の部位特異的切断に利用することで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用する。
本明細書に開示される方法で用いられる幾つかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、非天然に生じたものである。「非天然に生じた」システムには、人間の手が関与するいかなるものが含まれ、例えば、システムの１つ以上の構成要素が、天然に生じる状態から変更若しくは変異したか、事実上、天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないか、又は、天然に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連すること、が含まれる。例えば、幾つかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然では生じないｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを共に含む非天然のＣＲＩＳＰＲ複合体を使用する。
ｉ．Ｃａｓ ＲＮＡにガイドされるエンドヌクレアーゼ
Ｃａｓタンパク質は通常、少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。かかるドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ、下記で詳述する）と相互作用できる。Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅ又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン及び他のドメインを含むこともできる。ヌクレアーゼドメインは、核酸を切断する触媒活性を有する。切断には、核酸分子の共有結合の切断が含まれる。切断により、平滑末端又は粘着末端が生じ、それらは一本鎖又は二本鎖である。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓｌ０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６、並びにその相同物又は修飾誘導体が挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であってもよく、Ｃａｓ９タンパク質の誘導体であってもよい。Ｃａｓ９タンパク質は典型的には、保存された構造の４つのキーモチーフを共有する。モチーフ１、２及び４は、ＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。Ｃａｓ９タンパク質は、例えばＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、ＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃＨｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、又はＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ由来でありうる。Ｃａｓ９ファミリーの更なる例は、全内容を参照により本発明に援用する国際公開第２０１４／１３１８３３号に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質又はその誘導体が、好ましい酵素である。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２を有する。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち天然起源）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわちＣａｓタンパク質変異体）又は野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の断片であってもよい。Ｃａｓタンパク質は、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の活性型変異体又は断片でもよい。当該活性型変異体又は断片は、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質又はその部分に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し、当該活性型変異体は、望ましい部位で切断する能力を保持し、ゆえに切断の誘導若しくは二本鎖切断の誘導に関する活性を保持する。切断の誘導又は二本鎖切断の誘導に関する活性のアッセイ方法は公知であり、通常、切断部位を含むＤＮＡ基質上でのＣａｓタンパク質の全体活性及び特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質を修飾することにより、核酸結合親和性、核酸結合特異性及び／又は酵素活性を増減させることができる。Ｃａｓタンパク質を修飾することにより、他のいかなる活性又はタンパク質の特性（例えば安定性）も変化させることもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを、修飾、削除、不活性化することができ、又は、Ｃａｓタンパク質から、タンパク質の機能に不可欠でないドメインを除去して、Ｃａｓタンパク質の活性を最適化（例えば強化又は低減）することができる。
幾つかのＣａｓタンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン（例えばＤＮａｓｅドメイン）を含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含むことができる。ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの各々は、ＤＮＡの二本鎖を切断する際、二本鎖ＤＮＡの各々異なる鎖を切断できる。例えばＪｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１を参照（全内容を参照により本発明に援用する）。
ヌクレアーゼの１つ又は両ドメインを、削除又は変異させることにより、それらは機能を失うか、又はヌクレアーゼ活性が減少する。ヌクレアーゼドメインのうちの１つが削除又は変異した場合、得られるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）はニッカーゼ（nickase）と称され、二本鎖ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列で、二本鎖切断でなく一本鎖切断を行う（すなわち、相補鎖又は非相補鎖を切断できるが、両方ではない）。ヌクレアーゼドメインの両方とも削除若しくは変異した場合、得られるＣａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両鎖を切断する能力が低減する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインのＤ１０Ａ変異（Ｃａｓ９の位置１０のアスパラギン酸のアラニンへの変異）である。同様に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインのＨ９３９Ａ（アミノ酸位８３９のヒスチジンのアラニンへの変異）又はＨ８４０Ａ（アミノ酸位８４０のヒスチジンのアラニンへの変異）によってもＣａｓ９をニッカーゼ変換できる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する突然変異の他の例には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからＣａｓ９への対応する突然変異が含まれる。Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓら、（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９：９２７５〜９２８２及び国際公開第２０１３／１４１６８０号を参照（各々の内容を参照により本発明に援用する）。かかる変異は、例えば部位特異的変異導入、ＰＣＲによる変異導入、又は完全な遺伝子合成を用いることにより生じさせることができる。ニッカーゼを生じさせる他の変異の例は、例えば国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号及び国際公開第２０１３／１４２５７８Ａ１号に記載され、各内容を参照により本発明に援用する。
Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質であってもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、後成的修飾ドメイン、転写活性化ドメイン又は転写リプレッサードメインと融合させることができる。国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照（全内容を参照により本発明に援用する）。Ｃａｓタンパク質を異種ポリペプチドと融合させ、安定性を向上又は低下させることもできる。融合したドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、又は内部に位置させることができる。
Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化のための異種ポリペプチドと融合させることができる。当該異種ペプチドとしては、例えば、核内ターゲッティングのためのＳＶ４０ ＮＬＳのような核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへのターゲッティングのためのミトコンドリア局在シグナル、ＥＲ保留シグナルなどが挙げられる。Ｌａｎｇｅら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：５１０１〜５１０５を参照。かかる細胞内局在化シグナルは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端又は内部のいずれにも位置させることができる。ＮＬＳは、塩基性アミノ酸のストレッチを含んでもよく、一分節の配列又は二分節の配列であってもよい。
Ｃａｓタンパク質は、細胞貫通ドメインに結合してもよい。例えば、細胞貫通ドメインは、ＨＩＶ−１ ＴＡＴタンパク質（ヒトＢ型肝炎ウイルス由来の、ＴＬＭ細胞貫通モチーフ）、ＭＰＧ、Ｐｅｐ−１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞貫通ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来してもよい。国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照（全内容を参照により本発明に援用する）。細胞貫通ドメインは、Ｃａｓタンパク質内のＮ末端、Ｃ末端、又は内部のいずれにも位置させることができる。
Ｃａｓタンパク質は、トラッキング又は精製を容易にするため、例えば蛍光タンパク質、精製タグ又はエピトープタグなどの異種ポリペプチドを含んでもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、モノマー状のＡｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、並びに他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデム親和性精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリヤータンパク質（ＢＣＣＰ）及びカルモジュリンが挙げられる。
Ｃａｓタンパク質は、いかなる形で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、例えばｇＲＮＡと複合体を形成するＣａｓタンパク質の形で提供されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形（例えばＲＮＡ、例えば伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はＤＮＡ）で提供されてもよい。任意に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物におけるタンパク質への効果的な翻訳のためにコドンを最適化されてもよい。
Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。あるいは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現コンストラクト内のプロモーターに作動可能に連結されてもよい。当該発現コンストラクトは、目的遺伝子（例えばＣａｓ遺伝子）の発現を誘導でき、当該目的の核酸配列を標的細胞へ導入できるいかなる核酸コンストラクト又はその他の核酸配列を含んでもよい。発現コンストラクトで使用できるプロモーターとしては、例えば、多能性ラット、真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス又はハムスターの細胞で活性なプロモーターが挙げられる。他のプロモーターの例は、本明細書で随所に述べる。
ｉｉ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」には、Ｃａｓタンパク質と結合して、標的ＤＮＡ内の特定の位置にＣａｓタンパク質をターゲッティングするＲＮＡ分子が含まれる。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ−ターゲッティングセグメント」と「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含みうる。「セグメント」には、分子のセグメント、セクション又は領域（例えばＲＮＡ内のヌクレオチドの連続したストレッチ）が含まれる。幾つかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」と「ターゲッターＲＮＡ」の２つの別々のＲＮＡ分子を含む。他のｇＲＮＡとしては、単一ＲＮＡ分子（単一のＲＮＡポリヌクレオチド）であり、それは「単分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」とも称される。国際公開第２０１３／１７６７７２Ａ１号、同第２０１４／０６５５９６Ａ１号、同第２０１４／０８９２９０Ａ１号、同第２０１４／０９３６２２Ａ２号、同第２０１４／０９９７５０Ａ２号、同第２０１３１４２５７８Ａ１号、及び同第２０１４／１３１８３３Ａ１号を参照（各内容を参照により本発明に援用する）。用語「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」には、二分子ｇＲＮＡと一分子ｇＲＮＡが含まれる。
例示的な二分子ｇＲＮＡには、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡリピート」）分子、及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「ｔｒａｎｓ−作用型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又は「スキャフォールド」）分子が含まれる。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の片半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーターＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残り半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それらはハイブリダイズし、ｇＲＮＡのタンパク結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。
このように、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有するといえる。ｃｒＲＮＡと対応するｔｒａｃｒＲＮＡはハイブリダイズして、ｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする一本鎖のＤＮＡターゲッティングセグメントを更に提供する。細胞内での修飾のために用いられる場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が用いられる種に特異的であるよう設計することができる。例えば、Ｍａｌｉら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８２３〜８２６、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６〜８２１、Ｈｗａｎｇら（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２２７〜２２９、Ｊｉａｎｇら（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：２３３〜２３９、及びＣｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９：８１９〜８２３を参照（各内容を参照により本発明に援用する）。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメント（ｃｒＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ内の配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントは、ハイブリダーゼーション（すなわち塩基対形成）を経て、配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。このように、ＤＮＡターゲッティングセグメントのヌクレオチド配列を変化させることにより、ｇＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置が適宜決定される。本発明のｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントを修飾することにより、標的ＤＮＡ内のいかなる目的の配列とハイブリダイズさせることができる。天然起源のｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物により異なるが、通常、２１〜４６のヌクレオチド長の２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が隣接する、２１〜７２のヌクレオチド長のターゲッティングセグメントを含む（国際公開第２０１４／１３１８３３号参照）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、ターゲッティングセグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡと相補的であり、それらはハイブリダイズし、次にＣａｓ９タンパク質と結合する。
ＤＮＡターゲッティングセグメントは、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡターゲッティングセグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、又は約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有し得る。あるいは、ＤＮＡターゲッティングセグメントは、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有し得る。
標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列）と相補的なＤＮＡターゲッティングセグメントのヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡターゲッティング配列（すなわち、標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列と相補的なＤＮＡターゲッティングセグメント中の配列）は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔ、又は少なくとも約４０ｎｔの長さを有し得る。あるいは、ＤＮＡターゲッティング配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、又は約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有し得る幾つかの場合、ＤＮＡターゲッティング配列は、約２０ｎｔの長さを有し得る。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、いかなる形状（例えば全長ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性型の部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）でもよく、いかなる長さでもよい。それらは、一次転写物でもよく、又はプロセシングされた形状であってもよい。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一のガイドＲＮＡの一部として、又は二分子のｇＲＮＡの一部としての単離された分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全部又は一部を含んでもよく、又はそれからなってもよい（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５又はそれ以上のヌクレオチド）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓからの野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド及び６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１：６０２〜６０７、国際公開第２０１４／０９３６６１号を参照（それらの全内容を参照により本発明に援用する）。単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７及び＋８５バージョン内に存在するｔｒａｃｒＲＮＡ部分が挙げられる。なお、「＋ｎ」は、野生型＋ｎヌクレオチドまでのｔｒａｃｒＲＮＡがｓｇＲＮＡに含まれることを意味する。米国特許第８，６９７，３５９号を参照（全内容を参照により本発明に援用する）。
ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性（％）は、少なくとも６０％とすることができる（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％）。ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性（％）は、連続する約２０ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％とすることができる。一例を挙げると、ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性（％）は、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の５’末端の連続する１４ヌクレオチドにわたって１００％であり、その他に対しては０％である。この場合、ＤＮＡターゲッティング配列は、１４ヌクレオチド長であると考えられる。他の例を挙げると、ＤＮＡターゲッティング配列と標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列との間の相補性（％）は、標的ＤＮＡの相補鎖内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の５’末端の連続する７ヌクレオチドにわたって１００％であり、その他に対しては０％である。この場合、ＤＮＡターゲッティング配列は、７ヌクレオチド長であると考えられる。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つのヌクレオチドのストレッチを含んでもよい。タンパク質結合セグメントの相補ヌクレオチドはハイブリダイズし、ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。本発明のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互に作用する、そして、ｇＲＮＡはＤＮＡターゲッティングセグメントを経て標的ＤＮＡ内で特異的なヌクレオチド配列へ結合されたＣａｓタンパク質を導く。
ガイドＲＮＡは、望ましい特徴（例えば、安定性の修飾若しくは調節、細胞内のターゲッティング、蛍光ラベルによるトラッキング、タンパク質又はタンパク質複合体への結合部位、等）を提供する修飾又は配列を更に含んでもよい。当該修飾の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７メチルグアニレートのキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テイル（すなわち３’ポリ（Ａ）テイル）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による安定性及び／又はアクセス可能性の調節を容易にする）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわちヘアピン）形成配列）、ＲＮＡを細胞内局在（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体等）に標的化させる修飾又は配列、トラッキング用の修飾又は配列（例えば蛍光分子との直接的なコンジュゲート形成、蛍光検出を可能にする部分とのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列等）、タンパク質結合部位を提供する修飾又は配列（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ等などの、ＤＮＡに作用するタンパク質）、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。
ガイドＲＮＡは、いかなる形状で提供されてもよい。例えば、ｇＲＮＡはＲＮＡの形で、２分子（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）として、又は１分子（ｓｇＲＮＡ）として、また任意でＣａｓタンパク質との複合体の形状で提供することができる。ｇＲＮＡは、ＲＮＡをコードするＤＮＡの形状で提供されてもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一のＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別個のＲＮＡ分子（例えば別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードするものであってもよい。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、それぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供されてもよい。
ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれて、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されてもよい。あるいは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現コンストラクト内のプロモーターに作動可能に連結されてもよい。かかるプロモーターは、例えば、多能性のラット、真核生物、哺乳動物、非ヒト哺乳動物、ヒト、齧歯動物、マウス又はハムスターの細胞内で活性なものであってもよい。幾つかの場合、当該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えばヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター）である。他のプロモーターの例は、本明細書で随所に述べる。
あるいは、ｇＲＮＡは、様々な他の方法によって調製されてもよい。例えば、ｇＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ等を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製されてもよい（国際公開第２０１４／０８９２９０号及び国際公開第２０１４／０６５５９６号参照）。ガイドＲＮＡは、化学合成によって調製された合成分子であってもよい。
ｉｉｉ．ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列
「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列」という用語には、結合のための十分な条件の存在下で、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する、標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列が含まれる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、ガイドＲＮＡが相補性を有するよう設計される配列を含み、その際、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とＤＮＡターゲッティング配列との間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを生じさせ、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに充分な相補性が存在する場合には、完全な相補性が必ずしも必要とされるというわけではない。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列はまた、以下に詳述するように、Ｃａｓタンパク質のための切断部位を含む。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、いかなるポリヌクレオチドを含んでもよく、例えば、細胞の核若しくは原形質内に、又は細胞のオルガネラ内（例えばミトコンドリア又は葉緑体）に位置してもよい。
標的ＤＮＡ内のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡによって標的とされる（すなわち、結合する、又はハイブリダイズする、又は相補的である）ことができる。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞内の通常の生理的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系の条件）は、当分野で公知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照）。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡと相補的で、ハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称され、「相補鎖」と相補的である標的ＤＮＡの鎖（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡと相補的でない）は、「非相補的鎖」又は「テンプレート鎖」と称される。
Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ中に存在する核酸配列の範囲内又は外側の部位で核酸を切断することができる。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断をする核酸の位置を含む。例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列とハイブリダイズし、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するｇＲＮＡを含む）により、片方若しくは両方の鎖において、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列又はその近傍（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０若しくはそれ以上の塩基対内）が切断される。切断部位がｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントが結合する核酸配列の外側に存在する場合、切断部位は未だ、「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列」中に存在すると考えられる。切断部位は、核酸の１つの鎖上、又は両方の鎖上に存在してもよい。切断部位は、核酸の両鎖の（平滑断端を生じさせる）同じ位置に存在してもよく、又は、各鎖上の（粘着末端を生じさせる）異なる部位に存在してもよい。粘着末端は、例えば、２つのＣａｓタンパク質を用いて生じさせることができ、その際、各々が各鎖上の異なる切断部位で一本鎖を切断し、それにより二本鎖を切断する。例えば、第１ニッカーゼが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１鎖上で一本鎖を切断し、第２ニッカーゼが、ｄｓＤＮＡの第２鎖上で、突出鎖が生じるように一本鎖を切断することができる。幾つかの場合、第１鎖上のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、第２鎖上のニッカーゼのＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００又は１，０００塩基対離れている。
Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的切断は、標的ＤＮＡ内の、（ｉ）ｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対形成の相補性、及び（ｉｉ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される短いモチーフ、の両方により決定される位置で生じうる。ＰＡＭは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列に隣接してもよい。任意には、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、ＰＡＭに隣接してもよい。例えば、Ｃａｓ９の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流又は下流の、約１〜約１０又は約２〜約５塩基対（例えば、３塩基対）の位置に存在してもよい。幾つかの場合（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９又は近い関係のＣａｓ９を用いる場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−Ｎ１ＧＧ−３’であってもよく、ここで、Ｎ１は、ＤＮＡヌクレオチドであり、標的ＤＮＡの非相補鎖のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の直後の３’側に位置している。ゆえに、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣ Ｎ２−３’であり、ここで、Ｎ２はいかなるＤＮＡヌクレオチドであってもよく、標的ＤＮＡの相補鎖のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の直前の５’側に位置している。そのような幾つかの場合において、Ｎ１とＮ２とは相補的であり、Ｎ１−Ｎ２塩基対はいかなる塩基対であってもよい（例えば、Ｎ１＝ＣとＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝ＧとＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝ＡとＮ２＝Ｔ、Ｎ１＝ＴとＮ２＝Ａ）。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の例には、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントと相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列が追加された当該ＤＮＡ配列が含まれる。例えば、標的モチーフは、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧのモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であってもよい（例えば国際公開第２０１４／１６５８２５号を参照）。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の他の例としては、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含むものが挙げられ（例えばＧＧＮ２０ＮＧＧ、配列番号１０）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ７ポリメラーゼによる効果的な転写を促進することができる。例えば国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、細胞に内在の若しくは外来のいかなる核酸配列であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列は、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、非翻訳配列（例えば調節配列）、又はその両方を含む配列であってもよい。一実施形態では、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接している。一実施形態では、目的の遺伝子座は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、ｇＲＮＡは、（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、をコードする第３核酸配列を含む。他の実施形態では、多能性ラット細胞のゲノムは、標的配列と相補的な標的ＤＮＡ領域を含む。かかる方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。幾つかの実施形態では、ｇＲＮＡは、（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は、（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む。かかる方法では、ｃｒＲＮＡは、配列番号４、配列番号５又は配列番号６に示す配列を含む。かかる方法では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号７又は配列番号８に示す配列を含む。
また、ヌクレアーゼ剤の活性型の変異体及び断片（すなわち操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。かかる活性型の変異体は、生来のヌクレアーゼ剤に対し、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性であってもよく、当該活性型の変異体は、目的の認識部位を切断する能力を保持し、ゆえにニック又は二本鎖切断を誘導する活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれかは、生来のエンドヌクレアーゼの配列から修飾されることにより、生来のヌクレアーゼ剤によって認識されない認識部位を認識し、ニック又は二本鎖切断を誘導できるよう設計されうる。ゆえに、幾つかの実施形態では、操作されたヌクレアーゼ剤は、対応する生来のヌクレアーゼ剤認識部位と異なる認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニック又は二本鎖切断を誘導する活性のアッセイ方法は公知であり、通常、認識部位を含むＤＮＡ基質上におけるエンドヌクレアーゼ剤の全体活性及び特異性を測定する。
例えば、図３は、ＺＦＮの選択カセット上の結合部位及び切断部位の位置を表す。当該部位は、以下の通りである：Ｎｅｏ−ＺＦＮ（１，２）：ヌクレアーゼ結合部位／切断部位：
ヌクレアーゼ剤は、当分野で知られているあらゆる手段で細胞に導入されうる。ヌクレアーゼ剤をコードするポリペプチドを細胞に直接導入してもよい。あるいは、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドを、細胞に導入してもよい。ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入されるとき、当該ヌクレアーゼ剤は細胞内で、一過性に、条件に応じて、又は構成的に発現しうる。ゆえに、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは発現カセットに含めることができ、条件に応じるプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター又は組織特異的プロモーターに作動可能に連結されうる。目的のかかるプロモーターは、本発明で更に詳述する。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ヌクレアーゼ剤をコードするｍＲＮＡとして細胞に導入される。
具体的実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、細胞のゲノム内に安定的に組み込まれ、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結される。他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、挿入ポリヌクレオチドを含む同じターゲッティングベクターに存在し、一方、他の例では、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、挿入ポリヌクレオチドを含むターゲッティングベクターとは別のベクター又はプラスミドに存在している。
ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を通じてヌクレアーゼ剤が細胞に提供されるとき、そのようなヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼ剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の細胞内での高い使用頻度のコドンに置換する修飾がなされてもよい。例えば、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、目的の所与の原核又は真核生物細胞（目的の細菌細胞、酵母菌、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯動物細胞、マウス細胞、ラット細胞又は他のあらゆる宿主細胞が含まれる）内にて高い使用頻度のコドンに置換する修飾がなされてもよい。
Ｂ．選択マーカー
本明細書で提供される様々な方法及び組成物では、選択マーカーとの組み合わせにおいて、ヌクレアーゼ剤及びその対応する認識部位を使用する。本明細書に記載のように、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内への認識部位の配置により、標的遺伝子座での組み込みイベントの効率的な確認方法が提供されうる。更に、本明細書に記載の様々な方法では、ヌクレアーゼ認識部位を有する交替される選択マーカーが、導入効率及び効果の改善のために使用され、それにより、目的の複数のポリヌクレオチドが、所与の標的遺伝子座内に組み込まれる。
様々な選択マーカーが、本明細書に開示される方法及び組成物で使用できる。かかる選択マーカーは、例えば、抗生物質（例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシン）に対する抵抗性を付与できる。かかる選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）及びブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）が挙げられる。更に他の実施形態では、選択マーカーは、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、選択マーカーの発現は、細胞に対する毒性を示す。かかる選択マーカーの非限定的な例としては、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）が挙げられる。
選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結される。かかる発現カセット及びそれらの様々な調節要素は、本明細書で更に詳述する。
Ｃ．標的遺伝子座
本発明では、標的遺伝子座への少なくとも１つの挿入ポリヌクレオチドの組み込みを可能にする、様々な方法及び組成物が提供される。用語「標的遺伝子座」には、挿入ポリヌクレオチドを組み込もうとするＤＮＡのいかなるセグメント又は領域も含まれる。一実施形態では、標的遺伝子座は、ゲノム遺伝子座である。標的遺伝子座は、細胞の生来のものであってもよく、あるいは異種又は外来のＤＮＡセグメントを含んでもよい。かかる異種又は外来のＤＮＡセグメントは、トランスジーン、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、又は異種若しくは外来のＤＮＡ領域（すなわちゲノムＤＮＡの異種若しくは外来の領域）を含んでもよい。例えば、標的遺伝子座は、認識部位、選択マーカー、以前に組み込まれた挿入ポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド、プロモーター等、標的導入システムのいずれを含んでもよい。あるいは、標的遺伝子座は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体内、又は、適当な宿主細胞に含まれる他の任意の操作されたゲノム領域に位置させることができる。ゆえに、特定の実施形態では、標的遺伝子座は、生来の、異種の又は外来のゲノム核酸配列を含んでもよく、その由来としては、原核生物、真核細胞、酵母、細菌、非ヒト哺乳動物、非ヒト細胞、齧歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜化された哺乳動物若しくは農業用の哺乳動物、又は他のいかなる目的生物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
標的遺伝子座の非限定的な例としては、Ｂ細胞で発現されるタンパク質をコードするゲノム遺伝子座、未成熟のＢ細胞でポリペプチドを発現するゲノム遺伝子座、成熟したＢ細胞でポリペプチドを発現するゲノム遺伝子座、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座、又はＴ細胞受容体遺伝子座（例えばＴ細胞受容体α遺伝子座を含む）が挙げられる。かかる遺伝子座は、鳥類（例えばニワトリ）、非ヒト哺乳類、齧歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜化された哺乳類若しくは農業用の哺乳動物、又は他のいかなる目的生物、又はそれらの組み合わせに由来してもよい。
更なる実施形態では、標的遺伝子座は、ヌクレアーゼ剤により誘導されるニック又は二本鎖切断がない場合に、従来法では標的とできないか、又は、誤って、又は、顕著に低い効率で標的とされうるのみである。
Ｄ．ターゲッティングベクター及び挿入ポリヌクレオチド：
上記で概説したように、本明細書で提供される方法及び組成物は、ヌクレアーゼ剤と、選択カセット内のヌクレアーゼ剤の認識部位との戦略的なポジショニングを、相同組換えイベントとの組み合わせにおいて利用する。かかる方法は、相同組換えとの組み合わせにおいて認識部位でのニック又は二本鎖切断を用い、それにより、挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みを標的とする。「相同組換え」は従来、相同領域中の交差部位における、２つのＤＮＡ分子の間でのＤＮＡ断片の交換を行う際に用いられる。
ｉ．挿入ポリヌクレオチド
用語「挿入ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座に組み込まれることが所望されるＤＮＡのセグメントを含む。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、１つ以上の目的のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、１つ以上の発現カセットを含んでもよい。所与の発現カセットは、発現に影響する様々な調節因子に加えて、目的のポリヌクレオチド、並びに選択マーカー及び／又はリポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。挿入ポリヌクレオチド内に含めることができる、目的のポリヌクレオチド、選択マーカー及びリポーター遺伝子（例えばｅＧＦＰ）の非限定的な例は、本明細書で詳述する。
具体的実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、ゲノム核酸を含んでもよい。一実施形態では、当該ゲノム核酸は、マウス、ヒト、齧歯動物、非ヒトのラット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、鶏、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）、家畜化された哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、又は他のいかなる目的生物、又はそれらの組み合わせに由来する。
更なる実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、条件付き対立遺伝子を含む。一実施形態では、条件付き対立遺伝子は、参照により本発明に援用する米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号に記載のような多機能対立遺伝子である。具体的実施形態では、条件付き対立遺伝子は、以下を含む：（ａ）標的遺伝子の転写に関するセンス方向の作用配列、及びセンス又はアンチセンス方向の薬剤選択カセット、（ｂ）アンチセンス方向の目的ヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、及び逆位による条件付きモジュール（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｂｙ ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ）（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロン及び可逆的遺伝子トラップモジュールを利用する。参照により本発明に援用する米国特許出願公開第２０１１／０１０４７９９号参照）、及び（ｃ）第１リコンビナーゼへの暴露に応じて組換えを行い、条件付き対立遺伝子を形成する、（ｉ）作用配列及びＤＳＣを有さず、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩ及びアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、組換え可能ユニット。
挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。
具体的実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、部位特異的な組換え標的配列に隣接する核酸を含む。全挿入ポリヌクレオチドが、かかる部位特異的な組換え標的配列に隣接することができると理解できるが、挿入ポリヌクレオチド内の目的のいかなる領域又は個々のポリヌクレオチドが、かかる部位に隣接してもよい。「組換え部位」という用語には、部位特異的リコンビナーゼによって認識され、組換えイベントのための基質として使用できるヌクレオチド配列が含まれる。「部位特異的リコンビナーゼ」という用語には、組換え部位（１つの核酸分子内で、又は別々の核酸分子上で、２つの組換え部位が物理的に切り離される部位）間での組換えを可能にすることができる一群の酵素が含まれる。部位特異的リコンビナーゼの例としては、限定されないが、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ及びＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。部位特異的リコンビナーゼは、細胞にリコンビナーゼポリペプチドを導入するか、又は宿主細胞に部位特異的なリコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドを導入するなど、いかなる手段で細胞に導入してもよい。部位特異的リコンビナーゼをコードするポリヌクレオチドは、挿入ポリヌクレオチド内に、又は、別々のポリヌクレオチド内に位置させることができる。部位特異的リコンビナーゼは、例えば、誘導性プロモーター、細胞に内在のプロモーター、細胞に対し異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターなどの、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。挿入ポリヌクレオチド又は挿入ポリヌクレオチド内のいかなる目的のポリヌクレオチドと隣接しうる部位特異的組換え標的配列としては、限定されないが、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ及びそれらの組み合わせが挙げられる。
他の実施形態では、部位特異的組換え部位は、挿入ポリヌクレオチド内に含まれる選択マーカー及び／又はリポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接する。かかる例においては、標的遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの組み込み後、部位特異的組換え部位間の配列は除去されうる。
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含む。限定されないが、かかる選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されている。標的遺伝子座（すなわちゲノム遺伝子座）中に目的のポリヌクレオチドを連続的にタイリングするとき、上記で概説したように、選択マーカーはヌクレアーゼ剤のための認識部位を含んでもよい。一実施形態では、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、部位特異的組換え標的配列に隣接している。
挿入ポリヌクレオチドは、プロモーターに作動可能に連結されたリポーター遺伝子を更に含んでもよく、当該リポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるリポータータンパク質をコードする。かかるリポーター遺伝子は、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されうる。かかるプロモーターは、誘導性プロモーター、リポーター遺伝子又は細胞に内在のプロモーター、リポーター遺伝子又は細胞に対して異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターであってもよい。
ｉｉ．ターゲッティングベクター
ターゲッティングベクターは、標的遺伝子座に挿入ポリヌクレオチドを導入するために使用される。ターゲッティングベクターは、挿入ポリヌクレオチドと、挿入ポリヌクレオチドに隣接する、上流及び下流側のホモロジーアームを更に含む。挿入ポリヌクレオチドに隣接するホモロジーアームは、標的遺伝子座内の領域に対応する。説明の便宜のため、標的遺伝子座内の対応する領域を本発明では「標的部位」と称する。すなわち、一例では、ターゲッティングベクターは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の第１認識部位の充分近傍に位置する第１及び第２標的に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含んでもよい。したがって、ターゲッティングベクターは、細胞のゲノム内のホモロジーアームと対応する標的部位との間で生じる相同組換えイベントを通じて、挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みを促進する。
ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、対応する標的部位との相同組換えイベントを促進するのに十分ないかなる長さであってもよく、例えば、５０〜１００塩基、１００〜１０００塩基、又は少なくとも５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１００〜２００、又は２００〜３００ｋｂ若しくはそれ以上の長さである。下記で概説するように、大型ターゲッティングベクターはより長いターゲッティングアームを使用できる。
ターゲッティングベクターの上流及び下流のホモロジーアームに対応する標的遺伝子座内の標的部位は、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドに位置する「認識部位の十分近傍」に位置している。ターゲッティングベクターの上流及び下流のホモロジーアームは、認識部位に対して「十分近傍に位置」し、その距離は、認識部位におけるニック又は二本鎖切断の際に、標的部位とホモロジーアームとの間における相同組換えイベントの発生を促進する距離である。このように具体的実施形態では、ターゲッティングベクターの上流及び／又は下流のホモロジーアームに対応する標的部位は、所与の認識部位から少なくとも１ヌクレオチド内、所与の認識部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂ内、又は所与の認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド〜約５００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、又は約１０ｋｂ〜約１４ｋｂの範囲内である。具体的実施形態では、認識部位は、標的部位の少なくとも１つ若しくは両方と直接隣接している。
ターゲッティングベクターのホモロジーアームに対応する標的部位と、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の認識部位との位置関係は、適宜異なってもよい。例えば、標的部位は認識部位に対して５’に位置してもよく、両方の標的部位が認識部位に対して３’に位置してもよく、又は、標的部位は認識部位に隣接してもよい。
ホモロジーアーム及び標的部位は、２つの領域が相同組換え反応の基質として相互に機能するのに十分な配列同一性を有するとき、相互に「対応する」又は「対応している」という。「相同性」とは、対応する配列と同一であるか、又は配列同一性を共有するＤＮＡ配列を意味する。所与の標的部位と、対応するターゲッティングベクターに存在するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えを生じさせることができるいかなる配列同一性の程度であってもよい。ターゲッティングベクター（又はその断片）のホモロジーアームと、標的部位（又はその断片）との間で共有される配列同一性の程度としては、当該配列が相同組換えに供されうる、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であってもよい。更に、ホモロジーアームと対応する標的部位との間の対応する相同性の領域は、切断される認識部位における相同組換えを促進するのに十分な長さであればよい。例えば、所与のホモロジーアーム及び／又は対応する標的部位は、少なくとも約５０〜１００塩基、１００〜１０００塩基、又は５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、５〜１００、１００〜２００、又は２００〜３００ｋｂ、又はそれ以上の長さに対応する相同性の領域を含んでもよく（例えば本明細書に記載のＬＴＶＥＣベクター）、当該ホモロジーアームは、細胞のゲノム内の対応する標的部位と相同組換えを行うのに十分な相同性を有する。
説明の利便性のため、ホモロジーアームには、上流及び下流のホモロジーアームが含まれる。この用語は、ターゲッティングベクター内の挿入ポリヌクレオチドに対するホモロジーアームの相対的な位置に関するものである。
ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、したがって、標的遺伝子座の標的部位に対応するよう設計される。ゆえに、ホモロジーアームは細胞の生来の遺伝子座に対応しうるか、又は、それらはＤＮＡの異種若しくは外来のセグメントの領域に対応しうるものであり、それは導入遺伝子、発現カセット又はＤＮＡの異種の若しくは外来の領域などの細胞のゲノムに組み込まれる。あるいは、ターゲッティングベクターホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）若しくはヒト人工染色体の領域、又は適当な宿主細胞に含まれる他の操作された領域に対応させてもよい。更に、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー又はＰ１ファージライブラリーの領域に対応してもよく、又は由来してもよい。すなわち、特定の実施形態では、ターゲッティングベクターのホモロジーアームは、生来の遺伝子座に対応するか、異種であるか、又は原核生物、酵母、鳥類（例えばニワトリ）、非哺乳動物、齧歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）家畜用哺乳動物若しくは農業用哺乳動物、又は他の目的生物由来の外来のものでありうる。更なる実施形態では、ホモロジーアームは、ヌクレアーゼ剤によって誘導されるニック又は二本鎖切断がなければ、従来法を用いてターゲッティングできないか、又は、誤った若しくは顕著に低い効率でのみターゲッティングされうる、細胞内の遺伝子座に対応する。一実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡに由来する。
他の実施形態では、上流及び下流のホモロジーアームは、標的とされたゲノムと同じゲノムに対応する。一実施形態では、ホモロジーアームは、関連するゲノムに由来し、例えば、標的ゲノムは第１種のマウスゲノムであり、ターゲッティングアームは第２種のマウスゲノムに由来し、第１種と第２種とは異なる。他の実施形態では、ホモロジーアームは同じ動物のゲノム由来であるか、又は同じ種のゲノム由来であり、例えば、標的ゲノムは第１株のマウスゲノムであり、ターゲッティングアームは同じマウス由来のマウスゲノム由来、又は同じ種由来である。
本明細書の他の部分で述べるように、ターゲッティングベクター（例えば大型ターゲッティングベクター）は、選択カセット又はリポーター遺伝子を含んでもよい。選択カセットは、選択マーカーをコードする核酸配列を含んでもよく、当該核酸配列はプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、目的の原核細胞及び／又は真核生物細胞内で活性であり得る。かかるプロモーターは、誘導性プロモーター、リポーター遺伝子若しくは細胞に内在のプロモーター、リポーター遺伝子若しくは細胞に対して異種であるプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターであってもよい。一実施形態では、選択マーカーは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）、及びそれらの組み合わせから選択される。ターゲッティングベクターの選択マーカーは、上流及び下流のホモロジーアームと隣接させてもよく、ホモロジーアームに対して５’又は３’に配置してもよい。
一実施形態では、ターゲッティングベクター（例えば大型ターゲッティングベクター）は、プロモーターに作動可能に連結されたリポーター遺伝子を含み、当該リポーター遺伝子は、ＬａｃＺ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるリポータータンパク質をコードする。かかるリポーター遺伝子は、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されうる。かかるプロモーターは、誘導性プロモーター、レポーター遺伝子若しくは細胞に内在のプロモーター、リポーター遺伝子若しくは細胞に対して異種のプロモーター、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーター又は発生段階特異的プロモーターであってもよい。
一実施形態では、ターゲッティングベクター（例えば大型ターゲッティングベクターを含む）とヌクレアーゼ剤との併用により、ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率が増加する。一実施形態では、ターゲッティングベクターがヌクレアーゼ剤との組み合わせで使用されるとき、ターゲッティングベクターの単独での使用と比較して、ターゲッティングベクターのターゲッティング効率は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、又は少なくとも１０倍増加している。
ｉｉｉ．大型ターゲッティングベクター
用語「大型ターゲッティングベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」には、細胞内での相同組換えを実施しようとする他のアプローチにおいて典型的に用いられるものよりも大きな核酸配列に対応及び由来するホモロジーアーム、並びに／又は細胞内での相同組換えを実施しようとする他のアプローチにおいて典型的に用いられるものよりも大きな核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチド、を含む、大型ターゲッティングベクターが含まれる。具体的実施形態では、ＬＴＶＥＣのホモロジーアーム及び／又は挿入ポリヌクレオチドは、真核生物細胞のゲノム配列を含む。ＬＴＶＥＣのサイズは、従来のアッセイ（例えばサザンブロッティング及びロングレンジ（例えば１ｋｂ〜５ｋｂ）ＰＣＲ）によるターゲッティングイベントのスクリーニングを行うにはあまりに大きい。ＬＴＶＥＣの例としては、限定されないが、大腸菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣの非限定的な例及びそれらの作製方法は、例えば、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号、同第７，１０５，３４８号及び国際公開第２００２／０３６７８９号（ＰＣＴ／ＵＳ０１／４５３７５）に記載されている（各内容を参照により本発明に援用する）。
ＬＴＶＥＣはいかなる長さでもよく、限定されないが、約２０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約７５ｋｂ、約７５ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１７５ｋｂ，約１７５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さが挙げられる。
一実施形態では、ＬＴＶＥＣは、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂの挿入ポリヌクレオチドを含む。
一実施形態では、ＬＴＶＥＣホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリー、コスミドライブラリー又はＰ１ファージライブラリーに由来する。他の実施形態では、ホモロジーアームは、細胞の標的遺伝子座（すなわちゲノム遺伝子座）に由来し、幾つかの例では、ＬＴＶＥＣが標的とするよう設計されている当該標的遺伝子座は、従来法を用いた場合にはターゲッティングできない。更に他の実施形態では、ホモロジーアームは、合成ＤＮＡに由来する。一実施形態では、ＬＴＶＥＣの上流のホモロジーアームと下流のホモロジーアームの合計は、少なくとも１０ｋｂである。一実施形態では、上流のホモロジーアームは、約１ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲である。他の実施形態では、上流のホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲である。一実施形態では、下流のホモロジーアームは、約１ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲である。一実施形態では、下流のホモロジーアームは、約５ｋｂ〜約１００ｋｂの範囲である。他の実施形態では、上流と下流のホモロジーアームの合計は、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約７０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１１０ｋｂ〜約１２０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂである。
他の実施形態では、ＬＴＶＥＣの５’と３’のホモロジーアームの合計は、約１０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１２０ｋｂ、又は約１２０ｋｂ〜１５０ｋｂである。他の例において、５’と３’のホモロジーアームの合計は、約１６Ｋｂ〜約１５０Ｋｂである。
更なる実施形態では、ＬＴＶＥＣ及び挿入ポリヌクレオチドは、標的遺伝子座での削除を可能にするため、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約４００ｋｂ、約４００ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約１Ｍｂ、約１Ｍｂ〜約１．５Ｍｂ、約１．５Ｍｂ〜約２Ｍｂ、約２Ｍｂ〜約２．５Ｍｂ又は約２．５Ｍｂ〜約３Ｍｂであるよう設計される。
他の例では、ＬＴＶＥＣ及び挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列の標的遺伝子座への挿入を可能にするため、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約６０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約８０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約２００ｋｂ、約２００ｋｂ〜約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ〜約３００ｋｂ、約３００ｋｂ〜約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ〜約４００ｋｂであるよう設計される。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、約１３０ｋｂ又は約１５５ｋｂである。
一実施形態では、本明細書で他に述べるように、ＬＴＶＥＣは、選択カセット又はリポーター遺伝子を含む。
ＩＩＩ．標的遺伝子座への目的のポリヌクレオチドの組み込み方法
Ａ．相同組換えによる認識部位付近への挿入ポリヌクレオチドの組み込み方法
本発明では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法が提供される。当該方法は、（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第１ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第１認識部位の十分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。具体的実施形態では、第１選択マーカーを含む第１ポリヌクレオチドは、第１標的部位及び第２標的部位に隣接し、第１標的部位は、第１ターゲッティングベクターの第１ホモロジーアームに対応し、第２標的部位は、第１ターゲッティングベクターの第２ホモロジーアームに対応する。
挿入ポリヌクレオチドが標的遺伝子座に組み込まれた細胞を同定するのに、様々な方法が使用できる。一実施形態では、第１認識部位のニック又は二本鎖切断は、第１選択マーカーの活性を損なわせる。ゆえに、一実施形態では、かかる細胞は、細胞を同定する条件下で細胞を培養することによって同定され、当該細胞は、認識部位を有するポリヌクレオチドによってコードされた選択マーカーが、ヌクレアーゼ剤によって切断されたため、当該マーカーの活性を有さない。かかる選択マーカーの使用方法及びそれらの活性のアッセイ方法は公知である。標的遺伝子座に挿入ポリヌクレオチドを有する細胞を同定する更なる方法は、望ましい標的部位に挿入ポリヌクレオチドが組み込まれた少なくとも１つの細胞を同定することを含んでもよい。かかる方法は、第１及び第２標的部位に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドをそのゲノム中に含む、少なくとも１つの細胞を同定することを含んでもよい。
更なる方法を用いて、挿入ポリヌクレオチドが標的遺伝子座に組み込まれた細胞を同定してもよい。標的遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの挿入により、「遺伝子座の修飾」がなされる。用語「遺伝子座の修飾」又は「ＭＯＡ」には、ゲノム内の遺伝子又は染色体遺伝子座（遺伝子座）の１つの対立遺伝子の正確なＤＮＡ配列の修飾が含まれる。「遺伝子座の修飾（ＭＯＡ）」の例としては、限定されないが、１ヌクレオチドの欠失、置換若しくは挿入、又は、数キロベースにわたる目的の遺伝子若しくは染色体遺伝子座（遺伝子座）の欠失、並びにこれらの２つの両極端の間の全ての考えられる修飾、が挙げられる。
様々な実施形態では、標的修飾の同定を容易にするために、ハイスループットの定量的アッセイ（すなわち対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイ）を使用する。本明細書に記載のＭＯＡ分析は、遺伝的修飾後の、親の染色体内の修飾された対立遺伝子の大規模なスクリーニングを可能にする。ＭＯＡ分析は、様々な解析手法で実施でき、限定されないが定量的ＰＣＲ（例えばリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ））が例示される。例えば、リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１プライマーセットと、標的でない参照遺伝子座を認識する第２プライマーセットと、を含む。更に、当該プライマーセットは、増幅された配列を認識するための蛍光プローブを含む。定量的分析は、様々な解析手法で実施でき、限定されないが、蛍光媒介ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定プローブへの定量的ハイブリダイゼーション、インベーダープローブ（Ｉｎｖａｄｅｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標））、ＭＭＰアッセイ（登録商標）、ＴａｑＭａｎ（登録商標）モレキュラービーコン、及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ法が挙げられる（参照により全内容を本発明に援用する、米国特許出願公開第２００５／０１４４６５５号を参照）。
選択マーカー内の認識部位へのニック又は二本鎖切断の存在は、様々な実施形態では、ターゲッティングベクター（例えばＬＴＶＥＣ）と標的遺伝子座との間の組換えの効率及び／又は頻度を増加させる。一実施形態では、組換えは相同組換えである。様々な実施形態では、二本鎖のニック又は切断の存在において、標的遺伝子座でのターゲッティングベクター（例えばＬＴＶＥＣ）のターゲッティング効率は、ニック又は二本鎖切断がない場合（例えば、目的の遺伝子座において同じターゲッティングベクターと同じホモロジーアームに対応する標的部位を使用するが、ニック又は二本鎖切断を生じさせるヌクレアーゼ剤が添加されない場合）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約１０倍高い。
Ｂ．標的遺伝子座への複数の目的のポリヌクレオチドの組み込み方法
本明細書で提供される様々な方法及び組成物は、所与の標的遺伝子座への複数の目的のポリヌクレオチドの標的組み込みを可能にする。当該方法は、本明細書に記載の標的組み込みシステムを使用するものであり、それは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内にヌクレアーゼ剤認識部位を戦略的に配置することを採用する。具体的実施形態では、選択マーカー及び認識部位は、各挿入ポリヌクレオチド内で交替されている。その際、所与の標的遺伝子座内の連続的な挿入ポリヌクレオチドのタイリングが、高い効率及び有効性で生じる。
一実施形態では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法は、（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第１ヌクレアーゼ剤を導入し、細胞に、第１認識部位の十分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターを導入する工程であって、第１挿入ポリヌクレオチドが、（１）目的の第１ポリヌクレオチドと、（２）細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードし、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む第２ポリヌクレオチドと、を含む、工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。
更なる実施形態では、追加の目的のポリヌクレオチドを標的遺伝子座に組み込むこともできる。細胞内の標的遺伝子座を修飾する上記方法は、（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第１ヌクレアーゼ剤を導入し、細胞に、第１認識部位の十分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターを導入する工程であって、第１挿入ポリヌクレオチドが、（１）目的の第１ポリヌクレオチドと、（２）細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードし、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む第２ポリヌクレオチドと、を更に含む、工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、（ｄ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドをそのゲノム中に含む細胞に、（ｉ）第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第２ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｂ）標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。具体的実施形態では、第２認識メーカーのニック又は二本鎖切断は、第２選択マーカーの活性を損なわせる。更なる実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞の同定は、第２選択マーカーの活性を有さない細胞を同定する条件下で細胞を培養することを含む。更なる実施形態では、第２選択マーカーを含む第２ポリヌクレオチドは、第３標的部位及び第４標的部位に隣接し、第３標的部位は第２ターゲッティングベクターの第３ホモロジーアームに対応し、第４標的部位は第２ターゲッティングベクターの第４ホモロジーアームに対応する。更なる実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞の同定は、第３及び第４標的部位に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む。
細胞内の標的遺伝子座を修飾する更なる方法は、（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第１ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第１認識部位の十分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程であって、第１挿入ポリヌクレオチドが、（１）目的の第１ポリヌクレオチドと、（２）細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドと、を更に含み、第２ポリヌクレオチドが、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含み、第２選択マーカーを含む第２ポリヌクレオチドが、第３標的部位及び第４標的部位に隣接し、第３標的部位が、第２ターゲッティングベクター内の第３ホモロジーアームに対応し、第４標的部位が、第２ターゲッティングベクター内の第４ホモロジーアームに対応する、工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、（ｄ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む細胞に、（ｉ）第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第２ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程であって、第２挿入ポリヌクレオチドが、（１）目的の第２ポリヌクレオチドと、（２）細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードし、第３ヌクレアーゼ剤のために第３認識部位を含む第３ポリヌクレオチドと、を含む、工程と、（ｂ）標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。具体的実施形態では、第２認識メーカーのニック又は二本鎖切断は、第２選択マーカーの活性を損なわせる。更なる実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドをゲノム中に含む少なくとも１つの細胞の同定は、第２選択マーカーの活性を有さない細胞を同定する条件下で細胞を培養することを含む。更なる実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドをゲノム中に含む少なくとも１つの細胞の同定は、第３及び第４標的部位に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドをゲノム中に含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む。
上記の様々な方法は、連続的に繰り返すことにより、所与の標的遺伝子座への任意の数の挿入ポリヌクレオチドの標的組み込みが可能となる。ゆえに、様々な方法により、標的遺伝子座に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又はそれ以上の数の挿入ポリヌクレオチドを挿入しうる。具体的実施形態では、かかる連続的タイリング方法は、哺乳動物（すなわちヒト、非ヒト、齧歯動物、マウス、サル、ラット、ハムスター、家畜用哺乳動物又は農業用家畜）の細胞由来の大規模なゲノム領域の標的遺伝子座（すなわちゲノム遺伝子座）中への再構築を可能にする。このような場合、コーディング及び非コーディング領域を含むゲノム領域の転移及び再構築は、少なくとも部分的に、生来のゲノム領域中に存在するコーディング領域、非コーディング領域及びコピー数変動、を保存することによって、所与の領域の複雑度の維持を可能にする。ゆえに、例えば、目的のいかなる哺乳動物細胞又は動物内に「異種の」又は「外来の」ゲノム領域を生成するために様々な方法が提供される。１つの非限定的な例では、非ヒト動物内に「ヒト化された」ゲノム領域が生成する。
所与の標的遺伝子座内への複数の挿入ポリヌクレオチドの組み込みを行う場合、選択マーカーをコードし、ヌクレアーゼ剤認識部位を含むポリヌクレオチドを、組み込みラウンドの間に交替させることができる。例えば、特定の方法では、第１ヌクレアーゼ剤は第２ヌクレアーゼ剤と異なり、及び／又は、第１選択マーカーは第２選択マーカーと異なる。他の例では、３つの挿入ポリヌクレオチドを標的遺伝子座に挿入する場合、第１及び第３選択マーカーは、互いに同一であってもよく、具体的実施形態では、同じ認識部位を更に含み、第２選択マーカーは、第１及び第３選択マーカーと異なってもよく、異なる認識部位を含んでもよい。このような選択マーカー及び認識部位の選択により、生成させるヌクレアーゼ剤の数を最小化することができ、それにより、組み込みイベントの効率及び有効性が改善される。
Ｃ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いた１つ以上の目標遺伝子座の修飾方法
本発明は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用した、細胞内の１つ以上の目的の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムについて、用語「標的部位」又は「標的配列」は交換可能に用いられ、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のＤＮＡターゲッティングセグメントが、結合のための十分な条件が提供された場合に結合する、標的ＤＮＡ内に存在する核酸配列を含むものとする。例えば、標的ＤＮＡ内の標的部位（又は標的配列）は、Ｃａｓヌクレアーゼ又はｇＲＮＡによって標的とされる（又は結合され、又はハイブリダイズされ、又は相補的である）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件としては、細胞内に通常存在する生理的条件が挙げられる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば無細胞系の条件）は、当分野で公知である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）を参照）。Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡと相補的であり、ハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補鎖」と称され、「相補鎖」と相補的である標的ＤＮＡの鎖（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡと相補的でない）は「非相補鎖」又は「鋳型鎖」と称される。
Ｃａｓタンパク質は、標的配列内の部位、又は標的配列の外側で核酸を切断しうる。「切断部位」には、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を行う核酸の位置が含まれる。各鎖上の切断部位で一本鎖切断する２つのＣａｓ９タンパク質を用いて、粘着末端を生じさせてもよい。Ｃａｓ９による標的ＤＮＡの部位特異的な切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の相補的な塩基対合、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短モチーフ（プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称する）の両方により決定される位置で生じる。例えば、Ｃａｓ９の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流で、約１〜約１０、又は約２〜約５塩基対（例えば３塩基対）であってもよい。幾つかの実施形態では（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９又は近縁のＣａｓ９を用いる場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＸＧＧ−３’であってもよく、配列中、ＸはいずれかのＤＮＡヌクレオチドであり、Ｘは標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の３’に直接位置している。すなわち、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＹ−３’であり、Ｙは任意のＤＮＡヌクレオチドであり、Ｙは標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の５’に直接位置している。そのような実施形態では、ＸとＹは相補的であり、Ｘ−Ｙ塩基対はいかなる塩基対であってもよい（例えばＸ＝ＣとＹ＝Ｇ、Ｘ＝ＧとＹ＝Ｃ、Ｘ＝ＡとＹ＝Ｔ、Ｘ＝ＴとＹ＝Ａ）。
すなわち、幾つかの実施形態では、細胞内の目的の標的遺伝子座の修飾方法は、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸を含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）各々が細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されたＣａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第１核酸内の第１ ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２核酸を含む第１挿入核酸を含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞が、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む。一実施形態では、第１ ｇＲＮＡは、第１挿入核酸とハイブリダイズしない。一実施形態では、目的の標的遺伝子座は、細胞のゲノムに位置している。他の実施形態では、目的の標的遺伝子座は、細胞内のベクターに位置している。一実施形態では、同定する工程（ｃ）は、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さない、修飾された細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。
一実施形態では、本方法は、（ｄ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞に、（ｉ）修飾された細胞内で活性なプロモーターに各々作動可能に連結された、Ｃａｓタンパク質及び第２ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、Ｃａｓタンパク質が第２核酸を含む第１挿入核酸内の第２ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の核酸と、（ｉｉ）第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３核酸を含む第２挿入核酸を含む第２ターゲッティングベクターであって、第２挿入核酸が、第２標的遺伝子座に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接している、第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｅ）第２標的遺伝子座内に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞を同定する工程であって、第２の修飾された細胞が第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さず、第２及び第３選択マーカーが異なる、工程と、を更に含む。一実施形態では、第１及び第２標的遺伝子座は、各々直接隣接している。他の実施形態では、第１又は第２標的遺伝子座は、第１又は第２ ｇＲＮＡ標的部位から、約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第２ ｇＲＮＡは、第２挿入核酸とハイブリダイズしない。一実施形態では、同定する工程（ｅ）は、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さない第２の修飾された細胞の同定を可能にする条件下で、修飾された細胞を培養することを含む。
一実施形態では、本方法は、（ｆ）第２標的遺伝子座に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞に、（ｉ）第２の修飾された細胞内で活性なプロモーターに各々作動可能に連結された、Ｃａｓタンパク質及び第３ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第３核酸を含む第２挿入核酸内の第３ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第３選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第４プロモーターに作動可能に連結された第４選択マーカーをコードする第４核酸を含む第３挿入核酸を含む第３ターゲッティングベクターであって、第３挿入核酸が、第３標的遺伝子座に位置する第５及び第６標的部位に対応する第５及び第６ホモロジーアームに隣接している、第３ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｇ）第３標的遺伝子座内に第３挿入核酸を含む第３の修飾された細胞を同定する工程であって、第３の修飾された細胞が第４選択マーカーの活性を有するが、第３選択マーカーの活性を有さず、第３及び第４選択マーカーが異なる、工程と、を更に含む。一実施形態では、第２及び第３標的遺伝子座は、各々直接隣接している。他の実施形態では、第２又は第３標的遺伝子座は、第１又は第２ ｇＲＮＡ標的部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。
一実施形態では、第１、第２、第３又は第４マーカーは、抗生物質耐性を付与する。一実施形態では、抗生物質は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む。一実施形態では、第１、第２、第３又は第４選択マーカーは、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む。一実施形態では、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡは、（ｉ）第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位とハイブリダイズするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む。一実施形態では、第１、第２又は第３標的遺伝子座は、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位の近傍に位置し、それにより、ｇＲＮＡ標的部位のニック又は二本鎖切断が、標的遺伝子座でのターゲッティングベクターの相同組換えを促進する。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が直接隣接している。
具体的実施形態では、ｇＲＮＡは、第２選択マーカー（例えばＮｅｏｒ）をコードする第１挿入核酸の挿入のために、第１抗生物質選択マーカー（例えばＨｙｇｒ）を標的とするよう設計され、それにより、第１挿入核酸の挿入により、第１抗生物質選択マーカーの活性が損なわれる。第２ ｇＲＮＡ発現プラスミドは、第１選択マーカーをコードする第２挿入核酸の挿入のために、第２選択マーカーを標的とするｇＲＮＡを発現するよう設計されてもよく、それにより、第２挿入核酸の挿入により、第２抗生物質選択マーカーの活性が損なわれる。このように、ｇＲＮＡは、核酸挿入物の交替で使用できる２つの抗生物質選択マーカーの各々を標的とする設計であればよい。Ｎｅｏ耐性選択マーカーに特異的なｇＲＮＡをコードする核酸の例としては、配列番号１７、１８、１９及び２０に記載のものが挙げられる。Ｈｙｇ耐性選択マーカーに特異的なｇＲＮＡをコードする核酸の例としては、配列番号１７、１８、１９及び２０に記載のものが挙げられる。
一実施形態では、細胞は、原核細胞である。他の実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。一実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞又は非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、線維芽細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト線維芽細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト成体幹細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、発生的に限定された前駆細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、発生的に限定されたヒト前駆細胞である。
一実施形態では、哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞である。一実施形態では、哺乳動物細胞は、齧歯動物由来である。一実施形態では、齧歯動物はラット、マウス又はハムスターである。一実施形態では、真核生物細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、造血幹細胞又は神経幹細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、非ヒトＥＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、齧歯動物胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。
一実施形態では、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位は、第１、第２又は第３選択マーカーをコードする第１、第２又は第３核酸内のイントロン、エキソン、プロモーター又はプロモーター調節領域に位置している。一実施形態では、第１、第２又は第３ターゲッティングベクターは、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第１、第２又は第３挿入核酸は、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲である。
一実施形態では、第１、第２又は第３挿入核酸は、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座のゲノム領域を含む。一実施形態では、ゲノム領域は、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む。
一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同じである。一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同じであり、第２及び第４選択マーカーは同じである。一実施形態では、第１及び第３ ｇＲＮＡは同じである。
幾つかの実施形態では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法は、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸を含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）細胞内で活性なプロモーターに各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第１ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第１核酸内で第１ ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２核酸を含む第１挿入核酸を含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞が、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、（ｄ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞に、（ｉ）修飾された細胞内で活性プロモーターと各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第２ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、Ｃａｓタンパク質が第２核酸を含む第１挿入核酸で第２ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の核酸と、（ｉｉ）第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３核酸を含む第２挿入核酸を含む第２ターゲッティングベクターであって、第２挿入核酸が、第２標的遺伝子座に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接している、第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｅ）第２標的遺伝子座に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞を同定する工程であって、第２の修飾された細胞が、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さず、第１及び第３選択マーカーが同じであり、第２及び第３選択マーカーが異なる、工程を含む。
他の実施形態では、細胞内の目的の標的遺伝子座の修飾方法は、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸を含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）細胞内で活性なプロモーターに各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第１ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第１核酸内で第１ ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２核酸を含む第１挿入核酸を含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞が、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、（ｄ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞に、（ｉ）修飾された細胞内で活性なプロモーターと各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第２ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、Ｃａｓタンパク質が、第２核酸を含む第１挿入核酸で第２ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の核酸と、（ｉｉ）第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３核酸を含む第２挿入核酸を含む第２ターゲッティングベクターであって、第２挿入核酸が、第２標的遺伝子座に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接している、第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｅ）第２標的遺伝子座に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞を同定する工程であって、第２の修飾された細胞が、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さず、第２及び第３選択マーカーが異なる、工程と、（ｆ）第２標的遺伝子座で第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞に、（ｉ）第２の修飾された細胞内で活性なプロモーターと各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第３ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第３核酸を含む第２挿入核酸で第３ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第３選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第４プロモーターに作動可能に連結された第４選択マーカーをコードする第４核酸を含む第３挿入核酸を含む第３ターゲッティングベクターであって、第３挿入核酸が、第３標的遺伝子座に位置する第５及び第６標的部位に対応する第５及び第６ホモロジーアームに隣接している、第３ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｇ）第３標的遺伝子座に第３挿入核酸を含む第３の修飾された細胞を同定する工程であって、第３の修飾された細胞が第４選択マーカーの活性を有するが、第３選択マーカーの活性を有さず、第３及び第４選択マーカーが異なる、工程と、を含む。幾つかの実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同じであり、第２及び第４選択マーカーは同じである。一実施形態では、第１及び第３選択マーカーは同じであり、第２及び第４選択マーカーは同じであり、第１及び第３ ｇＲＮＡは同じである。
ＩＶ．目的のポリヌクレオチド
様々な挿入ポリヌクレオチドにいかなる目的のポリヌクレオチドを含め、それにより標的遺伝子座に組み込むことができる。本明細書に開示される方法により、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の目的のポリヌクレオチドが標的遺伝子座に組み込まれる。
挿入ポリヌクレオチド内の目的のポリヌクレオチドは、標的遺伝子座に組み込まれたとき、１つ以上の遺伝的修飾を細胞に導入することができる。遺伝的修飾は、内在の核酸配列の欠失及び／又は標的遺伝子座への外来の若しくは異種の若しくはオルソロガスなポリヌクレオチドの追加を含むことができる。一実施形態では、遺伝的修飾は、標的遺伝子座での目的の外来のポリヌクレオチドによる、内在の核酸配列の置換を含む。すなわち、本明細書で提供される方法は、ノックアウト、欠失、挿入、置換（「ノックイン」）、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせを含む遺伝的修飾を可能にする。かかる修飾は、第１、２、３、４、５、６、７又はそれ以降の挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより生じる。
挿入ポリヌクレオチド内に、及び／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に生来のもの若しくは相同なものであってもよく、目的のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に異種であってもよく、目的のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞に対して外来であってもよく、目的のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞にオルソロガスであってもよく、又は、目的のポリヌクレオチドは、それが導入される細胞とは異なる種に由来してもよい。配列に関する用語「相同な」は、細胞の生来の配列を含む。配列に関する用語「異種の」は、無縁の種に起源を有する配列を含むか、又は、同じ種に由来する場合、構成及び／又は遺伝子座内の生来の形状から、慎重な人為的介入によって実質的に修飾されている。配列に関する用語「外来の」は、無縁の種に起源を有する配列を含む。用語「オルソロガス」は、他の種（すなわち種変異体）において既知の参照配列に機能的に同等の、ある種からのポリヌクレオチドを含む。目的のポリヌクレオチドは、非ヒト、齧歯動物、ハムスター、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳類又は非農業用哺乳類を含むがこれに限らず、目的のいかなる生物に由来してもよい。目的のポリヌクレオチドは、コーディング領域、非コーディング領域、調節領域又はゲノムＤＮＡを更に有してもよい。すなわち、第１、２、３、４、５、６、７及び／又はそれ以降のいかなる挿入ポリヌクレオチドのいずれも、かかる配列を含んでよい。
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に位置し、及び／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、マウス核酸配列、ヒト核酸、非ヒト核酸、齧歯動物の核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳類核酸又は非農業用哺乳動物核酸と相同である。更なる実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、ゲノム核酸の断片である。一実施形態では、ゲノム核酸は、マウスゲノム核酸、ヒトゲノム核酸、非ヒト核酸、齧歯動物の核酸、ラット核酸、ハムスター核酸、サル核酸、農業用哺乳類の核酸若しくは非農業用の哺乳動物核酸又はそれらの組み合わせである。
一実施形態では、目的のポリヌクレオチドは、上述のように約５００〜約２００ｋｂの範囲であってもよい。目的のポリヌクレオチドは、約５００ヌクレオチド〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約２００ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約２０ｋｂ、約２０ｋｂ〜約３０ｋｂ、約３０ｋｂ〜約４０ｋｂ、約４０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約６０ｋｂ〜約７０ｋｂ、約８０ｋｂ〜約９０ｋｂ、約９０ｋｂ〜約１００ｋｂ、約１００ｋｂ〜約１１０ｋｂ、約１２０ｋｂ〜約１３０ｋｂ、約１３０ｋｂ〜約１４０ｋｂ、約１４０ｋｂ〜約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ〜約１６０ｋｂ、約１６０ｋｂ〜約１７０ｋｂ、約１７０ｋｂ〜約１８０ｋｂ、約１８０ｋｂ〜約１９０ｋｂ、又は約１９０ｋｂ〜約２００ｋｂであってもよい。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードしてもよく、ｍｉＲＮＡをコードしてもよく、又は、それは目的のいかなる調節領域若しくは非コーディング領域を含んでもよく、例えば調節配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、転写リプレッサー結合配列又は非タンパク質コード配列の欠失が挙げられる。挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、神経系、骨格系、消化器系、循環系、筋系、呼吸器系、心臓血管系、リンパ系、内分泌系、泌尿器系、生殖器系又はそれらの組み合わせにおいて発現するタンパク質をコードしてもよい。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、骨髄又は骨髄由来細胞内に発現されるタンパク質をコードする。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、脾臓細胞内に発現されるタンパク質をコードする。更なる実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、Ｂ細胞内に発現されるタンパク質をコードするか、未成熟のＢ細胞内に発現されるタンパク質をコードするか、成熟Ｂ細胞内に発現されるタンパク質をコードする。
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。用語「重鎖」又は「イムノグロブリン重鎖」には、いかなる生物由来の免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列も含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ及び４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含む。重鎖の断片は、ＣＤＲ、ＣＤＲ及びＦＲｓ、並びにそれらの組み合わせを含む。典型的な重鎖は、可変ドメイン（Ｎ末端からＣ末端に向かって）、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能性断片は、エピトープを特異的に認識（例えばμＭ、ｎＭ又はｐＭの範囲のＫＤでエピトープを認識）できる断片を含み、発現された後細胞から分泌され、少なくとも１つのＣＤＲを含む。重鎖可変ドメインは、可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、通常、生殖細胞系に存在するＶＨ、ＤＨ及びＪＨセグメントのレパートリーに由来するＶＨ、ＤＨ及びＪＨセグメントを含む。様々な生物のＶ、Ｄ及びＪ重鎖セグメントの配列、位置及び命名法は、ＩＭＧＴデータベースで検索でき、インターネットのワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）のＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」でアクセス可能である。
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に挿入された目的のポリヌクレオチドは、ゲノム核酸配列を含み、それはヒト免疫グロブリン重鎖可変領域アミノ酸配列をコードする。一実施形態では、ゲノム核酸配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列、又はヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。一実施形態では、ゲノム核酸配列は、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、マウス免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列、又はヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列又はそれらの組み合わせである。一実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３及びそれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、重鎖定常領域の核酸配列は、ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。用語「軽鎖」には、いかなる生物由来の免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限り、ヒトのカッパ（κ）及びラムダ（λ）軽鎖及びＶｐｒｅＢ、並びに代替軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変ドメインは典型的には３つの軽鎖ＣＤＲ及び４つのＦＲｓを含む。通常、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含む可変ドメインと、軽鎖定常領域アミノ酸配列と、を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、それは通常、生殖細胞系に存在する軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントのレパートリーに由来する軽鎖ＶＬと軽鎖ＪＬ遺伝子セグメントを含む。様々な生物の軽鎖Ｖ及びＪ遺伝子セグメントの配列、位置及び命名法は、ＩＭＧＴデータベースで検索でき、インターネットのワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）のＵＲＬ「ｉｍｇｔ．ｏｒｇ．」でアクセス可能である。軽鎖には、例えば、それが配置されるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第１又は第２エピトープのいずれかと選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖にはまた、それが配置されるエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される１つ以上のエピトープと結合及び認識するもの、又は重鎖が当該エピトープを結合及び認識することを補助するものが含まれる。
一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域アミノ酸配列をコードするゲノム核酸配列を含む。一実施形態では、ゲノム核酸配列は、再構成されていないヒトλ及び／又はκ軽鎖可変領域の核酸配列を含む。一実施形態では、ゲノム核酸配列は、再構成されたヒトλ及び／又はκ軽鎖可変領域の核酸配列を含む。一実施形態では、再構成されていない若しくは再構成されたλ及び／又はκ軽鎖可変領域の核酸配列は、マウス、ラット又はヒト免疫グロブリンの、λ軽鎖定常領域の核酸配列及びκ軽鎖定常領域の核酸配列から選択される、軽鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結されている。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、受容体の細胞外タンパク質又はリガンドをコードしてもよい。具体的実施形態では、コードされたリガンドは、サイトカインである。目的のサイトカインには、ＣＣＬ、ＣＸＣＬ、ＣＸ３ＣＬ及びＸＣＬから選択されるケモカインが含まれる。サイトカインは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含んでもよい。更に他の実施形態では、サイトカインは、インターロイキン（ＩＬ）である。一実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、ＩＬ−３５及びＩＬ−３６から選択される。一実施形態では、インターロイキンはＩＬ−２である。具体的実施形態では、かかる挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、ヒト由来であり、より具体的な実施形態では、ヒト配列を含んでもよい。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、細胞質タンパク質又は膜タンパク質をコードしてもよい。一実施形態では、膜タンパク質は受容体であり、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、インターロイキン２受容体α、インターロイキン２受容体β又はインターロイキン２受容体γが挙げられる。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、少なくともＴ細胞受容体（Ｔ細胞受容体αを含む）の領域をコードするポリヌクレオチドを含む。具体的な方法では、各挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体の遺伝子座（すなわちＴ細胞受容体αの遺伝子座）の領域を含み、連続的な組み込みの完了後、Ｔ細胞受容体遺伝子座の部分又は全部が標的遺伝子座に組み込まれる。かかる挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体遺伝子座（すなわちＴ細胞受容体α遺伝子座）の１つ以上の可変セグメント又は連結セグメントを含んでもよい。更なる態様では、Ｔ細胞受容体の領域をコードするポリヌクレオチドは、例えば、哺乳類、非哺乳類、齧歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳類又は家畜哺乳類の変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドに由来してもよい。
他の実施形態では、標的遺伝子座に組み込まれたポリヌクレオチドは、核タンパク質をコードする。一実施形態では、当該核タンパク質は、核受容体である。具体的実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、ヒト由来であり、より具体的な実施形態では、ヒトゲノム配列を含んでもよい。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、コーディング配列内に遺伝的修飾を有してもよい。かかる遺伝的修飾としては、限定されないが、コーディング配列の欠失変異、又は２つのコーディング配列の融合が挙げられる。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれる目的のポリヌクレオチドは、変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態では、当該変異タンパク質は、結合特性の変化、局在性の変化、発現の変化、発現パターンの変化を示すことを特徴とする。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、少なくとも１つの疾患遺伝子座を含み、例えば、神経性疾患の遺伝子座、心血管の遺伝子座、腎臓疾患の遺伝子座、筋肉疾患の遺伝子座、血液疾患の遺伝子座、発癌性遺伝子の遺伝子座、又は免疫疾患の遺伝子座が挙げられる。かかる疾患において、当該疾患遺伝子座は優性遺伝子座あってもよく、又は当該疾患遺伝子座は劣性遺伝子座である。更に、当該疾患遺伝子座は、１ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）遺伝子座を含んでもよい。変異タンパク質をコードする目的のポリヌクレオチドは、いかなる生物に由来してもよく、例えば、哺乳類、非哺乳類、齧歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳類又は家畜用哺乳類の変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドが例示される。
挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、調節配列を含んでもよく、例えば、プロモーター、エンハンサー又は転写リプレッサー結合配列が挙げられる。具体的実施形態では、挿入ポリヌクレオチド内に存在し、かつ／又は標的遺伝子座に組み込まれた目的のポリヌクレオチドは、非タンパク質コーディング配列の欠失を有するが、タンパク質をコードする配列の欠失は有さないヌクレオチドを含む。一実施形態では、非タンパク質コーディング配列の欠失には、調節配列の欠失が含まれる。他の実施形態では、調節エレメントの欠失には、プロモーター配列の欠失が含まれる。一実施形態では、調節エレメントの欠失には、エンハンサー配列の欠失が含まれる。かかる目的のポリヌクレオチドは、いかなる生物に由来してもよく、限定されないが、哺乳類、非哺乳類、齧歯動物、マウス、ラット、ヒト、サル、農業用哺乳類又は家畜用哺乳類の変異体タンパク質をコードするポリヌクレオチドが例示される。
Ｖ．配列の導入及びトランスジェニック動物の作製方法
上記で概説したように、本発明では、１つ以上の目的のポリヌクレオチドの標的組み込みを可能にする方法及び組成物が提供される。かかるシステムは、様々な要素を使用し、説明の便宜のため、本発明における用語「標的組み込みシステム」は、広義に、導入イベントに必要とされる全ての成分（様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ＤＮＡポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、標的遺伝子座、及び目的のポリヌクレオチド）のことを指すものとする。
本明細書で提供される方法は、１つ以上のポリヌクレオチド又は標的組み込みシステムの様々な要素を含むポリペプチドコンストラクトを細胞に導入することを含む。用語「導入する」には、細胞に配列（ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を提供して、配列を細胞内部にアクセスさせることが含まれる。本明細書で提供される方法では、標的組み込みシステムのいずれかの要素を細胞に導入する方法は、ポリヌクレオチドが少なくとも１つの細胞内部にアクセスする限り、特に限定されない。様々なタイプの細胞にポリヌクレオチドを導入する方法は、当分野で公知であり、限定されないが、安定的トランスフェクション法、一時的トランスフェクション法及びウイルスを用いた方法が例示される。
幾つかの実施形態では、本発明の方法及び組成物で使用される細胞は、ゲノム中に安定的に組み込まれるＤＮＡコンストラクトを含む。用語「安定的に取り込まれる」又は「安定的に導入される」は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム中に組み込まれ、その子孫によって遺伝されうる、細胞へのポリヌクレオチドの導入を意味する。ＤＮＡコンストラクト又は標的組み込みシステムの様々な要素の安定的な取り込みに用いられるいかなるプロトコルを使用してもよい。
トランスフェクションのプロトコル、並びに細胞へのポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の導入のためのプロトコルには、様々なものが存在する。限定されないが、トランスフェクション法として、化学ベースのトランスフェクション法、例えばリポソーム、ナノ粒子、リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍら（１９７３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（２）：４５６〜６７、Ｂａｃｃｈｅｔｔｉら（１９７７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７４（４）：１５９０〜４及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６〜９７）、デンドリマー又はカチオン性ポリマー（例えばＤＥＡＥ−デキストラン又はポリエチレンイミン）を用いた方法が挙げられる。非化学ベースの方法として、エレクトロポレーション、ソノポレーション、及び光学的トランスフェクションが挙げられる。粒子ベースのトランスフェクションとしては、遺伝子銃、磁石を用いたトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｊ．（２００６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７，２７７〜２８）が挙げられる。ウイルスを用いた方法をトランスフェクションに用いてもよい。
一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、ターゲッティングベクター又は大型ターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）と同時に細胞に導入される。あるいは、ヌクレアーゼ剤は、ターゲッティングベクター又はＬＴＶＥＣとは別に一定の時間を置いて導入される。一実施形態では、ヌクレアーゼ剤は、ターゲッティングベクター又はＬＴＶＥＣの導入の前に導入され、一方他の実施形態では、ヌクレアーゼ剤はターゲッティングベクター又はＬＴＶＥＣの導入の後に導入される。
本明細書に開示される様々な方法を使用して、非哺乳動物を作製できる。かかる方法は、（１）本明細書に開示される方法を用いて、非ヒト動物の多能性細胞の標的遺伝子座に１つ以上のポリヌクレオチドを組み込んで、標的遺伝子座に目的のポリヌクレオチドを含む、遺伝的に修飾された多能性細胞を作製する工程と、（２）標的遺伝子座に１つ以上の目的のポリヌクレオチドを有する、遺伝的に修飾された多能性細胞を選択する工程と、（３）前桑実胚期の非ヒト動物の宿主胚に、遺伝的に修飾された多能性細胞を導入する工程と、（４）遺伝子的に修飾した多能性細胞を含む宿主胚を仮親に移植して、遺伝的に修飾した多能性細胞に由来するＦ０世代を作製する工程と、を含む。非ヒト動物としては、非哺乳動物、齧歯動物（例えばマウス、ラット、ハムスター）、サル、農業用哺乳類又は家畜用哺乳類が例示される。多能性細胞としては、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、齧歯動物のＥＳ細胞（例えば、マウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞又はハムスターＥＳ細胞）、サルＥＳ細胞、農業用哺乳動物のＥＳ細胞又は家畜用哺乳動物のＥＳ細胞が例示される。米国特許公開第２０１４／０２３５９３３号、同第２０１４／０３１０８２８号、及びＴｏｎｇら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ，４６７（７３１２）：２１１〜２１３を参照（各々の全開示内容を参照により本発明に援用する）。
核移植技術を用いて、非哺乳動物を作製してもよい。端的には、核移植方法は、以下の工程を含む：（１）卵母細胞を除核する工程、（２）除核した卵母細胞と組み合わせるドナー細胞又は核を単離する工程、（３）細胞又は核を、除核した卵母細胞に挿入して、再構成した細胞を形成する工程、（４）再構成した細胞を動物の子宮に移植し、胚を形成させる工程、及び、（５）胚を発生させる工程。かかる方法では、卵母細胞は通常、動物死体から摘出されるが、動物生体の輸卵管及び／又は卵巣から単離してもよい。卵母細胞は、当業者に公知の様々な培地を用いて、除核前に成熟させることができる。卵母細胞の除核は、当業者に公知の様々な方法で実施できる。ドナー細胞又は核を除核した卵母細胞へ挿入して再構成した細胞を形成する工程は、通常、融合前に、透明帯下でドナー細胞をマイクロインジェクションすることにより実施される。融合は、接触／融合平面へのＤＣ電気パルスの適用（電気融合）、細胞融合を促進する化学物質（例えばポリエチレングリコール）への暴露、又は不活性化ウイルス（例えばセンダイウイルス）の使用により、誘導することができる。再構成した細胞は通常、核ドナーとレシピエント卵母細胞の融合前、融合の間及び／又は融合の後に、電気的及び／又は非電気的な手段で活性化される。活性化方法としては、電気的パルス、化学的に誘導したショック、精子の貫通、卵母細胞内の二価カチオン濃度の増加、及び卵母細胞内の細胞タンパク質リン酸化の減少（キナーゼ阻害剤による）が例示される。活性化され再構成された細胞又は胚は通常、当業者に公知の培地で培養し、動物の子宮へ移植する。例えば、米国特許公開第２００８００９２２４９号、国際公開第１９９９／００５２６６Ａ２号、米国特許公開第２００４０１７７３９０号、国際公開第２００８／０１７２３４Ａ１号及び米国特許第７，６１２，２５０号を参照（各々の全開示内容を参照により本発明に援用する）。
本発明では、生殖細胞系に１つ以上の遺伝的修飾を有する非ヒト動物を作製する他の方法が提供され、当該方法は、以下を含む：（ａ）本明細書に記載の様々な方法を使用して、非ヒト動物の標的遺伝子座を原核細胞内で修飾する工程、（ｂ）標的遺伝子座に遺伝的修飾を含む原核細胞を選択する工程、（ｃ）当該原核細胞から、遺伝的に修飾されたターゲッティングベクターを単離する工程、（ｄ）遺伝的に修飾されたターゲッティングベクターを非ヒト動物の多能性細胞に導入して、標的遺伝子座に核酸挿入物を有する遺伝的に修飾された多能性細胞を作製する工程、（ｅ）遺伝的に修飾された多能性細胞を選択する工程、（ｆ）前桑実胚期の非ヒト動物の宿主胚に、遺伝的に修飾された多能性細胞を導入する工程、及び（ｇ）遺伝的に修飾された多能性細胞を含む宿主胚を仮親に移植して、遺伝的に修飾された多能性細胞に由来するＦ０世代を作製する工程。かかる方法では、ターゲッティングベクターは、大型ターゲッティングベクターを含んでもよい。非ヒト動物は、非哺乳動物、齧歯動物、マウス、ラット、ハムスター、サル、農業用哺乳動物又は家畜用哺乳動物であってもよい。多能性細胞は、ヒトＥＳ細胞、ヒトｉＰＳ細胞、非ヒトＥＳ細胞、齧歯動物のＥＳ細胞（例えばマウスＥＳ細胞、ラットＥＳ細胞又はハムスターＥＳ細胞）、サルＥＳ細胞、農業用哺乳動物のＥＳ細胞又は家畜用哺乳動物のＥＳ細胞であってもよい。
更なる方法では、単離工程（ｃ）は、遺伝的に修飾されたターゲッティングベクター（すなわち遺伝的に修飾されたＬＴＶＥＣ）を直線化する工程（ｃ１）を更に含む。更なる実施形態では、導入工程（ｄ）は、多能性細胞に本明細書に記載のヌクレアーゼ剤を導入する工程（ｄ１）を更に含む。他の実施形態では、導入工程（ｄ）は、非ヒト哺乳動物の多能性細胞が、細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含み、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む場合において、多能性細胞にヌクレアーゼ剤を導入して、第１ヌクレアーゼ剤が第１認識部位におけるニック又は二本鎖切断を誘導する工程（ｄ２）を更に含む。多能性細胞に更に導入されるものは、修飾された原核細胞のゲノムから得た、遺伝的に修飾されたターゲッティングベクターを含む第１ターゲッティングベクターである。修飾されたターゲッティングベクターは、非哺乳類の多能性細胞のゲノム内の第１認識部位の十分な近くで第１及び第２の標的部位に対応する第１及び第２のホモロジーアームを含む。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／又は（ｄ）は、原核細胞又は多能性細胞に、本明細書に記載の選択剤を投与することにより実施される。一実施形態では、選択工程（ｂ）及び／又は（ｄ）は、本明細書に記載の対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）分析で実施される。
本発明では、原核細胞内に細菌相同組換え（ＢＨＲ）を経て哺乳動物細胞の標的遺伝子座を修飾する更なる方法が提供され、当該方法は、（ａ）原核細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む原核細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）原核細胞に、第１上流ホモロジーアームと第１下流ホモロジーアームに隣接する挿入ポリヌクレオチドを含むターゲッティングベクターを導入する工程であって、挿入ポリヌクレオチドが、哺乳類の領域を含む工程と、原核細胞に、第１認識部位でニック又は二本鎖切断をするヌクレアーゼ剤を導入する工程と、（ｃ）標的遺伝子座に挿入ポリヌクレオチドを含む標的原核細胞を選択する工程であって、当該原核細胞がＢＨＲを媒介する組換え誘導性タンパク質及び酵素を発現できる、工程と、を含む。本明細書で開示されるように、工程（ａ）〜（ｃ）を連続的に繰り返して、原核細胞内の標的遺伝子座への複数の挿入ポリヌクレオチドの導入を行うこともできる。標的遺伝子座が原核細胞により「構築」された後、修飾された標的遺伝子座を含むターゲッティングベクターを当該原核細胞から単離し、非ヒト哺乳動物細胞内の標的遺伝子座に導入することができる。修飾された遺伝子座を含む哺乳動物細胞は、次に、非ヒトトランスジェニック動物へと作製することができる。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の標的遺伝子座の様々な遺伝的修飾は、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥＲ（登録商標）遺伝子操作技術を使用して、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡを使用し、細菌細胞内における一連の相同組換え反応（ＢＨＲ）を通じて実施できる（米国特許第６５８６２５１号、Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ，Ｄ．Ｍ．ら（２００３），Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１（６）：６５２〜６５９）を参照（全開示内容を参照により本発明に援用する）。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の様々な遺伝的修飾を含む、標的とされた哺乳類のＥＳ細胞（すなわち非哺乳動物、齧歯動物（例えばマウス、ラット又はハムスター）、農業用哺乳動物、家畜用哺乳動物、サルなどに由来）は、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥＲ（登録商標）法により、対応する生物に由来する前桑実期胚（例えば８細胞期マウス胚）に導入される（米国特許第７，５７６，２５９号、同第７，６５９，４４２号、同第７，２９４，７５４号及び米国特許公開第２００８／００７８０００ Ａ１号を参照、全開示内容を参照により本発明に援用する）。遺伝的に修飾されたＥＳ細胞を含む非ヒト哺乳類の胚を、胚盤胞期までインキュベートし、次に仮親に移植し、Ｆ０を作製する。幾つかの他の実施形態では、本明細書に記載の様々な遺伝的修飾を含む標的哺乳動物のＥＳ細胞を、胚盤胞期の胚に導入する。本明細書に記載のように、遺伝的に修飾された遺伝子座を有する非ヒト哺乳動物は、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）分析を経て同定できる。遺伝的に修飾されたＥＳ細胞に由来する、得られたＦ０世代の非ヒト哺乳動物を、野生型の非ヒト哺乳動物と交配させ、Ｆ１子孫を得る。特異的プライマー及び／又はプローブによる遺伝型決定の後、遺伝的に修飾された遺伝子座がヘテロ接合であるＦ１非ヒト哺乳動物を互いに交配し、遺伝的に修飾された遺伝子座がホモ接合である非ヒト哺乳動物を作製する。
ＶＩ．細胞
本明細書に記載の様々な方法では、細胞内における遺伝子座ターゲッティングシステムを用いる。かかる細胞としては、原核細胞（例えば大腸菌などの細菌細胞）、又は真核生物細胞（例えば酵母、昆虫、両生類、鳥（例えばニワトリ細胞）、植物）、又は、限定されないが、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類（例えばマーモセット、アカゲザル）細胞など、並びに、家畜用哺乳動物由来の細胞若しくは農業用哺乳動物由来の細胞などの、哺乳動物細胞が挙げられる。幾つかの細胞は、非ヒト細胞、具体的には非ヒト哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、適切な遺伝的に修飾可能な多能性細胞が容易に得られない哺乳動物の場合、他の方法として、体細胞を用いて、例えば、限定されないが、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＬＩＮ２８及びＧｌｉｓ１などの多能性誘導因子の組み合わせを体細胞へ導入することにより、多能性細胞に再プログラムする方法が存在する。
一実施形態では、真核生物細胞は、多能性細胞である。一実施形態では、多能性細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞である。「胚性幹細胞」又は「ＥＳ細胞」という用語には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで未分化増殖できる、胚由来の全能性若しくは多能性細胞が含まれ、胚への導入により、発生中の胚のいかなる組織にも寄与することができる。用語「多能性細胞」には、複数の分化細胞のタイプへと発生する能力を有する未分化細胞が含まれる。ポリヌクレオチド配列に関する用語「生殖細胞系」には、子孫に継承できる核酸配列が含まれる。
多能性細胞は、非ヒトＥＳ細胞又は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよい。一実施形態では、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、線維芽細胞に由来する。具体的実施形態では、誘導多能性（ｉＰＳ）細胞は、ヒト線維芽細胞に由来する。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）又は胚盤葉上層幹細胞である。多能性細胞はまた、発生的に限定された前駆細胞であってもよい。更なる実施形態では、多能性細胞は齧歯動物の多能性細胞である。一実施形態では、齧歯動物の多能性細胞は、ラット多能性細胞又はラットＥＳ細胞である。他の実施形態では、齧歯動物の多能性細胞は、マウス多能性細胞又はマウスＥＳ細胞である。
他の実施形態では、哺乳動物細胞は、不死化したマウス細胞、ラット細胞又はヒト細胞であってもよい。一実施形態では、哺乳動物細胞はヒト線維芽細胞であり、一方他の実施形態では、哺乳動物細胞はヒト癌細胞などの癌細胞である。
更なる実施形態では、哺乳動物はヒトであり、ターゲッティングはｅｘ ｖｉｖｏのヒト細胞を使用して行われる。
一実施形態では、哺乳動物細胞は、疾患に罹患する患者から単離したヒト細胞であり、及び／又は、変異タンパク質をコードするヒトポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、変異ヒトタンパク質は、結合特性の変化、局在性の変化、発現の変化、及び／又は、発現パターンの変化を特徴とする。一実施形態では、ヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、ヒト核酸配列は、少なくとも１つのヒト疾患対立遺伝子を含む。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、神経性疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、心血管疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、腎臓疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、筋肉疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、血液疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、発癌遺伝子の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、免疫性器官系疾患の対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、優性対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、劣性対立遺伝子である。一実施形態では、ヒト疾患対立遺伝子は、一塩基多型（ＳＮＰ）対立遺伝子を含む。
細胞として原核細胞を用いるとき、具体的実施形態では、当該原核細胞は、組換えに対してコンピテントな大腸菌株である。一実施形態では、原核細胞は遺伝子組換えタンパク質及び酵素をコードする核酸を含む。一実施形態では、前記原核細胞は遺伝子組換えタンパク質と酵素をコードする核酸を含まず、遺伝子組換えタンパク質及び酵素をコードする核酸を当該原核細胞に導入する。一実施形態では、核酸は、遺伝子組換えタンパク質及び酵素をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡを含む。一実施形態では、遺伝子組換えタンパク質及び酵素をコードする核酸は、ｐＡＢＧである。一実施形態では、遺伝子組換えタンパク質及び酵素は、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一実施形態では、遺伝子組換えタンパク質及び酵素の発現は、アラビノースによって制御される。
ＶＩＩ．発現カセット
本発明では、本明細書で提供される標的組み込みシステムの様々な要素（すなわちヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ポリヌクレオチド、目的のポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、選択マーカー及び他の要素）を含むポリヌクレオチド又は核酸分子が提供される。
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」及び「核酸断片」は、本明細書において交換可能に用いられる。これらの用語には、ヌクレオチド配列などが含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってもよく、任意に合成若しくは非天然若しくは変形型のヌクレオチド塩基を含んでもよい。ＤＮＡポリマーの形のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はその混合物の１つ以上のセグメントからなってもよい。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含んでもよく、天然の分子及び合成アナログ、並びにそれらの組み合わせを含んでもよい。本明細書で提供されるポリヌクレオチドはまた、限定されないが、一本鎖の形状、二本鎖の形状、ヘアピン、ステムループ構造、などのあらゆる形状の配列を含む。
本発明では、標的組み込みシステムの様々な要素を含む組換えポリヌクレオチドが更に提供される。用語「組換えポリヌクレオチド」及び「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書において交換可能に用いられる。組換えコンストラクトは、核酸配列の人工的若しくは異種の組み合わせ（例えば、天然には共存しない調節配列及びコーディング配列）を含む。他の実施形態では、組換えコンストラクトは、異なる給源に由来する調節配列及びコーディング配列を含んでもよく、又は、当該調節配列及びコーディング配列は、同じ給源由来であっても、天然に存在するものとは異なる態様にアレンジされてもよい。かかるコンストラクトは、単独で用いてもよく、ベクターとの組み合わせで用いてもよい。ベクターを用いる場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞の形質転換に用いる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターが使用できる。本発明においては、宿主細胞を好適に形質転換し、選択し、増殖させるのに必要な、何らかの単離された核酸断片を含む遺伝的要素が提供される。特に、ＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現のイムノブロット解析又は表現型解析により、スクリーニングを実施することができる。
具体的実施形態では、本明細書に記載の標的組み込みシステムの要素の１つ以上を、原核細胞、真核生物細胞、細菌、酵母細胞、又は哺乳動物細胞、又は目的の他のタイプの生物体若しくは細胞における発現用の発現カセットとして提供することができる。当該カセットは、本明細書で提供されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された５’及び３’の調節配列を含んでもよい。「作動可能に連結された」の用語には、２つ以上の要素の機能性連結が含まれる。例えば、目的のポリヌクレオチドと調節配列（すなわちプロモーター）との作動可能な連結とは、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結のことを指す。作動可能に連結された要素は、連続していてもよく、又は連続していなくともよい。２つのタンパク質コーディング領域の連結の場合、作動可能に連結するとは、コーディング領域が同じ読み枠であることを意味する。別の例において、タンパク質をコードする核酸配列は、調節配列（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー配列等）に作動可能に連結させてもよく、それにより、適切な転写調節が維持される。１つの例において、可変領域（又はＶ（Ｄ）Ｊセグメント）の核酸配列は、免疫グロブリン定常部の核酸配列に作動可能に連結されてもよく、それにより、それらの配列間での、免疫グロブリンの重鎖若しくは軽鎖配列への適切な組換えが可能となる。
カセットは、生物に共導入される少なくとも１つの追加の目的のポリヌクレオチドを追加で含んでもよい。あるいは、追加の目的のポリヌクレオチドは、複数の発現カセット上で提供されてもよい。かかる発現カセットは、組換えポリヌクレオチドを調節領域の転写調節下となるように挿入するための、複数の制限部位及び／又は組換え部位を有する。発現カセットは、選択マーカー遺伝子を追加で含んでもよい。
発現カセットは、５’−３’の転写方向に向かって、哺乳動物細胞又は目的の宿主細胞内において機能的な、転写及び翻訳開始領域（すなわちプロモーター）、本明細書で提供される組換えポリヌクレオチド、並びに転写及び翻訳終結領域（すなわち終結領域）を含んでもよい。調節領域（すなわちプロモーター、転写調節領域及び翻訳終結領域）及び／又は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して、又は互いに、生来のものであっても類似のものであってもよい。あるいは、調節領域及び／又は本明細書で提供されるポリヌクレオチドは、宿主細胞に対して、又は互いに、異種のものであってもよい。例えば、異種ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターは、当該ポリヌクレオチドが由来する種と異なる種に由来するか、又は同じ／類縁の種に由来するか、それらの１つ又は両方が、それらの元の形態及び／又は遺伝子座から実質的に修飾されるか、又は、プロモーターは、作動可能に連結されたポリヌクレオチドについての生来のプロモーターでない。あるいは、調節領域及び／又は本明細書で提供される組換えポリヌクレオチドは、完全合成物であってもよい。
終結領域は、転写開始領域に生来のものであってもよく、作動可能に連結された組換えポリヌクレオチドに生来のものであってもよく、宿主細胞に生来のものであってもよく、又は、プロモーター、組換えポリヌクレオチド、宿主細胞又はそれらのあらゆる組み合わせとは別の給源に由来する（すなわち無縁の若しくは異種の）ものであってもよい。
発現カセットの調製の際、様々なＤＮＡ断片をマニピュレーションして、適切な方向性を有するＤＮＡ配列を提供してもよい。この際、アダプター又はリンカーを用いてＤＮＡ断片を連結してもよく、又は他のマニピュレーションを行って、適切な制限酵素部位の提供、余分なＤＮＡの除去、制限酵素部位の除去等を行ってもよい。この場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏ変異導入、プライマー修復、制限酵素処理、アニーリング、再置換（例えば塩基転移及び塩基転換を行ってもよい。
本明細書で提供される発現カセットでは、多くのプロモーターを使用できる。当該プロモーターは、所望する用途に基づき選択できる。発現カセット中のプロモーターを変更して用い、目的のポリヌクレオチドの発現のタイミング、位置及び／又はレベルを調整することにより、様々な応用が可能になることが理解できる。かかる発現コンストラクトは、必要に応じて、プロモーター調節領域（例えば、誘導的、構成的、環境的若しくは発生段階的に調節された、又は細胞若しくは組織特異的／選択的な発現に関与するもの）、転写開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終結部位及びポリアデニル化部位、を含んでもよい。
本明細書で提供されるポリヌクレオチドを含む発現カセットは、形質転換された細胞の選択用の選択マーカーを含んでもよい。当該選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞又は組織の選択に利用される。
必要に応じて、本発明の方法及び組成物で使用される配列（すなわち目的のポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤等）は、細胞内での更なる発現のために最適化されうる。すなわち、目的遺伝子の発現向上のために、哺乳動物に好適なコドン、ヒトに好適なコドン、齧歯動物に好適なコドン、マウスに好適なコドン、ラットに好適なコドン等、所与の目的の細胞内での好ましいコドンを使用して合成されうる。
ＶＩＩＩ．配列同一性
本明細書で提供される方法及び組成物では、標的組み込みシステムの様々な要素（すなわちヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ポリヌクレオチド、目的のポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、選択マーカー及び他の要素）を使用する。明細書の全体から、標的組み込みシステムの幾つかの要素は、活性型の変異体及び断片を有してもよいことが理解される。かかる要素としては、例えば、ヌクレアーゼ剤（すなわち操作されたヌクレアーゼ剤）、ヌクレアーゼ剤認識部位、目的のポリヌクレオチド、標的部位及びターゲッティングベクターの対応するホモロジーアームが例示される。これらの要素の生物学的活性については、他で述べる通りである。
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列の「配列同一性」又は「同一性」とは、特定の比較ウインドウにおいて最大限整合させて整列させた場合に同一な、２つの配列内の残基のことを指す。タンパク質において配列同一性（％）を用いるとき、アミノ酸の保存的置換により、しばしば同一でない残基位置が存在するが、それは、アミノ置換が、類似する化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有するアミノで置換され、分子の機能的特性を変更しないものである。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性（％）は、置換による保存的性質を補正するように高めに調整される場合がある。かかる保存的置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」があると称される。この調整方法は、当分野の当業者に公知である。この方法は典型的には、保存的置換を、完全なミスマッチではなく、むしろ一部としてスコアに含めることを含み、それにより、配列同一性（％）が高くなる。すなわち、例えば同一のアミノ酸をスコア１とし、非保存的置換をスコア０とした場合、保存的置換は、０〜１の間のスコアとなる。保存的置換のスコアリングは、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ社、マウンテンビュー、カリフォルニア）で実行されるように算出される。
「配列同一性（％）」は、比較ウインドウ上の、最適に整列された２つの配列を比較することにより測定される値を意味し、２つの配列の最適アラインメントの場合、比較ウインドウのポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加若しくは欠失（すなわちギャップ）を含むこともある。パーセンテージは、核酸又はアミノ酸の両配列内に存在する同一の残基を有する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、当該マッチ位置数を、比較ウインドウの全位置数で除算し、結果に１００を乗算し、配列同一性（％）を得ることにより、算出される。
特に明記しない限り、本明細書で提供される配列同一性／類似性の数値は、以下のパラメータを使用し、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を使用して得られる値のことを指す：ヌクレオチド配列の同一性（％）及び類似性（％）の場合、ギャップのウエイトを５０とし、長さのウエイトを３とし、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐのスコアリングマトリックス、ヌクレオチド配列の同一性（％）及び類似性（％）の場合、ギャップのウエイトを８とし、長さのウエイトを２とし、ＢＬＯＳＵＭ６２のスコアリングマトリックス、又はそのいずれかの同等のプログラム。対象となる２つの配列に関する「同等のプログラム」とは、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０によって得られた対応する配列と比較して、同一のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の一致を有するアラインメントを作成し、同一の配列同一性を（％）を算出する、配列比較プログラムを意味する。
非限定的な実施形態には、以下が含まれる。
１．細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、（ａ）細胞内で活性な第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）第１ヌクレアーゼ剤であって、第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する、第１ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第１認識部位の充分近傍に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接する第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を含む。
２．細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結された第１ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、第１ヌクレアーゼ剤が第１ポリヌクレオチド内の第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドを含む第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞は、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む。
３．標的遺伝子座が、細胞のゲノム中に存在している、実施形態１又は２に記載の方法。
４．標的遺伝子座が、細胞内のベクターに位置している、実施形態１又は２に記載の方法。
５．第１認識部位のニック又は二本鎖の切断が、第１選択マーカーの活性を損なわせる、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．同定する工程が、第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態１、２、３、４又は５に記載の方法。
７．第１選択マーカーを含む第１ポリヌクレオチドが、第１標的部位及び第２標的部位に隣接している、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
８．同定する工程が、第１及び第２標的部位に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む、実施形態７に記載の方法。
９．第１挿入ポリヌクレオチドが、（ａ）目的の第１ポリヌクレオチドと、（ｂ）細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドであって、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む、第２ポリヌクレオチドと、を含む、実施形態1〜８のいずれか1つに記載の方法。
１０．（ａ）標的遺伝子座に組み込まれた第１挿入ポリヌクレオチドを含む細胞に、（ｉ）第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第２ヌクレアーゼ剤と、（ｉｉ）第２認識部位の充分近傍に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接する、第２挿入ポリヌクレオチドを含むターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｂ）標的遺伝子座に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を更に含む、実施形態９に記載の方法。
１１．第２認識部位におけるニック又は二本鎖切断が、第２選択マーカーの活性を損なわせる、実施形態１０に記載の方法。
１２．同定する工程が、第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態１１に記載の方法。
１３．第２選択マーカーを含む第２ポリヌクレオチドが、第３標的部位及び第４標的部位に隣接している、実施形態１０、１１又は１２に記載の方法。
１４．前記同定する工程が、第３及び第４標的部位に組み込まれた第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．第２挿入ポリヌクレオチドが、（ａ）目的の第２ポリヌクレオチドと、（ｂ）細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドと、を含み、第３ポリヌクレオチドは、第３ヌクレアーゼ剤のための第３認識部位を含む、実施形態１０〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．第１ヌクレアーゼ剤が、第２ヌクレアーゼ剤と異なる、実施形態９〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．第１選択マーカーが、第２選択マーカーと異なる、実施形態９〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．第１及び第３ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ第２ヌクレアーゼ認識部位と異なり、第１及び第３ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ第２ヌクレアーゼ剤と異なる、実施形態１５に記載の方法。
１９．第１及び第３選択マーカーが、同一である、実施形態１５に記載の方法。
２０．第１、第２又は第３選択マーカーのうちの１つが、抗生物質耐性を付与する、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、実施形態２０に記載の方法。
２２．第１、第２又は第３選択マーカーのうちの１つが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、選択マーカーの発現が、細胞に対する毒性を示す、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２３．第１、第２又は第３選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、実施形態２２に記載の方法。
２４．細胞が、原核細胞である、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．細胞が、真核生物細胞である、実施形態１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２６．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２５に記載の方法。
２７．哺乳動物細胞が、非ヒト細胞である、実施形態２６に記載の方法。
２８．哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、実施形態２７に記載の方法。
２９．齧歯動物が、ラット又はマウスである、実施形態２８に記載の方法。
３０．細胞が、多能性細胞である、実施形態２６〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．哺乳動物細胞が、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態２６に記載の方法。
３２．多能性細胞が、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態３０に記載の方法。
３３．多能性細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態３０に記載の方法。
３４．多能性細胞が、造血幹細胞である、実施形態３０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．多能性細胞が、神経幹細胞である、実施形態３０〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３６．哺乳動物細胞が、ヒト線維芽細胞である、実施形態２６に記載の方法。
３７．第１ヌクレアーゼ剤と第１ターゲッティングベクターとの併用により、第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、実施形態１又は２に記載の方法。
３８．第１ターゲッティングベクターのターゲッティング効率が、第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している、実施形態３７に記載の方法。
３９．第１又は第２ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、核酸が、細胞内で活性な第４プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態１〜３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．第１又は第２ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．第１又は第２ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４２．第１又は第２ヌクレアーゼ剤が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４３．第１又は第２ヌクレアーゼ剤が、メガヌクレアーゼである、実施形態１〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４４．第１又は第２ヌクレアーゼ剤が、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態１〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、（ａ）第１、第２又は第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．第１又は第２認識部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している、実施形態４５に記載の方法。
４７．目的のゲノム遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、実施形態４４、４５又は４６に記載の方法。
４８．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態４４、４５、４６又は４７に記載の方法。
４９．ｇＲＮＡが、（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む、実施形態４４〜４６のいずれか１つに記載の方法。
５０．ｃｒＲＮＡが、配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含む、実施形態４４〜４６のいずれか１つに記載の方法。
５１．ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号７又は配列番号８を含む、実施形態４４〜４６のいずれか１つに記載の方法。
５２．第１、第２及び／又は第３認識部位が、第１、第２又は第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、実施形態１〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．第１標的部位及び第２標的部位が、第１認識部位に直接隣接している、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．第１標的部位及び第２標的部位が、第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、実施形態１０〜１９のいずれか１つに記載の方法。
５５．第３標的部位及び第４標的部位が、第２認識部位に直接隣接している、実施形態１０〜１９のいずれか１つに記載の方法。
５６．第３標的部位及び第４標的部位が、第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、実施形態１０〜１９のいずれか１つに記載の方法。
５７．第１ホモロジーアームと第２ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、実施形態１〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．第３ホモロジーアームと第４ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、実施形態１０〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．第１挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、実施形態１〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．第２挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、実施形態１０〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．第１挿入ポリヌクレオチドの遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．第１挿入ポリヌクレオチドの遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、実施形態１０〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．第１挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載の方法。
６４．第２挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態８〜６３のいずれか１つに記載の方法。
６５．第１挿入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．第２挿入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態８〜６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．第１又は第２挿入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態６５又は６６に記載の方法。
６８．Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域が、ヒト由来である、実施形態６５〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．第１挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜６４のいずれか１つに記載の方法。
７０．同定する工程が、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを経て実施される、実施形態１〜６９のいずれか１つに記載の方法。
７１．第１挿入ポリヌクレオチドが、細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜６５のいずれか１つに記載の方法。
７２．第２挿入ポリヌクレオチドが、細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む、実施形態１０〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．第１挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１〜７０のいずれか１つに記載の方法。
７４．第２挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態１０〜７０又は７３のいずれか１つに記載の方法。
他の非限定的な実施形態には、以下のものが含まれる。
１．細胞内の目的の標的遺伝子座の修飾方法であって、（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする核酸を含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、（ｂ）細胞に、（ｉ）Ｃａｓタンパク質と第１ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、各々が、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され、Ｃａｓタンパク質が第１核酸中の第１ ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２核酸を含む第１挿入核酸を含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｃ）第１標的遺伝子座に第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞は、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さず、第１及び第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
２．第１ ｇＲＮＡが、第１挿入核酸とハイブリダイズしない、実施形態１に記載の方法。
３．目的の標的遺伝子座が、細胞のゲノム中に位置している、実施形態１に記載の方法。
４．目的の標的遺伝子座が、細胞内のベクターに位置している、実施形態１に記載の方法。
５．同定する工程（ｃ）が、第２選択マーカーの活性を有するが、第１選択マーカーの活性を有さない、修飾された細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態１に記載の方法。
６．（ｄ）第１標的遺伝子座で第１挿入核酸を含む修飾された細胞に、（ｉ）Ｃａｓタンパク質及び第２ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の核酸であって、各々が修飾された細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結し、Ｃａｓタンパク質が、第２核酸を含む第１挿入核酸内の第２ ｇＲＮＡ標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の核酸と、（ｉｉ）第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３核酸を含む第２挿入核酸を含む第２ターゲッティングベクターであって、第２挿入核酸が、第２標的遺伝子座に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接している、第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｅ）第２標的遺伝子座内に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞を同定する工程であって、第２の修飾された細胞が、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さず、第２及び第３選択マーカーが異なる工程と、を更に含む、実施形態１に記載の方法。
７．第１及び第２標的遺伝子座が、各々に隣接して位置している、実施形態６に記載の方法。
８．第１又は第２標的遺伝子座が、第１又は第２ ｇＲＮＡ標的部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、実施形態６に記載の方法。
９．第２ ｇＲＮＡが、第２挿入核酸とハイブリダイズしない、実施形態８に記載の方法。
１０．同定する工程（ｅ）が、第３選択マーカーの活性を有するが、第２選択マーカーの活性を有さない第２の修飾された細胞の同定を可能にする条件下で、修飾された細胞を培養することを含む、実施形態６に記載の方法。
１１．（ｆ）第２標的遺伝子座に第２挿入核酸を含む第２の修飾された細胞に、（ｉ）第２の修飾された細胞内で活性なプロモーターと各々作動可能に連結されたＣａｓタンパク質及び第３ ｇＲＮＡをコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、Ｃａｓタンパク質が第３核酸を含む第２挿入核酸で第３ ｇＲＮＡ標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第３選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、（ｉｉ）第４プロモーターに作動可能に連結された第４選択マーカーをコードする第４核酸を含む第３挿入核酸を含む第３ターゲッティングベクターであって、第３挿入核酸が、第３標的遺伝子座に位置する第５及び第６標的部位に対応する第５及び第６ホモロジーアームに隣接している、第３ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、（ｇ）第３標的遺伝子座に第３挿入核酸を含む第３の修飾された細胞を同定する工程であって、第３の修飾された細胞が第４選択マーカーの活性を有するが、第３選択マーカーの活性を有さず、第３及び第４選択マーカーが異なる、工程と、を含む。
１２．第２及び第３標的遺伝子座が、各々直接隣接して位置している、実施形態１１に記載の方法。
１３．第２又は第３標的遺伝子座が、第１又は第２ ｇＲＮＡ標的部位から１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、実施形態１１に記載の方法。
１４．第１、第２、第３又は第４マーカーが、抗生物質耐性を付与する、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、実施形態１４に記載の方法。
１６．第１、第２、第３又は第４選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１７．第１、第２又は第３ ｇＲＮＡが、（ｉ）第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位とハイブリダイズするヌクレオチド配列と、（ｉｉ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
１８．第１、第２又は第３標的遺伝子座が、第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位の近傍に位置し、ｇＲＮＡ標的部位のニック又は二本鎖切断が、標的遺伝子座でのターゲッティングベクターの相同組換えを促進する、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
１９．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
２０．第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している、実施形態１９に記載の方法。
２１．細胞が、原核細胞である、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
２２．細胞が、真核生物細胞である、実施形態１、６及び１１のいずれか１つに記載の方法。
２３．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２４．哺乳動物細胞が、線維芽細胞である、実施形態２３に記載の方法。
２５．哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、実施形態２３に記載の方法。
２６．哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、実施形態２３に記載の方法。
２７．齧歯動物が、ラット、マウス又はハムスターである、実施形態２６に記載の方法。
２８．真核生物細胞が、多能性細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２９．多能性細胞が、造血幹細胞又は神経幹細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３０．多能性細胞が、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３１．多能性細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３２．第１、第２又は第３ ｇＲＮＡ標的部位が、第１、第２又は第３選択マーカーをコードする第１、第２又は第３核酸のイントロン、エキソン、プロモーター又はプロモーター調節領域に位置している、実施形態１、６及び１１のいずれか１つに記載の方法。
３３．第１、第２又は第３ターゲッティングベクターが、少なくとも約１０ｋｂである、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
３４．第１、第２又は第３挿入核酸が、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの範囲である、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
３５．第１、第２又は第３挿入核酸が、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座のゲノム領域を含む、実施形態１、６又は１１に記載の方法。
３６．ゲノム領域が、ヒトＴ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む、請求項３５に記載の方法。
３７．第１及び第３選択マーカーが同じである、実施形態６に記載の方法。
３８．第１及び第３選択マーカーが同じであり、第２及び第４選択マーカーが同じである、実施形態１１に記載の方法。
３９．第１及び第３ ｇＲＮＡが同じである、実施形態３８に記載の方法。
４０．ｇＲＮＡがハイグロマイシン又はネオマイシン抵抗性遺伝子に特有である実施形態１、６、３７、３８又は３９に記載の方法。
４１．ネオマイシン抵抗性遺伝子に特異的なｇＲＮＡが、配列番号１３、１４、１５又は１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態４０に記載の方法。
４２．ネオマイシン抵抗性遺伝子に特異的なｇＲＮＡが、配列番号１７、１８、１９又は２０に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態４０に記載の方法。
４３．ａ）第１ ｇＲＮＡが、配列番号１３、１４、１５又は１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、第２ ｇＲＮＡが、配列番号１７、１８、１９又は２０に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるか、又はｂ）第１ ｇＲＮＡが、配列番号１７、１８、１９又は２０に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、第２ ｇＲＮＡが、配列番号１３、１４、１５又は１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコード化される、実施形態６、３７、３８又は３９に記載の方法。
以下の実施例は、実例として提供されるものであり、本発明を限定するものではない。
図１及び２で表す連続的な遺伝子ターゲッティング実験により、薬剤選択カセット内の標的配列を認識し切断するよう設計された、大型のＢＡＣベースのターゲッティングベクター（ＬＴＶＥＣ）とジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）との組み合わせの価値を示す。
連続的なターゲッティングの第一段階では（図１）、ヒトＴ細胞受容体α（ＴＣＲα）の１１個の可変的な（Ｖ）ドメインをコードする１３６ｋｂのＤＮＡを、対応するマウスＴＣＲα遺伝子座に挿入して、修飾型のＬＴＶＥＣ（ＴＣＲαＢ−ｈｙｇ対立遺伝子）を構築した。構築された０．０２ｍｇのＬＴＶＥＣを、事前にＴＣＲα遺伝子座に設置した、マウス可変（Ｖ）セグメント及び連結（Ｊ）遺伝子セグメントがヒトＶｓ及びＪｓに置換された修飾（ＴＣＲα Ａ−ｎｅｏ対立遺伝子）を有する１０００万個のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションした。増殖培養液中のエレクトロポレーションされたＥＳ細胞の回収後、ハイグロマイシンを添加し、ＬＴＶＥＣがゲノムに取り込まれた細胞に由来するコロニーを選択した。単離されたコロニーの対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）スクリーニングにより、スクリーニングされた１３６個のハイグロマイシン耐性コロニーのうち、４個の正しくターゲッティングされたクローンを同定した。すなわち２．９％のターゲッティング効率であった（表１、実験１）。正しくターゲッティングされたクローンは、更なる１１個のＶｓの挿入に加えて、ネオマイシン（Ｇ４１８）抵抗性カセット（ｎｅｏｒ）で置換されたハイグロマイシン抵抗性カセット（ｈｙｇｒ）を有した。
実験２は、ｎｅｏｒ遺伝子中の認識配列と結合し、ＤＮＡを二本鎖切断する２量体のＮｅｏ−ＺＦＮ（１，２）の単量体を各々発現する各０．０２ｍｇの２つのプラスミドを添加したことを除き、実験１と同様に実施した。Ｎｅｏ−ＺＦＮ（１，２）の添加により、スクリーニングされた５６８個のハイグロマイシン耐性クローンのうち、５５個の正しくターゲッティングされたクローンを得た。すなわち、９．７％のターゲッティング効率であり、ＬＴＶＥＣ単独でのエレクトロポレーションと比較して、３．３倍高いターゲッティング効率を表す（表１、実験１及び２の比較より）。
実験３は、Ｎｅｏ−ＺＦＮ（３，４）をコードするプラスミドを、Ｎｅｏ−ＺＦＮ（１，２）のそれに置換したことを除き、実験２と同様に実施した。Ｎｅｏ−ＺＦＮ（３，４）の添加により、スクリーニングされた３６０個のハイグロマイシン耐性クローンのうち、４２個の正しくターゲッティングされたクローンを得た。すなわち、１１．７％のターゲッティング効率であり、ＬＴＶＥＣ単独でのエレクトロポレーションと比較して、４倍高いターゲッティング効率を表す（表１、実験１及び３の比較より）。
連続的なターゲッティングにおける第２段階では（図２）、更なる１１個の、ＴＣＲα Ａ−ｎｅｏ又はＢ−ｈｙｇ対立遺伝子の場合と異なるヒトＴＣＲα可変（Ｖ）ドメインをコードする、１５７ｋｂのＤＮＡが挿入された修飾（ＴＣＲα Ｃ−ｎｅｏ対立遺伝子）を生じるよう設計された、ＬＴＶＥＣを０．００２ｍｇ用い、連続的なターゲッティングの第１段階（図１）で作製したＴＣＲα Ｂ−ｈｙｇ対立遺伝子を有する、１０００万個のマウス胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションし、ＥＳ細胞にＬＴＶＥＣを導入した。増殖培養液中のエレクトロポレーションされたＥＳ細胞の回収後、Ｇ４１８を添加し、ＬＴＶＥＣがゲノムに取り込まれた細胞に由来するコロニーを選択した。単離されたコロニーのＭＯＡスクリーニングにより、スクリーニングされた１９２個のＧ４１８耐性コロニーのうち、２個の正しくターゲッティングされたクローンを同定した。１．０％のターゲッティング効率であった（表１、実験４）。正しくターゲッティングされたクローンは、更なる１１個のＶｓの挿入に加えて、ｈｙｇｒカセットで置換されたｎｅｏｒカセットを有していた。
実験５は、ｈｙｇｒ中の認識配列と結合し、ＤＮＡを二本鎖切断する２量体のＨｙｇ−ＺＦＮ（１，２）の単量体を各々発現する各０．０２ｍｇの２つのプラスミドを添加したことを除き、実験４と同様に実施した。Ｈｙｇ−ＺＦＮ（１，２）の添加により、スクリーニングされた１９２個のＧ４１８耐性クローンのうち、４０個の正しくターゲッティングされたクローンを得た。すなわち、２１％のターゲッティング効率であり、ＬＴＶＥＣ単独でのエレクトロポレーションと比較して、２１倍高いターゲッティング効率を表す（表１、実験４及び５の比較より）。
実験６は、Ｈｙｇ−ＺＦＮ（３，４）をコードするプラスミドを、Ｈｙｇ−ＺＦＮ（１，２）で置換したことを除き、実験５と同様に実施した。Ｈｙｇ−ＺＦＮ（３，４）の添加により、スクリーニングされた１９２個のハイグロマイシン耐性クローンのうち、４２個の正しくターゲッティングされたクローンを得た。すなわち、２２％のターゲッティング効率であり、ＬＴＶＥＣ単独でのエレクトロポレーションと比較して、２２倍高いターゲッティング効率を表す（表１、実験４及び６の比較より）。
表１にまとめる実験結果から、連続的なターゲッティング実験における、ｎｅｏｒ又はｈｙｇｒ選択カセットを標的とするＺＦＮｓと組み合わせたＬＴＶＥＣｓの添加により、ＬＴＶＥＣのみを含むターゲッティング実験と比較し３〜２０倍ターゲッティング効率を強化できることが明らかとなった。連続的なターゲッティング実験において、ＺＦＮｓの添加によってなされたターゲッティング効率の強化は、事前に修飾された対立遺伝子の所望する染色体位置への、ヒトＤＮＡの非常に大きな断片（１３６ｋｂ及び１５７ｋｂ）の、意図する通りの正確な挿入を促進した。ＺＦＮにより強化されたターゲッティングは、ターゲッティングプロジェクトにおける成功確率を飛躍的に向上させ、ＥＳ細胞スクリーニングのための時間、労力及び材料費の顕著な節約をもたらす。
明細書に記載の全ての公報及び特許出願は、本発明が関連する当業者の技術水準を表す。全ての公報及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、参照により具体的かつ個別的に援用されているのと同程度に、参照により本発明に援用する。さもなければ、当該発明のあらゆる実施形態、態様、工程又は特徴は、他のものとの組み合わせで使用できる。範囲への言及には、当該範囲内のあらゆる整数、及び当該範囲内のあらゆる範囲部分をも含まれる。複数の範囲への言及には、かかる範囲の組み合わせも含まれる。
例えば、以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、
（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、
（ｂ）前記細胞に、
（ｉ）前記細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結された第１ヌクレアーゼ剤をコードする１つ以上の発現コンストラクトであって、前記第１ヌクレアーゼ剤が前記第１ポリヌクレオチド内の第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、１つ以上の発現コンストラクトと、
（ｉｉ）第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドを含む第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターであって、第１挿入核酸が、前記第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
（ｃ）前記第１標的遺伝子座に前記第１挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第２選択マーカーの活性を有するが、前記第１選択マーカーの活性を有さず、
前記第１及び前記第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
（項目２）
前記標的遺伝子座が、前記細胞のゲノム中に存在している、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記標的遺伝子座が、前記細胞内のベクターに位置している、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記同定する工程（ｃ）が、前記第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養することを含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記同定する工程（ｃ）が、前記第１及び前記第２標的部位に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、目的の第１ポリヌクレオチドを更に含む、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記第２選択マーカーをコードする前記第２ポリヌクレオチドが、前記細胞内で活性な第２プロモーターに作動可能に連結され、前記第２ポリヌクレオチドが、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記方法が、
（ａ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む前記細胞に、
（ｉ）第２ヌクレアーゼ剤であって、前記第２ポリヌクレオチド内の前記第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、第２ヌクレアーゼ剤と、
（ｉｉ）前記第２認識部位の充分近傍に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
（ｂ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を更に含む、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記同定する工程（ｂ）が、前記第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養することを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記第２選択可能マーカーを含む前記第２ポリヌクレオチドが、前記第３標的部位及び前記第４標的部位に隣接している、項目８又は９に記載の方法。
（項目１１）
前記同定する工程（ｂ）が、前記第３及び前記第４標的部位に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定することを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、
（ａ）目的の第２ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドと、を含み、
前記第３ポリヌクレオチドが、第３ヌクレアーゼ剤のための第３認識部位を含む、項目８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記第１ヌクレアーゼ剤が、前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、項目７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記第１選択マーカーが、前記第２選択マーカーと異なる、項目７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記第１及び前記第３ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第１及び前記第３ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記第１及び前記第３選択マーカーが、同一である、項目１２に記載の方法。
（項目１７）
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーのうちの１つが、抗生物質耐性を付与する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーのうちの１つが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対する毒性を示す、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記細胞が、原核細胞である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記細胞が、真核生物細胞である、項目１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記齧歯動物が、ラット又はマウスである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記細胞が、多能性細胞である、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記哺乳動物細胞が、ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
前記多能性細胞が、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
前記多能性細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞である、項目２７に記載の方法。
（項目３１）
前記多能性細胞が、造血幹細胞である、項目２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記多能性細胞が、神経幹細胞である、項目２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記哺乳動物細胞が、ヒト線維芽細胞である、項目２３に記載の方法。
（項目３４）
前記第１ヌクレアーゼ剤と前記第１ターゲッティングベクターとの併用により、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記第１ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記第２又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記核酸が、前記細胞内で活性な第４プロモーターに作動可能に連結されている、項目１２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３７）
前記第１又は前記第２ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３８）
前記第１又は前記第２ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記第１又は前記第２ヌクレアーゼ剤が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記第１又は前記第２ヌクレアーゼ剤が、メガヌクレアーゼである、項目１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記第１又は前記第２ヌクレアーゼ剤が、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４２）
前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、（ａ）前記第１、前記第２又は前記第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記第１又は前記第２認識部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記標的遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目４１、４２又は４３に記載の方法。
（項目４５）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、項目４１、４２、４３又は４４に記載の方法。
（項目４６）
前記ｇＲＮＡが、
（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は
（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む、項目４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記ｃｒＲＮＡが、配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含む、項目４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号７又は配列番号８を含む、項目４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記第１、前記第２及び／又は前記第３認識部位が、前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、請求１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
（項目５０）
前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１認識部位に直接隣接している、項目１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
（項目５１）
前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、項目８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５２）
前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２認識部位に直接隣接している、項目８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、項目８〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５４）
前記第１ホモロジーアームと前記第２ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、項目１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５５）
前記第３ホモロジーアームと前記第４ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、項目８〜５４のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、項目１〜５５のいずれか一項に記載の方法。
（項目５７）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、項目８〜５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目５８）
前記第１挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、項目１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目５９）
前記第２挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、項目８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
（項目６０）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求１〜５９のいずれか一項に記載の方法。
（項目６１）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目８〜６０のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目８〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４）
前記第１又は前記第２挿入ポリヌクレオチドが、前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目６２又は６３に記載の方法。
（項目６５）
前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記領域が、ヒト由来である、項目６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６６）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
（項目６７）
前記同定する工程が、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを経て実施される、項目１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
（項目６８）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同又はオルソロガスな前記核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目１〜６２のいずれか一項に記載の方法。
（項目６９）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同又はオルソロガスな前記核酸配列を含む、項目８〜６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目７０）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
（項目７１）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目８〜６７又は７０のいずれか一項に記載の方法。
一実施形態では、第１又は第２ヌクレアーゼ剤は、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。一実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、（ａ）第１、第２又は第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。一実施形態では、第１又は第２認識部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している。一実施形態では、目的のゲノム遺伝子座は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。一実施形態では、ｇＲＮＡは、（ａ）配列番号２の核酸配列のキメラＲＮＡ、又は（ｂ）配列番号３の核酸配列のキメラＲＮＡを含む。一実施形態では、ｃｒＲＮＡは、配列番号４、配列番号５又は配列番号６を含む。一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号７又は配列番号８を含む。一実施形態では、第１、第２及び／又は第３認識部位は、第１、第２又は第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している。一実施形態では、第１標的部位及び第２標的部位は、第１認識部位に直接隣接している。一実施形態では、第１標的部位及び第２標的部位は、第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第３標的部位及び第４標的部位は、第２認識部位に直接隣接している。一実施形態では、第３標的部位及び第４標的部位は、第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している。一実施形態では、第１ホモロジーアームと第２ホモロジーアームの合計は、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第３ホモロジーアームと第４ホモロジーアームの合計は、少なくとも約１０ｋｂである。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第１又は第２挿入ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又はＴ細胞受容体α遺伝子座の連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域は、ヒト由来である。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、同定する工程は、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイで実施される。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、細胞内のゲノムの核酸配列に相同又はオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、細胞内のゲノムの核酸配列に相同又はオルソロガスな核酸配列を含む。一実施形態では、第１挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、第２挿入ポリヌクレオチドは、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、
（ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、
（ｂ）前記細胞に、
（ｉ）前記第１ヌクレアーゼ剤であって、前記第１ポリヌクレオチド内の前記第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第１ヌクレアーゼ剤と、
（ｉｉ）第１ターゲッティングベクターであって、第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドを含む第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターであって、前記第１挿入ポリヌクレオチドが、前記第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
（ｃ）前記第１標的遺伝子座に前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第２選択マーカーの活性を有するが、前記第１選択マーカーの活性を有さず、
前記第１及び前記第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
（項目２）
前記標的遺伝子座が、
（ａ）前記細胞のゲノム中に存在しているか、又は
（ｂ）前記細胞内のベクターに位置している、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記同定する工程（ｃ）が、
（ａ）前記第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
（ｂ）前記第１及び第２標的部位に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定すること、を含む、項目１又は２に記載の方法。
（項目４）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、目的の第１ポリヌクレオチドを更に含む、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
前記第２ポリヌクレオチドが、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記方法が、
（ａ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む前記細胞に、
（ｉ）前記第２ヌクレアーゼ剤であって、前記第２ポリヌクレオチド内の前記第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第２ヌクレアーゼ剤と、
（ｉｉ）前記第２認識部位の充分近傍に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
（ｂ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を更に含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記同定する工程（ｂ）が、
（ａ）前記第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
（ｂ）前記第３及び第４標的部位に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定すること、を含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記第２選択マーカーを含む前記第２ポリヌクレオチドが、前記第３標的部位及び前記第４標的部位に隣接している、項目６又は７に記載の方法。
（項目９）
前記第２挿入ポリヌクレオチドが、
（ａ）目的の第２ポリヌクレオチドと、
（ｂ）前記細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドと、を含み、
前記第３ポリヌクレオチドが、第３ヌクレアーゼ剤のための第３認識部位を含む、項目６〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記第１ヌクレアーゼ剤が、前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、項目５〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記第１及び前記第３ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第１及び前記第３ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記第１及び前記第３選択マーカーが、同一である、項目９に記載の方法。
（項目１３）
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、抗生物質耐性を付与する、項目９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対する毒性を示す、項目９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記細胞が、原核細胞又は真核生物細胞である、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記哺乳動物細胞が、
（ａ）非ヒト哺乳動物細胞、
（ｂ）多能性細胞、
（ｃ）ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、
（ｄ）ヒト線維芽細胞、又は
（ｅ）齧歯動物細胞である、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
前記齧歯動物が、ラット又はマウスである、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記多能性細胞が、
（ａ）非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、
（ｂ）マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞、
（ｃ）造血幹細胞、又は
（ｄ）神経幹細胞である、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記第１ヌクレアーゼ剤と前記第１ターゲッティングベクターとの併用により、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、項目１に記載の方法。
（項目２３）
前記第１ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記第１、前記第２又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸配列が、前記細胞内で活性な第４プロモーターに作動可能に連結されている、項目９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記第１、前記第２又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、
（ａ）ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、
（ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
（ｃ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
（ｄ）メガヌクレアーゼ、又は
（ｅ）クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、項目９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９であり、前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、
（ａ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している前記第１、前記第２又は前記第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
（ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記標的遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ｇＲＮＡが、
（ａ）配列番号２若しくは配列番号３の核酸配列を有するキメラＲＮＡ、
（ｂ）配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６を含むｃｒＲＮＡ、又は
（ｃ）配列番号７若しくは配列番号８を含むｔｒａｃｒＲＮＡを含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
前記第１、前記第２及び／又は前記第３認識部位が、前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、項目９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１認識部位に直接隣接している、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
（ａ）前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置しているか、
（ｂ）前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２認識部位に直接隣接しているか、又は
（ｃ）前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、項目６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
（ａ）前記第１ホモロジーアームと前記第２ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂであり、かつ／又は
（ｂ）前記第３ホモロジーアームと前記第４ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、項目６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
（ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲であり、かつ／又は
（ｂ）前記第２挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、項目６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４）
（補正有）
（ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらし、かつ／又は
（ｂ）前記第２挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらす、項目６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
（ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、
（ｉ）ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含み、
かつ／又は
（ｂ）前記第２挿入ポリヌクレオチドが、
（ｉ）ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
（ｉｉ）Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
（項目３６）
前記第１又は前記第２挿入ポリヌクレオチドが、前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記領域が、ヒト由来である、項目３５又は３６に記載の方法。
（項目３８）
前記第１挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目３９）
前記同定する工程が、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを経て実施される、項目１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
（ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、
（ｉ）前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、
（ｉｉ）外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含むか、又は
（ｂ）第２挿入ポリヌクレオチドが、
（ｉ）前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列、又は
（ｉｉ）外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含む、項目６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の例には、ｇＲＮＡのＤＮＡターゲッティングセグメントと相補的なＤＮＡ配列、又はＰＡＭ配列が追加された当該ＤＮＡ配列が含まれる。例えば、標的モチーフは、Ｃａｓタンパク質によって認識されるＮＧＧのモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列であってもよい（例えば国際公開第２０１４／１６５８２５号を参照）。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ認識配列の他の例としては、５’末端に２つのグアニンヌクレオチドを含むものが挙げられ（例えばＧＧＮ２０ＮＧＧ、配列番号２１）、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ７ポリメラーゼによる効果的な転写を促進することができる。例えば国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照。
具体的実施形態では、ｇＲＮＡは、第２選択マーカー（例えばＮｅｏｒ）をコードする第１挿入核酸の挿入のために、第１抗生物質選択マーカー（例えばＨｙｇｒ）を標的とするよう設計され、それにより、第１挿入核酸の挿入により、第１抗生物質選択マーカーの活性が損なわれる。第２ ｇＲＮＡ発現プラスミドは、第１選択マーカーをコードする第２挿入核酸の挿入のために、第２選択マーカーを標的とするｇＲＮＡを発現するよう設計されてもよく、それにより、第２挿入核酸の挿入により、第２抗生物質選択マーカーの活性が損なわれる。このように、ｇＲＮＡは、核酸挿入物の交替で使用できる２つの抗生物質選択マーカーの各々を標的とする設計であればよい。Ｎｅｏ耐性選択マーカーに特異的なｇＲＮＡをコードする核酸の例としては、配列番号１３、１４、１５及び１６に記載のものが挙げられる。Ｈｙｇ耐性選択マーカーに特異的なｇＲＮＡをコードする核酸の例としては、配列番号１７、１８、１９及び２０に記載のものが挙げられる。

Claims (40)

  1. 細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、
    （ａ）第１プロモーターに作動可能に連結された第１選択マーカーをコードする第１ポリヌクレオチドを含む第１標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記第１ポリヌクレオチドが、第１ヌクレアーゼ剤のための第１認識部位を更に含む、工程と、
    （ｂ）前記細胞に、
    （ｉ）前記第１ヌクレアーゼ剤であって、前記第１ポリヌクレオチド内の前記第１認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第１選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第１ヌクレアーゼ剤と、
    （ｉｉ）第１ターゲッティングベクターであって、第２プロモーターに作動可能に連結された第２選択マーカーをコードする第２ポリヌクレオチドを含む第１挿入ポリヌクレオチドを含む第１ターゲッティングベクターであって、前記第１挿入ポリヌクレオチドが、前記第１標的遺伝子座に位置する第１及び第２標的部位に対応する第１及び第２ホモロジーアームに隣接している、第１ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
    （ｃ）前記第１標的遺伝子座に前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第２選択マーカーの活性を有するが、前記第１選択マーカーの活性を有さず、
    前記第１及び前記第２選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
  2. 前記標的遺伝子座が、
    （ａ）前記細胞のゲノム中に存在しているか、又は
    （ｂ）前記細胞内のベクターに位置している、請求項１に記載の方法。
  3. 前記同定する工程（ｃ）が、
    （ａ）前記第１選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
    （ｂ）前記第１及び第２標的部位に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定すること、を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記第１挿入ポリヌクレオチドが、目的の第１ポリヌクレオチドを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第２ポリヌクレオチドが、第２ヌクレアーゼ剤のための第２認識部位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記方法が、
    （ａ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第１挿入ポリヌクレオチドを含む前記細胞に、
    （ｉ）前記第２ヌクレアーゼ剤であって、前記第２ポリヌクレオチド内の前記第２認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第２選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第２ヌクレアーゼ剤と、
    （ｉｉ）前記第２認識部位の充分近傍に位置する第３及び第４標的部位に対応する第３及び第４ホモロジーアームに隣接する第２挿入ポリヌクレオチドを含む第２ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
    （ｂ）前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定する工程と、を更に含む、請求項５に記載の方法。
  7. 前記同定する工程（ｂ）が、
    （ａ）前記第２選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
    （ｂ）前記第３及び第４標的部位に組み込まれた前記第２挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの細胞を同定すること、を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記第２選択マーカーを含む前記第２ポリヌクレオチドが、前記第３標的部位及び前記第４標的部位に隣接している、請求項６又は７に記載の方法。
  9. 前記第２挿入ポリヌクレオチドが、
    （ａ）目的の第２ポリヌクレオチドと、
    （ｂ）前記細胞内で活性な第３プロモーターに作動可能に連結された第３選択マーカーをコードする第３ポリヌクレオチドと、を含み、
    前記第３ポリヌクレオチドが、第３ヌクレアーゼ剤のための第３認識部位を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記第１ヌクレアーゼ剤が、前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、請求項５〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記第１及び前記第３ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第１及び前記第３ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第２ヌクレアーゼ剤と異なる、請求項９に記載の方法。
  12. 前記第１及び前記第３選択マーカーが、同一である、請求項９に記載の方法。
  13. 前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、抗生物質耐性を付与する、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記抗生物質が、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対する毒性を示す、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  16. 前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を含む、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記細胞が、原核細胞又は真核生物細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記哺乳動物細胞が、
    （ａ）非ヒト哺乳動物細胞、
    （ｂ）多能性細胞、
    （ｃ）ヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、
    （ｄ）ヒト線維芽細胞、又は
    （ｅ）齧歯動物細胞である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記齧歯動物が、ラット又はマウスである、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記多能性細胞が、
    （ａ）非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞、
    （ｂ）マウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラット胚性幹（ＥＳ）細胞、
    （ｃ）造血幹細胞、又は
    （ｄ）神経幹細胞である、請求項１９に記載の方法。
  22. 前記第１ヌクレアーゼ剤と前記第１ターゲッティングベクターとの併用により、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、請求項１に記載の方法。
  23. 前記第１ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第１ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも２倍向上している、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記第１、前記第２又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸配列が、前記細胞内で活性な第４プロモーターに作動可能に連結されている、請求項９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記第１、前記第２又は前記第３ヌクレアーゼ剤が、
    （ａ）ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、
    （ｂ）ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、
    （ｃ）転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、
    （ｄ）メガヌクレアーゼ、又は
    （ｅ）クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）−関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である、請求項９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９であり、前記ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、
    （ａ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に直接隣接している前記第１、前記第２又は前記第３認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、
    （ｂ）トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と、を含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記標的遺伝子座が、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ｇＲＮＡが、
    （ａ）配列番号２若しくは配列番号３の核酸配列を有するキメラＲＮＡ、
    （ｂ）配列番号４、配列番号５若しくは配列番号６を含むｃｒＲＮＡ、又は
    （ｃ）配列番号７若しくは配列番号８を含むｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２６に記載の方法。
  29. 前記第１、前記第２及び／又は前記第３認識部位が、前記第１、前記第２又は前記第３選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、請求項９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１認識部位に直接隣接している、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. （ａ）前記第１標的部位及び前記第２標的部位が、前記第１認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置しているか、
    （ｂ）前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２認識部位に直接隣接しているか、又は
    （ｃ）前記第３標的部位及び前記第４標的部位が、前記第２認識部位から約１０ヌクレオチド〜約１４ｋｂに位置している、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  32. （ａ）前記第１ホモロジーアームと前記第２ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂであり、かつ／又は
    （ｂ）前記第３ホモロジーアームと前記第４ホモロジーアームの合計が、少なくとも約１０ｋｂである、請求項６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. （ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲であり、かつ／又は
    （ｂ）前記第２挿入ポリヌクレオチドが、約５ｋｂ〜約３００ｋｂの長さの範囲である、請求項６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. （補正有）
    （ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらし、かつ／又は
    （ｂ）前記第２挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらす、請求項６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. （ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
    （ｉｉ）Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含み、
    かつ／又は
    （ｂ）前記第２挿入ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
    （ｉｉ）Ｔ細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求項６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記第１又は前記第２挿入ポリヌクレオチドが、前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の少なくとも１つの可変領域遺伝子セグメント及び／又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記Ｔ細胞受容体α遺伝子座の前記領域が、ヒト由来である、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 前記第１挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記同定する工程が、対立遺伝子の修飾（ＭＯＡ）アッセイを経て実施される、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. （ａ）前記第１挿入ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、
    （ｉｉ）外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含むか、又は
    （ｂ）第２挿入ポリヌクレオチドが、
    （ｉ）前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列、又は
    （ｉｉ）外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含む、請求項６〜３５のいずれか一項に記載の方法。
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