JP2017520243A - 標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2014年6月6日に出願の米国仮特許出願第62/008832号、及び2014年6月27日に出願の米国仮特許出願第62/017916号の優先権を主張するものであり、これらの全開示内容を参照により本発明に援用する。
本発明の方法及び組成物は、分子生物学の分野に関する。具体的には、細胞内の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。
配列表の公式なコピーは、ASCIIフォーマットの配列表(2015年6月5日作成、5KBのサイズ、461003SEQLIST.TXTというファイル名)として、EFS−ウェブで電子的に提出し、また本願明細書と共に提出する。このASCIIフォーマットの文書に含まれる配列表は本願明細書の一部をなし、その全開示内容を参照により本発明に援用する。
(b)細胞に、(i)第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第1ヌクレアーゼ剤と、(ii)第1認識部位の充分近傍に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接する第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(c)標的遺伝子座に組み込まれた第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を含む。一実施形態では、標的遺伝子座は、細胞のゲノム中に存在している。他の実施形態では、標的遺伝子座は、細胞内のベクターに位置している。一実施形態では、第1認識部位のニック又は二本鎖切断は、第1選択マーカーの活性を損なわせる。更なる実施形態では、同定する工程(c)は、第1選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。一実施形態では、第1選択マーカーを含む第1ポリヌクレオチドは、第1標的部位と第2標的部位に隣接している。一実施形態では、同定する工程(c)は、第1及び第2標的部位に組み込まれた第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定することを含む。一実施形態では、第1挿入ポリヌクレオチドは、(a)目的の第1ポリヌクレオチドと、(b)細胞内で活性な第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2ポリヌクレオチドであって、第2ヌクレアーゼ剤のための第2認識部位を含む、第2ポリヌクレオチドと、を含む。
本発明は、細胞内の標的遺伝子座(例えば、ゲノム遺伝子座)を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。本方法及び組成物は、ヌクレアーゼ剤及びヌクレアーゼ剤認識部位を用いることにより、標的遺伝子座への挿入ポリヌクレオチドの相同組換えイベントを促進する。本明細書で提供される様々な方法及び組成物は、ヌクレアーゼ剤認識部位を、選択マーカー、リポーター又は外来のタンパク質(例えば、eGFP又はマウス細胞内のヒト配列)をコードするポリヌクレオチド内に戦略的に位置させる。
本発明は、細胞内の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。システムは、ヌクレアーゼ剤、ヌクレアーゼ剤のための認識部位、標的遺伝子座、選択マーカー、ターゲッティングベクター及び挿入ポリヌクレオチドを用いる。これらの構成要素の各々を以下に詳述する。
用語「ヌクレアーゼ剤のための認識部位」には、ニック又は二本鎖切断がヌクレアーゼ剤によって誘導されるDNA配列が含まれる。ヌクレアーゼ剤のための認識部位は、細胞に内在(又は生来)のものであってもよく、又は当該認識部位は細胞に対して外来のものであってもよい。具体的実施形態では、認識部位は、細胞に対して外来のものであり、ゆえに、細胞のゲノム内で天然に生じない。なお更なる実施形態では、認識部位は、細胞に対して、及び、標的遺伝子座に挿入しようとする目的のポリヌクレオチドに対して外来のものである。更なる実施形態では、外来若しくは内在の認識部位は、宿主細胞のゲノム内に1つだけ存在している。具体的実施形態では、ゲノム内に1つだけ存在する内在若しくは生来の部位が同定される。かかる部位は次に、内在の認識部位でニック又は二本鎖切断を行うヌクレアーゼ剤を設計するのに使用できる。
Casタンパク質は通常、少なくとも1つのRNA認識又は結合ドメインを含む。かかるドメインは、ガイドRNA(gRNA、下記で詳述する)と相互作用できる。Casタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン(例えば、DNase又はRNaseドメイン)、DNA結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質−タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン及び他のドメインを含むこともできる。ヌクレアーゼドメインは、核酸を切断する触媒活性を有する。切断には、核酸分子の共有結合の切断が含まれる。切断により、平滑末端又は粘着末端が生じ、それらは一本鎖又は二本鎖である。
「ガイドRNA」又は「gRNA」には、Casタンパク質と結合して、標的DNA内の特定の位置にCasタンパク質をターゲッティングするRNA分子が含まれる。ガイドRNAは、「DNA−ターゲッティングセグメント」と「タンパク質結合セグメント」の2つのセグメントを含みうる。「セグメント」には、分子のセグメント、セクション又は領域(例えばRNA内のヌクレオチドの連続したストレッチ)が含まれる。幾つかのgRNAは、「アクチベーターRNA」と「ターゲッターRNA」の2つの別々のRNA分子を含む。他のgRNAとしては、単一RNA分子(単一のRNAポリヌクレオチド)であり、それは「単分子gRNA」、「単一ガイドRNA」又は「sgRNA」とも称される。国際公開第2013/176772A1号、同第2014/065596A1号、同第2014/089290A1号、同第2014/093622A2号、同第2014/099750A2号、同第2013142578A1号、及び同第2014/131833A1号を参照(各内容を参照により本発明に援用する)。用語「ガイドRNA」及び「gRNA」には、二分子gRNAと一分子gRNAが含まれる。
「CRISPR RNA認識配列」という用語には、結合のための十分な条件の存在下で、gRNAのDNAターゲッティングセグメントが結合する、標的DNA内に存在する核酸配列が含まれる。例えば、CRISPR RNA認識配列は、ガイドRNAが相補性を有するよう設計される配列を含み、その際、CRISPR RNA認識配列とDNAターゲッティング配列との間のハイブリダイゼーションがCRISPR複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを生じさせ、CRISPR複合体の形成を促進するのに充分な相補性が存在する場合には、完全な相補性が必ずしも必要とされるというわけではない。CRISPR RNA認識配列はまた、以下に詳述するように、Casタンパク質のための切断部位を含む。CRISPR RNA認識配列は、いかなるポリヌクレオチドを含んでもよく、例えば、細胞の核若しくは原形質内に、又は細胞のオルガネラ内(例えばミトコンドリア又は葉緑体)に位置してもよい。
本明細書で提供される様々な方法及び組成物では、選択マーカーとの組み合わせにおいて、ヌクレアーゼ剤及びその対応する認識部位を使用する。本明細書に記載のように、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内への認識部位の配置により、標的遺伝子座での組み込みイベントの効率的な確認方法が提供されうる。更に、本明細書に記載の様々な方法では、ヌクレアーゼ認識部位を有する交替される選択マーカーが、導入効率及び効果の改善のために使用され、それにより、目的の複数のポリヌクレオチドが、所与の標的遺伝子座内に組み込まれる。
本発明では、標的遺伝子座への少なくとも1つの挿入ポリヌクレオチドの組み込みを可能にする、様々な方法及び組成物が提供される。用語「標的遺伝子座」には、挿入ポリヌクレオチドを組み込もうとするDNAのいかなるセグメント又は領域も含まれる。一実施形態では、標的遺伝子座は、ゲノム遺伝子座である。標的遺伝子座は、細胞の生来のものであってもよく、あるいは異種又は外来のDNAセグメントを含んでもよい。かかる異種又は外来のDNAセグメントは、トランスジーン、発現カセット、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、又は異種若しくは外来のDNA領域(すなわちゲノムDNAの異種若しくは外来の領域)を含んでもよい。例えば、標的遺伝子座は、認識部位、選択マーカー、以前に組み込まれた挿入ポリヌクレオチド、ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチド、プロモーター等、標的導入システムのいずれを含んでもよい。あるいは、標的遺伝子座は、酵母人工染色体(YAC)、大腸菌人工染色体(BAC)、ヒト人工染色体内、又は、適当な宿主細胞に含まれる他の任意の操作されたゲノム領域に位置させることができる。ゆえに、特定の実施形態では、標的遺伝子座は、生来の、異種の又は外来のゲノム核酸配列を含んでもよく、その由来としては、原核生物、真核細胞、酵母、細菌、非ヒト哺乳動物、非ヒト細胞、齧歯動物、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類(例えばマーモセット、アカゲザル)、家畜化された哺乳動物若しくは農業用の哺乳動物、又は他のいかなる目的生物、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
上記で概説したように、本明細書で提供される方法及び組成物は、ヌクレアーゼ剤と、選択カセット内のヌクレアーゼ剤の認識部位との戦略的なポジショニングを、相同組換えイベントとの組み合わせにおいて利用する。かかる方法は、相同組換えとの組み合わせにおいて認識部位でのニック又は二本鎖切断を用い、それにより、挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みを標的とする。「相同組換え」は従来、相同領域中の交差部位における、2つのDNA分子の間でのDNA断片の交換を行う際に用いられる。
用語「挿入ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子座に組み込まれることが所望されるDNAのセグメントを含む。一実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、1つ以上の目的のポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、挿入ポリヌクレオチドは、1つ以上の発現カセットを含んでもよい。所与の発現カセットは、発現に影響する様々な調節因子に加えて、目的のポリヌクレオチド、並びに選択マーカー及び/又はリポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含んでもよい。挿入ポリヌクレオチド内に含めることができる、目的のポリヌクレオチド、選択マーカー及びリポーター遺伝子(例えばeGFP)の非限定的な例は、本明細書で詳述する。
ターゲッティングベクターは、標的遺伝子座に挿入ポリヌクレオチドを導入するために使用される。ターゲッティングベクターは、挿入ポリヌクレオチドと、挿入ポリヌクレオチドに隣接する、上流及び下流側のホモロジーアームを更に含む。挿入ポリヌクレオチドに隣接するホモロジーアームは、標的遺伝子座内の領域に対応する。説明の便宜のため、標的遺伝子座内の対応する領域を本発明では「標的部位」と称する。すなわち、一例では、ターゲッティングベクターは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内の第1認識部位の充分近傍に位置する第1及び第2標的に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接する第1挿入ポリヌクレオチドを含んでもよい。したがって、ターゲッティングベクターは、細胞のゲノム内のホモロジーアームと対応する標的部位との間で生じる相同組換えイベントを通じて、挿入ポリヌクレオチドの標的遺伝子座への組み込みを促進する。
用語「大型ターゲッティングベクター」又は「LTVEC」には、細胞内での相同組換えを実施しようとする他のアプローチにおいて典型的に用いられるものよりも大きな核酸配列に対応及び由来するホモロジーアーム、並びに/又は細胞内での相同組換えを実施しようとする他のアプローチにおいて典型的に用いられるものよりも大きな核酸配列を含む挿入ポリヌクレオチド、を含む、大型ターゲッティングベクターが含まれる。具体的実施形態では、LTVECのホモロジーアーム及び/又は挿入ポリヌクレオチドは、真核生物細胞のゲノム配列を含む。LTVECのサイズは、従来のアッセイ(例えばサザンブロッティング及びロングレンジ(例えば1kb〜5kb)PCR)によるターゲッティングイベントのスクリーニングを行うにはあまりに大きい。LTVECの例としては、限定されないが、大腸菌人工染色体(BAC)、ヒト人工染色体又は酵母人工染色体(YAC)に由来するベクターが挙げられる。LTVECの非限定的な例及びそれらの作製方法は、例えば、米国特許第6,586,251号、同第6,596,541号、同第7,105,348号及び国際公開第2002/036789号(PCT/US01/45375)に記載されている(各内容を参照により本発明に援用する)。
A.相同組換えによる認識部位付近への挿入ポリヌクレオチドの組み込み方法
本発明では、細胞内の標的遺伝子座の修飾方法が提供される。当該方法は、(a)細胞内で活性な第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程であって、第1ポリヌクレオチドが第1ヌクレアーゼ剤のための第1認識部位を更に含む、工程と、(b)細胞に、(i)第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第1ヌクレアーゼ剤と、(ii)第1認識部位の十分近傍に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接する第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(c)標的遺伝子座に組み込まれた第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を含む。具体的実施形態では、第1選択マーカーを含む第1ポリヌクレオチドは、第1標的部位及び第2標的部位に隣接し、第1標的部位は、第1ターゲッティングベクターの第1ホモロジーアームに対応し、第2標的部位は、第1ターゲッティングベクターの第2ホモロジーアームに対応する。
本明細書で提供される様々な方法及び組成物は、所与の標的遺伝子座への複数の目的のポリヌクレオチドの標的組み込みを可能にする。当該方法は、本明細書に記載の標的組み込みシステムを使用するものであり、それは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド内にヌクレアーゼ剤認識部位を戦略的に配置することを採用する。具体的実施形態では、選択マーカー及び認識部位は、各挿入ポリヌクレオチド内で交替されている。その際、所与の標的遺伝子座内の連続的な挿入ポリヌクレオチドのタイリングが、高い効率及び有効性で生じる。
本発明は、本明細書に記載のCRISPR/Casシステムを利用した、細胞内の1つ以上の目的の標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物の提供に関する。CRISPR/Casシステムについて、用語「標的部位」又は「標的配列」は交換可能に用いられ、ガイドRNA(gRNA)のDNAターゲッティングセグメントが、結合のための十分な条件が提供された場合に結合する、標的DNA内に存在する核酸配列を含むものとする。例えば、標的DNA内の標的部位(又は標的配列)は、Casヌクレアーゼ又はgRNAによって標的とされる(又は結合され、又はハイブリダイズされ、又は相補的である)。適切なDNA/RNA結合条件としては、細胞内に通常存在する生理的条件が挙げられる。他の適切なDNA/RNA結合条件(例えば無細胞系の条件)は、当分野で公知である(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrookら、Harbor Laboratory Press 2001)を参照)。Casタンパク質又はgRNAと相補的であり、ハイブリダイズする標的DNAの鎖は、「相補鎖」と称され、「相補鎖」と相補的である標的DNAの鎖(したがって、Casタンパク質又はgRNAと相補的でない)は「非相補鎖」又は「鋳型鎖」と称される。
様々な挿入ポリヌクレオチドにいかなる目的のポリヌクレオチドを含め、それにより標的遺伝子座に組み込むことができる。本明細書に開示される方法により、少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれ以上の目的のポリヌクレオチドが標的遺伝子座に組み込まれる。
上記で概説したように、本発明では、1つ以上の目的のポリヌクレオチドの標的組み込みを可能にする方法及び組成物が提供される。かかるシステムは、様々な要素を使用し、説明の便宜のため、本発明における用語「標的組み込みシステム」は、広義に、導入イベントに必要とされる全ての成分(様々なヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入DNAポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、標的遺伝子座、及び目的のポリヌクレオチド)のことを指すものとする。
本明細書に記載の様々な方法では、細胞内における遺伝子座ターゲッティングシステムを用いる。かかる細胞としては、原核細胞(例えば大腸菌などの細菌細胞)、又は真核生物細胞(例えば酵母、昆虫、両生類、鳥(例えばニワトリ細胞)、植物)、又は、限定されないが、マウス細胞、ラット細胞、ウサギ細胞、ブタ細胞、ウシ細胞、シカ細胞、ヒツジ細胞、ヤギ細胞、ネコ細胞、イヌ細胞、フェレット細胞、霊長類(例えばマーモセット、アカゲザル)細胞など、並びに、家畜用哺乳動物由来の細胞若しくは農業用哺乳動物由来の細胞などの、哺乳動物細胞が挙げられる。幾つかの細胞は、非ヒト細胞、具体的には非ヒト哺乳動物細胞である。幾つかの実施形態では、適切な遺伝的に修飾可能な多能性細胞が容易に得られない哺乳動物の場合、他の方法として、体細胞を用いて、例えば、限定されないが、Oct3/4、Sox2、KLF4、Myc、Nanog、LIN28及びGlis1などの多能性誘導因子の組み合わせを体細胞へ導入することにより、多能性細胞に再プログラムする方法が存在する。
本発明では、本明細書で提供される標的組み込みシステムの様々な要素(すなわちヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ポリヌクレオチド、目的のポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、選択マーカー及び他の要素)を含むポリヌクレオチド又は核酸分子が提供される。
本明細書で提供される方法及び組成物では、標的組み込みシステムの様々な要素(すなわちヌクレアーゼ剤、認識部位、挿入ポリヌクレオチド、目的のポリヌクレオチド、ターゲッティングベクター、選択マーカー及び他の要素)を使用する。明細書の全体から、標的組み込みシステムの幾つかの要素は、活性型の変異体及び断片を有してもよいことが理解される。かかる要素としては、例えば、ヌクレアーゼ剤(すなわち操作されたヌクレアーゼ剤)、ヌクレアーゼ剤認識部位、目的のポリヌクレオチド、標的部位及びターゲッティングベクターの対応するホモロジーアームが例示される。これらの要素の生物学的活性については、他で述べる通りである。
1.細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、(a)細胞内で活性な第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドを含む標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第1ポリヌクレオチドが、第1ヌクレアーゼ剤のための第1認識部位を更に含む、工程と、(b)細胞に、(i)第1ヌクレアーゼ剤であって、第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する、第1ヌクレアーゼ剤と、(ii)第1認識部位の充分近傍に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接する第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(c)標的遺伝子座に組み込まれた第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を含む。
2.細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、(a)第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドを含む第1標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、第1ポリヌクレオチドが、第1ヌクレアーゼ剤のための第1認識部位を更に含む、工程と、(b)細胞に、(i)細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結された第1ヌクレアーゼ剤をコードする1つ以上の発現コンストラクトであって、第1ヌクレアーゼ剤が第1ポリヌクレオチド内の第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第1選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、1つ以上の発現コンストラクトと、(ii)第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2ポリヌクレオチドを含む第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターであって、第1挿入核酸が、第1標的遺伝子座に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接している、第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(c)第1標的遺伝子座に第1挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞は、第2選択マーカーの活性を有するが、第1選択マーカーの活性を有さず、第1及び第2選択マーカーが異なる、工程と、を含む。
3.標的遺伝子座が、細胞のゲノム中に存在している、実施形態1又は2に記載の方法。
4.標的遺伝子座が、細胞内のベクターに位置している、実施形態1又は2に記載の方法。
5.第1認識部位のニック又は二本鎖の切断が、第1選択マーカーの活性を損なわせる、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法。
6.同定する工程が、第1選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態1、2、3、4又は5に記載の方法。
7.第1選択マーカーを含む第1ポリヌクレオチドが、第1標的部位及び第2標的部位に隣接している、実施形態1〜6のいずれか1つに記載の方法。
8.同定する工程が、第1及び第2標的部位に組み込まれた第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定することを含む、実施形態7に記載の方法。
9.第1挿入ポリヌクレオチドが、(a)目的の第1ポリヌクレオチドと、(b)細胞内で活性な第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2ポリヌクレオチドであって、第2ヌクレアーゼ剤のための第2認識部位を含む、第2ポリヌクレオチドと、を含む、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の方法。
10.(a)標的遺伝子座に組み込まれた第1挿入ポリヌクレオチドを含む細胞に、(i)第2認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導する第2ヌクレアーゼ剤と、(ii)第2認識部位の充分近傍に位置する第3及び第4標的部位に対応する第3及び第4ホモロジーアームに隣接する、第2挿入ポリヌクレオチドを含むターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(b)標的遺伝子座に組み込まれた第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を更に含む、実施形態9に記載の方法。
11.第2認識部位におけるニック又は二本鎖切断が、第2選択マーカーの活性を損なわせる、実施形態10に記載の方法。
12.同定する工程が、第2選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態11に記載の方法。
13.第2選択マーカーを含む第2ポリヌクレオチドが、第3標的部位及び第4標的部位に隣接している、実施形態10、11又は12に記載の方法。
14.前記同定する工程が、第3及び第4標的部位に組み込まれた第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定することを含む、実施形態13に記載の方法。
15.第2挿入ポリヌクレオチドが、(a)目的の第2ポリヌクレオチドと、(b)細胞内で活性な第3プロモーターに作動可能に連結された第3選択マーカーをコードする第3ポリヌクレオチドと、を含み、第3ポリヌクレオチドは、第3ヌクレアーゼ剤のための第3認識部位を含む、実施形態10〜14のいずれか1つに記載の方法。
16.第1ヌクレアーゼ剤が、第2ヌクレアーゼ剤と異なる、実施形態9〜15のいずれか1つに記載の方法。
17.第1選択マーカーが、第2選択マーカーと異なる、実施形態9〜16のいずれか1つに記載の方法。
18.第1及び第3ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ第2ヌクレアーゼ認識部位と異なり、第1及び第3ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ第2ヌクレアーゼ剤と異なる、実施形態15に記載の方法。
19.第1及び第3選択マーカーが、同一である、実施形態15に記載の方法。
20.第1、第2又は第3選択マーカーのうちの1つが、抗生物質耐性を付与する、実施形態1〜19のいずれか1つに記載の方法。
21.抗生物質が、G418、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、実施形態20に記載の方法。
22.第1、第2又は第3選択マーカーのうちの1つが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、選択マーカーの発現が、細胞に対する毒性を示す、実施形態1〜19のいずれか1つに記載の方法。
23.第1、第2又は第3選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV−TK)を含む、実施形態22に記載の方法。
24.細胞が、原核細胞である、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の方法。
25.細胞が、真核生物細胞である、実施形態1〜23のいずれか1つに記載の方法。
26.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態25に記載の方法。
27.哺乳動物細胞が、非ヒト細胞である、実施形態26に記載の方法。
28.哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、実施形態27に記載の方法。
29.齧歯動物が、ラット又はマウスである、実施形態28に記載の方法。
30.細胞が、多能性細胞である、実施形態26〜29のいずれか1つに記載の方法。
31.哺乳動物細胞が、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、実施形態26に記載の方法。
32.多能性細胞が、非ヒト胚性幹(ES)細胞である、実施形態30に記載の方法。
33.多能性細胞が、マウス胚性幹(ES)細胞又はラット胚性幹(ES)細胞である、実施形態30に記載の方法。
34.多能性細胞が、造血幹細胞である、実施形態30〜33のいずれか1つに記載の方法。
35.多能性細胞が、神経幹細胞である、実施形態30〜33のいずれか1つに記載の方法。
36.哺乳動物細胞が、ヒト線維芽細胞である、実施形態26に記載の方法。
37.第1ヌクレアーゼ剤と第1ターゲッティングベクターとの併用により、第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、実施形態1又は2に記載の方法。
38.第1ターゲッティングベクターのターゲッティング効率が、第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも2倍向上している、実施形態37に記載の方法。
39.第1又は第2ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、核酸が、細胞内で活性な第4プロモーターに作動可能に連結されている、実施形態1〜38のいずれか1つに記載の方法。
40.第1又は第2ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の方法。
41.第1又は第2ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)である、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の方法。
42.第1又は第2ヌクレアーゼ剤が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の方法。
43.第1又は第2ヌクレアーゼ剤が、メガヌクレアーゼである、実施形態1〜39のいずれか1つに記載の方法。
44.第1又は第2ヌクレアーゼ剤が、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)−関連(Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)を含む、実施形態1〜43のいずれか1つに記載の方法。
45.ガイドRNA(gRNA)が、(a)第1、第2又は第3認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)RNA(crRNA)と、(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)を含む、実施形態44に記載の方法。
46.第1又は第2認識部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に直接隣接している、実施形態45に記載の方法。
47.目的のゲノム遺伝子座が、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、実施形態44、45又は46に記載の方法。
48.Casタンパク質が、Cas9である、実施形態44、45、46又は47に記載の方法。
49.gRNAが、(a)配列番号2の核酸配列のキメラRNA、又は(b)配列番号3の核酸配列のキメラRNAを含む、実施形態44〜46のいずれか1つに記載の方法。
50.crRNAが、配列番号4、配列番号5又は配列番号6を含む、実施形態44〜46のいずれか1つに記載の方法。
51.tracrRNAが、配列番号7又は配列番号8を含む、実施形態44〜46のいずれか1つに記載の方法。
52.第1、第2及び/又は第3認識部位が、第1、第2又は第3選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、実施形態1〜51のいずれか1つに記載の方法。
53.第1標的部位及び第2標的部位が、第1認識部位に直接隣接している、実施形態1〜52のいずれか1つに記載の方法。
54.第1標的部位及び第2標的部位が、第1認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、実施形態10〜19のいずれか1つに記載の方法。
55.第3標的部位及び第4標的部位が、第2認識部位に直接隣接している、実施形態10〜19のいずれか1つに記載の方法。
56.第3標的部位及び第4標的部位が、第2認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、実施形態10〜19のいずれか1つに記載の方法。
57.第1ホモロジーアームと第2ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbである、実施形態1〜56のいずれか1つに記載の方法。
58.第3ホモロジーアームと第4ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbである、実施形態10〜57のいずれか1つに記載の方法。
59.第1挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲である、実施形態1〜58のいずれか1つに記載の方法。
60.第2挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲である、実施形態10〜59のいずれか1つに記載の方法。
61.第1挿入ポリヌクレオチドの遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、実施形態1〜60のいずれか1つに記載の方法。
62.第1挿入ポリヌクレオチドの遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、実施形態10〜61のいずれか1つに記載の方法。
63.第1挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜62のいずれか1つに記載の方法。
64.第2挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態8〜63のいずれか1つに記載の方法。
65.第1挿入ポリヌクレオチドが、T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜64のいずれか1つに記載の方法。
66.第2挿入ポリヌクレオチドが、T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態8〜65のいずれか1つに記載の方法。
67.第1又は第2挿入ポリヌクレオチドが、T細胞受容体α遺伝子座の少なくとも1つの可変領域遺伝子セグメント及び/又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態65又は66に記載の方法。
68.T細胞受容体α遺伝子座の領域が、ヒト由来である、実施形態65〜67のいずれか1つに記載の方法。
69.第1挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜64のいずれか1つに記載の方法。
70.同定する工程が、対立遺伝子の修飾(MOA)アッセイを経て実施される、実施形態1〜69のいずれか1つに記載の方法。
71.第1挿入ポリヌクレオチドが、細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜65のいずれか1つに記載の方法。
72.第2挿入ポリヌクレオチドが、細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む、実施形態10〜71のいずれか1つに記載の方法。
73.第1挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜70のいずれか1つに記載の方法。
74.第2挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、実施形態10〜70又は73のいずれか1つに記載の方法。
1.細胞内の目的の標的遺伝子座の修飾方法であって、(a)第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする核酸を含む第1標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程と、(b)細胞に、(i)Casタンパク質と第1ガイドRNA(gRNA)をコードする1つ以上の発現コンストラクトであって、各々が、細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され、Casタンパク質が第1核酸中の第1 gRNA標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第1選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、1つ以上の発現コンストラクトと、(ii)第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2核酸を含む第1挿入核酸を含む第1ターゲッティングベクターであって、第1挿入核酸が、第1標的遺伝子座に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接している、第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(c)第1標的遺伝子座に第1挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、修飾された細胞は、第2選択マーカーの活性を有するが、第1選択マーカーの活性を有さず、第1及び第2選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
2.第1 gRNAが、第1挿入核酸とハイブリダイズしない、実施形態1に記載の方法。
3.目的の標的遺伝子座が、細胞のゲノム中に位置している、実施形態1に記載の方法。
4.目的の標的遺伝子座が、細胞内のベクターに位置している、実施形態1に記載の方法。
5.同定する工程(c)が、第2選択マーカーの活性を有するが、第1選択マーカーの活性を有さない、修飾された細胞の同定を可能にする条件下で細胞を培養することを含む、実施形態1に記載の方法。
6.(d)第1標的遺伝子座で第1挿入核酸を含む修飾された細胞に、(i)Casタンパク質及び第2 gRNAをコードする1つ以上の核酸であって、各々が修飾された細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結し、Casタンパク質が、第2核酸を含む第1挿入核酸内の第2 gRNA標的部位でのニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第2選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、1つ以上の核酸と、(ii)第3プロモーターに作動可能に連結された第3選択マーカーをコードする第3核酸を含む第2挿入核酸を含む第2ターゲッティングベクターであって、第2挿入核酸が、第2標的遺伝子座に位置する第3及び第4標的部位に対応する第3及び第4ホモロジーアームに隣接している、第2ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(e)第2標的遺伝子座内に第2挿入核酸を含む第2の修飾された細胞を同定する工程であって、第2の修飾された細胞が、第3選択マーカーの活性を有するが、第2選択マーカーの活性を有さず、第2及び第3選択マーカーが異なる工程と、を更に含む、実施形態1に記載の方法。
7.第1及び第2標的遺伝子座が、各々に隣接して位置している、実施形態6に記載の方法。
8.第1又は第2標的遺伝子座が、第1又は第2 gRNA標的部位から10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、実施形態6に記載の方法。
9.第2 gRNAが、第2挿入核酸とハイブリダイズしない、実施形態8に記載の方法。
10.同定する工程(e)が、第3選択マーカーの活性を有するが、第2選択マーカーの活性を有さない第2の修飾された細胞の同定を可能にする条件下で、修飾された細胞を培養することを含む、実施形態6に記載の方法。
11.(f)第2標的遺伝子座に第2挿入核酸を含む第2の修飾された細胞に、(i)第2の修飾された細胞内で活性なプロモーターと各々作動可能に連結されたCasタンパク質及び第3 gRNAをコードする1つ以上の発現コンストラクトであって、Casタンパク質が第3核酸を含む第2挿入核酸で第3 gRNA標的部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、第3選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、1つ以上の発現コンストラクトと、(ii)第4プロモーターに作動可能に連結された第4選択マーカーをコードする第4核酸を含む第3挿入核酸を含む第3ターゲッティングベクターであって、第3挿入核酸が、第3標的遺伝子座に位置する第5及び第6標的部位に対応する第5及び第6ホモロジーアームに隣接している、第3ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、(g)第3標的遺伝子座に第3挿入核酸を含む第3の修飾された細胞を同定する工程であって、第3の修飾された細胞が第4選択マーカーの活性を有するが、第3選択マーカーの活性を有さず、第3及び第4選択マーカーが異なる、工程と、を含む。
12.第2及び第3標的遺伝子座が、各々直接隣接して位置している、実施形態11に記載の方法。
13.第2又は第3標的遺伝子座が、第1又は第2 gRNA標的部位から10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、実施形態11に記載の方法。
14.第1、第2、第3又は第4マーカーが、抗生物質耐性を付与する、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
15.抗生物質が、G418、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、実施形態14に記載の方法。
16.第1、第2、第3又は第4選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV−TK)を含む、実施形態1〜13のいずれか1つに記載の方法。
17.第1、第2又は第3 gRNAが、(i)第1、第2又は第3 gRNA標的部位とハイブリダイズするヌクレオチド配列と、(ii)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と、を含む、実施形態1、6又は11に記載の方法。
18.第1、第2又は第3標的遺伝子座が、第1、第2又は第3 gRNA標的部位の近傍に位置し、gRNA標的部位のニック又は二本鎖切断が、標的遺伝子座でのターゲッティングベクターの相同組換えを促進する、実施形態1、6又は11に記載の方法。
19.Casタンパク質が、Cas9である、実施形態1、6又は11に記載の方法。
20.第1、第2又は第3 gRNA標的部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に直接隣接している、実施形態19に記載の方法。
21.細胞が、原核細胞である、実施形態1、6又は11に記載の方法。
22.細胞が、真核生物細胞である、実施形態1、6及び11のいずれか1つに記載の方法。
23.真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、実施形態22に記載の方法。
24.哺乳動物細胞が、線維芽細胞である、実施形態23に記載の方法。
25.哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、実施形態23に記載の方法。
26.哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、実施形態23に記載の方法。
27.齧歯動物が、ラット、マウス又はハムスターである、実施形態26に記載の方法。
28.真核生物細胞が、多能性細胞である、実施形態22に記載の方法。
29.多能性細胞が、造血幹細胞又は神経幹細胞である、実施形態28に記載の方法。
30.多能性細胞が、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、実施形態28に記載の方法。
31.多能性細胞が、マウス胚性幹(ES)細胞又はラット胚性幹(ES)細胞である、実施形態28に記載の方法。
32.第1、第2又は第3 gRNA標的部位が、第1、第2又は第3選択マーカーをコードする第1、第2又は第3核酸のイントロン、エキソン、プロモーター又はプロモーター調節領域に位置している、実施形態1、6及び11のいずれか1つに記載の方法。
33.第1、第2又は第3ターゲッティングベクターが、少なくとも約10kbである、実施形態1、6又は11に記載の方法。
34.第1、第2又は第3挿入核酸が、約5kb〜約300kbの範囲である、実施形態1、6又は11に記載の方法。
35.第1、第2又は第3挿入核酸が、ヒトT細胞受容体α遺伝子座のゲノム領域を含む、実施形態1、6又は11に記載の方法。
36.ゲノム領域が、ヒトT細胞受容体α遺伝子座の少なくとも1つの可変領域遺伝子セグメント及び/又は連結領域遺伝子セグメントを含む、請求項35に記載の方法。
37.第1及び第3選択マーカーが同じである、実施形態6に記載の方法。
38.第1及び第3選択マーカーが同じであり、第2及び第4選択マーカーが同じである、実施形態11に記載の方法。
39.第1及び第3 gRNAが同じである、実施形態38に記載の方法。
40.gRNAがハイグロマイシン又はネオマイシン抵抗性遺伝子に特有である実施形態1、6、37、38又は39に記載の方法。
41.ネオマイシン抵抗性遺伝子に特異的なgRNAが、配列番号13、14、15又は16に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態40に記載の方法。
42.ネオマイシン抵抗性遺伝子に特異的なgRNAが、配列番号17、18、19又は20に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされる、実施形態40に記載の方法。
43.a)第1 gRNAが、配列番号13、14、15又は16に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、第2 gRNAが、配列番号17、18、19又は20に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされるか、又はb)第1 gRNAが、配列番号17、18、19又は20に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、第2 gRNAが、配列番号13、14、15又は16に記載のヌクレオチド配列を含む核酸によりコード化される、実施形態6、37、38又は39に記載の方法。
(項目1)
細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、
(a)第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドを含む第1標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記第1ポリヌクレオチドが、第1ヌクレアーゼ剤のための第1認識部位を更に含む、工程と、
(b)前記細胞に、
(i)前記細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結された第1ヌクレアーゼ剤をコードする1つ以上の発現コンストラクトであって、前記第1ヌクレアーゼ剤が前記第1ポリヌクレオチド内の第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第1選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、1つ以上の発現コンストラクトと、
(ii)第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2ポリヌクレオチドを含む第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターであって、第1挿入核酸が、前記第1標的遺伝子座に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接している、第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
(c)前記第1標的遺伝子座に前記第1挿入核酸を含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第2選択マーカーの活性を有するが、前記第1選択マーカーの活性を有さず、
前記第1及び前記第2選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
(項目2)
前記標的遺伝子座が、前記細胞のゲノム中に存在している、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記標的遺伝子座が、前記細胞内のベクターに位置している、項目1に記載の方法。
(項目4)
前記同定する工程(c)が、前記第1選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養することを含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記同定する工程(c)が、前記第1及び前記第2標的部位に組み込まれた前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定することを含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、目的の第1ポリヌクレオチドを更に含む、項目1〜5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
前記第2選択マーカーをコードする前記第2ポリヌクレオチドが、前記細胞内で活性な第2プロモーターに作動可能に連結され、前記第2ポリヌクレオチドが、第2ヌクレアーゼ剤のための第2認識部位を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記方法が、
(a)前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む前記細胞に、
(i)第2ヌクレアーゼ剤であって、前記第2ポリヌクレオチド内の前記第2認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第2選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、第2ヌクレアーゼ剤と、
(ii)前記第2認識部位の充分近傍に位置する第3及び第4標的部位に対応する第3及び第4ホモロジーアームに隣接する第2挿入ポリヌクレオチドを含む第2ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
(b)前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を更に含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記同定する工程(b)が、前記第2選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養することを含む、項目8に記載の方法。
(項目10)
前記第2選択可能マーカーを含む前記第2ポリヌクレオチドが、前記第3標的部位及び前記第4標的部位に隣接している、項目8又は9に記載の方法。
(項目11)
前記同定する工程(b)が、前記第3及び前記第4標的部位に組み込まれた前記第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定することを含む、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、
(a)目的の第2ポリヌクレオチドと、
(b)前記細胞内で活性な第3プロモーターに作動可能に連結された第3選択マーカーをコードする第3ポリヌクレオチドと、を含み、
前記第3ポリヌクレオチドが、第3ヌクレアーゼ剤のための第3認識部位を含む、項目8〜11のいずれか一項に記載の方法。
(項目13)
前記第1ヌクレアーゼ剤が、前記第2ヌクレアーゼ剤と異なる、項目7〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記第1選択マーカーが、前記第2選択マーカーと異なる、項目7〜13のいずれか一項に記載の方法。
(項目15)
前記第1及び前記第3ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第2ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第1及び前記第3ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第2ヌクレアーゼ剤と異なる、項目12に記載の方法。
(項目16)
前記第1及び前記第3選択マーカーが、同一である、項目12に記載の方法。
(項目17)
前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーのうちの1つが、抗生物質耐性を付与する、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記抗生物質が、G418、ハイグロマイシン、ブラストシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーのうちの1つが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対する毒性を示す、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目20)
前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV−TK)を含む、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記細胞が、原核細胞である、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記細胞が、真核生物細胞である、項目1〜20のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記哺乳動物細胞が、非ヒト哺乳動物細胞である、項目23に記載の方法。
(項目25)
前記哺乳動物細胞が、齧歯動物由来である、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記齧歯動物が、ラット又はマウスである、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記細胞が、多能性細胞である、項目23〜26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記哺乳動物細胞が、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞である、項目23に記載の方法。
(項目29)
前記多能性細胞が、非ヒト胚性幹(ES)細胞である、項目27に記載の方法。
(項目30)
前記多能性細胞が、マウス胚性幹(ES)細胞又はラット胚性幹(ES)細胞である、項目27に記載の方法。
(項目31)
前記多能性細胞が、造血幹細胞である、項目27〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記多能性細胞が、神経幹細胞である、項目27〜30のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記哺乳動物細胞が、ヒト線維芽細胞である、項目23に記載の方法。
(項目34)
前記第1ヌクレアーゼ剤と前記第1ターゲッティングベクターとの併用により、前記第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、項目1に記載の方法。
(項目35)
前記第1ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも2倍向上している、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記第2又は前記第3ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記核酸が、前記細胞内で活性な第4プロモーターに作動可能に連結されている、項目12〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
前記第1又は前記第2ヌクレアーゼ剤が、ヌクレアーゼをコードするmRNAである、項目1〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目38)
前記第1又は前記第2ヌクレアーゼ剤が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)である、項目1〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記第1又は前記第2ヌクレアーゼ剤が、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)である、項目1〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記第1又は前記第2ヌクレアーゼ剤が、メガヌクレアーゼである、項目1〜36のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記第1又は前記第2ヌクレアーゼ剤が、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)−関連(Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)を含む、項目1〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記ガイドRNA(gRNA)が、(a)前記第1、前記第2又は前記第3認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)RNA(crRNA)と、
(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と、を含む、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記第1又は前記第2認識部位が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に直接隣接している、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記標的遺伝子座が、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、項目41、42又は43に記載の方法。
(項目45)
前記Casタンパク質が、Cas9である、項目41、42、43又は44に記載の方法。
(項目46)
前記gRNAが、
(a)配列番号2の核酸配列のキメラRNA、又は
(b)配列番号3の核酸配列のキメラRNAを含む、項目41〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記crRNAが、配列番号4、配列番号5又は配列番号6を含む、項目41〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記tracrRNAが、配列番号7又は配列番号8を含む、項目41〜43のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記第1、前記第2及び/又は前記第3認識部位が、前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、請求1〜48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
前記第1標的部位及び前記第2標的部位が、前記第1認識部位に直接隣接している、項目1〜49のいずれか一項に記載の方法。
(項目51)
前記第1標的部位及び前記第2標的部位が、前記第1認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、項目8〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目52)
前記第3標的部位及び前記第4標的部位が、前記第2認識部位に直接隣接している、項目8〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目53)
前記第3標的部位及び前記第4標的部位が、前記第2認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、項目8〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目54)
前記第1ホモロジーアームと前記第2ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbである、項目1〜53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記第3ホモロジーアームと前記第4ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbである、項目8〜54のいずれか一項に記載の方法。
(項目56)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲である、項目1〜55のいずれか一項に記載の方法。
(項目57)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲である、項目8〜56のいずれか一項に記載の方法。
(項目58)
前記第1挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、項目1〜57のいずれか一項に記載の方法。
(項目59)
前記第2挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はそれらの組み合わせをもたらす、項目8〜58のいずれか一項に記載の方法。
(項目60)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求1〜59のいずれか一項に記載の方法。
(項目61)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目8〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目1〜61のいずれか一項に記載の方法。
(項目63)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、前記T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目8〜62のいずれか一項に記載の方法。
(項目64)
前記第1又は前記第2挿入ポリヌクレオチドが、前記T細胞受容体α遺伝子座の少なくとも1つの可変領域遺伝子セグメント及び/又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目62又は63に記載の方法。
(項目65)
前記T細胞受容体α遺伝子座の前記領域が、ヒト由来である、項目62〜64のいずれか一項に記載の方法。
(項目66)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目1〜61のいずれか一項に記載の方法。
(項目67)
前記同定する工程が、対立遺伝子の修飾(MOA)アッセイを経て実施される、項目1〜66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同又はオルソロガスな前記核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目1〜62のいずれか一項に記載の方法。
(項目69)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同又はオルソロガスな前記核酸配列を含む、項目8〜68のいずれか一項に記載の方法。
(項目70)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目1〜67のいずれか一項に記載の方法。
(項目71)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目8〜67又は70のいずれか一項に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
(項目1)
細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、
(a)第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドを含む第1標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記第1ポリヌクレオチドが、第1ヌクレアーゼ剤のための第1認識部位を更に含む、工程と、
(b)前記細胞に、
(i)前記第1ヌクレアーゼ剤であって、前記第1ポリヌクレオチド内の前記第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第1選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第1ヌクレアーゼ剤と、
(ii)第1ターゲッティングベクターであって、第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2ポリヌクレオチドを含む第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターであって、前記第1挿入ポリヌクレオチドが、前記第1標的遺伝子座に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接している、第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
(c)前記第1標的遺伝子座に前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第2選択マーカーの活性を有するが、前記第1選択マーカーの活性を有さず、
前記第1及び前記第2選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。
(項目2)
前記標的遺伝子座が、
(a)前記細胞のゲノム中に存在しているか、又は
(b)前記細胞内のベクターに位置している、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記同定する工程(c)が、
(a)前記第1選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
(b)前記第1及び第2標的部位に組み込まれた前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定すること、を含む、項目1又は2に記載の方法。
(項目4)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、目的の第1ポリヌクレオチドを更に含む、項目1〜3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
前記第2ポリヌクレオチドが、第2ヌクレアーゼ剤のための第2認識部位を含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の方法。
(項目6)
前記方法が、
(a)前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む前記細胞に、
(i)前記第2ヌクレアーゼ剤であって、前記第2ポリヌクレオチド内の前記第2認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第2選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第2ヌクレアーゼ剤と、
(ii)前記第2認識部位の充分近傍に位置する第3及び第4標的部位に対応する第3及び第4ホモロジーアームに隣接する第2挿入ポリヌクレオチドを含む第2ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
(b)前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を更に含む、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記同定する工程(b)が、
(a)前記第2選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
(b)前記第3及び第4標的部位に組み込まれた前記第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定すること、を含む、項目6に記載の方法。
(項目8)
前記第2選択マーカーを含む前記第2ポリヌクレオチドが、前記第3標的部位及び前記第4標的部位に隣接している、項目6又は7に記載の方法。
(項目9)
前記第2挿入ポリヌクレオチドが、
(a)目的の第2ポリヌクレオチドと、
(b)前記細胞内で活性な第3プロモーターに作動可能に連結された第3選択マーカーをコードする第3ポリヌクレオチドと、を含み、
前記第3ポリヌクレオチドが、第3ヌクレアーゼ剤のための第3認識部位を含む、項目6〜8のいずれか一項に記載の方法。
(項目10)
前記第1ヌクレアーゼ剤が、前記第2ヌクレアーゼ剤と異なる、項目5〜9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記第1及び前記第3ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第2ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第1及び前記第3ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第2ヌクレアーゼ剤と異なる、項目9に記載の方法。
(項目12)
前記第1及び前記第3選択マーカーが、同一である、項目9に記載の方法。
(項目13)
前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、抗生物質耐性を付与する、項目9〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目14)
前記抗生物質が、G418、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対する毒性を示す、項目9〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV−TK)を含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記細胞が、原核細胞又は真核生物細胞である、項目1〜16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記哺乳動物細胞が、
(a)非ヒト哺乳動物細胞、
(b)多能性細胞、
(c)ヒト人工多能性幹(iPS)細胞、
(d)ヒト線維芽細胞、又は
(e)齧歯動物細胞である、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記齧歯動物が、ラット又はマウスである、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記多能性細胞が、
(a)非ヒト胚性幹(ES)細胞、
(b)マウス胚性幹(ES)細胞又はラット胚性幹(ES)細胞、
(c)造血幹細胞、又は
(d)神経幹細胞である、項目19に記載の方法。
(項目22)
前記第1ヌクレアーゼ剤と前記第1ターゲッティングベクターとの併用により、前記第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、項目1に記載の方法。
(項目23)
前記第1ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも2倍向上している、項目22に記載の方法。
(項目24)
前記第1、前記第2又は前記第3ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸配列が、前記細胞内で活性な第4プロモーターに作動可能に連結されている、項目9〜23のいずれか一項に記載の方法。
(項目25)
前記第1、前記第2又は前記第3ヌクレアーゼ剤が、
(a)ヌクレアーゼをコードするmRNA、
(b)ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、
(c)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、
(d)メガヌクレアーゼ、又は
(e)クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)−関連(Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)である、項目9〜24のいずれか一項に記載の方法。
(項目26)
前記Casタンパク質が、Cas9であり、前記ガイドRNA(gRNA)が、
(a)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に直接隣接している前記第1、前記第2又は前記第3認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)RNA(crRNA)と、
(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と、を含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記標的遺伝子座が、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記gRNAが、
(a)配列番号2若しくは配列番号3の核酸配列を有するキメラRNA、
(b)配列番号4、配列番号5若しくは配列番号6を含むcrRNA、又は
(c)配列番号7若しくは配列番号8を含むtracrRNAを含む、項目26に記載の方法。
(項目29)
前記第1、前記第2及び/又は前記第3認識部位が、前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、項目9〜28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記第1標的部位及び前記第2標的部位が、前記第1認識部位に直接隣接している、項目1〜29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
(a)前記第1標的部位及び前記第2標的部位が、前記第1認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置しているか、
(b)前記第3標的部位及び前記第4標的部位が、前記第2認識部位に直接隣接しているか、又は
(c)前記第3標的部位及び前記第4標的部位が、前記第2認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、項目6〜12のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
(a)前記第1ホモロジーアームと前記第2ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbであり、かつ/又は
(b)前記第3ホモロジーアームと前記第4ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbである、項目6〜31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
(a)前記第1挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲であり、かつ/又は
(b)前記第2挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲である、項目6〜32のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
(補正有)
(a)前記第1挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらし、かつ/又は
(b)前記第2挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらす、項目6〜33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
(a)前記第1挿入ポリヌクレオチドが、
(i)ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
(ii)T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含み、
かつ/又は
(b)前記第2挿入ポリヌクレオチドが、
(i)ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
(ii)T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目6〜34のいずれか一項に記載の方法。
(項目36)
前記第1又は前記第2挿入ポリヌクレオチドが、前記T細胞受容体α遺伝子座の少なくとも1つの可変領域遺伝子セグメント及び/又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記T細胞受容体α遺伝子座の前記領域が、ヒト由来である、項目35又は36に記載の方法。
(項目38)
前記第1挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、項目1〜35のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記同定する工程が、対立遺伝子の修飾(MOA)アッセイを経て実施される、項目1〜38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
(a)前記第1挿入ポリヌクレオチドが、
(i)前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、
(ii)外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含むか、又は
(b)第2挿入ポリヌクレオチドが、
(i)前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列、又は
(ii)外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含む、項目6〜35のいずれか一項に記載の方法。
Claims (40)
- 細胞内の標的遺伝子座の修飾方法であって、
(a)第1プロモーターに作動可能に連結された第1選択マーカーをコードする第1ポリヌクレオチドを含む第1標的遺伝子座を含む細胞を提供する工程であって、前記第1ポリヌクレオチドが、第1ヌクレアーゼ剤のための第1認識部位を更に含む、工程と、
(b)前記細胞に、
(i)前記第1ヌクレアーゼ剤であって、前記第1ポリヌクレオチド内の前記第1認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第1選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第1ヌクレアーゼ剤と、
(ii)第1ターゲッティングベクターであって、第2プロモーターに作動可能に連結された第2選択マーカーをコードする第2ポリヌクレオチドを含む第1挿入ポリヌクレオチドを含む第1ターゲッティングベクターであって、前記第1挿入ポリヌクレオチドが、前記第1標的遺伝子座に位置する第1及び第2標的部位に対応する第1及び第2ホモロジーアームに隣接している、第1ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
(c)前記第1標的遺伝子座に前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む修飾された細胞を同定する工程であって、前記修飾された細胞は、前記第2選択マーカーの活性を有するが、前記第1選択マーカーの活性を有さず、
前記第1及び前記第2選択マーカーが異なる、工程と、を含む、方法。 - 前記標的遺伝子座が、
(a)前記細胞のゲノム中に存在しているか、又は
(b)前記細胞内のベクターに位置している、請求項1に記載の方法。 - 前記同定する工程(c)が、
(a)前記第1選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
(b)前記第1及び第2標的部位に組み込まれた前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定すること、を含む、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記第1挿入ポリヌクレオチドが、目的の第1ポリヌクレオチドを更に含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2ポリヌクレオチドが、第2ヌクレアーゼ剤のための第2認識部位を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、
(a)前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第1挿入ポリヌクレオチドを含む前記細胞に、
(i)前記第2ヌクレアーゼ剤であって、前記第2ポリヌクレオチド内の前記第2認識部位でニック又は二本鎖切断を誘導することにより、前記第2選択マーカーの発現又は活性を損なわせる、前記第2ヌクレアーゼ剤と、
(ii)前記第2認識部位の充分近傍に位置する第3及び第4標的部位に対応する第3及び第4ホモロジーアームに隣接する第2挿入ポリヌクレオチドを含む第2ターゲッティングベクターと、を導入する工程と、
(b)前記標的遺伝子座に組み込まれた前記第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定する工程と、を更に含む、請求項5に記載の方法。 - 前記同定する工程(b)が、
(a)前記第2選択マーカーの活性を有さない細胞の同定を可能にする条件下で前記細胞を培養すること、又は
(b)前記第3及び第4標的部位に組み込まれた前記第2挿入ポリヌクレオチドを含む少なくとも1つの細胞を同定すること、を含む、請求項6に記載の方法。 - 前記第2選択マーカーを含む前記第2ポリヌクレオチドが、前記第3標的部位及び前記第4標的部位に隣接している、請求項6又は7に記載の方法。
- 前記第2挿入ポリヌクレオチドが、
(a)目的の第2ポリヌクレオチドと、
(b)前記細胞内で活性な第3プロモーターに作動可能に連結された第3選択マーカーをコードする第3ポリヌクレオチドと、を含み、
前記第3ポリヌクレオチドが、第3ヌクレアーゼ剤のための第3認識部位を含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1ヌクレアーゼ剤が、前記第2ヌクレアーゼ剤と異なる、請求項5〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1及び前記第3ヌクレアーゼ認識部位が、互いに同一であり、かつ前記第2ヌクレアーゼ認識部位と異なり、前記第1及び前記第3ヌクレアーゼ剤が、互いに同一であり、かつ前記第2ヌクレアーゼ剤と異なる、請求項9に記載の方法。
- 前記第1及び前記第3選択マーカーが、同一である、請求項9に記載の方法。
- 前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、抗生物質耐性を付与する、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗生物質が、G418、ハイグロマイシン、ブラスチシジン、ネオマイシン又はピューロマイシンを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、誘導性プロモーターに作動可能に連結され、前記選択マーカーの発現が、前記細胞に対する毒性を示す、請求項9〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーが、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT)又は単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ(HSV−TK)を含む、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞が、原核細胞又は真核生物細胞である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項17に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、
(a)非ヒト哺乳動物細胞、
(b)多能性細胞、
(c)ヒト人工多能性幹(iPS)細胞、
(d)ヒト線維芽細胞、又は
(e)齧歯動物細胞である、請求項18に記載の方法。 - 前記齧歯動物が、ラット又はマウスである、請求項19に記載の方法。
- 前記多能性細胞が、
(a)非ヒト胚性幹(ES)細胞、
(b)マウス胚性幹(ES)細胞又はラット胚性幹(ES)細胞、
(c)造血幹細胞、又は
(d)神経幹細胞である、請求項19に記載の方法。 - 前記第1ヌクレアーゼ剤と前記第1ターゲッティングベクターとの併用により、前記第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、ターゲッティング効率の向上をもたらす、請求項1に記載の方法。
- 前記第1ターゲッティングベクターの前記ターゲッティング効率が、前記第1ターゲッティングベクター単独での使用と比較して、少なくとも2倍向上している、請求項22に記載の方法。
- 前記第1、前記第2又は前記第3ヌクレアーゼ剤が、前記ヌクレアーゼ剤をコードする核酸配列を含む発現コンストラクトを含み、前記ヌクレアーゼ剤をコードする前記核酸配列が、前記細胞内で活性な第4プロモーターに作動可能に連結されている、請求項9〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1、前記第2又は前記第3ヌクレアーゼ剤が、
(a)ヌクレアーゼをコードするmRNA、
(b)ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、
(c)転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、
(d)メガヌクレアーゼ、又は
(e)クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)−関連(Cas)タンパク質及びガイドRNA(gRNA)である、請求項9〜24のいずれか一項に記載の方法。 - 前記Casタンパク質が、Cas9であり、前記ガイドRNA(gRNA)が、
(a)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列に直接隣接している前記第1、前記第2又は前記第3認識部位を標的とする、クラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列(CRISPR)RNA(crRNA)と、
(b)トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)と、を含む、請求項25に記載の方法。 - 前記標的遺伝子座が、配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項26に記載の方法。
- 前記gRNAが、
(a)配列番号2若しくは配列番号3の核酸配列を有するキメラRNA、
(b)配列番号4、配列番号5若しくは配列番号6を含むcrRNA、又は
(c)配列番号7若しくは配列番号8を含むtracrRNAを含む、請求項26に記載の方法。 - 前記第1、前記第2及び/又は前記第3認識部位が、前記第1、前記第2又は前記第3選択マーカーのイントロン、エキソン、プロモーター、プロモーター調節領域又はエンハンサー領域に位置している、請求項9〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1標的部位及び前記第2標的部位が、前記第1認識部位に直接隣接している、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- (a)前記第1標的部位及び前記第2標的部位が、前記第1認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置しているか、
(b)前記第3標的部位及び前記第4標的部位が、前記第2認識部位に直接隣接しているか、又は
(c)前記第3標的部位及び前記第4標的部位が、前記第2認識部位から約10ヌクレオチド〜約14kbに位置している、請求項6〜12のいずれか一項に記載の方法。 - (a)前記第1ホモロジーアームと前記第2ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbであり、かつ/又は
(b)前記第3ホモロジーアームと前記第4ホモロジーアームの合計が、少なくとも約10kbである、請求項6〜31のいずれか一項に記載の方法。 - (a)前記第1挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲であり、かつ/又は
(b)前記第2挿入ポリヌクレオチドが、約5kb〜約300kbの長さの範囲である、請求項6〜32のいずれか一項に記載の方法。 - (補正有)
(a)前記第1挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらし、かつ/又は
(b)前記第2挿入ポリヌクレオチドの前記標的遺伝子座への組み込みにより、ノックアウト、ノックイン、点変異、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、遺伝子スワップ又はその組み合わせをもたらす、請求項6〜33のいずれか一項に記載の方法。 - (a)前記第1挿入ポリヌクレオチドが、
(i)ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
(ii)T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含み、
かつ/又は
(b)前記第2挿入ポリヌクレオチドが、
(i)ヒトポリヌクレオチドを含む目的のポリヌクレオチド、若しくは
(ii)T細胞受容体α遺伝子座の領域を含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求項6〜34のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1又は前記第2挿入ポリヌクレオチドが、前記T細胞受容体α遺伝子座の少なくとも1つの可変領域遺伝子セグメント及び/又は連結領域遺伝子セグメントを含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記T細胞受容体α遺伝子座の前記領域が、ヒト由来である、請求項35又は36に記載の方法。
- 前記第1挿入ポリヌクレオチドが、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の核酸配列に作動可能に連結された、再構成されていないヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチドを含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記同定する工程が、対立遺伝子の修飾(MOA)アッセイを経て実施される、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
- (a)前記第1挿入ポリヌクレオチドが、
(i)前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、
(ii)外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含むか、又は
(b)第2挿入ポリヌクレオチドが、
(i)前記細胞のゲノム内の核酸配列に相同若しくはオルソロガスな核酸配列、又は
(ii)外来の核酸配列を含む目的のポリヌクレオチド、を含む、請求項6〜35のいずれか一項に記載の方法。
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