RS60359B1 - Postupci i kompozicije za modifikovanje ciljanog lokusa - Google Patents

Postupci i kompozicije za modifikovanje ciljanog lokusa

Info

Publication number
RS60359B1
RS60359B1 RS20200430A RSP20200430A RS60359B1 RS 60359 B1 RS60359 B1 RS 60359B1 RS 20200430 A RS20200430 A RS 20200430A RS P20200430 A RSP20200430 A RS P20200430A RS 60359 B1 RS60359 B1 RS 60359B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cell
polynucleotide
nucleic acid
target
exemplary embodiment
Prior art date
Application number
RS20200430A
Other languages
English (en)
Inventor
Wojtek Auerbach
David Frendewey
Gustavo Droguett
Anthony Gagliardi
Junko Kuno
David M Valenzuela
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS60359B1 publication Critical patent/RS60359B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNO POVEZIVANJE SA SRODNIM PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava zahteva pravo prvenstva saglasno sa S.A.D. privremenom prijavom br.
62/008,832, podnetom 6. juna 2014, i S.A.D. privremenom prijavom br. 62/017,916, podnetom 27. juna 2014.
OBLAST
[0002] Postupci i kompozicije se odnose na oblast molekularne biologije. Konkretno, postupci i kompozicije su obezbeđeni za modifikovanje ciljanog lokusa u ćeliji.
KAO TEKSTUALNA DATOTEKA PUTEM EFS WEB
[0003] Zvanična kopija liste sekvenci je dostavljena elektronski, putem EFS-Web kao lista sekvenci u ASCII formatu sa datotekom pod nazivom 461003SEQLIST.TXT, koja je kreirana 5. juna 2015, i ima veličinu od 5KB, i podneta je istovremeno sa specifikacijom. Lista sekvenci sadržana u ovom dokumentu u ASCII formatu je deo specifikacije.
POZADINA
[0004] Homologna rekombinacija upotrebom vektora koji ciljno deluju koji su posebno dizajnirani da dodaju, izvrše deleciju, ili zamene određenu sekvencu nukleinske kiseline na genskom lokusu je popularan pristup za postizanje željene genske modifikacije u ćeliji. Nukleaza koja je posebno projektovana za introdukovanje nika (eng. nick; prekid jednog lanca) ili dvolančanog prekida na ili blizu ciljnog lokusa može se upotrebljavati u kombinaciji sa vektorom koji ciljno deluje da poveća efikasnost homologne rekombinacije na ciljnom lokusu.
[0005] Iako je veština ciljane modifikacije putem homologne rekombinacije znatno napredovala u poslednje dve decenije, i dalje postoje poteškoće u postizanju prihvatljive efikasnosti ciljnog delovanja upotrebom vektora koji ciljno deluju. Potrebni su postupci koji poboljšavaju delotvornost i efikasnost pomoću kojih se proizvode ciljane modifikacije. WO2013/163394, Xiaoxia Cui et al., Nature Biotechnology, vol. 29, br. 1, 1. januara 2011., str. 64-67 i WO2012/018726 objavljuju poboljšanu efikasnost ciljnog delovanja koja je rezultat kombinacije nukleaze i vektora koji ciljno deluje. WO02/066630 i WO2011/158009 objavljuju serijsku modifikaciju lokusa upotrebom zamene antibiotske rezistencije.
SAŽETAK
[0006] Obezbeđeni su postupci i kompozicije za modifikovanje jednog ili više ciljnih lokusa u ćeliji.
[0007] Pronalazak je kao što je definisano u patentnim zahtevima.
[0008] U prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je postupak za serijsku modifikaciju ciljnog lokusa u ćeliji, koji sadrži:
(a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži ciljni lokus, pri čemu ciljni lokus
sadrži polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom i koji sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, pri čemu je prvo mesto za prepoznavanje nukleaze smešteno u kodirajućem regionu prvog selekcionog markera ili bilo kom ne-protein-kodirajućem regionu prvog selekcionog markera, opciono pri čemu je ciljni lokus u genomu ćelije ili je smešten u vektoru u ćeliji;
(b) introdukovanje u ćeliju:
(i) prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje nukleaze, čime se narušava ekspresija ili aktivnost prvog selekcionog markera; i
(ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom homolognom granom koja odgovara prvom ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu i drugom homolognom granom koja odgovara drugom ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu, pri čemu prvi insertovani polinukleotid sadrži: (I) prvi polinukleotid od interesa; i (II) polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom i koji sadrži drugo mesto za prepoznavanje nukleaze za drugi agens nukleaze,
pri čemu su prvi selekcioni marker i drugi selekcioni marker različiti,
pri čemu je prvi agens nukleaze različit od drugog agensa nukleaze, i
pri čemu je drugo mesto za prepoznavanje nukleaze smešteno u kodirajućem regionu drugog selekcionog markera ili bilo kom ne-protein-kodirajućem regionu drugog selekcionog markera;
(c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid na ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, opciono pri čemu se identifikovanje vrši putem testa modifikacije alela (MOA);
(d) introdukovanje u modifikovanu ćeliju:
(i) drugog agensa nukleaze, pri čemu drugi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje nukleaze, čime se narušava ekspresija ili aktivnost drugog selekcionog markera; i
(ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana trećom homolognom granom koja odgovara trećem ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu i četvrtom homolognom granom koja odgovara četvrtom ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu, pri čemu drugi insertovani polinukleotid sadrži: (I) drugi polinukleotid od interesa; i (II) polinukleotid koji kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom koji je aktivan u ćeliji i koji sadrži treće mesto za prepoznavanje nukleaze za treći agens nukleaze,
pri čemu su prvi selekcioni marker i treći selekcioni marker identični, i
pri čemu je treće mesto za prepoznavanje nukleaze identično prvom mestu za prepoznavanje nukleaze i različito je od drugog mesta za prepoznavanje nukleaze, i prvi agens nukleaze i treći agens nukleaze identični su jedan drugom i različiti su od drugog agensa nukleaze; i
(e) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus, opciono pri čemu se identifikovanje vrši putem testa modifikacije alela (MOA).
[0009] U nekim primerima obezbeđeni su postupci za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji i sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, (b) introdukovanje u ćeliju (i) prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje; i, (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje; i, (c) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus.
[0010] U nekim primerima, postupak za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji sadrži: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži prvi ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, (b) introdukovanje u ćeliju: (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju prvi agens nukleaze koji je operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje u prvom polinukleotidu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost prvog selekcionog markera; i (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid koji sadrži drugi polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom, pri čemu je prva insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u prvom ciljnom lokusu; i (c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, i pri čemu su prvi i drugi selekcioni markeri različiti.
[0011] U jednom primeru izvođenja, ciljni lokus je u genomu ćelije. U drugom primeru izvođenja, ciljni lokus je smešten u vektoru u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost prvog selekcionog markera. U još jednom dodatnom primeru izvođenja, korak identifikovanja (c) sadrži uzgajanje ćelija pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje ćelija koje nemaju aktivnost prvog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, prvi polinukleotid koji sadrži prvi selekcioni marker omeđen je sa bočnih strana prvim ciljnim mestom i drugim ciljnim mestom. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (c) sadrži identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u prvo i drugo ciljno mesto. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži: (a) prvi polinukleotid od interesa; i, (b) drugi polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu drugi polinukleotid sadrži drugo mesto za prepoznavanje za drugi agens nukleaze.
[0012] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži (a) introdukovanje u ćeliju koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus, (i) drugog agensa nukleaze, pri čemu drugi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje; i, (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom koje odgovaraju trećem i četvrtom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini drugog mesta za prepoznavanje; i, (b) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U jednom primeru izvođenja, nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost drugog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (b) sadrži uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje ćelija koje nemaju aktivnost drugog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, drugi polinukleotid koji sadrži drugi selekcioni marker omeđen je sa bočnih strana trećim ciljnim mestom i četvrtim ciljnim mestom. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (b) sadrži identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u treće i četvrto ciljno mesto.
[0013] U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži: (a) drugi polinukleotid od interesa; i, (b) treći polinukleotid koji kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu treći polinukleotid sadrži treće mesto za prepoznavanje za treći agens nukleaze. U jednom primeru izvođenja, prvi agens nukleaze se razlikuje od drugog agensa nukleaze. U jednom primeru izvođenja, prvi selekcioni marker se razlikuje od drugog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, prvo i treće mesto za prepoznavanje nukleaze su identična jedno drugom i razlikuju se od drugog mesta za prepoznavanje nukleaze; i, prvi i treći agens nukleaze su identični jedan drugom i razlikuju se od drugog agensa nukleaze. U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni markeri su identični. U jednom primeru izvođenja, jedan od prvog, drugog ili trećeg selekcionog markera daje rezistenciju na antibiotik. U jednom primeru izvođenja, antibiotik sadrži G418, higromicin, blastocidin, neomicin, ili puromicin. U jednom primeru izvođenja, jedan od prvog, drugog ili trećeg selekcionog markera je operativno povezan sa inducibilnim promotorom, i ekspresija selektabilnog markera je toksična za ćeliju. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi ili treći selekcioni marker sadrži hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu Herpes simplex virusa (HSV-TK). U jednom primeru izvođenja, navedena ćelija je prokariotska ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija je eukariotska ćelija. U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je ćelija sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija ne-humanog sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je od glodara. U jednom primeru izvođenja, glodar je pacov ili miš.
[0014] U jednom primeru izvođenja, ćelija je pluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je embrionalna matična (ES) ćelija koja nije humana. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je embrionalna matična (ES) ćelija miša ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je hematopoetska matična ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je neuronska matična ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je humani fibroblast.
[0015] U jednom primeru izvođenja, kombinovana upotreba prvog vektora koji ciljno deluje sa prvim agensom nukleaze rezultira povećanom efikasnošću ciljnog delovanja u poređenju sa upotrebom samo prvog vektora koji ciljno deluje. U jednom primeru izvođenja, efikasnost ciljnog delovanja prvog vektora koji ciljno deluje je povećana najmanje dvostruko u poređenju sa upotrebom samo prvog vektora koji ciljno deluje.
[0016] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira agens nukleaze, i pri čemu je nukleinska kiselina operativno povezana sa četvrtim promotorom koji je aktivan u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je iRNK koja kodira nukleazu. U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je cinkani prst nukleaza (zinc finger nuclease-ZFN). U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (Transcription Activator-Like Effector Nuclease-TALEN). U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je meganukleaza.
[0017] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze sadrži sa grupisanim kratkim palindromskim ponovcima na jednakim rastojanjima (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR)-povezan (Cas) protein i vodeću RNK (gRNA). U jednom primeru izvođenja, vodeća RNK (gRNA) sadrži (a) grupisane kratke palindromske ponovke na jednakim rastojanjima (CRISPR) RNK (crRNA) koji ciljaju prvo, drugo, ili treće mesto za prepoznavanje; i (b) trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA). U jednom primeru izvođenja, prvo ili drugo mesto za prepoznavanje neposredno su omeđeni sa bočnih strana protospejser susednog motiva (Protospacer Adjacent Motif-PAM) sekvencom. U jednom primeru izvođenja, genski lokus od interesa sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1. U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas9. U jednom primeru izvođenja, gRNA sadrži: (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 2; ili, (b) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 3. U jednom primeru izvođenja, crRNA sadrži SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; ili SEQ ID NO: 6. U jednom primeru izvođenja, tracrRNA sadrži SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8.
[0018] U jednom primeru izvođenja, prvo, drugo, i/ili treće mesto za prepoznavanje je smešteno u intronu, egzonu, promotoru, regulatornom regionu promotora, ili enhanser regionu prvog, drugog, ili trećeg selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, prvo ciljno mesto i drugo ciljno mesto su neposredno pored prvog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, prvo ciljno mesto i drugo ciljno mesto su oko 10 nukleotida do oko 14 kb od prvog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, treće ciljno mesto i četvrto ciljno mesto su neposredno pored drugog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, treće ciljno mesto i četvrto ciljno mesto su oko 10 nukleotida do oko 14 kb od drugog mesta za prepoznavanje.
[0019] U jednom primeru izvođenja, ukupan zbir prve homologne grane i druge homologne grane je najmanje oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, ukupan zbir treće homologne grane i četvrte homologne grane je najmanje oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid dugačak je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid dugačak je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb.
[0020] U jednom primeru izvođenja, integracija prvog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira knockout-om, knock-in-om, tačkastom mutacijom, zamenom domena, zamenom egzona, zamenom introna, zamenom regulatorne sekvence, zamenom gena, ili njihovom kombinacijom. U jednom primeru izvođenja, integracija drugog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira knockout-om, knock-in-om, tačkastom mutacijom, zamenom domena, zamenom egzona, zamenom introna, zamenom regulatorne sekvence, zamenom gena, ili njihovom kombinacijom.
[0021] U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži humani polinukleotid. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži humani polinukleotid. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži region alfa lokusa T ćelijskog receptora.
[0022] U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži region alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona i/ili segment gena povezujućeg (eng. joining) regiona alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, region alfa lokusa T ćelijskog receptora je od čoveka.
[0023] U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca ne-humanog imunoglobulina.
[0024] U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja se vrši putem testa modifikacije alela (MOA). U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline u genomu ćelije. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline u genomu ćelije. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži sekvencu egzogene nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži sekvencu egzogene nukleinske kiseline.
[0025] U nekim primerima izvođenja, postupci za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži prvi ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom; (b) introdukovanje u ćeliju (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i prvu vodeću RNK (gRNA), od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom gRNA ciljnom mestu u prvoj nukleinskoj kiselini, čime se narušava ekspresija ili aktivnost prvog selekcionog markera, i (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom, pri čemu je prva insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u prvom ciljnom lokusu; i (c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, i pri čemu su prvi i drugi selekcioni markeri različiti. U jednom primeru izvođenja, prva gRNA ne hibridizuje sa prvom insertovanom nukleinskom kiselinom. U jednom primeru izvođenja, ciljni lokus od interesa smešten je u genomu ćelije. U drugom primeru izvođenja, ciljni lokus od interesa je smešten u vektoru u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (c) sadrži uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje modifikovane ćelije koja ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera.
[0026] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži (d) introdukovanje u modifikovanu ćeliju koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu (i) jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju Cas protein i drugu gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u modifikovanoj ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom gRNA ciljnom mestu u prvoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost drugog selekcionog markera, i (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži treću nukleinsku kiselinu koja kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom, pri čemu je druga insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom koje odgovaraju trećem i četvrtom ciljnom mestu koja su smeštena u drugom ciljnom lokusu; i (e) identifikovanje druge modifikovane ćelije koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu, pri čemu druga modifikovana ćelija ima aktivnost trećeg selekcionog markera ali nema aktivnost drugog selekcionog markera, pri čemu su drugi i treći selekcioni markeri različiti. U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi ciljni lokus su koji su smešteni neposredno jedan pored drugog. U drugom primeru izvođenja, prvi ili drugi ciljni lokus je smešten oko 10 nukleotida do oko 14 kb, oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida, oko 100 nukleotida do oko 500 nukleotida, oko 500 nukleotida do oko 1000 nukleotida, oko 1 kb do oko 5 kb, oko 5 kb do oko 10 kb, ili oko 10 kb do oko 14 kb od prvog ili drugog gRNA ciljnog mesta. U jednom primeru izvođenja, druga gRNA ne hibridizuje sa drugom insertovanom nukleinskom kiselinom. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (e) sadrži uzgajanje modifikovane ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje druge modifikovane ćelije koja ima aktivnost trećeg selekcionog markera ali nema aktivnost drugog selekcionog markera.
[0027] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži (f) introdukovanje u drugu modifikovanu ćeliju koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu: (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i treću gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u drugoj modifikovanoj
1
ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na trećem gRNA ciljnom mestu u drugoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži treću nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost trećeg selekcionog markera, i (ii) trećeg vektora koji ciljno deluje koji sadrži treću insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži četvrtu nukleinsku kiselinu koja kodira četvrti selekcioni marker koji je operativno povezan sa četvrtim promotorom, pri čemu je treća insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana petom i šestom homolognom granom koje odgovaraju petom i šestom ciljnom mestu koja su smeštena u trećem ciljnom lokusu; i (g) identifikovanje treće modifikovane ćelije koja sadrži treću insertovanu nukleinsku kiselinu na trećem ciljnom lokusu, pri čemu treća modifikovana ćelija ima aktivnost četvrtog selekcionog markera ali nema aktivnost trećeg selekcionog markera, pri čemu su treći i četvrti selekcioni markeri različiti. U jednom primeru izvođenja, drugi i treći ciljni lokusi su smešteni neposredno jedan pored drugog. U drugom primeru izvođenja, drugi ili treći ciljni lokus je smešten oko 10 nukleotida do oko 14 kb od prvog ili drugog gRNA ciljnog mesta.
[0028] U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, treći, ili četvrti marker daje rezistenciju na antibiotik. U jednom primeru izvođenja, antibiotik sadrži G418, higromicin, blastocidin, neomicin, ili puromicin. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, treći, ili četvrti selekcioni markeri sadrže hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu Herpes simplex virusa (HSV-TK). U jednom primeru izvođenja, prva, druga, ili treća gRNA sadrže (i) nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje sa prvim, drugim ili trećim gRNA ciljnim mestom i (ii) trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA). U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, ili treći ciljni lokus je smešten u neposrednoj blizini prvog, drugog ili trećeg gRNA ciljnog mesta tako da nik ili dvolančani prekid na gRNA ciljnom mestu promoviše homolognu rekombinaciju vektora koji ciljno deluje na ciljnom lokusu. U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas9. U jednom primeru izvođenja, prvo, drugo, ili treće gRNA ciljno mesto je neposredno omeđeno sa bočnih strana protospejser susednog motiva (PAM) sekvencom.
[0029] U jednom primeru izvođenja, ćelija je prokariotska ćelija. U drugom primeru izvođenja, ćelija je eukariotska ćelija. U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je ćelija sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija fibroblast. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija humanog fibroblasta. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija ne-humanog sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je od glodara. U jednom primeru izvođenja, glodar je pacov, miš, ili hrčak.
[0030] U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je pluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je hematopoetska matična ćelija ili neuronska matična ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je embrionalna matična (ES) ćelija miša ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova.
[0031] U jednom primeru izvođenja, prvo, drugo, ili treće gRNA ciljno mesto je smešteno u intronu, egzonu, promotoru, ili regulatornom regionu promotora u prvoj, drugoj, ili trećoj nukleinskoj kiselini koja kodira prvi, drugi, ili treći selekcioni marker. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, ili treći vektor koji ciljno deluje je najmanje oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, prva, druga, ili treća insertovana nukleinska kiselina je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb.
[0032] U jednom primeru izvođenja, prva, druga, ili treća insertovana nukleinska kiselina sadrži genski region humanog alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, genski region sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona i/ili segment gena povezujućeg regiona humanog alfa lokusa T ćelijskog receptora.
[0033] U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni markeri su isti. U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni markeri su isti i drugi i četvrti selekcioni markeri su isti. U jednom primeru izvođenja, prva i treća gRNA su iste.
[0034] Dodatno su u ovoj objavi obezbeđeni postupci i kompozicije za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji. Takvi postupci sadrže obezbeđivanje ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze. Prvi agens nukleaze se introdukuje u ćeliju, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje. Dodatno je u ćeliju introdukovan prvi vektor koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje. Najmanje jedna ćelija je onda identifikovana koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus.
[0035] Takođe su obezbeđeni postupci za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji koji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, (b) introdukovanje u ćeliju (i) prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje; i, (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje; i, (c) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U jednom primeru izvođenja, ciljni lokus je u genomu ćelije. U drugom primeru izvođenja, ciljni lokus je smešten u vektoru u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost prvog selekcionog markera. U još jednom dodatnom primeru izvođenja, korak identifikovanja (c) sadrži uzgajanje ćelija pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje ćelija koje nemaju aktivnost prvog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, prvi polinukleotid koji sadrži prvi selekcioni marker omeđen je sa bočnih strana prvim ciljnim mestom i drugim ciljnim mestom. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (c) sadrži identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u prvo i drugo ciljno mestu. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži: (a) prvi polinukleotid od interesa; i, (b) drugi polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu drugi polinukleotid sadrži drugo mesto za prepoznavanje za drugi agens nukleaze.
[0036] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži (a) introdukovanje u ćeliju koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus, (i) drugog agensa nukleaze, pri čemu drugi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje; i, (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom koje odgovaraju trećem i četvrtom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini drugog mesta za prepoznavanje; i, (b) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U jednom primeru izvođenja, nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost drugog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (b) sadrži uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje ćelija koje nemaju aktivnost drugog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, drugi polinukleotid koji sadrži drugi selekcioni marker omeđen je sa bočnih strana trećim ciljnim mestom i četvrtim ciljnim mestom. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (b) sadrži identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u treće i četvrto ciljno mesto. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži: (a) drugi polinukleotid od interesa; i, (b) treći polinukleotid koji kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu treći polinukleotid sadrži treće mesto za
1
prepoznavanje za treći agens nukleaze. U jednom primeru izvođenja, prvi agens nukleaze se razlikuje od drugog agensa nukleaze. U jednom primeru izvođenja, prvi selekcioni marker se razlikuje od drugog selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, prvo i treće mesto za prepoznavanje nukleaze su identična jedno drugom i razlikuju se od drugog mesta za prepoznavanje nukleaze; i, prvi i treći agens nukleaze su identični jedan drugom i razlikuju se od drugog agensa nukleaze. U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni markeri su identični. U jednom primeru izvođenja, jedan od prvog, drugog ili trećeg selekcionog markera daje rezistenciju na antibiotik. U jednom primeru izvođenja, antibiotik sadrži G418, higromicin, blastocidin, neomicin, ili puromicin. U jednom primeru izvođenja, jedan od prvog, drugog ili trećeg selekcionog markera je operativno povezan sa inducibilnim promotorom, i ekspresija selekcionog markera je toksična za ćeliju. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi ili treći selekcioni marker sadrži hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu Herpes simplex virusa (HSV-TK). U jednom primeru izvođenja, navedena ćelija je prokariotska ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija je eukariotska ćelija. U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je ćelija sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija ne-humanog sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je od glodara. U jednom primeru izvođenja, glodar je pacov ili miš. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je humani fibroblast.
[0037] U jednom primeru izvođenja, ćelija je pluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je embrionalna matična (ES) ćelija koja nije humana. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je embrionalna matična (ES) ćelija miša ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je hematopoetska matična ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je neuronska matična ćelija.
[0038] U jednom primeru izvođenja, kombinovana upotreba prvog vektora koji ciljno deluje sa prvim agensom nukleaze rezultira povećanom efikasnošću ciljnog delovanja u poređenju sa upotrebom samo prvog vektora koji ciljno deluje. U jednom primeru izvođenja, efikasnost ciljnog delovanja prvog vektora koji ciljno deluje je povećana najmanje dvostruko u poređenju sa upotrebom samo prvog vektora koji ciljno deluje.
[0039] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira agens nukleaze, i nukleinska kiselina je operativno povezana sa četvrtim promotorom koji je aktivan u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je iRNK koja kodira nukleazu. U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je cinkani prst nukleaza (ZFN). U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (TALEN). U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze je meganukleaza.
[0040] U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi agens nukleaze sadrži sa grupisanim kratkim palindromskim ponovcima na jednakim rastojanjima (CRISPR)-povezan (Cas) protein i vodeću RNK (gRNA). U jednom primeru izvođenja, vodeća RNK (gRNA) sadrži (a) grupisane kratke palindromske ponovke na jednakim rastojanjima (CRISPR) RNK (crRNA) koji ciljaju prvo, drugo, ili treće mesto za prepoznavanje; i (b) trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA). U jednom primeru izvođenja, prvo ili drugo mesto za prepoznavanje neposredno je omeđeno sa bočnih strana protospejser susednog motiva (PAM) sekvencom. U jednom primeru izvođenja, genski lokus od interesa sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1. U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas9. U jednom primeru izvođenja, gRNA sadrži: (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 2; ili, (b) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 3. U jednom primeru izvođenja, crRNA sadrži SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; ili SEQ ID NO: 6. U jednom primeru izvođenja, tracrRNA sadrži SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8. U jednom primeru izvođenja, prvo, drugo, i/ili treće mesto za prepoznavanje je smešteno u intronu, egzonu, promotoru, regulatornom regionu promotora, ili enhanser regionu prvog, drugog, ili trećeg selekcionog markera. U jednom primeru izvođenja, prvo ciljno mesto i drugo ciljno mesto su neposredno pored prvog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, prvo ciljno mesto i drugo ciljno mesto su oko 10 nukleotida do oko 14 kb od prvog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, treće ciljno mesto i četvrto ciljno mesto su neposredno pored drugog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, treće ciljno mesto i četvrto ciljno mesto su oko 10 nukleotida do oko 14 kb od drugog mesta za prepoznavanje. U jednom primeru izvođenja, ukupan zbir prve homologne grane i druge homologne grane je najmanje oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, ukupan zbir treće homologne grane i četvrte homologne grane je najmanje oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid dugačak je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid dugačak je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb. U jednom primeru izvođenja, integracija prvog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira knockout-om, knock-in-om, tačkastom mutacijom, zamenom domena, zamenom egzona, zamenom introna, zamenom regulatorne sekvence, zamenom gena, ili njihovom kombinacijom. U jednom primeru izvođenja, integracija drugog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira knockout-om, knock-in-
1
om, tačkastom mutacijom, zamenom domena, zamenom egzona, zamenom introna, zamenom regulatorne sekvence, zamenom gena, ili njihovom kombinacijom. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži humani polinukleotid. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži humani polinukleotid. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži region alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži region alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, prvi ili drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona i/ili segment gena povezujućeg regiona alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, region alfa lokusa T ćelijskog receptora je od čoveka. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca ne-humanog imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja se vrši putem testa modifikacije alela (MOA). U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline u genomu ćelije. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline u genomu ćelije. U jednom primeru izvođenja, prvi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži sekvencu egzogene nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, drugi insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid od interesa koji sadrži sekvencu egzogene nukleinske kiseline.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0041]
Slika 1 obezbeđuje šematski prikaz događaja genskog ciljnog delovanja u kome je ćelija koja ima heterozigotnu modifikaciju TCR alfa lokusa na hromozomu 14 miša, od kojih je jedan alel humanizovani TCR alfa A-neo alel, koji sadrži neomicin selekcionu kasetu smeštenu uzvodno od osam segmenata humanog varijabilnog (V) gena i 61 segmenta humanog povezujućeg (J) gena ciljana sa humanizovanim TCR alfa alel B-
1
hyg vektorom koji ciljno deluje, koji sadrži higromicin selekcionu kasetu i fragment veći od 100 kb koji sadrži 11 dodatnih segmenata humanog varijabilnog gena. Elektroporacija alel B-hyg vektora koji ciljno deluje i plazmida koji eksprimiraju dve polovine para cinkani prst nukleaze (ZFN) koja cilja neomicin kasetu u TCR alfa A-neo alelu generisala je modifikovani TCR alfa lokus (alel B-hyg) koji sadrži, od 5' do 3', higromicin kasetu, 19 segmenata humanog V gena, i 61 segment humanog J gena koji su smešteni uzvodno od nukleotidne sekvence endogenog konstantnog regiona. Događaj ciljnog delovanja precizno je insertovao više od 100 kb sekvence humanog TCR alfa gena u TCR alfa lokus miša.
Slika 2 obezbeđuje šematski prikaz događaja genskog ciljnog delovanja u kome je ćelija koja ima heterozigotnu modifikaciju TCR alfa lokusa na hromozomu 14 miša, od kojih je jedan alel humanizovani TCR alfa B-hyg alel, koji sadrži higromicin selekcionu kasetu smeštenu uzvodno od 19 segmenata humanog V gena i 61 segmenta humanog J gena ciljana sa humanizovanim TCR alfa alel C-neo vektorom koji ciljno deluje, koji sadrži neomicin selekcionu kasetu i fragment veći od 100 kb koji sadrži 11 dodatnih segmenata humanog varijabilnog gena. Elektroporacija alel C-neo vektora koji ciljno deluje i plazmida koji eksprimiraju dve polovine para cinkani prst nukleaze (ZFN) koja cilja higromicin kasetu u TCR alfa B-hyg alelu generisala je modifikovani TCR alfa lokus (alel C-neo) koji sadrži, od 5' do 3', neomicin kasetu, 30 segmenata humanog V gena, i 61 segment humanog J gena koji su smešteni uzvodno od nukleotidne sekvence endogenog konstantnog regiona. Događaj ciljnog delovanja precizno je insertovao više od 100 kb sekvence humanog TCR alfa gena u TCR alfa lokus miša.
Slika 3 obezbeđuje šematski prikaz neo<r>, koja kodira neomicin fosfotransferazu, i hyg<r>, koja kodira higromicin B fosfotransferazu, selekcione kasete leka. Pozicije mesta za prepoznavanje (sekvence date ispod) za Neo-ZFN(1,2) i Neo-ZFN(3,4) cinkani prst nukleaze (ZFN, Sl.3A) koje ciljaju neor i Hyg-ZFN(1,2) i Hyg-ZFN(3,4) ZFN (Sl.3B) koje ciljaju hygr su označene šrafiranim pravougaonicima iznad ili ispod debelih strelica koje predstavljaju odgovarajuće kodirajuće sekvence fosfotransferaze.
DETALJAN OPIS
[0042] Predmetni pronalasci će sada biti potpunije opisani u daljem tekstu sa pozivanjem na prateće crteže, na kojima su prikazani neki, ali ne svi primeri izvođenja pronalaska. Zaista, ovi pronalasci mogu biti izvedeni kao primer u mnogo različitih oblika i ne treba ih tumačiti
1
kao ograničene na primere izvođenja ovde iznete; radije, ovi primeri izvođenja se obezbeđuju tako da ova objava zadovolji važeće zakonske zahteve. Slični brojevi kroz pronalazak označavaju slične elemente.
[0043] Mnoge modifikacije i drugi primeri izvođenja pronalazaka koji su izneti ovde pašće na pamet stručnjaku u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi imajući koristi od učenja koja su predstavljena u navedenim opisima i pridruženim crtežima. Stoga, treba razumeti da se pronalazak ne ograničava na specifične primere izvođenja koji su objavljeni i da su modifikacije i drugi primeri izvođenja uključeni u obim priloženih patentnih zahteva. Iako se ovde koriste specifični pojmovi, upotrebljavaju se samo u generičkom i opisnom smislu a ne u svrhe ograničavanja.
I. Pregled
[0044] Postupci i kompozicije su obezbeđeni za modifikovanje ciljnog lokusa, npr. genskog lokusa, u ćeliji. Postupci i kompozicije koriste agense nukleaze i mesta za prepoznavanje agensa nukleaze kako bi se poboljšali događaji homologne rekombinacije insertovanog polinukleotida u ciljni lokus. Ovde obezbeđeni različiti postupci i kompozicije strateški smeštaju mesto za prepoznavanje agensa nukleaze unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker, reporter, ili egzogeni protein (npr. eGFP ili humana sekvenca u ćeliji miša).
[0045] Dodatno su obezbeđeni postupci koji omogućavaju serijsku modifikaciju (tj. popločavanje, eng. tiling) polinukleotida od interesa na ciljnom lokusu (tj. genskom lokusu). Kao što je detaljnije objašnjeno u daljem tekstu, obezbeđeni su postupci za serijsko popločavanje polinukleotida od interesa u ciljnom lokusu (tj. genskom lokusu) pri čemu ciljni lokus (tj. genski lokus) i različiti vektori koji ciljno deluju korišćeni u postupku naizmenično upotrebljavaju prvi selekcioni marker koji sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze i drugi selekcioni marker koji sadrži drugo mesto za prepoznavanje za drugi agens nukleaze. Pritom, postupak ne zahteva stalnu isporuku nukleaza projektovanih da prepoznaju nova mesta za prepoznavanje. Umesto toga, u specifičnim primerima izvođenja, ciljano serijsko popločavanje zahteva samo dva agensa nukleaze i odgovarajuće mesto za prepoznavanje dva agensa nukleaze. Štaviše, budući da agensi nukleaze ciljaju egzogene sekvence (tj. mesto za prepoznavanje unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker) i budući da je delotvornost i efekat izvan cilja bilo kog datog mesta za prepoznavanje
1
prethodno potvrđena, nespecifično isecanje endogene genske sekvence može se minimalizovati uz povećanje vremena i efikasnosti troškova postupka popločavanja.
II. Ciljani integracioni sistem
[0046] Obezbeđeni su postupci i kompozicije za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji. Sistem koristi agense nukleaze, mesta za prepoznavanje agensa nukleaze, ciljni lokus, selekcione markere, vektore koji ciljno deluju, i insertovane polinukleotide. Svaka od ovih komponenti je detaljnije opisana u nastavku.
A. Agensi nukleaze i mesta za prepoznavanje agenasa nukleaze
[0047] Termin "mesto za prepoznavanje agensa nukleaze" uključuje DNK sekvencu na kojoj agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid. Mesto za prepoznavanje agensa nukleaze može biti endogeno (ili nativno) za ćeliju ili mesto za prepoznavanje može biti egzogeno za ćeliju. U specifičnim primerima izvođenja, mesto za prepoznavanje je egzogeno za ćeliju i samim tim se ne javlja u prirodi u genomu ćelije. U još dodatnim primerima izvođenja, mesto za prepoznavanje je egzogeno za ćeliju i za polinukleotide od interesa koje neko želi da budu postavljeni na ciljnom lokusu. U dodatnim primerima izvođenja, egzogeno ili endogeno mesto za prepoznavanje prisutno je samo jednom u genomu ćelije domaćina. U specifičnim primerima izvođenja, identifikovano je endogeno ili nativno mesto koje se javlja samo jednom unutar genoma. Takvo mesto se zatim može upotrebljavati za dizajniranje agenasa nukleaze koji će proizvesti nik ili dvolančani prekid na endogenom mestu za prepoznavanje.
[0048] Dužina mesta za prepoznavanje može varirati, i uključuje, na primer, mesta za prepoznavanje koja su oko 30-36 bp za par cinkani prst nukleaze (ZFN) (tj. oko 15-18 bp za svaku ZFN), oko 36 bp za efektorsku nukleazu sličnu aktivatoru transkripcije (TALEN), ili oko 20 bp za CRISPR/Cas9 vodeću RNK.
[0049] U ovde objavljenim postupcima i kompozicijama može se upotrebljavati bilo koji agens nukleaze koji indukuje nik ili dvolančani prekid u željenom mestu za prepoznavanje. Može se koristiti agens nukleaze koji se javlja u prirodi ili nativni agens nukleaze sve dok agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid u željenom mestu za prepoznavanje. Alternativno može se koristiti modifikovani ili projektovani agens nukleaze. "Projektovani agens nukleaze" uključuje nukleazu koja je projektovana (modifikovana ili izvedena) iz nativnog oblika da specifično prepozna i indukuje nik ili dvolančani prekid u željenom mestu
1
za prepoznavanje. Stoga, projektovani agens nukleaze može biti izveden iz nativnog agensa nukleaze koji se javlja u prirodi ili se može veštački stvoriti ili sintetisati. Modifikacija agensa nukleaze može biti tako mala kao jedna amino-kiselina u agensu isecanja proteina ili jedan nukleotid u agensu isecanja nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, projektovana nukleaza indukuje nik ili dvolančani prekid u mestu za prepoznavanje, pri čemu mesto za prepoznavanje nije sekvenca koja bi bila prepoznata od strane nativnog (neprojektovanog ili nemodifikovanog) agensa nukleaze. Stvaranje nika ili dvolančanog prekida u mestu za prepoznavanje ili drugoj DNK može se ovde označiti kao "sečenje" ili "isecanje" mesta za prepoznavanje ili druge DNK.
[0050] Takođe su obezbeđene aktivne varijante i fragmenti mesta za prepoznavanje koja služe kao primer. Takve aktivne varijante mogu sadržati najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence datom mestu za prepoznavanje, pri čemu aktivne varijante zadržavaju biološku aktivnost i otuda je agens nukleaze sposoban da ih prepozna i iseeče na način specifičan za sekvencu. Testovi za merenje dvolančanog prekida mesta za prepoznavanje od strane agensa nukleaze su poznati u struci (npr. TaqMan® qPCR test, Frendewey D. et al., Methods in Enzymology, 2010, 476:295-307).
[0051] U specifičnim primerima izvođenja, mesto za prepoznavanje je pozicionirano unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker. Takva pozicija može biti smeštena unutar kodirajućeg regiona selekcionog markera ili unutar regulatornih regiona, koji utiču na ekspresiju selekcionog markera. Stoga, mesto za prepoznavanje agensa nukleaze može biti smešteno u intronu selekcionog markera, promotoru, enhanseru, regulatornom regionu, ili bilo kom ne-protein-kodirajućem regionu polinukleotida koji kodira selekcioni marker. U specifičnim primerima izvođenja, nik ili dvolančani prekid na mestu za prepoznavanje narušava aktivnost selekcionog markera. Postupci za testiranje na prisustvo ili odsustvo funkcionalnog selekcionog markera su poznati.
[0052] U jednom primeru izvođenja, agens nukleaze je efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (TALEN). TAL efektorske nukleaze su klasa nukleaza specifičnih za sekvencu koje se mogu upotrebljavati da naprave dvolančane prekide na specifičnim ciljnim sekvencama u genomu prokariotskog ili eukariotskog organizma. TAL efektorske nukleaze su kreirane fuzionisanjem nativnog ili projektovanog efektora sličnog aktivatoru transkripcije (TAL), ili njegovog funkcionalnog dela, sa katalitičkim domenom endonukleaze, kao što je, na primer, FokI. Jedinstveni, modularni domen vezivanja DNK TAL efektora omogućava dizajn proteina sa potencijalno bilo kojom DNK specifičnošću prepoznavanja. Stoga, DNK
2
vezujući domeni TAL efektorskih nukleza mogu biti projektovani tako da prepoznaju specifična DNK ciljna mesta i stoga upotrebljeni da prave dvolančane prekide na željenim ciljnim sekvencama. Videti, WO 2010/079430; Morbitzer et al. (2010) PNAS 10.1073/pnas.1013133107; Scholze & Boch (2010) Virulence 1:428-432; Christian et al. Genetics (2010) 186:757-761; Li et al. (2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704; i Miller et al. (2011) Nature Biotechnology 29:143-148.
[0053] Primeri pogodnih TAL nukleaza, i postupaka za pripremu pogodnih TAL nukleaza objavljeni su, npr. u SAD patentnoj prijavi br. 2011/0239315 A1, 2011/0269234 A1, 2011/0145940 A1, 2003/0232410 A1, 2005/0208489 A1, 2005/0026157 A1, 2005/0064474 A1, 2006/0188987 A1, i 2006/0063231 A1. U različitim primerima izvođenja, projektovane su TAL efektorske nukleaze koje seku u ili blizu ciljne sekvence nukleinske kiseline u, na primer, lokusu od interesa ili genskom lokusu od interesa, pri čemu je ciljna sekvenca nukleinske kiseline na ili blizu sekvence koja se modifikuje vektorom koji ciljno deluje. TAL nukleaze pogodne za upotrebu sa različitim postupcima i kompozicije koje su ovde obezbeđene uključuju one koje su specifično dizajnirane da se vežu na ili blizu ciljne sekvence nukleinske kiseline koja se modifikuje vektorima koji ciljno deluju kako je ovde opisano.
[0054] U jednom primeru izvođenja, svaki monomer TALEN-a sadrži 33-35 TAL ponovaka koji prepoznaju pojedinačni bazni par putem dva hipervarijabilna ostatka. U jednom primeru izvođenja, agens nukleaze je himerni protein koji sadrži DNK vezujući domen zasnovan na TAL ponovku koji je operativno povezan sa nezavisnom nukleazom. U jednom primeru izvođenja, nezavisna nukleaza je FokI endonukleaza. U jednom primeru izvođenja, agens nukleaze sadrži prvi DNK vezujući domen zasnovan na TAL ponovku i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL ponovku, pri čemu je svaki od prvog i drugog DNK vezujućeg domena zasnovanog na TAL ponovku operativno povezan sa subjedinicom FokI nukleaze, pri čemu prvi i drugi DNK vezujući domen zasnovan na TAL ponovku prepoznaje dve neprekidne ciljne DNK sekvence u svakom lancu ciljne DNK sekvence odvojene spejser sekvencom varijabilne dužine (12-20 bp), i pri čemu subjedinice FokI nukleaze dimerizuju da bi se stvorila aktivna nukleaza koja pravi dvolančani prekid na ciljnoj sekvenci.
[0055] Agens nukleaze koji se koristi u različitim ovde opisanim postupcima i kompozicijama može dalje sadržati cinkani prst nukleazu (ZFN). U jednom primeru izvođenja, svaki monomer ZFN sadrži 3 ili više DNK vezujućih domena zasnovanih na cinkanom prstu, pri čemu se svaki DNK vezujući domen zasnovan na cinkanom prstu vezuje na submesto od 3 bp. U drugim primerima izvođenja, ZFN je himerni protein koji sadrži DNK vezujući domen zasnovan na cinkanom prstu koji je operativno povezan sa nezavisnom nucleazom. U jednom primeru izvođenja, nezavisna endonukleaza je FokI endonukleaza. U jednom primeru izvođenja, agens nukleaze sadrži prvu ZFN i drugu ZFN, pri čemu je svaka od prve ZFN i druge ZFN operativno povezana sa subjedinicom FokI nukleaze, pri čemu prva i druga ZFN prepoznaje dve neprekidne ciljne DNK sekvence u svakom lancu ciljne DNK sekvence odvojene spejserom od oko 5-7 bp, i pri čemu subjedinice FokI nukleaze dimerizuju da bi se stvorila aktivna nukleaza koja pravi dvolančani prekid. Videti, na primer, US20060246567; US20080182332; US20020081614; US20030021776; WO/2002/057308A2; US20130123484; US20100291048; WO/2011/017293A2; i Gaj et al. (2013) Trends in Biotechnology, 31(7):397-405.
[0056] U još jednom primeru izvođenja, agensa nukleaze je meganukleaza. Meganukleze su klasifikovane u četiri porodice na osnovu konzerviranih motiva sekvenci, porodice su LAGLIDADG, GIY-YIG, H-N-H, i His-Cys boks porodice. Ovi motivi učestvuju u koordinaciji jona metala i hidrolizi fosfodiestarskih veza. Meganukleaze su karakteristične po svojim dugačkim mestima za prepoznavanje, i po tolerisanju nekih polimorfizama sekvenci u svojim DNK supstratima. Domeni meganukleaze, struktura i funkcija su poznati, videti na primer, Guhan i Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248; Lucas et al., (2001) Nucleic Acids Res 29:960-9; Jurica and Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci 55:1304-26; Stoddard, (2006) Q Rev Biophys 38:49-95; i Moure et al, (2002) Nat Struct Biol 9:764. U nekim primerima upotrebljava se varijanta koja se javlja u prirodi, i/ili projektovana izvedena meganukleaza. Postupci za modifikovanje kinetike, interakcije kofaktora, ekspresije, optimalnih uslova, i/ili specifičnosti mesta za prepoznavanje, i pregled za aktivnost su poznati, videti na primer, Epinat et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:2952-62; Chevalier et al., (2002) Mol Cell 10:895-905; Gimble et al, (2003) Mol Biol 334:993-1008; Seligman et al, (2002) Nucleic Acids Res 30:3870-9; Sussman et al., (2004) J Mol Biol 342:31-41; Rosen et al, (2006) Nucleic Acids Res 34:4791-800; Chames et al., (2005) Nucleic Acids Res 33:e178; Smith et al., (2006) Nucleic Acids Res 34:e149; Gruen et al., (2002) Nucleic Acids Res 30:e29; Chen i Zhao, (2005) Nucleice Acids Res 33:e154; WO2005105989; WO2003078619; WO2006097854; WO2006097853; WO2006097784; i WO2004031346.
[0057] Bilo koja meganukleaza može se upotrebljavati ovde, uključujući, ali ne ograničavajući se na, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, FSceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, IMsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NcIIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp6803I, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-MtuI, PI-MtuHIP PI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, PI-TliII, ili bilo koje njene aktivne varijante ili fragmenti.
[0058] U jednom primeru izvođenja, meganukleaza prepoznaje dvolančane DNK sekvence od 12 do 40 baznih parova. U jednom primeru izvođenja, meganukleaza prepoznaje jednu savršeno podudaranu ciljnu sekvencu u genomu. U jednom primeru izvođenja, meganukleaza je homing nukleaza. U jednom primeru izvođenja, homing nukleaza je LAGLIDADG porodica homing nukleaze. U jednom primeru izvođenja, LAGLIDADG porodica homing nukleaze je odabrana od I-SceI, I-CreI, i I-Dmol.
[0059] Agensi nukleaze mogu dodatno sadržati restrikcione endonukleze, koje uključuju endonukleaze tipa I, tipa II, tipa III, i tipa IV. Restrikcione endonukleaze tipa I i tipa III prepoznaju specifična mesta za prepoznavanje, ali tipično isecaju na varijabilnoj poziciji od vezujućeg mesta nukleaze, što može biti stotine baznih parova udaljeno od mesta isecanja (mesto za prepoznavanje). U tip II sistemima restrikciona aktivnost je nezavisna od bilo koje aktivnosti metilaze, i isecanje se obično javlja na specifičnim mestima unutar ili blizu vezujućeg mesta. Većina enzima tipa II seče palindromske sekvence, međutim enzimi tipa IIa prepoznaju ne-palindromska mesta za prepoznavanje i isecaju izvan mesta za prepoznavanje, enzimi tipa IIb seku sekvence dva puta sa oba mesta izvan mesta za prepoznavanje, i enzimi tipa IIs prepoznaju asimetrično mesto za prepoznavanje i isecaju sa jedne strane i na definisanoj udaljenosti od oko 1-20 nukleotida od mesta za prepoznavanje. Restrikcioni enzimi tipa IV ciljaju metilovanu DNK. Restrikcioni enzimi su dodatno opisani i klasifikovani, na primer u REBASE bazi podataka (internet stranica na rebase.neb.com; Roberts et al, (2003) Nucleic Acids Res 31:418-20), Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res 31:1805-12, i Belfort et al., (2002) u Mobile DNA II, str. 761-783, Eds. Craigie et al., (ASM Press, Washington, DC).
[0060] Agens nukleaze korišćen u različitim postupcima i kompozicijama takođe može da sadrži CRISPR/Cas sistem. Takvi sistemi mogu da koriste Cas9 nukleazu, koja je u nekim slučajevima optimizovana za kodon za željeni tip ćelije u kojoj treba da bude eksprimirana. Sistem dodatno koristi fuzionisani crRNA-tracrRNA konstrukt koji funkcioniše sa Cas9 optimizovanom za kodon. Ova pojedinačna RNK često se označava kao vodeća RNK ili
2
gRNA. Unutar gRNA, crRNA deo je identifikovan kao 'ciljna sekvenca' za dato mesto za prepoznavanje i tracrRNA se često označava kao 'skela (scaffold)'. Pokazano je da ovaj sistem funkcioniše u različitim eukariotskim i prokariotskim ćelijama. Ukratko, kratak DNK fragment koji sadrži ciljnu sekvencu je insertovan u ekspresioni plazmid vodeće RNK. gRNA ekspresioni plazmid sadrži ciljnu sekvencu (u nekim primerima izvođenja oko 20 nukleotida), oblik tracrRNA sekvence (skela) kao i pogodan promotor koji je aktivan u ćeliji i neophodne elemente za pravilnu obradu u eukariotskim ćelijama. Mnogi od sistema se oslanjaju na prilagođene, komplementarne oligove koji se vezuju da formiraju dvolančanu DNK i zatim kloniraju u gRNA ekspresioni plazmid. gRNA ekspresiona kaseta i Cas9 ekspresiona kaseta se zatim introdukuju u ćeliju. Videti, na primer, Mali P et al. (2013) Science 2013, feb 15; 339 (6121):823-6; Jinek M et al. Science 2012, Aug 17; 337(6096):816-21; Hwang WY et al. Nat Biotechnol 2013 mar; 31(3):227-9; Jiang W et al. Nat Biotechnol 2013 mar; 31(3):233-9; i, Cong L et al. Science 2013 feb 15; 339(6121):819-23.
[0061] Ovde objavljeni postupci i kompozicije mogu primenjivati grupisane kratke palindromske ponovke na jednakim rastojanjima (CRISPR)/CRISPR-povezane (Cas) sisteme ili komponente takvih sistema kako bi modifikovale genom unutar ćelije. CRISPR/Cas sistemi uključuju transkripte i druge elemente koji su uključeni u ekspresiju, ili usmeravanje aktivnosti, Cas gena. CRISPR/Cas sistem može biti sistem tipa I, tipa II, ili tipa III. Ovde objavljeni postupci i kompozicije koriste CRISPR/Cas sisteme primenjivanjem CRISPR komplekasa (koji sadrže vodeću RNK (gRNA) u kompleksu sa Cas proteinom) za isecanje nukleinskih kiselina koje je usmereno na mesto.
[0062] Neki CRISPR/Cas sistemi koji se upotrebljavaju u ovde objavljenim postupcima se ne javljaju u prirodi. Sistem "koji se ne javlja u prirodi" uključuje sve što ukazuje na uplitanje čovekove ruke, kao što je alteracija ili mutacija jedne ili više komponenti sistema od svog prirodnog stanja, koji je najmanje značajno oslobođen najmanje jedne druge komponente sa kojom su oni prirodno povezani u prirodi, ili koji je povezan najmanje sa jednom drugom komponentom sa kojom oni nisu prirodno povezani. Na primer, neki CRISPR/Cas sistemi koriste CRISPR komplekse koji se ne javljaju u prirodi koji sadrže gRNA i Cas protein koji se ne javljaju zajedno u prirodi.
i. RNK-vođene Cas endonukleaze
[0063] Cas proteini uobičajeno sadrže najmanje jedan RNK domen za prepoznavanje ili vezujući domen. Takvi domeni mogu da interaguju sa vodećim RNK (gRNA, detaljnije opisane u daljem tekstu). Cas proteini takođe mogu sadržati domene nukleaze (npr. domene DNaze ili RNaze), DNK vezujuće domene, domene helikaze, domene interakcije proteinprotein, domene dimerizacije, i druge domene. Domen nukleaze poseduje katalitičku aktivnost za isecanje nukleinske kiseline. Isecanje uključuje prekidanje kovalentnih veza molekula nukleinske kiseline. Isecanje može proizvesti tupe krajeve ili stepenaste krajeve, i može biti jednolančano ili dvolančano.
[0064] Primeri Cas proteina uključuju Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (Csn1 ili Csx12), Cas10, Cas10d, CasF, CasG, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1 (CasA), Cse2 (CasB), Cse3 (CasE), Cse4 (CasC), Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, i Cu1966, i njihove homologe ili modifikovane verzije.
[0065] Cas proteini mogu biti od tipa II CRISPR/Cas sistema. Na primer, Cas protein može biti Cas9 protein ili biti izveden iz Cas9 proteina. Cas9 proteini tipično dele četiri ključna motiva sa konzerviranom arhitekturom. Motivi 1, 2, i 4 su RuvC-slični motivi, a motiv 3 je motiv HNH. Cas9 protein može biti od, na primer, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, AlicyclobacHlus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, ili Acaryochloris marina. Dodatni primeri članova Cas9 porodice opisani su u WO 2014/131833. Cas9 protein iz S. pyogenes ili izveden iz njega je poželjan enzim. Cas9 proteinu iz S. pyogenes je dodeljen SwissProt pristupni broj Q99ZW2.
2
[0066] Cas proteini mogu biti proteini divljeg tipa (tj. oni koji se javljaju u prirodi), modifikovani Cas proteini (tj. varijante Cas proteina), ili fragmenti Cas proteina divljeg tipa ili modifikovanih. Cas proteini takođe mogu biti aktivne varijante ili fragmenti Cas proteina divljeg tipa ili modifikovanih. Aktivne varijante ili fragmenti mogu sadržati najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence sa Cas proteinom ili njegovim delom divljeg tipa ili modifikovanim, pri čemu aktivne varijante zadržavaju sposobnost da seku na željenom mestu isecanja i samim tim zadržavaju aktivnost koja indukuje nik ili indukuje dvolančani prekid. Testovi za aktivnost indukovanja nika ili indukovanja dvolančanog prekida su poznati i uobičajeno mere ukupnu aktivnost i specifičnost Cas proteina na DNK supstratima koji sadrže mesto isecanja.
[0067] Cas proteini se mogu modifikovati da povećaju ili smanje afinitet vezivanja nukleinske kiseline, specifičnost vezivanja nukleinske kiseline, i/ili enzimsku aktivnost. Cas proteini se takođe mogu modifikovati da promene bilo koju drugu aktivnost ili svojstvo proteina, kao što je kao stabilnost. Na primer, jedan ili više domena nukleaze Cas proteina mogu biti modifikovani, deletirani, ili inaktivirani, ili Cas protein može biti skraćen da se uklone domeni koji nisu esencijalni za funkciju proteina ili da se optimizuje (npr. pojača ili smanji) aktivnost Cas proteina.
[0068] Neki Cas proteini sadrže najmanje dva domena nukleaze, kao što su DNaza domeni. Na primer, Cas9 protein može sadržati RuvC-sličan domen nukleaze i HNH-sličan domen nukleaze. Svaki od RuvC i HNH domena može da seče različiti lanac dvolančane DNK da bi se napravio dvolančani prekid u DNK. Videti npr. Jinek et al. (2012) Science 337:816-821.
[0069] Može se izvršiti delecija ili mutacija jednog ili oba domena nukleaze tako da više nisu funkcionalni ili tako da imaju smanjenu aktivnost nukleaze. Ukoliko je jedan od domena nukleaze deletiran ili mutiran, rezultujući Cas protein (npr. Cas9) može se označiti kao nikaza i može generisati jednolančani prekid u CRISPR RNK sekvenci za prepoznavanje unutar dvolančane DNK ali ne i dvolančani prekid (tj. može da iseca komplementarni lanac ili nekomplementarni lanac, ali ne oba). Ukoliko su oba domena nukleaze deletirana ili mutirana, rezultujući Cas protein (npr. Cas9) imaće smanjenu sposobnost da iseca oba lanca dvolančane DNK. Primer mutacije koja konvertuje Cas9 u nikazu je D10A (aspartat u alanin na poziciji 10 Cas9) mutacija u RuvC domenu Cas9 od S. pyogenes. Slično tome, H939A (histidin u alanin na amino-kiselinskoj poziciji 839) ili H840A (histidin u alanin na amino-kiselinskoj poziciji 840) u HNH domenu Cas9 od S. pyogenes može konvertovati Cas9 u nikazu. Drugi primeri mutacija koje konvertuju Cas9 u nikazu uključuju odgovarajuće mutacije u Cas9 od S. thermophilus. Videti, npr. Sapranauskas et al. (2011) Nuclaic Acids Research 39:9275-9282 i
2
WO 2013/141680. Takve mutacije mogu biti generisane upotrebom postupaka kao što su mutageneza usmerena na mesto, mutageneza posredovana PCR-om, ili sinteza celog gena. Primeri drugih mutacija koje stvaraju nikaze mogu se naći, na primer, u WO/2013/176772A1 i WO/2013/142578A1.
[0070] Cas proteini takođe mogu biti fuzioni proteini. Na primer, Cas protein može biti fuzionisan sa domenom isecanja, domenom epigenetičke modifikacije, domenom aktivacije transkripcije, ili domenom transkripcionog represora. Videti WO 2014/089290. Cas proteini takođe mogu biti fuzionisani sa heterolognim polipeptidom koji obezbeđuje povećanu ili smanjenu stabilnost. Fuzionisani domen ili heterologni polipeptid mogu biti smešteni na N-terminusu, C-terminusu, ili interno unutar Cas proteina.
[0071] Cas protein može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji obezbeđuje subćelijsku lokalizaciju. Takvi heterologni peptidi uključuju, na primer, signal nukleusne lokalizacije (NLS) kao što je SV40 NLS za usmeravanje u nukleus, signal mitohondrijalne lokalizacije za usmeravanje u mitohondrije, ER zadržavajući signal, i slično. Videti, npr. Lange et al. (2007) J. Biol. Chem. 282:5101-5105. Takvi signali subćelijske lokalizacije mogu biti smešteni na N-terminusu, C-terminusu, ili bilo gde unutar Cas proteina. NLS može sadržati niz baznih amino-kiselina, i može biti monopartitna sekvenca ili bipartitna sekvenca.
[0072] Cas proteini se takođe mogu povezati sa domenom koji prodire u ćeliju. Na primer, domen koji prodire u ćeliju može biti izveden iz HIV-1 TAT proteina, TLM motiva prodora u ćeliju iz humanog hepatitis B virusa, MPG, Pep-1, VP22, peptida prodora u ćeliju iz Herpes simplex virusa, ili poliarginin peptidne sekvence. Videti, na primer, WO 2014/089290. Domen koji prodire u ćeliju može biti smešten na N-terminusu, C-terminusu, ili bilo gde unutar Cas proteina.
[0073] Cas proteini takođe mogu sadržati heterologni polipeptid za lako praćenje ili prečišćavanje, kao što je fluorescentni protein, oznaka za prečišćavanje, ili epitopska oznaka. Primeri fluorescentnih proteina uključuju zelene fluorescentne proteine (npr. GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, monomerni Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), žute fluorescentne proteine (npr. YFP, eYFP, Citrin, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), plave fluorescentne proteine (npr. eBFP, eBFP2, Azurit, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), cijan fluorescentne proteine (npr. eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), crvene fluorescentne proteine (mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), narandžaste fluorescentne proteine (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, monomerni Kusabira-Orange, mTangerine,
2
tdTomato), i bilo koji drugi pogodan fluorescentni protein. Primeri oznaka uključuju glutation-S-transferazu (GST), hitin vezujući protein (CBP), maltoza vezujući protein, tioredoksin (TRX), poly(NANP), oznaku tandem afinitetnog pročišćavanja (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, hemaglutinin (HA), nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, histidin (His), biotin karboksil protein nosač (BCCP), i kalmodulin.
[0074] Cas proteini mogu biti obezbeđeni u bilo kom obliku. Na primer, Cas protein može biti obezbeđen u obliku proteina, kao što je Cas protein u kompleksu sa gRNA. Alternativno, Cas protein može biti obezbeđen u obliku nukleinske kiseline koja kodira Cas protein, kao što je RNK (npr. informaciona RNK (iRNK)) ili DNK. Opciono, nukleinska kiselina koja kodira Cas protein može biti kodon optimizovan za efikasnu translaciju u protein u određenoj ćeliji ili organizmu.
[0075] Nukleinske kiseline koje kodiraju Cas proteine mogu biti stabilno integrisane u genom ćelije i operativno povezane sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. Alternativno, nukleinske kiseline koje kodiraju Cas proteine mogu se operativno povezati sa promotorom u ekspresionom konstruktu. Ekspresioni konstrukti uključuju bilo koje konstrukte nukleinske kiseline koji su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena ili druge sekvence nukleinske kiseline od interesa (npr. Cas gen) i koji mogu da prenesu takvu sekvencu nukleinske kiseline od interesa u ciljnu ćeliju. Promotori koji se mogu upotrebljavati u ekspresionom konstruktu uključuju, na primer, promotore koji su aktivni u pluripotentnoj ćeliji pacova, eukariotskoj, sisarskoj, ćeliji ne-humanog sisara, humanoj ćeliji, ćeliji glodara, miša, ili hrčka. Primeri drugih promotora su ovde opisani na drugom mestu.
ii. Vodeće RNK (gRNA)
[0076] "Vodeća RNK" ili "gRNA" uključuje RNK molekul koji se vezuje za Cas protein i usmerava Cas protein na specifičnu lokaciju unutar ciljne DNK. Vodeće RNK mogu da sadrže dva segmenta: "DNK-usmeravajući segment" i "protein-vezujući segment". "Segment" uključuje segment, sekciju, ili region molekula, kao što je neprekidni niz nukleotida u RNK. Neke gRNA sadrže dva odvojena molekula RNK: "aktivator-RNK" i "targeter-RNK". Druge gRNA su pojedinačni RNK molekuli (jedan RNK polinukleotid), koja se takođe može nazvati "jedno-molekulska gRNA", "jedno-vodeća RNK", ili "sgRNA". Videti, npr. WO/2013/176772A1, WO/2014/065596A1, WO/2014/089290A1, WO/2014/093622A2,
2
WO/2014/099750A2, WO/2013/142578A1, i WO 2014/131833A1. Termini "vodeća RNK" i "gRNA" uključuju i dvo-molekulske gRNA i jedno-molekulske gRNA.
[0077] Dvo-molekulska gRNA koja služi kao primer sadrži crRNA-sličan ("CRISPR RNK" ili "targeter-RNK" ili "crRNA" ili "crRNA ponovak") molekul i odgovarajući tracrRNA-sličan ("trans-delujuća CRISPR RNK" ili "aktivator-RNK" ili "tracrRNA" ili "skela") molekul. crRNA sadrži i DNK-usmeravajući segment (jednolančani) gRNA i niz nukleotida koji formiraju jednu polovinu dsRNA dupleksa protein-vezujućeg segmenta gRNA.
[0078] Odgovarajuća tracrRNA (aktivator-RNK) sadrži niz nukleotida koji formiraju drugu polovinu dsRNA dupleksa protein-vezujućeg segmenta gRNA. Niz nukleotida crRNA komplementaran je i hibridizuje sa nizom nukleotida tracrRNA kako bi se formirao dsRNA dupleks protein-vezujućeg domena gRNA. Kao takva, za svaku crRNA se može reći da ima odgovarajuću tracrRNA.
[0079] crRNA i odgovarajuća tracrRNA hibridizuju da formiraju gRNA. crRNA dodatno obezbeđuje jednolančani DNK-usmeravajući segment koji hibridizuje sa CRISPR RNK sekvencom za prepoznavanje. Ukoliko se upotrebljava za modifikovanje unutar ćelije, tačna sekvenca datog molekula crRNA ili tracrRNA može se dizajnirati tako da bude specifična za vrstu u kojoj će se upotrebljavati molekuli RNK. Videti, na primer, Mali et al. (2013) Science 339:823-826; Jinek et al. (2012) Science 337:816-821; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol.
31:227-229; Jiang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31:233-239; i Cong et al. (2013) Science 339:819-823.
[0080] DNK-usmeravajući segment (crRNA) date gRNA sadrži nukleotidnu sekvencu koja je komplementarna sa sekvencom u ciljnoj DNK. DNK-usmeravajući segment gRNA interaguje sa ciljnom DNK na način specifičan za sekvencu putem hibridizacije (tj. sparivanja baza). Kao takva, nukleotidna sekvenca DNK-usmeravajućeg segmenta može varirati i određuje lokaciju unutar ciljne DNK sa kojom će gRNA i ciljna DNK interagovati. DNK-usmeravajući segment subjektne gRNA može se modifikovati tako da hibridizuje sa bilo kojom željenom sekvencom unutar ciljne DNK. crRNA koje se javljaju u prirodi razlikuju se zavisno od Cas9 sistema i organizma ali često sadrže usmeravajući segment dužine između 21 i 72 nukleotida, omeđen sa bočnih strana sa dva direktna ponovka (DR), dužine između 21 i 46 nukleotida (videti npr. WO2014/131833). U slučaju S. pyogenes, DR su dugački 36 nukleotida i usmeravajući segment je dugačak 30 nukleotida. DR koji je smešten na 3ꞌ komplementaran je i hibridizuje sa odgovarajućom tracrRNA, koja se zauzvrat vezuje za Cas9 protein.
[0081] DNK-usmeravajući segment može imati dužinu od oko 12 nukleotida do oko 100 nukleotida. Na primer, DNK-usmeravajući segment može imati dužinu od oko 12 nukleotida
2
(nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, ili od oko 12 nt do oko 19 nt. Alternativno, DNK-usmeravajući segment može imati dužinu od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 19 nt do oko 70 nt, od oko 19 nt do oko 80 nt, od oko 19 nt do oko 90 nt, od oko 19 nt do oko 100 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, od oko 20 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 70 nt, od oko 20 nt do oko 80 nt, od oko 20 nt do oko 90 nt, ili od oko 20 nt do oko 100 nt.
[0082] Nukleotidna sekvenca DNK-usmeravajućeg segmenta koja je komplementarna nukleotidnoj sekvenci (CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje) ciljne DNK može imati dužinu najmanje oko 12 nt. Na primer, DNK-usmeravajuća sekvenca (tj. sekvenca unutar DNK-usmeravajućeg segmenta koja je komplementarna CRISPR RNK sekvenci za prepoznavanje unutar ciljne DNK) može imati dužinu najmanje oko 12 nt, najmanje oko 15 nt, najmanje oko 18 nt, najmanje oko 19 nt, najmanje oko 20 nt, najmanje oko 25 nt, najmanje oko 30 nt, najmanje oko 35 nt, ili najmanje oko 40 nt. Alternativno, DNK-usmeravajuća sekvanca može imati dužinu od oko 12 nukleotida (nt) do oko 80 nt, od oko 12 nt do oko 50 nt, od oko 12 nt do oko 45 nt, od oko 12 nt do oko 40 nt, od oko 12 nt do oko oko 35 nt, od oko 12 nt do oko 30 nt, od oko 12 nt do oko 25 nt, od oko 12 nt do oko 20 nt, od oko 12 nt do oko 19 nt, od oko 19 nt do oko 20 nt, od oko 19 nt do oko 25 nt, od oko 19 nt do oko 30 nt, od oko 19 nt do oko 35 nt, od oko 19 nt do oko 40 nt, od oko 19 nt do oko 45 nt, od oko 19 nt do oko 50 nt, od oko 19 nt do oko 60 nt, od oko 20 nt do oko 25 nt, od oko 20 nt do oko 30 nt, od oko 20 nt do oko 35 nt, od oko 20 nt do oko 40 nt, od oko 20 nt do oko 45 nt, od oko 20 nt do oko 50 nt, ili od oko 20 nt do oko 60 nt. U nekim slučajevima, DNK-usmeravajuća sekvenca može imati dužinu od oko 20 nt.
[0083] tracrRNA mogu biti u bilo kom obliku (npr. tracrRNA pune dužine ili aktivne delimične tracrRNA) i različitih dužina. Mogu uključivati primarne transkripte ili obrađene oblike. Na primer, tracrRNA (kao deo jedno-vodeće RNK ili kao odvojeni molekul kao deo dvo-molekulske gRNA) može sadržati ili se sastojati od cele ili dela sekvence tracrRNA divljeg tipa (npr. oko ili više od oko 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ili više nukleotida sekvence tracrRNA divljeg tipa). Primeri sekvenci tracrRNA divljeg tipa od S. pyogenes uključuju verzije od 171 nukleotida, 89 nukleotida, 75 nukleotida, i 65 nukleotida. Videti, na primer, Deltcheva et al. (2011) Nature 471:602-607; WO 2014/093661. Primeri tracrRNA unutar jedno-vodećih RNK (sgRNA) uključuju segmente tracrRNA koji se nalaze unutar 48, 54, 67, i 85 verzija sgRNA, gde "+n" ukazuje da je do n nukleotida tracrRNA divljeg tipa uključeno u sgRNA. Videti US 8,697,359.
[0084] Procenat komplementarnosti između DNK-usmeravajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje unutar ciljne DNK može biti najmanje 60% (npr. najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100%). Procenat komplementarnosti između DNK-usmeravajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje unutar ciljne DNK može biti najmanje 60% duž oko 20 neprekidnih nukleotida. Kao primer, procenat komplementarnosti između DNK-usmeravajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje unutar ciljne DNK je 100% duž 14 neprekidnih nukleotida na 5' kraju CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje unutar komplementarnog lanca ciljne DNK i tako nizak kao 0% duž ostatka. U takvom slučaju, može se smatrati da je DNK-usmeravajuća sekvenca dugačka 14 nukleotida. Kao drugi primer, procenat komplementarnosti između DNK-usmeravajuće sekvence i CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje unutar ciljne DNK je 100% duž sedam neprekidnih nukleotida na 5' kraju CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje unutar komplementarnog lanca ciljne DNK i tako nizak kao 0% duž ostatka. U takvom slučaju, može se smatrati da je DNK-usmeravajuća sekvenca dugačka 7 nukleotida.
[0085] Protein-vezujući segment gRNA može sadržati dva niza nukleotida koji su komplementarni jedan drugom. Komplementarni nukleotidi protein-vezujućeg segmenta hibridizuju da formiraju dvolančani RNK dupleks (dsRNA). Protein-vezujući segment subjektne gRNA interaguje sa Cas proteinom, i gRNA usmerava vezani Cas protein na specifičnu nukleotidnu sekvencu unutar ciljne DNK putem DNK-usmeravajućeg segmenta.
[0086] Vodeće RNK mogu uključivati modifikacije ili sekvence koje obezbeđuju dodatne poželjne karakteristike (npr. modifikovanu ili regulisanu stabilnost; subćelijsko ciljno delovanje; praćenje sa fluorescentnim obeleživačem; vezujuće mesto za protein ili proteinski kompleks; i slično). Primeri takvih modifikacija uključuju, na primer, 5' kapu (npr. 7 metilguanilat kapu (m7G)); 3' poliadenilisani rep (tj. 3' poly(A) rep); riboswitch sekvencu (npr. da se omogući regulisana stabilnost i/ili regulisana dostupnost proteinima i/ili proteinskim kompleksima); sekvencu kontrole stabilnosti; sekvencu koja formira dsRNA dupleks (tj. ukosnicu); modifikaciju ili sekvencu koja usmerava RNK na subćelijsku lokaciju (npr. nukleus, mitohondrije, hloroplaste, i slično); modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje praćenje (npr. direktna konjugacija sa fluorescentnim molekulom, konjugacija sa grupom koja olakšava fluorescentno detektovanje, sekvenca koja omogućava fluorescentno detektovanje, i
1
tako dalje); modifikaciju ili sekvencu koja obezbeđuje mesto za vezivanje za proteine (npr. proteini koji deluju na DNK, uključujući transkripcione aktivatore, transkripcione represore, DNK metiltransferaze, DNK demetilaze, histon acetiltransferaze, histon deacetilaze, i slično); i njihove kombinacije.
[0087] Vodeće RNK se mogu obezbediti u bilo kom obliku. Na primer, gRNA se može obezbediti u obliku RNK, bilo kao dva molekula (odvojena crRNA i tracrRNA) ili kao jedan molekul (sgRNA), i opciono u obliku kompleksa sa Cas proteinom. gRNA se takođe može obezbediti u obliku DNK koja kodira RNK. DNK koja kodira gRNA može da kodira jedan RNK molekul (sgRNA) ili odvojene RNK molekule (npr. odvojene crRNA i tracrRNA). U potonjem slučaju, DNK koja kodira gRNA može se obezbediti kao odvojeni DNK molekuli koji kodiraju crRNA i tracrRNA, respektivno.
[0088] DNK koje kodiraju gRNA mogu se stabilno integrisati u genom ćelije i operativno povezati sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. Alternativno, DNK koje kodiraju gRNA mogu se operativno povezati sa promotorom u ekspresionom konstruktu. Takvi promotori mogu biti aktivni, na primer, u pluripotentnoj ćeliji pacova, eukariotskoj, sisarskoj, ćeliji nehumanog sisara, humanoj ćeliji, ćeliji glodara, miša, ili hrčka. U nekim slučajevima, promotor je promotor RNK polimeraze III, kao što je humani U6 promotor, promotor U6 polimeraze III pacova, ili promotor U6 polimeraze III miša. Primeri drugih promotora su ovde opisani na drugom mestu.
[0089] Alternativno, gRNA se mogu pripremiti različitimim drugim postupcima. Na primer, gRNA se mogu pripremiti pomoću in vitro transkripcije upotrebom, na primer, T7 RNK polimeraze (videti, na primer, WO 2014/089290 i WO 2014/065596). Vodeće RNK takođe mogu biti sintetički proizveden molekul pripremljen hemijskom sintezom.
iii. CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje
[0090] Termin "CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje" uključuje sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK za koje će se DNK-usmeravajući segment gRNA vezati, pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje. Na primer, CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje uključuju sekvence za koje je vodeća RNK dizajnirana da ima komplementarnost, gde hibridizacija između CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje i DNK-usmeravajuće sekvence promoviše formiranje CRISPR kompleksa. Potpuna komplementarnost nije nužno neophodna, pod uslovom da postoji dovoljna komplementarnost da izazove hibridizaciju i promoviše formiranje CRISPR kompleksa.
2
CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje takođe uključuju mesta isecanja za Cas proteine, detaljnije opisana u daljem tekstu. CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje može sadržati bilo koji polinukleotid, koji može biti smešten, na primer, u nukleusu ili citoplazmi ćelije ili unutar organele ćelije, kao što je mitohondrija ili hloroplast.
[0091] CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje unutar ciljne DNK može se ciljati od strane (tj. vezati od strane, ili hibridizovati sa, ili biti komplementaran) Cas proteinu ili gRNA. Pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK uključuju fiziološke uslove koji su normalno prisutni u ćeliji. Drugi uslovi pogodni za vezivanje DNK/RNK (npr. uslovi u sistemu bez ćelija) su poznati u struci (videti, npr, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)). Lanac ciljne DNK koji je komplementaran i hibridizuje sa Cas proteinom ili gRNA može se nazvati "komplementarni lanac", i lanac ciljne DNK koji je komplementaran "komplementarnom lancu" (i samim tim nije komplementaran Cas proteinu ili gRNA) može se nazvati "nekomplementarni lanac" ili "templat lanac".
[0092] Cas protein može isecati nukleinsku kiselinu na mestu unutar ili izvan sekvence nukleinske kiseline koja je prisutna u ciljnoj DNK za koju će se vezati DNK-usmeravajući segment gRNA. "Mesto isecanja" uključuje poziciju nukleinske kiseline na kojoj Cas protein stvara jednolančani prekid ili dvolančani prekid. Na primer, formiranje CRISPR kompleksa (koji sadrži gRNA hibridizovanu sa CRISPR RNK sekvencom za prepoznavanje i u kompleksu sa Cas proteinom) može rezultirati isecanjem jednog ili oba lanca u ili blizu (npr. unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, ili više baznih parova od) sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK za koju će se vezati DNK-usmeravajući segment gRNA. Ukoliko je mesto isecanja izvan sekvence nukleinske kiseline za koju će se DNK-usmeravajući segment gRNA vezati, ipak se smatra da se mesto isecanja nalazi u "CRISPR RNK sekvenci za prepoznavanje". Mesto isecanja može biti na samo jednom lancu ili na oba lanca nukleinske kiseline. Mesta isecanja mogu biti na istoj poziciji na oba lanca nukleinske kiseline (proizvodeći tupe krajeve) ili se mogu biti na različitim mestima na svakom lancu (proizvodeći stepenaste krajeve). Stepenasti krajevi mogu se proizvesti, na primer, upotrebom dva Cas proteina, od kojih svaki proizvodi jednolančani prekid na različitom mestu isecanja na svakom lancu, stvarajući tako dvolančani prekid. Na primer, prva nikaza može stvoriti jednolančani prekid na prvom lancu dvolančane DNK (dsDNA), i druga nikaza može stvoriti jednolančani prekid na drugom lancu dsDNA, stvarajući tako viseće sekvence. U nekim slučajevima, CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje nikaze na prvom lancu je odvojena od CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje nikaze na drugom lancu pomoću najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, ili 1.000 baznih parova.
[0093] Isecanje ciljne DNK specifično za mesto od strane Cas9 može se desiti na lokacijama određenim i (i) komplementarnošću baznog sparivanja između gRNA i ciljne DNK i (ii) kratkim motivom, zvanim protospejser susednog motiva (PAM), u ciljnoj DNK. PAM može omeđiti sa bočnih strana CRISPR RNK sekvencu za prepoznavanje. Opciono, CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje može biti omeđena sa bočnih strana PAM-om. Na primer, mesto isecanja Cas9 može biti oko 1 do oko 10 ili oko 2 do oko 5 baznih parova (npr.3 bazna para) uzvodno ili nizvodno od PAM sekvence. U nekim slučajevima (npr. kada je Cas9 od S. pyogenes ili se upotrebljava usko srodna Cas9), PAM sekvenca nekomplementarnog lanca može biti 5'-N1GG-3', gde je N1bilo koji DNK nukleotid i neposredno je 3' od CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje nekomplementarnog lanca ciljne DNK. Kao takva, PAM sekvenca komplementarnog lanca bila bi 5-CC N2-3', gde je N2bilo koji DNK nukleotid i neposredno je 5' od CRISPR RNK sekvence za prepoznavanje komplementarnog lanca ciljne DNK. U nekim takvim slučajevima, N1i N2mogu biti komplementarni i N1-N2bazni par može biti bilo koji bazni par (npr. N1=C i N2=G; N1=G i N2=C; N1=A i N2=T, N1=T, i N2=A).
[0094] Primeri CRISPR RNK sekvenci za prepoznavanje uključuju DNK sekvencu koja je komplementarna DNK-usmeravajućem segmentu gRNA, ili takvu DNK sekvencu pored PAM sekvence. Na primer, ciljni motiv može biti 20-nukleotidna DNK sekvenca neposredno pre NGG motiva koji prepoznaje Cas protein (videti, na primer, WO 2014/165825). Guanin na 5' kraju može olakšati transkripciju od strane RNK polimeraze u ćelijama. Drugi primeri CRISPR RNK sekvenci za prepoznavanje mogu uključivati dva nukleotida guanina na 5' kraju kako bi se olakšala efikasna transkripcija od strane T7 polimeraze in vitro. Videti, na primer, WO 2014/065596.
[0095] CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje može biti bilo koja sekvenca nukleinske kiseline endogena ili egzogena za ćeliju. CRISPR RNK sekvenca za prepoznavanje može biti sekvenca koja kodira proizvod gena (npr. protein) ili nekodirajuća sekvenca (npr. regulatorna sekvenca) ili može uključivati obe. U jednom primeru izvođenja, ciljna sekvenca je neposredno omeđena sa bočnih strana protospejser susednog motiva (PAM) sekvencom. U jednom primeru izvođenja, lokus od interesa sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1. U jednom primeru izvođenja, gRNA sadrži treću sekvencu nukleinske kiseline koja kodira grupisane kratke palindromske ponovke na jednakim rastojanjima (CRISPR) RNK (crRNA) i trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA). U drugom primeru izvođenja, genom pluripotentne ćelije pacova sadrži ciljni DNK region koji je komplementaran ciljnoj sekvenci. U nekim takvim postupcima, Cas protein je Cas9. U nekim primerima izvođenja, gRNA sadrži (a) himernu RNK sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 2; ili (b) himernu RNK
4
sekvence nukleinske kiseline SEQ ID NO: 3. U nekim takvim postupcima, crRNA sadrži sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, ili SEQ ID NO: 6. U nekim takvim postupcima, tracrRNA sadrži sekvencu koja je izneta u SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8.
[0096] Takođe su obezbeđene aktivne varijante i fragmenti agenasa nukleaze (tj. projektovani agens nukleaze). Takve aktivne varijante mogu sadržati najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sekvence nativnom agensu nukleaze, pri čemu aktivne varijante zadržavaju sposobnost da seku na željenom mestu za prepoznavanje i stoga zadržavaju aktivnost indukovanja nika ili dvolančanog prekida. Na primer, bilo koji od agenasa nukleaze ovde opisani mogu biti modifikovani od sekvence nativne endonukleaze i dizajnirani da prepoznaju i indukuju nik ili dvolančani prekid na mestu za prepoznavanje koje nije prepoznato od strane nativnog agensa nukleaze. Stoga, u nekim primerima izvođenja, projektovana nukleaza ima specifičnost da indukuje nik ili dvolančani prekid na mestu za prepoznavanje koje se razlikuje od odgovarajućeg mesta za prepoznavanje nativnog agensa nukleaze. Testovi za aktivnost indukovanja nika ili dvolančanog prekida su poznati i uopšteno mere ukupnu aktivnost i specifičnost endonukleaze na DNK supstratima koji sadrže mesto za prepoznavanje.
[0097] Na primer, Sl. 3 prikazuje pozicije ZFN vezujućih mesta i mesta sečenja na selekcionim kasetama. Mesta su sledeća: Neo-ZFN(1,2): VEZUJUĆE MESTO NUKLEAZE/mesto sečenja GGGCGCCCGGTTCTTTTT/gtcaag/ACCGACCTGTCCGGTG (SEQ ID NO: 9); Neo-ZFN(3,4): VEZUJUĆE MESTO NUKLEAZE/mesto sečenja CCGGTTCTTTTTGTC/aagacc/GACCTGTCCGGTGCC (SEQ ID NO: 10); Hyg-ZFN(1,2): VEZUJUĆE MESTO NUKLEAZE/mesto sečenja TGCGATCGCTGCGGCCGA/tcttag/CCAGACGAGCGGGTTCGG (SEQ ID NO: 11); i, Hyg-ZFN(3,4): VEZUJUĆE MESTO NUKLEAZE/mesto sečenja CGCTGCGGCCGATCT/tagcca/GACGAGCGGGTTCGG (SEQ ID NO: 12).
[0098] Agens nukleaze se može introdukovati u ćeliju bilo kojim načinom poznatim u struci. Polipeptid koji kodira agens nukleaze može se direktno introdukovati u ćeliju. Alternativno, polinukleotid koji kodira agens nukleaze može se introdukovati u ćeliju. Kada se polinukleotid koji kodira agens nukleaze introdukuje u ćeliju, agens nukleaze može se prolazno, kondicionalno ili konstitutivno eksprimirati unutar ćelije. Stoga, polinukleotid koji kodira agens nukleaze može biti sadržan u ekspresionoj kaseti i operativno povezan sa kondicionalnim promotorom, inducibilnim promotorom, konstitutivnim promotorom ili tkivno-specifičnim promotorom. Takvi promotori od interesa detaljnije se ovde razmatraju na drugim mestima. Alternativno, agens nukleaze se introdukuje u ćeliju kao iRNK koja kodira agens nukleaze.
[0099] U specifičnim primerima izvođenja, polinukleotid koji kodira agens nukleaze je stabilno integrisan u genom ćelije i operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. U drugim primerima izvođenja, polinukleotid koji kodira agens nukleaze je u istom vektoru koji ciljno deluje koji sadrži insertovani polinukleotid, dok je u drugim slučajevima polinukleotid koji kodira agens nukleaze u vektoru ili plazmidu koji je odvojen od vektora koji ciljno deluje koji sadrži insertovani polinukleotid.
[0100] Kada se agens nukleaze obezbeđuje ćeliji introdukovanjem polinukleotida koji kodira agens nukleaze, takav polinukleotid koji kodira agens nukleaze može biti modifikovan da supstituiše kodone koji imaju veću učestalost upotrebe u ćeliji od interesa, u poređenju sa polinukleotidnom sekvencom koja kodira agens nukleaze koja se javlja u prirodi. Na primer polinukleotid koji kodira agens nukleaze može biti modifikovan da supstituiše kodone koji imaju veću učestalost upotrebe u datoj prokariotskoj ili eukariotskoj ćeliji od interesa, uključujući bakterijsku ćeliju, ćeliju kvasca, humanu ćeliju, ne-humanu ćeliju, ćeliju sisara, ćeliju glodara, ćeliju miša, ćeliju pacova ili bilo koju drugu ćeliju domaćina od interesa, u poređenju sa polinukleotidnom sekvencom koja se javlja u prirodi.
B. Selekcioni markeri
[0101] Različiti postupci i kompozicije koji su ovde obezbeđeni koriste agense nukleaze i njihova odgovarajuća mesta za prepoznavanje u kombinaciji sa selekcionim markerima. Kako je ovde razmatrano, pozicija mesta za prepoznavanje u polinukleotidu koji kodira selekcioni marker omogućava efikasan postupak kojim se mogu prepoznati događaji integracije na ciljnom lokusu. Pored toga, ovde su obezbeđeni različiti postupci pri čemu se koriste alternirajući selekcioni markeri koji imaju mesto za prepoznavanje nukleaze radi poboljšanja efikasnosti i delotvornosti kojima se više polinukleotida od interesa integriše unutar datog ciljanog lokusa.
[0102] U ovde objavljenim postupcima i kompozicijama mogu se upotrebljavati različiti selekcioni markeri. Takvi selekcioni markeri mogu, na primer, davati rezistenciju na antibiotik kao što je G418, higromicin, blastocidin, neomicin, ili puromicin. Takvi selekcioni markeri uključuju neomicin fosfotransferazu (neo<r>), higromicin B fosfotransferazu (hyg<r>), puromicin-N-acetiltransferazu (puror), i blasticidin S deaminazu (bsr<r>). U još nekim drugim primerima izvođenja, selekcioni marker je operativno povezan sa inducibilnim promotorom i ekspresija selekcionog markera je toksična za ćeliju. Neograničavajući primeri takvih selekcionih markera uključuju ksantin/guanin fosforibozil transferazu (gpt), hipoksantinguanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu herpes simplex virusa (HSV-TK).
[0103] Polinukleotid koji kodira selekcione markere je operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. Takve ekspresione kasete i njihove različite regulatorne komponente detaljnije se ovde razmatraju na drugim mestima.
C. Ciljni lokus
[0104] Obezbeđeni su različiti postupci i kompozicije koje omogućavaju integraciju najmanje jednog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus. Termin "ciljni lokus" sadrži bilo koji segment ili region DNK u koji se želi integrisati insertovani polinukleotid. U jednom primeru izvođenja, ciljni lokus je genski lokus. Ciljni lokus može biti nativan za ćeliju, ili alternativno može sadržati heterologni ili egzogeni segment DNK. Takvi heterologni ili egzogeni segmenti DNK mogu uključivati transgene, ekspresione kasete, polinukleotide koji kodiraju selekcione markere, ili heterologne ili egzogene regione DNK (tj. heterologne ili egzogene regione genske DNK). Ciljni lokus može sadržati bilo koji od ciljanih sistema integracije uključujući, na primer, mesto za prepoznavanje, selekcioni marker, prethodno integrisane insertovane polinukleotide, polinukleotide koji kodiraju agense nukleaze, promotore, itd. Alternativno, ciljni lokus može biti smešten unutar veštačkog hromozoma kvasca (YAC), veštačkog bakterijskog hromozoma (BAC), humanog veštačkog hromozoma, ili bilo kog drugog projektovanog genskog regiona koji se nalazi u odgovarajućoj ćeliji domaćinu. Stoga, u specifičnim primerima izvođenja, ciljani lokus može sadržati nativnu, heterolognu ili egzogenu sekvencu genske nukleinske kiseline iz prokariota, eukariota, kvasca, bakterija, nehumanog sisara, ne-humane ćelije, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, goveda, jelena, ovce, koze, kokoške, mačke, psa, feretke, primata (npr. marmoset, rezus majmun), pripitomljenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo kog drugog organizma od interesa ili njihove kombinacije.
[0105] Neograničavajući primeri ciljnog lokusa uključuju, genski lokus koji kodira protein eksprimiran u B ćeliji, genski lokus koji eksprimira polipeptid u nezreloj B ćeliji, genski lokus koji eksprimira polipeptid u zreloj B ćeliji, lokuse imunoglobulina (Ig), ili lokuse T ćelijskog receptora, uključujući na primer alfa lokus T ćelijskog receptora. Takav lokus može biti od ptice (npr. kokoške), ne-humanog sisara, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinje, goveda, jelena, ovce, koze, mačke, psa, feretke, primata (npr. marmoset, rezus majmun), pripitomljenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo kog drugog organizma od interesa ili njihove kombinacije.
[0106] U dodatnim primerima izvođenja, ciljani lokus nije moguće ciljati upotrebom konvencionalnog postupka ili se može ciljati samo pogrešno ili samo sa značajno niskom efikasnošću, u odsustvu nika ili dvolančanog prekida izazvanog angensom nukleaze.
D. Vektori koji ciljno deluju i insertovani polinukleotidi
[0107] Kako je naznačeno iznad, ovde obezbeđeni postupci i kompozicije iskorišćavaju agense nukleaze i strateško pozicioniranje mesta za prepoznavanje za agens nukleaze unutar selekcione kasete u kombinaciji sa događajem homologne rekombinacije. Takvi postupci koriste nik ili dvolančani prekid na mestu za prepoznavanje u kombinaciji sa homolognom rekombinacijom kako bi se na taj način ciljala integracija insertovanog polinukleotida u ciljni lokus. "Homologna rekombinacija" se upotrebljava konvencionalno da uključi razmenu DNK fragmenata između dva DNK molekula na cross-over mestima unutar regiona homologije.
i. Insertovani polinukleotid
[0108] Termin "insertovani polinukleotid" sadrži segment DNK koji se želi integrisati u ciljni lokus. U jednom primeru izvođenja, insertovani polinukleotid sadrži jedan ili više polinukleotida od interesa. U drugim primerima izvođenja, insertovani polinukleotid može sadržati jednu ili više ekspresionih kaseta. Data ekspresiona kaseta može sadržati polinukleotid od interesa, polinukleotid koji kodira selekcioni marker i/ili reporterski gen zajedno sa različitim regulatornim komponentama koje utiču na ekspresiju. Neograničavajući primeri polinukleotida od interesa, selekcionih markera, i reporterskih gena (npr. eGFP) koji mogu biti uključeni unutar insertovanog polinukleotida detaljno se ovde razmatraju na drugim mestima.
[0109] U specifičnim primerima izvođenja, insertovani polinukleotid može sadržati gensku nukleinsku kiselinu. U jednom primeru izvođenja, genska nukleinska kiselina je izvedena iz miša, čoveka, glodara, ne-čoveka, pacova, hrčka, zeca, svinje, goveda, jelena, ovce, koze, kokoške, mačke, psa, feretke, primata (npr. marmoset, rezus majmun), pripitomljenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo kog drugog organizma od interesa ili njihove kombinacije.
[0110] U dodatnim primerima izvođenja, insertovani polinukleotid sadrži kondicionalni alel. U jednom primeru izvođenja, kondicionalni alel je multifunkcionalni alel, kao što je opisano u US 2011/0104799. U specifičnim primerima izvođenja, kondicionalni alel sadrži: (a) pobuđujuću sekvencu u sens orijentaciji u odnosu na transkripciju ciljnog gena, i selekcionu kasetu leka u sens ili antisens orijentaciji; (b) u antisens orijentaciji nukleotidnu sekvencu od interesa (NSI) i kondicionalnu pomoću inverzionog modula (COIN, koji koristi intron koji deli egzon i invertibilni genskoj zamci-sličan (eng. genetrap-like) modul; videti, na primer, US 2011/0104799); i (c) jedinice koje se mogu rekombinovati koje se rekombinuju nakon izlaganja prvoj rekombinazi da formiraju kondicionalni alel koji (i) nema pobuđujuću sekvencu i DSC, i (ii) sadrži NSI u sens orijentaciji i COIN u antisens orijentaciji.
[0111] Insertovani polinukleotid može biti od oko 5kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10 kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb.
[0112] U specifičnim primerima izvođenja, insertovani polinukleotid sadrži nukleinsku kiselinu omeđenu sa bočnih strana sa ciljnim sekvencama rekombinacije specifične za mesto. Prepoznato je da dok ceo insertovani polinukleotid može biti omeđen sa bočnih strana takvom ciljnom sekvencom rekombinacije specifične za mesto, bilo koji region ili individualni polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida može takođe biti omeđen sa bočnih strana takvim mestima. Termin "mesto rekombinacije" uključuje nukleotidnu sekvencu koja je prepoznata od strane rekombinaze specifične za mesto i koja može služiti kao supstrat za događaj rekombinacije. Termin "rekombinaza specifična za mesto" uključuje grupu enzima koji mogu olakšati rekombinaciju između mesta rekombinacije gde su dva mesta rekombinacije fizički odvojena unutar jednog molekula nukleinske kiseline ili na odvojenim molekulima nukleinske kiseline. Primeri rekombinaze specifične za mesto uključuju, ali nisu ograničeni na, Cre, Flp, i Dre rekombinaze. Rekombinaza specifična za mesto može se introdukovati u ćeliju bilo kojim načinima, uključujući introdukovanjem polipeptida rekombinaze u ćeliju ili introdukovanjem polinukleotida koji kodira rekombinazu specifičnu za mesto u ćeliju domaćina. Polinukleotid koji kodira rekombinazu specifičnu za mesto može biti smešten unutar insertovanog polinukleotida ili unutar odvojenog polinukleotida. Rekombinaza specifična za mesto može biti operativno povezana sa promotorom koji je aktivan u ćeliji, uključujući, na primer, inducibilni promotor, promotor koji je endogen za ćeliju, promotor koji je heterologan za ćeliju, promotor specifičan za ćeliju, tkivno-specifičan promotor, ili promotor koji je specifičan za razvojnu fazu. Ciljne sekvence rekombinacije specifične za mesto koje mogu omeđiti sa bočnih strana insertovani polinukleotid ili bilo koji polinukleotid od interesa u insertovanom polinukleotidu mogu uključivati, ali nisu ograničene na, loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2, lox5171, FRT, FRT11, FRT71, attp, att, FRT, rox, i njihovu kombinaciju.
[0113] U drugim primerima izvođenja, mesta rekombinacije specifična za mesto omeđavaju sa bočnih strana polinukleotid koji kodira selekcioni marker i/ili reporterski gen koji se nalazi unutar insertovanog polinukleotida. U takvim slučajevima nakon integracije insertovanog polinukleotida na ciljanom lokusu sekvence između mesta rekombinacije specifičnih za mesto mogu biti uklonjene.
[0114] U jednom primeru izvođenja, insertovani polinukleotid sadrži polinukleotid koji kodira selekcioni marker. Takvi selekcioni markeri uključuju, ali nisu ograničeni na, neomicin fosfotransferazu (neor), higromicin B fosfotransferazu (hygr), puromicin-N-acetiltransferazu (puror), blasticidin S deaminazu (bsrr), ksantin/guanin fosforibozil transferazu (gpt), ili timidin kinazu herpes simplex virusa (HSV-k), ili njihovu kombinaciju. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid koji kodira selekcioni marker operativno je povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. Kada se serijski popločaju polinukleotidi od interesa u ciljanom lokusu (tj. genskom lokusu), selekcioni marker može sadržati mesto za prepoznavanje za agens nukleaze, kao što je istaknuto iznad. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid koji kodira selekcioni marker je omeđen sa bočnih strana ciljnim sekvencama rekombinacije specifične za mesto.
[0115] Insertovani polinukleotid može dodatno sadržati reporterski gen koji je operativno povezan sa promotorom, pri čemu reporterski gen kodira reporterski protein odabran iz grupe koja se sastoji od LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, poboljšanog žutog fluorescentnog proteina (EYFP), Emeralda, poboljšanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP), CyPet, cijan fluorescentnog proteina (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferaze, alkalne fosfataze, i njihove kombinacije. Takvi reporterski geni mogu se operativno povezati sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za reporterski gen ili ćeliju, promotor koji je heterologan za reporterski gen ili ćeliju, promotor specifičan za ćeliju, tkivno-specifičan promotor ili promotor koji je specifičan za razvojnu fazu.
ii. Vektori koji ciljno deluju
4
[0116] Vektori koji ciljno deluju se koriste da introdukuju insertovani polinukleotid u ciljani lokus. Vektor koji ciljno deluje sadrži insertovani polinukleotid i dodatno sadrži uzvodnu i nizvodnu homolognu granu, koje omeđavaju sa bočnih strana insertovani polinukleotid. Homologne grane, koje omeđavaju sa bočnih strana insertovani polinukleotid, odgovaraju regionima unutar ciljanog lokusa. Radi lakšeg pozivanja, odgovarajući regioni unutar ciljanog lokusa ovde se označavaju kao "ciljna mesta". Stoga, u jednom primeru, vektor koji ciljno deluje može sadržati prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu smeštenom u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker. Kao takav, vektor koji ciljno deluje time pomaže u integraciji insertovanog polinukleotida u ciljani lokus kroz događaj homologne rekombinacije koji se događa između homolognih grana i odgovarajućih ciljnih mesta, na primer, unutar genoma ćelije.
[0117] Homologna grana vektora koji ciljno deluje može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoviše događaj homologne rekombinacije sa odgovarajućim ciljnim mestom, uključujući na primer, 50-100 baza, 100-1000 baza ili najmanje dugačka 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5- 50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 100-200, ili 200-300 kilobaza ili više. Kao što je detaljnije istaknuto ispod, veliki vektori koji ciljno deluju mogu koristiti grane koje ciljno deluju veće dužine.
[0118] Ciljna mesta unutar ciljanog lokusa koja odgovaraju uzvodnim i nizvodnim homolognim granama vektora koji ciljno deluje su smeštena u "dovoljnoj blizini mesta za prepoznavanje" smeštenog u polinukleotidu koji kodira selekcioni marker. Uzvodne i nizvodne homologne grane vektora koji ciljno deluje su "smeštene u dovoljnoj blizini" mesta za prepoznavanje gde je udaljenost takva da promoviše dešavanje događaja homologne rekombinacije između ciljnih mesta i homolognih grana nakon nika ili dvolančanog prekida na mestu za prepoznavanje. Stoga, u specifičnim primerima izvođenja, ciljna mesta koja odgovaraju uzvodnoj i/ili nizvodnoj homolognoj grani vektora koji ciljno deluje su unutar najmanje 1 nukleotida od datog mesta za prepoznavanje, su unutar najmanje 10 nukleotida do oko 14 kb od datog mesta za prepoznavanje ili su unutar oko 10 nukleotida do oko 100 nukleotida, oko 100 nukleotida do oko 500 nukleotida, oko 500 nukleotida do oko 1000 nukleotida, oko 1 kb do oko 5 kb, oko 5 kb do oko 10 kb, ili oko 10 kb do oko 14 kb od datog mesta za prepoznavanje. U specifičnim primerima izvođenja, mesto za prepoznavanje je neposredno pored najmanje jednog ili oba ciljna mesta.
[0119] Prostorni odnos ciljnih mesta koja odgovaraju homolognim granama vektora koji ciljno deluje i mesta za prepoznavanje unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker može varirati. Na primer, ciljna mesta mogu biti smeštena 5ꞌ do mesta za prepoznavanje, oba ciljna mesta mogu biti smeštena 3ꞌ do mesta za prepoznavanje, ili ciljna mesta mogu omeđavati sa bočnih strana mesto za prepoznavanje.
[0120] Homologna grana i ciljno mesto "odgovaraju" ili su "odgovarajuća" jedno drugom kada dva regiona dele dovoljan nivo identičnosti sekvence jedan sa drugim kako bi delovali kao supstrati za reakciju homologne rekombinacije. Pod "homolognim" se podrazumevaju DNK sekvence koje su ili identične ili dele identičnost sekvence sa odgovarajućom sekvencom. Identičnost sekvence između datog ciljnog mesta i odgovarajuće homologne grane koja se nalazi na vektoru koji ciljno deluje može biti bilo koji stepen identičnosti sekvence koji omogućava da se desi homologna rekombinacija. Na primer, količina identičnosti sekvence koju dele homologna grana vektora koji ciljno deluje (ili njegov fragment) i ciljno mesto (ili njegov fragment) može biti najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnosti sekvence, tako da sekvence podležu homolognoj rekombinaciji. Štaviše, odgovarajući region homologije između homologne grane i odgovarajućeg ciljnog mesta može biti bilo koje dužine koja je dovoljna da promoše homolognu rekombinaciju na isečenom mestu za prepoznavanje. Na primer, data homologna grana i/ili odgovarajuće ciljno mesto može sadržati odgovarajuće regione homologije koji su dugački najmanje oko 50-100 baza, 100-1000 baza, ili 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 100-200, ili 200-300 kilobaza ili više (kao što je opisano u LTVEC vektorima ovde opisanim na drugom mestu) tako da homologna grana ima dovoljnu homologiju da podleže homolognoj rekombinaciji sa odgovarajućim ciljnim mestima unutar genoma ćelije.
[0121] Radi lakšeg pozivanja, homologne grane uključuju uzvodnu i nizvodnu homolognu granu. Ova terminologija se odnosi na relativnu poziciju homolognih grana u odnosu na insertovani polinukleotid unutar vektora koji ciljno deluje.
[0122] Homologne grane vektora koji ciljno deluje su prema tome dizajnirane da odgovaraju ciljnom mestu sa ciljanim lokusom. Stoga, homologne grane mogu odgovarati lokusu koji je nativan za ćeliju, ili alternativno one mogu odgovarati regionu heterolognog ili egzogenog segmenta DNK koji je integrisan u genom ćelije, uključujući, ali ne ograničavajući se na transgene, ekspresione kasete, ili heterologne ili egzogene regione DNK. Alternativno, homologne grane vektora koji ciljno deluje mogu odgovarati regionu veštačkog hromozoma kvasca (YAC), veštačkom bakterijskom hromozomu (BAC), veštačkom humanom hromozomu, ili bilo kom drugom projektovanom regionu koji se nalazi u odgovarajućoj ćeliji domaćinu. Ipak dodatno homologne grane vektora koji ciljno deluje mogu odgovarati ili biti izvedene iz regiona biblioteke BAC, biblioteke kozmida, ili biblioteke P1 faga. Stoga, u specifičnim primerima izvođenja, homologne grane vektora koji ciljno deluje odgovaraju lokusu koji je nativan, heterologan ili egzogen za prokariote, kvasac, pticu (npr. kokošku), nehumanog sisara, glodara, čoveka, pacova, miša, hrčka, zeca, svinju, govedo, jelena, ovcu, kozu, mačku, psa, feretku, primata (npr. marmoset, rezus majmun), pripitomljenog sisara ili poljoprivrednog sisara ili bilo koji drugi organizam od interesa. U dodatnim primerima izvođenja, homologne grane odgovaraju lokusu ćelije koju nije moguće ciljati upotrebom konvencionalnog postupka ili se može ciljati samo pogrešno ili samo sa znatno niskom efikasnošću, u odsustvu nika ili dvolančanog prekida indukovanog agensom nukleaze. U jednom primeru izvođenja, homologne grane su izvedene iz sintetičke DNK.
[0123] U još nekim drugim primerima izvođenja, uzvodne i nizvodne homologne grane odgovaraju istom genomu kao ciljani genom. U jednom primeru izvođenja, homologne grane su iz srodnog genoma, npr. ciljani genom je genom miša prvog soja, i grane koje ciljno deluju su iz genoma miša drugog soja, pri čemu su prvi soj i drugi soj različiti. U drugim primerima izvođenja, homologne grane su iz genoma iste životinje ili su iz genoma istog soja, npr. ciljani genom je genom miša prvog soja, i grane koje ciljno deluju su iz genoma miša iz istog miša ili iz istog soja.
[0124] Vektor koji ciljno deluje (kao što je veliki vektor koji ciljno deluje) takođe može sadržati selekcionu kasetu ili reporterski gen kao što se ovde razmatra na drugom mestu. Selekciona kaseta može sadržati sekvencu nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker, pri čemu je sekvenca nukleinske kiseline operativno povezana sa promotorom. Promotor može biti aktivan u prokariotskoj ćeliji od interesa i/ili aktivan u eukariotskoj ćeliji od interesa. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za reporterski gen ili ćeliju, promotor koji je heterologan za reporterski gen ili ćeliju, promotor specifičan za ćeliju, tkivno-specifičan promotor ili promotor koji je specifičan za razvojnu fazu. U jednom primeru izvođenja, selekcioni marker je odabran od neomicin fosfotransferaze (neor), higromicin B fosfotransferaze (hygr), puromicin-N-acetiltransferaze (puror), blasticidin S deaminaze (bsrr), ksantin/guanin fosforibozil transferaze (gpt), i timidin kinaze herpes simplex virusa (HSV-k), i njihovih kombinacija. Selekcioni marker vektora koji ciljno deluje može biti omeđen sa bočnih strana uzvodnim i nizvodnim homolognim granama ili se naći bilo 5ꞌ ili 3ꞌ od homolognih grana.
[0125] U jednom primeru izvođenja, vektor koji ciljno deluje (kao što je veliki vektor koji ciljno deluje) sadrži reporterski gen koji je operativno povezan sa promotorom, pri čemu
4
reporterski gen kodira reporterski protein odabran iz grupe koja se sastoji od LacZ, mPlum, mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, poboljšanog žutog fluorescentnog proteina (EYFP), Emeralda, poboljšanog zelenog fluorescentnog proteina (EGFP), CyPet, cijan fluorescentnog proteina (CFP), Cerulean, T-Sapphire, luciferaze, alkalne fosfataze, i njihovih kombinacija. Takvi reporterski geni mogu biti operativno povezani sa promotorom koji je aktivan u ćeliji. Takvi promotori mogu biti inducibilni promotor, promotor koji je endogen za reporterski gen ili ćeliju, promotor koji je heterologan za reporterski gen ili ćeliju, promotor specifičan za ćeliju, tkivno-specifičan promotor ili promotor koji je specifičan za razvojnu fazu.
[0126] U jednom primeru izvođenja, kombinovana upotreba vektora koji ciljno deluje (uključujući, na primer, veliki vektor koji ciljno deluje) sa agensom nukleaze rezultira povećanom efikasnošću ciljnog delovanja u poređenju sa upotrebom samo vektora koji ciljno deluje. U jednom primeru izvođenja, kada se vektor koji ciljno deluje upotrebljava zajedno sa agensom nukleaze, efikasnost ciljnog delovanja vektora koji ciljno deluje se povećava najmanje dva puta, najmanje tri puta, najmanje četitri puta, ili najmanje 10 puta, kada se poredi sa onim kada sa upotrebljava sam vektor koji ciljno deluje.
iii. Veliki vektori koji ciljno deluju
[0127] Termin "veliki vektor koji ciljno deluje(eng. large largeting vector)" ili "LTVEC" uključuje velike vektore koji ciljno deluju koji sadrže homologne grane koje odgovaraju i izvedene su iz sekvenci nukleinske kiselinske veće od onih koje se uobičajeno upotrebljavaju u drugim pristupima predviđenim za obavljanje homologne rekombinacije u ćelijama i/ili koji sadrže insertovane polinukleotide koji sadrže sekvence nukleinske kiseline veće od onih koje se uobičajeno upotrebljavaju u drugim pristupima predviđenim za obavljanje homologne rekombinacije u ćelijama. U specifičnim primerima izvođena, homologne grane i/ili insertovani polinukleotid LTVEC sadrži gensku sekvencu eukariotske ćelije. Veličina LTVEC-a je prevelika da bi se omogućio pregled događaja ciljnog delovanja konvencionalnim testovima, npr. southern bloting i PCR širokog opsega (npr. 1 kb-5 kb). Primeri LTVEC uključuju, ali nisu ograničeni na, vektore izvedene iz veštačkog bakterijskog hromozoma (BAC), veštačkog humanog hromozoma ili veštačkog hromozoma kvasca (YAC). Neograničavajući primeri LTVEC i postupci za njihovu izradu opisani su, npr. u SAD patentu br.6,586,251, 6,596,541, 7,105,348 i WO 2002/036789 (PCT/US01/45375).
[0128] LTVEC može biti bilo koje dužine, uključujući, ali ne ograničavajući se na, od oko 20 kb do oko 300kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 75kb, od oko 75kb do oko 100kb, od oko 100kb do 125kb, od oko 125kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 175kb, oko 175kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 225kb, od oko 225kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 275kb ili od oko 275kb do oko 300kb.
[0129] U jednom primeru izvođenja, LTVEC sadrži insertovani polinukleotid u opsegu od oko 5kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb.
[0130] U jednom primeru izvođenja, homologne grane LTVEC su izvedene iz biblioteke BAC, biblioteke kozmida ili biblioteke P1 faga. U drugim primerima izvođenja, homologne grane su izvedene iz ciljanog lokusa (tj. genskog lokusa) ćelije i u nekim slučajevima ciljnog lokusa, za koji je LTVEC dizajniran da cilja koji nije moguće ciljati upotrebom konvencionalnog postupka. U drugim primerima izvođenja, homologne grane su izvedene iz sintetičke DNK. U jednom primeru izvođenja, ukupan zbir uzvodne homologne grane i nizvodne homologne grane u LTVEC je najmanje 10kb. U jednom primeru izvođenja, uzvodna homologna grana je u opsegu od oko 1 kb do oko 100kb. U drugim primerima izvođenja, uzvodna homologna grana je u opsegu od oko 5kb do oko 100kb. U jednom primeru izvođenja, nizvodna homologna grana je u opsegu od oko 1kb do oko 100kb. U jednom primeru izvođenja, nizvodna homologna grana je u opsegu od oko 5kb do oko 100kb. U drugim primerima izvođenja, ukupan zbir uzvodnih i nizvodnih homolognih grana je od oko 1kb do oko 5kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 50kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 70kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 110kb do oko 120kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb.
[0131] U drugim primerima izvođenja, ukupan zbir 5' i 3' homolognih grana LTVEC je od oko 10kb do oko 30kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do
4
oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 120kb, ili od oko 120kb do 150kb. U ostalim slučajevima, ukupan zbir 5' i 3' homologne grane je oko 16Kb do oko 150Kb.
[0132] U dodatnim primerima izvođenja, LTVEC i insertovani polinukleotid dizajnirani su tako da omoguće deleciju na ciljnom lokusu od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40 kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, ili od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 400kb, od oko 400 kb do oko 500kb, od oko 500kb do oko 1Mb, od oko 1Mb do oko 1,5Mb, od oko 1,5Mb do oko 2Mb, od oko 2Mb do oko 2,5Mb, ili od oko 2,5Mb do oko 3Mb.
[0133] U drugim slučajevima, LTVEC i insertovani polinukleotid dizajnirani su tako da omoguće insertovanje u ciljni lokus egzogene sekvence nukleinske kiseline u opsegu od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20 kb, od oko 20kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 60kb, od oko 60kb do oko 80kb, od oko 80kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 200kb, od oko 200kb do oko 250kb, od oko 250kb do oko 300kb, od oko 300kb do oko 350kb, ili od oko 350kb do oko 400kb. U jednom primeru izvođenja, insertovani polinukleotid je oko 130 kb ili oko 155 kb.
[0134] U jednom primeru izvođenja, LTVEC sadrži selekcionu kasetu ili reporterski gen kao što se ovde razmatra na drugom mestu.
III. Postupci za integrisanje polinukleotida od interesa u ciljni lokus
A. Postupci integrisanja insertovanog polinukleotida blizu mesta za prepoznavanje pomoću homologne rekombinacije
[0135] Obezbeđeni su postupci za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji. Postupci sadrže (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze; (b) introdukovanje u ćeliju: (i) prvog agensa nukleaze, koji indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje; i, (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje; i, (c) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani
4
polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U specifičnim primerima izvođenja, prvi polinukleotid koji sadrži prvi selekcioni marker je omeđen sa bočnih strana prvim ciljnim mestom i drugim ciljnim mestom, prvo ciljno mesto odgovara prvoj homolognoj grani u prvom vektoru koji ciljno deluje i drugo ciljno mesto odgovara drugoj homolognoj grani u prvom vektoru koji ciljno deluje.
[0136] Različiti postupci se mogu upotrebljavati za identifikovanje ćelija koje imaju insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U jednom primeru izvođenja, nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost prvog selekcionog markera. Stoga, u jednom primeru izvođenja, takve ćelije se identifikuju uzgajanjem ćelija pod uslovima koji identifikuju ćelije, koje nemaju aktivnost selekcionog markera kodiranog polinukleotidom koji ima mesto za prepoznavanje, koji je isečen od strane agensa nukleaze. Poznati su postupci koji koriste takve selekcione markere i testiraju za njihovu aktivnost. Dodatni postupak za identifikovanje ćelija koje imaju insertovani polinukleotid na ciljnom lokusu može sadržati identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži insertovani polinukleotid integrisan u željeno ciljno mesto. Takvi postupci mogu uključivati identifikovanje najmanje jedne ćelije koja u svom genomu sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u prvo i drugo ciljno mesto.
[0137] Dodatni postupci takođe se mogu koristiti za identifikovanje ćelija koje imaju insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. Insertovanje insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira "modifikacijom alela". Termin "modifikacija alela" ili "MOA" uključuje modifikaciju tačne DNK sekvence jednog alela jednog ili više gena ili jednog ili više hromozomskih lokusa u genomu. Primeri "modifikacije alela (MOA)" uključuju, ali nisu ograničeni na, delecije, supstitucije, ili insertovanja tako mala kao jedan nukleotid ili delecije mnogo kilobaza koje obuhvataju gen(e) ili hromozomski lokus (lokuse) od interesa, kao i bilo koje i sve moguće modifikacije između ove dve krajnosti.
[0138] U različitim primerima izvođenja, da bi se olakšalo identifikovanje ciljane modifikacije koristi se, kvantitativni test visoke propusnosti, naime, test modifikacije alela (MOA). Ovde opisani MOA test omogućava preglede velikih razmera modifikovanog(ih) alela u roditeljskom hromozomu nakon genetičke modifikacije. MOA test može biti izveden putem različitih analitičkih tehnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, kvantitativni PCR, npr. PCR u realnom vremenu (qPCR). Na primer, PCR u realnom vremenu sadrži prvi set prajmera koji prepoznaje ciljni lokus i drugi set prajmera koji prepoznaje ne-ciljani referentni lokus. Pored toga, set prajmera sadrži fluorescentnu probu koja prepoznaje amplifikovanu sekvencu. Kvantitativni test se takođe može izvesti putem različitih analitičkih
4
tehnika, uključujući, ali ne ograničavajući se na, fluorescentno-posredovanu in situ hibridizaciju (FISH), uporednu gensku hibridizaciju, izotermičku DNK amplifikaciju, kvantitativnu hibridizaciju na imobilizovanoj probi(ama), Invader Probes®, MMP assays®, TaqMan® Molecular Beacon, i Eclipse™ tehnologiju probe. (Videti, na primer, US2005/0144655).
[0139] Prisustvo nika ili dvolančanog prekida na mestu za prepoznavanje unutar selekcionog markera, u različitim primerima izvođenja, povećava efikasnost i/ili učestalost rekombinacije između vektora koji ciljno deluje (kao što je LTVEC) i ciljanog lokusa. U jednom primeru izvođenja rekombinacija je homologna rekombinacija. U različitim primerima izvođenja, u prisustvu nika ili dvolančanog prekida, efikasnost ciljnog delovanja vektora koji ciljno deluje (kao što je LTVEC) na ciljni lokus je najmanje oko 2 puta veća, najmanje oko 3 puta veća, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 10 puta veća nego u odsustvu nika ili dvolančanog prekida (upotrebom npr. istog vektora koji ciljno deluje i istih homolognih grana i odgovarajućih ciljnih mesta na lokusu od interesa ali u odsustvu dodatog agensa nukleaze koji pravi nik ili dvolančani prekid).
B. Postupci integrisanja više polinukleotida od interesa u ciljani lokus
[0140] Različiti postupci i kompozicije ovde obezbeđeni omogućavaju ciljano integrisanje više polinukleotida od interesa unutar datog ciljnog lokusa. Postupci koriste sistem za ciljano integrisanje koji je ovde opisan, koji koristi strateško pozicioniranje mesta za prepoznavanje agensa nukleaze unutar polinukleotida koji kodira selekcioni marker. U specifičnim primerima izvođenja, selekcioni marker i mesto za prepoznavanje naizmenično alterniraju unutar svakog insertovanog polinukleotida. Pri tome se popločavanje sekvencijalnih insertovanih polinukleotida unutar datog ciljnog lokusa dešava sa poboljšanom efikasnošću i delotvornošću.
[0141] U jednom primeru izvođenja, postupak za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji sadrži: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze; (b) introdukovanje u ćeliju prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje; i, introdukovanje u ćeliju prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom, koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja
4
su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje; i prvi insertovani polinukleotid dodatno sadrži (1) prvi polinukleotid od interesa; i, (2) drugi polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu drugi polinukleotid sadrži drugo mesto za prepoznavanje za drugi agens nukleaze; i, (c) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus.
[0142] U dodatnim primerima izvođenja, dodatni polinukleotidi od interesa mogu biti integrisani u ciljni lokus. Takvi postupci za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži lokus, koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze; (b) introdukovanje u ćeliju prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje; i, introdukovanje u ćeliju prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom, koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje; i prvi insertovani polinukleotid dodatno sadrži (1) prvi polinukleotid od interesa; i, (2) drugi polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu drugi polinukleotid sadrži drugo mesto za prepoznavanje za drugi agens nukleaze; i, (c) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus; (d) introdukovanje u ćeliju koja sadrži u svom genomu prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus, (i) drugog agensa nukleaze, pri čemu drugi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje; i, (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom; i, (b) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U specifičnim primerima izvođenja, nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost drugog selekcionog markera. U dodatnim primerima izvođenja, identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus sadrži uzgajanje ćelije pod uslovima koji identifikuju ćelije koje nemaju aktivnost drugog selekcionog markera. U još dodatnim primerima izvođenja, drugi polinukleotid koji sadrži drugi selekcioni marker omeđen je sa bočnih strana trećim ciljnim mestom i četvrtim ciljnim mestom, treće ciljno mesto odgovara trećoj homolognoj grani u drugom vektoru koji ciljno deluje i četvrto ciljno mesto odgovara četvrtoj homolognoj grani u drugom vektoru koji ciljno
4
deluje. U još dodatnim primerima izvođenja, identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus sadrži identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u treće i četvrto ciljno mesto.
[0143] Dodatni postupci za modifikovanje ciljnog lokusa u ćeliji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze; (b) introdukovanje u ćeliju (i) prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje; i, (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje i prvi insertovani polinukleotid dodatno sadrži (1) prvi polinukleotid od interesa; i, (2) drugi polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu drugi polinukleotid sadrži drugo mesto za prepoznavanje za drugi agens nukleaze, i drugi polinukleotid koji sadrži drugi selekcioni marker omeđen je sa bočnih strana trećim ciljnim mestom i četvrtim ciljnim mestom, treće ciljno mesto odgovara trećoj homolognoj grani u drugom vektoru koji ciljno deluje i četvrto ciljno mesto odgovara četvrtoj homolognoj grani u drugom vektoru koji ciljno deluje; (c) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus; (d) introdukovanje u ćeliju koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus, (i) drugog agensa nukleaze, pri čemu drugi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje; i, (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom pri čemu drugi insertovani polinukleotid sadrži (1) drugi polinukleotid od interesa; i, (2) treći polinukleotid koji kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu treći polinukleotid sadrži treće mesto za prepoznavanje za treći agens nukleaze; i, (b) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus. U specifičnim primerima izvođenja, nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje narušava aktivnost drugog selekcionog markera. U dodatnim primerima izvođenja, identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži u svom genomu drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus sadrži uzgajanje ćelije pod uslovima koji identifikuju ćelije koje nemaju aktivnost drugog selekcionog markera. U dodatnim primerima izvođenja, identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži u svom genomu drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus sadrži identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži u svom genomu drugi insertovani polinukleotid integrisan u treće i četvrto ciljno mesto.
[0144] Različiti postupci izneti iznad se mogu uzastopno ponavljati kako bi se omogućila ciljana integracija bilo kog broja insertovanih polinukleotida u dati ciljani lokus. Stoga, različiti postupci obezbeđuju insertovanje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više insertovanih polinukleotida u ciljni lokus. U pojedinim primerima izvođenja, takvi uzastopni postupci popločavanja omogućavaju rekonstrukciju velikih genskih regiona iz ćelije sisara (tj. humane, ne-humane, glodarske, mišje, majmunske, pacovske, hrčka, pripitomljenog sisara ili poljoprivredne životinje) u ciljani lokus (tj. genski lokus). U takvim slučajevima, transfer i rekonstrukcija genskih regiona koji uključuju i kodirajuće i nekodirajuće regione omogućavaju da kompleksnost datog regiona bude očuvana zadržavanjem, najmanje delom, kodirajućih regiona, nekodirajućih regiona i pronađenih varijacija broja kopija unutar nativnog genskog regiona. Stoga, različiti postupci obezbeđuju, na primer, postupke za generisanje "heterolognih" ili "egzogenih" genskih regiona unutar bilo koje ćelije sisara ili životinje od interesa. U jednom neograničavajućem primeru generisan je "humanizovani" genski region unutar ne-humane životinje.
[0145] Kada se izvodi integrisanje više insertovanih polinukleotida unutar datog ciljnog lokusa, polinukleotidi koji kodiraju selekcione markere i sadrže mesto za prepoznavanje agensa nukleaze mogu alternirati između rundi integracije. Na primer, u specifičnim postupcima, prvi agens nukleaze se razlikuje od drugog agensa nukleaze i/ili prvi selekcioni marker se razlikuje od drugog selekcionog markera. U drugim primerima, kada se insertuju tri insertovana polinukleotida u ciljani lokus, prvi i treći selekcioni marker mogu biti identični jedan drugom i, u specifičnim primerima izvođenja, dodatno sadrže isto mesto za prepoznavanje, i drugi selekcioni marker može biti različit od prvog i trećeg selekcionog markera i sadrži različito mesto za prepoznavanje. Odabir selekcionih markera i mesta za prepoznavanje na takav način minimalizuje broj ili agense nukleaze koji moraju biti generisani, i time poboljšava efikasnost i delotvornost događaja integracije.
C. Postupci za modifikovanje jednog ili više ciljnih lokusa upotrebom CRISPR/Cas sistema
[0146] Postupci i kompozicije su obezbeđeni za modifikovanje jednog ili više ciljnih lokusa od interesa u ćeliji korišćenjem CRISPR/Cas sistema kao što je opisano na drugom mestu ovde. Za CRISPR/Cas sistem, termini "ciljno mesto" ili "ciljna sekvenca" mogu se upotrebljavati naizmenično i uključuju sekvence nukleinske kiseline prisutne u ciljnoj DNK
1
za koje će se DNK-usmeravajući segment vodeće RNK (gRNA) vezati, pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje. Na primer, ciljno mesto (ili ciljna sekvenca) unutar ciljne DNK je ciljano od strane (ili je vezano od strane, ili hibridizuje sa, ili je komplementarno) Cas nukleazi ili gRNA. Pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK uključuju fiziološka stanja koja su normalno prisutna u ćeliji. Drugi pogodni uslovi za vezivanje DNK/RNK (npr. uslovi u sistemu bez ćelija) su poznati u struci (videti, npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., Harbor Laboratory Press 2001)). Lanac ciljne DNK koji je komplementaran i hibridizuje sa Cas proteinom ili gRNA označava se kao "komplementarni lanac" i lanac ciljne DNK koji je komplementaran "komplementarnom lancu" (i zbog toga nije komplementaran Cas proteinu ili gRNA) označava se kao "nekomplementarni lanac" ili "templat lanac".
[0147] Cas protein može da iseći nukleinsku kiselinu na mestu unutar ciljne sekvence ili izvan ciljne sekvence. "Mesto isecanja" uključuje poziciju nukleinske kiseline pri čemu Cas protein proizvodi jednolančani prekid ili dvolančani prekid. Lepljivi krajevi se takođe mogu proizvesti upotrebom dva Cas9 proteina koji proizvode jednolančani prekid na mestima isecanja na svakom lancu. Isecanje ciljne DNK specifično za mesto od strane Cas9 može se desiti na lokacijama određenim i (i) komplementarnošću baznog sparivanja između vodeće RNK i ciljne DNK; i (ii) kratakim motivom, koji se označava kao protospejser susednog motiva (PAM), u ciljnoj DNK. Na primer, mesto isecanja Cas9 može biti oko 1 do oko 10 ili oko 2 do oko 5 baznih parova (npr. 3 bazna para) uzvodno od PAM sekvence. U nekim primerima izvođenja (npr. kada se upotrebljava Cas9 od S. pyogenes, ili usko srodna Cas9), PAM sekvenca nekomplementarnog lanca može biti 5'-XGG-3', gde je X bilo koji DNK nukleotid i X je neposredno 3' od ciljne sekvence nekomplementarnog lanca ciljne DNK. Kao takva, PAM sekvenca komplementarnog lanca bila bi 5'-CCY-3', gde je Y bilo koji DNK nukleotid i Y je neposredno 5' od ciljne sekvence komplementarnog lanca ciljne DNK. U nekim takvim primerima izvođenja, X i Y mogu biti komplementarni i X-Y bazni par može biti bilo koji bazni par (npr. X=C i Y=G; X=G i Y=C; X=A i Y=T, X=T i Y=A).
[0148] Stoga, u nekim primerima izvođenja, postupci za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa u ćeliji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži prvi ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom; (b) introdukovanje u ćeliju (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i prvu vodeću RNK (gRNA), od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom gRNA ciljnom mestu u prvoj nukleinskoj kiselini, čime se narušava ekspresija ili
2
aktivnost prvog selekcionog markera, i (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom, pri čemu je prva insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u prvom ciljnom lokusu; i (c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, i pri čemu su prvi i drugi selekcioni marker različiti. U jednom primeru izvođenja, prva gRNA ne hibridizuje sa prvom insertovanom nukleinskom kiselinom. U jednom primeru izvođenja, ciljni lokus od interesa je smešten u genomu ćelije. U drugom primeru izvođenja, ciljni lokus od interesa je smešten u vektoru u ćeliji. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (c) sadrži uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje modifikovane ćelije koja ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera.
[0149] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži (d) introdukovanje u modifikovanu ćeliju koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu (i) jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju Cas protein i drugu gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u modifikovanoj ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom ciljnom mestu gRNA u prvoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost drugog selekcionog markera, i (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži treću nukleinsku kiselinu koja kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom, pri čemu je druga insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom koje odgovaraju trećem i četvrtom ciljnom mestu koja su smeštena u drugom ciljnom lokusu; i (e) identifikovanje druge modifikovane ćelije koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu, pri čemu druga modifikovana ćelija ima aktivnost trećeg selekcionog markera ali nema aktivnost drugog selekcionog markera, pri čemu su drugi i treći selekcioni marker različiti. U jednom primeru izvođenja, prvi i drugi ciljni lokus su smešteni neposredno jedan pored drugog. U drugom primeru izvođenja, prvi ili drugi ciljni lokus je smešten oko 10 nukleotida do oko 14 kb od prvog ili drugog ciljnog mesta gRNA. U jednom primeru izvođenja, druga gRNA ne hibridizuje sa drugom insertovanom nukleinskom kiselinom. U jednom primeru izvođenja, korak identifikovanja (e) sadrži uzgajanje modifikovane ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje druge modifikovane ćelije koja ima aktivnost trećeg selekcionog markera ali nema aktivnost drugog selekcionog markera.
[0150] U jednom primeru izvođenja, postupak dodatno sadrži (f) introdukovanje u drugu modifikovanu ćeliju koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu: (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i treću gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u drugoj modifikovanoj ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na trećem ciljnom mestu gRNA u drugoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži treću nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost trećeg selekcionog markera, i (ii) trećeg vektora koji ciljno deluje koji sadrži treću insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži četvrtu nukleinsku kiselinu koja kodira četvrti selekcioni marker koji je operativno povezan sa četvrtim promotorom, pri čemu je treća insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana petom i šestom homolognom granom koje odgovaraju petom i šestom ciljnom mestu koja su smeštena u trećem ciljnom lokusu; i (g) identifikovanje treće modifikovane ćelije koja sadrži treću insertovanu nukleinsku kiselinu na trećem ciljnom lokusu, pri čemu treća modifikovana ćelija ima aktivnost četvrtog selekcionog markera ali nema aktivnost trećeg selekcionog markera, pri čemu su treći i četvrti selekcioni marker različiti. U jednom primeru izvođenja, drugi i treći ciljni lokus su smešteni neposredno jedan pored drugog. U drugom primeru izvođenja, drugi ili treći ciljni lokus je smešten oko 10 nukleotida do oko 14 kb od prvog ili drugog ciljnog mesta gRNA.
[0151] U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, treći, ili četvrti marker daju rezistenciju na antibiotik. U jednom primeru izvođenja, antibiotik sadrži G418, higromicin, blastocidin, neomicin, ili puromicin. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, treći, ili četvrti selekcioni marker sadrže hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu Herpes simplex virusa (HSV-TK). U jednom primeru izvođenja, prva, druga, ili treća gRNA sadrži (i) nukleotidnu sekvencu koja hibridizuje sa prvim, drugim ili trećim ciljnim mestom gRNA i (ii) trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA). U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, ili treći ciljni lokus je smešten u neposrednoj blizini prvog, drugog ili trećeg ciljnog mesta gRNA tako da nik ili dvolančani prekid na ciljnom mestu gRNA promoviše homolognu rekombinaciju vektora koji ciljno deluje na ciljnom lokusu. U jednom primeru izvođenja, Cas protein je Cas9. U jednom primeru izvođenja, prvo, drugo, ili treće ciljno mesto gRNA je neposredno omeđeno sa bočnih strana protospejser susednog motiva (PAM) sekvencom.
[0152] U specifičnim primerima izvođenja, gRNA je dizajnirana da cilja prvi selekcioni marker za antibiotik (npr. Hygr) za insertovanje prve insertovane nukleinske kiseline koja
4
kodira drugi selekcioni marker (npr. Neo<r>), pri čemu insertovanje prve insertovane nukleinske kiseline narušava aktivnost prvog selekcionog markera za antibiotik. Drugi gRNA ekspresioni plazmid može biti dizajniran da eksprimira gRNA koja cilja drugi selekcioni marker za insertovanje druge insertovane nukleinske kiseline koja kodira prvi selekcioni marker, pri čemu insertovanje druge insertovane nukleinske kiseline narušava aktivnost drugog selekcionog markera za antibiotik. Na ovaj način, gRNA moraju samo biti dizajnirane tako da ciljaju svaki od dva selekciona markera za antibiotik koja mogu biti upotrebljena u alternirajućim insertovanim nukleinskim kiselinama. Nukleinske kiseline koje kodiraju gRNA specifične za selekcione markere za rezistenciju na Neo koje služe kao primer mogu se pronaći u SEQ ID NO: 13, 14, 15, i 16. Nukleinske kiseline koje kodiraju gRNA specifične za selekcione markere za rezistenciju na Hyg koje služe kao primer mogu se pronaći u SEQ ID NO: 17, 18, 19, i 20.
[0153] U jednom primeru izvođenja, ćelija je prokariotska ćelija. U drugom primeru izvođenja, ćelija je eukariotska ćelija. U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je ćelija sisara ili ćelija ne-humanog sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija fibroblast. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija humanog fibroblasta. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je matična ćelija odraslog čoveka. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je razvojno ograničena progenitorska ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je razvojno ograničena humana progenitorska ćelija.
[0154] U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je ćelija ne-humanog sisara. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je od glodara. U jednom primeru izvođenja, glodar je pacov, miš, ili hrčak. U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je pluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je hematopoetska matična ćelija ili neuronska matična ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je humana indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je nehumana ES ćelija, humana ES ćelija, embrionalna matična (ES) ćelija glodara, embrionalna matična (ES) ćelija miša, ili embrionalna matična (ES) ćelija pacova.
[0155] U jednom primeru izvođenja, prvo, drugo, ili treće ciljno mesto gRNA je smešteno u intronu, egzonu, promotoru, ili regulatornom regionu promotora u prvoj, drugoj, ili trećoj nukleinskoj kiselini koja kodira prvi, drugi, ili treći selekcioni marker. U jednom primeru izvođenja, prvi, drugi, ili treći vektor koji ciljno deluje je najmanje oko 10 kb. U jednom primeru izvođenja, prva, druga, ili treća insertovana nukleinska kiselina je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb.
[0156] U jednom primeru izvođenja, prva, druga, ili treća insertovana nukleinska kiselina sadrži genski region humanog alfa lokusa T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, genski region sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona i/ili segment gena povezujućeg regiona humanog alfa lokusa T ćelijskog receptora.
[0157] U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni marker su isti. U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni marker su isti i drugi i četvrti selekcioni marker su isti. U jednom primeru izvođenja, prva i treća gRNA su iste.
[0158] U nekim primerima izvođenja, postupci za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa u ćeliji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži prvi ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom; (b) introdukovanje u ćeliju (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i prvu gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom ciljnom mestu gRNA u prvoj nukleinskoj kiselini, čime se narušava ekspresija ili aktivnost prvog selekcionog markera, i (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom, pri čemu je prva insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u prvom ciljnom lokusu; (c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, i pri čemu su prvi i drugi selekcioni marker različiti; (d) introdukovanje u modifikovanu ćeliju koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu: (i) jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju Cas protein i drugu gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u modifikovanoj ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom ciljnom mestu gRNA u prvoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost drugog selekcionog markera; i (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži treću nukleinsku kiselinu koja kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom, pri čemu je druga insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom koje odgovaraju trećem i četvrtom ciljnom mestu koja su smeštena u drugom ciljnom lokusu; i (e) identifikovanje druge modifikovane ćelije koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu, pri čemu druga modifikovana ćelija ima aktivnost trećeg selekcionog markera ali nema aktivnost drugog selekcionog markera, pri čemu su prvi i treći selekcioni marker isti, a drugi i treći selekcioni marker su različiti.
[0159] U drugim primerima izvođenja, postupci za modifikovanje ciljnog lokusa od interesa u ćeliji sadrže: (a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži prvi ciljni lokus koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom; (b) introdukovanje u ćeliju (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i prvu gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom ciljnom mestu gRNA u prvoj nukleinskoj kiselini, čime se narušava ekspresija ili aktivnost prvog selekcionog markera, i (ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu koja kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom, pri čemu je prva insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana prvom i drugom homolognom granom koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu koja su smeštena u prvom ciljnom lokusu; (c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, i pri čemu su prvi i drugi selekcioni marker različiti; (d) introdukovanje u modifikovanu ćeliju koja sadrži prvu insertovanu nukleinsku kiselinu na prvom ciljnom lokusu: (i) jedne ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju Cas protein i drugu gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u modifikovanoj ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom ciljnom mestu gRNA u prvoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži drugu nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost drugog selekcionog markera; i (ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži treću nukleinsku kiselinu koja kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom, pri čemu je druga insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana trećom i četvrtom homolognom granom koje odgovaraju trećem i četvrtom ciljnom mestu koja su smeštena u drugom ciljnom lokusu; (e) identifikovanje druge modifikovane ćelije koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu, pri čemu druga modifikovana ćelija ima aktivnost trećeg selekcionog markera ali nema aktivnost drugog selekcionog markera, pri čemu su drugi i treći selekcioni markeri različiti; (f) introdukovanje u drugu modifikovanu ćeliju koja sadrži drugu insertovanu nukleinsku kiselinu na drugom ciljnom lokusu: (i) jednog ili više ekspresionih konstrukata koji kodiraju Cas protein i treću gRNA, od kojih je svaki operativno povezan sa promotorom koji je aktivan u drugoj modifikovanoj ćeliji, pri čemu Cas protein indukuje nik ili dvolančani prekid na trećem ciljnom mestu gRNA u drugoj insertovanoj nukleinskoj kiselini koja sadrži treću nukleinsku kiselinu, čime se narušava ekspresija ili aktivnost trećeg selekcionog markera; i (ii) trećeg vektora koji ciljno deluje koji sadrži treću insertovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži četvrtu nukleinsku kiselinu koja kodira četvrti selekcioni marker koji je operativno povezan sa četvrtim promotorom, pri čemu je treća insertovana nukleinska kiselina omeđena sa bočnih strana petom i šestom homolognom granom koje odgovaraju petom i šestom ciljnom mestu koja su smeštena u trećem ciljnom lokusu; i (g) identifikovanje treće modifikovane ćelije koja sadrži treću insertovanu nukleinsku kiselinu na trećem ciljnom lokusu, pri čemu treća modifikovana ćelija ima aktivnost četvrtog selekcionog markera ali nema aktivnost trećeg selekcionog markera, pri čemu su treći i četvrti selekcioni marker različiti. U nekim primerima izvođenja, prvi i treći selekcioni marker su isti i drugi i četvrti selekcioni marker su isti. U jednom primeru izvođenja, prvi i treći selekcioni marker su isti, drugi i četvrti selekcioni marker su isti, a prvi i treći gRNA su iste.
IV. Polinukleotidi od interesa
[0160] Bilo koji polinukleotid od interesa može biti sadržan u različitim insertovanim polinukleotidima i na taj način integrisan u ciljni lokus. Ovde objavljeni postupci obezbeđuju da se integriše najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više polinukleotida od interesa u ciljani lokus.
[0161] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida kada se integriše u ciljni lokus može introdukovati jednu ili više genetičkih modifikacija u ćeliju. Genetička modifikacija može sadržati deleciju endogene sekvence nukleinske kiseline i/ili adiciju egzogenog ili heterolognog ili ortolognog polinukleotida u ciljni lokus. U jednom primeru izvođenja, genetička modifikacija sadrži zamenu endogene sekvence nukleinske kiseline sa egzogenim polinukleotidom od interesa na ciljnom lokusu. Stoga, ovde obezbeđeni postupci omogućavaju generisanje genetičke modifikacije koja sadrži knockout, deleciju, insertaciju, zamenu ("knock-in"), tačkastu mutaciju, zamenu domena, zamenu egzona, zamenu introna, zamenu regulatorne sekvence, zamenu gena, ili njihovu kombinaciju. Takve modifikacije se mogu dešavati nakon integracije prvog, drugog, trećeg, četvrtog, petog, šestog, sedmog, ili bilo kog narednog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus.
[0162] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati sekvencu koja je nativna ili homologna za ćeliju u koju se introdukuje; polinukleotid od interesa može biti heterologan za ćeliju u koju se introdukuje; polinukleotid od interesa može biti egzogen za ćeliju u koju se introdukuje; polinukleotid od interesa može biti ortologan za ćeliju u koju se introdukuje; ili polinukleotid od interesa može biti od različite vrste u odnosu na ćeliju u koju se introdukuje. Termin "homologan" u pozivanju na sekvencu uključuje sekvencu koja je nativna za ćeliju. Termin "heterologan" u pozivanju na sekvencu uključuje sekvencu koja potiče od strane vrste, ili, ukoliko je od iste vrste, bitno je modifikovana od svog nativnog oblika u kompoziciji i/ili lokusu namernom humanom intervencijom. Termin "egzogen" u pozivanju na sekvencu uključuje sekvencu koja potiče od strane vrste. Termin "ortologan" uključuje polinukleotid od jedne vrste koji je funkcionalno ekvivalentan sa poznatom referentnom sekvencom kod druge vrste (tj. varijanta vrste). Polinukleotid od interesa može biti iz bilo kog organizma od interesa uključujući, ali ne ograničavajući se na, ne-čoveka, glodara, hrčka, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili nepoljoprivredniog sisara. Polinukleotid od interesa može dodatno sadržati kodirajući region, nekodirajući region, regulatorni region, ili gensku DNK. Stoga, prvi, drugi, treći, četvrti, peti, šesti, sedmi, i/ili bilo koji od narednih insertovanih polinukleotida može sadržati takve sekvence.
[0163] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus je homologan sekvenci nukleinske kiseline miša, humanoj nukleinskoj kiselini, ne-humanoj nukleinskoj kiselini, nukleinskoj kiselini glodara, nukleinskoj kiselini pacova, nukleinskoj kiselini hrčka, nukleinskoj kiselini majmuna, nukleinskoj kiselini poljoprivrednog sisara, ili nukleinskoj kiselini nepoljoprivrednog sisara. U još dodatnim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa integrisan u ciljni lokus je fragment genske nukleinske kiseline. U jednom primeru izvođenja, genska nukleinska kiselina je genska nukleinska kiselina miša, humana genska nukleinska kiselina, ne-humana nukleinska kiselina, nukleinska kiselina glodara, nukleinska kiselina pacova, nukleinska kiselina hrčka, nukleinska kiselina majmuna, nukleinska kiselina poljoprivrednog sisara ili nukleinska kiselina nepoljoprivrednog sisara ili njihova kombinacija.
[0164] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa može biti u opsegu od oko 500 nukleotida do oko 200kb kao što je opisano iznad. Polinukleotid od interesa može biti od oko 500 nukleotida do oko 5kb, od oko 5kb do oko 200kb, od oko 5kb do oko 10kb, od oko 10kb do oko 20kb, od oko 20kb do oko 30kb, od oko 30 kb do oko 40kb, od oko 40kb do oko 50kb, od oko 60kb do oko 70kb, od oko 80kb do oko 90kb, od oko 90kb do oko 100kb, od oko 100kb do oko 110kb, od oko 120kb do oko 130kb, od oko 130kb do oko 140kb, od oko 140kb do oko 150kb, od oko 150kb do oko 160kb, od oko 160kb do oko 170kb, od oko 170kb do oko 180kb, od oko 180kb do oko 190kb, ili od oko 190kb do oko 200kb.
[0165] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili insertovan u ciljni lokus može kodirati polipeptid, može kodirati miRNA, ili može sadržati bilo koje regulatorne regione ili nekodirajuće regione od interesa uključujući, na primer, regulatornu sekvencu, sekvencu promotora, enhanser sekvencu, vezujuću sekvencu transkripcionog represora, ili deleciju ne-protein-kodirajuće sekvence. Pored toga, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili insertovan u ciljni lokus može kodirati protein eksprimiran u nervnom sistemu, skeletnom sistemu, digestivnom sistemu, cirkulatornom sistemu, mišićnom sistemu, respiratornom sistemu, kardiovaskularnom sistemu, limfnom sistemu, endokrinom sistemu, mokraćnom sistemu, reproduktivnom sistemu, ili njihovoj kombinaciji. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili insertovan u ciljni lokus kodira protein eksprimiran u kostnoj srži ili ćeliji koja potiče iz kostne srži. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus kodira protein eksprimiran u ćeliji slezine. U još dodatnim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili insertovan u ciljni lokus kodira protein eksprimiran u B ćeliji, kodira protein eksprimiran u nezreloj B ćeliji ili kodira protein eksprimiran u zreloj B ćeliji.
[0166] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili insertovan u ciljni lokus sadrži sekvencu genske nukleinske kiseline koja kodira amino-kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca imunoglobulina. Fraza "teški lanac", ili "teški lanac imunoglobulina" uključuje sekvencu teškog lanca imunoglobulina, uključujući sekvencu konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, iz bilo kog organizma. Varijabilni domeni teškog lanca uključuju tri CDR teškog lanca i četiri regiona okvira (FR), osim ukoliko nije drugačije navedeno. Fragmenti teškog lanca uključuju CDR-ove, CDR-ove i FR-ove, i njihove kombinacije. Tipičan teški lanac ima, prateći varijabilni domen (od N-terminusa do C-terminusa), CH1 domen, zglob, CH2 domen, i CH3 domen. Funkcionalni fragment teškog lanca uključuje fragment koji je sposoban specifično da prepozna epitop (npr. prepoznavanje epitopa sa KD u mikromolarnom, nanomolarnom, ili pikomolarnom opsegu), koji je sposoban da se eksprimira i sekretuje iz ćelije, i koji sadrži najmanje jedan CDR. Varijabilni domeni teškog lanca kodirani su nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona, koja uobičajeno sadrži VH, DH, i JH segmente izvedene iz repertoara VH, DH, i JH segmenata koji su prisutni u germinativnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za V, D, i J segmente teškog lanca za različite organizme mogu se pronaći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna putem interneta na svetskoj mreži (www) na URL "imgt.org."
[0167] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus sadrži sekvencu genske nukleinske kiseline koja kodira amino-kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, sekvenca genske nukleinske kiseline sadrži nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina ili sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, ili njihova kombinacija. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina odabrana je od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-zglob-CH2-CH3. U jednom primeru izvođenja, sekvenca genske nukleinske kiseline sadrži reorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca mišjeg imunoglobulina ili sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina, ili njihova kombinacija. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je odabrana od CH1, zgloba, CH2, CH3, i njihove kombinacije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca sadrži CH1-zglob-CH2-CH3.
[0168] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus sadrži sekvencu genske nukleinske kiseline koja kodira amino-kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca imunoglobulina. Fraza "laki lanac" uključuje sekvencu lakog lanaca imunoglobulina iz bilo kog organizma, i osim ukoliko nije drugačije navedeno uključuje humane kapa (κ) i lambda (λ) lake lance i VpreB, kao i surogatne lake lance. Varijabilni domeni lakog lanca tipično uključuju tri CDR lakog lanca i četiri FR, osim ukoliko nije drugačije navedeno. Uobičajeno, laki lanac pune dužine uključuje, od amino terminusa do karboksi terminusa, varijabilni domen koji uključuje FR1-
1
CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, i amino-kiselinsku sekvencu konstantnog regiona lakog lanca. Varijabilni domeni lakog lanca su kodirani nukleotidnom sekvencom varijabilnog regiona lakog lanca, koji uobičajeno sadrži VL lakog lanca i JL segmente gena lakog lanca, izvedene iz repertoara V i J segmenata gena lakog lanca prisutnih u germinativnoj liniji. Sekvence, lokacije i nomenklatura za V i J segmente gena lakog lanca za različite organizme mogu se pronaći u IMGT bazi podataka, koja je dostupna putem interneta na svetskoj mreži (www) na URL "imgt.org." Laki lanci uključuju one, npr. koji ne vezuju selektivno bilo prvi ili drugi epitop selektivno vezan od strane epitop-vezujućeg proteina u kom se pojavljuju. Laki lanci takođe uključuju one koji vezuju i prepoznaju, ili pomažu teškom lancu sa vezivanjem i prepoznavanjem, jednog ili više epitopa selektivno vezanih od strane epitopvezujućeg proteina u kom se pojavljuju.
[0169] U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus sadrži sekvencu genske nukleinske kiseline koja kodira amino-kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina. U jednom primeru izvođenja, sekvenca genske nukleinske kiseline sadrži nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona humanog λ i/ili κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, sekvenca genske nukleinske kiseline sadrži reorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona humanog λ i/ili κ lakog lanca. U jednom primeru izvođenja, nereorganizovana ili reorganizovana sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i/ili κ lakog lanca je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona lakog lanca imunoglobulina miša, pacova, ili čoveka odabranom od sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona λ lakog lanca i sekvence nukleinske kiseline konstantnog regiona κ lakog lanca.
[0170] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus može da kodira vanćelijski protein ili ligand za receptor. U specifičnim primerima izvođenja, kodirani ligand je citokin. Citokini od interesa uključuju hemokin odabran od CCL, CXCL, CX3CL, i XCL. Citokin takođe može sadržati faktor tumora nekroze (TNF). U još drugim primerima izvođenja, citokin je interleukin (IL). U jednom primeru izvođenja, interleukin je odabran od IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-34, IL-35, i IL-36. U jednom primeru izvođenja interleukin je IL-2. U specifičnim primerima izvođenja, takvi polinukleotidi od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisani u ciljni lokus su humani i, u specifičnijim primerima izvođenja, mogu sadržati humanu sekvencu.
2
[0171] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus može da kodira citoplazmatski protein ili membranski protein. U jednom primeru izvođenja, membranski protein je receptor, kao što je, citokin receptor, interleukin receptor, interleukin 2 receptor alfa, interleukin 2 receptor beta, ili interleukin 2 receptor gama.
[0172] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati polinukleotid koji kodira najmanje region T ćelijskog receptora, uključujući alfa T ćelijski receptor. U specifičnim postupcima svaki od insertovanih polinukleotida sadrži region lokusa T ćelijskog receptora (tj. alfa lokus T ćelijskog receptora) tako da je po završetku serijske integracije, deo ili ceo lokus T ćelijskog receptora integrisan u ciljni lokus. Takvi insertovani polinukleotidi mogu sadržati najmanje jedan ili više varijabilnih segmenata ili povezujućih segmenata lokusa T ćelijskog receptora (tj. alfa lokusa T ćelijskog receptora). Nadalje polinukleotid od interesa koji kodira region T ćelijskog receptora može biti polinukleotid iz, na primer, sisara, ne-humanog sisara, glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara koji kodira mutantni protein.
[0173] U drugim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa koji je integrisan u ciljni lokus kodira nukleusni protein. U jednom primeru izvođenja, nukleusni protein je nukleusni receptor. U specifičnim primerima izvođenja, takvi polinukleotidi od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisani u ciljni lokus su humani i, u specifičnijim primerima izvođenja, mogu sadržati humanu gensku sekvencu.
[0174] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni genski lokus može sadržati genetičku modifikaciju u kodirajućoj sekvenci. Takve genetičke modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, delecionu mutaciju kodirajuće sekvence ili fuziju dve kodirajuće sekvence.
[0175] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus može sadržati polinukleotid koji kodira mutantni protein. U jednom primeru izvođenja, mutantni protein je okarakterisan izmenjenim karakteristikama vezivanja, izmenjenom lokalizacijom, izmenjenom ekspresijom, i/ili izmenjenim obrascem ekspresije. U jednom primeru izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus sadrži najmanje jedan alel bolesti, uključujući na primer, alel neurološke bolesti, alel kardiovaskularne bolesti, alel bolesti bubrega, alel mišićne bolesti, alel bolesti krvi, alel gena koji izaziva kancer, ili alel bolesti imunskog sistema. U takvim slučajevima, alel bolesti može biti dominantan alel ili je alel bolesti recesivni alel. Štaviše, alel bolesti može sadržati alel polimorfizma pojedinačnog nukleotida (SNP). Polinukleotid od interesa koji kodira mutantni protein može biti iz bilo kog organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polinukleotid sisara, ne-humanog sisara, glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara koji kodira mutantni protein.
[0176] Polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus može takođe sadržati regulatornu sekvencu, uključujući na primer, promotor sekvencu, enhanser sekvencu, ili vezujuću sekvencu transkripcionog represora. U specifičnim primerima izvođenja, polinukleotid od interesa unutar insertovanog polinukleotida i/ili integrisan u ciljni lokus sadrži polinukleotid koji ima deleciju ne-protein-kodirajuće sekvence, ali ne sadrži deleciju protein-kodirajuće sekvence. U jednom primeru izvođenja, delecija ne-proteinkodirajuće sekvence sadrži deleciju regulatorne sekvence. U drugom primeru izvođenja, delecija regulatornog elementa sadrži deleciju promotor sekvence. U jednom primeru izvođenja, delecija regulatornog elementa sadrži deleciju enhanser sekvence. Takav polinukleotid od interesa može biti iz bilo kog organizma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polinukleotid sisara, ne-humanog sisara, glodara, miša, pacova, čoveka, majmuna, poljoprivrednog sisara ili domaćeg sisara koji kodira mutantni protein.
V. Postupci introdukovanja sekvenci i generisanje ne-humanih transgenih životinja
[0177] Kao što je naznačeno iznad, ovde su obezbeđeni postupci i kompozicije koji omogućavaju ciljanu integraciju jednog ili više polinukleotida od interesa. Takvi sistemi koriste različite komponente i radi lakšeg pozivanja, ovde termin "ciljani integracioni sistem" uopšteno označava sve komponente potrebne za događaj integracije (tj. različite agense nukleaze, mesta za prepoznavanje, insertovane DNK polinukleotide, vektore koji ciljno deluju, ciljni lokus, i polinukleotide od interesa).
[0178] Ovde obezbeđeni postupci sadrže introdukovanje u ćeliju jednog ili više polinukleotida ili polipeptidnih konstrukata koji sadrže različite komponente ciljanog integracionog sistema. Termin "introdukovanje" uključuje predstavljanje ćeliji sekvence (polipeptidne ili polinukleotidne) na takav način da sekvenca dobije pristup unutrašnjosti ćelije. Ovde obezbeđeni postupci ne zavise od određenog postupka za introdukovanje bilo koje komponente ciljanog integracionog sistema u ćeliju, samo da polinukleotid dobije pristup unutrašnjosti najmanje jedne ćelije. Postupci za introdukovanje polinukleotida u različite tipove ćelija poznati su u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, postupke stabilne transfekcije, postupke prolazne transfekcije, i postupke posredovane virusom.
4
[0179] U nekim primerima izvođenja ćelije korišćene u postupcima i kompozicijama imaju DNK konstrukt stabilno inkorporisan u svoj genom. "Stabilno inkorporisan" ili "stabilno introdukovan" znači introdukovanje polinukleotida u ćeliju tako da se nukleotidna sekvenca integriše u genom ćelije i sposobna je da se nasledi od strane njenog potomstva. Bilo koji protokol se može upotrebiti za stabilnu inkorporaciju DNK konstrukata ili različitih komponenti ciljanog integracionog sistema.
[0180] Transfekcioni protokoli kao i protokoli za introdukovanje polipeptidnih ili polinukleotidnih sekvenci u ćelije mogu varirati. Neograničavajući postupci transfekcije uključuju hemijski-zasnovane postupke transfekcije uključujući upotrebu lipozoma; nanočestica; kalcijum fosfata (Graham et al. (1973). Virology 52 (2): 456-67, Bacchetti et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4 i, Kriegler, M (1991). Transfer and Expression: A Laboratory Manual. New York: W. H. Freeman and Company, pp. 96-97); dendrimera; ili katjonskih polimera kao što su DEAE-dekstran ili polietilenimin. Nehemijski postupci uključuju elektroporaciju; sono-poraciju; i optičku transfekciju. Transfekcija zasnovana na česticama uključuje upotrebu genskog pištolja, transfekcija potpomognuta magnetom (Bertram, J. (2006) Current Pharmaceutical Biotechnology 7, 277-28). Virusni postupci se takođe mogu upotrebljavati za transfekciju.
[0181] U jednom primeru izvođenja, agens nukleaze se introdukuje u ćeliju istovremeno sa vektorom koji ciljno deluje ili velikim vektorom koji ciljno deluje (LTVEC). Alternativno, agens nukleaze se introdukuje odvojeno od vektora koji ciljno deluje ili LTVEC tokom određenog vremenskog perioda. U jednom primeru izvođenja, agens nukleaze se introdukuje pre introdukovanja vektora koji ciljno deluje ili LTVEC, dok se u drugim primerima izvođenja, agens nukleaze introdukuje nakon introdukovanja vektora koji ciljno deluje ili LTVEC.
[0182] Ne-humane životinje sisari mogu se generisati korišćenjem različitih ovde objavljenih postupaka. Takvi postupci sadrže (1) integrisanje jednog ili više polinukleotida od interesa u ciljni lokus pluripotentne ćelije ne-humane životinje da bi se generisala genetički modifikovana pluripotentna ćelija koja sadrži insertovani polinukleotid u ciljanom lokusu koristeći ovde objavljene postupke; (2) selektovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije koja ima jedan ili više polinukleotida od interesa u ciljnom lokusu; (3) introdukovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije u embrion domaćina ne-humane životinje u premorula fazi; i (4) implantiranje embriona domaćina koji sadrži genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majku da bi se generisala F0 generacija izvedena iz genetički modifikovane pluripotentne ćelije. Ne-humana životinja može biti ne-humani sisar, glodar (npr. miš, pacov, hrčak), majmun, poljoprivredni sisar ili domaći sisar. Pluripotentna ćelija može biti ne-humana ES ćelija, ES ćelija glodara (npr. ES ćelija miša, ES ćelija pacova, ili ES ćelija hrčka), ES ćelija majmuna, ES ćelija poljoprivrednog sisara ili ES ćelija pripitomljenog sisara. Videti, npr. SAD publikacija br. 2014/0235933; SAD publikacija br. 2014/0310828; i Tong et al. (2010) Nature, 467 (7312):211-213.
[0183] Tehnike nukleusnog tranfsera mogu se takođe upotrebljavati za generisanje nehumanih životinja sisara. Ukratko, postuci za nukleusni transfer uključuju korake: (1) enukleacija ne-humane oocite; (2) izolovanje ne-humane donorske ćelije ili nukleusa koji treba kombinovati sa enukleisanom oocitom; (3) insertovanje ćelije ili nukleusa u enukleisanu oocitu da se formira rekonstituisana ćelija; (4) implantiranje rekonstituisane ćelije u matericu životinje da bi se formirao embrion; i (5) dozvoljavanje embrionu da se razvije. Kod takvih postupaka oocite se uglavnom izvlače iz umrlih životinja, iako mogu biti izolovane takođe bilo iz jajovoda i/ili jajnika živih životinja. Oocite mogu sazrevati u različitim medijumima poznatim onima koji imaju prosečnu veštinu u struci pre enukleacije. Enukleacija oocite se može izvesti na više načina dobro poznatih onima koji imaju prosečnu veštinu u struci. Insertovanje donorske ćelije ili nukleusa u enukleisanu oocitu da bi se formirala rekonstituisana ćelija uobičajeno je pomoću mikroinjektiranja donorske ćelije ispod zone pellucida pre fuzije. Fuzija može biti indukovana primenom električnog impulsa jednosmerne (DC) struje preko kontaktne/fuzione ravni (elektrofuzija), izlaganjem ćelija hemikalijama koje podstiču fuziju, kao što je polietilen glikol, ili putem inaktiviranog virusa, kao što je Sendai virus. Rekonstituisana ćelija se uobičajeno aktivira električnim i/ili neelektričnim načinima pre, tokom, i/ili posle fuzije nukleusnog donora i oocite primaoca. Postupci aktiviranja uključuju električne impulse, hemijski indukovan šok, penetraciju pomoću sperme, rastuće nivoe divalentnih katjona u oociti, i smanjenje fosforilacije ćelijskih proteina (kao putem inhibitora kinaze) u oociti. Aktivirane rekonstituisane ćelije, ili embrioni, se uobičajeno uzgajaju u medijumu koji je dobro poznat onima koji imaju prosečnu veštinu u struci i potom prenesu u matericu životinje. Videti, na primer, US20080092249, WO/1999/005266A2, US20040177390, WO/2008/017234A1, i SAD patent br.7,612,250.
[0184] Obezbeđeni su drugi postupci za pravljenje ne-humane životinje koja sadrži u svojoj germinativnoj liniji jednu ili više genetičkih modifikacija kako je ovde opisano, koji sadrže: (a) modifikovanje ciljanog lokusa ne-humane životinje u prokariotskoj ćeliji korišćenjem različitih ovde opisanih postupaka; (b) selektovanje modifikovane prokariotske ćelije koja sadrži genetičku modifikaciju u ciljanom lokusu; (c) izolovanje genetički modifikovanog vektora koji ciljno deluje iz modifikovane prokariotske ćelije; (d) introdukovanje genetički modifikovanog vektora koji ciljno deluje u pluripotentnu ćeliju ne-humane životinje da bi se generisala genetički modifikovana pluripotentna ćelija koja sadrži insertovanu nukleinsku kiselinu u ciljanom lokusu; (e) selektovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije; (f) introdukovanje genetički modifikovane pluripotentne ćelije u embrion domaćina ne-humane životinje u pre-morula fazi; i (g) implantiranje embriona domaćina koji sadrži genetički modifikovanu pluripotentnu ćeliju u surogat majku da bi se generisala F0 generacija izvedena iz genetički modifikovane pluripotentne ćelije. U takvim postupcima vektor koji ciljno deluje može sadržati veliki vektor koji ciljno deluje. Ne-humana životinja može biti he-humani sisar, glodar, miš, pacov, hrčak, majmun, poljoprivredni sisar ili domaći sisar. Pluripotentna ćelija može biti ne-humana ES ćelija, ES ćelija glodara (npr. ES ćelija miša, ES ćelija pacova, ili ES ćelija hrčka), ES ćelija majmuna, ES ćelija poljoprivrednog sisara ili ES ćelija domaćeg sisara.
[0185] U dodatnim postupcima, korak izolovanja (c) dodatno sadrži (c1) linearizaciju genetički modifikovanog vektora koji ciljno deluje (tj. genetički modifikovanog LTVEC). U još dodatnim primerima izvođenja, korak introdukovanja (d) dodatno sadrži (d1) introdukovanje agensa nukleaze kako je ovde opisano u pluripotentnu ćeliju. U drugim primerima izvođenja, korak introdukovanja (d) dodatno sadrži (d2) pri čemu pluripotentna ćelija ne-humanog sisara sadrži ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, i introdukovanje agensa nukleaze u pluripotentnu ćeliju, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid u prvom mestu za prepoznavanje. Dodatno se u pluripotentnu ćeliju introdukuje prvi vektor koji ciljno deluje koji sadrži genetički modifikovani vektor koji ciljno deluje iz genoma modifikovane prokariotske ćelije. Modifikovani vektor koji ciljno deluje sadrži prvu i drugu homolognu granu koje odgovaraju prvom i drugom ciljnom mestu u dovoljnoj blizini prvog mesta za prepoznavanje unutar genoma pluripotentne ćelije nehumanog sisara. U jednom primeru izvođenja, koraci selektovanja (b) i/ili (e) su izvedeni primenom selekcionog agensa kako je ovde opisano na prokariotsku ćeliju ili pluripotentnu ćeliju. U jednom primeru izvođenja, koraci selektovanja (b) i/ili (e) su izvedeni putem testa modifikacije alela (MOA) kao što je ovde opisano.
[0186] Dodatni postupci za modifikovanje ciljnog lokusa ćelije sisara putem bakterijske homologne rekombinacije (BHR) u prokariotskoj ćeliji su obezbeđeni i sadrže: (a) obezbeđivanje prokariotske ćelije koja sadrži ciljni lokus koji sadrži prvi polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom koji je aktivan u prokariotskoj ćeliji, pri čemu prvi polinukleotid dodatno sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, (b) introdukovanje u prokariotsku ćeliju vektora koji ciljno deluje koji sadrži insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom uzvodnom homolognom granom i prvom nizvodnom homolognom granom, pri čemu insertovani polinukleotid sadrži region sisara, i introdukovnje u prokariotsku ćeliju agensa nukleaze koji pravi nik ili dvolančani prekid i ili blizu prvog mesta za prepoznavanje, i (c) selektovanje ciljane prokariotske ćelije koja sadrži insertovani polinukleotid u ciljnom lokusu, pri čemu je prokariotska ćelija sposobna da eksprimira rekombinogene proteine i enzime koji posreduju u BHR. Koraci (a)-(c) mogu biti serijski ponovljeni kao što je ovde objavljeno da bi se omogućilo introdukovanje više insertovanih polinukleotida u ciljani lokus u prokariotskoj ćeliji. Jednom kada je ciljani lokus "izgrađen" sa prokariotskom ćelijom, vektor koji ciljno deluje koji sadrži modifikovani ciljni lokus se može izolovati iz prokariotske ćelije i introdukovati u ciljni lokus unutar ćelije ne-humanog sisara. Ćelije sisara koje sadrže modifikovani lokus mogu se zatim pretvoriti u ne-humane transgene životinje.
[0187] U nekim primerima izvođenja, ovde opisane različite genetičke modifikacije ciljnih lokusa se mogu izvršiti serijom homolognih reakcija rekombinacije (BHR) u bakterijskim ćelijama upotrebom DNK bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) upotrebom VELOCIGENE® tehnologije genetičkog projektovanja (videti, npr. SAD patent br.6,586,251 i Valenzuela, D.M. et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotechnology 21(6):652-659).
[0188] U nekim primerima izvođenja, ciljane ES ćelije ne-humanog sisara (tj. od ne-humanih sisara, glodara (npr. miševa, pacova, ili hrčaka), poljoprivrednih sisara, domaćih sisara, majmuna, itd.) koje sadrže različite genetičke modifikacije kako je opisano ovde introdukovane su u embrion u pre-morula fazi od odgovarajućeg organizma, npr. mišji embrion u fazi od 8 ćelija, putem VELOCIMOUSE® postupka (videti, npr. US 7,576,259, US 7,659,442, US 7,294,754, i US 2008-0078000 A1). Embrion ne-humanog sisara koji sadrži genetički modifikovane ES ćelije se inkubira do faze blastocista i zatim implantira u surogat majku da bi se proizvela F0. U nekim drugim primerima izvođenja, ciljane ES ćelije sisara koje sadrže različite genetičke modifikacije kako je ovde opisano su introdukovane u embrion u fazi blastocista. Ne-humani sisari koji nose genetički modifikovani lokus mogu se identifikovati putem testa modifikacije alela (MOA) kako je ovde opisano. Rezultujuća F0 generacija ne-humanog sisara izvedena iz genetički modifikovanih ES ćelija je ukrštena sa nehumanim sisarom divljeg tipa da bi se dobilo potomstvo F1 generacije. Nakon genotipizacije sa specifičnim prajmerima i/ili probama, F1 ne-humani sisari koji su heterozigotni za genetički modifikovani lokus ukrštani su jedni sa drugima da bi se stvorili ne-humani sisari koji su homozigotni za genetički modifikovani lokus.
VI. Ćelije
[0189] Različiti ovde opisani postupci koriste sistem koji ciljno deluje na lokus u ćeliji. Takve ćelije uključuju prokariotske ćelije kao što su bakterijske ćelije uključujući E. coli, ili eukariotske ćelije kao što su ćelije kvasca, insekta, vodozemca, ptice (npr. kokošije ćelije), biljke, ili ćelije sisara, uključujući, ali ne ograničavajući se na ćeliju miša, ćeliju pacova, ćeliju zeca, ćeliju svinje, ćeliju goveda, ćeliju jelena, ćeliju ovce, ćeliju koze, ćeliju mačke, ćeliju psa, ćeliju feretke, ćeliju primata (npr. marmoset, rezus majmun), i slično i ćelije od pripitomljenih sisara ili ćelije od poljoprivrednih sisara. Neke ćelije su ne-humane, posebno ne-humane ćelije sisara. U nekim primerima izvođenja, za one sisare za koje pogodne pluripotentne ćelije koje se mogu genetički modifikovati nisu lako dostupne, koriste se drugi postupci za reprogramiranje somatskih ćelija u pluripotentne ćelije, npr. putem introdukovanja u somatske ćelije kombinacije faktora koji indukuju pluripotenciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Oct3/4, Sox2, KLF4, Myc, Nanog, LIN28, i Glis1.
[0190] U jednom primeru izvođenja, eukariotska ćelija je pluripotentna ćelija. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija je embrionalna matična (ES) ćelija. Termin "embrionalna matična ćelija" ili "ES ćelija" uključuje ćeliju koja je sposobna za nediferenciranu proliferaciju in vitro, i koja je sposobna da doprinese bilo kom tkivu embriona u razvoju nakon introdukovanja u embrion. Termin "pluripotentna ćelija" uključuje nediferenciranu ćeliju koja ima sposobnost da se razvije u više od jednog diferenciranog tipa ćelije. Termin "germinativna linija" u pozivanju na polinukleotidnu sekvencu uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja se može preneti na potomstvo.
[0191] Pluripotentna ćelija može biti ne-humana ES ćelija ili indukovana pluripotentna matična (iPS) ćelija. U jednom primeru izvođenja, indukovana pluripotentna (iPS) ćelija je izvedena iz fibroblasta. U specifičnim primerima izvođenja, indukovana pluripotentna (iPS) ćelija je izvedena iz humanog fibroblasta. U nekim primerima izvođenja, pluripotentna ćelija je hematopoetska matična ćelija (HSC), neuronska matična ćelija (NSC), ili matična ćelija epiblasta. Pluripotentna ćelija takođe može biti razvojno ograničena progenitorska ćelija. U dodatnim primerima izvođenja, pluripotentna ćelija je pluripotentna ćelija glodara. U jednom primeru izvođenja, pluripotentna ćelija glodara je pluripotentna ćelija pacova ili ES ćelija pacova. U drugim primerima izvođenja, pluripotentna ćelija glodara je pluripotentna ćelija miša ili mišja ES ćelija.
[0192] U drugim primerima izvođenja, ćelija sisara može biti imortalizovana ćelija miša, ćelija pacova ili humana ćelija. U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je humani fibroblast, dok u drugim primerima izvođenja, ćelija sisara je ćelija kancera, uključujući humanu ćeliju kancera.
[0193] U još dodatnim primerima izvođenja, sisar je čovek i ciljano delovanje se vrši upotrebom ex vivo humane ćelije.
[0194] U jednom primeru izvođenja, ćelija sisara je humana ćelija izolovana iz pacijenta koji ima bolest i/ili sadrži humani polinukleotid koji kodira mutantni protein. U jednom primeru izvođenja, mutantni humani protein okarakterisan je izmenjenom karakteristikom vezivanja, izmenjenom lokalizacijom, izmenjenom ekspresijom, i/ili izmenjenim obrascem ekspresije. U jednom primeru izvođenja, sekvenca humane nukleinske kiseline sadrži najmanje jedan alel humane bolesti. U jednom primeru izvođenja, sekvenca humane nukleinske kiseline sadrži najmanje jedan alel humane bolesti. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel neurološke bolesti. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel kardiovaskularne bolesti. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel bolesti bubrega. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel mišićne bolesti. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel bolesti krvi. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel gena koji izaziva kancer. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je alel bolesti imunskog sistema. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je dominantni alel. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti je recesivni alel. U jednom primeru izvođenja, alel humane bolesti sadrži alel polimorfizma pojedinačnog nukleotida (SNP).
[0195] Kada ćelija sadrži prokariotsku ćeliju, u specifičnim primerima izvođenja, prokariotska ćelija je rekombintno kompetentni soj E. coli. U jednom primeru izvođenja, prokariotska ćelija sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinogene proteine i enzime. U jednom primeru izvođenja, prokariotska ćelija ne sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira rekombinogene proteine i enzime, i nukleinska kiselina koja kodira rekombinogene proteine i enzime je introdukovana u prokariotsku ćeliju. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina sadrži DNK ili iRNK koja kodira rekombinogene proteine i enzime. U jednom primeru izvođenja nukleinska kiselina koja kodira rekombinogene proteine i enzime je pABG. U jednom primeru izvođenja, rekombinogeni proteini i enzimi su eksprimirani pod kontrolom inducibilnog promotora. U jednom primeru izvođenja, ekspresija rekombinogenih proteina i enzima se kontroliše od strane arabinoze.
VII. Ekspresione kasete
[0196] Ovde su obezbeđeni polinukleotidi ili molekuli nukleinske kiseline koji sadrže različite komponente ciljanog integracionog sistema koji je ovde obezbeđen (tj. agense nukleaze, mesta za prepoznavanje, insertovane polinukleotide, polinukleotide od interesa, vektore koji ciljno deluju, selekcione markere i druge komponente).
[0197] Termini "polinukleotid", "polinukleotidna sekvenca", "sekvenca nukleinske kiseline", i "fragment nukleinske kiseline" ovde se koriste naizmenično. Ovi termini obuhvataju nukleotidne sekvence i slično. Polinukleotid može biti polimer RNK ili DNK koji je jedno- ili dvolančan, koji opciono sadrži sintetičke, ne-prirodne ili izmenjene nukleotidne baze. Polinukleotid u obliku polimera DNK može da se sastoji od jednog ili više segmenata cDNA, genske DNK, sintetičke DNK, ili njihove smeše. Polinukleotidi mogu sadržati deoksiribonukleotide i ribonukleotide uključujući i molekule koji se javljaju u prirodi i sintetičke analoge, i bilo koju njihovu kombinaciju. Ovde obezbeđeni polinukleotidi takođe obuhvataju sve oblike sekvenci uključujući, ali ne ograničavajući se na, jednolančane oblike, dvolančane oblike, ukosnice, strukture stabljike-i-petlje (eng. stem-and-loop), i slično.
[0198] Dodatno su obezbeđeni rekombinantni polinukleotidi koji sadrže različite komponente ciljanog integracionog sistema. Termini "rekombinantni polinukleotid" i "rekombinantni DNK konstrukt" ovde se upotrebljavaju naizmenično. Rekombinantni konstrukt sadrži veštačku ili heterolognu kombinaciju sekvenci nukleinske kiseline, npr. regulatorne i kodirajuće sekvence koje se u prirodi ne nalaze zajedno. U drugim primerima izvođenja, rekombinantni konstrukt može sadržati regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence koje su izvedene iz različitih izvora, ili regulatorne sekvence i kodirajuće sekvence koje su izvedene iz istog izvora, ali raspoređene na način drugačiji od onoga koji se nalazi u prirodi. Takav konstrukt se može upotrebljavati sam ili se može upotrebljavati zajedno sa vektorom. Ukoliko se upotrebljava vektor, onda izbor vektora zavisi od postupka koji se upotrebljava za transformisanje ćelija domaćina kao što je dobro poznato stručnjacima u oblasti. Na primer, može se upotrebljavati plazmidni vektor. Ovde su obezbeđeni genetički elementi potrebni za uspešno transformisanje, selektovanje, i propagiranje ćelija domaćina i koji sadrže bilo koji od izolovanih fragmenata nukleinske kiseline. Pregled se može obaviti Southern analizom DNK, Northern analizom ekspresije iRNK, imunobloting analizom ekspresije proteina, ili analizom fenotipa, između ostalog.
1
[0199] U specifičnim primerima izvođenja, jedna ili više od komponenata ciljanog integracionog sistema opisanog ovde može se obezbediti u ekspresionoj kaseti za ekspresiju u prokariotskoj ćeliji, eukariotskoj ćeliji, bakterijskoj, ćeliji kvasca, ili ćeliji sisara ili drugog organizma ili tipa ćelije od interesa. Kaseta može uključivati 5' i 3' regulatorne sekvence koje su operativno povezane sa polinukleotidom koji je ovde obezbeđen. "Operativno povezan" uključuje funkcionalnu vezu između dva ili više elemenata. Na primer, operativna veza između polinukleotida od interesa i regulatorne sekvence (tj. promotora) je funkcionalna veza koja omogućava ekspresiju polinukleotida od interesa. Operativno povezani elementi mogu biti neprekidni ili ne-neprekidni. Kada se upotrebljava da označava spajanje dva protein kodirajuća regiona, operativno povezan znači da su kodirajući regioni u istom okviru čitanja. U drugom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može biti operativno povezana sa regulatornim sekvencama (npr. promotorom, enhanserom, sekvencom prigušivačem, itd.) tako da zadrže pravilnu regulaciju transkripcije. U jednom slučaju, sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog regiona imunoglobulina (ili V(D)J segmenti) može biti operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona imunoglobulina tako da omogućava pravilnu rekombinaciju između sekvenci u sekvencu teškog ili lakog lanca imunoglobulina.
[0200] Kaseta može dodatno sadržati najmanje jedan dodatni polinukleotid od interesa koji će biti ko-introdukovan u organizam. Alternativno, dodatni polinukleotid od interesa može biti obezbeđen na više ekspresionih kaseta. Takva ekspresiona kaseta obezbeđena je sa mnoštvom restrikcionih mesta i/ili mesta rekombinacije za insertovanje rekombinantnog polinukleotida kako bi bio pod transkripcionom regulacijom regulatornih regiona. Ekspresiona kaseta može dodatno sadržati gene selekcionog markera.
[0201] Ekspresiona kaseta može uključivati u 5ꞌ-3ꞌ smeru transkripcije, region inicijacije transkripcije i translacije (tj. promotor), rekombinantni polinukleotid obezbeđen ovde, i i region terminacije transkripcije i translacije (tj. region terminacije) funkcionalan u ćeliji sisara ili ćeliji domaćina od interesa. Regulatorni regioni (tj. promotori, regioni regulacije transkripcije, i regioni terminacije translacije) i/ili polinukleotid koji su ovde obezbeđeni mogu biti nativni/analogni za ćeliju domaćinu ili jedan drugome. Alternativno, regulatorni regioni i/ili polinukleotid koji su ovde obezbeđeni mogu biti heterologni za ćeliju domaćina ili jedan drugome. Na primer, promotor koji je operativno povezan sa heterolognim polinukleotidom je iz vrste koja je različita od vrste iz koje je polinukleotid izveden, ili, ukoliko su iz iste/analogne vrste, jedan ili oba su značajno modifikovana od svog izvornog oblika i/ili lokusa, ili promotor nije nativni promotor za operativno povezan polinukleotid.
2
Alternativno, regulatorni regioni i/ili rekombinantni polinukleotid koji su ovde obezbeđeni mogu biti u potpunosti sintetički.
[0202] Region terminacije može biti nativan sa regionom inicijacije transkripcije, može biti nativan sa operativno povezanim rekombinantnim polinukleotidom, može biti nativan sa ćelijom domaćina ili može biti izveden iz drugog izvora (tj. stranog ili heterolognog) od promotora, rekombinantnog polinukleotida, ćelije domaćina, ili bilo koje njihove kombinacije.
[0203] U pripremi ekspresione kasete, različiti DNK fragmenti mogu biti manipulisani, tako da se obezbede DNK sekvence pravilne orijentacije. U tom cilju, mogu se koristiti adapteri ili linkeri koji bi sjedinili DNK fragmente ili druge manipulacije mogu biti uključene da se obezbede pogodna restrikciona mesta, uklanjanje suvišne DNK, uklanjanje restrikcionih mesta, ili slično. U tu svrhu, in vitro mutageneza, popravka prajmera, restrikcija, vezivanje, resupstitucije, npr. tranzicije i transverzije, mogu biti uključene.
[0204] Jedan broj promotora može se upotrebljavati u ekspresionim kasetama koje su ovde obezbeđene. Promotori se mogu selektovati na osnovu željenog rezultata. Prepoznato je da se različite aplikacije mogu poboljšati upotrebom različitih promotora u ekspresionim kasetama za modulaciju vremena, lokacije i/ili nivoa ekspresije polinukleotida od interesa. Takvi ekspresioni konstrukti mogu takođe sadržati, po želji, regulatorni region promotora (npr. onaj koji daje inducibilnu, konstitutivnu, ekološki- ili razvojno-regulisanu, ili ćelijski- ili tkivnospecifičnu/selektivnu ekspresiju), početno mesto inicijacije transkripcije, vezujuće mesto za ribozom, signal za obradu RNK, mesto terminacije transkripcije, i/ili signal poliadenilacije.
[0205] Ekspresiona kaseta koja sadrži ovde obezbeđene polinukleotide takođe može sadržati gen selekcionog markera za selekciju transformisanih ćelija. Geni selekcionog markera se koriste za selekciju transformisanih ćelija ili tkiva.
[0206] Gde je to prikladno, sekvence korišćene u postupcima i kompozicijama (tj. polinukleotid od interesa, agens nukleaze, itd.) mogu biti optimizovane za pojačanu ekspresiju u ćeliji. To jest, geni mogu biti sintetisani upotrebom kodona preferiranih u datoj ćeliji od interesa uključujući, na primer, kodone preferirane u sisaru, kodone preferirane u čoveku, kodone preferirane u glodaru, kodone preferirane u mišu, kodone preferirane u pacovu, itd. za poboljšanu ekspresiju.
VIII. Identičnost sekvence
[0207] Ovde obezbeđeni postupci i kompozicije koriste niz različitih komponenti ciljanog integracionog sistema (tj. agensi nukleaze, mesta za prepoznavanje, insertovane polinukleotide, polinukleotide od interesa, vektore koji ciljno deluju, selekcione markere i druge komponente). Kroz opis je prepoznato da neke komponente ciljanog integracionog sistema mogu imati aktivne varijante i fragmente. Takve komponente uključuju, na primer, agense nukleaze (tj. projektovane agense nukleaze), mesta za prepoznavanje agensa nukleaze, polinukleotide od interesa, ciljna mesta i odgovarajuće homologne grane vektora koji ciljno deluje. Biološka aktivnost svake od ovih komponenti je ovde opisana na drugom mestu.
[0208] Kako se ovde upotrebljava, "identičnost sekvence" ili "identičnost" u kontekstu dve sekvence polinukleotida ili polipeptida upućuje na ostatke u dve sekvence koji su isti kada su poravnati radi maksimalne korespondencije preko navedenog prozora za upoređivanje. Kada se procenat identičnosti sekvence upotrebljava u pozivanju na proteine prepoznato je da se pozicije ostataka koji nisu identični često razlikuju po konzervativnim supstitucijama aminokiselina, gde su amino-kiselinski ostaci supstituisani za druge amino-kiselinske ostatke sa sličnim hemijskim svojstvima (npr. naelektrisanje ili hidrofobnost) i stoga ne menjaju funkcionalna svojstva molekula. Kada se sekvence razlikuju u konzervativnim supstitucijama, procenat identičnosti sekvence se može podesiti prema gore kako bi se ispravila konzervativna priroda supstitucije. Za sekvence koje se razlikuju po takvim konzervativnim supstitucijama kaže se da imaju "sličnost sekvence" ili "sličnost". Sredstva za izvođenje ovog podešavanja dobro su poznata stručnjacima u oblasti. Tipično to uključuje ocenjivanje konzervativne supstitucije kao parcijalne rađe nego potpune neusklađenosti, čime se povećava procenat identičnosti sekvence. Stoga, na primer, gde se identičnoj amino-kiselini daje ocena 1 i nekonzervativnoj supstituciji daje ocena nula, konzervativnoj supstituciji daje se ocena između nule i 1. Ocenjivanje konzervativnih supstitucija računa se, npr. kao što je implementirano u programu PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).
[0209] Kako se ovde upotrebljava, "procenat identičnosti sekvence" znači vrednost koja je određena upoređivanjem dve optimalno poravnate sekvence preko prozora za upoređivanje, pri čemu deo sekvence polinukleotida u prozoru za upoređivanje može sadržati adicije ili delecije (tj. praznine) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se identična baza nukleinske kiseline ili amino-kiselinski ostatak javlja u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih pozicija, deljenjem broja podudarnih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru za upoređivanje, i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence.
4
[0210] Ukoliko nije drugačije navedeno, vrednosti identičnosti/sličnosti sekvence koje su ovde obezbeđene označavaju vrednost dobijenu upotrebom GAP verzije 10 upotrebom sledećih parametara: % identičnosti i % sličnosti za nukleotidnu sekvencu upotrebom GAP težine od 50 i težine dužine 3, i nwsgapdna.cmp matriksa za ocenjivanje; % identičnosti i % sličnosti za amino-kiselinsku sekvencu upotrebom GAP težine od 8 i težine dužine 2, i BLOSUM62 matriksa za ocenjivanje; ili bilo kog njemu ekvivalentnog programa. "Ekvivalentni program" znači bilo koji program za poređenje sekvenci koji, za bilo koje dve sekvence u pitanju, generiše poravnanje koje ima identične podudarnosti nukleotida ili aminokiselinskih ostataka i identičan procenat identičnosti sekvence u poređenju sa odgovarajućim poravnanjem koje je generisano pomoću GAP verzije 10.
[0211] Sledeći primeri su ponuđeni kao ilustracija i ne kao ograničenje.
PRIMERI
[0212] Eksperimenti sekvencijalnog genskog ciljnog delovanja prikazani na Sl. 1 i 2 pokazali su vrednost kombinovanja velikog vektora koji ciljno deluje zasnovanog na BAC (LTVEC) sa cinkani prst nukleazom (ZFN) dizajniranom da prepozna i iseče ciljnu sekvencu u selekcionoj kaseti leka.
[0213] Za prvi korak u sekvencijalnom ciljnom delovanju (Sl.1), LTVEC je konstruisan da stvori modifikaciju (TCRα B-hyg alel) koja insertuje 136 kb DNK koja kodira 11 varijabilnih (V) domena humanog alfa T-ćelijskog receptora (TCRα) u odgovarajući TCRα lokus miša.
0,02 mg konstruisanog LTVEC je elektroporisano u 10 miliona embrionalnih matičnih (ES) ćelija miša koje su nosile prethodno stvorenu modifikaciju (TCRα A-neo alel) na TCRα lokusu, koji je zamenio segmente mišjeg varijabilnog (V) i povezujućeg (J) gena sa humanim V i J. Posle izdvajanja elektroporisane ES ćelije u medijumu za rast, dodat je higromicin za selektovanje kolonija koje su izvedene iz ćelija koje su inkorporisale LTVEC u svoje genome. Pregled modifikacije alela (MOA) izolovanih kolonija rezultirao je identifikacijom četiri pravilno ciljana klona među 136 pregledanih kolonija rezistentnih na higromicin, za efikasnost ciljnog delovanja od 2,9% (Tabela 1, Eksperiment 1). Pored insertovanja 11 dodatnih V, pravilno ciljani klonovi imali su kasetu za rezistenciju na higromicin (hygr) koja je zamenila kasetu za rezistenciju na neomicin (G418) (neor).
[0214] Eksperiment 2 je bio identičan Eksperimentu 1 osim dodavanja 0,02 mg svakog od dva plazmida koji eksprimiraju svaki polovinu Neo-ZFN(1,2), koja se veže za sekvence za prepoznavanje u neor genu i katalizuje dvolančani prekid u DNK. Uključivanje NeoZFN(1,2) rezultiralo je sa 55 pravilno ciljanih klonova od 568 pregledanih klonova rezistentnih na higromicin, za efikasnost ciljnog delovanja od 9,7%, što predstavlja 3,3 puta veću efikasnost ciljnog delovanja u poređenju sa elektroporacijom samo sa LTVEC (Tabela 1, uporediti Eksperimente 1 i 2).
[0215] Eksperiment 3 je bio identičan Eksperimentu 2 osim što su plazmidi koji kodiraju Neo-ZFN(3,4) zamenili one za Neo-ZFN(1,2). Uključivanje Neo-ZFN(3,4) rezultiralo je sa 42 pravilno ciljanih klonova od 360 pregledanih klonova rezistentnih na higromicin, za efikasnost ciljnog delovanja od 11,7%, što predstavlja 4 puta veću efikasnost ciljnog delovanja u poređenju sa elektroporacijom samo sa LTVEC (Tabela 1, uporediti Eksperimente 1 i 3).
[0216] Za drugi korak u sekvencijalnom ciljnom delovanju (Sl. 2), elektroporacija 0,002 mg LTVEC dizajniranog da stvori modifikaciju (TCRα C-neo alel) koja insertuje 157 kb DNK koja kodira 11 dodatnih humanih TCRα varijabilnih (V) domena različitih od onih u TCRα A-neo ili B-hyg alelima u 10 miliona embrionalnih matičnih (ES) ćelija miša koje su nosile TCRα B-hyg alel napravljen u prvom koraku sekvencijalnog ciljnog delovanja (Sl. 1), introdukovala je LTVEC u ES ćelije. Posle izdvajanja elektroporisane ES ćelije u medijumu za rast, dodat je G418 za selektovanje kolonija koje su izvedene iz ćelija koje su inkorporisale LTVEC u svoje genome. MOA pregled izolovanih kolonija rezultirao je identifikacijom dva pravilno ciljana klona među 192 pregledane kolonije rezistentne na G418, za efikasnost ciljnog delovanja od 1,0% (Tabela 1, Eksperiment 4). Pored insertovanja 11 dodatnih V, pravilno ciljani klonovi imali su neor kasetu koja je zamenila hygr kasetu.
[0217] Eksperiment 5 je bio identičan Eksperimentu 4 osim dodavanja 0,02 mg svakog od dva plazmida koji eksprimiraju svaki polovinu Hyg-ZFN(1,2), koja se veže za sekvence za prepoznavanje u hygr i katalizuje dvolančani prekid u DNK. Uključivanje Hyg-ZFN(1,2) rezultiralo je sa 40 pravilno ciljanih klonova od 192 pregledana klona rezistentna na G418, za efikasnost ciljnog delovanja od 21%, što predstavlja 21 put veću efikasnost ciljnog delovanja u poređenju sa elektroporacijom samo sa LTVEC (Tabela 1, uporediti Eksperimente 4 i 5).
[0218] Eksperiment 6 je bio identičan Eksperimentu 5 osim što su plazmidi koji kodiraju Hyg-ZFN(3,4) zamenili one za Hyg-ZFN(1,2). Uključivanje Hyg-ZFN(3,4) rezultiralo je sa 42 pravilno ciljana klona od 192 pregledana klona rezistentna na higromicin, za efikasnost ciljnog delovanja od 22%, što predstavlja 22 puta veću efikasnost ciljnog delovanja u poređenju sa elektroporacijom samo sa LTVEC (Tabela 1, uporediti Eksperimente 4 i 6).
[0219] Eksperimenti sažeti u Tabeli 1 utvrdili su da uključivanje ZFN koje ciljaju neo<r>ili hyg<r>selekcione kasete sa LTVEC u eksperimentima sekvencijalnog ciljnog delovanja mogu da poboljšaju efikasnost ciljnog delovanja faktorom od 3 do 20 puta u poređenju sa eksperimentima ciljnog delovanja koji uključuju samo LTVEC. Poboljšana efikasnost ciljnog delovanja proizvedena pomoću uključivanja ZFN u eksperimentima sekvencijalnog ciljnog delovanja promovisala je pravilno predviđeno insertovanje veoma krupnih delova (136 kb i 157 kb) humane DNK precizno na željenu hromozomsku poziciju prethodno modifikovanog alela. Ciljno delovanje poboljšano ZFN umnogome povećava verovatnoću uspeha u projektu ciljnog delovanja i donosi značajne uštede u vremenu, radu, i materijalnim troškovima za pregled ES ćelija.
Tabela 2. Uzorak gRNA za upotrebu u ciljnom delovanju na markere za rezistenciju na neomicin i higromicin
SEQ ID NO gRNA
13 Neo Crispr#1 UGCGCAAGGAACGCCCGUCG
14 Neo Crispr#2 GGCAGCGCGGCUAUCGUGGC
15 Neo Crispr#3 ACGAGGCAGCGCGGCUAUCG
16 Neo Crispr#4 GCUCUGAUGCCGCCGUGUUC
17 Hyg Crispr#1 ACGAGCGGGUUCGGCCCAUU
18 Hyg Crispr#6 CUUAGCCAGACGAGCGGGUU
19 Hyg Crispr#10 GCCGAUCUUAGCCAGACGAG
20 Hyg Crispr#16 CGACCUGAUGCAGCUCUCGG
Sve publikacije i patentne prijave pomenute u specifikaciji indikativne su na nivou stručnjaka u oblasti na koje se ovaj pronalazak odnosi. Pozivanje na opseg uključuje bilo koje cele brojeve unutar opsega, bilo koji podopseg unutar opsega. Pozivanje na više opsega uključuje kompozite takvih opsega.
1
2
4

Claims (18)

Patentni zahtevi
1. Postupak za serijsku modifikaciju ciljnog lokusa u ćeliji, naznačen time što sadrži:
(a) obezbeđivanje ćelije koja sadrži ciljni lokus, pri čemu ciljni lokus sadrži polinukleotid koji kodira prvi selekcioni marker koji je operativno povezan sa prvim promotorom i koji sadrži prvo mesto za prepoznavanje za prvi agens nukleaze, pri čemu je prvo mesto za prepoznavanje nukleaze smešteno u kodirajućem regionu prvog selekcionog markera ili bilo kom ne-proteinkodirajućem regionu prvog selekcionog markera, opciono pri čemu je ciljni lokus u genomu ćelije ili je smešten u vektoru u ćeliji;
(b) introdukovanje u ćeliju:
(i) prvog agensa nukleaze, pri čemu prvi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na prvom mestu za prepoznavanje nukleaze, čime se narušava ekspresija ili aktivnost prvog selekcionog markera; i
(ii) prvog vektora koji ciljno deluje koji sadrži prvi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana prvom homolognom granom koja odgovara prvom ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu i drugom homolognom granom koja odgovara drugom ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu, pri čemu prvi insertovani polinukleotid sadrži: (I) prvi polinukleotid od interesa; i (II) polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker koji je operativno povezan sa drugim promotorom i koji sadrži drugo mesto za prepoznavanje nukleaze za drugi agens nukleaze,
pri čemu su prvi selekcioni marker i drugi selekcioni marker različiti, pri čemu je prvi agens nukleaze različit od drugog agensa nukleaze, i pri čemu je drugo mesto za prepoznavanje nukleaze smešteno u kodirajućem regionu drugog selekcionog markera ili bilo kom ne-protein-kodirajućem regionu drugog selekcionog markera;
(c) identifikovanje modifikovane ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid na ciljnom lokusu, pri čemu modifikovana ćelija ima aktivnost drugog selekcionog markera ali nema aktivnost prvog selekcionog markera, opciono pri čemu se identifikovanje vrši putem testa modifikacije alela (MOA);
(d) introdukovanje u modifikovanu ćeliju:
(i) drugog agensa nukleaze, pri čemu drugi agens nukleaze indukuje nik ili dvolančani prekid na drugom mestu za prepoznavanje nukleaze, čime se narušava ekspresija ili aktivnost drugog selekcionog markera; i
(ii) drugog vektora koji ciljno deluje koji sadrži drugi insertovani polinukleotid omeđen sa bočnih strana trećom homolognom granom koja odgovara trećem ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu i četvrtom homolognom granom koja odgovara četvrtom ciljnom mestu smeštenom u ciljnom lokusu, pri čemu drugi insertovani polinukleotid sadrži: (I) drugi polinukleotid od interesa; i (II) polinukleotid koji kodira treći selekcioni marker koji je operativno povezan sa trećim promotorom koji je aktivan u ćeliji i koji sadrži treće mesto za prepoznavanje nukleaze za treći agens nukleaze,
pri čemu su prvi selekcioni marker i treći selekcioni marker identični, i
pri čemu je treće mesto za prepoznavanje nukleaze identično prvom mestu za prepoznavanje nukleaze i različito je od drugog mesta za prepoznavanje nukleaze, i prvi agens nukleaze i treći agens nukleaze identični su jedan drugom i različiti su od drugog agensa nukleaze; i
(e) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u ciljni lokus, opciono pri čemu se identifikovanje vrši putem testa modifikacije alela (MOA).
2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što korak identifikovanja (c) sadrži:
(i) uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje ćelija koje nemaju aktivnost prvog selekcionog markera; ili
(ii) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži prvi insertovani polinukleotid integrisan u prvo i drugo ciljno mesto; i/ili
pri čemu korak identifikovanja (e) sadrži:
(i) uzgajanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju identifikovanje ćelija koje nemaju aktivnost drugog selekcionog markera; ili
(ii) identifikovanje najmanje jedne ćelije koja sadrži drugi insertovani polinukleotid integrisan u treće i četvrto ciljno mesto.
3. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je polinukleotid koji kodira drugi selekcioni marker u modifikovanoj ćeliji u koraku (c) omeđen sa bočnih strana trećim ciljnim mestom i četvrtim ciljnim mestom.
4. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što prvi, drugi, ili treći selekcioni marker daje rezistenciju na antibiotik, opciono pri čemu antibiotik sadrži G418, higromicin, blasticidin, neomicin, ili puromicin, ili pri čemu je prvi, drugi, ili treći selekcioni marker operativno povezan sa inducibilnim promotorom, i ekspresija selekcionog markera je toksična za ćeliju, opciono pri čemu prvi, drugi, ili treći selekcioni marker sadrži hipoksantin-guanin fosforiboziltransferazu (HGPRT) ili timidin kinazu Herpes simplex virusa (HSV-TK).
5. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je ćelija eukariotska ćelija, opciono pri čemu je eukariotska ćelija ćelija sisara, opciono pri čemu je ćelija sisara:
(a) ćelija ne-humanog sisara;
(b) pluripotentna ćelija;
(c) humana indukovana pluripotentna matična ćelija;
(d) humani fibroblast; ili
(e) ćelija glodara.
6. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što je ćelija embrionalna matična (ES) ćelija miša ili ES ćelija pacova.
7. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što kombinovana upotreba prvog vektora koji ciljno deluje sa prvim agensom nukleaze rezultira povećanom efikasnošću ciljnog delovanja u poređenju sa upotrebom samo prvog vektora koji ciljno deluje, opciono pri čemu je efikasnost ciljnog delovanja prvog vektora koji ciljno deluje povećana najmanje dvostruko u poređenju sa upotrebom samo prvog vektora koji ciljno deluje.
8. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što prvi agens nukleaze, drugi agens nukleaze, ili treći agens nukleaze:
(a) sadrži polinukleotid koji kodira agens nukleaze, pri čemu je polinukleotid sadržan u ekspresionoj kaseti i operativno je povezan sa kondicionalnim promotorom, inducibilnim promotorom, konstitutivnim promotorom, ili tkivnospecifičnim promotorom;
(b) je iRNK koja kodira nukleazu;
(c) je cinkani prst nukleaza (ZFN);
(d) je efektorska nukleaza slična aktivatoru transkripcije (TALEN);
(e) je meganukleaza; ili
(f) je sa grupisanim kratkim palindromskim ponovcima na jednakim rastojanjima (CRISPR)-povezan (Cas) protein i vodeća RNK (gRNA).
9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što je prvi agens nukleaze, drugi agens nukleaze, ili treći agens nukleaze Cas protein i vodeća RNK, pri čemu je Cas protein Cas9, i pri čemu vodeća RNK (gRNA) sadrži:
(a) CRISPR RNK (crRNA) koja cilja prvo, drugo, ili treće mesto za prepoznavanje, pri čemu je prvo, drugo, ili treće mesto za prepoznavanje neposredno omeđeno sa bočnih strana protospejser susednog motiva (PAM) sekvencom.
(b) trans-aktivirajuću CRISPR RNK (tracrRNA);
opciono pri čemu ciljni lokus sadrži nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 1; i
opciono pri čemu gRNA sadrži himernu RNK koja ima sekvencu nukleinske kiseline SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 3 ili tracrRNA koja sadrži SEQ ID NO: 7 ili SEQ ID NO: 8.
10. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što:
(a) prvo ciljno mesto i drugo ciljno mesto su neposredno pored prvog mesta za prepoznavanje nukleaze;
(b) prvo ciljno mesto i drugo ciljno mesto su oko 10 nukleotida do oko 14 kb od prvog mesta za prepoznavanje nukleaze;
(c) treće ciljno mesto i četvrto ciljno mesto su neposredno pored drugog mesta za prepoznavanje nukleaze; ili
(d) treće ciljno mesto i četvrto ciljno mesto su oko 10 nukleotida do oko 14 kb od drugog mesta za prepoznavanje nukleaze.
11. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što:
(a) ukupan zbir prve homologne grane i druge homologne grane je najmanje oko 10 kb ili je svaka od prve i druge homologne grane u opsegu od oko 5 kb do oko 100 kb; i/ili
(b) ukupan zbir treće homologne grane i četvrte homologne grane je najmanje oko 10 kb ili je svaka od treće i četvrte homologne grane u opsegu od oko 5 kb do oko 100 kb; i/ili
(c) prvi vektor koji ciljno deluje je najmanje oko 10 kb ili je od oko 20 kb do oko 300 kb; i/ili
(d) drugi vektor koji ciljno deluje je najmanje oko 10 kb ili je od oko 20 kb do oko 300 kb; i/ili
(e) prvi insertovani polinukleotid dugačak je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb; i/ili
(f) drugi insertovani polinukleotid dugačak je u opsegu od oko 5 kb do oko 300 kb.
12. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što:
(a) integracija prvog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira knockoutom, knock-in-om, tačkastom mutacijom, zamenom domena, zamenom egzona, zamenom introna, zamenom regulatorne sekvence, zamenom gena, ili njihovom kombinacijom; i/ili
(b) integracija drugog insertovanog polinukleotida u ciljni lokus rezultira knockout-om, knock-in-om, tačkastom mutacijom, zamenom domena, zamenom
1
egzona, zamenom introna, zamenom regulatorne sekvence, zamenom gena, ili njihovom kombinacijom.
13. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što:
(a) prvi polinukleotid od interesa sadrži humani polinukleotid, sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline u genomu ćelije, ili sekvencu egzogene nukleinske kiseline, opciono pri čemu prvi polinukleotid od interesa sadrži:
(i) region alfa lokusa T ćelijskog receptora, opciono pri čemu prvi polinukleotid od interesa sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona i/ili segment gena povezujućeg regiona alfa lokusa T ćelijskog receptora; ili
(ii) nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina; i/ili
(b) drugi polinukleotid od interesa sadrži humani polinukleotid, sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna ili ortologna sekvenci nukleinske kiseline u genomu ćelije, ili sekvencu egzogene nukleinske kiseline, opciono pri čemu drugi polinukleotid od interesa sadrži:
(i) region alfa lokusa T ćelijskog receptora, opciono pri čemu drugi polinukleotid od interesa sadrži najmanje jedan segment gena varijabilnog regiona i/ili segment gena povezujućeg regiona alfa lokusa T ćelijskog receptora; ili
(ii) nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina koja je operativno povezana sa sekvencom nukleinske kiseline konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina.
14. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što:
2
(a) prvi polinukleotid od interesa i/ili drugi polinukleotid od interesa sadrži najmanje jedan alel bolesti;
(b) prvi polinukleotid od interesa i/ili drugi polinukleotid od interesa sadrži sekvencu genske nukleinske kiseline koja kodira amino-kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona teškog lanca humanog imunoglobulina; ili
(c) prvi polinukleotid od interesa i/ili drugi polinukleotid od interesa sadrži sekvencu genske nukleinske kiseline koja kodira amino-kiselinsku sekvencu varijabilnog regiona lakog lanca humanog imunoglobulina, opciono pri čemu:
(i) sekvenca genske nukleinske kiseline sadrži nereorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i/ili κ lakog lanca; ili
(ii) sekvenca genske nukleinske kiseline sadrži reorganizovanu sekvencu nukleinske kiseline varijabilnog regiona λ i/ili κ lakog lanca.
15. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što:
(a) ciljni lokus sadrži lokus imunoglobulina; ili
(b) ciljni lokus sadrži lokus T ćelijskog receptora, opciono pri čemu je lokus T ćelijskog receptora alfa lokus T ćelijskog receptora.
16. Postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time što prvi agens nukleaze, drugi agens nukleaze, i treći agens nukleaze su svaki Cas protein i vodeća RNK, i pri čemu je vodeća RNK (gRNA) specifična za gen za rezistenciju na higromicin ili neomicin.
17. Postupak prema patentnom zahtevu 16, naznačen time što je gRNA specifična za gen za rezistenciju na neomicin kodirana nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 13, 14, 15, ili 16, ili pri čemu je gRNA specifična za gen za rezistenciju na higromicin kodirana nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 17, 18, 19, ili 20.
18. Postupak prema patentnom zahtevu 17, naznačen time što:
(a) prva gRNA kodirana je nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 13, 14, 15, ili 16, i druga gRNA kodirana je nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 17, 18, 19, ili 20; ili
(b) prva gRNA kodirana je nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 17, 18, 19, ili 20, i druga gRNA kodirana je nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu iznetu u SEQ ID NO: 13, 14, 15, ili 16.
4
RS20200430A 2014-06-06 2015-06-05 Postupci i kompozicije za modifikovanje ciljanog lokusa RS60359B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462008832P 2014-06-06 2014-06-06
US201462017916P 2014-06-27 2014-06-27
EP15729724.3A EP3152312B1 (en) 2014-06-06 2015-06-05 Methods and compositions for modifying a targeted locus
PCT/US2015/034503 WO2015188109A1 (en) 2014-06-06 2015-06-05 Methods and compositions for modifying a targeted locus

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60359B1 true RS60359B1 (sr) 2020-07-31

Family

ID=53404960

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200430A RS60359B1 (sr) 2014-06-06 2015-06-05 Postupci i kompozicije za modifikovanje ciljanog lokusa

Country Status (25)

Country Link
US (4) US10106820B2 (sr)
EP (2) EP3152312B1 (sr)
JP (2) JP6688231B2 (sr)
KR (1) KR102374379B1 (sr)
CN (2) CN113215196B (sr)
AU (1) AU2015269187B2 (sr)
BR (1) BR112016028564A2 (sr)
CA (1) CA2950173C (sr)
CY (1) CY1122897T1 (sr)
DK (1) DK3152312T3 (sr)
ES (2) ES3019688T3 (sr)
HR (1) HRP20200529T1 (sr)
HU (1) HUE049776T2 (sr)
IL (1) IL249042B (sr)
LT (1) LT3152312T (sr)
MX (1) MX385689B (sr)
NZ (1) NZ727481A (sr)
PL (1) PL3152312T3 (sr)
PT (1) PT3152312T (sr)
RS (1) RS60359B1 (sr)
RU (1) RU2704283C9 (sr)
SG (2) SG11201609634YA (sr)
SI (1) SI3152312T1 (sr)
SM (1) SMT202000264T1 (sr)
WO (1) WO2015188109A1 (sr)

Families Citing this family (80)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2734621B1 (en) 2011-07-22 2019-09-04 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
CN104364380B (zh) 2012-04-25 2018-10-09 瑞泽恩制药公司 核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向
AU2014218931C1 (en) 2013-02-20 2020-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
CA2908697C (en) 2013-04-16 2023-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340800B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College Extended DNA-sensing GRNAS
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
SG10201700961TA (en) 2013-12-11 2017-04-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for the targeted modification of a genome
HUE041331T2 (hu) 2013-12-11 2019-05-28 Regeneron Pharma Módszerek és készítmények a genom célzott módosításához
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
HUE049776T2 (hu) 2014-06-06 2020-10-28 Regeneron Pharma Módszerek és készítmények egy célzott lókusz módosítására
EP3161128B1 (en) 2014-06-26 2018-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
CA2956224A1 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
DK3207124T3 (da) 2014-10-15 2019-08-12 Regeneron Pharma Fremgangsmåder og sammensætninger til generering eller bevaring af pluripotente celler
EP3221457B1 (en) 2014-11-21 2019-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas
JP6840077B2 (ja) 2014-12-19 2021-03-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 単一ステップの複数標的化を通じた標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物
DK3359660T3 (en) 2015-10-05 2020-02-17 Prec Biosciences Inc Engineered meganucleases with recognition sequences found in the human t cell receptor alpha constant region gene
DK3359184T3 (da) * 2015-10-05 2020-06-15 Prec Biosciences Inc Genetisk modificerede celler, der omfatter et modificeret gen fra konstant alfaregion i human t-cellereceptor
EP4434589A3 (en) 2015-10-23 2025-05-14 President and Fellows of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
RU2018135819A (ru) * 2016-03-11 2020-04-13 Блубёрд Био, Инк. Иммунные эффекторные клетки с отредактированным геномом
US11802281B2 (en) * 2016-04-04 2023-10-31 Eth Zurich Mammalian cell line for protein production and library generation
SG11201808831TA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Transgenic t cell and chimeric antigen receptor t cell compositions and related methods
CN109475109B (zh) * 2016-05-20 2021-10-29 瑞泽恩制药公司 用于使用多个引导rna来破坏免疫耐受性的方法
SI3462853T1 (sl) 2016-06-03 2023-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Glodavci, ki izražajo eksogeno terminalno deoksinukleotidiltransferazo
CN107513538A (zh) * 2016-06-17 2017-12-26 北京大学 基因敲除方法
US11359234B2 (en) 2016-07-01 2022-06-14 Microsoft Technology Licensing, Llc Barcoding sequences for identification of gene expression
US20180004537A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Molecular State Machines
WO2018005117A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Microsoft Technology Licensing, Llc Storage through iterative dna editing
JP7231935B2 (ja) 2016-08-03 2023-03-08 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ アデノシン核酸塩基編集因子およびそれらの使用
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
AU2017342543B2 (en) 2016-10-14 2024-06-27 President And Fellows Of Harvard College AAV delivery of nucleobase editors
EP3766343B1 (en) 2016-11-04 2022-05-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having an engineered immunoglobulin lambda light chain locus
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
SG10202109874VA (en) 2017-01-19 2021-10-28 Open Monoclonal Tech Inc Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
WO2018151514A1 (ko) * 2017-02-16 2018-08-23 고려대학교 산학협력단 골재생 효능이 우수한 골질환 예방 또는 치료용 조성물
CN110662556A (zh) 2017-03-09 2020-01-07 哈佛大学的校长及成员们 癌症疫苗
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
WO2018167621A1 (en) * 2017-03-16 2018-09-20 Pfizer Inc. Tyrosine prototrophy
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CA3068465A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Precision Biosciences, Inc. Genetically-modified t cells comprising a modified intron in the t cell receptor alpha gene
EP3652320B1 (en) 2017-07-12 2025-12-24 Mayo Foundation for Medical Education and Research Materials and methods for efficient targeted knock in or gene replacement
US11732274B2 (en) 2017-07-28 2023-08-22 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE)
US12012596B2 (en) * 2017-08-21 2024-06-18 Tokushima University Target sequence specific alteration technology using nucleotide target recognition
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
JP2020534812A (ja) * 2017-09-08 2020-12-03 ライフ テクノロジーズ コーポレイション 改良された相同組換えおよびその組成物のための方法
KR20200121782A (ko) 2017-10-16 2020-10-26 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 아데노신 염기 편집제의 용도
US12406749B2 (en) 2017-12-15 2025-09-02 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
US20210017544A1 (en) * 2017-12-22 2021-01-21 Novozymes A/S Counter-Selection by Inhibition of Conditionally Essential Genes
CN107904208B (zh) * 2017-12-25 2019-11-01 云舟生物科技（广州）有限公司 细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用
CN111742051A (zh) * 2018-01-23 2020-10-02 基础科学研究院 延伸的单向导rna及其用途
US20190256867A1 (en) 2018-02-01 2019-08-22 Homology Medicines, Inc. Adeno-associated virus compositions for restoring pah gene function and methods of use thereof
JP7328243B2 (ja) 2018-03-26 2023-08-16 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 治療薬を試験するためのヒト化げっ歯類
US11786554B2 (en) 2018-04-12 2023-10-17 Precision Biosciences, Inc. Optimized engineered nucleases having specificity for the human T cell receptor alpha constant region gene
TW202014519A (zh) * 2018-05-04 2020-04-16 美商羅卡斯生物科學公司 殺目標細菌之組合物及方法
CN112654710A (zh) 2018-05-16 2021-04-13 辛瑟高公司 用于指导rna设计和使用的方法和系统
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
CN117904208A (zh) * 2018-12-30 2024-04-19 豪夫迈·罗氏有限公司 基于可检测标签与靶蛋白的CRISPR/Cas控制的整合而选择细胞的方法
WO2020154500A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
MX2021011426A (es) 2019-03-19 2022-03-11 Broad Inst Inc Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos.
US11111504B2 (en) * 2019-04-04 2021-09-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
WO2020232081A2 (en) * 2019-05-13 2020-11-19 Rapid Genomics Llc Capture and analysis of target genomic regions
WO2021016608A1 (en) * 2019-07-25 2021-01-28 Precision Biosciences, Inc. Compositions and methods for sequential stacking of nucleic acid sequences into a genomic locus
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
WO2021119594A1 (en) * 2019-12-13 2021-06-17 The Regents Of The University Of California Reducing antibiotic resistance in bacteria using pro-active genetics
IL271656A (en) 2019-12-22 2021-06-30 Yeda Res & Dev System and methods for identifying cells that have undergone genome editing
WO2021226558A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
TW202208632A (zh) 2020-05-27 2022-03-01 美商同源醫藥公司 用於恢復ｐａｈ基因功能的腺相關病毒組成物及其使用方法
US20240018493A1 (en) * 2020-11-10 2024-01-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Knock-in of large dna for long-term high genomic expression
CN114763559B (zh) * 2021-01-15 2024-07-19 中国农业大学 一种不依赖于同源重组的靶向性基因捕获系统及其应用
WO2023046038A1 (en) * 2021-09-24 2023-03-30 Immunocan Biotech Co. Ltd. Methods for large-size chromosomal transfer and modified chromosomes and organisims using same
EP4709869A1 (en) * 2023-05-10 2026-03-18 Takeda Pharmaceutical Company Limited Re-editable templates, cells, compositions and methods of making

Family Cites Families (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992003917A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International Homologous recombination in mammalian cells
US5830729A (en) 1996-04-18 1998-11-03 Institut Pasteur I Sce I-induced gene replacement and gene conversion in embryonic stem cells
AU8587598A (en) 1997-07-26 1999-02-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Trans-species nuclear transfer
DK1015576T3 (da) * 1997-09-16 2005-08-29 Egea Biosciences Llc Fremgangsmåde til fuldstændig kemisk syntese og aggregering af gener og genomer
WO2000039316A1 (en) 1998-12-31 2000-07-06 The J. David Gladstone Institutes Transgenic rodents and rodent cell lines expressing hiv co-receptors
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US20030104526A1 (en) 1999-03-24 2003-06-05 Qiang Liu Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers
CA2394850C (en) 1999-12-06 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050144655A1 (en) 2000-10-31 2005-06-30 Economides Aris N. Methods of modifying eukaryotic cells
EP1341914A2 (en) 2000-12-07 2003-09-10 Sangamo Biosciences Inc. Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins
AU2002225187A1 (en) 2001-01-22 2002-07-30 Sangamo Biosciences, Inc. Zinc finger polypeptides and their use
DK1353941T3 (da) 2001-01-22 2013-06-17 Sangamo Biosciences Inc Modificerede zinkfingerbindingsproteiner
AUPR451401A0 (en) 2001-04-20 2001-05-24 Monash University A method of nuclear transfer
US20030082591A1 (en) 2001-07-24 2003-05-01 Donald Awrey Methods for gene disruption and uses thereof
ATE347593T1 (de) 2002-01-23 2006-12-15 Univ Utah Res Found Zielgerichtete chromosomale mutagenese mit zinkfingernukleasen
US8206965B2 (en) 2002-03-15 2012-06-26 Cellectis S.A. Hybrid and single chain meganucleases and use thereof
EP1504092B2 (en) 2002-03-21 2014-06-25 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
US7612250B2 (en) 2002-07-29 2009-11-03 Trustees Of Tufts College Nuclear transfer embryo formation method
WO2004037977A2 (en) 2002-09-05 2004-05-06 California Institute Of Thechnology Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting
AU2003290518A1 (en) 2002-09-06 2004-04-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions concerning designed highly-specific nucleic acid binding proteins
US20030175968A1 (en) 2002-10-30 2003-09-18 Golic Kent G. Gene targeting method
CA2513226A1 (en) 2003-01-13 2004-07-29 Mahendra S. Rao Persistent expression of candidate molecule in proliferating stem and progenitor cells for delivery of therapeutic products
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
US7888121B2 (en) 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
EP1591521A1 (en) 2004-04-30 2005-11-02 Cellectis I-Dmo I derivatives with enhanced activity at 37 degrees C and use thereof
AU2005287278B2 (en) 2004-09-16 2011-08-04 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
FR2879622B1 (fr) 2004-12-17 2008-02-01 Agronomique Inst Nat Rech Procede in vitro de production d'ovocytes ou d'oeufs presentant une modification genomique ciblee
ES2347684T3 (es) 2005-03-15 2010-11-03 Cellectis Variantes de la meganucleasa i-crei con especificidad modifica, metodo de preparacion y usos de las mismas.
WO2006097784A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Cellectis I-crei meganuclease variants with modified specificity, method of preparation and uses thereof
WO2007005053A1 (en) 2005-06-30 2007-01-11 Codon Devices, Inc. Hierarchical assembly methods for genome engineering
GB0615327D0 (en) 2006-03-30 2006-09-13 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitors and uses thereof
AU2007235496B2 (en) 2006-03-31 2013-11-21 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Transgenic animals expressing chimeric antibodies for use in preparing human antibodies
CN101117633B (zh) 2006-08-03 2011-07-20 上海交通大学附属儿童医院 一种细胞核移植方法
US9187758B2 (en) 2006-12-14 2015-11-17 Sangamo Biosciences, Inc. Optimized non-canonical zinc finger proteins
US7771967B2 (en) 2006-12-22 2010-08-10 The J. David Gladstone Institutes Nucleic acid encoding apolipoprotein E-I3
US8110379B2 (en) 2007-04-26 2012-02-07 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration into the PPP1R12C locus
KR102096731B1 (ko) 2007-06-01 2020-04-02 오픈 모노클로날 테크놀로지, 인코포레이티드 내생적 면역글로불린 유전자를 억제하고 트랜스제닉 인간 이디오타입 항체를 생산하기 위한 방법 및 조성물
KR20100103810A (ko) 2007-12-10 2010-09-28 알리바 바이오파마수티컬스, 아이엔씨. 동종 재조합에 의한 표적화된 영역의 순차적인 치환 방법
JP5681114B2 (ja) 2008-12-04 2015-03-04 サンガモ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用したラットのゲノム編集
EP2206723A1 (en) 2009-01-12 2010-07-14 Bonas, Ulla Modular DNA-binding domains
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
AU2010226313B2 (en) 2009-03-20 2014-10-09 Sangamo Therapeutics, Inc. Modification of CXCR4 using engineered zinc finger proteins
EP2425018A4 (en) 2009-04-30 2013-06-05 Univ Columbia IN VIVO CONSTRUCTION OF DNA BY HOMOLOGOUS RECOMBINATION
US8772008B2 (en) 2009-05-18 2014-07-08 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for increasing nuclease activity
CN102638971B (zh) * 2009-07-08 2015-10-07 科马布有限公司 动物模型及治疗分子
US20120178647A1 (en) 2009-08-03 2012-07-12 The General Hospital Corporation Engineering of zinc finger arrays by context-dependent assembly
WO2011051390A1 (en) 2009-10-28 2011-05-05 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Homologous recombination in the oocyte
WO2011059799A1 (en) 2009-10-29 2011-05-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Multifunctional alleles
US20120315670A1 (en) 2009-11-02 2012-12-13 Gen9, Inc. Compositions and Methods for the Regulation of Multiple Genes of Interest in a Cell
EP2508595B1 (en) 2009-12-01 2016-11-23 National Cancer Center Method for constructing chimeric rat using rat embryonic stem cells
EP3456826B1 (en) 2009-12-10 2023-06-28 Regents of the University of Minnesota Tal effector-mediated dna modification
CA2951341A1 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Keygene N.V. Improved techniques for transfecting protoplasts
GEP201606544B (en) 2010-01-22 2016-09-26 Dow Agrosciences Llc Excision of transgenes in genetically modified organisms
EP2534163B1 (en) 2010-02-09 2015-11-04 Sangamo BioSciences, Inc. Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules
GB201009732D0 (en) 2010-06-10 2010-07-21 Gene Bridges Gmbh Direct cloning
CA2800534C (en) 2010-06-11 2019-01-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Production of fertile xy female animals from xy es cells
AU2011266843C9 (en) * 2010-06-17 2018-03-01 Kymab Limited Animal models and therapeutic molecules
CA2993567C (en) 2010-07-21 2022-06-28 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for modification of a t-cell receptor gene
WO2012018726A1 (en) 2010-08-02 2012-02-09 Cellectis Sa Method for increasing double-strand break-induced gene targeting
WO2012129198A1 (en) 2011-03-23 2012-09-27 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Genetically modified rat models for obesity and diabetes
CN114891797A (zh) 2011-10-28 2022-08-12 瑞泽恩制药公司 T细胞受体基因修饰小鼠
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
CN104364380B (zh) * 2012-04-25 2018-10-09 瑞泽恩制药公司 核酸酶介导的使用大靶向载体的靶向
CA2871524C (en) 2012-05-07 2021-07-27 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for nuclease-mediated targeted integration of transgenes
PL4289948T3 (pl) 2012-05-25 2025-06-02 The Regents Of The University Of California Sposoby i kompozycje do modyfikacji kierowanego na rna docelowego dna i do nakierowanej na rna modulacji transkrypcji
EP2912175B1 (en) 2012-10-23 2018-08-22 Toolgen Incorporated Composition for cleaving a target dna comprising a guide rna specific for the target dna and cas protein-encoding nucleic acid or cas protein, and use thereof
CN105142669B (zh) 2012-12-06 2018-07-03 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基于crispr的基因组修饰和调控
WO2014093622A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Delivery, engineering and optimization of systems, methods and compositions for sequence manipulation and therapeutic applications
PT2898075E (pt) 2012-12-12 2016-06-16 Harvard College Manipulação e otimização de sistemas, métodos e composições de enzima melhorados para manipulação de sequências
CN105658796B (zh) * 2012-12-12 2021-10-26 布罗德研究所有限公司 用于序列操纵的crispr-cas组分系统、方法以及组合物
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
EP4282970A3 (en) 2012-12-17 2024-01-17 President and Fellows of Harvard College Rna-guided human genome engineering
DK2938184T3 (en) 2012-12-27 2018-12-17 Keygene Nv Method of removing a genetic linkage in a plant
AU2014218931C1 (en) 2013-02-20 2020-05-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetic modification of rats
EP2922393B2 (en) 2013-02-27 2022-12-28 Helmholtz Zentrum München - Deutsches Forschungszentrum für Gesundheit und Umwelt (GmbH) Gene editing in the oocyte by cas9 nucleases
WO2014143381A1 (en) 2013-03-09 2014-09-18 Agilent Technologies, Inc. Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple crispr/cas selections of recombineering events
US20140349400A1 (en) 2013-03-15 2014-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Programmable Modification of DNA
US9234213B2 (en) * 2013-03-15 2016-01-12 System Biosciences, Llc Compositions and methods directed to CRISPR/Cas genomic engineering systems
WO2014153470A2 (en) * 2013-03-21 2014-09-25 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of t cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
JP2016522679A (ja) 2013-04-04 2016-08-04 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を用いたゲノム編集の治療的使用
CA2908697C (en) 2013-04-16 2023-12-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Targeted modification of rat genome
CN116083487A (zh) 2013-05-15 2023-05-09 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗遗传病状的方法和组合物
JP7065564B2 (ja) 2013-05-29 2022-05-12 セレクティス Ｃａｓ９ニッカーゼ活性を用いて正確なｄｎａ切断をもたらすための方法
AU2014281472A1 (en) 2013-06-19 2016-01-21 Sigma-Aldrich Co. Llc. Targeted integration
EP3418379B1 (en) 2013-09-18 2020-12-09 Kymab Limited Methods, cells & organisms
WO2015052231A2 (en) 2013-10-08 2015-04-16 Technical University Of Denmark Multiplex editing system
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
SG10201700961TA (en) 2013-12-11 2017-04-27 Regeneron Pharma Methods and compositions for the targeted modification of a genome
WO2015086798A2 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Cellectis New method of selection of algal-transformed cells using nuclease
US10233456B2 (en) 2014-01-30 2019-03-19 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method, vectors, cells, seeds and kits for stacking genes into a single genomic site
US20170076039A1 (en) 2014-04-24 2017-03-16 Institute For Basic Science A Method of Selecting a Nuclease Target Sequence for Gene Knockout Based on Microhomology
GB201407852D0 (en) 2014-05-02 2014-06-18 Iontas Ltd Preparation of libraries od protein variants expressed in eukaryotic cells and use for selecting binding molecules
HUE049776T2 (hu) 2014-06-06 2020-10-28 Regeneron Pharma Módszerek és készítmények egy célzott lókusz módosítására
EP3161128B1 (en) 2014-06-26 2018-09-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modifications and methods of use
DK3207124T3 (da) 2014-10-15 2019-08-12 Regeneron Pharma Fremgangsmåder og sammensætninger til generering eller bevaring af pluripotente celler
EP3221457B1 (en) 2014-11-21 2019-03-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for targeted genetic modification using paired guide rnas
JP6840077B2 (ja) 2014-12-19 2021-03-10 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 単一ステップの複数標的化を通じた標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物
GB201504223D0 (en) 2015-03-12 2015-04-29 Genome Res Ltd Biallelic genetic modification
WO2019046350A1 (en) 2017-08-30 2019-03-07 President And Fellows Of Harvard College ITERATIVE GENOMIC ASSEMBLY

Also Published As

Publication number Publication date
CA2950173C (en) 2023-10-10
HRP20200529T1 (hr) 2020-09-04
ES2784754T3 (es) 2020-09-30
RU2704283C2 (ru) 2019-10-25
US20190225992A1 (en) 2019-07-25
RU2016150168A (ru) 2018-07-18
AU2015269187A1 (en) 2017-01-12
IL249042A0 (en) 2017-01-31
PT3152312T (pt) 2020-04-23
EP3708671A1 (en) 2020-09-16
ES3019688T3 (en) 2025-05-21
JP2020137521A (ja) 2020-09-03
US10106820B2 (en) 2018-10-23
NZ727481A (en) 2023-06-30
SMT202000264T1 (it) 2020-07-08
PL3152312T3 (pl) 2020-08-10
SG10201913804WA (en) 2020-03-30
US20170211099A1 (en) 2017-07-27
CN106795521A (zh) 2017-05-31
CY1122897T1 (el) 2021-05-05
EP3152312B1 (en) 2020-02-12
SI3152312T1 (sl) 2020-07-31
EP3152312A1 (en) 2017-04-12
IL249042B (en) 2021-09-30
AU2015269187B2 (en) 2021-06-17
RU2016150168A3 (sr) 2018-12-05
JP2017520243A (ja) 2017-07-27
CN113215196A (zh) 2021-08-06
US10294494B2 (en) 2019-05-21
CN113215196B (zh) 2024-09-03
US20240352489A1 (en) 2024-10-24
US12060571B2 (en) 2024-08-13
KR102374379B1 (ko) 2022-03-17
DK3152312T3 (da) 2020-04-06
WO2015188109A1 (en) 2015-12-10
CA2950173A1 (en) 2015-12-10
LT3152312T (lt) 2020-04-27
BR112016028564A2 (pt) 2018-01-30
CN106795521B (zh) 2021-06-04
US20150376650A1 (en) 2015-12-31
RU2704283C9 (ru) 2020-02-07
JP6688231B2 (ja) 2020-04-28
AU2015269187A2 (en) 2017-01-19
EP3708671C0 (en) 2025-04-02
SG11201609634YA (en) 2016-12-29
MX2016016133A (es) 2017-08-04
HUE049776T2 (hu) 2020-10-28
KR20170027743A (ko) 2017-03-10
MX385689B (es) 2025-03-18
JP7154248B2 (ja) 2022-10-17
EP3708671B1 (en) 2025-04-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240352489A1 (en) Methods and compositions for modifying a targeted locus
JP7095066B2 (ja) 単一ステップの複数標的化を通じた標的化された遺伝子修飾のための方法及び組成物
RS58009B1 (sr) Postupci i supstance za ciljane genetske modifikacije i načini upotrebe
HK40035693A (en) Methods and compositions for modifying a targeted locus
HK1235817A1 (en) Methods and compositions for modifying a targeted locus
HK1235817B (en) Methods and compositions for modifying a targeted locus
HK1238083B (en) Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting
HK1238083A1 (en) Methods and compositions for targeted genetic modification through single-step multiple targeting