JP2017214383A - 標的リガンドをエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる核酸の部位特異的送達 - Google Patents

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Manoharan Muthiah
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Abstract

【課題】核酸の部位特異的送達のための構成物および方法の提供。
【解決手段】核酸、エンドソーム分解性成分、および標的リガンドを含む、式（１）で表されるモジュラー構成物。［Ｌｘ−Ｅ−｛（Ｅｘ−Ｌｘ−）Ａ｝ｙ］ｚ−核酸−［｛Ａ（−Ｅｘ−（ｘ）｝ｙ−Ｌ−Ｅｘ］ｚ・・・（１）（Ｅはエンドソーム分解成分；Ｌは標的リガンド；ｘは各々独立に０又は１；ｙは各々独立に１〜６の整数；ｚは０〜６の整数）
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、２００８年４月１１日出願の米国仮特許出願第６１／０４４，１８６号に対する優先権の利益を主張する。
本発明は、核酸を標的リガンドおよびエンドソーム分解性成分と組み合わせることによる、核酸の部位特異的送達のための構成物および方法に関する。
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」とは、ある特定の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を蠕虫に導入すると、遺伝子発現を阻止することができるという観察を説明するために、Ｆｉｒｅおよび共同研究者らによって最初に作り出された用語である（非特許文献１）。短い二本鎖干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）は、脊椎動物を含む多くの生物における遺伝子特異的な転写後サイレンシングを導き、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡ分解に関与し得る。
この分野の研究は、生きている哺乳動物へのｄｓｉＲＮＡの送達のための比較的煩雑な方法を特徴とする。例えば、非特許文献２は、マウスにおけるルシフェラーゼ・レポーター遺伝子の発現を阻害するためのｄｓｉＲＮＡの使用を実証した。ｄｓｉＲＮＡは、流体力学的な尾静脈注射の方法によって投与された（加えて、阻害は、２ｍｇ／ｋｇを超えるｄｓｉＲＮＡの注射に依存すると思われた）。
Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１，８０６−８１１ ＭｃＣａｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９，２００２
本発明者らは、とりわけ、幾つかの報告された研究に特有の扱いにくい方法が、哺乳動物に有効量のｄｓｉＲＮＡを提供するのに必要ではなく、特に、ヒト対象に治療量のｄｓｉＲＮＡを提供するのに必要ではないことを発見した。本発明の利点は、実用的で簡単な投与方法および治療への応用を含む。
本発明は、ｉＲＮＡ剤（例えばｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤）または他の核酸の送達のための構成物および方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明のモジュラー構成物および方法に使用され得る核酸としては、ｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、一本鎖ｉＲＮＡ、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、アプタマー、アンチセンス核酸、デコイオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ模倣体、ａｎｔｉｍｉｒ、活性化ＲＮＡ（ＲＮＡａ）、リボザイム、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、Ｕ１アダプター等が挙げられる。これらの核酸の誘導体もまた使用され得る。
したがって、一態様では、本発明は、核酸（例えばｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤）、エンドソーム分解性成分、および標的リガンドを含む、モジュラー構成物を特徴とする。
エンドソーム分解性成分は、ｐＨ依存性膜活性および融合性を示す、ポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣薬であってもよい。ある実施形態では、エンドソーム分解性成分は、エンドソームｐＨにおいてその活性立体配座を採る。「活性」立体配座は、エンドソーム分解性成分が、エンドソームの溶解、および／またはエンドソームから細胞の細胞質への本発明のモジュラー構成物もしくはその成分の輸送を促進する立体配座である。
また、エンドソームｐＨ（例えばｐＨ５〜６）対中性ｐＨにおけるそれらの異なる膜活性に対して、化合物ライブラリをスクリーニングするための方法を提供する。ある実施形態では、これらの方法は、溶血アッセイを利用してもよい。この方法によって単離される有望な候補は、本発明のモジュラー構成物の成分として有用であり得る。
標的リガンドは、例えば、本発明のモジュラー構成物の薬物動態、生体内分布、または細胞取り込みを変化させる、任意の部分であってもよい。例示的な標的リガンドとしては、例えば、血中タンパク質への結合に影響を及ぼすもの、および特定の器官、組織、または細胞の種類を標的とするものが挙げられる。標的化は、能動的または受動的であってもよい。能動的標的化は、例えば、標的リガンドとして、細胞表面抗原のための抗体または結合パートナーを使用することによって、達成されてもよい。受動的標的化は、例えば、生体内分布に影響を及ぼすように、本発明のモジュラー構成物の物理化学的特性（例えば分子量）を変化させることによって、達成され得る。受動的標的化の一例は、強化された透過性および滞留性（ＥＰＲ）効果である。
本発明のエンドソーム分解性成分および標的リガンドは、多くの異なる方法で核酸に連結されてもよく、それらの方法は、詳細な説明においてさらに詳細に説明される。ある実施形態では、エンドソーム分解性成分または標的リガンドを本発明のモジュラー構成物の別の成分に共有結合させるために、リンカーが使用されてもよい。このリンカーの性質（例えば開裂可能、または開裂不可能）は、用途に依存する。
ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤または他の核酸を、それを必要とする対象に送達するために、例えば、疾患、例えば本明細書に記載する疾患を有する対象に、ｉＲＮＡ剤を送達するために、モジュラー構成物が使用されてもよい。
ある実施形態では、モジュラー構成物は、典型的にエンドソームの内側に見られるものを上回るｐＨ（例えばｐＨ６．５を上回る、ｐＨ６．８を上回る、ｐＨ７．０を上回る、ｐＨ７．５を上回る、ｐＨ８．０を上回る、またはそれ以上）で保持、維持、または保存され得る。
別の態様では、本発明は、細胞にｉＲＮＡ剤または他の核酸を送達する方法を含む。この方法は、（ａ）本発明のモジュラー構成物を提供または取得し、（ｂ）細胞をモジュラー構成物と接触させ、（ｃ）細胞がモジュラー構成物を取り込むことを可能にする、各工程を有してなる。
この方法は、例えば、ｉＲＮＡ剤または他の核酸を必要としていると特定される対象を治療するために、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施することができる。上記の薬剤を必要としている対象は、遺伝子（複数を含む）、例えば、疾患に関連する遺伝子の発現が下方制御またはサイレンシングされる必要がある対象、例えば、ヒトである。
ある実施形態では、モジュラー構成物は、例えば、エンドサイトーシスによって、細胞によってエンドソームに取り込まれ得る。そのような実施形態では、モジュラー構成物は、エンドソームを分裂させ、例えば、モジュラー構成物またはその成分のいずれか（例えばｉＲＮＡ剤）の細胞の細胞質への放出をもたらすことができる。
一態様では、本発明は、１つ以上の遺伝子の発現を阻害するための方法を提供する。その方法は、１つ以上の細胞を本発明の有効量のオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、その有効量は、１つ以上の遺伝子の発現を抑制する量である。その方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで実施することができる。
別の態様では、本発明は、キットを特徴とする。キットは、（ａ）エンドソーム分解性成分、（ｂ）標的リガンド、ならびに（ｃ）ｉＲＮＡ剤または他の核酸をエンドソーム分解性成分および標的リガンドに付着させるための説明書を含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットは、ｉＲＮＡ剤または他の核酸を含んでもよい。いくつかの他の実施形態では、キットは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ投与のための説明書と共に、本発明のモジュラー構成物を含んでもよい。
本発明の方法および構成物、例えば、本明細書に記載するモジュラー構成物は、本明細書に記載するｉＲＮＡ剤または核酸のいずれとも一緒に使用することができる。本発明の方法および構成物はまた、当該技術分野で既知のｉＲＮＡ剤または核酸のいずれとも一緒に使用されてもよい。加えて、本発明の方法および構成物は、本明細書に記載するいずれの疾病または疾患の治療のためにも、および任意の対象、例えば、任意の動物、任意のヒト等の任意の哺乳動物の治療のために使用することができる。当業者はまた、本発明の方法および構成物が、遺伝子（複数を含む）の下方制御またはサイレンシングから利益を得るであろう、任意の疾病の治療のために使用されてもよいことを認識するであろう。
本発明の方法および構成物、例えば、本明細書に記載するモジュラー構成物は、本明細書に記載するいかなる投与量および／もしくは剤形、または当該技術分野で既知のいかなる投与量もしくは剤形でも使用することができる。本明細書に記載する投与経路に加えて、当業者はまた、他の投与経路が本発明のモジュラー構成物を投与するために使用されてもよいことを理解するであろう。
本明細書で使用する「ＲＮＡ剤」は、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代替物であり、それらの全ては本明細書に定義されており、ＲＮＡ剤と題する本明細書の項を参照されたい。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシド代替物が本明細書に記載されるが、例としては、ヌクレアーゼ分解に対して非修飾ＲＮＡよりも大きい耐性を有するものが挙げられる。さらなる例としては、２’糖修飾、一本鎖突出部における修飾、例えば、３'一本鎖突出部、または特に一本鎖の場合、１つ以上のリン酸基またはリン酸基の１つ以上の類似体を含む５'修飾を有するものが挙げられる。
本明細書で使用する「ｉＲＮＡ剤」は、例えば、内在性または病原体標的ＲＮＡ等、標的遺伝子の発現を下方制御することができるＲＮＡ剤、または標的遺伝子の発現を下方制御することができるＲＮＡ剤に開裂することができるＲＮＡ剤である。理論によって束縛されることを望まないが、ｉＲＮＡ剤は、当該技術分野で時にＲＮＡｉと称される標的ｍＲＮＡの転写後開裂、または転写前もしくは翻訳前機構を含む、多くの機構のうちの１つ以上によって作用し得る。ｉＲＮＡ剤は、一本鎖を含むことができるか、または２つ以上の鎖を含むことができ、例えば、それは、二本鎖ｉＲＮＡ剤であってもよい。ｉＲＮＡ剤が一本鎖である場合、それは、１つ以上のリン酸基、またはリン酸基の１つ以上の類似体を含む、５'修飾を含んでもよい。
一態様では、本発明のモジュラー構成物は、標的遺伝子の発現を調整することができる。「調整する」とは、遺伝子の発現、または１つ以上のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子の相当物のレベル、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性が上方制御または下方制御されて、発現、レベル、または活性がモジュレータの非存在下で観察されるものよりも大きくなる、または小さくなることを意味する。例えば、「調整する」という用語は、「阻害する」を意味し得るが、「調整する」という用語の使用は、この定義に限定されない。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面および以下の詳細な説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、本明細書および特許請求の範囲から明らかとなろう。当業者は、本発明のさらなる実施形態が存在することを容易に認識するであろう。本願は、全ての引用された参考文献、特許、および特許出願を、その全体を参照することにより本明細書に組み込む。
核酸（例えばｉＲＮＡ）、標的リガンド、およびエンドソーム分解性成分を含む、いくつかの例示的なモジュラー構成物の略図。Ａ）核酸上の同一末端側への標的リガンドおよびエンドソーム分解性成分の共役（同一鎖および末端）、Ｂ）同一鎖であるが反対側の末端への標的リガンドおよびエンドソーム分解性成分の共役、Ｃ）反対側の鎖であるが同一末端への標的リガンドおよびエンドソーム分解性成分の共役、Ｄ）反対側の鎖および反対側の末端への標的リガンドおよびエンドソーム分解性成分の共役。本実施形態では、コレステロールが標的リガンドとして使用される。標的リガンドはまた、図２に概略的に示すように、エンドソーム分解性成分に共役されてもよい。 核酸（例えばｉＲＮＡ）は、標的リガンドがエンドソーム分解性成分に共有結合される場所で共役する（核酸−エンドソーム分解性成分−標的リガンド）。核酸−標的リガンド−エンドソーム分解性成分の配列もまた考えられる。 ｐＨ感受性リンカーによって、標的リガンドおよびエンドソーム分解剤をオリゴヌクレオチドに共役させるためのいくつかの例示的な戦略。 オリゴヌクレオチドに共役された、標的リガンド（葉酸）およびエンドソーム分解剤（スペルミン）の略図。 エンドソーム分解剤および標的リガンドをオリゴヌクレオチドと共役させるためのいくつかの例示的な合成モノマーで。 ＧａｌＮＡｃ２を標的リガンドとして使用する、異なるエンドソーム分解剤を有する、例示的なモジュラー構成物。 ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３の化学構造。 ビオチン化ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３。
一態様では、本発明は、核酸、少なくとも１つのエンドソーム分解性成分、および少なくとも１つの標的リガンドを含む、モジュラー構成物を特徴とする。エンドソーム分解性成分はまた、本明細書においてエンドソーム分解性リガンドおよびエンドソーム分解剤とも称される。
モジュラー構成物は、式：
Figure 2017214383
 を有し得、式中、
Figure 2017214383
は、核酸であり、Ｅは、エンドソーム分解性成分であり、Ｌは、標的リガンドであり、ｘは存在ごとに独立して、０または１を表し、ｙは存在ごとに独立して、１、２、３、４、５、または６を表し、ｚは存在ごとに独立して、０、１、２、３、４、５、または６を表す。モジュラー構成物中、ＥおよびＬはそれぞれ、少なくとも１つは存在する。
好ましいモジュラー構成物は、式：
Figure 2017214383
 を有するモジュラー構成物、
式：
Figure 2017214383
 を有するモジュラー構成物であって、式中、ｚは独立して、１、２、３、４、５、または６である、モジュラー構成物、および
式：
Figure 2017214383
 を有するモジュラー構成物であって、式中、ｚは、一例において、１、２、３、４、５、または６であり、ｚは、他の例において、０、１、２、３、４、５、または６である、モジュラー構成物を含む。
Ａ部分は、連結部分である。エンドソーム分解性成分および／または標的リガンドを核酸に付着させるために、当該技術分野で既知の任意の部分が使用されてもよい。好ましくは、Ａは、
Figure 2017214383
 から成る群より選択される、連結部分であり、式中、
Ｚ１は存在ごとに独立して、ＯまたはＳを表し、
Ｚ２は存在ごとに独立して、−ＯＨ、−ＯＭ、−Ｏアルキル、−Ｏアリール、−Ｏアラルキル、−ＳＨ、−ＳＭ、−サルキル、−サリール、−アラルキル、−Ｎ（Ｒ３）Ｒ４、−Ｃ（Ｒ１１）２）ｍＮ（Ｒ１１）２、−Ｎ（Ｒ１１）（Ｃ（Ｒ１１）２）ｍＮ（Ｒ１１）２、またはアルキルを表し、
Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈもしくはアルキルを表すか、またはＲ３およびＲ４は一緒になって、３、４、５、６、もしくは７員環を形成し、
Ｒ１１は存在ごとに独立して、水素またはアルキルを表し、
Ｍは存在ごとに独立して、＋１の総電荷を有するアルカリ金属または遷移金属を表し、
Ｒ８は存在ごとに独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキル、アシル、シリル、核酸への結合、または、Ｂ１０と組み合わされる場合には連結部分間の結合を表し、
Ｂ１０は、Ａと核酸との結合、または、Ｒ８と組み合わされる場合には連結部分間の結合を表す。
Ａは、２つ以上であり得るため、連結部分は相互に結合され、次いで、エンドソーム分解性成分および／または標的リガンドに結合されてもよい。好ましい実施形態では、少なくとも２つのＡ連結部分が一緒に結合され、次いで、核酸に結合される。エンドソーム分解性成分および標的リガンドの両方は、同一連結部分を介して一緒に結合されてもよく、またはエンドソーム分解性成分が一方の連結部分に、標的リガンドが他方の連結部分に結合されてもよい。
連結部分は、連結部分とエンドソーム分解性成分および／または標的リガンドとの間にテザー（Ａ'）を含有してもよい。したがって、Ａ'は、式：−［（Ｐ−Ｑ−Ｒ）ｑ−Ｘ−（Ｐ'−Ｑ'−Ｒ'）ｑ'］ｑ"−Ｔ−を有する直接結合またはテザーであり、式中、
Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ'、およびＲ'はそれぞれ独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、Ｃ（Ｏ）−（随意的に置換されたアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2017214383
 シクリル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、Ｒ５０およびＲ５１は独立して、アルキル、置換アルキルであるか、またはＲ５０およびＲ５１は一緒になって、環式環を形成し、
ＱおよびＱ'はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ４０）（Ｒ４１）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ４０）（Ｒ４１）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、アリール、ヘテロアリール、シクリル、またはヘテロシクリルであり、
Ｘは、存在しないか、または開裂可能な連結基であり、
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり、
Ｒ４０およびＲ４１はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＸ）２であり、
ＲＸは、存在ごとに、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
ｑ、ｑ'、およびｑ”はそれぞれ独立して、０〜３０であり、
ｎは、存在ごとに、１〜２０の整数であり、
ｍは、存在ごとに、０〜５０の整数である。
好ましい実施形態では、テザーは、レドックス開裂可能な連結基、ｐＨ感受性成分、またはそれらの組み合わせを含有する。好ましいテザーは、アルキルジラジカル、ヘテロアルキルジラジカル、アルケニルジラジカル、アルキニルジラジカル、アルキルアルキニルジラジカル、アミノアルキルジラジカル、チオエーテル、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ）２−、または式：
Figure 2017214383
 を有するテザーを含み、式中、ｍは存在ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、または８を表し、ｍ１は存在ごとに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、または８を表し、ｐは存在ごとに独立して、１、２、３、または４を表し、Ｒは存在ごとに独立して、水素またはアルキルを表す。
より好ましいテザーは、
Figure 2017214383
 を含む。
本発明のエンドソーム分解性成分は、細胞内コンパートメント放出成分であり、エンドソーム、リソソーム、小胞体（ＥＲ）、ゴルジ装置、微小管、ペルオキシソーム、または他の細胞を伴う小胞体等、当該技術分野で既知の細胞内コンパートメントのいずれかからの放出が可能な任意の化合物であってもよい。
エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、核酸中のどこにでも位置することができる。例示的な位置は、５'末端、３'末端および／または内部非末端位置である。「末端」という用語は、オリゴヌクレオチドの末端からの最初の５つのヌクレオチドを含む。したがって、末端からの最初の５つのヌクレオチドは、末端内にあると考えられる。
例えば、５'末端は、核酸の一方または両方の鎖上にエンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方を含有してもよく、３'末端は、核酸の一方または両方の鎖上にエンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方を含有してもよく、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、核酸上の内部非末端位置に存在してもよく、または上記の任意の組み合わせでもよい。エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、相互を介して、および／または連結部分を介して付着されてもよい。モジュラー構成物は少なくとも１つのエンドソーム分解性成分および標的リガンドを含有するが、それは、６つ以上のエンドソーム分解性成分および６つ以上の標的リガンドを含有することができる。異なる数のエンドソーム分解性成分および標的リガンドが、構成物の所望の機能性に応じて、モジュラー構成物上に存在してもよい。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、オリゴヌクレオチドの同一末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、オリゴヌクレオチドの５'末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、オリゴヌクレオチドの３'末端上にある。
エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方が同一末端上にある場合、それらのうちの１つは、連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、オリゴヌクレオチドの反対側の末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、オリゴヌクレオチドの５'末端上にあり、標的リガンドは、オリゴヌクレオチドの３'末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、オリゴヌクレオチドの３'末端上にあり、標的リガンドは、オリゴヌクレオチドの５'末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドのうちの１つが末端上にある一方で、他方は、オリゴヌクレオチドの内部非末端部分に位置する。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、末端上にあり、標的リガンドは、内部位置に位置する。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、５'末端上にあり、標的リガンドは、内部位置に位置する。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、３'末端上にあり、標的リガンドは、内部位置に位置する。
いくつかの実施形態では、標的リガンドは、末端上にあり、エンドソーム分解性リガンドは、内部位置に位置する。
いくつかの実施形態では、標的リガンドは、５'末端上にあり、エンドソーム分解性リガンドは、内部位置に位置する。
いくつかの実施形態では、標的リガンドは、３'末端上にあり、エンドソーム分解性リガンドは、内部位置に位置する。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、内部非末端位置に位置する。
オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドである場合、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、同一鎖上または異なる鎖上に位置してもよい。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、同一鎖上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、センス鎖上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドの両方は、アンチセンス鎖上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、異なる鎖上に位置する。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドがセンス鎖上にある一方で、標的リガンドは、アンチセンス鎖上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドがセンス鎖上にある一方で、標的リガンドは、アンチセンス鎖上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの異なる鎖上であるが、同一末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、二本鎖オリゴヌクレオチドの異なる鎖上および反対側の末端上にある。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドは、異なる鎖上にあり、それらのうちの１つは、二本鎖オリゴヌクレオチドの末端上にあり、他方は、内部非末端位置に位置する。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドは、介在テザー／リンカーを介して、オリゴヌクレオチドに付着される。いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドは、オリゴヌクレオチドへの共役前にモノマーに連結される。エンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドは、直接またはリンカーを介してモノマーに連結され得る。エンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドは、上記のモノマーが成長鎖に組み込まれる場合、モノマー上に存在し得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが成長鎖に組み込まれた後に、上記の「前駆体」モノマーへのカップリングを介して組み込まれてもよい。例えば、アミノ終端テザー（すなわち、関連リガンドを有しない）、例えば、Ｘ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーは、成長オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれてもよい。後続の作業において、すなわち、前駆体モノマーの鎖への組み込み後に、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドは、続いて、リガンドの求電子基を前駆体モノマーのテザーの末端求核基とカップリングすることによって、前駆体モノマーに付着することができる。
別の例では、例えば、アジドまたはアルキン終端テザー／リンカー等、クリック化学反応に関与するのに好適な化学基を有するモノマーが組み込まれてもよい。後続の作業において、すなわち、前駆体モノマーの鎖への組み込み後に、相補化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドは、アルキンおよびアジドを一緒にカップリングすることによって、前駆体モノマーに付着することができる。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解剤および／または標的リガンドは、直接またはリンカーを介して、核酸塩基、糖部分、または核酸分子のインターヌクレオシド連結に共役することができる。プリン核酸塩基またはその誘導体への共役は、環内および環外原子を含む、任意の位置で生じることができる。いくつかの実施形態では、プリン核酸塩基の２、６、７、または８位置が、共役部分に付着される。ピリミジン核酸塩基またはその誘導体への共役もまた、任意の位置で生じることができる。いくつかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２、５、および６位置は、共役部分で置換することができる。ヌクレオシドの糖部分への共役は、任意の炭素原子で生じることができる。共役部分に付着することができる糖部分の例示的な炭素原子は、２'、３'、４'、および５'炭素原子を含む。１'位置もまた、脱塩基残基中等、共役部分に付着することができる。インターヌクレオシド連結はまた、共役部分を有することができる。リン含有連結（例えばホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミデート等）に対して、共役部分は、リン原子に直接、またはリン原子に結合されるＯ、Ｎ、もしくはＳ原子に付着することができる。アミンまたはアミド含有インターヌクレオシド連結（例えばＰＮＡ）に対して、共役部分は、アミンもしくアミドの窒素原子、または隣接する炭素原子に付着することができる。
オリゴマー化合物の共役体を調製するための多くの方法がある。概して、オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物上の反応基（例えばＯＨ、ＳＨ、アミン、カルボキシル、アルデヒド等）を共役部分上の反応基と接触させることによって、共役部分に付着される。いくつかの実施形態では、１つの反応基は、求電子性であり、他方は、求核性である。
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能性であってもよく、求核基は、アミンまたはチオールであってもよい。連結基を伴う、および伴わない核酸および関連オリゴマー化合物の共役の方法は、例えば、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ ＬｅＢｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ １７等の文献に詳細に記載されており、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、１つのエンドソーム分解性リガンドおよび２つ以上の標的リガンドが、オリゴヌクレオチド中に存在する。
いくつかの実施形態では、１つの標的リガンドおよび２つ以上の標的リガンドが、オリゴヌクレオチド中に存在する。
いくつかの実施形態では、２つ以上のエンドソーム分解性リガンドおよび２つ以上の標的リガンドが存在する。
オリゴヌクレオチドが二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつ複数のエンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドが存在する場合、そのような複数のエンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドは全て、二本鎖オリゴヌクレオチドの一方の鎖または両方の鎖に存在してもよい。
複数のエンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドが存在する場合、それらは全て、同一であってもよく、または異なってもよい。
いくつかの実施形態では、リガンド、例えば、エンドソーム分解性リガンドおよび／または標的リガンドは、次いで成長オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるモノマーに連結される。そのようなモノマーは、本明細書において担体モノマーとも称される。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（Ｉ）
Figure 2017214383
 の少なくとも１つの担体モノマーを含み、式中、
ＡおよびＢは存在ごとに独立して、水素、保護基、随意的に置換された脂肪族化合物、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホネート、ホスホノチオアート、ホスホノジチオアート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオナート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−であり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または随意的に置換されたアルキルであり、
Ｊ１およびＪ２は独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、随意的に置換されたアルキル、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり、
Figure 2017214383
は、環式基または非環式基であり、
Ｌ１は、−Ｌ２または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３であり、
Ｌ２およびＬ３はそれぞれ独立して、エンドソーム分解剤または標的リガンドであり、
ｐは、１〜３である。
いくつかの実施形態では、ｐは１である。
いくつかの実施形態では、担体モノマーは環式であり、
Figure 2017214383
は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択される。
いくつかの実施形態では、担体モノマーは、非環式であり、
Figure 2017214383
は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
ある実施形態では、Ｌ１は、−Ｌ２である。
いくつかの実施形態では、担体モノマーは、式（ＩＩ）
Figure 2017214383
 に示されるようなピロリン環系に基づいており、式中、Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、もしくはＳＯ２ＮＨであり、
Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、およびＲ１８はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、−ＣＨ２ＯＲａ、またはＯＲｂであり、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に置換されたアラルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホネート、ホスホノチオアート、ホスホノジチオアート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオナート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−であり、
Ｒ３０は存在ごとに独立して、−リンカー−ＲＬであり、
ＲＬは、水素、−Ｌ２、または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３であり、
Ｌ２およびＬ３はそれぞれ独立して、エンドソーム分解剤または標的リガンドであり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または随意的に置換されたアルキルであり、
ただし、ＲＬの少なくとも１つは、−Ｌ２または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩ）の少なくとも１つのモノマーを含む。
ある実施形態では、ＲＬは、−Ｌ２である。
ピロリン系モノマーに対して、Ｒ１１は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１３は、ＯＲｂである。またはＲ１１は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ９は、ＯＲｂである。またはＲ１１は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１７は、ＯＲｂである。またはＲ１３は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１１は、ＯＲｂである。またはＲ１３は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１５は、ＯＲｂである。またはＲ１３は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１７は、ＯＲｂである。ある実施形態では、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂは、ジェミナル置換されてもよい。４−ヒドロキシプロリン系モノマーに対して、Ｒ１１は、−ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１７は、ＯＲｂである。したがって、ピロリン系および４−ヒドロキシプロリン系化合物は、結合回転がその特定の連結の周囲に制限される（例えば環の存在に起因する制限）、連結（例えば炭素−炭素結合）を含有し得る。したがって、ＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂは、上記に説明されるいずれの対においても、相互に対してシスまたはトランスとなり得る。したがって、全てのシス／トランス異性体が明示的に含まれる。化合物はまた、１つ以上の不斉中心を含有し、それによって、ラセミ化合物およびラセミ混合物、単一光学異性体、個々のジアステレオマーおよびジアステレオマー混合物として生じてもよい。全てのそのような異性体の化合物が明示的に含まれる（例えばＣＨ２ＯＲａおよびＯＲｂを有する中心の両方がＲ配置を有するか、もしくは両方がＳ配置を有するか、または一方の中心がＲ配置を有し、他方の中心がＳ配置を有することができ、逆もまた同様である）。
いくつかの実施形態では、Ｒ１１は、ＣＨ２ＯＲａであり、Ｒ１５は、ＯＲｂである。
いくつかの実施形態では、Ｒｂは、固体支持体である。
一実施形態では、式（ＩＩ）の担体は、ホスホラミダイトであり、すなわち、ＲａまたはＲｂのうちの１つは、−Ｐ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）２、例えば、−Ｐ（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）Ｎ（ｉ−プロピル）２である。一実施形態では、Ｒｂは、−Ｐ（Ｏ−アルキル）Ｎ（アルキル）２である。
いくつかの実施形態では、担体モノマーは、式（ＩＩＩ）に示されるようなリボース環系に基づく。
Figure 2017214383
 式中、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、またはＣＲＰ ２であり、
Ｂは存在ごとに独立して、水素、随意的に置換された天然または非天然核酸塩基、−リンカー−ＲＬと共役される随意的に置換された天然核酸塩基、または−リンカー−ＲＬと共役される随意的に置換された非天然核酸塩基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＯＲ６、Ｆ、Ｎ（ＲＮ）２、または−Ｊ−リンカー−ＲＬであり、
Ｊは、存在しないか、Ｏ、Ｓ、ＮＲＮ、ＯＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）、ＮＨＳＯ、ＮＨＳＯ２、ＮＨＳＯ２ＮＨ、ＯＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、ＯＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）Ｏ、またはＯＰ（Ｎ（ＲＰ）２）であり、
Ｒ６は存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に置換されたアラルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホネート、ホスホノチオアート、ホスホノジチオアート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオナート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−であり、
ＲＮは存在ごとに独立して、Ｈ、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたアルキニル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に置換されたアラルキル、随意的に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
ＲＰは存在ごとに独立して、Ｈ、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたアルキニル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、または随意的に置換されたヘテロアリールであり、
ＲＬは、水素、−Ｌ２、または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３であり、
Ｌ２およびＬ３はそれぞれ独立して、エンドソーム分解剤または標的リガンドであり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または随意的に置換されたアルキルであり、
ただし、ＲＬは、少なくとも１つ存在し、さらに、ＲＬの少なくとも１つは、−Ｌ２または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＩＩ）の少なくとも１つのモノマーを含む。
ある実施形態では、ＲＬは、−Ｌ２である。
いくつかの実施形態では、担体モノマーは、非環式基に基づいており、「非環式担体」と呼ばれる。好ましい非環式担体は、以下の式（ＩＶ）または式（Ｖ）に示される構造を有することができる。
いくつかの実施形態では、非環式担体は、式（ＩＶ）に示される構造を有する。
Figure 2017214383
 式中、
Ｗは、存在しないか、Ｏ、Ｓ、およびＮ（ＲＮ）であり、ＲＮは存在ごとに独立して、Ｈ、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたアルキニル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に置換されたアラルキル、随意的に置換されたヘテロアリール、またはアミノ保護基であり、
Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、もしくはＳＯ２ＮＨであり、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に置換されたアラルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたヘテロアリール，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホネート、ホスホノチオアート、ホスホノジチオアート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオナート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−であり、
Ｒ３０は存在ごとに独立して、−リンカー−ＲＬであり、
ＲＬは、水素、−Ｌ２または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３であり、
Ｌ２およびＬ３はそれぞれ独立して、エンドソーム分解剤または標的リガンドであり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または随意的に置換されたアルキルであり、
ｒ、ｓ、およびｔはそれぞれ存在ごとに独立して、０、１、２、または３であり、
ただし、ＲＬの少なくとも１つは、−Ｌ２または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３である。
ｒおよびｓが異なる場合、第３炭素は、ＲまたはＳ配置のいずれかであることができる。好ましい実施形態では、ｘおよびｙは、１であり、ｚは、ゼロである（例えば担体は、セリノールに基づく）。非環式担体は、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、パーハロアルキルで随意的に置換することができる。
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（ＩＶ）の少なくとも１つのモノマーを含む。
ある実施形態では、ＲＬは、−Ｌ２である。
いくつかの実施形態では、非環式担体は、式（Ｖ）
Figure 2017214383
 に示される構造を有し、式中、Ｅは、存在しないか、またはＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、Ｃ（Ｓ）、Ｃ（Ｓ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、もしくはＳＯ２ＮＨであり、
ＲａおよびＲｂはそれぞれ存在ごとに独立して、水素、ヒドロキシル保護基、随意的に置換されたアルキル、随意的に置換されたアリール、随意的に置換されたシクロアルキル、随意的に置換されたアラルキル、随意的に置換されたアルケニル、随意的に置換されたヘテロアリール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸、二リン酸、三リン酸、ホスホネート、ホスホノチオアート、ホスホノジチオアート、ホスホロチオエート、ホスホロチオレート、ホスホロジチオエート、ホスホロチオロチオナート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、活性化リン酸基、活性化亜リン酸基、ホスホラミダイト、固体支持体、−Ｐ（Ｚ１）（Ｚ２）−、または−Ｐ（Ｚ１）（Ｏ−リンカー−ＲＬ）−であり、
Ｒ３０は存在ごとに独立して、−リンカー−ＲＬであり、
ＲＬは、水素、−Ｌ２、または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３であり、
Ｌ２およびＬ３はそれぞれ独立して、エンドソーム分解剤または標的リガンドであり、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｏ、Ｓ、Ｎ（アルキル）、または随意的に置換されたアルキルであり、
ｒおよびｓはそれぞれ存在ごとに独立して、０、１、２、または３であり、
ただし、ＲＬの少なくとも１つは、−Ｌ２または−Ｌ２−リンカー−Ｌ３である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（Ｖ）の少なくとも１つのモノマーを含む。
ある実施形態では、ＲＬは、−Ｌ２である。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、式（Ｉ）〜式（Ｖ）から選択される、少なくとも２つの異なるモノマーを含む。
干渉ＲＮＡ
二本鎖干渉ＲＮＡ（ｄｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知のプロセスによって、ｍＲＮＡの配列特異的サイレンシングを導く。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含む、幅広い種類の生物において生じる。
ｄｓｉＲＮＡの２１〜２３ｎｔの断片は、例えば、ＲＮＡ分解を引き起こすことによる、ＲＮＡサイレンシングの配列特異的メディエータであることが証明されている。理論によって束縛されることを望まないが、単にこれらの２１〜２３ｎｔの断片中に存在する断片の特定の長さであり得る分子シグナルが、ＲＮＡｉを媒介する細胞因子を動員する可能性がある。これらの２１〜２３ｎｔの断片および他のｉＲＮＡ剤を調製および投与するための方法、ならびに特に活性化遺伝子機能におけるそれらの使用方法を本明細書に記載する。ｉＲＮＡ剤（または同一もしくは同様の性質の組み換え的に産生された、もしくは化学的に合成されたオリゴヌクレオチド）の使用は、哺乳類細胞におけるサイレンシングのための特異的ｍＲＮＡの標的化を可能にする。加えて、例えば以下に記載するような、より長いｄｓｉＲＮＡ剤の断片もまた使用することができる。
哺乳類細胞において、長いｄｓｉＲＮＡは、しばしば有害であるインターフェロン応答を誘発し得るが、ｓｉＲＮＡは、少なくとも細胞および宿主に有害である程度まで、インターフェロン応答を引き起こすことはない。特に、ｓｉＲＮＡ剤中のｉＲＮＡ剤鎖の長さは、例えば、有害なインターフェロン応答の誘発を回避するのに十分短い、３１、３０、２８、２５、または２３ｎｔ未満であり得る。したがって、ｓｉＲＮＡ剤構成物（例えば本明細書に記載されるように製剤化される）の哺乳類細胞への投与は、インターフェロン応答を回避しながら標的遺伝子の発現をサイレンシングするために使用することができる。さらに、個別の種のｉＲＮＡ剤の使用は、例えば、対立遺伝子に対してヘテロ接合性の対象において、標的遺伝子の１つの対立遺伝子を選択的に標的化するために使用することができる。
さらに、一実施形態では、哺乳類細胞は、例えば、ｄｓｉＲＮＡ活性化タンパク質キナーゼＰＫＲ等、インターフェロン応答の成分を破壊するｉＲＮＡ剤で治療される。そのような細胞は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含み、かつそうでなければインターフェロン応答を引き起こし得る長さを有する、第２のｉＲＮＡ剤で治療されてもよい。
典型的な実施形態では、対象は、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、または霊長類等の哺乳動物である。対象は、乳用哺乳動物（例えばウシもしくはヤギ）、または他の家畜動物（例えばニワトリ、シチメンチョウ、ヒツジ、ブタ、魚類、エビ）であってもよい。ある実施形態では、対象は、ヒト、例えば、正常な個人、または疾病もしくは疾患を有する、有すると診断される、または有すると予測される個人である。
さらに、ｉＲＮＡ剤媒介サイレンシングは、ｉＲＮＡ剤構成物を投与した後数日間持続するため、多くの場合、１日１回よりも少ない頻度で、場合によっては、治療計画全体に対して１回のみ、構成物を投与することが可能である。例えば、いくつかの癌細胞の治療は、単回ボーラス投与によって媒介され得る一方で、慢性ウイルス感染症は、例えば、１週間に１回または１ヵ月に１回等、通常の投与を必要とし得る。
対象にｉＲＮＡ剤を投与するために使用され得る、多くの例示的な送達経路を記載する。加えて、ｉＲＮＡ剤は、本明細書に記載するいかなる例示的な方法に従っても製剤化することができる。
本発明は、核酸（例えばｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）の送達のためのモジュラー構成物および方法に関する。本発明の一態様は、エンドソーム分解性成分、標的リガンド、および核酸（例えばｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ剤）を含む、モジュラー構成物に関する。
説明を簡単にするために、本願における特定の製剤、構成物、および方法は、主に非修飾核酸またはｉＲＮＡに関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、修飾核酸で実施することができ、そのような実施が本発明の範囲内であることを理解されたい。
エンドソーム分解性成分
容易に二分子層膜を通過することができない高分子薬物および親水性薬物分子に対して、細胞のエンドソーム／リソソームコンパートメントへの封入は、それらの作用部位への効果的な送達に対する最大の障害であると考えられる。近年、この問題に対処するために、多くの方法および戦略が考案されてきた。リポソーム製剤に関しては、製剤中の融合性脂質の使用が最も一般的な方法である（Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｓ．，Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｏｎ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｅｆｆｉｃａｃｉｅｓ ｏｆ ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｖｉａ Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ Ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ．Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１１，７１３−７２３）。プロトン化および／またはｐＨによって誘発された立体配座の変化によって、ｐＨ感受性エンドソーム分解性活性を示す他の成分は、荷電ポリマーおよびペプチドを含む。例えば、Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．，Ｓｔａｙｔｏｎ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ “ｓｍａｒｔ” ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｄｉｒｅｃｔ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｏｌｙｍｅｒｓ Ａｄｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３，９９２−９９９、Ｋａｋｕｄｏ，Ｃｈａｋｉ，Ｔ．，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ Ｅｑｕｉｐｐｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｐＨ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｖｉｒａｌ−ｌｉｋｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３６，５６１８−５６２８、Ｙｅｓｓｉｎｅ，Ｍ．Ａ． ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｘ，Ｊ．Ｃ．（２００４）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｐｏｌｙａｎｉｏｎｓ：ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｉｐｉｄ ｂｉｌａｙｅｒｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｏｆ ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５６，９９９−１０２１、Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．，ｖａｎ Ｒｏｏｙ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｉＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．３３１，２１１−４を参照されたい。それらは、概して、リポソームまたはリポプレックス等、薬物送達システムとの関連で使用されている。リポソーム製剤を使用する葉酸受容体媒介送達に対して、例えば、ｐＨ感受性融合ペプチドがリポソームに組み込まれ、取り込みプロセス中の薬物の排出を改善することによって、活性を強化することが示されている（Ｔｕｒｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｆｏｌａｔｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ａｔ ｅｎｄｏｓｏｍａｌ ｐＨｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５５９，５６−６８）。
ある実施形態では、本発明のエンドソーム分解性成分は、ｐＨ依存性膜活性および／または融合性を示す、ポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣薬であってもよい。ペプチド模倣薬は、ペプチドを模倣するように設計される、小タンパク質様鎖であってもよい。ペプチド模倣薬は、分子の特性を変化させるための既存のペプチドの修飾、または非天然アミノ酸もしくはそれらの類似体を使用した、ペプチド様分子の合成から生じ得る。ある実施形態では、それらは、ペプチドと比較して改善された安定性および／または生物活性を有する。ある実施形態では、エンドソーム分解性成分は、エンドソームｐＨ（例えばｐＨ５〜６）においてその活性立体配座を採る。「活性」立体配座は、エンドソーム分解性成分が、エンドソームの溶解、および／またはエンドソームから細胞の細胞質への本発明のモジュラー構成物もしくはその構成成分のいずれか（例えば核酸）の輸送を促進する、立体配座である。
化合物ライブラリは、溶血アッセイを使用して、中性ｐＨに対してエンドソームｐＨにおけるそれらの異なる膜活性に対して、スクリーニングされてもよい。本方法によって単離される有望な候補を、本発明のモジュラー構成物の構成成分として使用することができる。本発明の構成物および方法で使用するためのエンドソーム分解性成分を同定するための方法は、化合物ライブラリを提供することと、血球をライブラリのメンバーと接触させ、接触が生じる媒体のｐＨは制御されること、化合物が、中性ｐＨ（例えば約ｐＨ７〜８）に対して低ｐＨ（例えば約ｐＨ５〜６）において、血球の異なる溶解を誘発するかどうかを判定することとを含み得る。
例示的なエンドソーム分解性成分としては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７、２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６、１１８：１５８１−１５８６）、およびそれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２、１５５９：５６−６８）が挙げられる。ある実施形態では、エンドソーム分解性成分は、ｐＨの変化に反応した電荷の変化またはプロトン化を受ける化学基（例えばアミノ酸）を含有してもよい。エンドソーム分解性成分は、直鎖または分岐鎖であってもよい。エンドソーム分解性成分の例示的な一次配列としては、Ｈ２Ｎ−（ＡＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡＡＡＡＧＧＣ）−ＣＯ２Ｈ、Ｈ２Ｎ−（ＡＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＥＡＬＡＡＡＡＧＧＣ）−ＣＯ２Ｈ、およびＨ２Ｎ−（ＡＬＥＡＬＡＥＡＬＥＡＬＡＥＡ）−ＣＯＮＨ２が挙げられる。
エンドソーム分解性成分のさらなる例としては、表１のものが挙げられる。
Figure 2017214383
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、直鎖または分岐鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖および分岐鎖ポリアミン、例えば、スペルミン、カチオン性直鎖および分岐鎖ポリアミン、ポリカルボン酸塩、ポリカチオン、マスク化オリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケタール、オルトエステル、マスク化または非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有する直鎖または分岐鎖ポリマー、マスク化または非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマー、ｐＨ感受性ペプチド、天然または合成融合性脂質、天然または合成カチオン性脂質を含むことができる。
エンドソーム分解性活性を有する好ましい合成ポリマーは、以下の米国特許出願公開第２００９／００４８４１０号、同第２００９／００２３８９０号、同第２００８／０２８７６３０号、同第２００８／０２８７６２８号、同第２００８／０２８１０４４号、同第２００８／０２８１０４１号、同第２００８／０２６９４５０号、同第２００７／０１０５８０４号、同第２００７００３６８６５号、および同第２００４／０１９８６８７号の各明細書に記載され、それらの内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解剤の膜活性官能基は、上記のエンドソーム分解剤がオリゴヌクレオチドと共役される時にマスクされる。オリゴヌクレオチドがエンドソームに達する時、膜活性官能基は、脱マスクされ、薬剤は活性化する。脱マスキングは、エンドソームの外側よりもエンドソーム内に見られる条件下でより容易に実行され得る。例えば、膜活性官能基は、エンドソーム内で開裂を受ける開裂可能なリンカーを介して分子でマスクすることができる。理論によって束縛されることを望まないが、エンドソーム内に入ると、そのような連結は開裂され、マスキング剤がエンドソーム分解剤から放出されることが想定される。
いくつかの実施形態では、マスキング剤は、開裂によって、マスキング剤とエンドソーム分解剤の活性官能基との間の連結を開裂することができる官能基を放出する、開裂可能なリンカーを有する。一例は、アミド型連結を介してエンドソーム分解剤に連結され、かつＳ−Ｓ結合を有する、マスキング剤である。エンドソーム内に入ると、Ｓ−Ｓ結合は開裂し、遊離チオールを放出することができ、次いで、遊離チオールは、分子間あるいは分子内で、マスキング剤とエンドソーム分解剤との間のアミド連結を開裂することができる。米国特許出願公開第２００８／０２８１０４１号明細書は、本発明に適したいくつかのマスク化エンドソーム分解性ポリマーを記載する。
膜活性を有する脂質もまた、エンドソーム分解剤として本発明に適している。そのような脂質はまた、融合性脂質としても記載される。これらの融合性脂質は、膜と融合し、その結果として膜を不安定化すると考えられる。融合性脂質は通常、小さい頭部基および不飽和アシル鎖を有する。例示的な融合性脂質としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オル（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）、およびＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（ＸＴＣ）が挙げられる。
ヒスチジンに富んだペプチドＨ５ＷＹＧは、アミノ酸の５がヒスチジン残基で置き換えられた、インフルエンザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニットのＮ末端配列の誘導体である。Ｈ５ＷＹＧは、ヒスチジン残基がプロトン化されると、弱酸性ｐＨで膜を選択的に不安定化することができる。
いくつかの実施形態では、エンドソーム分解性リガンドは、細胞透過剤であり、好ましくは、へリックス細胞透過剤である。好ましくは、その薬剤は、両親媒性である。へリックス薬剤は、好ましくは、αヘリックス薬剤であり、好ましくは、αヘリックス薬剤は、親油性および疎油性相を有する。細胞透過剤は、例えば、細胞透過性ペプチド、カチオン性ペプチド、例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、およびＰｈｅから成る、両親媒性ペプチドもしくは疎水性ペプチド、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋されたペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、細胞透過性ペプチドは、疎水性膜輸送配列（ＭＴＳ）を含むことができる。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰを有する、ＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えばアミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ）はまた、標的リガンドであってもよい。細胞透過性ペプチドは、細胞膜にわたってペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きい極性分子を運ぶことができる、「送達」ペプチドであってもよい。いくつかの例示的な細胞透過性ペプチドを表２に示す。
Figure 2017214383
細胞透過性ペプチドは、直鎖または環式であってもよく、Ｄ−アミノ酸、非ペプチドまたは偽ペプチド連結、ペプチジル模倣体を含む。加えて、ペプチドおよびペプチド模倣体は、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。標的化ペプチドの合成模倣体もまた含まれる。
ある実施形態では、２つ以上のエンドソーム分解性成分が、本発明のモジュラー構成物に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、これは、同一エンドソーム分解性成分のうちの２つ以上をモジュラー構成物に組み込むことを含む。他の実施形態では、これは、２つ以上の異なるエンドソーム分解性成分をモジュラー構成物に組み込むことを含む。
これらのエンドソーム分解性成分は、例えば、エンドソームｐＨにおいて立体配座を変化させることによって、エンドソームエスケープを媒介してもよい。ある実施形態では、エンドソーム分解性成分は、中性ｐＨにおけるランダムコイル立体配座で存在し、エンドソームｐＨにおいて両親媒性へリックスに再配置され得る。この立体配座遷移の結果として、これらのペプチドは、エンドソームの脂質膜に挿入し、エンドソーム内容物の細胞質への漏出を引き起こし得る。立体配座遷移はｐＨ依存性であるため、エンドソーム分解性成分は、血中を循環する間は融合活性をほとんどまたは全く示すことができない（ｐＨ〜７．４）。融合活性は、エンドソーム分解性成分によって脂質膜の破壊をもたらす活性として定義される。融合活性の一例は、エンドソーム溶解または漏出、およびエンドソームから細胞質への本発明のモジュラー構成物の１つ以上の構成成分（例えば核酸）の輸送をもたらす、エンドソーム分解性成分によるエンドソーム膜の破壊である。
本明細書に記載する溶血アッセイに加えて、好適なエンドソーム分解性成分は、当業者が他の方法を使用することによって試験および同定することができる。例えば、ｐＨ環境に応じた電荷変化に対応する化合物の能力は、例えば、細胞アッセイにおける通常の方法によって試験することができる。ある実施形態では、試験化合物は、細胞と組み合わされるか、または細胞と接触され、細胞は、例えば、エンドサイトーシスによって試験化合物を取り込むことが可能になる。次いで、エンドソーム調製物を接触した細胞から作製することができ、そのエンドソーム調製物は、対照細胞からのエンドソーム調製物と比較される。接触した細胞対対照細胞からのエンドソーム画分の変化、例えば、減少は、試験化合物が融合剤として機能することができることを示す。別法では、接触した細胞および対照細胞は、例えば、顕微鏡法、例えば、光学または電子顕微鏡法によって、細胞内のエンドソーム集団の差を判定することにより評価することができる。試験化合物および／またはエンドソームは、例えば、エンドソーム漏出を定量化するために、標識化することができる。
別の種類のアッセイでは、本明細書に記載するモジュラー構成物は、１つ以上の試験または推定融合剤を使用して構成される。モジュラー構成物は、標識化核酸を使用して構成することができる。一旦モジュラー構成物が細胞によって取り込まれると、エンドソームエスケープを促進するエンドソーム分解性成分の能力を、例えば、エンドソーム調製物の調製によって、または細胞の細胞質内の標識化核酸の可視化を可能にする顕微鏡技術によって、評価することができる。特定の他の実施形態では、遺伝子発現の阻害または任意の他の生理学的パラメータが、エンドソームエスケープに対する代理マーカとして使用されてもよい。
他の実施形態では、ｐＨ依存性構造転移を示す化合物を同定するために、円偏光二色性分光法を使用することができる。
二段階アッセイもまた実施することができ、第１のアッセイは、ｐＨの変化に対応する試験化合物のみの能力を評価し、第２のアッセイは、ｐＨの変化に対応する試験化合物を含むモジュラー構成物の能力を評価する。
標的リガンド
本発明のモジュラー構成物は、標的リガンドを含む。いくつかの実施形態では、この標的リガンドは、特定の細胞にモジュラー構成物を導くことができる。例えば、標的リガンドは、標的細胞の表面上の分子と特異的または非特異的に結合することができる。標的化部分は、標的細胞に対して特異親和性を有する分子であり得る。標的化部分は、標的細胞の表面上に見られるタンパク質、または標的細胞の表面上に見られる分子に対するリガンドもしくはリガンドの受容体結合部分に対する抗体を含むことができる。例えば、標的化部分は、癌特異的抗原（例えばＣＡ１５−３、ＣＡ１９−９、ＣＥＡ、またはＨＥＲ２／ｎｅｕ）またはウイルス抗原を認識し、それによって癌細胞またはウイルス感染細胞にｉＲＮＡを送達することができる。例示的な標的化部分としては、抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等、またはそれらの機能部分）、細胞表面受容体に対するリガンド（例えばそれらの細胞外ドメイン）が挙げられる。
表３は、選択された細胞を標的化するために使用され得る、多くの抗原の例を提供する。
Figure 2017214383
細胞表面上の特定組織のそれぞれの受容体への結合を介した特定組織へのリガンド媒介標的化は、薬物の組織特異的送達を改善するための魅力的な方法を提供する。疾病関連細胞型および組織への特異的標的化は、有効量を低下させ、副作用を低減し、その結果として治療指数を最大化するのに役立ち得る。複数の炭水化物モチーフを有する炭水化物および炭水化物群は、標的リガンドの重要な種類を表し、それは、幅広い種類の組織および細胞型への薬物の標的化を可能にする。例えば、Ｈａｓｈｉｄａ，Ｍ．，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５２，１８７−９、Ｍｏｎｓｉｇｎｙ，Ｍ．，Ｒｏｃｈｅ，Ａ．−Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｄｒｕｇｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１４，１−２４、Ｇａｂｉｕｓ，Ｓ．，Ｋａｙｓｅｒ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｃｔｉｎｓ ａｎｄ ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａ ｓｗｅｅｔ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ． ａｎｄ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．４２，２５０−２６１、Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ Ｒｉｃｅ，Ｋ．Ｇ．（１９９５）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｊ．Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ．３，１１１−１２７を参照されたい。
最もよく特徴がわかっている受容体−リガンド対のうちの１つは、肝細胞上に高度に発現し、かつＤ−ガラクトースならびにＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）に対して高親和性を有する、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）である。それらの炭水化物リガンドは、肝実質に幅広い種類の薬剤およびリポソームまたはポリマー担体系さえ標的化するために、成功裏に使用されている。例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．，ａｎｄ Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８７）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｙ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ＤＮＡ ｃａｒｒｉｅｒ ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９−４４３２、Ｂｉｅｓｓｅｎ，Ｅ．Ａ．Ｌ．，Ｖｉｅｔｓｃｈ，Ｈ．，Ｒｕｍｐ，Ｅ．Ｔ．，Ｆｌｕｔｔｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｋ．，ａｎｄ Ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ，Ｔ．Ｊ．Ｃ．（２０００）Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，３２４−３４２、Ｚａｎｔａ，Ｍ．−Ａ．，Ｂｏｕｓｓｉｆ，Ｏ．，Ａｄｉｂ，Ａ．，ａｎｄ Ｂｅｈｒ，Ｊ．−Ｐ．（１９９７）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．８，８３９−８４４、Ｍａｎａｇｉｔ，Ｃ．，Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ＰＥＧｙｌａｔｅｄ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２６６，７７−８４、Ｓａｔｏ，Ａ．，Ｔａｋａｇｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｌｉｖｅｒ ｂｙ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２８；１４３４−４２を参照されたい。
Ｄ−マンノースに対して高親和性を有するマンノース受容体は、別の重要な炭水化物系リガンド−受容体対を表す。マンノース受容体は、マクロファージ及びおそらく樹枝状細胞等の特定の細胞型上に高度に発現する。マンノース共役体ならびにマンノース化薬物担体は、それらの細胞に薬物分子を標的化するために、成功裏に使用されている。例えば、Ｂｉｅｓｓｅｎ，Ｅ．Ａ．Ｌ．，Ｎｏｏｒｍａｎ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｌｙｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒ ｍａｎｎｏｓｉｄｅｓ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｌｉｇａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｔ ｎａｎｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，２８０２４−２８０３０、Ｋｉｎｚｅｌ，Ｏ．，Ｆａｔｔｏｒｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ−，ｐｏｌｙａｍｉｄｅ− ａｎｄ ＰＮＡ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉ．９，３７５−３８５、Ｂａｒｒａｔｔ，Ｇ．，Ｔｅｎｕ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９８６）．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍａｎｎｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｒｕｇｓ ｔｏ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８６２，１５３−６４、Ｄｉｅｂｏｌｄ，Ｓ．Ｓ．，Ｐｌａｎｋ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（２００２）．Ｍａｎｎｏｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｔｏ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２７，６５−７４を参照されたい。
炭水化物を基にした標的リガンドとしては、Ｄ−ガラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価ＧａｌＮＡｃ、例えば、ＧａｌＮＡｃ２およびＧａｌＮＡｃ３、Ｄ−マンノース、多価マンノース、多価ラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、ならびにレクチンが挙げられるがこれに限定されない。多価という用語は、２つ以上の単糖ユニットが存在することを示す。そのような単糖サブユニットは、グリコシド連結を介して相互に連結されてもよく、または骨格分子に連結されてもよい。
コレステロールまたは脂肪酸等の親油性部分は、核酸等の高親水性分子に付着される際、血漿タンパク結合、およびその結果として循環半減期を実質的に強化することができる。加えて、リポタンパク質等のある特定の血漿タンパク質への結合は、対応するリポタンパク質受容体（例えばＬＤＬ−受容体またはスカベンジャー受容体ＳＲ−Ｂ１）を発現する特定組織への取り込みを増加させることが示されている。例えば、Ｂｉｊｓｔｅｒｂｏｓｃｈ，Ｍ．Ｋ．，Ｒｕｍｐ，Ｅ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０００）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，２７１７−２５、Ｗｏｌｆｒｕｍ，Ｃ．，Ｓｈｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００７）．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ ｓｉＲＮＡｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，１１４９−５７を参照されたい。したがって、親油性共役もまた、標的化送達方法と考えることができ、それらの細胞内移動は、潜在的に、エンドソーム分解剤との組み合わせによってさらに改善され得る。
血漿タンパク結合を強化する例示的な親油性部分としては、ステロール、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、フェノキサジン、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、およびビオチン等が挙げられるかこれに限定されない。
葉酸は、葉酸受容体を介した標的化薬物送達に広く使用されている、別の種類のリガンドを表す。この受容体は、幅広い種類の腫瘍細胞、ならびに活性化マクロファージ等の他の細胞型上に高度に発現される。例えば、Ｍａｔｈｅｒｌｙ，Ｌ．Ｈ． ａｎｄ Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｉ．Ｄ．（２００３）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｆｏｌａｔｅｓ．Ｖｉｔａｍｉｎｓ Ｈｏｒｍｏｎｅｓ ６６，４０３−４５６、Ｓｕｄｉｍａｃｋ，Ｊ． ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．（２０００）．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｉａ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．４１，１４７−１６２を参照されたい。炭水化物系リガンドと同様に、葉酸は、核酸およびリポソーム担体さえ含む幅広い種類の薬物を送達することができることが示されている。例えば、Ｒｅｄｄｙ，Ｊ．Ａ．，Ｄｅａｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｌａｔｅ−Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｆｏｌａｔｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８８，１１１２−１１１８、Ｌｕ，Ｙ． ａｎｄ Ｌｏｗ Ｐ．Ｓ．（２００２）．Ｆｏｌａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５４，６７５−６９３、Ｚｈａｏ，Ｘ．Ｂ． ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｒ．Ｊ．（２００４）．Ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ；Ｌｅａｍｏｎ，Ｃ．Ｐ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．（２００３）．Ｆｏｌａｔｅ−Ｌｉｐｏｓｏｍｅ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｏ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ：Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．１４，７３８−７４７を参照されたい。
２００８年１２月４日出願の米国特許出願第１２／３２８，５３７号および２００８年１２月４日出願の同第１２／３２８，５２８号明細書は、本発明のモジュラー構成物に適している、多くの葉酸および炭水化物標的リガンドを記載する。これらの特許出願の内容は、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
標的リガンドはまた、細胞マーカ、例えば、増殖細胞に濃縮されているマーカを標的化することができる、タンパク質、ペプチド、およびペプチド模倣薬も含む。ペプチド模倣薬（本明細書において、オリゴペプチド模倣薬とも称される）は、天然ペプチドと同様の明確な３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチドまたはペプチド模倣薬部分は、約５〜５０アミノ酸長、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０アミノ酸長であり得る。そのようなペプチドとしては、特にαｖβ３（アルファｖベータ３）インテグリンを示す細胞内の癌細胞を標的化することができる、ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣薬が挙げられるかこれに限定されない。標的化ペプチドは、直鎖または環式であってもよく、Ｄ−アミノ酸、非ペプチドまたは偽ペプチド連結、ペプチジル模倣体を含む。加えて、ペプチドおよびペプチド模倣体は、修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。標的化ペプチドの合成模倣体もまた含まれる。
標的リガンドはまた、ホルモンおよびホルモン受容体結合リガンド等の他の受容体結合リガンドを含むことができる。標的リガンドは、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスフォネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはアプタマーであってもよい。表４は、標的リガンドおよびそれらの関連受容体のいくつかの例を示す。
Figure 2017214383
２つ以上の標的リガンドが存在する場合、そのような標的リガンドは全て、同一細胞／組織／器官を標的化する同一または異なる標的リガンドであってもよい。
エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドに加えて、モジュラー構成物は、循環半減期および／または細胞取り込みを強化し得る、１つ以上の他の部分／リガンドを含んでもよい。これらは、タンパク質（例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）、または炭水化物（例えばデキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）等の自然発生する物質を含むことができる。これらの部分はまた、合成ポリマーまたは合成ポリアミノ酸等の組み換えまたは合成分子であってもよい。例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬ‐アスパラギン酸、ポリＬ‐グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−ＣＯ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエチル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えば、ＰＥＧ−５Ｋ、ＰＥＧ−１０Ｋ、ＰＥＧ−１２Ｋ、ＰＥＧ−１５Ｋ、ＰＥＧ−２０Ｋ、ＰＥＧ−４０Ｋ）、メチル−ＰＥＧ（ｍＰＥＧ）、［ｍＰＥＧ］２、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、偽ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、またはαへリックスペプチドが挙げられる。
多くのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドおよびオリゴマー化合物は、血清タンパク質に結合することが当該技術分野で知られており、したがって、短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチド、および複数のホスホロチオエート連結を含む非ヌクレオシドオリゴマー化合物を使用して、本発明のモジュラー構成物の循環半減期を強化することができる。加えて、血清リガンド（例えば血清タンパク質）と結合するオリゴヌクレオチド、例えば、アプタマーもまた、本発明のモジュラー構成物の循環半減期を強化するために使用することができる。これらのオリゴヌクレオチドおよびアプタマーは、本願に記載する任意の核酸修飾、例えば、糖修飾、骨格修飾、または核酸塩基修飾を含んでもよい。
エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドに加えて、モジュラー構成物の細胞取り込みを増加させるリガンドもまた存在してもよい。細胞取り込みを強化する例示的なリガンドとしては、ビタミンが挙げられる。これらは、例えば、癌細胞等の悪性または非悪性の望ましくない細胞増殖を特徴とする細胞／組織／器官を標的化するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、Ｂビタミン、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサル、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。
リガンドは、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、モジュラー構成物の細胞への取り込みを増加させることができる、物質、例えば、薬物であってもよい。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スインホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであってもよい。
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、モジュラー構成物の細胞への取り込みを増加させることができる。そのような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
いくつかの実施形態では、そのようなリガンドは、細胞透過剤、好ましくは、へリックス細胞透過剤である。好ましくは、薬剤は、両親媒性である。へリックス薬剤は、好ましくは、αへリックス薬剤であり、それは、好ましくは、親油性および疎油性相を有する。
本発明のモジュラー構成物中に存在し得る他のリガンドとしては、分布を監視するための色素およびレポーター基、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、アルキル化剤、リン酸、メルカプト、アミノ、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール群、アクリジン−イミダゾール共役、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、およびＡＰが挙げられる。
いくつかの実施形態では、単一リガンドは、２つ以上の特性を有してもよく、例えば、リガンドは、エンドソーム分解性および標的化特性の両方を有する。
強化された透過性および滞留性
ある実施形態では、本発明のモジュラー構成物は、強化された透過性および滞留性（ＥＰＲ）効果によって部位に標的化され得る。ＥＰＲ効果は、ある特定のサイズの分子、典型的には高分子が、例えば、正常組織よりも腫瘍組織においてより大きい程度まで蓄積する傾向がある特性である。理論によって束縛されないが、この現象に関する一般的説明は、腫瘍を供給する血管が、典型的には、それらの構造に異常があり、血液からの高分子の拡散を可能にする幅広い有窓を含むということである。さらに、腫瘍は、典型的には、効果的なリンパ排液を欠いており、血液から拡散する分子の蓄積をもたらす。当業者は、そのような標的化方法がまた、異常な血管系が低下したリンパ排液の有無にかかわらず特定部位にアクセスすることが可能である他の条件にも有用であり得ることを認識するであろう。
オリゴヌクレオチド共役の調製を教示する代表的な米国特許としては、米国特許第４，８２８，９７９号、同第４，９４８，８８２号、同第５，２１８，１０５号、同第５，５２５，４６５号、同第５，５４１，３１３号、同第５，５４５，７３０号、同第５，５５２，５３８号、同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５８０，７３１号、同第５，５９１，５８４号、同第５，１０９，１２４号、同第５，１１８，８０２号、同第５，１３８，０４５号、同第５，４１４，０７７号、同第５，４８６，６０３号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５７８，７１８号、同第５，６０８，０４６号、同第４，５８７，０４４号、同第４，６０５，７３５号、同第４，６６７，０２５号、同第４，７６２，７７９号、同第４，７８９，７３７号、同第４，８２４，９４１号、同第４，８３５，２６３号、同第４，８７６，３３５号、同第４，９０４，５８２号、同第４，９５８，０１３号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，２１４，１３６号、同第５，０８２，８３０号、同第５，１１２，９６３号、同第５，１４９，７８２号、同第５，２１４，１３６号、同第５，２４５，０２２号、同第５，２５４，４６９号、同第５，２５８，５０６号、同第５，２６２，５３６号、同第５，２７２，２５０号、同第５，２９２，８７３号、同第５，３１７，０９８号、同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号、同第５，４１６，２０３、５，４５１，４６３号、同第５，５１０，４７５号、同第５，５１２，６６７号、同第５，５１４，７８５号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９５，７２６号、同第５，５９７，６９６号、同第５，５９９，９２３号、同第５，５９９，９２８号、同第５，６７２，６６２号、同第５，６８８，９４１号、同第５，７１４，１６６号、同第６，１５３，７３７号、同第６，１７２，２０８号、同第６，３００，３１９号、同第６，３３５，４３４号、同第６，３３５，４３７号、同第６，３９５，４３７号、同第６，４４４，８０６号、同第６，４８６，３０８号、同第６，５２５，０３１号、同第６，５２８，６３１号、同第６，５５９，２７９号の各明細書が挙げられるが、これに限定されず、それらのそれぞれは、参照することによって本明細書に組み込まれる。
リンカー
ある実施形態では、本発明のモジュラー構成物の３つの構成成分のうちのいずれの間の共有結合も、リンカーによって媒介されてもよい。このリンカーは、用途に応じて開裂可能または開裂不可能であってもよい。ある実施形態では、エンドソームから細胞質への輸送後に核酸を放出するために、開裂可能なリンカーが使用されてもよい。共役もしくはカップリング相互作用の目的とする性質、または所望の生物学的効果により、リンカー基の選択が決定される。
リンカー基は、リンカー基付着点（ＬＡＰ）においてオリゴヌクレオチド鎖に接続されてもよく、任意のＣ１〜Ｃ１００炭素含有部分（例えばＣ１〜Ｃ７５、Ｃ１〜Ｃ５０、Ｃ１〜Ｃ２０、Ｃ１〜Ｃ１０、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、またはＣ１０）を含んでもよく、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの酸素原子、少なくとも１つのリン原子、および／または少なくとも１つの窒素原子を有する。いくつかの実施形態では、リン原子は、核酸鎖の接続点としての機能を果たし得る、リンカー基上の末端リン酸またはホスホロチオエート基の一部を形成する。ある実施形態では、窒素原子は、エンドソーム分解性成分または標的リガンドの接続点としての機能を果たし得る、リンカー基上の末端エーテル、エステル、アミノ、またはアミド（ＮＨＣ（Ｏ）−）基の一部を形成する。好ましいリンカー基（下線）は、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −、またはＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を含み、−Ｘは、（−Ｏ−（Ｒ''''Ｏ）Ｐ（Ｏ）−Ｏ）ｍ，（−Ｏ−（Ｒ''''Ｏ）Ｐ（Ｓ）−Ｏ−）ｍ，（−Ｏ−（Ｒ''''Ｓ）Ｐ（Ｏ）−Ｏ）ｍ，（−Ｏ−（Ｒ''''Ｓ）Ｐ（Ｓ）−Ｏ）ｍ，（−Ｏ−（Ｒ''''Ｏ）Ｐ（Ｏ）−Ｓ）ｍ，（−Ｓ−（Ｒ''''Ｏ）Ｐ（Ｏ）−Ｏ）ｍ、または無しであり、ｎは、１〜２０（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）であり、ｍは、１〜３であり、Ｒ''''は、ＨまたはＣ１−Ｃ６アルキルである。好ましくは、ｎは、５、６、または１１である。他の実施形態では、窒素は、末端オキシアミノ基、例えば、−ＯＮＨ２、またはヒドラジノ基、−ＮＨＮＨ２の一部を形成してもよい。リンカー基は、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、パーハロアルキルで随意的に置換されてもよく、および／または１つ以上の追加のヘテロ原子例えば、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを随意的に挿入されてもよい。ある特定のリンカー基は、例えば、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ ＯＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＯＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ ＯＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨＮＨ ２ −、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨＮＨ ２ −、ＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ ＮＨＮＨ ２ −、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ ２ ） ｎ −、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −、またはＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−を含んでもよい。いくつかの実施形態では、アミノ終端リンカー基（例えばＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、リガンドとのイミノ結合（すなわち、Ｃ＝Ｎ）を形成することができる。いくつかの実施形態では、アミノ終端リンカー基（例えばＮＨ２、ＯＮＨ２、ＮＨ２ＮＨ２）は、例えば、Ｃ（Ｏ）ＣＦ３でアシル化することができる。
いくつかの実施形態では、リンカー基は、メルカプト基（すなわち、ＳＨ）またはオレフィン（例えばＣＨ＝ＣＨ２）で終端することができる。例えば、リンカー基は、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −ＳＨ、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＳＨ、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ −（ＣＨ＝ＣＨ ２ ）、またはＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ （ＣＨ＝ＣＨ ２ ）であってもよく、Ｘおよびｎは、上記のリンカー基に関して記載されるようなものであり得る。ある実施形態では、オレフィンは、ディールス・アルダージエンまたはジエノフィルであってもよい。リンカー基は、例えば、ヒドロキシ、アルコキシ、パーハロアルキルで随意的に置換されてもよく、および／または１つ以上の追加のヘテロ原子例えば、Ｎ、Ｏ、もしくはＳを随意的に挿入されてもよい。二重結合は、シスもしくはトランス、またはＥもしくはＺであり得る。
他の実施形態では、リンカー基は、好ましくは、リンカー基の末端位置において、求電子性部分を含み得る。ある特定の求電子性部分には、例えば、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、メシラート、トシラート、ノシラート、もしくはブロシラート、または活性化カルボン酸エステル、例えば、ＮＨＳエステル、もしくはペンタフルオロフェニルエステルが含まれる。他のリンカー基（下線）は、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＯ、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＯ、もしくはＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨＯを含み、ｎは、１〜６であり、Ｒ''''は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、またはＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｏ）ＯＮＨＳ、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｏ）ＯＮＨＳ、もしくはＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｏ）ＯＮＨＳを含み、ｎは、１〜６であり、Ｒ''''は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、ＬＡＰ−Ｘ−（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｏ）ＯＣ ６ Ｆ ５ 、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｏ）ＯＣ ６ Ｆ ５ 、もしくはＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｏ）ＯＣ ６ Ｆ ５ を含み、ｎは、１−１１であり、Ｒ''''は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか、または−（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨ ２ ＬＧ、ＬＡＰ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨ ２ ＬＧ、もしくはＬＡＰ−Ｘ−ＮＲ''''（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＨ ２ ＬＧを含み、Ｘ、Ｒ''''、およびｎは、上記のリンカー基に関して記載されるようなものであってもよい（ＬＧは、離脱基、例えば、ハロゲン化物、メシラート、トシラート、ノシラート、ブロシラートであってもよい）。いくつかの実施形態では、リンカー基のエンドソーム分解性成分または標的リガンドへのカップリングは、エンドソーム分解性成分または標的リガンドの求核基をリンカー基上の求電子基とカップリングすることによって実行することができる。
他の実施形態では、他の保護アミノ基は、リンカー基の末端位置において、例えば、ａｌｌｏｃ、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、トリフルオロアセチル、Ｆｍｏｃ、またはアリールスルホニル（例えばアリール部分は、オルト−ニトロフェニルもしくはオルト、パラ−ジニトロフェニルであってもよい）であってもよい。
上記のリンカー基のいずれにおいても、さらに、ｎ−ＣＨ２−基のうちの１つ、２つ以上、または全ては、例えば、上記のＸ、−Ｙ−（ＣＨ２）ｍ−、−Ｙ−（Ｃ（ＣＨ３）Ｈ）ｍ−、−Ｙ−Ｃ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）Ｈ）ｍ−、−Ｙ−（ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）Ｈ）ｍ−、−Ｙ−（ＣＨ２−Ｃ（（ＣＨ２）ｐＣＨ３）Ｈ）ｍ−、−ＣＨ＝ＣＨ−、または−Ｃ≡Ｃ−のうちの１つまたは組み合わせによって置き換えられてもよく、Ｙは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、Ｓ−Ｓ、Ｓ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）２であり、ｍは、１〜４であり、ｐは、０〜４である。
２つ以上のエンドソーム分解性成分または標的リガンドが同一モジュラー構成物上に存在する場合、２つ以上のエンドソーム分解性成分または標的リガンドは、オリゴヌクレオチド鎖またはエンドソーム分解性成分もしくは標的リガンドに、直鎖状に、または分岐リンカー基によって連結されてもよい。
いくつかの実施形態では、リンカー基は、分岐リンカー基であり、さらに、ある特定の場合においては、対称分岐リンカー基である。分岐点は、少なくとも三価であってもよいが、四価、五価、もしくは六価原子、またはそのような複数の価数を示す基であってもよい。いくつかの実施形態では、分岐点は、グリセロールまたはグリセロール三リン酸基である。
いくつかの実施形態では、分岐点は、−Ｎ、−Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｏ−Ｃ、−Ｓ−Ｃ、−ＳＳ−Ｃ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｑ）−Ｃ、−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）−Ｃ、または−Ｎ（Ｑ）Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃであり、Ｑは存在ごとに独立して、Ｈまたは随意的に置換されたアルキルである。他の実施形態では、分岐点は、グリセロール誘導体である。
一実施形態では、リンカーは、−［（Ｐ−Ｑ−Ｒ）ｑ−Ｘ−（Ｐ'−Ｑ'−Ｒ'）ｑ'］ｑ"−Ｔ−であり、
Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ'、およびＲ'はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、Ｃ（Ｏ）−（随意的に置換されたアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2017214383
 シクリル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
ＱおよびＱ'はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ１００）（Ｒ２００）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ１００）（Ｒ２００）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、アリール、ヘテロアリール、シクリル、またはヘテロシクリルであり、
Ｘは、存在しないか、または開裂可能な連結基であり、
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり、
Ｒ１００およびＲ２００はそれぞれ存在ごとに独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＸ）２であり、
ＲＸは存在ごとに独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
ｑ、ｑ'、およびｑ”はそれぞれ存在ごとに独立して、０〜３０であり、反復単位は、同一であっても、または異なってもよい。
ｎは存在ごとに独立して、１〜２０であり、
ｍは存在ごとに独立して、０〜５０である。
いくつかの実施形態では、担体モノマーもまたリンカーと考えられる。そのような場合において、リンカーという用語は、モノマーとリガンド、例えば、エンドソーム分解性リガンドおよび標的リガンドとの間の担体モノマーおよびリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの開裂可能な連結基を含む。
開裂可能な連結基
開裂可能な連結基は、細胞外で十分安定しているが、標的細胞に入ると、リンカーが一緒に保持する２つの部分を放出するように開裂される、連結基である。好ましい実施形態では、開裂可能な連結基は、対象の血液中または第２の基準条件（例えば血液または血清に見られる条件を模倣または表現するように選択され得る）下よりも、標的細胞内または第１の基準条件（例えば細胞内条件を模倣または表現するように選択され得る）下において、少なくとも１０回倍、好ましくは、少なくとも１００倍速く開裂される。
開裂可能な連結基は、開裂剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位、または分解性分子の存在に対して感受性を有する。概して、開裂剤は、血清または血液中よりも細胞内において、より行き渡るか、またはより高いレベルまたは活性において見られる。そのような分解剤の例としては、例えば、還元によってレドックス開裂可能な連結基を分解することができる、細胞内に存在する、メルカプタン等の酸化もしくは還元酵素または還元剤を含む、特定の基質に選択されるか、もしくは基質特異性を有しない酸化還元剤；エステラーゼ；例えば、５以下のｐＨをもたらすような、酸性環境を生成することができるエンドソームまたは薬剤；一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であってもよい）、およびホスファターゼとしての機能を果たすことによって、酸性開裂可能な連結基を加水分解または分解することができる酵素が挙げられる。
ジスルフィド結合等の開裂可能な連結基は、ｐＨに対して感受性を有し得る。ヒト血清のｐＨは、７．４であるが、平均細胞内ｐＨは、わずかに低く、約７．１〜７．３の範囲である。エンドソームは、５．５〜６．０の範囲のより酸性のｐＨを有し、リソソームは、約５．０のさらに酸性のｐＨを有する。いくつかのリンカーは、好ましいｐＨにおいて開裂され、それによって、リガンドから細胞内または細胞の所望のコンパートメント内にカチオン性脂質を放出する、開裂可能な連結基を有する。
リンカーは、特定の酵素によって開裂可能である、開裂可能な連結基を含むことができる。リンカーに組み込まれる開裂可能な連結基の種類は、標的化される細胞によって決定され得る。例えば、肝臓標的リガンドは、エステル基を含むリンカーを介して、カチオン性脂質に連結することができる。肝細胞は、エステラーゼが豊富であり、したがって、リンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞型よりも肝細胞において、より効率的に開裂される。エステラーゼが豊富な他の細胞型としては、肺、腎皮質、および睾丸の細胞が挙げられる。
肝細胞および滑膜細胞等のペプチダーゼが豊富な細胞型を標的化する場合、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
一般的に、候補の開裂可能な連結基の適合性は、候補連結基を開裂する分解剤（または条件）の能力を試験することによって、評価することができる。また、血液中または他の非標的組織と接触している時の開裂に抵抗する能力に関して、候補の開裂可能な連結基を試験することも望ましい。したがって、第１の条件と第２の条件との間の開裂に対する相対的感受性を決定することができ、第１の条件は、標的細胞内の開裂を示すように選択され、第２の条件は、他の組織または体液、例えば、血液もしくは血清中の開裂を示すように選択される。評価は、無細胞系中、細胞内、細胞培養物中、器官もしくは組織培養物中、または動物全体において実施することができる。無細胞または培養条件において最初の評価を行い、動物全体におけるさらなる評価によって確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液もしくは血清（または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）で、少なくとも２、４、１０、または１００倍速く開裂される。
レドックス開裂可能な連結基
開裂可能な連結基の１つの種類は、還元または酸化下で開裂されるレドックス開裂可能な連結基である。還元的に開裂可能な連結基の一例は、ジスルフィド連結基（−Ｓ−Ｓ−）である。候補の開裂可能な連結基が好適な「還元的に開裂可能な連結基」であるかどうか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定の標的薬剤で使用するのに好適であるかどうかを判定するために、本明細書に記載する方法に目を向けることができる。例えば、候補は、細胞、例えば、標的細胞内に観察され得る開裂速度を模倣する、当該技術分野で既知の試薬を使用して、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはた他の還元剤でのインキュベーションによって評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣する様に選択される条件下でも評価することができる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血中で最大でも１０％開裂される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液（または細胞外条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）と比較して、細胞内（または細胞内条件を模倣するように選択されるインビトロ条件下）で、少なくとも２、４、１０、または１００倍速く分解される。候補化合物の開裂速度は、細胞内培地を模倣するように選択される条件下で、標準的な酵素反応速度アッセイを使用して判定し、細胞外培地を模倣するように選択される条件と比較することができる。
リン酸系の開裂可能な連結基
リン酸系の開裂可能な連結基は、リン酸基を分解または加水分解する薬剤によって開裂される。細胞内のリン酸基を開裂する薬剤の一例は、細胞内のホスファターゼ等の酵素である。リン酸系連結基の例は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
酸性開裂可能な連結基
酸性開裂可能な連結基は、酸性条件下で開裂される連結基である。好ましい実施形態では、酸性開裂可能な連結基は、約６．５以下（例えば約６．０、５．５、５．０、またはそれ以下）のｐＨを有する酸性環境において、または一般酸としての機能を果たすことができる酵素等の薬剤によって開裂される。細胞において、エンドソームおよびリソソーム等の特定の低ｐＨ細胞小器官は、酸性開裂可能な連結基のための開裂環境を提供することができる。酸性開裂可能な連結基の例としては、アミノ酸のヒドラゾン、エステル、およびエステルが挙げられるがこれに限定されない。酸性開裂可能な基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有することができる。好ましい実施形態は、エステル（アルコキシ基）の酵素に付着した炭素が、アリール基、置換アルキル基、または第３級アルキル基、例えば、ジメチルペンチルまたはｔ−ブチルである場合である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
エステル系の開裂可能な連結基
エステル系の開裂可能な連結基は、細胞内のエステラーゼおよびアミダーゼ等の酵素によって開裂される。エステル系の開裂可能な連結基の例としては、アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレン基のエステルが挙げられるがこれに限定されない。エステル開裂可能な連結基は、一般式−Ｃ（Ｏ）Ｏ−または−ＯＣ（Ｏ）−を有する。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
ペプチド系の開裂連結基
ペプチド系の開裂可能な連結基は、細胞内のペプチダーゼおよびプロテアーゼ等の酵素によって開裂される。ペプチド系の開裂可能な連結基は、オリゴペプチド（例えばジペプチド、トリペプチド等）およびポリペプチドを生じさせるために、アミノ酸の間に形成されるペプチド結合である。ペプチド結合は、ペプチドおよびタンパク質を生じさせるために、アミノ酸の間に形成されるアミド結合の特別な種類である。ペプチド系開裂基は、概して、ペプチドおよびタンパク質を生じさせる、アミノ酸の間に形成されるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、アミド官能基全体を含まない。ペプチド系の開裂可能な連結基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、ＲＡおよびＲＢは、２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これらの候補は、上記の方法と類似した方法を使用して評価することができる。
２つ以上のエンドソーム分解性リガンドまたは標的リガンドが同一モジュラー構成物上に存在する場合、２つ以上のエンドソーム分解性リガンドまたは標的リガンドは、オリゴヌクレオチド鎖またはエンドソーム分解性リガンドもしくは標的リガンドに、直鎖状に、または分岐リンカー基によって連結されてもよい。
ｉＲＮＡ剤
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤またはその断片が、標的遺伝子の下方制御を媒介することができるように、標的遺伝子に対して十分な相同性の領域を含み、かつヌクレオチドの観点から十分な長さを有するべきである（説明を簡単にするために、ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドという用語は、時にＲＮＡ剤の１つ以上のモノマーサブユニットに関連して、本明細書で使用される。本明細書の「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代替物の場合、修飾ヌクレオチドまたは１つ以上の位置における代理置換部分にも言及することをここで理解されたい）。したがって、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡに少なくとも部分的に、いくつかの実施形態では完全に相補的である領域であるか、またはそのような領域を含む。ｉＲＮＡ剤と標的との間で完全な相補性がある必要はないが、対応は、ｉＲＮＡ剤またはその開裂産物が、例えば、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡのＲＮＡｉ開裂によって、配列特異的サイレンシングを導くことを可能にするのに十分でなければならない。標的鎖との相補性または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖において、完全な相補性がしばしば所望である一方で、いくつかの実施形態は、特にアンチセンス鎖において、１つ以上、例えば、６、５、４、３、２、またはそれ未満の（標的ＲＮＡに対する）ミスマッチを含むことができる。特にアンチセンス鎖において、ミスマッチは、末端領域内で最も許容され、存在する場合、末端領域、または例えば、５'および／もしくは３'末端の６、５、４、もしくは３ヌクレオチド内の領域内にあってもよい。センス鎖は、分子の二本鎖特徴全体を維持するために、アンチセンス鎖と十分に相補的であるだけでよい。
本明細書の別の箇所に考察されるように、また全体が参照として組み込まれる資料において、ｉＲＮＡ剤はしばしば、修飾されるか、またはヌクレオシド代替物を含む。ｉＲＮＡ剤の一本鎖領域はしばしば、修飾されるか、またはヌクレオシド代替物を含み、例えば、ヘアピン構造の不対領域（複数を含む）、例えば、２つの相補的な領域を連結する領域は、修飾またはヌクレオシド代替物を有することができる。例えば、エキソヌクレアーゼに対して、ｉＲＮＡ剤の１つ以上の３'もしくは５'末端を安定化するための、またはアンチセンスｓｉＲＮＡ剤がＲＩＳＣに入ることを助長するための修飾もまた、想定される。修飾は、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、脱塩基、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、特別なビオチン、またはホスホラミダイトとして生じ、かつＲＮＡ合成中に複数のカップリングを可能にするように、別のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有する、フルオレセイン試薬を含むことができる。
ｉＲＮＡ剤は、インターフェロン応答を引き起こすのに十分長い分子（Ｄｉｃｅｒ（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．２００１．Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３−３６６）によって開裂され、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘発サイレンシング複合体）に入ることができる）、およびインターフェロン応答を引き起こさないくらい十分短い分子（その分子もまた、Ｄｉｃｅｒによって開裂され、ＲＩＳＣに入ることができる）、例えば、ＲＩＳＣへ入ることを可能にするサイズの分子、例えば、Ｄｉｃｅｒ開裂産物に類似する分子を含む。インターフェロン応答を引き起こさないくらい十分短い分子は、本明細書において、ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ剤と呼ばれる。本明細書で使用する「ｓｉＲＮＡ剤またはより短いｉＲＮＡ剤」は、ヒト細胞内で有害なインターフェロン応答を誘発しないくらい十分短い、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡ剤または一本鎖薬剤を指し、例えば、それは、６０、５０、４０、または３０未満のヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。ｓｉＲＮＡ剤またはその開裂産物は、例えば、標的ＲＮＡに対してＲＮＡｉを誘発することによって、標的遺伝子を下方制御することができ、その標的は、内在性または病原体標的ＲＮＡを含み得る。
ｓｉＲＮＡ剤の各鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０以下のヌクレオチド長であり得る。鎖は、少なくとも１９ヌクレオチド長であり得る。例えば、各鎖は、２１〜２５の間のヌクレオチド長であってもよい。ｓｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５のヌクレオチド対の二本鎖領域、および２〜３ヌクレオチドの１つ以上の突出部、または１つもしくは２つの３'突出部を有してもよい。
標的ＲＮＡとの相同性および標的遺伝子を下方制御するための能力に加えて、ｉＲＮＡ剤は、以下の特性のうちの１つ以上を有することができる。
（１）ｉＲＮＡ剤は、以下のＲＮＡ剤の項に記載される式ＶＩであり得る。
（２）一本鎖の場合、ｉＲＮＡ剤は、１つ以上のリン酸基、またはリン酸基の１つ以上の類似体を含む、５'修飾を有してもよい。
（３）ｉＲＮＡ剤は、非常に多くの数または全てのヌクレオシドに対してさえの修飾にもかかわらず、正確な塩基対合を形成し、かつ例えば、標的ＲＮＡの開裂によって、標的の下方制御を可能にするのに十分な相同の標的ＲＮＡと二本鎖構造を形成することができるように、適切な３次元骨格において塩基（または修飾塩基）を示すことができる、アンチセンス鎖を有し得る。
（４）ｉＲＮＡ剤は、非常に多くの数または全てのヌクレオシドに対してさえの修飾にもかかわらず、「ＲＮＡ類似」の性質をなおも有し得、すなわち、リボヌクレオチドをベースとした内容物の全てまたは部分的でさえないが、ＲＮＡ分子の全体の構造的、化学的、および物理的特性を有し得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、例えば、ヌクレオチド糖の全てが、２'ヒドロキシルの代わりに２'フルオロを含有する、センスおよび／またはアンチセンス鎖を含有することができる。このデオキシリボヌクレオチド含有薬剤は、ＲＮＡ類似の性質を示すことがなおも予測され得る。理論によって束縛されることを望まないが、電気陰性のフッ素は、リボースのＣ２'位置に付着される場合、軸配向性を好む。このフッ素の空間的な優先傾向は、糖にＣ３'エンドパッカーを採用させることができる。これは、ＲＮＡ分子に観察されるものと同一のパッカー形式であり、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型へリックスが生じる。さらに、フッ素は、良好な水素結合の受体であることから、ＲＮＡ構造を安定化することが既知である水分子と同一の水素結合相互作用に関与することができる。２'糖位置における修飾部分は、デオキシリボヌクレオチドのＨ部分よりもリボヌクレオチドのＯＨ部分の特徴をより示す、Ｈ結合に関与することが可能であり得る。特定のｉＲＮＡ剤は、その糖の全てまたは少なくとも５０、７５，８０、８５、９０、もしくは９５％においてＣ３'エンドパッカーを示すか、ＲＮＡに特徴的なＡファミリー型へリックスを生じさせることができるくらい十分な量のその糖において、Ｃ３'エンドパッカーを示すか、２０、１０、５、４、３、２、または１より多いＣ３'エンドパッカー構造ではない糖を有することがない。修飾の本質にかかわらず、またＲＮＡ剤は、特に突出部または他の一本鎖領域において、デオキシヌクレオチドまたは修飾デオキシヌクレオチドを含有することができるが、ＤＮＡ分子、あるいは分子中のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％超、または二本鎖領域内のヌクレオチドの５０、６０、もしくは７０％超が、デオキシリボヌクレオチドであるか、または２'位置においてデオキシである修飾デオキシリボヌクレオチドである任意の分子が、ＲＮＡ剤の定義から除外されることは確実である。
本明細書で使用する「一本鎖ｉＲＮＡ剤」は、単一分子で構成されるｉＲＮＡ剤である。それは、鎖内対合によって形成される二本鎖領域を含むことができ、例えば、ヘアピンまたはパンハンドル構造であっても、もしくはそれを含んでもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、標的分子に対してアンチセンスであり得る。ある実施形態では、一本鎖ｉＲＮＡ剤は、５'リン酸化であるか、または５'プライム末端においてホスホリル類似体を含む。５'−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾としては、５'−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５'）；５'−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５'−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５'−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５'）；５'−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５'）、５'−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５'）；酸素／硫黄で置き換えられた一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意の追加の組み合わせ（例えば５'−α−チオ三リン酸、５'−γ−チオ三リン酸等）、５'−ホスホロアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５'、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５'）、５'−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５'−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５'−ＣＨ２−）、５'−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５'−）が挙げられる（これらの修飾はまた、二本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖で使用することができる）。
一本鎖ｉＲＮＡ剤は、ＲＩＳＣに入り、かつ標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ媒介開裂に関与することができるくらい十分長くてもよい。一本鎖ｉＲＮＡ剤は、少なくとも１４、他の実施形態では、少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチド長である。ある実施形態では、２００、１００、または６０未満のヌクレオチド長である。
ヘアピンｉＲＮＡ剤は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５に等しいか、または少なくとも１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、もしくは２５ヌクレオチド対の二本鎖領域を有する。二本鎖領域は、２００、１００、または５０以下の長さであってもよい。ある実施形態では、二本鎖領域の範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長である。ヘアピンは、一本鎖突出部、またはいくつかの実施形態では、３'末端の、および特定の実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側の末端不対領域を有してもよい。いくつかの実施形態では、突出部は、２〜３ヌクレオチド長である。
本明細書で使用する「二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤」は、鎖間のハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成することができる、２つ以上、場合によっては、２つの鎖を含むｉＲＮＡ剤である。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド長であってもよい。それは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であってもよい。範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長であってもよい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド長であってもよい。それは、２００、１００、または５０ヌクレオチド長以下であってもよい。範囲は、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長であってもよい。
二本鎖ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対長に等しいか、または少なくとも１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、もしくは６０ヌクレオチド対長であってもよい。それは、２００、１００、または５０ヌクレオチド対長以下であってもよい。範囲は、１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対長であってもよい。
多くの実施形態では、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、より小さいｄｓ ｉＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤を産生するために、内在性分子によって、例えば、Ｄｉｃｅｒによって開裂することができるくらい十分大きい。
本発明はさらに、本発明のｉＲＮＡ剤のうちの１つによって標的化される配列内で標的化するｉＲＮＡ剤を含む。本明細書で使用するように、第２のｉＲＮＡ剤は、第２のｉＲＮＡ剤が第１のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖に相補的なｍＲＮＡ内のどこかでメッセージを開裂する場合、第１のｉＲＮＡ剤の配列内で標的化するとされる。そのような第２の薬剤は、概して、標的遺伝子中の選択された配列に連続する領域から取られる、さらなるヌクレオチド配列に結合した、少なくとも１５連続ヌクレオチドから成る。
本発明のｄｓｉＲＮＡは、標的配列との１つ以上のミスマッチを含有することができる。好ましい実施形態では、本発明のｄｓｉＲＮＡは、３つより多いミスマッチは含有しない。ｄｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。ｄｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、いずれかの末端から５−ヌクレオチド、例えば相補性領域の５'または３'末端のいずれかから５、４、３、２、または１ヌクレオチドに限定されることが好ましい。例えば、標的遺伝子の領域に相補的な２３ヌクレオチドｄｓｉＲＮＡ鎖に対して、ｄｓＲＮＡは、概して、中央の１３ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。標的配列とのミスマッチを含有するｄｓｉＲＮＡが、標的遺伝子の発現の阻害に有効であるかどうかを判定するために、本発明に記載する方法を使用することができる。標的遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチを有するｄｓｉＲＮＡの有効性の考察は、特に、標的遺伝子中の特定の相補性領域が集団内で多型配列変異を有することが既知である場合、重要であり得る。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖とのミスマッチを含む。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、３'末端から５ヌクレオチド、例えば、相補性領域の末端から５、４、３、２、または１ヌクレオチドにある。いくつかの実施形態では、ミスマッチは、標的開裂部位領域内に位置する。一実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖と１、２、３、４、または５つより多くのミスマッチを有することがない。好ましい実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖と３つより多くのミスマッチを有することはない。
ある実施形態では、センス鎖は、標的開裂部位領域内に、核酸塩基修飾、例えば、随意的に置換された天然または非天然核酸塩基、ユニバーサル核酸塩基を含む。
本明細書における「標的開裂部位」は、ｉＲＮＡ剤を利用することによって、ＲＩＳＣ機構によって開裂される、標的遺伝子、例えば、標的ｍＲＮＡ、またはセンス鎖における骨格連結を意味する。また「標的開裂部位領域」は、開裂部位の両側に少なくとも１つまたは少なくとも２つのヌクレオチドを含む。センス鎖に対して、標的開裂部位は、センス鎖自体がＲＮＡｉ機構によって開裂される標的であるならば、開裂されるであろうセンス鎖中の骨格連結である。標的開裂部位は、当該技術分野で既知の方法、例えば、Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）４３２，１７３−１７８に詳述されるような５'−ＲＡＣＥアッセイを使用して判定することができる。当該技術分野においてよく理解されるように、２つの２１ヌクレオチド長の鎖（該鎖は、３'末端において２−ヌクレオチド一本鎖突出部を有する、１９の連続塩基対の二本鎖領域を形成する）を含む円錐型の二本鎖ＲＮＡｉ剤に対する開裂部位領域は、センス鎖の５'末端から９〜１２位置に対応する。
本発明はまた、キメラ化合物である核酸を含む。本発明との関連で、「キメラ」核酸化合物または「キメラ」は、２つ以上の化学的に異なる領域を含有する核酸化合物であり、各領域は、少なくとも１つのモノマー単位、すなわち、核酸化合物の場合、ヌクレオチドで構成される。これらの核酸は、典型的には、核酸が修飾され、それによって、増加したヌクレアーゼ分解への耐性、増加した細胞取り込み、および／または標的核酸に対する増加した結合親和性をもたらすような、少なくとも１つの領域を含有する。核酸のさらなる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを開裂することが可能な酵素の基質としての機能を果たしてもよい。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を開裂する細胞エンドヌクレアーゼである。したがって、ＲＮａｓｅ Ｈの活性化は、ＲＮＡ標的の開裂をもたらし、それによって、遺伝子発現のｄｓＲＮＡ阻害の効率性を大いに増大する。
本発明はまた、２つの鎖が一緒に連結されるｄｓ ｉＲＮＡを含む。２つの鎖は、（ｄＴ）ｎ（ｎは、４〜１０である）等のポリヌクレオチドリンカーによって一緒に連結することができ、それによって、ヘアピンを形成する。２つの鎖はまた、非ヌクレオシドリンカー、例えば、本明細書に記載するリンカーによって一緒に連結することができる。本明細書に記載する任意のオリゴヌクレオチド化学修飾または変異を、ポリヌクレオチドリンカーで使用することができることは、当業者によって理解されるであろう。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、二本鎖がアンチセンス鎖の５'末端領域内で解離または融解する傾向を増加させる（二本鎖会合の自由エネルギーを減少させる）ことによって、ＲＮＡ干渉に対して最適化することができる。これは、例えば、二本鎖がアンチセンス鎖の５'末端領域内で解離または融解する傾向を増加させる、修飾または修飾ヌクレオシドの包含によって達成することができる。それはまた、二本鎖がアンチセンス鎖の５'末端領域内で解離または融解する傾向を増加させる、修飾もしくは修飾ヌクレオシドの包含、またはリガンドの付着によっても達成することができる。理論によって束縛されることを望まないが、その効果は、ヘリカーゼ等の酵素の効果を促進すること、例えば、アンチセンス鎖の５'末端付近の酵素の効果を促進することに起因し得る。
二本鎖中のアンチセンス鎖の５'末端が解離する傾向を増加させる修飾は、単独で、または本明細書に記載する他の修飾、例えば、二本鎖中のアンチセンスの３'末端が解離する傾向を現象させる修飾と組み合わせて使用することができる。同様に、二本鎖中のアンチセンスの３'末端が解離する傾向を減少させる修飾は、単独で、または本明細書に記載する他の修飾、例えば、二本鎖中のアンチセンスの５'末端が解離する傾向を増加させる修飾と組み合わせて使用することができる。
核酸塩基対は、解離または融解を促進するそれらの傾向に基づいてランク付けすることができる（例えば会合の自由エネルギーまたは特定の対合の解離に対して、最も単純な方法は、個々の対に基づいて対を検査することであるが、近隣または同様分析を使用することもできる）。解離の促進の観点から、Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、Ｇ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく、Ｉ：Ｃは、Ｇ：Ｃよりも好ましく（Ｉ＝イノシン）、ミスマッチ、例えば、非正準または正準対合以外は、正準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）対合よりも好ましく、ユニバーサル塩基を含む対合は、正準対合よりも好ましい。
二本鎖を形成する傾向を減少させる対合は、アンチセンス鎖の５'末端における二本鎖中の位置の１つ以上で使用されることが好ましい。末端対（アンチセンス鎖の観点から、最も５'側の対）、および二本鎖中のそれに続く４つの塩基対合位置（アンチセンス鎖の観点から、３'方向に進む）が、二本鎖を形成する傾向を減少させるための修飾の置き換えに好ましい。最末端の対およびそれに続く３、２、または１つの塩基対合の置き換えがより好ましい。二本鎖中のアンチセンス鎖の５'末端から少なくとも１、およびより好ましくは、２、３、４、または５つの塩基対が、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃ、ミスマッチ対、例えば、非正準もしくは正準対合以外、またはユニバーサル塩基を含む対合の群から独立して選択されることが好ましい。好ましい実施形態では、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの塩基対がユニバーサル塩基を含む。
解離を促進する修飾または変化は、好ましくは、センス鎖中で行われるが、いくつかの実施形態では、そのような修飾／変化は、アンチセンス鎖中で行われる。
核酸塩基対はまた、安定性を促進し、かつ解離または融解を阻害するそれらの傾向に基づいてランク付けすることができる（例えば会合の自由エネルギーまたは特定の対合の解離に対して、最も単純な方法は、個々の対に基づいて対を検査することであるが、近隣または同様分析を使用することもできる）。二本鎖安定性の観点から、Ｇ：Ｃは、Ａ：Ｕよりも好ましく、ワトソン・クリックマッチ（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）は、非正準または正準対合以外よりも好ましく、安定性を増加させる類似体は、ワトソン・クリックマッチ（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく、例えば、２−アミノ−Ａ：Ｕは、Ａ：Ｕよりも好ましく、２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、Ｇ−クランプ（４つの水素結合を有するＣの類似体）：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇは、Ｃ：Ｇよりも好ましく、偽ウリジン：Ａは、Ｕ：Ａよりも好ましく、結合を強化する糖修飾、例えば、２'修飾、例えば、２'Ｆ、ＥＮＡ、またはＬＮＡは、非修飾部分よりも好ましく、二本鎖の安定性を強化するために、一方または両方の鎖上に存在することができる。
二本鎖を形成する傾向を増加させる対合は、アンチセンス鎖の３'末端における二本鎖中の位置の１つ以上で使用されることが好ましい。末端対（アンチセンス鎖の観点から、最も３'側の対）、および二本鎖中のそれに続く４つの塩基対合位置（アンチセンス鎖の観点から、５'方向に進む）は、二本鎖を形成する傾向を減少させるための修飾の置き換えに好ましい。最末端の対およびそれに続く３、２、または１つの塩基対合の置き換えがより好ましい。列挙された領域の少なくとも１、およびより好ましくは、２、３、４、または５つの対が、Ｇ：Ｃ、ワトソン・クリックマッチ（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも安定性を増加させる類似体を有する対、２−アミノ−Ａ：Ｕ、２−チオＵまたは５Ｍｅ−チオ−Ｕ：Ａ、Ｇ−クランプ（４つの水素結合を有するＣの類似体）：Ｇ、グアナジニウム−Ｇ−クランプ：Ｇ、偽ウリジン：Ａ、一方または両方のサブユニットが、結合を強化する糖修飾、例えば、２'修飾、例えば、２'Ｆ、ＥＮＡ、またはＬＮＡを有する、対の群から独立して選択されることが好ましい。いくつかの実施形態では、塩基対のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つが二本鎖の安定性を促進する。
好ましい実施形態では、塩基対のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つは、一方または両方のサブユニットが、結合を強化する糖修飾、例えば、２'修飾、例えば、２'−Ｏ−メチル、２'−Ｏ−Ｍｅ（２'−Ｏ−メチル）、２'−Ｏ−ＭＯＥ（２'−Ｏ−メトキシエチル）、２'−Ｆ、２'−Ｏ−ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＬＮＡ）、および２'−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＥＮＡ）を有する、対である。
Ｇ−クランプおよびグアニジニウムＧ−クランプは、以下の参考文献において考察される。Ｈｏｌｍｅｓ ａｎｄ Ｇａｉｔ，“Ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２'−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ Ｇ−Ｃｌａｍｐ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ Ｔａｔ−ＴＡＲ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２２：１２５９−１２６２，２００３、Ｈｏｌｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−１ Ｔａｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２'−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ Ｇ−ｃｌａｍｐ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３１：２７５９−２７６８，２００３、Ｗｉｌｄｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｂｙ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅ：Ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ Ｇ−ｃｌａｍｐ，”Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ，８６：９６６−９７８，２００３、Ｒａｊｅｅｖ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ Ｃｙｔｏｓｉｎｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：４３９５−４３９８，２００２、Ａｕｓｉｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏ− ａｎｄ Ｇｕａｎｉｄｉｎｏ−Ｇ−Ｃｌａｍｐ ＰＮＡ Ｍｏｎｏｍｅｒｓ，”Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４：４０７３−４０７５，２００２、Ｍａｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ ａｎｄ ９−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｏｘｙ）−ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ（”Ｇ−ｃｌａｍｐ”） ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：１３２３−７，２００２、Ｆｌａｎａｇａｎ，ｅｔ ａｌ．，“Ａ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎａｌｏｇ ｔｈａｔ ｃｏｎｆｅｒｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｔｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，９６：３５１３−８，１９９９。
上で考察されるように、ｄｓ ｉＲＮＡは、二本鎖のアンチセンス５'末端の安定性の減少、および二本鎖のアンチセンス３'末端の安定性の増加の両方を行うために修飾することができる。これは、二本鎖のアンチセンス５'末端における安定性減少修飾のうちの１つ以上を、二本鎖のアンチセンス３'末端の安定性増加修飾のうちの１つ以上と組み合わせることによって達成することができる。
二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンスおよびセンス鎖の一方または両方を修飾することが望ましくあり得る。ある場合には、それらは、同一修飾または同一種類の修飾を有するが、他の場合では、センスおよびアンチセンス鎖は、異なる修飾を有し、例えば、ある場合には、センス鎖のみを修飾することが望ましい。例えば、センス鎖を不活性化するために、センス鎖のみを修飾することが望ましくあり得、例えば、センス鎖は、センス鎖を不活性化し、かつ活性ｓｉＲＮＡ／タンパク質またはＲＩＳＣの形成を防止するために、修飾することができる。これは、例えば、５'−Ｏ−メチルリボヌクレオチドでの修飾によって、センス鎖の５'−リン酸化反応を防止する修飾によって、達成することができる（Ｎｙｋａｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２００１）ＡＴＰ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ １０７，３０９−３２１を参照）。リン酸化反応を防止する他の修飾もまた、使用することができ、例えば、Ｏ−ＭｅよりもむしろＨによって５'−ＯＨを簡単に置換する。あるいは、巨大な基が５'−リン酸に添加され、それをホスホジエステル連結に変化させてもよいが、これは、ホスホジエステラーゼがそのような連結を開裂し、官能性ｓｉＲＮＡ５'−末端を放出することができるため、あまり望ましくない場合がある。アンチセンス鎖修飾は、５'リン酸化反応、および本明細書に考察される他の５'修飾のいずれか、特に、一本鎖ｉＲＮＡ分子の項で先に考察された５'修飾を含む。
センスおよびアンチセンス鎖は、ｄｓ ｉＲＮＡ剤が分子の一方または両方の末端において一本鎖または不対領域を含むように選択されてもよい。したがって、ｄｓ ｉＲＮＡ剤は、突出部、例えば、１つもしくは２つの５'もしくは３'突出部、または２〜３ヌクレオチドの３'突出部を含有するように対合される、センスおよびアンチセンス鎖を含有してもよい。多くの実施形態は、３'突出部を有する。特定のｓｉＲＮＡ剤は、一本鎖突出部を、いくつかの実施形態では、各末端において１または２または３ヌクレオチド長の３'突出部を有する。突出部は、一方の鎖が他方よりも長い結果、または同一長さの２つの鎖が互い違いである結果であり得る。５'末端は、リン酸化されてもよい。
一実施形態では、一本鎖突出部は、配列５'−ＧＣＮＮ−３'を有し、Ｎは存在ごとに独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ、ｄＴ、ｄＵであるか、または存在しない。１つの突出部のみを有する二本鎖ｉＲＮＡは、インビボ、ならびに種々の細胞、細胞培養媒体、血液、および血清中で特に安定し、かつ効果的であることがわかった。ｄｓＲＮＡはまた、概してアンチセンス鎖の５'末端に位置する、平滑末端を有してもよい。
一実施形態では、ｄｓ ｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、センス鎖上の３'末端および５'末端において、それぞれ１〜１０のヌクレオチド突出部を有する。一実施形態では、ｄｓ ｉＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖上の３'末端および５'末端において、それぞれ１〜１０のヌクレオチド突出部を有する。
いくつかの実施形態では、二本鎖領域の長さは、例えば、上記に考察されるｓｉＲＮＡ剤の範囲内で、１５〜３０の間、または１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ剤は、長いｄｓｉＲＮＡからの天然Ｄｉｃｅｒ処理産物と長さおよび構造において類似し得る。ｓｉＲＮＡ剤の２つの鎖が連結される、例えば、共有結合される実施形態もまた含まれる。ヘアピン、または要求される二本鎖領域を提供する他の一本鎖構造、および３'突出部もまた、本発明の範囲内である。
いくつかの実施形態では、二本鎖領域の長さは、１０〜１５の間、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、および１５ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、センス鎖上の３'末端および５'末端において、それぞれ１〜１０のヌクレオチド一本鎖突出部を有する。
ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤を含む、本明細書に記載する単離ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる。便宜上、そのようなｍＲＮＡはまた、本明細書において、サイレンシングされるｍＲＮＡと称される。そのような遺伝子はまた、標的遺伝子と称される。一般的に、サイレンシングされるＲＮＡは、内在性遺伝子または病原遺伝子である。加えて、ｍＲＮＡ以外のＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、およびウイルスＲＮＡもまた、標的化することができる。
本明細書で使用する「ＲＮＡｉを媒介する」というフレーズは、配列特異的な方法で標的ＲＮＡをサイレンシングする能力を指す。理論によって束縛されることを望まないが、サイレンシングは、ＲＮＡｉ機構またはプロセス、およびガイドＲＮＡ、例えば、２１〜２３ヌクレオチドのｓｉＲＮＡ剤を使用すると考えられる。
本明細書で使用する「特にハイブリダイズ可能な」および「相補的な」は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子と間で、安定した、かつ特異的な結合が生じるのに十分な程度の相補性を示するのに使用される用語である。特異的結合は、特異的結合が望ましい条件下で、すなわちインビボアッセイもしくは治療の場合、生理学的条件下で、またはインビトロアッセイの場合、アッセイが実施される条件下で、オリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性を必要とする。非標的配列は、典型的には、少なくとも５ヌクレオチド異なる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤が標的ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の産生をサイレンシングするように、標的ＲＮＡ、例えば、標的ｍＲＮＡに対して「十分相補的」である。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、正確な相補性領域内でワトソン・クリック塩基対のみで作製されるハイブリッドを形成するために、標的ＲＮＡ、例えば、標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ剤アニールに「正確に相補的」である。「十分に相補的な」標的ＲＮＡは、標的ＲＮＡに正確に相補的な内部領域（例えば少なくとも１０ヌクレオチドの）を含むことができる。さらに、いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、特に、単一のヌクレオチド差を区別する。この場合、ｉＲＮＡ剤は、正確な相補性が単一ヌクレオチド差の（例えば７ヌクレオチドの範囲内の）領域内に見られる場合にのみ、ＲＮＡｉを媒介する。
本明細書で使用する「オリゴヌクレオチド」という用語は、例えば、１００、２００、３００、または４００未満のヌクレオチド長の核酸分子（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。
本明細書に考察されるＲＮＡ剤は、非修飾ＲＮＡ、ならびに例えば、有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代替物のポリマーを含む。非修飾ＲＮＡは、核酸の構成成分、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、自然発生する、例えば、人体内で自然発生するものと同一、または本質的に同一である、分子を指す。当該技術はしばしば、希少または異常であるが自然発生するＲＮＡを修飾ＲＮＡと称しており、例えば、Ｌｉｍｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓｕｍｍａｒｙ：ｔｈｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｏｆ ＲＮＡ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２１８３−２１９６を参照されたい。しばしば修飾ＲＮＡ（明らかに、典型的には転写後修飾の結果であるため）と呼ばれるそのような希少または異常なＲＮＡは、本明細書で使用する非修飾ＲＮＡという用語の範囲内である。修飾ＲＮＡは、核酸の構成成分のうちの１つ以上、すなわち、糖、塩基、およびリン酸部分が、自然発生するものとは異なる、例えば、人体内で発生するものとは異なる、分子を指す。それらは、修飾「ＲＮＡ」と称されるが、それらは、当然のことながら、修飾によって、ＲＮＡではない分子を含む。ヌクレオシド代替物は、リボリン酸骨格が非リボリン酸構造体で置き換えられた分子であり、非リボリン酸構造体は、例えば、リボリン酸骨格の非荷電模倣体のように、ハイブリダイゼーションがリボリン酸骨格に見られるものと実質的に同様になるように、塩基が正確な空間関係で示されることを可能にする。上記の全ての例を本明細書において考察する。
以下の考察の大部分は、一本鎖分子を指す。本発明の多くの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤、例えば、部分的に二本鎖のｉＲＮＡ剤が想定される。したがって、以下に記載する一本鎖構造で作られる二本鎖構造（例えば２つの別々の分子が接触されて二本鎖領域を形成する、または二本鎖領域が分子内対合によって形成される（例えばヘアピン構造））が、本発明の範囲内であることが理解される。長さは、本明細書の他の箇所に記載される。
核酸は、サブユニットのポリマーであるため、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非連結Ｏの修飾等、以下に記載する修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じる。場合によっては、修飾は、核酸中の対象位置の全て生じるが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、３'または５'末端位置においてのみ生じてもよく、末端領域のみ、例えば、末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中のみで生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方で生じてもよい。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみで生じてもよく、またはＲＮＡの一本鎖領域のみで生じてもよい。例えば、非連結Ｏ位置におけるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端のみで生じてもよく、末端領域のみ、例えば、末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５、もしくは１０ヌクレオチド中のみで生じてもよく、または二本鎖および一本鎖領域で、特に末端において生じてもよい。５'末端（複数を含む）は、リン酸化することができる。
本明細書に記載する修飾は、唯一の修飾、もしくは複数のヌクレオチド上に含まれる唯一の種類の修飾であってもよく、または修飾は、本明細書に記載する１つ以上の他の修飾と組み合わせることができる。本明細書に記載する修飾はまた、オリゴヌクレオチドに組み合わせることができ、例えば、オリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドは、本明細書に記載する異なる修飾を有する。
いくつかの実施形態では、例えば、突出部において特定の塩基を含むように、または一本鎖突出部、例えば、５'もしくは３'突出部、または両方において、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含むように、安定性を強化することが可能である。例えば、突出部においてプリンヌクレオチドを含むことが望ましくあり得る。いくつかの実施形態では、３'または５'突出部における塩基の全てまたはいくつかは、例えば、本明細書に記載する修飾で修飾される。修飾は、例えば、リボース糖の２'ＯＨ基における修飾の使用、例えば、リボヌクレオチドの代わりにデオキシリボヌクレオチド、例えば、デオキシチミジンの使用、およびリン酸基における修飾、例えば、ホスホチオエート修飾の使用を含むことができる。突出部は、標的配列と相同である必要はない。
修飾およびヌクレオチド代替物を以下に考察する。
Figure 2017214383
上記の式ＶＩに示される骨格は、リボ核酸の一部を表す。基本的構成成分は、リボース糖、塩基、末端リン酸、およびリン酸ヌクレオチド間リンカーである。塩基が、自然発生する塩基、例えば、アデニン、ウラシル、グアニン、またはシトシンである場合、糖は、（図示されるように）非修飾２'ヒドロキシルリボース糖であり、Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、全てＯであり、式ＶＩは、自然発生する非修飾オリゴリボヌクレオチドを表す。
非修飾オリゴリボヌクレオチドは、いくつかの用途において最適未満であり得、例えば、非修飾オリゴリボヌクレオチドは、例えば、細胞ヌクレアーゼによる分解する傾向がある。ヌクレアーゼは、核酸ホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、上記のＲＮＡ構成成分のうちの１つ以上への化学修飾は、改善された特性をもたらすことができ、例えば、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼにより安定した状態にすることができる。
修飾核酸およびヌクレオチド代替物は、以下のうちの１つ以上を含むことができる。
（ｉ）非連結（ＸおよびＹ）リン酸酸素のうちの一方もしくは両方、および／または連結（ＷおよびＺ）リン酸酸素のうちの１つ以上の変化、例えば、置き換え（リン酸が末端位置にある場合、位置ＷまたはＺのうちの１つは、リン酸を自然発生するリボ核酸中の追加の要素に連結しない。しかしながら、用語を簡単にするために、特に指定のない限り、核酸の５'末端におけるＷ位置および核酸の３'末端におけるＺ位置は、本明細書で使用する「連結リン酸酸素」という用語の範囲内である）、
（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖上の２'ヒドロキシルの変化、例えば、置き換え、
（ｉｉｉ）リン酸部分（括弧Ｉ）の「脱リン酸化」リンカーによる大規模な置き換え、
（ｉｖ）自然発生する塩基の修飾または置き換え、
（ｖ）リボース−リン酸骨格（括弧ＩＩ）の置き換えまたは修飾、
（ｖｉ）ＲＮＡの３'末端または５'末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置き換え、または部分、例えば、蛍光標識部分のＲＮＡの３'末端もしくは５'末端のいずれかへの共役。
この文脈において使用される置き換え、修飾、変化等の用語は、任意のプロセスの制限を暗示せず、例えば、修飾は、基準または自然発生するリボ核酸から始め、修飾リボ核酸を産生するためにそれを修飾しなければならないという意味ではなく、むしろ、修飾は、単に自然発生する分子との違いを示す。
いくつかの化学物質の実際の電子構造は、たった１つの正準形式（すなわち、Ｌｅｗｉｓ構造）によって適切に表すことができないことが理解される。理論によって束縛されることを望まないが、実際の構造は、その代わりに、集合的に共鳴形式または構造として既知である、２つ以上の正準形式のあるハイブリッドまたは加重平均であり得る。共鳴構造は、別個の化学物質ではなく、紙の上のみで存在する。それらは、特定の化学物質の結合および非結合電子の配置または「局在化」の点においてのみ、相互に異なる。１つの共鳴構造が他のものよりも大きい程度でハイブリッドに寄与することは可能であり得る。したがって、本発明の実施形態の文書および図の説明は、当業者が特定の種の主要な共鳴形式として認識するものの観点から作成されている。例えば、任意のホスホロアミデート（非連結酸素の窒素による置き換え）は、上記の図において、Ｘ＝ＯおよびＹ＝Ｎとして表されるだろう。
特定の修飾を以下により詳細に考察する。
リン酸基
リン酸基は、負に帯電した種である。電荷は、２つの非連結酸素原子（すなわち、上記の式ＶＩにおけるＸおよびＹ）にわたって均等に分布している。しかしながら、リン酸基は、酸素のうちの１つを異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。このＲＮＡリン酸骨格に対する修飾の１つの結果は、核酸分解へのオリゴリボヌクレオチドの増加した耐性であり得る。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、非対称電荷分布を有する非荷電リンカーまたは荷電リンカーのいずれかをもたらす変化を導入することが望ましくあり得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、およびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄によって置き換えられている。ＸまたはＹのうちの１つのみが変化する状態とは異なり、ホスホロジチオエートのリン中心は、オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を妨げるアキラルである。ジアステレオマー形成は、個々のジアステレオマーが種々のヌクレアーゼ耐性を示す調製物を得ることができる。さらに、キラルリン酸基を含有するＲＮＡのハイブリダイゼーション親和性は、対応する非修飾ＲＮＡ種に対してより低くなり得る。したがって、理論によって束縛されることを望まないが、キラル中心を排除するＸおよびＹの両方に対する修飾、例えば、ホスホロジチオエート形成は、それらがジアステレオマー混合物を産生することができないという点で望ましいであろう。したがって、ＸはＳ、Ｓｅ、Ｂ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基等）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリール等である）、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のうちのいずれか１つであってもよい。したがって、ＹはＳ、Ｓｅ、Ｂ、ＢＲ３（Ｒは水素、アルキル、アリールである）、Ｃ（すなわち、アルキル基、アリール基等）、Ｈ、ＮＲ２（Ｒは水素、アルキル、アリール等である）、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のうちのいずれか１つであってもよい。Ｘおよび／またはＹを硫黄で置き換えすることが可能である。
リン酸の修飾がステレオジェニックになるリン原子をもたらす場合、そのようなキラルリン酸は、「Ｒ」配置（本明細書において、Ｒｐ）または「Ｓ」配置（本明細書において、Ｓｐ）のいずれかを有することができる。
リン酸リンカーはまた、連結酸素（すなわち、式ＶＩのＷまたはＺ）を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置き換えることによって修飾することができる。置き換えは、末端酸素（位置Ｗ（３'）または位置Ｚ（５'））で生じることができる。Ｗの炭素での置き換えまたはＺの窒素での置き換えが可能である。架橋酸素がヌクレオシドの３'−酸素である場合、炭素での置き換えが好ましい。架橋酸素がヌクレオシドの５'−酸素である場合、窒素での置き換えが好ましい。
候補薬剤は、以下に記載されるように、適合性に関して評価することができる。
糖基
修飾ＲＮＡは、リボ核酸の糖基の全てまたはいくつかの修飾を含むことができる。例えば、２'ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾するか、または置き換えることができる。理論によって束縛されないが、ヒドロキシルが２'アルコキシドイオンを形成するためにもはやプロトン化することができないため、強化された安定性が期待される。２'アルコキシドは、リンカーリン原子への分子内求核攻撃による分解を触媒することができる。この場合もやはり、理論によって束縛されることを望まないが、いくつかの実施形態では、２'位置でのアルコキシド形成が不可能である変化を導入することが望ましくあり得る。
「オキシ」−２'ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２'ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋によって、同一リボース糖の４'炭素に接続される、「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；２'ヒドロキシルが、エチレン架橋によって同一リボース糖の４'炭素に接続される、ＥＮＡ；−アミン（アミン＝ＮＨ２，アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ、およびアミノアルコキシ）、Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン，（例えばアミン＝ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ、およびアミノアルコキシ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含有するオリゴヌクレオチドが、強力なホスホロチオエート修飾で修飾されるものに相当するヌクレアーゼ安定性を示すことは、注目に値するものである。
「デオキシ」修飾としては、水素（すなわち、部分的にｄｓ ＲＮＡの突出部分に特に関係があるデオキシリボース糖）；ハロ（例えばフルオロ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；ならびにハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、またはウレイドで随意的に置換されてもよい、アルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルが挙げられる。ある実施形態の他の置換基としては、２'−メトキシエチル、２'−ＯＣＨ３、２'−Ｏ−アリル、２'−Ｃ−アリル、および２'−フルオロが挙げられる。
他の好ましい置換基は、２'−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２'−Ｏ−ＮＭＡ）、２'−ＮＨ２、２'−Ｏ−アミン、２'−ＳＨ、２'−Ｓ−アルキル、２'−Ｓ−アリル、２'−Ｏ−ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＥＮＡ）、２'−Ｏ−アミノプロピル（２'−Ｏ−ＡＰ）、２'−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２'−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２'−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２'−Ｏ−ＤＭＡＰ）、および２'−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２'−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）である。
いくつかの実施形態では、同一リボース糖の２'−および４'−炭素は、本明細書に記載するリンカーによって一緒に連結されてもよい。
糖基はまた、リボースにおける対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する、１つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、修飾ＲＮＡは、糖として、例えば、アラビノースを含有するヌクレオチドを含むことができる。
糖基はまた、糖上の１'位置においてα連結、例えば、α−ヌクレオシドを有することもできる。
糖基はまた、Ｌ−糖例えば、Ｌ−ヌクレオシドであってもよい。
修飾ＲＮＡはまた、Ｃ−１'において核酸塩基を欠いている「脱塩基」糖を含むことができる。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子のうちの１つ以上において、修飾をさらに含有することができる。
ヌクレアーゼ耐性を最大化するために、２'修飾を１つ以上のリン酸リンカー修飾（例えばホスホロチオエート）と組み合わせて使用することができる。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２つ以上の異なる修飾を含有するものである。
修飾候補は、以下に記載するように評価することができる。
リン酸基の置き換え
リン酸基は、非リン含有結合によって置き換えることができる（上記の式ＶＩの括弧Ｉを参照）。理論によって束縛されることを望まないが、荷電ホスホジエステル基は、核酸分解における反応中心であるため、その中性の構造模倣体との置き換えは、強化されたヌクレアーゼ安定性を付与するはずであると考えられる。この場合もやはり、理論によって束縛されることを望まないが、ある実施形態では、荷電リン酸基が中性部分によって置き換えられる変化を導入することが望ましくあり得る。
リン酸基を置き換えることができる部分の例としては、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、およびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。ある実施形態では、置き換えは、メチレンカルボニルアミノおよびメチレンメチルイミノ基を含んでもよい。
修飾候補は、以下に記載するように評価することができる。
リボリン酸骨格の置き換え
また、オリゴヌクレオチド模倣骨格を構成することができ、そこで、リン酸リンカーおよびリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチド代替物によって置き換えられる（上記の式１の括弧ＩＩを参照）。理論によって束縛されることを望まないが、反復電荷骨格の非存在は、ポリアニオンを認識するタンパク質への結合を減少させると考えられる（例えばヌクレアーゼ）。この場合もやはり、理論によって束縛されることを望まないが、ある実施形態では、塩基が中性代替物骨格によってテザーされる変化を導入することが望ましくあり得る。
例としては、モフィリノ、シクロブチル、ピロリジン、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物が挙げられる。ある実施形態では、ＰＮＡ代替物が使用されてもよい。
リン酸に連結される酸素のうちの少なくとも１つ、またはリン酸基が、非リン基によって置き換えられた、修飾リン酸連結は、「非ホスホジエステル骨格連結」とも称される。
好ましい骨格修飾は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、ホスホネート、アルキルホスホネート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンアミノカルボニル、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ（ＭＤＨ）、およびメチレンオキシメチルイミノである。
修飾候補は、以下に記載するように評価することができる。
骨格連結の種類
正準３'−５'骨格連結はまた、ヌクレオシド上の他の位置の間の連結によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５'−５'、３'−３'、３'−２'、２'−３'、２'−３'、または２'−５'骨格連結のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの末端上の最後のヌクレオチドは、５'−５'、３'−３'、３'−２'、２'−３'、または２'−３'骨格連結を介して、オリゴヌクレオチドの残りの部分に連結される。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの３'および５'末端を修飾することができる。そのような修飾は、分子の３'末端、５'末端、または両方の末端にあってもよい。それらは、末端リン酸全体、またはリン酸基の原子のうちの１つ以上の修飾または置き換えを含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３'および５'末端は、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えばピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３、またはＣｙ５色素）、または保護基（例えば硫黄、シリコン、ホウ素、またはエステルに基づく）等の他の官能性分子物質に共役することができる。官能性分子物質は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖に付着することができる。スペーサーの末端原子は、リン酸基、あるいは糖のＣ−３'もしくはＣ−５'、Ｏ、Ｎ、Ｓ、またはＣ基の連結原子に接続するか、またはそれらを置き換えることができる。あるいは、スペーサーは、ヌクレオチド代替物の末端原子に接続するか、またはそれらを置き換えることができる（例えばＰＮＡ）。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えばｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、またはビオチン、およびフルオレセイン試薬を含むことができる。スペーサー／リン酸−官能性分子物質−スペーサー／リン酸の配列がｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間に介在する場合、この配列は、ヘアピン型ＲＮＡ剤中のヘアピンＲＮＡループと置き換わることができる。３'末端は、−ＯＨ基であってもよい。理論によって束縛されることを望まないが、特定の部分の共役は、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を改善することができると考えられる。この場合もやはり、理論によって束縛されることを望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善する末端変化を導入することが望ましいであろう。末端修飾の他の例としては、色素、挿入剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性担体（例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド共役（例えばアンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカ、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えばアスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えばイミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾール群、アクリジン−イミダゾール共役、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋複合体）が挙げられる。
末端修飾は、活性を調整するために、または分解への耐性を調整するために、本明細書の他の箇所で考察されるものを含む様々な理由で、追加することができる。活性を調整するのに有用な末端修飾は、リン酸またはリン酸類似体での５'末端の修飾を含む。例えば、特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、特に、アンチセンス鎖は、５'リン酸化されるか、または５'プライム末端においてホスホリル類似体を含む。５'−リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングに適合するものを含む。好適な修飾としては、５'−一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５'）；５'−二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５'−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５'−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５'）；５'−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５'）；５'−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５'）、５'−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５'）；酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸、および三リン酸の任意のさらなる組合せ（例えば５'−α−チオ三リン酸、５'−γ−チオ三リン酸等）、５'−ホスホロアミダート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５'、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５'）、５'−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５'−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５'−ＣＨ２−）、５'−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル等、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５'−）が挙げられる。
末端修飾はまた、分布を監視するのに有用であり得、そのような場合、添加される基は、フルオロフォア、例えば、フルオレセイン、またはアレクサ色素、例えばアレクサ４８８を含んでもよい。末端修飾はまた、取り込みを強化するのに有用であり得、このための有用な修飾は、コレステロールを含む。末端修飾はまた、ＲＮＡ剤を別の部分に架橋結合するのに有用であり得、これに有用な修飾は、マイトマイシンＣを含む。
修飾候補は、以下に記載するように評価することができる。
塩基
アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルは、ＲＮＡに見られる最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改善された特性を有するＲＮＡを提供するために、修飾するか、または置き換えることができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基で、または合成および天然核酸塩基（例えばイノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、またはツベルシジン）、ならびに上記の修飾のいずれか１つで調製することができる。あるいは、上記の塩基および「ユニバーサル塩基」のいずれかの置換または修飾類似体を採用することができる。例としては、２−アミノアデニン、６−メチル、アデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン、（２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含む）、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノ−アリル−ウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン、またはＯ−アルキル化塩基が挙げられる。さらなるプリンおよびピリミジンは、米国特許第３，６８７，８０８号明細書に開示されるもの、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、およびＥｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるものを含む。
概して、塩基の変化は、安定性を促進するために使用されないが、それらは、他の理由で有用であり得、例えば、いくつかの理由は、例えば、２，６−ジアミノプリンおよび２アミノプリンが蛍光性であることである。修飾塩基は、標的特異性を低減し得る。これは、ｉＲＮＡ剤の設計の際に考慮され得る。
いくつかの実施形態では、核酸塩基は、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２−（ハロ）アデニン、２−（アルキル）アデニン、２−（プロピル）アデニン、２−（アミノ）アデニン、２−（アミノアルキルｌ）アデニン、２−（アミノプロピル）アデニン、２−（メチルチオ）−Ｎ６−（イソペンテニル）アデニン、６−（アルキル）アデニン、６−（メチル）アデニン、７−（デアザ）アデニン、８−（アルケニル）アデニン、８−（アルキル）アデニン、８−（アルキニル）アデニン、８−（アミノ）アデニン、８−（ハロ）アデニン、８−（ヒドロキシル）アデニン、８−（チオアルキル）アデニン、８−（チオール）アデニン、Ｎ６−（イソペンチル）アデニン、Ｎ６−（メチル）アデニン、Ｎ６，Ｎ６−（ジメチル）アデニン、２−（アルキル）グアニン，２−（プロピル）グアニン、６−（アルキル）グアニン、６−（メチル）グアニン、７−（アルキル）グアニン、７−（メチル）グアニン、７−（デアザ）グアニン、８−（アルキル）グアニン、８−（アルケニル）グアニン、８−（アルキニル）グアニン、８−（アミノ）グアニン、８−（ハロ）グアニン、８−（ヒドロキシル）グアニン、８−（チオアルキル）グアニン、８−（チオール）グアニン、Ｎ−（メチル）グアニン、２−（チオ）シトシン、３−（デアザ）−５−（アザ）シトシン、３−（アルキル）シトシン、３−（メチル）シトシン、５−（アルキル）シトシン、５−（アルキニル）シトシン、５−（ハロ）シトシン、５−（メチル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（プロピニル）シトシン、５−（トリフルオロメチル）シトシン、６−（アゾ）シトシン、Ｎ４−（アセチル）シトシン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、２−（チオ）ウラシル，５−（メチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２−（チオ）ウラシル、４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−４−（チオ）ウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）−２，４−（ジチオ）ウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−（アルキル）ウラシル、５−（アルキニル）ウラシル、５−（アリルアミノ）ウラシル、５−（アミノアリル）ウラシル、５−（アミノアルキル）ウラシル、５−（グアニジンアルキル）ウラシル、５−（１，３−ジアゾール−１−アルキル）ウラシル、５−（シアノアルキル）ウラシル、５−（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５−（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５−（ハロ）ウラシル、５−（メトキシ）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−（チオ）ウラシル、５−（メトキシカルボニル−メチル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（プロピニル）ウラシル、５−（トリフルオロメチル）ウラシル、６−（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３−（メチル）ウラシル、５−ウラシル（すなわち、偽ウラシル）、２−（チオ）偽ウラシル、４−（チオ）偽ウラシル，２，４−（ジチオ）偽ウラシル，５−（アルキル）偽ウラシル、５−（メチル）偽ウラシル、５−（アルキル）−２−（チオ）偽ウラシル、５−（メチル）−２−（チオ）偽ウラシル、５−（アルキル）−４−（チオ）偽ウラシル、５−（メチル）−４−（チオ）偽ウラシル、５−（アルキル）−２，４−（ジチオ）偽ウラシル、５−（メチル）−２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１−置換偽ウラシル、１−置換２（チオ）−偽ウラシル、１−置換４−（チオ）偽ウラシル、１−置換２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−偽ウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２（チオ）−偽ウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）偽ウラシル、１−（アミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−偽ウラシル、１−（アミノアルキルアミノ−カルボニルエチレニル）−２（チオ）−偽ウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−４−（チオ）偽ウラシル、１−（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）−２，４−（ジチオ）偽ウラシル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−置換１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−置換１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（アミノアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジンアルキルヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジンアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェノキサジン−１−イル、７−（グアニジンアルキル−ヒドロキシ）−１，３−（ジアザ）−２−（オキソ）−フェンチアジン−１−イル、７−（グアニジンアルキルヒドロキシ）−１−（アザ）−２−（チオ）−３−（アザ）−フェンチアジン−１−イル、１，３，５−（トリアザ）−２，６−（ジオキサ）−ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２−アザ−イノシニル、７−デアザ−イノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンズイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３−（メチル）イソカルボスチリリル、５−（メチル）イソカルボスチリリル、３−（メチル）−７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、７−（アザ）インドリル、６−（メチル）−７−（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９−（メチル）−イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７−（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル−７−（アザ）インドリル、２，４，５−（トリメチル）フェニル、４−（メチル）インドリル、４，６−（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４−（フルオロ）−６−（メチル）ベンズイミダゾール、４−（メチル）ベンズイミダゾール、６−（アゾ）チミン、２−ピリジノン、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、６−（アザ）ピリミジン、２−（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、Ｏ６−置換プリン、置換１，２，４−トリアゾール、およびそれらの任意のＯ−アルキル化またはＮ−アルキル化誘導体から成る基から選択される。
修飾候補は、以下に記載するように評価することができる。
カチオン性基
オリゴヌクレオチドに対する修飾はまた、１つ以上のカチオン性基のリン酸または修飾リン酸骨格部分の糖、塩基、および／またはリン原子への付着を含むことができる。カチオン性基は、天然、異常、またはユニバーサル塩基に対する置換が可能である任意の原子に付着することができる。好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨げない、すなわち、塩基対合に必要な水素結合相互作用を妨げない位置である。カチオン性基は、例えば、糖のＣ２'位置、または環式もしくは非環式糖代替物における類似位置を介して付着することができる。カチオン性基としては、例えば、Ｏ−アミン（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノアルコキシ、例えば、Ｏ（ＣＨ２）ｎアミン（例えばアミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）；アミノ（例えばＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、もしくはアミノ酸）；またはＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（アミン＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ）から得られるプロトン化アミノ基を挙げることができる。
オリゴヌクレオチド内の修飾の配置
いくつかの修飾は、好ましくは、特定の位置の、例えば、鎖の内部位置の、またはオリゴヌクレオチドの５'もしくは３'末端上のオリゴヌクレオチド上に含まれてもよい。オリゴヌクレオチドの修飾の好ましい位置は、該薬剤に好ましい特性をもたらし得る。例えば、特定の修飾の好ましい位置は、最適な遺伝子サイレンシング特性、またはエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ活性に対する増加した耐性をもたらし得る。
オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、２'−５'連結を有してもよい。オリゴヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドは、逆連結、例えば、３'−３'、３'−２'、５'−５'、２'−２'、または２'−３'連結を有してもよい。
オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの５'−ピリミジン−プリン−３'（５'−ＰｙＰｕ−３'）ジヌクレオチドを含んでもよく、ピリミジンは、２'−Ｏ−Ｍｅ（２'−Ｏ−メチル）、２'−Ｏ−ＭＯＥ（２'−Ｏ−メトキシエチル）、２'−Ｆ、２'−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２'−Ｏ−ＮＭＡ）、２'−Ｓ−メチル、２'−Ｏ−ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＬＮＡ）、および２'−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＥＮＡ）から成る基から独立して選択される修飾で修飾される。
一実施形態では、オリゴヌクレオチド中の配列モチーフ５'−ピリミジン−プリン−３'（５'−ＰｙＰｕ−３'）ジヌクレオチドの全ての出現における５'−最末端ピリミジンは、２''−Ｏ−Ｍｅ（２'−Ｏ−メチル）、２'−Ｏ−ＭＯＥ（２'−Ｏ−メトキシエチル）、２'−Ｆ、２'−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２'−Ｏ−ＮＭＡ）、２'−Ｓ−メチル、２'−Ｏ−ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＬＮＡ）、および２'−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＥＮＡ）から成る基から選択される修飾で修飾される。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの５'−ウリジン−アデニン−３'（５'−ＵＡ−３'）ジヌクレオチドを含んでもよく、ウリジンは、２'−修飾ヌクレオチドまたは５'−ウリジン−グアニン−３'（５'−ＵＧ−３'）ジヌクレオチドであり、５'−ウリジンは、２'−修飾ヌクレオチドまたは末端５'−シチジン−アデニン−３'（５'−ＣＡ−３'）ジヌクレオチドであり、５'−シチジンは、２'−修飾ヌクレオチドまたは末端５'−ウリジン−ウリジン−３'（５'−ＵＵ−３'）ジヌクレオチドであり、５'−ウリジンは、２'−修飾ヌクレオチドまたは末端５'−シチジン−シチジン−３'（５'−ＣＣ−３'）ジヌクレオチドであり、５'−シチジンは、２'−修飾ヌクレオチドまたは末端５'−シチジン−ウリジン−３'（５'−ＣＵ−３'）ジヌクレオチドであり、５'−シチジンは、２'−修飾ヌクレオチドまたは末端５'−ウリジン−シチジン−３'（５'−ＵＣ−３'）ジヌクレオチドであり、５'−ウリジンは、２'−修飾ヌクレオチドである。これらの修飾を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、特に、エンドヌクレアーゼ活性に対して安定化される。
候補ＲＮＡの評価
候補ＲＮＡ剤、例えば、修飾ＲＮＡを、該薬剤または修飾分子および対照分子を適切な条件に露出し、選択された特性の存在を評価することによって、選択された特性に関して評価することができる。例えば、分解生成物への耐性を以下のように評価することができる。修飾候補ＲＮＡ（および対照分子、通常は非修飾形態）は、分解条件に露出、例えば、分解剤、例えば、ヌクレアーゼを含む環境に露出することができる。例えば、生体試料、例えば、治療上の使用において遭遇し得る環境と同様の生体試料、例えば、血液または細胞分画、例えば、無細胞ホモジネートもしくは破壊細胞を使用することができる。次いで、候補および対照は、多くの方法のいずれかによって分解耐性に関して評価することができる。例えば、候補および対照は、例えば、放射性標識もしくは酵素標識、またはＣｙ３もしくはＣｙ５等の蛍光標識を用いて、露出前に標識化し得る。対照および修飾ＲＮＡは、分解剤、随意的に、対照、例えば、不活化された、熱不活性化された分解剤とインキュベートすることができる。次いで、物理的パラメータ、例えば、修飾および対照分子の大きさが決定される。それらは、物理的方法、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動またはサイジングカラムによって決定し、分子がその元の長さを維持しているかどうかを評価することができるか、または機能的に評価することができる。あるいは、未標識の修飾分子の長さを評価するために、ノーザンブロット分析を使用することができる。
候補薬剤を評価するために、機能アッセイを使用することもできる。機能アッセイは、最初に、または前に行った非機能アッセイ（例えば分解耐性のアッセイ）の後に適用し、修飾が分子の遺伝子発現をサイレンシングする能力を変化させるかどうかを判定することができる。例えば、細胞、例えば、マウスまたはヒト細胞等の哺乳類細胞は、蛍光タンパク質を発現するプラスミド、例えばＧＦＰ、および蛍光タンパク質をコードする転写物と相同の候補ＲＮＡ剤と同時にトランスフェクトすることができる（例えば国際公開第００／４４９１４号パンフレットを参照）。例えば、ＧＦＰ ｍＲＮＡに相同の修飾ｄｓｉＲＮＡは、トランスフェクションが候補ｄｓｉＲＮＡを含んでいなかった対照細胞、例えば薬剤が添加されていない対照および／または非修飾ＲＮＡが添加された対照と比較して、細胞蛍光の低減を監視することによって、ＧＦＰ発現を阻害する能力を分析することができる。遺伝子発現に対する候補薬剤の有効性は、修飾および非修飾ｄｓｉＲＮＡ剤の存在下で細胞蛍光を比較することによって、評価することができる。
代替の機能アッセイでは、マウスの内在性遺伝子、例えば、ｃ−ｍｏｓ等の母性発現した遺伝子に相同の候補ｄｓｉＲＮＡ剤をマウス未成熟卵母細胞に注入し、インビボにで該薬剤が遺伝子発現を阻害する能力を分析することができる（例えば国際公開第０１／３６６４６号パンフレットを参照）。卵母細胞の表現型、例えば、分裂中期ＩＩにおいて停止を維持する能力は、該薬剤が発現を阻害している指標として監視することができる。例えば、ｄｓｉＲＮＡ剤によるｃ−ｍｏｓ ｍＲＮＡの開裂によって、卵母細胞は、分裂中期停止を終了し、単為発生を開始する（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３７０：６５−６８，１９９４、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ ．Ｎａｔｕｒｅ，３７０：６８−７１，１９９４）。陰性対照と比較して、該修飾薬剤の標的ＲＮＡ濃度に対する効果をノーザンブロット分析によって検証し、標的ｍＲＮＡの濃度の低下を分析することができるか、またはウェスタンブロット分析によって検証し、標的タンパク質の濃度の低下を分析することができる。対照は、薬剤が添加されていない、および／または非修飾ＲＮＡが添加された細胞を含むことができる。
ＲＮＡ構造の参考文献
本明細書に列挙される全ての出版物、特許、および公開特許出願の開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる。
一般的な参考文献
本発明に従って使用されるオリゴリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオシドは、固相合成によるものであってもよく、例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８４、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”，Ｅｄ．Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９９１（特に、Ｃｈａｐｔｅｒ １，Ｍｏｄｅｒｎ ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ３，２'−Ｏ−−Ｍｅｔｈｙｌｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ４，Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ５，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ ６，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏ−２'−ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ、およびＣｈａｐｔｅｒ ７，Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｓ）を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、保護基、および反応条件は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３−２３１１、およびＢｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ． ａｎｄ Ｉｙｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３−６１９４、またはそれらの中で参照される参考文献に記載される。国際公開第００／４４８９５号、同第０１／７５１６４号、または同第０２／４４３２１号の各パンフレットに記載される修飾もまた、本明細書で使用することができる。
リン酸基の参考文献
ホスフィン酸オリゴリボヌクレオチドの調製に関しては、米国特許第５，５０８，２７０号明細書に記載される。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製に関しては、米国特許第４，４６９，８６３号明細書に記載される。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製に関しては、米国特許第５，２５６，７７５号または同第５，３６６，８７８号の各明細書に記載される。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製に関しては、米国特許第５，０２３，２４３号明細書に記載される。ボラノリン酸オリゴリボヌクレオチドの調製に関しては、米国特許第５，１３０，３０２号および同第５，１７７，１９８号の各明細書に記載される。３'−デオキシ−３'−アミノホスホロアミダートオリゴリボヌクレオチドの調製に関しては、米国特許第５，４７６，９２５号明細書に記載される。３'−デオキシ−３'−メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドに関しては、Ａｎ，Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００１，６６，２７８９−２８０１に記載される。硫黄架橋ヌクレオチドの調製に関しては、Ｓｐｒｏａｔ ｅｔ ａｌ ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９８８，７，６５１、およびＣｒｏｓｓｔｉｃｋ ｅｔ ａｌ ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８９，３０，４６９３に記載される。
糖基の参考文献
２'修飾に対する修飾は、Ｖｅｒｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８，６７，９９−１３４、およびその中の全ての参考文献に記載されている。リボースに対する具体的な修飾は、以下の参考文献に記載されている。２'−フルオロ（Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，３６，８３１−８４１）、２'−ＭＯＥ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９９６，７９，１９３０−１９３８）、“ＬＮＡ”（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９９，３２，３０１−３１０）。
リン酸基の置き換えの参考文献
本明細書においてＭＭＩ連結オリゴリボヌクレオシドとしても特定される、メチレンメチルイミノ連結オリゴリボヌクレオシド、本明細書においてＭＤＨ連結オリゴリボヌクレオシドとしても特定される、メチレンジメチルヒドラゾ連結オリゴリボヌクレオシド、および本明細書においてアミド−３連結オリゴリボヌクレオシドとしても特定される、メチレンカルボニルアミノ連結オリゴヌクレオシド、および本明細書においてアミド−４連結オリゴリボヌクレオシドとしても特定される、メチレンアミノカルボニル連結オリゴヌクレオシド、ならびに、例えば、交互ＭＭＩおよびＰＯまたはＰＳ連結を有する、混合骨格化合物は、米国特許第５，３７８，８２５号、同第５，３８６，０２３号、同第５，４８９，６７７号の各明細書、ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４２９４号および同第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０４３０５号（それぞれ、国際公開第９２／２０８２２号および同第９２／２０８２３号として公開される）の各パンフレットに記載されるように調整することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール連結オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２６４，５６２号および同第５，２６４，５６４号の各明細書に記載されるように調製することができる。エチレンオキシド連結オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第５，２２３，６１８号明細書に記載されるように調製することができる。シロキサンの置き換えに関しては、Ｃｏｒｍｉｅｒ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８８，１６，４５８３に記載される。カーボネートの置き換えに関しては、Ｔｉｔｔｅｎｓｏｒ，Ｊ．Ｒ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃ １９７１，１９３３に記載される。カルボキシメチルの置き換えに関しては、Ｅｄｇｅ，Ｍ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１ １９７２，１９９１に記載される。カルバメートの置き換えに関しては、Ｓｔｉｒｃｈａｋ，Ｅ．Ｐ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８９，１７，６１２９に記載される。
リン酸−リボース骨格の置き換えの参考文献
シクロブチル糖代理化合物は、米国特許第５，３５９，０４４号明細書に記載されるように調製することができる。ピロリジン糖代替物は、米国特許第５，５１９，１３４号明細書に記載されるように調製することができる。モルホリノ糖代替物は、米国特許第５，１４２，０４７号および同第５，２３５，０３３号の各明細書、ならびに他の関連特許開示に記載されるように調製することができる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、それ自体が既知であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＰＮＡ）：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，４，５−２３において参照される種々の手順のいずれかに従って調製することができる。それらはまた、米国特許第５，５３９，０８３号明細書に記載されるように調製することもできる。
末端修飾の参考文献
末端修飾に関しては、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３−１２８（２００２）およびその中の参考文献に記載される。
塩基の参考文献
Ｎ−２置換プリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５９，２５５号明細書に記載されるように調製することができる。３−デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４５７，１９１号明細書に記載されるように調製することができる。５，６−置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，６１４，６１７号明細書に記載されるように調製することができる。５−プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第５，４８４，９０８号明細書に記載されるように調製することができる。さらなる参考文献が、塩基修飾に関する上記の項において開示され得る。
末端修飾の参考文献
末端修飾に関しては、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２，１０３−１２８（２００２）およびその中の参考文献に記載される。
定義
「ハロ」という用語は、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素の任意のラジカルを意味する。「アルキル」という用語は、随意的にＮ、Ｏ、またはＳを挿入されてもよい、指定数の炭素原子（これらは、プロピル、アリル、またはプロパルギルを含むがこれに限定されない）を含む、直鎖または分岐鎖であってもよい、飽和および不飽和非芳香族炭化水素鎖を指す。例えば、Ｃ１−Ｃ１０は、その基がその中に１〜１０（を含む）個の炭素原子を有し得ることを示す。「アルコキシ」という用語は、−Ｏ−アルキルラジカルを指す。「アルキレン」という用語は、二価アルキル（すなわち、−Ｒ−）を指す。「アルキレンジオキソ」という用語は、構造−Ｏ−Ｒ−Ｏ−を持つ二価種を指し、Ｒは、アルキレンを表す。「アミノアルキル」という用語は、アミノで置換されるアルキルを指す。「メルカプト」という用語は、−ＳＨラジカルを指す。「チオアルコキシ」という用語は、−Ｓ−アルキルラジカルを指す。
「アリール」という用語は、６−炭素単環式または１０−炭素二環式芳香環系を指し、各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基で置換されてもよい。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル等が挙げられる。「アリールアルキル」という用語または「アラルキル」という用語は、アリールで置換されるアルキルを指す。「アリールアルコキシ」という用語は、アリールで置換されるアルコキシを指す。
本明細書で採用される「シクロアルキル」という用語は、３〜１２個の炭素、例えば、３〜８個の炭素、および、例えば、３〜６個の炭素を有する、飽和および部分的に不飽和の環式炭化水素基を含み、シクロアルキル基はさらに、随意的に置換されてもよい。シクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられるがこれに限定されない。
「ヘテロアリール」という用語は、単環式の場合、１〜３個のヘテロ原子を有し、二環式の場合、１〜６個のヘテロ原子を有し、または三環式の場合、１〜９個のヘテロ原子を有する、芳香族５〜８員環単環式、８〜１２員環二環式、または１１〜１４員環三環式環系を指し、上記のヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ、炭素原子およびＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２、３、または４個の原子は、置換基で置換されてもよい。ヘテロアリール基の例としては、ピリジル、フリルまたはフラニル、イミダゾリル、ベンズイミダゾリル、ピリミジニル、チオフェニルまたはチエニル、キノリニル、インドリル、チアゾリル等が挙げられる。「ヘテロアリールアルキル」という用語または「ヘテロアラルキル」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルキルを指す。「ヘテロアリールアルコキシ」という用語は、ヘテロアリールで置換されるアルコキシを指す。
「ヘテロシクリル」という用語は、単環式の場合、１〜３個のヘテロ原子を有し、二環式の場合、１〜６個のヘテロ原子を有し、または三環式の場合、１〜９個のヘテロ原子を有する、非芳香族５〜８員環単環式、８〜１２員環二環式、または１１〜１４員環三環式環系を指し、上記のヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択され（例えば単環式、二環式、または三環式の場合、それぞれ、炭素原子およびＮ、Ｏ、またはＳの１〜３、１〜６、または１〜９個のヘテロ原子）、各環の０、１、２、または３個の原子は、置換基で置換されてもよい。ヘテロシクリル基の例としては、ピペラジニル、ピロリジニル、ジオキサニル、モルホリニル、テトラヒドロフラニル等が挙げられる。
「オキソ」という用語は、炭素に付着した場合にカルボニルを形成し、窒素に付着した場合にＮ−オキシドを形成し、硫黄に付着した場合にスルホキシドまたはスルホンを形成する、酸素原子を指す。
「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、またはヘテロアリールカルボニル置換基を指し、それらのいずれも、置換基によってさらに置換され得る。
「置換基」という用語は、その基の任意の原子において、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリル、またはヘテロアリール基上で「置換される」基を指す。好適な置換基としては、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、およびウレイド基が挙げられるがこれに限定されない。
パリンドローム
本発明のｉＲＮＡ剤は、２つ以上のＲＮＡ領域を標的化することができる。例えば、ｉＲＮＡ剤は、ハイブリダイズするのに相互に十分に相補的な、第１および第２の配列を含むことができる。第１の配列は、第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができ、第２の配列は、第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であることができる。ｉＲＮＡ剤の第１および第２の配列は、異なるＲＮＡ鎖上にあってもよく、第１および第２の配列間のミスマッチは、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満であり得る。ｉＲＮＡ剤の第１および第２の配列は、同一ＲＮＡ鎖上にあり、関連実施形態では、ｉＲＮＡ剤の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１％超が、二分子型であり得る。ｉＲＮＡ剤の第１および第２の配列は、相互に完全に相補的であってもよい。
第１の標的ＲＮＡ領域は、第１の遺伝子によってコードすることができ、第２の標的ＲＮＡ領域は、第２の遺伝子によってコードすることができるか、または第１および第２の標的ＲＮＡ領域は、単一遺伝子からのＲＮＡの異なる領域であってもよい。第１および第２の配列は、少なくとも１ヌクレオチド異なり得る。
第１および第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝子の第１および第２の配列変異体、例えば、第１および第２の対立遺伝子によってコードされる転写物上にあってもよい。配列変異体は、例えば、突然変異または多型であってもよい。第１の標的ＲＮＡ領域は、第２の標的ＲＮＡ領域に対するヌクレオチド置換、挿入、もしくは欠失を含んでもよく、または第２の標的ＲＮＡ領域は、第１の標的領域の突然変異体または変異体であってもよい。
第１および第２の標的ＲＮＡ領域は、ウイルスまたはヒトＲＮＡ領域を含むことができる。第１および第２の標的ＲＮＡ領域はまた、癌遺伝子の変異体転写物上にあってもく、または腫瘍抑制遺伝子転写物の異なる突然変異を含むことができる。加えて、第１および第２の標的ＲＮＡ領域は、遺伝的変異のためのホットスポットに対応することができる。
本発明の構成物は、ｉＲＮＡ剤分子の混合物を含むことができる。例えば、１つのｉＲＮＡ剤は、ハイブリダイズするのに相互に十分に相補的な第１の配列および第２の配列を含有することができ、さらに、第１の配列は、第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であり、第２の配列は、第２の標的ＲＮＡ領域に相補的である。その混合物はまた、ハイブリダイズするのに相互に十分に相補的な第３の配列および第４の配列を含む、少なくとも１つの追加のｉＲＮＡ剤の種類を含むことができ、第３の配列は、第３の標的ＲＮＡ領域に相補的であり、第４の配列は、第４の標的ＲＮＡ領域に相補的である。加えて、第１または第２の配列は、相互にハイブリダイズすることが可能であるように、第３または第４の配列に十分に相補的であってもよい。第１および第２の配列は、同一または異なるＲＮＡ鎖上にあってもよく、第３および第４の配列は、同一または異なるＲＮＡ鎖上にあってもよい。
標的ＲＮＡ領域は、ウイルスまたはヒトＲＮＡの変異体配列であってもよく、ある実施形態では、標的ＲＮＡ領域のうちの少なくとも２つは、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の変異体転写物上にあってもよい。標的ＲＮＡ領域は、遺伝子ホットスポットに対応することができる。
ｉＲＮＡ剤構成物を作製する方法は、標的遺伝子（例えばウイルスもしくはヒト遺伝子、または癌遺伝子もしくは腫瘍抑制遺伝子、例えば、ｐ５３）のＲＮＡの領域に関する情報を取得または提供することを含み得、その領域は、高い変異性または突然変異頻度を有する（例えばヒトにおいて）。加えて、その領域内の複数のＲＮＡ標的に関する情報を取得または提供することができ、各ＲＮＡ標的は、遺伝子の異なる変異体または突然変異体に対応する（例えばｐ５３ ２４８Ｑおよび／またはｐ５３ ２４９Ｓをコードするコドンを含む領域）。ｉＲＮＡ剤は、第１の配列が複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第１の標的（（例えば２４９Ｑをコードする）に相補的であり、第２の配列が複数の変異体ＲＮＡ標的のうちの第２の標的（（例えば２４９Ｓをコードする）に相補的であるように構成することができ、第１および第２の配列は、ハイブリダイズするのに十分に相補的であり得る。
高い変異性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域を同定するために、例えば、標的遺伝子中の一般的な突然変異体を同定するための配列分析を使用することができる。高い変異性または突然変異頻度を有する標的遺伝子の領域は、集団からの標的遺伝子に関する遺伝子型情報を取得または提供することによって、同定することができる。
標的遺伝子の発現は、ハイブリダイズするのに相互に十分に相補的な第１の配列および第２の配列を有するｉＲＮＡ剤を提供することによって、調整、例えば、下方制御またはサイレンシングすることができる。加えて、第１の配列は、第１の標的ＲＮＡ領域に相補的であってもよく、第２の配列は、第２の標的ＲＮＡ領域に相補的であってもよい。
ｉＲＮＡ剤は、第１の変異体ＲＮＡ標的領域に相補的な第１の配列、および第２の変異体ＲＮＡ標的領域に相補的な第２の配列を含むことができる。第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、標的遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、または癌遺伝子の第１および第２の変異体または突然変異体に対応することができる。第１および第２の変異体標的ＲＮＡ領域は、標的遺伝子の対立遺伝子変異体、突然変異（例えば点突然変異）、または多型を含むことができる。第１および第２の変異体ＲＮＡ標的領域は、遺伝子ホットスポットに対応することができる。
複数のｉＲＮＡ剤（例えばパネルまたはバンク）を提供することができる。
他の実施形態
さらに別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、インビボで細胞内で、例えば、細胞に送達される外因性ＤＮＡテンプレートから産生される。例えば、ＤＮＡテンプレートは、ベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば静脈注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号明細書）によって、または定位注射（例えばＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照）によって、対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達媒体が埋め込まれた持続放出マトリックスを含むことができる。ＤＮＡテンプレートは、例えば、２つの転写ユニットを含むことができ、一方は、ｉＲＮＡ剤の上の鎖を含む転写物を産生し、他方は、ｉＲＮＡ剤の下の鎖を含む転写物を産生する。テンプレートが転写されると、ｉＲＮＡ剤が産生され、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ剤断片に処理される。
ある実施形態では、核酸は、２'−ＯＭｅ修飾で修飾されてもよい（Ｋｒａｙｎａｃｋ ＆ Ｂａｋｅｒ，ＲＮＡ，１２：１６３−１７６，２００６）。他の実施形態では、核酸は、エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）を含んでもよい（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，Ｓｕｐｐｌ．１，２４１−２４２、Ｓｕｒｏｎｏ Ａ ｅｔ ａｌ ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，１５：７４９−７５７，２００４）。
マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉｒ）は、植物または動物のゲノム中のＤＮＡから転写されるが、タンパク質には翻訳されない、小ＲＮＡ分子の高度に保存された種類である。プレ−マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＡに処理される。処理されたマイクロＲＮＡは、ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、成長、細胞増殖、アポトーシス、および分化の主要調節因子として同定されている、一本鎖の約１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡ分子である。それらは、特定のｍＲＮＡの３'−非翻訳領域に結合することによって、遺伝子発現の調節に関与すると考えられる。ＲＩＳＣは、翻訳阻害、転写物開裂、または両方を介して、遺伝子発現の下方制御を媒介する。ＲＩＳＣはまた、幅広い種類の真核生物の核内の転写サイレンシングに関与する。
今日まで同定されたｍｉＲＮＡ配列の数は多く、かつ増加しており、それらの具体的な実例は、例えば、“ｍｉＲＢａｓｅ：ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ，Ｇｒｏｃｏｃｋ ＲＪ，ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ Ｓ，Ｂａｔｅｍａｎ Ａ，Ｅｎｒｉｇｈｔ ＡＪ．ＮＡＲ，２００６，３４，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１４０−Ｄ１４４、“Ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ”Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ−Ｊｏｎｅｓ Ｓ．ＮＡＲ，２００４，３２，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｉｓｓｕｅ，Ｄ１０９−Ｄ１１１に記載されている。
標的として使用され得る、または本発明のオリゴヌクレオチドの設計のテンプレートとしての機能を果たし得る、マイクロＲＮＡまたはｍｉｒとして記載および／または同定されるものを含む、一本鎖オリゴヌクレオチドは、例えば、“Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ”と題するＥｓａｕ，ｅｔ ａｌ．米国公開第２００５／０２６１２１８号明細書（米国特許出願第１０／９０９，１２５号明細書）において教示され、その内容全体は、参照することによって本明細書に組み込まれる。本明細書に記載する任意のオリゴヌクレオチド化学修飾または変異はまた、一本鎖オリゴヌクレオチドに適用することも、当業者に理解されるであろう。
ｍｉＲＮＡ模倣体
ｍｉＲＮＡ模倣体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング能力を模倣するために使用することができる、分子の種類を表す。したがって、「マイクロＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉ経路に入り、遺伝子発現を調節することができる合成非コードＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲＮＡは、内在性ｍｉＲＮＡの源からの精製によって得られない）を指す。ｍｉＲＮＡ模倣体は、成熟分子（例えば一本鎖）または模倣前駆体（例えばプリ−またはプレ−ｍｉＲＮＡ）として設計することができる。ｍｉＲＮＡ模倣体は、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ロックされた核酸、もしくは２'−Ｏ，４'−Ｃ−エチレン−架橋核酸（ＥＮＡ）、または上記の任意の組み合わせ（ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを含む）が挙げられるがこれに限定されない、オリゴヌクレオチドを含む、核酸（修飾または修飾核酸）から成ることができる。加えて、ｍｉＲＮＡ模倣体は、送達，細胞内コンパートメント化、安定性、特異性、機能性、鎖の利用、および／または効力に影響を及ぼし得る共役を含むことができる。１つの設計において、ｍｉＲＮＡ模倣体は、二本鎖分子（例えば約１６〜約３１ヌクレオチド長の二本鎖領域を有する）であり、所与のｍｉＲＮＡの成熟鎖との同一性を有する、１つ以上の配列を含有する。修飾は、分子の一方または両方の鎖上の２'修飾（２'−Ｏメチル修飾および２'Ｆ修飾を含む）、ならびに核酸安定性および／または特異性を強化する、ヌクレオチド間修飾（例えばホスホロチオエート修飾）を含むことができる。加えて、ｍｉＲＮＡ模倣体は、突出部を含むことができる。突出部は、いずれかの鎖の３'または５'末端のいずれかの１〜６ヌクレオチドから成ることができ、安定性または機能性を強化するように修飾することができる。一実施形態では、ｍｉＲＮＡ模倣体は、１６〜３１の間のヌクレオチドおよび以下の化学修飾パターンのうちの１つ以上の二本鎖領域を含む。センス鎖は、ヌクレオチド１および２（センスオリゴヌクレオチドの５'末端から数えて）の２'−Ｏ−メチル修飾、ならびにＣおよびＵの全てを含有し、アンチセンス鎖修飾は、ＣおよびＵの全ての２'Ｆ修飾、オリゴヌクレオチドの５'末端のリン酸化反応、ならびに２ヌクレオチド３'突出部に関連する安定化ヌクレオチド間連結を含むことができる。
ｓｕｐｅｒｍｉｒ
ｓｕｐｅｒｍｉｒは、ｍｉＲＮＡと実質的に同一であり、その標的に対してアンチセンスである、核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）または両方またはその修飾の一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを指す。この用語は、自然発生する核酸塩基、糖、および共有ヌクレオシド間（骨格）連結から成り、同様に機能する少なくとも１つの非自然発生的な部分を含有する、オリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾または置換オリゴヌクレオチドは、例えば、強化された細胞取り込み、核酸標的に対する強化された親和性、およびヌクレアーゼの存在下での増加した安定性等の所望の特性により、天然型よりも好ましい。好ましい実施形態では、ｓｕｐｅｒｍｉｒは、センス鎖を含まず、別の好ましい実施形態では、ｓｕｐｅｒｍｉｒは、かなりの程度までは自己ハイブリダイズしない。本発明で取り上げられるｓｕｐｅｒｍｉｒは、二次構造を有することができるが、生理学的条件下では実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるｓｕｐｅｒｍｉｒは、ｓｕｐｅｒｍｉｒの約５０％未満（例えば約４０％、３０％、２０％、１０％、または５％未満）がそれ自体と二重である範囲で一本鎖である。ｓｕｐｅｒｍｉｒは、ヘアピン断片を含むことができ、例えば、好ましくは、３'末端における配列は、自己ハイブリダイズし、二本鎖領域、例えば、少なくとも１、２、３、または４、および好ましくは、８、７、６、またはｎ未満のヌクレオチド、例えば、５ヌクレオチドの二本鎖領域を形成することができる。二本鎖領域は、リンカー、例えば、ヌクレオチドリンカー、例えば、３、４、５、または６ｄＴ、例えば、修飾ｄＴによって接続することができる。別の実施形態では、ｓｕｐｅｒｍｉｒは、例えば、３'および５'末端の一方もしくは両方において、またはｓｕｐｅｒｍｉｒの一方の末端および非末端もしくは中央において、例えば、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド長のより短いオリゴと二重である。
ＡｎｔｉｍｉｒまたはｍｉＲＮＡ阻害剤
「ａｎｔｉｍｉｒ」、「マイクロＲＮＡ阻害剤」、「ｍｉＲ阻害剤」、または「阻害剤」という用語は同義語であり、特定のｍｉＲＮＡの能力を妨げるオリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドを指す。一般的に、阻害剤は、ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾ＤＮＡ、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、または上記の任意の組み合わせを含む、オリゴヌクレオチドを本質的に含む、核酸または修飾核酸である。修飾は、送達、安定性、特異性、細胞内コンパートメント化、または効力に影響を及ぼし得る、２'修飾（２'−０アルキル修飾および２'Ｆ修飾を含む）ならびにヌクレオチド間修飾（例えばホスホロチオエート修飾）を含む。加えて、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、送達、細胞内コンパートメント化、安定性、および／または効力に影響を及ぼし得る、共役を含むことができる。阻害剤は、一本鎖、二本鎖（ＲＮＡ／ＲＮＡもしくはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖）、およびヘアピン設計を含む、種々の構造を採ることができ、一般的に、マイクロＲＮＡ阻害剤は、１つ以上の配列、または標的化されるｍｉＲＮＡの成熟鎖（複数を含む）と相補的もしくは部分的に相補的な配列の部分を含有し、さらに、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、成熟ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列に対して５'および３'に位置する追加の配列を含むこともできる。追加の配列は、成熟ｍｉＲＮＡが得られるプリ−ｍｉＲＮＡ中の成熟ｍｉＲＮＡに隣接する配列の逆相補体であってもよく、または追加の配列は、任意配列（Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵの混合物を有する）であってもよい。いくつかの実施形態では、追加の配列の一方または両方は、ヘアピンを形成することが可能な任意配列である。したがって、いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡの逆相補体である配列は、ヘアピン構造によって５'側および３'側に配置される。マイクロＲＮＡ阻害剤は、二本鎖である場合、反対側の鎖上のヌクレオチド間にミスマッチを含み得る。さらに、マイクロＲＮＡ阻害剤は、阻害剤の細胞への取り込みを促進するために、共役部分に連結されてもよい。例えば、マイクロＲＮＡ阻害剤は、マイクロＲＮＡ阻害剤の細胞への受動的な取り込みを可能にする、コレステリル５−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−３ヒドロキシペンチルカルバメート）に連結されてもよい。ヘアピンｍｉＲＮＡ阻害剤を含むマイクロＲＮＡ阻害剤は、Ｖｅｒｍｅｕｌｅｎ ｅｔ ａｌ ．，“Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ Ａｒｅ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ Ｏｆ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＲＩＳＣ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，”ＲＮＡ １３：７２３−７３０（２００７）ならびに国際公開第２００７／０９５３８７号および同第２００８／０３６８２５号の各パンフレットに詳細に記載され、それらのそれぞれは、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。当業者は、所望のｍｉＲＮＡのデータベースから配列を選択し、本明細書に開示する方法に有用な阻害剤を設計することができる。
Ｕ１アダプター
Ｕ１アダプターは、ポリＡ部位を阻害し、かつ標的遺伝子の末端エクソンにおける部位、およびＵ１ ｓｎＲＮＰのＵ１核内低分子ＲＮＡ構成成分に結合する「Ｕ１ドメイン」に相補的な標的ドメインを有する、二官能性オリゴヌクレオチドである（Ｇｏｒａｃｚｎｉａｋ，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７（３），２５７−２６３。それは、その全体が参照として本明細書に明示的に組み込まれる）。Ｕ１ ｓｎＲＮＰは、主に、プレ−ｍＲＮＡエクソン−イントロン境界に結合することによって、スプライセオソーム形成における初期段階を導く働きをする、リボヌクレオタンパク質複合体である（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｓｉｍｐｓｏｎ，１９９８，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ ４９：７７−９５）。Ｕ１ ｓｎＲＮＡ塩基対の５'末端のヌクレオチド２−１１は、プレｍＲＮＡの５'ｓｓと結合する。一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、Ｕ１アダプターである。一実施形態では、Ｕ１アダプターは、少なくとも１つの他のｉＲＮＡ剤と組み合わせて投与することができる。
ａｎｔａｇｏｍｉｒ
ａｎｔａｇｏｍｉｒは、ＲＮＡｓｅ保護、ならびに強化された組織および細胞取り込み等の薬理学的特性のために、種々の修飾を有する、ＲＮＡ様オリゴヌクレオチドである。それらは、例えば、糖の完全な２'−Ｏ−メチル化、ホスホロチオエート骨格、および例えば、３'−末端におけるコレステロール部分によって、正常なＲＮＡとは異なる。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、ａｎｔａｇｏｍｉｒおよび内在性ｍｉＲＮＡを含む二本鎖を形成することによって、内在性ｍｉＲＮＡを効率的にサイレンシングするために使用されてもよく、それによって、ｍｉＲＮＡ誘発遺伝子サイレンシングを防止する。ａｎｔａｇｏｍｉｒ媒介ｍｉＲＮＡサイレンシングの一例は、Ｋｒｕｔｚｆｅｌｄｔ ｅｔ ａｌ ，Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３８：６８５−６８９に記載される、ｍｉＲ−１２２のサイレンシングであり、それは、その全体が参照として本明細書に明示的に組み込まれる。ａｎｔａｇｏｍｉｒ ＲＮＡは、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコルを使用して合成することができる。米国特許出願第１１／５０２，１５８号および同第１１／６５７，３４１号明細書を参照されたい（それらのそれぞれの開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる）。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、オリゴヌクレオチド合成のためのリガンド共役モノマーサブユニットおよびモノマーを含むことができる。例示的なモノマーは、２００４年８月１０日出願の米国出願第１０／９１６，１８５号明細書に記載される。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載されるような、ＺＸＹ構造を有することができる。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、両親媒性部分と複合することができる。オリゴヌクレオチド薬剤で使用するための例示的な両親媒性部分は、２００４年３月８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０号パンフレットに記載される。
ａｎｔａｇｏｍｉｒは、マイクロＲＮＡを標的化する、一本鎖、二本鎖、部分的に二本鎖、またはヘアピン構造の化学修飾オリゴヌクレオチドであってもよい。ａｎｔａｇｏｍｉｒは、内在性ｍｉＲＮＡに実質的に相補的な約１２個以上の連続的なヌクレオチド、より具体的には、ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡヌクレオチド配列の標的配列に実質的に相補的な約１２個以上の連続的なヌクレオチドを含む薬剤から本質的に成るか、またはそれらを含んでもよい。ある実施形態では、本発明で取り上げられるａｎｔａｇｏｍｉｒは、約１２〜２５個のヌクレオチド、場合によっては、約１５〜２３個のヌクレオチドのｍｉＲＮＡ標的配列をハイブリダイズのに十分に相補的な、ヌクレオチド配列を含む。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムＤＮＡの非存在下でさえ、それらの比較的短い結合配列を認識することができるため、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を有する短いオリゴヌクレオチドを生細胞内の遺伝子発現を操作するためのツールとして使用することができる。この戦略は、そのような「デコイオリゴヌクレオチド」の細胞内送達を含み、それは、次いで、標的因子によって認識および結合される。デコイによる転写因子のＤＮＡ結合部位の占領は、転写因子を、続いて標的遺伝子のプロモーター領域に結合することが不可能な状態にする。デコイは、転写因子によって活性化される遺伝子発現を阻害すること、または転写因子の結合によって抑制される遺伝子を上方制御することのいずれかのために、治療薬剤として使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの利用の例は、Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０００，１０６：１０７１−１０７５に記載されており、その全体が参照として本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明で取り上げられるオリゴヌクレオチド薬剤はまた、デコイ核酸、例えば、デコイＲＮＡであってもよい。デコイ核酸は、天然核酸と似ているが、天然核酸の活性を阻害または遮断するように修飾され得る。例えば、デコイＲＮＡは、リガンドの天然結合ドメインを模倣することができる。したがって、デコイＲＮＡは、特異的リガンドとの結合をめぐって天然結合ドメインと競合する。天然結合標的は、内在性核酸、例えば、プレ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、プレ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＤＮＡであってもよい。例えば、ＨＩＶトランス活性化反応（ＴＡＲ）ＲＮＡの過剰発現は、「デコイ」としての機能を果たし、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質に効率的に結合し、それによって、それが、ＨＩＶ ＲＮＡにコードされるＴＡＲ配列に結合することを防止することができることが示されている。ある実施形態では、デコイＲＮＡは、標的化を改善する修飾、例えば、本明細書に記載する標的化修飾を含んでもよい。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に少なくとも部分的に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスＲＮＡの場合、それらは、相補的なＲＮＡ鎖に結合することによって、相補的なＲＮＡ鎖の翻訳を防止する。アンチセンスＤＮＡはまた、特定の相補的（コードまたは非コード）ＲＮＡを標的化するために使用することができる。結合が起こる場合、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅ Ｈによって分解することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの利用の例は、Ｄｉａｓ ｅｔ ａｌ ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．，２００２，１：３４７−３５５に記載されており、それは、その全体が参照として本明細書に明示的に組み込まれる。
本発明で取り上げられる一本鎖オリゴヌクレオチド薬剤は、アンチセンス核酸を含む。「アンチセンス」核酸は、遺伝子発現産物をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な、またはＲＮＡ配列、例えば、プレ−ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、もしくはプレ−ｍｉＲＮＡに相補的な、ヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸は、センス核酸標的と水素結合を形成し得る。
コード鎖配列（例えばｃＤＮＡ分子のセンス鎖の配列）を所与として、アンチセンス核酸は、ワトソン−クリック塩基対合の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＲＮＡ、例えば、プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部に相補的であってもよい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、プレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域、例えば、５'ＵＴＲに相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０〜２５ヌクレオチド長（例えば約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチド長）であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、ｍｉＲＮＡまたはプレ−ｍｉＲＮＡに相補的であってもよい。
ある実施形態では、アンチセンス核酸は、当該技術分野で既知の手順を使用した、化学合成および／または酵素的連結反応を使用して、構成することができる。例えば、アンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、分子の生物学的安定性を増加させるように、またはアンチセンスと標的核酸との間に形成される二本鎖の物理的安定性を増加させるように設計される、自然発生するヌクレオチドまたは様々に修飾されたヌクレオチドを使用して、化学的に合成することができ、例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することができる。他の適切な核酸修飾は、本明細書に記載される。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス配向でサブクローン化された発現ベクターを使用して、生物学的に産生することができる（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、対象となる標的核酸に対してアンチセンス配向になる）。
アンチセンス剤は、リボヌクレオチドのみ、デオキシリボヌクレオチドのみ（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの両方を含むことができる。例えば、リボヌクレオチドのみから成るアンチセンス剤は、相補的なＲＮＡにハイブリダイズし、標的ＲＮＡ転写物への翻訳機構のアクセスを防止し、それによってタンパク質合成を防止することができる。デオキシリボヌクレオチドのみ、またはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含むアンチセンス分子、例えば、アンチセンス剤の５'および３'末端においてＲＮＡ配列によって配置されるＤＮＡ配列は、相補的なＲＮＡにハイブリダイズすることができ、ＲＮＡ標的は、続いて、酵素、例えば、ＲＮＡｓｅ Ｈによって開裂することができる。標的ＲＮＡの分解は、翻訳を防止する。フランキングＲＮＡ配列は、２'−Ｏ−メチル化ヌクレオチドおよびホスホロチオエート連結を含むことができ、内部ＤＮＡ配列は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含むことができる。いくつかの実施形態では、内部ＤＮＡ配列は、ＲＮＡｓｅＨ活性による標的化が所望の場合、少なくとも５ヌクレオチド長であってもよい。
増加したヌクレアーゼ耐性のために、アンチセンス剤を、３'−３'連結で３'−末端のヌクレオシドを反転させることによって、さらに修飾することができる。別の代替例では、３'−末端は、アミノアルキル基でブロックすることができる。
他の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、標的化を改善する修飾、例えば、本明細書に記載する標的化修飾を含んでもよい。
アプタマー
アプタマーは、特定の標的分子（複数を含む）を結合する核酸分子である。アプタマーは、ＲＮＡまたはＤＮＡをベースとしてもよく、リボスイッチを含んでもよい。リボスイッチは、小さい標的分子を直接結合することができるｍＲＮＡ分子の一部であり、その標的結合は、遺伝子活性に影響を及ぼす。したがって、リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、その標的分子の存在または非存在に応じて、それ自体の活性の調節に直接関与する。
本発明で取り上げられるオリゴヌクレオチド薬剤は、アプタマーであってもよい。アプタマーは、有機小分子またはタンパク質、例えば、転写または翻訳因子等の非核酸リガンドに結合し、続いて活性を修飾する（例えば阻害する）。アプタマーは、非核酸リガンド上の標的化結合部位の認識を導く、特定の構造に折り畳むことができる。アプタマーは、本明細書に記載する修飾のいずれをも含有することができる。
リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する、特定の触媒ドメインを有する、オリゴヌクレオチドである（Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｅｃｈ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．１９８７ Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２、Ｆｏｒｓｔｅｒ ａｎｄ Ｓｙｍｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９８７ Ａｐｒ ２４；４９（２）：２１１−２０）。自然発生する酵素的ＲＮＡの少なくとも６個の基本的種類が現在既知である。一般的に、酵素的核酸は、最初に標的ＲＮＡと結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを開裂するように作用する分子の酵素部分に極めて接近して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素的核酸は、相補的な塩基対合を介して、最初に標的ＲＮＡを認識し、次いで標的ＲＮＡに結合し、一旦正確な部位に結合されると、標的ＲＮＡを切断するように酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的開裂は、コードされたタンパク質の合成を導くその能力を破壊する。酵素的核酸は、そのＲＮＡ標的を結合および開裂した後、そのＲＮＡから放出され、別の標的を探し、新たな標的を繰り返し結合および開裂することができる。
任意の標的配列に標的化されるリボザイムを産生する方法は、当該技術分野で既知である。リボザイムは、国際公開第９３／２３５６９号および同第９４／０２５９５号の各パンフレット（それぞれは、参照することによって本明細書に明確に組み込まれる）に記載されるように設計され、それらの中に記載されるように、インビトロおよびインビボで試験されるように合成されてもよい。
生理学的効果
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤は、治療毒性の決定が、ｉＲＮＡ剤の、ヒトおよび非ヒト動物の両方の配列に対する相補性によって容易になるように設計することができる。これらの方法によって、ｉＲＮＡ剤は、ヒトからの核酸配列、および少なくとも１つの非ヒト動物、例えば、齧歯動物、反芻動物、または霊長動物等の非ヒト哺乳動物からの核酸配列に完全に相補的な配列から成ることができる。例えば、非ヒト哺乳動物は、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、サル、ボノボ、チンパンジー、アカゲザル、またはカニクイザルであってもよい。ｉＲＮＡ剤の配列は、非ヒト哺乳動物およびヒトの相同の遺伝子、例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子内の配列に相補的であり得る。非ヒト哺乳動物におけるｉＲＮＡ剤の毒性を判定することによって、ヒトにおけるｉＲＮＡ剤の毒性を推定することができる。より厳しい毒性試験に対して、ｉＲＮＡ剤は、ヒト、および２つ以上の、例えば、２つまたは３つ以上の非ヒト動物に相補的であり得る。
本明細書に記載する方法は、ヒトに対するｉＲＮＡ剤の任意の生理学的効果、例えば、毒性効果等の任意の望ましくない効果、または任意のプラス効果もしくは所望の効果を関連付けるために使用することができる。
ｄｓｉＲＮＡの細胞取り込みの増加
本発明の方法は、ｉＲＮＡ剤およびｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みに影響を及ぼす薬剤を投与することを含む。薬剤は、ｉＲＮＡ剤が投与される前、後、またはそれと同時に投与することができる。薬剤は、ｉＲＮＡ剤に共有結合することができる。薬剤は、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であってもよい。該薬剤は、細胞に一時的な影響を及ぼし得る。
薬剤は、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増加させることができる。薬剤は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スインホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビンであってもよい。
薬剤はまた、例えば、炎症反応を活性化することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞への取り込みを増加させることができる。そのような効果を有し得る例示的な薬剤としては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
ｉＲＮＡ共役体
ｉＲＮＡ剤は、第２の薬剤にカップリング、例えば、共有結合することができる。例えば、特定の疾患を治療するために使用されるｉＲＮＡ剤は、第２の治療薬剤、例えば、ｉＲＮＡ剤以外の薬剤にカップリングすることができる。第２の治療薬剤は、同一疾患の治療に向けられる薬剤であってもよい。例えば、望ましくない細胞増殖、例えば、癌を特徴とする疾患を治療するために使用されるｉＲＮＡの場合、ｉＲＮＡ剤は、抗癌作用を有する第２の薬剤にカップリングすることができる。例えば、それは、免疫系を刺激する薬剤、例えば、ＣｐＧモチーフ、あるいはより一般的には、トール様受容体を活性化する、および／またはγインターフェロンの産生を増加させる薬剤にカップリングすることができる。
ｉＲＮＡ産生
ｉＲＮＡは、種々の方法によって、例えば、大量に産生することができる。例示的な方法としては、有機合成およびＲＮＡ開裂、例えば、インビトロ開裂が挙げられる。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製することができるという利点を提供する。当該技術分野で既知のそのような合成のための任意の他の手段が、追加的または代替的に採用されてもよい。また、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびアルキル化誘導体等、他のオリゴヌクレオチドを調製するための同様の技術を使用することも既知である。
合成方法にかかわらず、オリゴヌクレオチドは、製剤に適切な溶液（例えば水溶液および／または有機溶液）中で調製することができる。例えば、オリゴヌクレオチド調製物は、純粋な２回蒸留水中で沈殿および再溶解し、凍結乾燥することができる。次いで、乾燥オリゴヌクレオチドは、目的とする製剤プロセスに適切な溶液中に再懸濁することができる。
特定の修飾オリゴヌクレオチドの合成に関する教示は、米国特許または係属中の特許出願に記載されている。ポリアミンが共役されたオリゴヌクレオチドに関しては、米国特許第５，１３８，０４５号および同第５，２１８，１０５号の各明細書；キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドの調製のためのモノマーに関しては、米国特許第５，２１２，２９５号明細書；修飾骨格を有するオリゴヌクレオチドに関しては、米国特許第５，３７８，８２５号および同第５，５４１，３０７号の各明細書；骨格−修飾オリゴヌクレオチドおよび還元カップリングによるその調製に関しては、米国特許第５，３８６，０２３号；３−デアザプリン環系に基づく修飾核酸塩基およびその合成方法に関しては、米国特許第５，４５７，１９１号明細書；Ｎ−２置換プリンに基づく修飾核酸塩基に関しては、米国特許第５，４５９，２５５号明細書；キラルリン連結を有するオリゴヌクレオチドを調製するためのプロセスに関しては、米国特許第５，５２１，３０２号明細書；ペプチド核酸に関しては、米国特許第５，５３９，０８２号明細書；β−ラクタム骨格を有するオリゴヌクレオチドに関しては、米国特許第５，５５４，７４６号明細書；オリゴヌクレオチドの合成のための方法および材料に関しては、米国特許第５，５７１，９０２号明細書；アルキルチオ基を有するヌクレオシドであって、そのような基は、ヌクレオシドの種々の位置のいずれかにおいて付着される他の部分へのリンカーとして使用され得る、ヌクレオシドに関しては、米国特許第５，５７８，７１８号明細書；高いキラル純度のホスホロチオエート連結を有するオリゴヌクレオチドに関しては、米国特許第５，５８７，３６１号および同第５，５９９，７９７号の各明細書；２'−Ｏ−アルキルグアノシン、および２，６−ジアミノプリン化合物を含む関連化合物の調製のためのプロセスに関しては、米国特許第５，５０６，３５１号明細書；Ｎ−２置換プリンを有するオリゴヌクレオチドに関しては、米国特許第５，５８７，４６９号明細書；３−デアザプリンを有するオリゴヌクレオチドに関しては、米国特許第５，５８７，４７０号；共役された４'−デスメチルヌクレオシド類似体に関しては、米国特許第５，２２３，１６８号および同第米国特許第５，６０８，０４６号の各明細書；骨格−修飾オリゴヌクレオチド類似体に関しては、米国特許第５，６０２，２４０号および同第５，６１０，２８９号の各明細書；ならびにとりわけ、２'−フルオロ−オリゴヌクレオチドを合成する方法に関しては、米国特許第６，２６２，２４１号および同第５，４５９，２５５号の各明細書。
有機合成
ｉＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ分子の各鎖を別々に合成することによって作製することができる。次いで、構成成分鎖をアニールすることができる。
所与のｉＲＮＡのための大量の特定のＲＮＡ鎖を産生するために、大型生物反応器、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｓｗｅｄｅｎ）のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ ＩＩを使用することができる。ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔＩＩ反応器は、１．５モル過剰のみのホスホラミダイトヌクレオチドを使用して、ヌクレオチドを効率的にカップリングすることができる。ＲＮＡ鎖を作製するために、リボヌクレオチドアミダイトが使用される。ｉＲＮＡのための２１〜２３ヌクレオチド鎖を合成するために、モノマー添加の標準的なサイクルを使用することができる。典型的には、２つの相補的な鎖が別々に産生され、次いで、例えば、固体支持体からの放出および脱保護の後にアニールされる。
別個のｉＲＮＡ種を産生するために、有機合成を使用することができる。特定の標的遺伝子に対する種の相補性は、正確に指定することができる。例えば、種は、多型、例えば、単一ヌクレオチド多型を含む領域に相補的であってもよい。さらに、多型の位置は、正確に定義され得る。いくつかの実施形態では、多型は、内部領域、例えば、末端の一方または両方から少なくとも４、５、７、または９ヌクレオチドに位置する。
ｄｓｉＲＮＡ開裂
ｉＲＮＡはまた、より大きいｄｓ ｉＲＮＡを開裂することによって作製することができる。開裂は、インビトロまたはインビボで媒介することができる。例えば、インビトロでの開裂によってｉＲＮＡを産生するために、以下の方法を使用することができる。
インビトロ転写。ｄｓｉＲＮＡは、両方の方向に核酸（ＤＮＡ）断片を転写することによって産生される。例えば、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（登録商標）ＲＮＡｉ転写キット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、ベクター、およびＴ７プロモーターによってどちらの側にも配置される位置において、ベクターにクローン化される核酸断片のためのｄｓｉＲＮＡを産生するための方法を提供する。別々のテンプレートは、ｄｓｉＲＮＡのための２つの相補的な鎖のＴ７転写のために生成される。テンプレートは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの添加によってインビトロで転写され、ｄｓｉＲＮＡが産生される。ＰＣＲおよび／または他のＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ３もしくはＳＰ６ポリメラーゼ）を使用した、同様の方法もまた、使用することができる。一実施形態では、この方法によって評価されるＲＮＡ遺伝子は、組み換え酵素の調製物を汚染し得る内毒素を除去するために、注意深く精製される。
インビトロ開裂。ｄｓｉＲＮＡは、例えば、Ｄｉｃｅｒまたは類似のＲＮＡｓｅ ＩＩＩベースの活性を使用して、ｉＲＮＡにインビトロで開裂される。例えば、ｄｓｉＲＮＡは、ショウジョウバエからのインビトロ抽出物中で、または精製された構成成分、例えば、精製されたＲＮＡｓｅもしくはＲＩＳＣ複合体（ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体）を使用して、インキュベートすることができる。例えば、Ｋｅｔｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ ．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００１ Ｏｃｔ １５；１５（２０）：２６５４−９、およびＨａｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００１ Ａｕｇ １０；２９３（５５３２）：１１４６−５０を参照されたい。
ｄｓｉＲＮＡ開裂は、概して、複数のｉＲＮＡ種を産生し、それぞれは、元のｄｓｉＲＮＡ分子の特定の２１〜２３ｎｔ断片である。例えば、元のｄｓｉＲＮＡ分子の重複領域および隣接領域に相補的な配列を含む、ｉＲＮＡが存在し得る。
合成方法にかかわらず、ｉＲＮＡ調製物は、製剤に適切な溶液（例えば水溶液および／または有機溶液）中で調製することができる。例えば、ｉＲＮＡ調製物は、純粋な２回蒸留水中で沈殿および再溶解し、凍結乾燥することができる。次いで、乾燥ｉＲＮＡは、目的とする製剤プロセスに適切な溶液中に再懸濁することができる。
製剤
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤は、対象への投与のために製剤化することができる。
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。
製剤化されたｉＲＮＡ構成物は、種々の状態を取ることができる。いくつかの例では、構成物は、少なくとも部分的に結晶性、均一に結晶性、および／または無水（例えば８０、５０、３０、２０、もしくは１０％未満の水）である。別の例では、ｉＲＮＡは、水相、例えば、水を含む溶液中にある。
水相または結晶性構成物は、例えば、送達媒体、例えば、リポソーム（特に水相に対する）または粒子（例えば結晶性構成物に適切であり得るような微小粒子）に組み込まれる。概して、ｉＲＮＡ構成物は、目的とする投与方法に適合する方法で製剤化される（以下を参照）。
特定の実施形態では、該構成物は、以下の方法のうちの少なくとも１つによって調製される。噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、もしくはこれらの技術の組み合わせ；または脂質を用いた超音波処理、フリーズドライ、凝縮、および他の自己集合。
ｉＲＮＡ調製物は、別の薬剤、例えば、別の治療薬剤またはｉＲＮＡを安定化する薬剤、例えば、ｉＲＮＡ剤と複合してｉＲＮＰを形成するタンパク質と組み合わせて、製剤化することができる。さらに他の薬剤としては、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（例えばＭｇ２＋等の二価カチオンを除去するための）、塩、ＲＮＡｓｅ阻害剤（例えばＲＮＡｓｉｎ等の広い特異性のＲＮＡｓｅ阻害剤）等が挙げられる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、第２の遺伝子に対して、または同一遺伝子に対して、ＲＮＡｉを媒介することができる、第２のｉＲＮＡを含む。さらに他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０、または１００個以上の異なるｉＲＮＡ種を含むことができる。そのようなｉＲＮＡは、同様の数の異なる遺伝子に対して、ＲＮＡｉを媒介することができる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ調製物は、少なくとも第２の治療薬剤（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ以外の薬剤）を含む。例えば、ウイルス疾患、例えば、ＨＩＶの治療のためのｉＲＮＡ構成物は、既知の抗ウイルス薬（例えばプロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）を含み得る。別の例では、癌治療のためのｉＲＮＡ構成物はさらに、化学療法剤を含み得る。
例示的な製剤は、以下に考察される。
リポソーム
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）調製物は、膜分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルにおける送達のために製剤化することができる。本明細書で使用する「リポソーム」という用語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層に配列される両親媒性脂質から成る小胞を指す。リポソームは、親油性物質および水性内部から形成される膜を有する、単層および多層小胞を含む。水性部分は、ｉＲＮＡ構成物を含有する。親油性物質は、典型的にはｉＲＮＡ構成物を含まないが、いくつかの例では含み得る水性外部から、水性内部を隔離する。リポソームは、作用部位への活性成分の輸送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に類似するので、リポソームが組織に適用されると、リポソーム二重層は、細胞膜の二重層と融合する。リポソームおよび細胞の融合が進行すると、ｉＲＮＡを含む内部の水性内容物は、細胞に送達され、そこで、ｉＲＮＡは、標的ＲＮＡに特異的に結合することができ、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によっては、リポソームはまた、例えば、特定の細胞型にｉＲＮＡを導くように、特異的に標的化される。
ｉＲＮＡを含有するリポソームは、種々の方法によって調製することができる。
一例では、リポソームの脂質成分は、ミセルが脂質成分によって形成されるように、洗浄剤中に溶解される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗浄剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗浄剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ｉＲＮＡ調製物は、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン性基は、ｉＲＮＡと相互作用し、ｉＲＮＡの周囲で凝縮し、リポソームを形成する。凝縮後、洗浄剤は、例えば、透析によって除去され、ｉＲＮＡのリポソーム調製物を得る。
必要な場合、凝縮を補助する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えばスペルミンまたはスペルミジン）であってもよい。凝縮を助けるためにｐＨを調節することもできる。
送達媒体の構造的構成成分としてポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達媒体を生産するための方法のさらなる説明は、例えば、国際公開第９６／３７１９４号パンフレットに記載される。リポソーム形成はまた、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７、米国特許第４，８９７，３５５号明細書、米国特許第５，１７１，６７８号明細書、Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５、Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９、Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８、Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３、およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載される例示的な方法の１つ以上の態様を含むことができる。送達媒体としての使用に適切なサイズの脂質会合体を調製するための一般的に使用される技術としては、超音波処理、および凍結融解と押出が挙げられる（例えばＭａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照）。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）かつ比較的均一な会合体が望ましい場合、微小流動化を使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。これらの方法は、リポソームにｉＲＮＡ調製物をパッケージングするように容易に適合される。
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸分子と複合するのではなくむしろ、核酸分子を捕捉する。核酸分子および脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体形成ではなくむしろ反発が生じる。それにもかかわらず、いくつかの核酸分子は、これらのリポソームの水性内部内に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、培養において細胞単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するのに使用されている。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９，（１９９２）２６９−２７４）。
リポソーム組成物の１つの主要な種類は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。例えば、中性リポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物が、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方で、アニオン性融合リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣ等のホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
インビトロおよびインビボでリポソームを細胞に導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号、同第５，１７１，６７８号の各明細書、国際公開第９４／００５６９号、同第９３／２４６４０号、同第９１／１６０２４号の各パンフレット、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４、Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３、Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２、Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３、およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、血漿膜と同じくらい効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれ、マクロファージにｉＲＮＡに送達するために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られるリポソームは、生体適合性および生分解性を有し、リポソームは、幅広い種類の水溶性および脂溶性薬剤を組み込むことができ、リポソームは、それらの内部コンパートメント内の封入されたｉＲＮＡを代謝および分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質表面電荷、小胞サイズ、およびリポソームの含水量である。
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自発的に相互作用して、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、ｉＲＮＡの送達をもたらすことができる脂質−核酸複合体を形成する、小リポソームを形成することができる（例えばＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用の説明に関して、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７および米国特許第４，８９７，３５５号を参照）。
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用し、ＤＮＡ複合小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用し、複合体を形成する、正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む、生体組織培養細胞に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分正に帯電したリポソームを使用する場合、得られた複合体上の正味電荷もまた、正である。このようにして調製される正に帯電した複合体は、自発的に負に帯電した細胞表面に付着し、血漿膜と融合し、機能性核酸を、例えば、組織培養細胞に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分が、エーテル連結よりもむしろエステルによって連結されるという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物としては、２つの種類の脂質のうちの１つに共役され、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）等の化合物を含む、例えば、カルボキシスペルミンを含む種々の部分に共役されたものが挙げられる。（例えば米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照）。
別のカチオン性脂質複合体としては、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）での脂質の誘導体化が挙げられる（Ｇａｏ，Ｘ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照）。ポリリシンをＤＯＰＥに共役することによって作製されるリポポリリシンは、血清の存在下でのトランスフェクションに効果的であると報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株に対して、共役されたカチオン性脂質を含有するこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを提供するとされている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、ならびにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ （ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に好適な他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号および同第９６／３７１９４号の各パンフレットに記載される。リポソーム形成に好適な他のカチオン性脂質は、米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号（２００８年１月２日出願）、同第６１／０３９，７４８号（２００８年３月２６日出願）、同第６１／０４７，０８７号（２００８年４月２２日出願）、および同第６１／０５１，５２８号（２００８年５月２１日出願）の各明細書に記載され、それらの全ては、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームは、他の製剤に優る利点を示す。そのような利点としては、投与された薬物の高全身性吸収率に関連する副作用の減少、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、およびｉＲＮＡの皮膚への投与能力が挙げられる。いくつかの実施において、表皮細胞にｉＲＮＡを送達するために、かつ真皮組織、例えば、皮膚へのｉＲＮＡの透過性を強化するために、リポソームが使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤化される薬物の皮膚への局所送達が報告されている（例えばＷｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０およびｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５、Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ． ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０，１９８８、Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７−２７６．１９８７、Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ． ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３、Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照）。
非イオン性リポソーム系はまた、皮膚への薬物送達におけるそれらの有用性を判定するために検査され、特定の系は、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む。マウス皮膚の真皮に薬物を送達するために、Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が使用された。ｉＲＮＡを有するそのような製剤は、皮膚疾患を治療するのに有用である。
ｉＲＮＡを含むリポソームは、高度に変形可能に作製することができる。そのような変形能は、リポソームがリポソームの平均半径よりも小さい孔に浸透することを可能にし得る。例えば、トランスフェロソームは、変形可能なリポソームの一種である。トランスフェロソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ｉＲＮＡを含むトランスフェロソームは、例えば、皮膚のケラチノサイトにｉＲＮＡを送達するために、例えば、皮下感染によって送達することができる。無傷哺乳動物の皮膚を横断するために、脂質小胞は、好適な経皮勾配の影響下で、それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する、一連の微細孔を通過しなければならない。加えて、脂質の特性に起因して、これらのトランスフェロソームは、自己最適化（例えば皮膚の孔の形状に適応可能）、自己修復性であってもよく、かつ多くの場合、断片化することなくそれらの標的に到達し、多くの場合、自己装填性であってもよい。
界面活性剤
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソーム（上記を参照）等の製剤に広く応用される。ｉＲＮＡ（または前駆体、例えば、ｉＲＮＡに処理することができる、より大きいｄｓｉＲＮＡ、またはｉＲＮＡもしくは前駆体をコードするＤＮＡ）構成物は、界面活性剤を含むことができる。一実施形態では、ｉＲＮＡは、界面活性剤を含むエマルションとして製剤化される。天然および合成の両方の多くの異なる種類の界面活性剤の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するのに最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、非イオン性界面活性剤と分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品に広く応用され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて、２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステル等の非イオン性エステルが挙げられる。脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー等の非イオン性アルカノールアミドおよびエーテルもまた、この種類に含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤の種類の最も一般的なメンバーである。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散されると負電荷を担持する場合、界面活性剤は、アニオン性と分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸等のカルボン酸、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキル硫酸およびエトキシル化アルキル硫酸等の硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸等のスルホン酸、アシルイセチオナート、アシルタウレートおよびスルホコハク酸、およびリン酸が挙げられる。アニオン性界面活性剤の種類の最も重要なメンバーは、アルキル硫酸および石鹸である。
界面活性剤分子が水中に溶解または分散されると正電荷を担持する場合、界面活性剤は、カニオン性と分類される。カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第４級アンモニウム塩は、この種類の最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正または負電荷のいずれかを担持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が考察されている（Ｒｉｅｇｅｒ，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９８８，ｐ．２８５）。
ミセルおよび他の膜状製剤
説明を簡単にするために、本項のミセルおよび他の製剤、構成物、ならびに方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらのミセルおよび他の製剤、構成物、ならびに方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）構成物は、ミセル製剤として提供することができる。「ミセル」は、分子の疎水性部分の全てが内側に向き、親水性部分を周囲の水相と接触したままにするように、両親媒性分子が球体構造で配置される、特定の種類の分子集合体として本明細書に定義される。環境が疎水性である場合、逆の配列が存在する。
経皮膜を通じた送達に好適な混合ミセル製剤は、ｉＲＮＡ構成物の水溶液、アルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸、およびミセル形成化合物を混合することによって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容可能な塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリシン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、ならびにそれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸の添加と同時またはその後に添加されても良い。混合ミセルは、実質的に任意の種類の成分混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには、強力な混合で形成される。
一方法では、ｉＲＮＡ構成物および少なくともアルカリ金属アルキル硫酸を含有する、第１のミセル組成物が調製される。次いで、第１のミセル組成物は、少なくとも３個のミセル形成化合物と混合され、混合ミセル組成物を形成する。別の方法では、ミセル組成物は、ｉＲＮＡ構成物、アルカリ金属アルキルサルフェート、およびミセル形成化合物のうちの少なくとも１つを混合し、続いて強力に混合しながら，残りのミセル形成化合物を添加することによって調製される。
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールが混合ミセル組成物に添加され、製剤を安定化し、細菌増殖から保護してもよい。あるいは、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールは、ミセル形成成分と添加されてもよい。グリセリン等の等張剤もまた、混合ミセル組成物の形成後に添加されてもよい。
噴霧としてのミセル製剤の送達のために、製剤は、エアロゾルディスペンサーに入れることができ、ディスペンサーは、噴射剤で充填される。圧力下にある噴射剤は、ディスペンサー内で液体形態である。成分の比は、水相および噴射剤相が１つになるように、すなわち１つの相が存在するように調節される。２つの相が存在する場合、例えば、定量弁によって内容物の一部を投薬する前に、ディスペンサーを震盪する必要がある。医薬品の投薬用量は、微細噴霧で定量弁から噴射される。
噴射剤は、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを含み得る。ある実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）が使用されてもよい。
必須成分の特定濃度は、比較的容易な実験によって決定することができる。口腔による吸収のために、投与量を注射または胃腸管を介した投与に対する投与量の、例えば、少なくとも２倍または３倍に増加させることが望ましい場合が多い。
粒子
説明を簡単にするために、本項の粒子、製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの粒子、製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）調製物は、粒子、例えば、微小粒子に組み込まれてもよい。微小粒子は、噴霧乾燥によって産生することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって産生されてもよい。
持続放出製剤。本明細書に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）は、制御、例えば、持続放出のために製剤化することができる。制御放出は、その放出を妨げる構造または物質内にｉＲＮＡを配置することによって、達成することができる。例えば、ｉＲＮＡは、多孔質マトリックスまたは浸食性マトリックス内に配置することができ、それらのいずれも、ある期間にわたるｉＲＮＡの放出を可能にする。
ポリマー粒子、例えば、微小粒子のポリマーは、生分解によって微小粒子からのみ放出される、細胞によって取り込まれるｉＲＮＡの持続放出リザーバとして使用することができる。したがって、本実施形態のポリマー粒子は、食作用を妨害するのに十分大きくあるべきである（例えば１０μｍを超える、または２０μｍを超える）。そのような粒子は、より小さい粒子を作製するのと同一の方法によって産生することができるが、第１および第２のエマルションの混合はあまり強力ではない。すなわち、１０μｍよりもむしろ約１００μｍの直径を有する粒子を得るために、より低い均質化速度、ボルテックス混合速度、または超音波処理設定を使用することができる。混合時間もまた変更することができる。
より大きい微小粒子は、筋肉内、皮下、皮内、静脈、もしくは腹腔内注射によって、吸入（鼻腔内もしくは肺内）を介して、経口で、または埋め込みによって送達される、懸濁液、粉末、または埋め込み可能な固体として製剤化することができる。これらの粒子は、比較的長い期間にわたる持続放出が望ましい場合、任意のｉＲＮＡの送達に有用である。分解およびその結果としての放出の速度は、ポリマー製剤によって異なる。
微小粒子は、液体懸濁媒体が粒子境界を自由に浸透およびかん流する孔、空隙、中空、欠損、または他の間質腔を含んでもよい。例えば、中空の多孔質噴霧乾燥マイクロスフェアを形成するために、有孔微細構造を使用することができる。
ｉＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）を含有するポリマー粒子は、例えば、二重エマルション技術を使用して作製することができる。第一に、ポリマーが、有機溶媒中に溶解される。ポリマーは、６５：３５、５０：５０、または７５：２５の乳酸／グリコール酸の重量比を有する、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸であってもよい。次に、水溶液中に懸濁される核酸の試料がポリマー溶液に添加され、２つの溶液が、第１のエマルションを形成するために混合される。その溶液は、ボルテックスまたは撹拌によって混合することができ、その混合物中で超音波分解することができる。核酸がニッキング、剪断、または分解の形で、最も少ない量の損傷を受ける一方で、適切なエマルションの形成を可能にする、任意の方法が考えられる。例えば、設定＃３における、１／８”のマイクロチッププローブを有するビブラセルモデルＶＣ−２５０超音波処理器によって、許容できる結果を得ることができる。
噴霧乾燥
ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）は、噴霧乾燥によって調製することができる。噴霧乾燥ｉＲＮＡは、対象に投与するか、またはさらなる製剤化に供することができる。ｉＲＮＡの医薬組成物は、分散性粉末組成物、例えば、医薬組成物を提供するのに十分な条件下で、ｉＲＮＡを含む、均質水性混合物を噴霧乾燥することによって調製することができる。噴霧乾燥のための材料はまた、薬学的に許容される賦形剤、または分散性を強化する量の生理学的に許容される水溶性タンパク質のうちの１つ以上を含むことができる。噴霧乾燥生成物は、ｉＲＮＡを含む分散性粉末であってもよい。
噴霧乾燥は、液体またはスラリー材料を乾燥粒子形態に転換するプロセスである。吸入を含む種々の投与経路のための粉末材料を提供するために、噴霧乾燥を使用することができる。例えば、Ｍ．Ｓａｃｃｈｅｔｔｉ ａｎｄ Ｍ．Ｍ．Ｖａｎ Ｏｏｒｔ ｉｎ：Ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ Ａｅｒｏｓｏｌｓ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａ．Ｊ．Ｈｉｃｋｅｙ，ｅｄ．Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋａｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６を参照されたい。
噴霧乾燥は、液滴の微細ミストを形成するために、溶液、エマルション、または懸濁液を噴霧化し、液滴を乾燥させる、各工程を含むことができる。ミストは、乾燥チャンバ（例えば容器、タンク、管、またはコイル）に放出することができ、そこで乾燥ガスと接触する。ミストは、固体または液体孔形成剤を含むことができる。溶媒および孔形成剤は、液滴から乾燥ガスへと蒸発し、液滴を固化し、同時に該固体全体にわたって孔を形成する。次いで、その固体（典型的には、粉末、粒子形態）は、乾燥ガスから分離され、回収される。
噴霧乾燥は、高度に分散された液体および十分な量の空気（例えば熱気）を一緒にし、液体液滴の蒸発および乾燥をもたらすことを含む。噴霧乾燥される調製物は、選択された噴霧乾燥器具を使用して噴霧化され得る任意の溶液、粗懸濁液、スラリー、コロイド分散液、またはペーストであってもよい。典型的には、該供給物は、溶媒を蒸発し、乾燥生成物を回収器に運搬する、温かい濾過空気流中に噴霧される。次いで、消費された空気は、溶媒と共に排出される。所望の生成物を提供するために、いくつかの異なる種類の器具が使用されてもよい。例えば、Ｂｕｃｈｉ Ｌｔｄ．またはＮｉｒｏ Ｃｏｒｐ．によって製造される市販の噴霧乾燥機は、所望のサイズの粒子を効果的に産生することができる。
噴霧乾燥粉末粒子は、ほぼ球状の形状であり、サイズがほぼ均一であり、多くの場合、中空であってもよい。組み込まれた薬剤および噴霧乾燥条件に応じて、形状にはある程度の不規則性があり得る。多くの場合、噴霧乾燥マイクロスフェアの分散安定性は、それらの産生において膨張剤（または発泡剤）が使用される場合、より有効であるように思われる。特定の実施形態は、分散相または連続相（他方の相は、本質的に水性である）として膨張剤を有するエマルションを含んでもよい。膨張剤は、例えば、５，０００〜１５，０００ｐｓｉの圧力で、市販の微小流動化装置を使用して、界面活性剤溶液で分散されてもよい。本プロセスは、典型的には、水性連続相中に分散される水非混和性発泡剤のサブミクロン液滴を含む、組み込まれた界面活性剤によって安定化され得るエマルションを形成する。この技術および他の技術を使用したそのような分散の形成は、一般的であり、当業者に一般的かつ既知である。発泡剤は、噴霧乾燥プロセス中に蒸発し、概して、中空の多孔質の空気力学的に軽いマイクロスフェアを残す、フッ素化化合物（例えばペルフルオロヘキサン、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデカリン、ペルフルオロブチルエタン）であってもよい。以下により詳細に考察されるように、他の好適な発泡剤としては、クロロホルム、フレオン、および炭化水素が挙げられる。窒素ガスおよび二酸化炭素もまた、好適な発泡剤として考えられる。
有孔微細構造は、上記の発泡剤を使用して形成されてもよいが、場合によっては、発泡剤は必要ではなく、薬剤および界面活性剤の水分散液が直接噴霧乾燥されることを理解されたい。そのような場合、製剤は、概して、中空の比較的多孔質の微小粒子の形成をもたらすプロセス条件（例えば昇温）に適し得る。さらに、薬剤は、そのような技術での使用に特に好適となるような特別な物理化学的特性（例えば高結晶性、融解温度の上昇、表面活性等）を有し得る。
有孔微細構造は、随意的に、１つ以上の界面活性剤を伴うか、またはそれを含んでもよい。さらに、混和性界面活性剤は、随意的に、懸濁媒体液相と組み合わされてもよい。界面活性剤の使用はさらに、分散安定性を増加させる、製剤化手順を単純化する、または投与時のバイオアベイラビリティを増加させ得ることを、当業者は理解するであろう。当然のことながら、液相中の１つ以上の界面活性剤および有孔微細構造に伴う１つ以上の界面活性剤を含む、界面活性剤の組み合わせは、本発明の範囲内であると考えられる。「伴う、または含む」とは、構造マトリックスまたは有孔微細構造が、界面活性剤を組み込む、吸収する、界面活性剤で被覆される、または界面活性剤によって形成され得ることを意味する。
使用に好適な界面活性剤としては、構造マトリックスと懸濁媒体との間の界面において層を形成することによって、安定化された呼吸器用分散液の形成および維持を補助する任意の化合物または組成物が挙げられる。界面活性剤は、単一化合物、またはコサーファクタントの場合のように、化合物の任意の組み合わせを含んでもよい。特に特定の界面活性剤は、噴射剤中に実質的に不溶性であり、非フッ素化であり、飽和および不飽和脂質、非イオン性洗浄剤、非イオン性ブロックコポリマー、イオン性界面活性剤、ならびにそのような薬剤の組み合わせから成る群より選択される。上述の界面活性剤に加えて、好適な（すなわち、生体適合性の）フッ素化界面活性剤は、本明細書の教示に適合しており、所望の安定化された調製物を提供するために使用され得ることが強調され得る。
構造マトリックスを形成するために、天然または合成源の両方からのリン脂質を含む脂質が、異なる濃度で使用されてもよい。概して、適合する脂質は、約４０℃を超えるゲルから液晶相への遷移を有する脂質を含む。ある実施形態では、組み込まれた脂質は、比較的長い鎖（すなわち、Ｃ６〜Ｃ２２）飽和脂質であり、リン脂質を含んでもよい。開示された安定化された調製物に有用な、例示的なリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジル−コリン、ジステロイルホスファチジルコリン、短鎖ホスファチジルコリンｓ、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、糖脂質、ガングリオシドＧＭ１、スフィンゴミエリン、ホスファチジン酸、カルジオリピン；ポリエチレングリコール、キチン、ヒアルロン酸、またはポリビニルピロリドン等のポリマー鎖を有する脂質；スルホン化単糖、二糖、および多糖を有する脂質；パルミチン酸、ステアリン酸、およびオレイン酸等の脂肪酸；コレステロール、コレステロールエステル、およびコレステロールヘミコハク酸を含む。それらの優れた生体適合性の特徴によって、リン脂質、ならびにリン脂質およびポロキサマーの組み合わせは、本明細書に開示する安定化された分散液のでの使用に特に好適である。
適合する非イオン性洗浄剤は、三オレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎｓ（登録商標）８５）、セスキオレイン酸ソルビタン、ソルビタンモノオレアート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート、およびポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレアートを含む、ソルビタンエステル、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル、グリセロールエステル、ならびにショ糖エステルを含む。他の好適な非イオン性洗浄剤は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ'ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ（ＭｃＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．）を使用して、容易に同定することができる。特定のブロックコポリマーとしては、ポロキサマー１８８（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ６８）、ポロキサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ．ＲＴＭ．Ｆ−１２７）、ならびにポロキサマー３３８を含む、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのジブロックおよびトリブロックコポリマーが挙げられる。スルホコハク酸ナトリウム等のイオン性界面活性剤および脂肪酸石鹸もまた、利用されてもよい。ある実施形態では、微細構造は、オレイン酸またはそのアルカリ塩を含んでもよい。
上述の界面活性剤に加えて、特に、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）の送達の場合、カチオン性界面活性剤または脂質が使用されてもよい。好適なカチオン性脂質の例としては、ＤＯＴＭＡ、Ｎ−［−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム；ＤＯＴＡＰ，１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン；およびＤＯＴＢ，１，２−ジオレイル−３−（４'−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロールが挙げられる。ポリリシン等のポリカチオン性アミノ酸およびポリアルギニンもまた考えられる。
噴霧プロセスのために、回転噴霧化、圧力噴霧化、および二液噴霧化等の噴霧方法を使用することができる。これらのプロセスに使用されるデバイスの例としては、Ｙａｍａｔｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．製造の「Ｐａｒｕｂｉｓｕ［音声レンダリング］Ｍｉｎｉ−Ｓｐｒａｙ ＧＡ−３２」および「Ｐａｒｕｂｉｓｕ Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ ＤＬ−４１」が挙げられるか、または回転ディスクアトマイザーを使用した噴霧方法のために、Ｏｋａｗａｒａ Ｋａｋｏｋｉ Ｃｏ．製造の「Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ ＣＬ−８」、「Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ Ｌ−８」、「Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ ＦＬ−１２」、「Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ ＦＬ−１６」、もしくは「Ｓｐｒａｙ Ｄｒｉｅｒ ＦＬ−２０」を使用することができる。
噴霧材料を乾燥させるために使用されるガスに関して、特定の制限は設けられていないが、空気、窒素ガス、または不活性ガスを使用することが勧められる。噴霧材料を乾燥させるために使用されるガスの入口の温度は、噴霧材料の熱不活性化を引き起こさない温度である。温度範囲は、約５０℃〜約２００℃、例えば、約５０℃〜１００℃の間で変化し得る。噴霧材料を乾燥させるために使用される出口ガスの温度は、約０℃〜約１５０℃、例えば、０℃〜９０℃、および例えば、０℃〜６０℃の間で変化し得る。
噴霧乾燥は、呼吸に適した粒径、低水分含量、および即座のエアロゾル化を可能にする流量特性を有する均質構造の実質的に非晶質の粉末をもたらす条件下で行われる。場合によっては、得られた粉末の粒径は、質量の約９８％超が、約１０μｍ以下の直径を有する粒子中にあり、質量の約９０％が５μｍ未満の直径を有する粒子中にあるような粒径である。あるいは、質量の約９５％は、１０μｍ未満の直径を有する粒子を有し、質量の約８０％が５μｍ未満の直径を有する粒子である。
ｉＲＮＡ調製物を含む分散性医薬ベースの乾燥粉末は、随意的に、経呼吸器および経肺投与に好適な医薬担体または賦形剤と組み合わされてもよい。そのような担体は、患者に送達されている粉末中のｉＲＮＡ濃度を低減するのが所望である場合、単に増量剤としての機能を果たし得るが、ｉＲＮＡ構成物の安定性を強化し、粉末分散装置内の粉末の分散性を改善し、より効率的かつ再現可能なｉＲＮＡの送達を提供し、製造および粉末充填を促進するための流動性および一貫性等のｉＲＮＡの取り扱い特性を改善する働きもし得る。
そのような担体材料は、噴霧乾燥の前に薬物と組み合わされてもよく、すなわち、担体材料を精製されたバルク溶液に添加することによって、組み合わされてもよい。そのようにして、担体粒子は、薬物粒子と同時に形成され、均質粉末を生成する。あるいは、担体は、乾燥粉末形態で別に調製され、ブレンドによって乾燥粉末薬物と組み合わされてもよい。粉末担体は、通常、結晶性（吸水を回避するために）であるが、場合によっては、非晶質、または結晶性および非晶質の混合物であり得る。担体粒子の粒径は、薬物粉末の流動性を改善するように選択されてもよく、典型的には、２５μｍ〜１００μｍの範囲である。担体材料は、上記の範囲の粒径を有する結晶性ラクトースであってもよい。
上記の方法のいずれかによって調製される粉末は、それに続く使用のために、従来の方法で噴霧乾燥機から回収される。製薬としての使用および他の目的のために、多くの場合、遮蔽または他の従来の技術によって形成された可能性がある任意の凝集体を破壊することが望ましい。製薬学的用途のために、乾燥粉末製剤は、通常、測定され単回投与に分けられ、単回投与は、パッケージに密閉される。そのようなパッケージは、以下に詳細に記載するような乾燥粉末吸入器中の分散に特に有用である。あるいは、粉末は、複数回投与容器にパッケージングされてもよい。
疎水性薬物および他の薬物ならびに成分を噴霧乾燥させるための方法は、米国特許第５，０００，８８８号、同第５，０２６，５５０号、同第４，６７０，４１９号、同第４，５４０，６０２号、および同第４，４８６，４３５号の各明細書に記載される。Ｂｌｏｃｈ ａｎｄ Ｓｐｅｉｓｏｎ（１９８３）Ｐｈａｒｍ．Ａｃｔａ Ｈｅｌｖ ５８：１４−２２は、ジオキサン−水および２−エトキシエタノール−水の共沸溶媒中のヒドロクロロチアジドおよびクロルタリドン（親油性薬物）ならびに親水性補助剤（ペンタエリトリトール）の噴霧乾燥を教示する。多くの日本特許出願の要約は、親水性−疎水性生成物の組み合わせの噴霧乾燥に関し、特開平０８−００６７６６号、特開平０７−２４２５６８号、特開平０７−１０１８８４号、特開平０７−１０１８８３号、特開平０７−１０１８９８２号、特開平０７−１０１８８１号、および特開平０４−０３６２３３号の各明細書が挙げられる。親水性−疎水性生成物の組み合わせの噴霧乾燥に関する他の外国の特許出願としては、仏国特許出願公開第２５９４６９３号、独国特許出願公開第２２０９４７７号の各明細書、および国際公開第８８／０７８７０号パンフレットが挙げられる。
凍結乾燥
ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）調製物は、凍結乾燥によって作製することができる。凍結乾燥は、水が凍結した後に組成物から昇華する、フリーズドライプロセスである。凍結乾燥プロセスに関連する特定の利点は、水溶液中で比較的不安定な生物学的製剤および医薬品を、昇温なしで乾燥させ（それによって、熱の悪影響を排除する）、次いで、安定性に関する問題がほとんどない乾燥状態で保存することができるという点である。本発明に関して、そのような技術は、生理学的活性を低下させることなく、核酸の有孔微細構造への組み込みに特に適合する。凍結乾燥した粒子を提供するための方法は、当業者に既知であり、本明細書の教示に従った分散適合性の微細構造を提供するために、過度の実験は明らかに必要ないであろう。したがって、所望の多孔性およびサイズを有する微細構造を提供するために、凍結乾燥プロセスが使用され得る限りにおいて、凍結乾燥プロセスは、本明細書の教示に適合し、本発明の範囲内であると明確に考えられる。
遺伝子
一態様では、本発明は、本発明のモジュラー構成物の投与が有効であり得る疾病のリスクがあるか、またはその疾病に罹患した対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療される疾病に応じて決まる。
ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、成長因子もしくは成長因子受容体遺伝子、キナーゼ、例えば、タンパク質チロシン、セリンもしくはトレオニンキナーゼ遺伝子、アダプタータンパク質遺伝子、Ｇタンパク質スーパーファミリー分子をコードする遺伝子、または転写因子をコードする遺伝子をサイレンシングする。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＰＤＧＦβ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＤＧＦβ発現を特徴とする疾患、例えば、精巣癌および肺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｂ−Ｂ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、Ｓｒｃ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳｒｃ発現を特徴とする疾患、例えば、結腸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＣＲＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＣＲＫ発現を特徴とする疾患、例えば、結腸癌および肺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＧＲＢ２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＧＲＢ２発現を特徴とする疾患、例えば、扁平上皮癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＲＡＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする疾患、例えば、膵臓癌、結腸癌、および肺癌、ならびに慢性白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＭＥＫＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＥＫＫ発現を特徴とする疾患、例えば、扁平上皮癌、メラノーマ、もしくは白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＪＮＫ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＮＫ発現を特徴とする疾患、例えば、膵臓癌もしくは乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＲＡＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＦ発現を特徴とする疾患、例えば、肺癌もしくは白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、Ｅｒｋ１／２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥｒｋ１／２発現を特徴とする疾患、例えば、肺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＣＮＡ発現を特徴とする疾患、例えば、肺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＭＹＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＹＢ発現を特徴とする疾患、例えば、結腸癌もしくは慢性骨髄性白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｃ−ＭＹＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ−ＭＹＣ発現を特徴とする疾患、例えば、バーキットリンパ腫もしくは神経芽腫を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＪＵＮ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＪＵＮ発現を特徴とする疾患、例えば、卵巣癌、前立腺癌、もしくは乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＦＯＳ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦＯＳ発現を特徴とする疾患、例えば、皮膚癌もしくは前立腺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＢＣＬ−２遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＬ−２発現を特徴とする疾患、例えば、肺癌もしくは前立腺癌または非ホジキンリンパ腫を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、サイクリンＤ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＤ発現を特徴とする疾患、例えば、食道癌および結腸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＶＥＧＦ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＶＥＧＦ発現を特徴とする疾患、例えば、食道癌および結腸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＥＧＦＲ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＧＦＲ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、サイクリンＡ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＡ発現を特徴とする疾患、例えば、肺癌および子宮頸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、サイクリンＥ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないサイクリンＥ発現を特徴とする疾患、例えば、肺癌および乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＷＮＴ−１遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＷＮＴ−１発現を特徴とする疾患、例えば、基底細胞癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、β−カテニン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないβ−カテニン発現を特徴とする疾患、例えば、腺癌もしくは肝細胞癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｃ−ＭＥＴ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないｃ−ＭＥＴ発現を特徴とする疾患、例えば、肝細胞癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＰＫＣ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＫＣ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＮＦＫＢ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＮＦＫＢ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＳＴＡＴ３遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＳＴＡＴ３発現を特徴とする疾患、例えば、前立腺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、スルビビン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないスルビビン発現を特徴とする疾患、例えば、子宮頸癌もしくは膵臓癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＨｅｒ２／Ｎｅｕ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、トポイソメラーゼＩ遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩ発現を特徴とする疾患、例えば、卵巣癌および結腸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないトポイソメラーゼＩＩα発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌および結腸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｐ７３遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ７３発現を特徴とする疾患、例えば、結腸直腸腺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）発現を特徴とする疾患、例えば、肝臓癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ２７（ＫＩＰ１）発現を特徴とする疾患、例えば、肝臓癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＰＭ１Ｄ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＲＡＳ遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＲＡＳ発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、カベオリンＩ遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないカベオリンＩ発現を特徴とする疾患、例えば、食道扁平上皮癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＭＩＢ Ｉ遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＩＢ Ｉ発現を特徴とする疾患、例えば、男性乳癌（ＭＢＣ）を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＭＴＡＩ遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＴＡＩ発現を特徴とする疾患、例えば、卵巣癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、Ｍ６８遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭ６８発現を特徴とする疾患、例えば、食道、胃、結腸、および直腸のヒト腺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
特定の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、腫瘍抑制遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、化学療法薬と組み合わせて、アポトーシス活性を促進する方法として使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐ５３発現を特徴とする疾患、例えば、胆嚢癌、膵臓癌、および肺癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｐ５３ファミリーメンバーＤＮ−ｐ６３の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＤＮ−ｐ６３発現を特徴とする疾患、例えば、扁平上皮癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ｐＲｂ腫瘍抑制遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないｐＲｂ発現を特徴とする疾患、例えば、口腔扁平上皮癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＡＰＣ１腫瘍抑制遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＡＰＣ１発現を特徴とする疾患、例えば、結腸癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＢＲＣＡ１腫瘍抑制遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＲＣＡ１発現を特徴とする疾患、例えば、乳癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＰＴＥＮ腫瘍抑制遺伝子の突然変異をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＴＥＮ発現を特徴とする疾患、例えば、過誤腫、神経膠腫、ならびに前立腺癌および子宮内膜癌を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＭＬＬ融合遺伝子、例えば、ＭＬＬ−ＡＦ９をサイレンシングし、したがって、望ましくないＭＬＬ融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、急性白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＢＣＲ／ＡＢＬ融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、急性および慢性白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＴＥＬ／ＡＭＬ１融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、小児急性白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＥＷＳ／ＦＬＩ１融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、ユーイング肉腫を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＴＬＳ／ＦＵＳ１融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、粘液性脂肪肉腫を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＰＡＸ３／ＦＫＨＲ融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、粘液性脂肪肉腫を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＡＭＬ１／ＥＴＯ融合遺伝子発現を特徴とする疾患、例えば、急性白血病を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
疾病
血管形成
別の態様では、本発明は、血管形成阻害が有効であり得る疾病または疾患、例えば、癌のリスクがあるか、またはそれに罹患した対象、例えば、ヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療される血管形成関連遺伝子の種類に応じて決まる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、α ｖ−インテグリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないα ｖ−インテグリンを特徴とする疾患、例えば、脳腫瘍もしくは上皮性起源の腫瘍を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、Ｆｌｔ−１受容体遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないＦｌｔ−１受容体を特徴とする疾患、例えば、癌および関節リウマチを有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、チューブリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないチューブリンを特徴とする疾患、例えば、癌および網膜新生血管を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、チューブリン遺伝子をサイレンシングし、したがって、望ましくないチューブリンを特徴とする疾患、例えば、癌および網膜新生血管を有するか、またはそのリスクがある対象を治療するために使用することができる。
ウイルス性疾患
さらに別の態様では、本発明は、ウイルスに感染した、またはウイルス感染に関連する疾患もしくは疾病のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療されるウイルス性疾患の種類に応じて決まる。いくつかの実施形態では、核酸は、ウイルス遺伝子を標的化してもよい。他の実施形態では、核酸は、宿主遺伝子を標的化してもよい。
したがって、本発明は、ヒトパピローマウイル（ＨＰＶ）に感染した、またはＨＰＶによって媒介される疾患、例えば、子宮頸癌のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。ＨＰＶは、子宮頸癌の９５％に関連があり、したがって、抗ウイルス療法は、これらの癌およびウイルス感染の他の症状を治療するための魅力的な方法である。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、ＨＰＶ遺伝子は、Ｅ２、Ｅ６、またはＥ７の群のうちの１つである。いくつかの実施形態では、ＨＰＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した、またはＨＩＶによって媒介される疾患、例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、ＨＩＶ遺伝子は、ＣＣＲ５、Ｇａｇ、またはＲｅｖである。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、遺伝子は、ＣＤ４またはＴｓｇ１０１である。
本発明はまた、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した、またはＨＢＶによって媒介される疾患、例えば、肝硬変および肝細胞癌のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、標的化ＨＢＶ遺伝子は、ＨＢＶコアタンパク質の尾部領域、プレ−ｃｒｅｇｉｏｕｓ（プレｃ）領域、またはｃｒｅｇｉｏｕｓ（ｃ）領域の群のうち１つをコードする。別の実施形態では、標的化ＨＢＶ−ＲＮＡ配列は、ポリ（Ａ）尾部から成る。特定の実施形態では、遺伝子は、ＣＤ４またはＴｓｇ１０１である。特定の実施形態では、ＨＢＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）に感染した、またはＨＡＶによって媒介される疾患のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＡＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した、またはＨＣＶによって媒介される疾患、例えば、肝硬変のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＣＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、ＨＣＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、もしくはＨ型肝炎を含む肝炎ウイルス株の群のいずれかに感染した、またはこれらの肝炎型のいずれかによって媒介される疾患のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨ型肝炎遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、またはＨ型肝炎複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した、またはＲＳＶによって媒介される疾患、例えば、乳児における下部呼吸器感染症および小児喘息、例えば、高齢者における肺炎および他の合併症のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、標的化ＨＢＶ遺伝子は、遺伝子Ｎ、Ｌ、またはＰの群のうちの１つをコードする。いくつかの実施形態では、ＲＳＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に感染した、またはＨＳＶによって媒介される疾患、例えば、性器ヘルペスおよび単純疱疹、ならびに主に免疫障害を持つ患者における命に関わる疾病もしくは視覚障害をもたらす疾病のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、標的化ＨＳＶ遺伝子は、ＤＮＡポリメラーゼまたはヘリカーゼ−プライマーゼをコードする。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ヘルペスサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染した、またはＣＭＶによって媒介される疾患、例えば、免疫障害を持つ患者における先天性ウイルス感染および合併症のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＣＭＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ヘルペスエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）に感染した、またはＥＢＶによって媒介される疾患、例えば、ＮＫ／Ｔ−細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、およびホジキン病のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ヒトヘルペスウイルス８型とも呼ばれる、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）に感染した、またはＫＳＨＶによって媒介される疾患、例えば、カポジ肉腫、多中心性キャッスルマン病、およびＡＩＤＳ関連原発性滲出液のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＫＳＨＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＫＳＨＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ＪＣウイルス（ＪＣＶ）、またはこのウイルスに関連した疾病もしくは疾患、例えば、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）に感染した患者を治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、ＪＣＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＪＣＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ミクソウイルスに感染した、またはミクソウイルスによって媒介される疾患、例えば、インフルエンザのリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ミクソウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ミクソウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ライノウイルスに感染した、またはライノウイルスによって媒介される疾患、例えば、感冒のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ライノウイルス遺伝子の発現が低減される。特定の実施形態では、ライノウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、コロナウイルスに感染した、またはコロナウイルスによって媒介される疾患、例えば、感冒のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、コロナウイルス遺伝子の発現が低減される。特定の実施形態では、コロナウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、フラビウイルス・ウエストナイルに感染した、またはウエストナイルウイルスによって媒介される疾患のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルス遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、ウエストナイルウイルス遺伝子は、Ｅ、ＮＳ３、またはＮＳ５を含む群のうちの１つである。いくつかの実施形態では、ウエストナイルウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、セントルイス脳炎フラビウイルスに感染した、またはこのウイルスに関連した疾病もしくは疾患、例えば、ウイルス性出血熱もしくは神経疾病のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、セントルイス脳炎遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、セントルイス脳炎ウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ダニ媒介脳炎フラビウイルスに感染した、またはダニ媒介脳炎ウイルスによって媒介される疾患、例えば、ウイルス性出血熱および神経疾病のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ダニ媒介脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ダニ媒介脳炎ウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、一般的にウイルス性出血熱および神経疾病をもたらす、マレーバレー脳炎フラビウイルスに感染した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、マレーバレー脳炎ウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、マレーバレー脳炎ウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、デング熱フラビウイルス、またはこのウイルスに関連した疾病もしくは疾患、例えば、デング出血熱に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、デング熱ウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、デング熱ウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に感染した、またはＳＶ４０によって媒介される疾患、例えば、腫瘍形成のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＳＶ４０複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、またはこのウイルスに関連した疾病もしくは疾患、例えば、白血病および脊髄症に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ＨＴＬＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、ＨＴＬＶ１遺伝子は、Ｔａｘ転写活性化因子である。いくつかの実施形態では、ＨＴＬＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）に感染した、またはＭｏ−ＭｕＬＶによって媒介される疾患、例えば、Ｔ−細胞白血病のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、Ｍｏ−ＭｕＬＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、Ｍｏ−ＭｕＬＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に感染した、またはＥＭＣＶによって媒介される疾患、例えば、心筋炎のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。ＥＭＣＶは、マウスおよびブタにおける心筋炎をもたらし、ヒト心筋細胞に感染することができる。したがって、このウイルスは、異種移植を受ける患者に対する懸念事項である。いくつかの実施形態では、ＥＭＣＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＥＭＣＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、麻疹ウイルス（ＭＶ）に感染した、またはＭＶによって媒介される疾患、例えば、麻疹のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ＭＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＭＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）に感染した、またはＶＺＶによって媒介される疾患、例えば、水疱瘡もしくは帯状疱疹（帯状ヘルペスとも呼ばれる）のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ＶＺＶ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ＶＺＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、アデノウイルスに感染した、またはアデノウイルスによって媒介される疾患、例えば、呼吸器感染症のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、アデノウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、アデノウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明は、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に感染した、またはＹＦＶによって媒介される疾患、例えば、呼吸器感染症のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ＹＦＶ遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、遺伝子は、Ｅ、ＮＳ２Ａ、またはＮＳ３遺伝子を含む群のうちの１つであり得。いくつかの実施形態では、ＹＦＶ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ポリオウイルスに感染した、またはポリオウイルスによって媒介される疾患、例えば、ポリオのリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポリオウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ポリオウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明の方法はまた、ポックスウイルスに感染した、またはポックスウイルスによって媒介される疾患、例えば、天然痘のリスクがあるか、もしくはそれに罹患した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ポックスウイルス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ポックスウイルス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
他の病原体
別の態様では、本発明は、病原体、例えば、細菌性、アメーバ性、寄生性、または菌類病原体に感染した対象を治療する方法を特徴とする。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療される病原体の種類に応じて決まる。いくつかの実施形態では、核酸は、病原遺伝子を標的化してもよい。他の実施形態では、核酸は、宿主遺伝子を標的化してもよい。
標的遺伝子は、成長、細胞壁合成、タンパク質合成、転写、エネルギー代謝、例えば、クレブス回路、または毒素産生に関与するものであってもよい。
したがって、マラリアを引き起こすマラリア原虫に感染した患者を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、マラリア原虫遺伝子の発現が低減される。別の実施形態では、遺伝子は、頂端膜抗原１（ＡＭＡ１）である。いくつかの実施形態では、マラリア原虫複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、マイコバクテリウム・ウルセランス、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、ブルーリ潰瘍に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランス遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、マイコバクテリウム・ウルセランス複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ヒト型結核菌、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、結核に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ヒト型結核菌遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ヒト型結核菌複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、ハンセン菌、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、ハンセン病に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、ハンセン菌遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、ハンセン菌複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、黄色ブドウ球菌、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、皮膚および粘膜感染症に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、黄色ブドウ球菌複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、肺炎連鎖球菌、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、肺炎もしくは小児下部呼吸器感染症に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、肺炎連鎖球菌複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、化膿連鎖球菌、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、連鎖球菌性咽頭炎もしくは猩紅熱に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、化膿連鎖球菌遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、化膿連鎖球菌複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、クラミジア・ニューモニエ、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、肺炎もしくは小児下部呼吸器感染症に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、クラミジア・ニューモニエ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、クラミジア・ニューモニエ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
本発明はまた、マイコプラズマ・ニューモニエ、またはこの病原体に関連する疾病もしくは疾患、例えば、肺炎もしくは小児下部呼吸器感染症に感染した患者を治療するための方法を含む。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・ニューモニエ遺伝子の発現が低減される。いくつかの実施形態では、マイコプラズマ・ニューモニエ複製に必要なヒト遺伝子の発現が低減される。
免疫障害
一態様では、本発明は、望ましくない免疫反応を特徴とする疾病もしくは疾患、例えば、炎症性疾病もしくは疾患、または自己免疫疾病もしくは疾患のリスクがあるか、またはそれに罹患した対象、例えば、ヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療される免疫障害の種類に応じて決まる。
いくつかの実施形態では、疾病または疾患は、虚血または再かん流傷害、例えば、急性心筋梗塞、不安定狭心症、心肺バイパス、外科的介入、例えば、血管形成、例えば、経皮経管冠動脈形成、移植器官もしくは組織、例えば、移植心臓もしくは維管束組織への反応、または血栓溶解に関連した虚血もしくは再かん流傷害である。
いくつかの実施形態では、疾病または疾患は、再狭窄、例えば、外科的介入、例えば、血管形成、例えば、経皮経管冠動脈形成に関連した再狭窄である。
特定の実施形態では、疾病または疾患は、炎症性腸疾患、例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎である。
特定の実施形態では、疾病または疾患は、感染症または損傷に関連した炎症である。
特定の実施形態では、疾病または疾患は、喘息、ループス、多発性硬化症、糖尿病、例えば、２型糖尿病、関節炎、例えば、リウマチまたは乾癬である。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、インテグリンまたはそのコリガンド、例えば、ＶＬＡ４、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭをサイレンシングする。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、セレクチンまたはそのコリガンド、例えば、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン（ＥＬＡＭ）、Ｉ−セレクチン、Ｐ−セレクチン糖タンパク質−１（ＰＳＧＬ−１）をサイレンシングする。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、補体系の構成成分、例えば、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ３ａＲ、Ｃ５ａＲ、Ｃ３転換酵素、Ｃ５転換酵素をサイレンシングする。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ケモカインまたはその受容体、例えば、ＴＮＦＩ、ＴＮＦＪ、ＩＬ−１Ｉ、ＩＬ−１Ｊ、ＩＬ −２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦＲＩ、ＴＮＦＲＩＩ、ＩｇＥ、ＳＣＹＡ１１、ＣＣＲ３をサイレンシングする。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＧＣＳＦ、Ｇｒｏ１、Ｇｒｏ２、Ｇｒｏ３、ＰＦ４、ＭＩＧ、プロ−血小板塩基性タンパク質（ＰＰＢＰ）、ＭＩＰ−１Ｉ、ＭＩＰ−１Ｊ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＣＭＢＫＲ１、ＣＭＢＫＲ２、ＣＭＢＫＲ３、ＣＭＢＫＲ５、ＡＩＦ−１、Ｉ−３０９をサイレンシングする。
疼痛
一態様では、本発明は、急性疼痛または慢性疼痛のリスクがあるか、またはそれに罹患した対象、例えば、ヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療される疼痛の種類に応じて決まる。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、イオンチャネルの構成成分をサイレンシングする。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、神経伝達物質受容体またはリガンドをサイレンシングする。
一態様では、本発明は、神経疾病または疾患のリスクがあるか、またはそれに罹患した対象、例えば、ヒトを治療する方法を特徴とする。この方法は、
ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）を提供することであって、ｉＲＮＡは、神経疾病または疾患を媒介する遺伝子と相同であり、かつ例えば開裂によって、遺伝子をサイレンシングすることができ、そのｉＲＮＡ剤を対象に投与することと、
それによって、その対象を治療することと、
を含む。
神経障害
特定の実施形態では、疾病または疾患は、アルツハイマー病またはパーキンソン病を含む神経障害である。この方法は、本発明のモジュラー構成物をそれを必要としている対象に投与し、それによってその対象を治療することを含む。投与される核酸は、治療される神経障害の種類に応じて決まる。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、アミロイドファミリー遺伝子、例えば、ＡＰＰ、プレセニリン遺伝子、例えば、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２、またはＩ−シヌクレインをサイレンシングする。
いくつかの実施形態では、疾病または疾患は、神経変性トリヌクレオチド反復障害、例えば、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、または脊髄小脳失調、例えば、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３（マシャド・ジョセフ病）、ＳＣＡ７、もしくはＳＣＡ８である。
特定の他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、ＨＤ、ＤＲＰＬＡ、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＭＪＤ１、ＣＡＣＮＬ１Ａ４、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８をサイレンシングする。
ヘテロ接合性の消失
ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、ＬＯＨの領域内の配列、例えば、遺伝子の半接合をもたらし得る。これは、正常細胞と病態の細胞、例えば、癌細胞との間の有意な遺伝的な差をもたらし得、正常細胞と病態の細胞、例えば、癌細胞との間の有益な差を提供する。遺伝子または他の配列は、正倍数体細胞においてヘテロ接合であるが、ＬＯＨを有する細胞においては半接合であるため、この差が生じ得る。ＬＯＨの領域はしばしば、その遺伝子の消失が望ましくない増殖を促進する遺伝子、例えば、腫瘍抑制遺伝子、および例えば、他の遺伝子、場合によっては、正常な機能、例えば、成長に必須の遺伝子を含む他の配列を含む。本発明の方法は、部分的に、本発明のｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）による、必須遺伝子の１つの対立遺伝子の特異的な開裂またはサイレンシングに依存する。ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、それが、ＬＯＨを有する細胞内に見られる必須遺伝子の１つの対立遺伝子を標的化するが、ＬＯＨを示さない細胞内に存在する他の対立遺伝子をサイレンシングしないように選択される。本質的に、ｉＲＮＡ剤は、２つの対立遺伝子を区別し、選択された対立遺伝子を選択的にサイレンシングする。本質的に、多型、例えば、ＬＯＨによって影響を受ける必須遺伝子のＳＮＰは、ＬＯＨを有する細胞、例えば、ＬＯＨを有する癌細胞を特徴とする疾患に対する標的として使用される。
当業者は、腫瘍抑制遺伝子に近接し、かつ腫瘍抑制遺伝子を含むＬＯＨ領域内にある必須遺伝子を同定することができる。ヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットをコードする遺伝子であるＰＯＬＲ２Ａ、すなわち腫瘍抑制遺伝子ｐ５３に近接して位置する遺伝子は、そのような遺伝子である。それはしばしば、癌細胞におけるＬＯＨの領域内に生じる。ＬＯＨ領域内に生じ、かつ多くの癌細胞型において欠けている他の遺伝子としては、複製タンパク質Ａ７０−ｋＤａサブユニット、複製タンパク質Ａ３２−ｋＤ、リボヌクレオチドレダクターゼ、チミジル酸シンターゼ、ＴＡＴＡ関連因子２Ｈ、リボソームタンパク質Ｓ１４、真核開始因子５Ａ、アラニルｔＲＮＡシンテターゼ、システイニルｔＲＮＡシンテターゼ、ＮａＫ ＡＴＰａｓｅ、α−１サブユニット、およびトランスフェリン受容体を含む群が挙げられる。
したがって、本発明は、ＬＯＨを特徴とする疾患、例えば、癌を治療する方法を特徴とする。この方法は随意的に、ＬＯＨの領域内の遺伝子の対立遺伝子の遺伝子型を決定し、正常細胞内の遺伝子の両方の対立遺伝子の遺伝子型を決定し、ＬＯＨ細胞内に見られる対立遺伝子を選択的に開裂またはサイレンシングし、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）を提供し、対象にｉＲＮＡを投与し、それによって該疾患を治療する、各工程を有してなる。
本発明はまた、本明細書に開示するｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）、例えば、多型遺伝子の１つの対立遺伝子を選択的にサイレンシングする、例えば、開裂することができる、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）を含む。
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）で、２つ以上の遺伝子を開裂またはサイレンシングする方法を提供する。これらの実施形態では、ｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、２つ以上の遺伝子に見られる配列に十分な相同性を有するように選択される。例えば、配列ＡＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＴは、マウスラミンＢ１、ラミンＢ２、ケラチン複合体２−遺伝子１、および等ミンＡ／Ｃの間で保存される。したがって、この配列に標的化されるｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）は、遺伝子の集合体全体を効果的にサイレンシングし得る。
本発明はまた、２つ以上の遺伝子をサイレンシングすることができる、本明細書に開示するｉＲＮＡ剤（例えば本明細書に記載するモジュラー構成物中のｉＲＮＡ剤）を含む。
送達経路
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｉＲＮＡを含む構成物は、種々の経路で対象に送達することができる。例示的な経路としては、静脈、局所、直腸、経肛門、膣内、経鼻、経肺、眼内が挙げられる。
本発明のｉＲＮＡ分子は、投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。そのような組成物は、典型的には、１つ以上の種のｉＲＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌薬、等張剤、ならびに吸収遅延剤等を含むことを意図する。薬学的活性物質のためのそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の従来の媒質または薬剤が活性化合物に適合する場合を除いて、組成物中のその使用が企図されている。補助活性化合物もまた、該組成物中に組み込むことができる。
本発明の医薬組成物は、局所または全身治療が望ましいかに応じて、かつ治療される領域に応じて、多くの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼内、膣内、直腸、鼻腔内、経皮）、経口、または非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内注射、または髄腔内もしくは脳室内投与が挙げられる。
投与経路および部位は、標的化を強化するように選択されてもよい。例えば、筋細胞を標的化するために、対象となる筋肉への筋肉内注射が、当然のふさわしい選択であり得る。肺細胞は、エアロゾルの形態でｉＲＮＡを投与することによって標的化されてもよい。血管内皮細胞は、ｉＲＮＡでバルーンカテーテルを被覆し、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的化され得る。
局所投与のための製剤としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、噴霧、液体、および粉末が含まれ得る。従来の医薬担体、水性基剤、粉末状基剤、または油性塩基、増粘剤等が必要または所望であり得る。被覆されたコンドーム、手袋等もまた有用であり得る。
経口投与のための組成物としては、粉末もしくは顆粒、水中の懸濁液もしくは溶液シロップ、エリキシル剤、非水性溶媒、タブレット、カプセル、ドロップ、またはトローチが挙げられる。タブレットの場合、使用され得る担体としては、ラクトース、クエン酸ナトリウム、およびリン酸塩が挙げられる。デンプン等の種々の崩壊剤、ならびにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の潤滑剤が、一般的にタブレットに使用される。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤は、ラクトースおよび高分子量ポリエチレングリコールである。水性懸濁液が経口使用に必要な場合、核酸組成物は、乳化剤および懸濁化剤と組み合わせることができる。望ましい場合、特定の甘味剤および／または香味剤を添加することができる。
髄腔内または脳室内投与のための組成物は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤を含有し得る滅菌水溶液を含んでもよい。
非経口投与のための製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る滅菌水溶液を含んでもよい。脳室内注射は、例えば、リザーバに取り付けられた脳室内カテーテルによって促進されてもよい。静脈使用のために、溶質の総濃度は、調製物を等張性にするように制御されてもよい。
眼内投与のために、軟膏または点滴液体が、アプリケータまたは点眼器等の当該技術分野で既知の眼内送達システムによって送達されてもよい。そのような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはポリ（ビニルアルコール）等の粘液模倣物、ソルビン酸、ＥＤＴＡ、もしくは塩化ベンジルクロム等の防腐剤、ならびに通常の量の希釈剤および／または担体を含むことができる。
局所送達
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）は、局所投与を介して対象に送達される。「局所投与」とは、対象の表面に製剤を直接接触させることによる、対象への送達を指す。最も一般的な形態の局所送達は、皮膚への送達であるが、本明細書に開示する構成物は、身体の他の表面、例えば、眼、粘膜、体腔、または内面に直接適用することができる。上記のように、最も一般的な局所送達は、皮膚への送達である。この用語は、局所および経皮を含むがこれに限定されない、いくつかの投与経路を包含する。これらの投与方法は、典型的には、皮膚の透過障壁への浸透および標的組織または層への効率的な送達を含む。局所投与は、表皮および真皮に浸透し、最終的に構成物の全身送達を達成するための手段として使用することができる。局所投与はまた、対象の表皮もしくは真皮、またはその特定の層、または下層組織にオリゴヌクレオチドを選択的に送達するための手段としても使用することができる。
本明細書で使用する「皮膚」という用語は、動物の表皮および／または真皮を指す。哺乳動物の皮膚は、２つの主要な異なる層から成る。皮膚の外層は、表皮と呼ばれる。表皮は、角質層、顆粒層、有棘層、および基底層から成り、角質層は、皮膚の表面にあり、基底層は、表皮の最深部分にある。表皮は、身体上のその位置に応じて、５０μｍ〜０．２ｍｍの間の厚さである。
表皮の下には、表皮よりも有意に厚い真皮がある。真皮は主に、繊維束の形態のコラーゲンから成る。コラーゲン束は、とりわけ、血管、毛細リンパ管、腺、神経終末、および免疫学的に活性な細胞に対する支持を提供する。
器官としての皮膚の主要な機能のうちの１つは、体内に物質が入ることを調節することである。皮膚の主要な透過障壁は、分化の種々の状態で細胞の多くの層から形成される角質層によって提供される。角質層中の細胞間の空間は、皮膚の透過障壁をさらに強化するための密閉を提供する、格子状の構造に配列された異なる脂質で充填される。
皮膚によって提供される透過障壁は、約７５０Ｄａを超える分子量を有する分子に概して不浸透性であるような障壁である。より大きい分子が皮膚の透過障壁を通過するために、通常の浸透作用以外の機構を使用しなければならない。
いくつかの要因が、投与された薬剤に対する皮膚の透過性を決定する。これらの要因としては、治療された皮膚の特徴、送達剤の特徴、薬剤と送達剤との間および薬剤と皮膚との間の両方の相互作用、適用される薬剤の投与量、治療形態、および治療後レジメンが挙げられる。表皮および真皮を選択的に標的化するために、時に、予め選択された層に対する薬剤の浸透を可能にする１つ以上の浸透促進剤を含む、組成物を製剤化することが可能である。
経皮送達は、脂溶性治療薬の投与に有益な経路である。真皮は、表皮よりも透過性であり、したがって、吸収は、擦りむいた皮膚、火傷した皮膚、または剥離された皮膚を通じてはるかに急速である。炎症および皮膚への血流量を増加させる他の生理学的条件もまた、経皮吸収を強化する。この経路を介した吸収は、油性媒体（塗擦）の使用によって、または１つ以上の浸透促進剤の使用によって強化され得る。経皮経路を介して本明細書に開示する構成物を送達する他の効果的な方法としては、皮膚の水和および制御放出局所パッチの使用が挙げられる。経皮経路は、全身および／または局所療法のために本明細書に開示する構成物を送達するための潜在的に効果的な手段を提供する。
加えて、イオントフォレーシス（電場の影響下での生体膜を通じたイオン性溶質の輸送）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６３）、フォノフォレーシス、またはソノフォレーシス（生体膜、特に皮膚および角膜にわたる種々の治療薬剤の吸収を強化するための超音波の使用）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６６）、および投与部位における用量状態および滞留性に対する媒体特徴の最適化（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．１６８）は、皮膚および粘膜部にわたる局所的に提供される構成物の輸送を強化するための有用な方法であり得る。
提供される構成物および方法はまた、インビトロで、培養または保存真皮組織中で、および動物において、種々のタンパク質および遺伝子の機能を検査するために使用されてもよい。したがって、本発明は、任意の遺伝子の機能を検査するために適用することができる。本発明の方法はまた、治療的または予防的に使用することができる。例えば、乾癬、扁平苔癬、中毒性表皮剥離症、多形性紅斑、基底細胞癌、扁平上皮癌、悪性メラノーマ、パジェット病、カポジ肉腫、肺線維症、ライム病、ならびに皮膚のウイルス感染、真菌感染、および細菌感染等の疾病に罹患していることが既知であるか、またはその疑いがある動物の治療に使用され得る。
経肺送達
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む構成物は、経肺送達によって対象に投与することができる。経肺送達組成物は、分散剤中の構成物、例えば、ｉＲＮＡが肺に達することができ、肺内で肺胞領域を通じて血液循環に直接容易に吸収されることができるように、分散剤の患者による吸収によって送達することができる。経肺送達は、全身送達、および肺疾患を治療するための局所送達の両方に効果的であり得る。
経肺送達は、ネブライザー製剤、エアロゾル製剤、ミセル製剤、または乾燥粉末製剤の使用を含む、異なる方法によって達成することができる。送達は、液体ネブライザー、エアロゾル吸入器、および乾燥粉末分散装置を用いて達成することができる。定量デバイスが使用されてもよい。アトマイザーまたは吸入器を使用する利点のうちの１つは、デバイスが内蔵式であるため、汚染の可能性が最小限に抑えられることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬剤を送達する。ｉＲＮＡ構成物は、単独で、または好適な粉末担体と組み合わせて、凍結乾燥または噴霧乾燥粉末として安定的に保存され得る。吸入のための組成物の送達は、デバイスに組み込まれた場合に、エアロゾル薬剤の投与中に患者に対する用量追跡、コンプライアンス監視、および／または用量トリガーを可能にする、タイマー、用量カウンター、時間測定デバイス、または時間指示器が挙げられ得る、投薬タイミング要素によって媒介することができる。
「粉末」という用語は、自由流動性であり、吸入デバイス内で容易に分散され、続いて対象によって吸入され、粒子が肺に達し、肺胞への浸透を可能にすることができる、微細分散した個体粒子から成る組成物を意味する。したがって、粉末は、「呼吸に適している」と考えられる。例えば、平均粒径は、直径が約１０μｍ未満であり、比較的均一な球状の分布を有する。いくつかの実施形態では、直径は、約７．５μｍ未満であり、いくつかの実施形態では、約５．０μｍ未満である。通常、粒径分布は、約０．１μｍ〜約５μｍの間の直径である、時に、約０．３μｍ〜約５μｍの間の直径である。
「乾燥」という用語は、組成物が、水分含量が約１０重量％（％ｗ）を下回る、約５重量％を下回る、および場合によっては、約３重量％を下回る水を有することを意味する。乾燥組成物は、粒子が、エアロゾルを形成するために吸入デバイス内で容易に分散可能であるような組成物である。
「治療有効量」という用語は、予測される生理学的反応をもたらすために、治療されている対象において所望のレベルの薬剤を提供するために必要な組成物中に存在する量である。
「生理学的有効量」という用語は、緩和または治療効果をもたらすために対象に送達される量である。
「薬学的に許容される担体」という用語は、肺への有意な有害毒性効果なく、担体を肺に取り込むことができることを意味する。
担体として有用な医薬品賦形剤の種類としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）等の安定剤、炭水化物、アミノ酸、およびポリペプチド等の増量剤；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩化ナトリウム等の塩等が挙げられる。これらの担体は、結晶性または非晶質形態であってもよく、または２つの混合物であってもよい。
特に有益な増量剤としては、適合する炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好適な炭水化物としては、ガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース等の単糖類；ラクトース、トレハロース等の二糖類；２−ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン等のシクロデキストリン；およびラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等の多糖類；マンニトールキシリトール等のアルジトールが挙げられる。炭水化物の群としては、ラクトース、トレハロース、ラフィノースマルトデキストリン、およびマンニトールが挙げられ得る。好適なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニンおよびグリシンが挙げられ、いくつかの実施形態では、グリシンが使用されている。
本発明の組成物の微量構成成分である添加剤は、噴霧乾燥中の構造安定性および粉末の分散性の改善のために含まれてもよい。これらの添加剤としては、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン等の疎水性アミノ酸が挙げられる。
好適なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等の有機酸および塩基から調整される有機塩が挙げられ、いくつかの実施形態では、クエン酸ナトリウムが使用されてもよい。
ミセルｉＲＮＡ製剤の経肺投与は、テトラフルオロエタン、ヘプタフルオロエタン、ジメチルフルオロプロパン、テトラフルオロプロパン、ブタン、イソブタン、ジメチルエーテル、ならびに他の非ＣＦＣおよびＣＦＣ噴射剤等の噴射剤を用いた定量噴霧デバイスによって達成することができる。
経口または経鼻送達
説明を簡単にするために、本項の製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。口膜および鼻粘膜の両方は、他の投与経路に優る利点を提供する。例えば、これらの膜を通じた投与される薬物は、作用の急速な発現を有し、治療血漿レベルを提供し、肝代謝の初回通過効果を回避し、好ましくない胃腸（ＧＩ）を環境への薬剤の暴露を回避する。さらなる利点としては、薬剤を容易に適用、局所化、および除去することができるような、膜部位への容易なアクセスである。
経口送達において、構成物は、口腔の表面、例えば、舌の腹側表面の膜および口底を含む舌下粘膜、または頬の内面を構成する頬粘膜に標的化することができる。舌下粘膜は、比較的透過性であり、したがって、多くの薬物の急速な吸収および許容可能なバイオアベイラビリティをもたらす。さらに、舌下粘膜は、便利、許容可能、かつ容易にアクセス可能である。
分子が口腔粘膜に浸透する能力は、分子量、脂溶性、およびペプチドタンパク質イオン化に関連するように思われる。１０００ダルトン未満の小分子は、急速に粘膜を横断するように思われる。分子量が増加するにつれて、透過性は急速に減少する。脂溶性化合物は、非脂溶性分子よりも透過性である。最大吸収は、分子がイオン化されていないか、電荷において中性である場合に生じる。したがって、荷電分子は、口腔粘膜を介した吸収にとって最大の課題を示す。
ｉＲＮＡの医薬組成物はまた、上記の混合ミセル医薬品製剤および噴射剤を定量噴霧ディスペンサーから吸入なしで口腔に噴霧することによって、ヒトの口腔に投与されてもよい。一実施形態では、ディスペンサーは、医薬品製剤および噴射剤を口腔に噴霧する前に最初に震盪される。
デバイス
説明を簡単にするために、本項のデバイス、製剤、構成物、および方法は、主に、非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらのデバイス、製剤、構成物、および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば、修飾ｉＲＮＡ剤で実施することができ、そのような実施は本発明の範囲内であることが理解され得る。ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）は、デバイス、例えば、対象内に埋め込まれる、または別様に配置されるデバイス上またはデバイス内に配置することができる。例示的なデバイスとしては、ステント、カテーテル、心臓弁、および他の血管デバイスを含む、血管系に導入されるデバイス、例えば、維管束組織の管腔に挿入されるデバイス、またはそれ自体が血管系の一部を形成するデバイスが挙げられる。これらのデバイス、例えば、カテーテルまたはステントは、肺、心臓、または脚の血管系に配置することができる。
他のデバイスとしては、非血管デバイス、例えば、腹膜内、または器官もしくは腺組織内に埋め込まれるデバイス、例えば、人工器官が挙げられる。デバイスは、ｉＲＮＡに加えて治療物質を放出することができ、例えば、デバイスは、インスリンを放出することができる。
他のデバイスとしては、人工関節、例えば、股関節、および他の整形外科用インプラントが挙げられる。
一実施形態では、ｉＲＮＡを含む単位用量または測定用量の組成物は、埋め込み型デバイスによって分注される。デバイスは、対象内のパラメータを監視するセンサを含むことができる。例えば、デバイスは、例えば、ポンプ、および随意的に、関連電子機器を含むことができる。
組織、例えば、細胞または器官は、エクスビボで、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）で処理し、次いで、対象に投与するか、または埋め込むことができる。
組織は、自家移植組織、同種異系組織、または異種組織であってもよい。例えば、組織は、移植片対宿主病を軽減するように処置することができる。他の実施形態では、組織は、同種異系であり、組織は、組織内の望ましくない遺伝子発現を特徴とする疾患を治療するように処置される。例えば、組織、例えば、造血細胞、例えば、骨髄造血細胞は、望ましくない細胞増殖を阻害するように処置することができる。
自己移植組織または移植組織にかかわらず、組織の導入は、他の両方と組み合わせることができる。
いくつかの実施において、ｉＲＮＡで処理された細胞は、例えば、細胞が移植片から離れることを防止するが、身体からの分子が細胞に到達すること、および細胞によって産生される分子が体内に入ることを可能にする、半透過性多孔質障壁によって、他の細胞から隔離される。一実施形態では、多孔質障壁は、アルギン酸から形成される。
一実施形態では、避妊用デバイスが、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）によって被覆されるか、またはそれを含有する。例示的なデバイスとしては、コンドーム、ペッサリー、ＩＵＤ（埋め込み型子宮内デバイス）、スポンジ、膣コンドーム、およびバースコントロールデバイスが挙げられる。一実施形態では、ｉＲＮＡは、精子または卵子を不活性化するように選択される。別の実施形態では、ｉＲＮＡは、ウイルスまたは病原体ＲＮＡ、例えば、ＳＴＤのＲＮＡに相補的になるように選択される。場合によっては、ｉＲＮＡ組成物は、殺精子剤を含んでもよい。
投与量
一態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤を対象（例えばヒト対象）に投与する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）二本鎖部分が１９〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）長、例えば、２１〜２３ｎｔであり、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば内在性または病原体標的ＲＮＡ）に相補的であり、かつ随意的に（ｃ）１〜５ヌクレオチド長の少なくとも１つの３'突出部を含む、ｉＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡ剤の単位用量を投与することを含む。一実施形態では、単位用量は、体重１ｋｇ当たり１．４ｍｇ未満、または体重１ｋｇ当たり１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１、０．０００５、０．０００１、０．００００５、もしくは０．００００１ｍｇ未満、および体重１ｋｇ当たり２００ナノモル未満のＲＮＡ剤（例えば約４．４×１０１６の複製）、または体重１ｋｇ当たり１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ナノモル未満のＲＮＡ剤である。
規定量は、疾病もしくは疾患、例えば、標的ＲＮＡに関連する疾病もしくは疾患を治療または予防するのに有効な量であり得る。例えば、単位用量は、注射（例えば静脈もしくは筋肉内）、吸入投与、または局所適用によって投与することができる。いくつかの実施形態では、投与量は、２、１、または０．１ｍｇ／体重ｋｇ未満であってもよい。
いくつかの実施形態では、単位用量は、１日１回よりも少ない頻度、例えば、２、４、８、または３０日ごとよりも少なく投与される。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度で投与されない（例えば定期的な頻度ではない）。例えば、単位用量は、単回投与されてもよい。
一実施形態では、有効量は、他の従来の治療法とともに投与される。一実施形態では、対象は、ウイルス感染を有し、治療法は、ｉＲＮＡ剤以外の、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤以外の抗ウイルス薬である。別の実施形態では、対象は、アテローム性動脈硬化症を有し、有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤が、外科的介入、例えば、血管形成と組み合わせて、例えば、その後に投与される。
一実施形態では、対象は、初期用量および１つ以上の維持用量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を投与される。維持用量（複数を含む）は、概して、初期用量よりも低く、例えば、初期用量の半分である。維持レジメンは、１日当たり０．０１μｇ〜１．４ｍｇ／体重ｋｇに及ぶ用量（複数を含む）、例えば、１日当たり体重１ｋｇ当たり１０、１、０．１、０．０１、０．００１、または０．００００１ｍｇで、対象を治療することを含むことができる。維持用量は、例えば、５、１０、または３０日に１回以下投与される。さらに、治療レジメンは、特定の疾病の性質、その重症度、および患者の全身状態に応じて異なる一定期間にわたって継続され得る。特定の実施形態では、投与量は、１日１回以下、例えば、２４、３６、４８、またはそれ以上の時間に１回以下、例えば、５または８日に１回以下送達されてもよい。治療後、状態の変化および病態の症状の緩和に関して患者を監視することができる。化合物の投与量は、患者が現在の投与量レベルに有意に反応しない場合増加されてもよく、あるいは、病態の症状の緩和が観察される場合、病態が除去された場合、または望ましくない副作用が観察される場合は、用量は減少されてもよい。
有効量は、特定の状況下において望ましい、または適切と見なされる通りに、単回投与または２回以上の用量で投与することができる。反復の、または頻繁な注入を促進することが望ましい場合、送達デバイス、例えば、ポンプ、半永久的ステント（例えば静脈、腹腔内、嚢内、もしくは関節包内）、またはリザーバ等の埋め込みが望ましくあり得る。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤医薬組成物は、複数のｉＲＮＡ剤種を含む。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤種は、自然発生する標的配列に対して、別の種と非重複および非隣接である配列を有する。別の実施形態では、複数のｉＲＮＡ剤種は、異なる自然発生する標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、対立遺伝子に特異的である。
場合によっては、患者は、他の治療法と併用してｉＲＮＡ剤で治療される。例えば、ウイルス性疾患、例えば、ＨＩＶ関連疾病（例えばＡＩＤＳ）の治療を受けている患者は、既知の抗ウイルス薬（例えばプロテアーゼ阻害剤または逆転写酵素阻害剤）と併用して、ウイルスに必須の標的遺伝子に特異的なｉＲＮＡ剤を投与されてもよい。別の例では、癌の治療を受けている患者は、化学療法と併用して、腫瘍細胞増殖に必須の標的に特異的なｉＲＮＡ剤を投与されてもよい。
成功的治療後、病態の再発を予防するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましくあり得、本発明の化合物は、体重１ｋｇ当たり０．０１μｇ〜１００ｇに及ぶ維持用量で投与される（米国特許第６，１０７，０９４号明細書を参照されたい）。
ｉＲＮＡ剤構成物の濃度は、ヒトにおける疾患を治療もしくは予防するのに、または生理学的状態を調節するのに有効であるのに十分な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度または量は、薬剤および投与方法、例えば、経鼻、口腔、経肺に関して決定されるパラメータに応じて決まる。例えば、経鼻製剤は、鼻道の刺激またはヒリヒリ感を回避するために、はるかに低濃度のいくつかの成分を必要とする傾向がある。時に、好適な経鼻製剤を提供するために、経口製剤を最大で１０〜１００倍希釈することが望ましい。
疾病または疾患の重症度、以前治療、対象の全般的健康および／または年齢、ならびに他の存在する疾病が挙げられるがこれに限定されない、特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投与量に影響を及ぼし得る。さらに、治療有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）での対象の治療は、単回治療を含むことができるか、または例えば、一連の治療を含むことができる。また、治療に使用されるｓｉＲＮＡ剤等のｉＲＮＡ剤の有効投与量は、特定の治療過程にわたって増加または減少し得ることを理解されたい。投与量の変化は、本明細書に記載するような診断アッセイの結果に起因し得、かつ該結果から明らかとなり得る。例えば、対象は、ｉＲＮＡ剤構成物の投与後に監視され得る。監視からの情報に基づいて、追加の量のｉＲＮＡ剤構成物が投与され得る。
投薬は、治療される病状の重症度および反応性に依存し、治療過程は、数日間から数ヶ月まで、または治癒が達成されるか、もしくは病態の軽減が達成されるまで継続される。最適な投薬スケジュールは、患者の体内の薬物蓄積の測定から計算することができる。当業者は、最適な投与量、投薬方法、および反復率を容易に決定することができる。最適な投与量は、個々の化合物の相対効力に応じて異なってもよく、概して、インビトロおよびインビボ動物モデルで効果的であることがわかっているＥＣ５０に基づいて推測することができる。いくつかの実施形態では、動物モデルとしては、ヒト遺伝子、例えば、標的ＲＮＡを産生する遺伝子を発現するトランスジェニック動物が挙げられる。トランスジェニック動物は、対応する内在性ＲＮＡが欠損し得る。別の実施形態では、試験のための構成物は、動物モデルの標的ＲＮＡとヒトの標的ＲＮＡとの間で保存される配列に、少なくとも内部領域において相補的である、ｉＲＮＡ剤を含む。
本発明者らは、本明細書に記載するｉＲＮＡ剤が、多くの方法で、哺乳動物、特に非ヒト霊長動物またはヒト等の大型哺乳動物に投与され得ることを発見した。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤構成物の投与は、非経口、例えば、静脈（例えばボーラスまたは拡散注入として）、皮内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、脳室内、頭蓋内、皮下、経粘膜、口腔、舌下、内視鏡的、直腸、経口、膣内、局所、経肺、鼻腔内、尿道、または眼内である。投与は、対象によって、または別の人、例えば、医療提供者によって提供することができる。薬剤は、測定用量で、または定量を送達するディスペンサーで提供することができる。選択された送達方法は、以下により詳細に考察される。
本発明は、本明細書に記載するｉＲＮＡ剤の直腸投与または送達のための方法、組成物、およびキットを提供する。
したがって、本明細書に記載するｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば、本明細書に記載する治療有効量のｉＲＮＡ剤、例えば、４０未満、例えば、３０未満のヌクレオチドの二本鎖領域を有し、かつ１つまたは２つの１〜３ヌクレオチド一本鎖３'突出部を有するｉＲＮＡ剤は、直腸内に投与することができ、例えば、直腸を通じて下部結腸または上部結腸に導入することができる。この方法は、炎症性疾患、望ましくない細胞増殖、例えば、ポリープを特徴とする疾患、または結腸癌の治療に特に有用である。
薬剤は、分注デバイス、例えば、薬剤の送達のための手段を含む、結腸の視診またはポリープの除去に使用されるものと同様のフレキシブルカメラ誘導デバイスを導入することによって、結腸内の部位に送達することができる。
ｉＲＮＡ剤の直腸投与は、浣腸を用いる。浣腸用のＩＲＮＡ剤は、食塩溶液または緩衝液に溶解することができる。直腸投与はまた、他の成分、例えば、賦形剤、例えば、ココアバターまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含むことができる、坐剤を用いることができる。
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤はいずれも、例えば、タブレット、カプセル、ゲルカプセル、ドロップ、トローチ、または液体シロップの形態で、経口投与することができる。さらに、該組成物は、口腔の表面に局所的に適用することができる。
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤はいずれも、口腔投与することができる。例えば、該薬剤は、口腔に噴霧するか、または例えば、液体、固体、またはゲルの形態で、口腔の表面に直接適用することができる。この投与は、口腔、例えば、歯肉または舌の炎症の治療に特に望ましく、例えば、一実施形態では、口腔投与は、ディスペンサー、例えば、医薬組成物および噴射剤を分注する定量噴霧ディスペンサーから、例えば、吸入なしで、腔に噴霧することによる。
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤はいずれも、眼組織に投与することができる。例えば、該薬剤は、眼組織または周囲組織、例えば、眼瞼の内側の表面に適用することができる。それらは、例えば、噴霧することによって、点滴剤中で、洗眼液として、または軟膏として局所的に適用することができる。投与は、対象によって、または別の人、例えば、医療提供者によって提供することができる。該薬剤は、測定用量で、または定量を送達するディスペンサーで提供することができる。該薬剤はまた、眼内に投与することもでき、該薬剤を選択された範囲または構造に導入することができる、針または他の送達デバイスによって導入することができる。眼治療は、癌組織または周囲組織の炎症を治療するのに特に望ましい。
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤はいずれも、皮膚に直接投与することができる。例えば薬剤は、局所的に適用するか、例えば、皮膚は貫通するが、例えば、下層の筋組織は貫通しないマイクロニードルまたは一連のマイクロニードルの使用によって、皮膚の層に送達することができる。ｉＲＮＡ剤組成物の投与は、局所的であってもよい。局所適用は、例えば、対象の真皮または表皮に組成物を送達することができる。局所投与は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、点滴、坐剤、噴霧、液体、または粉末の形態であってもよい。局所投与のための組成物は、リポソーム、ミセル、エマルション、または他の親油性分子集合体として製剤化することができる。経皮投与は、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス、およびソノフォレーシス等の少なくとも１つの浸透促進剤を用いて適用することができる。
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤はいずれも、肺系に投与することができる。経肺投与は、吸入によって、または肺系への送達デバイスの導入によって、例えば、該薬剤を分注することができる送達デバイスを導入することによって、達成することができる。特定の実施形態は、吸入による経肺送達の方法を使用し得る。該薬剤は、それが吸入され得るくらい十分に小さい形態で、例えば湿潤または乾燥の薬剤を送達する、ディスペンサーで提供することができる。デバイスは、定量の薬剤を送達することができる。対象または別の人が、該薬剤を投与することができる。
経肺送達は、肺組織に直接影響を及ぼす疾患だけでなく、他の組織に影響を及ぼす疾患にも効果的である。
ｉＲＮＡ剤は、経肺送達のための液体、または非液体、例えば、粉末、結晶、またはエアロゾルとして製剤化することができる。
本明細書に記載するｉＲＮＡ剤はいずれも、経鼻投与することができる。経鼻投与は、鼻への送達デバイスの導入によって、例えば、薬剤を分注することができる送達デバイスを導入することによって、達成することができる。経鼻送達方法としては、例えば、点滴による、または鼻腔の表面への局所投与による、噴霧、エアロゾル、液体が挙げられる。薬剤は、それが吸入され得るくらい十分に小さい形態で、例えば湿潤または乾燥の薬剤を送達する、ディスペンサーで提供することができる。デバイスは、定量の薬剤を送達することができる。対象または別の人が、該薬剤を投与することができる。
経鼻送達は、鼻腔組織に直接影響を及ぼす疾患だけでなく、他の組織に影響を及ぼす疾患にも効果的である。
ｉＲＮＡ剤は、経鼻送達のための液体、または非液体、例えば、粉末、結晶として製剤化することができる。
ｉＲＮＡ剤は、ウイルス天然カプシド内に、または化学的もしくは酵素的に生成された人工カプシド、またはそれから得られる構造内にパッケージングすることができる。
ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物の投与量は、病態、例えば、癌または心血管疾患の症状を軽減するために投与することができる。対象は、上記の方法のいずれかによって、該医薬組成物で治療することができる。
対象における遺伝子発現は、ｉＲＮＡ剤を含む医薬組成物を投与することによって調整することができる。
対象は、粉末形態、例えば、結晶状粒子等の微小粒子の集合体である、規定量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤）組成物を投与することによって、治療することができる。組成物は、例えば、１つ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的な複数のｉＲＮＡ剤を含むことができる。この方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
対象は、噴霧乾燥、すなわち、溶液、エマルション、または懸濁液を噴霧化し、即座に液滴を乾燥ガスに曝露し、得られた多孔質粉末粒子を回収することを含む方法によって調製される、規定量のｉＲＮＡ剤組成物を投与することによって、治療することができる。組成物は、例えば、１つ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的な複数のｉＲＮＡ剤を含むことができる。この方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
ＩＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）は、吸入または他の経肺送達に好適な担体、例えば、微粒子またはナノ粒子とともに、またはそれを伴わず、粉末化、結晶化、または他の微粉化形態で提供することができる。これは、エアロゾル調製物、例えば、エアロゾル化噴霧乾燥組成物を提供することを含むことができる。エアロゾル組成物は、定量送達デバイスで提供および／または分注することができる。
対象は、吸入によって、例えば、噴霧乾燥ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）組成物をエアロゾル化し、エアロゾル化組成物を吸入することによって治療可能な状態の治療を受けることができる。ｉＲＮＡ剤は、ｓｉＲＮＡであり得る。組成物は、例えば、１つ以上の異なる内在性標的ＲＮＡに特異的な複数のｉＲＮＡ剤を含むことができる。この方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
対象は、例えば、有効量／規定量のｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む組成物を投与することによって、治療することができ、該組成物は、噴霧乾燥、凍結乾燥、真空乾燥、蒸発、流動床乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む方法によって調製される。
別の態様では、本発明は、対象の細胞内の転写物の存在量に関するパラメータを評価し、評価されたパラメータを基準値と比較し、評価されたパラメータが基準値に対する予め選択された関係（例えばより大きい）を有する場合に、ｉＲＮＡ剤（または前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤もしくはまたはその前駆体をコードするＤＮＡ）を対象に投与する、各工程を有してなる方法を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、評価された転写物に相補的な配列を含む。例えば、パラメータは、転写レベルの直接測定値、タンパク質レベルの測定値、疾病もしくは疾患の症状、または特性化（例えば細胞増殖速度および／または腫瘍量、ウイルス負荷）であってもよい。
別の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む第１の量の組成物を対象に投与し、ｉＲＮＡ剤は、標的核酸に実質的に相補的な鎖を含むことと、標的核酸によってコードされるタンパク質に関連する活性を評価し、その評価は、第２の量が投与され得るかを判定するために使用されることを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、この方法は、第２の量の組成物を投与することを含み、第２の量の投与のタイミングまたは投与量は、評価に依存する。この方法は、本明細書に記載する他の特徴を含むことができる。
別の態様では、本発明は、二本鎖ｉＲＮＡ剤（ｄｓ ｉＲＮＡ剤）の供給源を対象に投与する方法を特徴とする。この方法は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、例えば、２１〜２３ヌクレオチドである二本鎖領域を含み、（ｂ）標的ＲＮＡ（例えば内在性ＲＮＡまたは病原体ＲＮＡ）に相補的であり、かつ随意的に（ｃ）１〜５ｎｔ長の少なくとも１つの３'突出部を含む、ｄｓ ｉＲＮＡ剤、例えば、ｓｉＲＮＡ剤の供給源を投与する、または埋め込むことを含む。一実施形態では、供給源は、長期間にわたりｄｓ ｉＲＮＡ剤を放出し、例えば、供給源は、制御または持続放出供給源、例えば、ｄｓ ｉＲＮＡ剤を徐々に放出する微小粒子である。別の実施形態では、供給源は、ポンプ、例えば、センサを含むポンプ、または１つ以上の単位用量を放出することができるポンプである。
一態様では、本発明は、標的ＲＮＡに相補的な、例えば、実質的におよび／または正確に相補的なヌクレオチド配列を含む、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む、医薬組成物を特徴とする。標的ＲＮＡは、内在性ヒト遺伝子の転写物であってもよい。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、例えば、２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、かつ随意的に（ｃ）１〜５ｎｔ長の少なくとも１つの３'突出部を含む。一実施形態では、医薬組成物は、エマルション、マイクロエマルション、クリーム、ゼリー、またはリポソームであってもよい。
一例では、該医薬組成物は、局所送達剤と混合されたｉＲＮＡ剤を含む。局所送達剤は、複数の微細小胞であってもよい。微細小胞は、リポソームであってもよい。いくつかの実施形態では、リポソームは、カチオン性リポソームである。
別の態様では、医薬組成物は、局所浸透促進剤と混合された、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む。一実施形態では、局所浸透促進剤は、脂肪酸である。脂肪酸は、アラキドン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、もしくはＣ１−１０アルキルエステル、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。
別の実施形態では、局所浸透促進剤は、胆汁塩である。胆汁塩は、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、またはそれらの薬学的に許容される塩であり得る。
別の実施形態では、浸透促進剤は、キレート剤である。キレート剤は、ＥＤＴＡ、クエン酸、サリチル酸、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、β−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体、またはそれらの混合物であり得る。
別の実施形態では、浸透促進剤は、界面活性剤、例えば、イオン性または非イオン性界面活性剤である。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル、ペルフルオロ化合物エマルション、またはそれらの混合物であり得る。
別の実施形態では、浸透促進剤は、不飽和環状尿素、１−アルキル−アルコン、１−アルケニルアザシクロ−アラカノン、ステロイド性抗炎症薬、およびそれらの混合物から成る群より選択することができる。さらに別の実施形態では、浸透促進剤は、グリコール、ピロール、アゾン、またはテルペンであり得る。
一態様では、本発明は、経口送達に好適な形態で、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口送達は、ｉＲＮＡ剤組成物を胃腸管、例えば、小腸、結腸（例えば結腸癌を治療するために）等の細胞または領域に送達するために使用することができる。経口送達形態は、タブレット、カプセル、またはゲルカプセルであってもよい。一実施形態では、医薬組成物のｉＲＮＡ剤は、細胞接着タンパク質の発現を調整する、細胞増殖速度を調整する、または真核病原体もしくはレトロウイルスに対する生物活性を有する。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物の胃においてタブレット、カプセル、またはゲルカプセルの溶解を実質的に防止する腸溶性物質を含む。いくつかの実施形態では、腸溶性物質は、コーティングである。コーティングは、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはセルロース酢酸フタル酸であり得る。
別の実施形態では、医薬組成物の経口投薬形態は、浸透促進剤を含む。浸透促進剤は、胆汁塩または脂肪酸であり得る。胆汁塩は、ウルソデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、およびそれらの塩であり得る。脂肪酸は、カプリン酸、ラウリン酸、およびそれらの塩であり得る。
別の実施形態では、医薬組成物の経口投薬形態は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤は、ポリエチレングリコールである。別の例では、賦形剤は、プレシロールである。
別の実施形態では、医薬組成物の経口投薬形態は、可塑剤を含む。可塑剤は、ジエチルフタレート、トリアセチンセバシン酸ジブチル、ジブチルフタレート、またはクエン酸トリエチルであり得る。
一態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤および送達媒体を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、（ａ）１９〜２５ヌクレオチド長、例えば、２１〜２３ヌクレオチドであり、（ｂ）内在性標的ＲＮＡに相補的であり、かつ随意的に（ｃ）１〜５ｎｔ長の少なくとも１つの３'突出部を含む。
一実施形態では、送達媒体は、局所投与経路によって、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を細胞に送達することができる。送達媒体は、微細小胞であり得る。一例では、微細小胞は、リポソームである。いくつかの実施形態では、リポソームは、カチオン性リポソームである。別の例では、微細小胞は、ミセルである。一態様では、本発明は、注射可能な投薬形態で、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、医薬組成物の注射可能な投薬形態は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌粉末を含む。いくつかの実施形態では、滅菌溶液は、水等の希釈剤、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、またはプロピレングリコールを含むことができる。
一態様では、本発明は、経口投薬形態で、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、経口投薬形態は、タブレット、カプセル、およびゲルカプセルから成る群より選択される。別の実施形態では、医薬組成物は、哺乳動物の胃においてタブレット、カプセル、またはゲルカプセルの溶解を実質的に防止する腸溶性物質を含む。いくつかの実施形態では、腸溶性物質は、コーティングである。コーティングは、酢酸フタル酸、プロピレングリコール、モノオレイン酸ソルビタン、トリメリト酸酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、またはセルロース酢酸フタル酸であり得る。一実施形態では、医薬組成物の経口投薬形態は、浸透促進剤、例えば、本明細書に記載する浸透促進剤を含む。
別の実施形態では、医薬組成物の経口投薬形態は、賦形剤を含む。一例では、賦形剤は、ポリエチレングリコールである。別の例では、賦形剤は、プレシロールである。
別の実施形態では、医薬組成物の経口投薬形態は、可塑剤を含む。可塑剤は、ジエチルフタレート、トリアセチンセバシン酸ジブチル、ジブチルフタレート、またはクエン酸トリエチルであり得る。
一態様では、本発明は、直腸投薬形態で、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、直腸投薬形態は、浣腸である。別の実施形態では、直腸投薬形態は、坐剤である。
一態様では、本発明は、膣内投薬形態で、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、膣内投薬形態は、坐剤である。別の実施形態では、膣内投薬形態は、泡、クリーム、またはゲルである。
一態様では、本発明は、経肺または経鼻投薬形態で、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）を含む医薬組成物を特徴とする。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、粒子、例えば、マクロ粒子、例えば、マイクロスフェアに組み込まれる。粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはそれらの組み合わせによって生成することができる。マイクロスフェアは、懸濁液、粉末、または埋め込み可能な固体として製剤化することができる。
一態様では、本発明は、（ａ）吸入によって対象の状態を治療するのに好適な治療有効量のｉＲＮＡ剤、（ｂ）炭水化物およびアミノ酸から成る群より選択される、薬学的に許容される賦形剤、ならびに（ｃ）随意的に、分散性を強化する量の生理学的に許容される水溶性ポリペプチドを含む、対象による吸入に好適な噴霧乾燥ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）組成物を特徴とする。
一実施形態では、賦形剤は、炭水化物である。炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、および多糖類から成る群より選択することができる。いくつかの実施形態では、炭水化物は、デキストロース、ガラクトース、マンニトール、Ｄ−マンノース、ソルビトール、およびソルボースから成る群より選択される、単糖類である。別の実施形態では、炭水化物は、ラクトース、マルトース、スクロース、およびトレハロースから成る群より選択される、二糖類である。
別の実施形態では、賦形剤は、アミノ酸である。一実施形態では、アミノ酸は、疎水性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、疎水性アミノ酸は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンから成る群より選択される。さらに別の実施形態では、アミノ酸は、極性アミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン、システイン、グリシン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸から成る群より選択される。
一実施形態では、分散性強化ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、α−ラクトアルブミン、トリプシノーゲン、およびポリアラニンから成る群より選択される。
一実施形態では、噴霧乾燥ｉＲＮＡ剤組成物は、１０ミクロン未満の質量中央径（ＭＭＤ）を有する粒子を含む。別の実施形態では、噴霧乾燥ｉＲＮＡ剤組成物は、５ミクロン未満の質量中央径を有する粒子を含む。さらに別の実施形態では、噴霧乾燥ｉＲＮＡ剤組成物は、５ミクロン未満の空気動力学的中央粒子径（ＭＭＡＤ）を有する粒子を含む。
特定の他の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）の医薬品製剤を含有する好適な容器を含むキットを提供する。特定の実施形態では、医薬品製剤の個々の構成成分は、１つの容器内に提供されてもよい。あるいは、２つ以上の容器に別々に医薬品製剤の構成成分を提供すること、例えば、ｉＲＮＡ剤調製物に対して１つの容器、および担体化合物に対して少なくとも別の容器が望ましくあり得る。キットは、単一の箱内の１つ以上の容器等、多くの異なる構成でパッケージングされ得る。異なる構成成分は、例えば、キットと共に提供される説明書に従って混合することができる。構成成分は、例えば、医薬組成物を調製および投与するために、本明細書に記載する方法に従って混合することができる。キットはまた、送達デバイスを含むことができる。
別の態様では、本発明は、デバイス、例えば、埋め込み型デバイスを特徴とし、そのデバイスは、ｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えば、ｓｉＲＮＡ剤に処理することができる、より大きいｉＲＮＡ剤、またはｉＲＮＡ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤もしくはｓｉＲＮＡ剤またはその前駆体をコードするＤＮＡ）、例えば、内在性転写物をサイレンシングするｉＲＮＡ剤を含む組成物を分注または投与することができる。一実施形態では、デバイスは、組成物で被覆される。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、デバイス内に配置される。別の実施形態では、デバイスは、組成物の単位用量を分注する機構を含む。他の実施形態では、デバイスは、例えば、拡散によって組成物を連続的に放出する。例示的なデバイスとしては、ステント、カテーテル、ポンプ、人工器官または器官構成要素（例えば人工心臓、心臓弁等）、および縫合が挙げられる。
本明細書で使用する「結晶性」という用語は、結晶の構造または特徴を有する固体、すなわち、平面が明確な角度で交差し、かつ規則正しい内部構造がある三次元構造の粒子を表す。本発明の構成物は、結晶形態を有し得る。結晶形態は、例えば、噴霧乾燥を含む種々の方法によって調製することができる。
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは、さらなる限定と解釈されるべきではない。本願全体を通して引用される全ての参考文献、係属中の特許出願、および公開特許の内容は、参照することによって本明細書に明示的に組み込まれる。
実施例１：ｉＲＮＡ、エンドソーム分解性成分、および標的リガンドを含むモジュラー構成物の合成
ｉＲＮＡまたは他の核酸（例えばａｎｔａｇｏｍｉｒ、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、デコイオリゴヌクレオチド）が提供される。エンドソーム分解性成分および標的リガンドは、種々の形式で選択されたｉＲＮＡまたは核酸に共役されてもよい（図１および２）。ある実施形態では、核酸とエンドソーム分解性成分との間、核酸と標的リガンドとの間、および／または標的リガンドとエンドソーム分解性成分との間にリンカーが使用されてもよい。このリンカーは、用途に応じて開裂可能または開裂不可能であってもよい。
実施例２：オリゴヌクレオチド合成および精製
ステップ１．オリゴヌクレオチド合成
全てのオリゴヌクレオチドをＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置またはＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上で合成した。合成のために、市販の制御された多孔質ガラス固体支持体（Ｐｒｉｍｅ ＳｙｎｔｈｅｓｉｓのｒＵ−ＣＰＧ、２'−Ｏ−メチル修飾ｒＡ−ＣＰＧ、および２'−Ｏ−メチル修飾ｒＧ−ＣＰＧ）または社内で合成した固体支持体ヒドロキシプロリノール−コレステロール−ＣＰＧを使用した。標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイトおよび２'−Ｏ−メチル修飾ＲＮＡホスホラミダイト（５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブトリル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２'−Ｏ−メチル−アデノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−Ｏ−メチル−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブトリル−２'−Ｏ−メチル−グアノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−デオキシ−チミジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト）は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。Ｑｕａｓａｒ ５７０ホスホラミダイトは、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−イノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈから入手した。５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−（２，４）−ジフルオロトリル−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（ＤＦＴ−ホスホラミダイト）、および５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−９−（２−アミノエトキシ）−フェノキサジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｇ−クランプホスホラミダイト）は、社内で合成した。
ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置上での合成のために、１０％ＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍ濃度で使用したグアノシンおよび２'−Ｏ−メチル−ウリジンを除いて、全てのホスホラミダイトをＣＨ３ＣＮ中０．２Ｍの濃度で使用した。全てのホスホラミダイトカップリングのために、１６分間のカップリング／リサイクル時間を使用した。活性化因子は、５−エチル−チオ−テトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であった。ＰＯ酸化のために、水／ピリジン（１０：９０ｖ／ｖ）中５０ｍＭのヨードを使用し、ＰＳ酸化のために、２，６−ルチジン／ＣＨ３ＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中２％ＰＡＤＳ（ＧＬ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を使用した。ＡＢＩ ３９４ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上の合成のために、１０％ＴＨＦ／ＣＨ３ＣＮ（ｖ／ｖ）中０．１５Ｍの濃度で使用した２'−Ｏ−メチル−ウリジンを除いて、ＤＦＴおよびＧ−クランプホスホラミダイトを含む全てのホスホラミダイトを、ＣＨ３ＣＮ中０．１５Ｍの濃度で使用した。全てのホスホラミダイトカップリングのために、１０分間のカップリング時間を使用した。活性化因子は、５−エチル−チオ−テトラゾール（０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であった。ＰＯ酸化のために、水／ピリジン中２０ｍＭのヨード（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、ＰＳ酸化のために、ピリジン中０．１ＭのＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。Ｑｕａｓａｒ５７０ホスホラミダイトのカップリングをＡＢＩ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上で実施した。Ｑｕａｓａｒ５７０ホスホラミダイトは、１０分間のカップリング時間で、ＣＨ３ＣＮ中０．１Ｍの濃度で使用した。活性化因子は、５−エチル−チオ−テトラゾール（０．２５Ｍ、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）であり、ＰＳ酸化のために、ピリジン中０．１ＭのＤＤＴＴ（ＡＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。
ステップ２．オリゴヌクレオチドの脱保護
Ａ．ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置上で合成された配列
合成終了後、支持体を１００ｍＬガラスボトル（ＶＷＲ）に移した。４５℃で９０分間、４０ｍＬの４０％水性メチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）による塩基およびリン酸基の脱保護と同時に、オリゴヌクレオチドを開裂した。ボトルを氷上で短時間冷却し、次いで、メチルアミンを新しい５００ｍＬボトルに濾過した。ＣＰＧを４０ｍＬ部分のＤＭＳＯで３回洗浄した。次いで、混合物をドライアイス上で冷却した。
２'位置におけるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去するために、６０ｍＬのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（Ｅｔ３Ｎ−ＨＦ）を上記の混合物に添加した。混合物を６０分間４０℃で加熱した。次いで、反応物を２２０ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で反応停止処理をし、精製までフリーザー内に保管した。
Ｂ．ＡＢＩ ＤＡＮ／ＲＮＡ合成装置上で合成された配列
合成終了後、支持体を１５ｍＬ管（ＶＷＲ）に移した。６５℃で１５分間、７ｍＬの４０％水性メチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）による塩基およびリン酸基の脱保護と同時に、オリゴヌクレオチドを開裂した。ボトルを氷上で短期間冷却し、次いで、メチルアミンを１００ｍＬボトルに濾過した。ＣＰＧを７ｍＬ部分のＤＭＳＯで３回洗浄した。次いで、混合物をドライアイス上で冷却した。
２'位置におけるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去するために、１０．５ｍＬのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（Ｅｔ３Ｎ−ＨＦ）を上記の混合物に添加した。混合物を１５分間６０℃で加熱した。次いで、反応物を３８．５ｍＬの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）で反応停止処理をし、精製までフリーザー内に保管した。
ステップ３．粗オリゴヌクレオチドの定量化
全ての試料に対して、１０μＬアリコートを９９０μＬの脱イオン化ヌクレアーゼ無含有水（１．０ｍＬ）で希釈し、２６０ｎｍの吸収度測定値を得た。
ステップ４．オリゴヌクレオチドの精製
（ａ）非共役オリゴヌクレオチド
最初に、非共役粗オリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＰＡ １００）によって分析した。緩衝剤は、２０ｍＭのリン酸、ｐＨ１１（緩衝剤Ａ）、および２０ｍＭのリン酸、１．８ＭのＮａＢｒ、ｐＨ１１（緩衝剤Ｂ）であった。流速は、１．０ｍＬ／分であり、監視された波長は、２６０〜２８０ｎｍであった。各試料に対して、５〜１５μＬの注入を行った。
社内で充填したＴＳＫ−Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（２０）カラム（１７．３×５ｃｍ）、またはＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能な市販のＴＳＫ−Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷカラム（１５×０．２１５ｃｍ）上でＨＰＬＣによって非共役試料を精製した。緩衝剤は、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭのリン酸、ｐＨ８．５（緩衝剤Ａ）、および１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭのリン酸、１．０ＭのＮａＢｒ、ｐＨ８．５（緩衝剤Ｂ）であった。流速は、社内で充填したカラムに対して５０．０ｍＬ／分であり、評者から入手したカラムに対して１０．０ｍｌ／分であった。２６０および２９４ｎｍの波長を監視した。完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分を一緒に混合し、蒸発させ、脱イオン水で約１００ｍＬに再構成した。
（ｂ）コレステロール共役オリゴヌクレオチド
最初に、純度を判定するために、コレステロール共役粗オリゴヌクレオチドをＬＣ／ＭＳによって分析した。社内で充填したＲＰＣ−Ｓｏｕｒｃｅ１５逆相カラム（１７．３×５ｃｍまたは１５×２ｃｍ）上で、コレステロール共役配列をＨＰＬＣ精製した。緩衝剤は、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭのＮａＯＡｃ（緩衝剤Ａ）、および７０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭのＮａＯＡｃ（緩衝剤Ｂ）であった。流速は、１７．３×５ｃｍカラムに対して５０．０ｍＬ／分であり、１５×２ｃｍカラムに対して１２．０ｍＬ／分であった。２６０および２８４ｎｍの波長が監視された。完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分を混合し、蒸発させ、脱イオン水で約１００ｍＬに再構成した。
ステップ５．精製されたオリゴヌクレオチドの脱塩
社内で充填したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用して、ＡＫＴＡ ＥｘｐｌｏｒｅｒまたはＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかで、精製されたオリゴヌクレオチドを脱塩した。最初に、２０〜３０分間、４０ｍＬ／分の流速の水でカラムを洗浄した。次いで、試料を４０〜６０ｍＬ画分で適用した。溶出無塩画分を混合し、乾燥させ、約５０ｍＬのＲＮａｓｅフリー水中で再構成した。
ステップ６．キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、イオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ）、およびエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳによる純度分析
約０．３ＯＤの各脱塩オリゴヌクレオチドを水中で３００μＬに希釈し、ＣＧＥ、イオン交換ＨＰＬＣ、およびＬＣ／ＭＳによって分析した。
ステップ７．二本鎖形成
完全な二本鎖の二本鎖ために、等モル量の２つの鎖を一緒に混合した。混合物を−８０℃で冷凍し、真空遠心分離装置（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）上の真空下で乾燥させた。次いで、乾燥試料を４０ｍｇ／ｍＬの最終濃度まで１ｘＰＢＳ中に溶解した。溶解した試料を５分間、９５℃まで加熱し、ゆっくりと室温まで冷却した。
ステップ８．Ｔｍ判定
部分的に二本鎖の二本鎖およびヘアピンのために、融解温度を決定した。二本鎖のために、等モル量の２つの一本鎖ＲＮＡを一緒に混合した。混合物を−８０℃で冷凍し、真空遠心分離装置（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）上の真空下で乾燥させた。次いで、乾燥試料を２．５μＭの最終濃度まで１ｘＰＢＳ中に溶解した。溶解した試料を５分間、９５℃まで加熱し、ゆっくりと室温まで冷却した。６試料恒温セルブロックが取り付けられたＢｅｃｋｍａｎ分光光度計を使用して、０．５℃／分の温度傾斜で、２６０ｎｍにおいて、１０〜９０℃の間で変性曲線が得られた。次いで、製造者が供給したプログラムの第１の誘導法を使用して、Ｔｍを判定した。
実施例３：２'−Ｆオリゴヌクレオチド合成
１．オリゴヌクレオチド合成：
全てのオリゴヌクレオチドをＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置上で合成した。オリゴヌクレオチド合成のために、市販の制御された多孔質ガラス固体支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、５００Å、プライム合成）、ならびに標準的な保護基を有するＲＮＡホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチルＮ６−ベンゾイル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−−イソブトリル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト、および５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホラミダイト（Ｐｉｅｒｃｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。２'−Ｆホスホラミダイト、５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２'−フルロ−シチジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイト、および５'−Ｏ−ジメトキシトリチル−２'−フルロ−ウリジン−３'−Ｏ−Ｎ，Ｎ'−ジイソプロピル−２−シアノエチル−ホスホラミダイトをＰｒｏｍｅｇａから購入した。１０％ＴＨＦ／ＡＮＣ（ｖ／ｖ）中０．２Ｍの濃度で使用したグアノシンを除いて、全てのホスホラミダイトをアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．２Ｍの濃度で使用した。１６分間のカップリング／リサイクル時間を使用した。活性化因子は、ＰＯ酸化に対して５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）であり、ＰＳ酸化に対して２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１ｖ／ｖ）中のＰＡＤＳ（２％）を使用した。コレステロールホスホラミダイトを社内で合成し、ジクロロメタン中０．１Ｍの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトに対するカップリング時間は、１６分間であった。
２．脱保護−Ｉ（核酸塩基脱保護）
合成終了後、支持体を１００ｍＬガラスボトル（ＶＷＲ）に移した。５５℃で６．５時間、８０ｍＬのエタノールアンモニア［アンモニア：エタノール（３：１）］の混合物による塩基およびリン酸基の脱保護と同時に、オリゴヌクレオチドを支持体から開裂した。ボトルを氷上で短期間冷却し、次いで、エタノールアンモニア混合物を新しい２５０ｍＬボトルに濾過した。ＣＰＧを２×４０ｍＬ部分のエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄した。次いで、混合物の体積を回転式エバポレータによって約３０ｍＬまで減少させた。次いで、混合物をドライアイス上で冷凍し、真空遠心分離装置（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）上の真空下で乾燥させた。
３．脱保護−ＩＩ（２'ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥残渣を２６ｍＬのトリエチルアミン、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩（ＴＥＡ．３ＨＦ）、およびＤＭＳＯ（３：４：６）中に再懸濁し、９０分間、６０℃で加熱し、２'位置におけるｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで、反応物を、ｐＨを６．５に調節した５０ｍＬの２０ｍＭ酢酸ナトリウムで反応低処理をし、精製までフリーザー内に保管した。
４．粗オリゴマーの定量化または生分析
全ての試料に対して、１０μｌアリコートを９９０μｌの脱イオン化ヌクレアーゼ無含有水（１．０ｍＬ）で希釈し、２６０ｎｍにおいて吸収度測定値を得た。
５．オリゴマーの精製
（ａ）ＨＰＬＣ精製
最初に、粗オリゴマーをＨＰＬＣ（Ｄｉｏｎｅｘ ＰＡ１００）によって分析した。緩衝系は、Ａ＝２０ｍＭのリン酸、ｐＨ１１、Ｂ＝２０ｍＭのリン酸、１．８ＭのＮａＢｒ、ｐＨ１１であり、流速は、１．０ｍＬ／分、波長は、２６０〜２８０ｎｍであった。５〜１５μｌの各試料を注入した。社内で充填したＴＳＫ−Ｇｅｌ ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（２０）カラム（１７．３×５ｃｍ）上で、ＨＰＬＣによって非共役試料を精製した。緩衝系は、Ａ＝１０％ＣＡＮ中２０ｍＭのリン酸、ｐＨ８．５、およびＢ＝１０％ＣＡＮ中２０ｍＭのリン酸、１．０ＭのＮａＢｒ、ｐＨ８．５であり、流速は、５０．０ｍＬ／分、波長は、２６０および２９４であった。５'−コレステロール共役配列は、逆相カラムを使用してＨＰＬＣ精製した。緩衝系は、Ａ＝１０％ＣＡＮ中２０ｍＭのＴＥＡＡ、およびＢ＝７０％ＣＡＮ中２０ｍＭのＴＥＡＡであった。次いで、完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分を一緒に混合し、蒸発させ、脱イオン水で１００ｍＬに再構成した。
６．精製されたオリゴマーの脱塩
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムを使用したＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、精製されたオリゴヌクレオチドを脱塩した。２０〜３０分間、２５ｍＬ／分の流速の水で第１のカラムを洗浄した。次いで、試料を２５ｍＬ画分で適用した。溶出無塩画分を一緒に混合し、乾燥させ、５０ｍＬのＲＮａｓｅ無含有水中に再構成した。
７．キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ
約０．１５ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを１５０μｌに水中で希釈し、次いで、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析のためにバイアルにピペットで採取した。
表５は、合成したオリゴヌクレオチドのいくつかを列挙する。
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本発明がその特定の実施形態を参照して具体的に示され記載されているが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態および詳細において種々の変更が加えられ得ることが、当業者には理解されるであろう。例えば、本明細書に記載する構成物および方法は、任意の数のオリゴヌクレオチド修飾、標的リガンド、または膜作用性薬剤、およびそれに関連する方法、ならびに当該技術分野で既知の他の構成物および方法と組み合わせて使用される場合に有用であり得る。
特に、本発明で使用され得るそのような構成物および方法の限定されない例は、以下の共同出願に記載され、それらの全ては、その全体が参照として本明細書に明示的に組み込まれる。２００５年４月２７日出願の米国特許出願第１１／１１５，９８９号明細書；２００５年４月２９出願の米国特許出願第１１／１１９，５３３号明細書；２００５年７月２１日出願の米国特許出願第１１／１８６，９１５号明細書；２００７年８月２６日出願の米国特許出願第１１／８３４，１４０号明細書；２００５年８月４日出願の米国特許出願第１１／１９７，７５３号明細書；２００５年４月５日出願の米国特許出願第１１／０９９，４３０号明細書；２００５年６月２９日出願の米国特許出願第１１／１７０，７９８号明細書；および２００４年６月１４日出願の米国特許出願第１１／５６０，３３６号明細書。
実施例３−２
Figure 2017214383
化合物９０１の合成：ヒドラゾン一水和物（０．８０ｇ、１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３０ｍＬ）中の市販の化合物９００（２．００ｇ、６．４０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、混合物を室温で１時間撹拌した。ＮＨＳを除去するための濾過、溶媒の除去、次いで、カラムカラムクロマトグラフィによって、純粋化合物９０１、０．８９ｇ、６１％を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．０６（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｄ，Ｊ＝４．１，１Ｈ），７．８１（ｔｄ，Ｊ＝７．９，１．８，１Ｈ），７．７３（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．２６−７．１８（ｍ，１Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），２．５１−２．４５（ｍ，２Ｈ），２．４２（ｔ，Ｊ＝７．１，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，）δ１７０．１６，１６０．０１，１５０．５６，１３８．８０，１２２．１５，１２０．１１，３４．８５，３３．７０。エレクトロスプレー／ＡＰＣＩデュアルモードＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ８Ｈ１２Ｎ３Ｏ８Ｓ２（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：２３０．０、実測値：２２９．９
化合物９０３の合成：化合物９０２をすでに記載されたように調製した（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００２，１３，４７−５８）。化合物９０２（０．８５ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）、化合物９０１（０．８８ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）、およびＡｃＯＨ（２ｍＬ）のエタノール溶液（４０ｍＬ）を４５℃で６時間加熱した。室温まで冷却し、得られた無色沈殿物を濾過によって回収し、吸引下で乾燥させた。純粋化合物９０３の収量は、１．４９ｇ、９０％であった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ，８０℃で処理）δ１１．８２（ｓ，１Ｈ），１０．１８（ｓ，１Ｈ），８．４８（ｄ，Ｊ＝４．１，１Ｈ），７．８１（ｄ，Ｊ＝４．０，２Ｈ），７．６９（ｓ，２Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝３．９，１Ｈ），６．９６（ｄ，Ｊ＝８．６，２Ｈ），４．１０（ｔ，Ｊ＝６．５，２Ｈ），３．２０（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），３．０７（ｓ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝７．３，２Ｈ），２．２４（ｓ，３Ｈ），２．０２（ｐ，Ｊ＝６．９，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，８０℃で処理）δ１７４．１６，１６０．００，１５９．９０，１４９．９５，１３７．９６，１３１．３８，１２７．９７，１２１．５７，１２０．１６，１１４．９４，６７．５７，３４．６７，３０．７４，２４．８９。エレクトロスプレー／ＡＰＣＩデュアルモードＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ２０Ｈ２４Ｎ３Ｏ４Ｓ２（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：４３４．１、実測値：４３４．１。
化合物９０４の合成：ＤＣＣ（１８１ｍｇ、０．８７８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（４ｍＬ）をＮａＳＯ３ＮＨＳ（１７３ｍｇ、０．７９８ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（５ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）、および化合物９０３（３４６ｍｇ、０．７９８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（１ｍＬ）に添加し、室温で１８時間撹拌した。混合物を氷浴上で２時間冷却し、ジシクロヘキシル尿素を濾過によって除去し、撹拌しながら濾液にＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加することによって生成物を沈殿させた。淡クリーム色固体化合物９０４（４２６ｍｇ、８４％）を濾過によって回収し、真空内で乾燥させた。この物質は、元素分析によって、１０ｍｏｌ％のＮａＳＯ３ＮＨＳおよび３０ｍｏｌ％の水を含有することがわかった。１Ｈ ＮＭＲは、加熱によって単一化合物に分解する、３：１の比の異性体のＥ／Ｚ混合物を示す。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１０．４１（２ｘｓ，１Ｈ），８．４３（２ｘｄ，Ｊ＝４．６，１Ｈ），７．８５−７．７５（ｍ，２Ｈ），７．６５（２ｘｄ，Ｊ＝８．８，２Ｈ），７．３２−７．１２（ｍ，１Ｈ），６．９４（２ｘｄ，Ｊ＝８．９，２Ｈ），４．０７（ｔ，Ｊ＝６．２，２Ｈ），３．９４（ｓ，１Ｈ），３．１５−３．０１（ｍ，４Ｈ），２．９１−２．７８（ｍ，３Ｈ），２．７４（２ｘｄ，５．４，１Ｈ），２．１８（２ｘｓ，３Ｈ），２．１３−２．００（ｍ，２Ｈ）。元素分析：（Ｃ２４Ｈ２５Ｎ４ＮａＯ９Ｓ３）（Ｃ４Ｈ４ＮＮａＯ６Ｓ）０．１（Ｈ２Ｏ）０．３に対する計算値：Ｃ：４４．４２、Ｈ：３．９８、Ｎ：８．７１、Ｓ：１５．０４、実測値：Ｃ：４４．３２、Ｈ：４．０１、Ｎ：８．６８、Ｓ：１５．２６。
化合物９０６の合成：化合物９０５をすでに記載されたように調製した（Ｐａｒａｍｏｎｏｖ，Ｓｅｒｇｅｙ Ｅ．；Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，Ｅｒｉｃ Ｍ．；Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ，Ｔｒｉｓｔａｎ Ｔ．；Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｓｔｅｐｈａｎｙ Ｍ．；Ｌｅｅ，Ｃａｍｅｒｏｎ Ｃ．；Ｄａｓｈｅ，Ｊｅｓｓｅ；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊｅａｎ Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８），１９（４），９１１−９１９）。
化合物９００（１．７６ｇ、５．６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（１０ｍＬ）を化合物９０５（１．００ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ３（１．４ｇ、１４ｍｍｏｌ）の冷却された（−７８℃）メタノール溶液（３０ｍＬ）に添加した。混合物を２時間にわたって室温まで温めた。溶媒を除去し、残渣をカラムクロマトグラフィに供し（ＤＣＭ中０〜１０％の７ＮメタノールＮＨ３）、不安定な無色油として化合物９０６（１．３８ｇ、６９％）を得、それを次の反応ステップに即刻使用した。エレクトロスプレー／ＡＰＣＩデュアルモードＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ１５Ｈ２６Ｎ３Ｏ３Ｓ２（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：３６０．１、実測値：３６０．１。
化合物９０７の合成：コハク酸無水物（５７８ｍｇ、５．７７ｍｍｏｌ）を新しく調製した化合物９０６（１．３８ｇ、３．８４ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ３（１．６ｇ、１５．４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（５０ｍＬ）に添加し、１時間室温で撹拌した。混合物をカラムクロマトグラフィ精製に供し、部分的トリエチルアンモニウム塩として化合物９０７（１．８３ｇ、９５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．９９（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｄｄ，Ｊ＝４．８，０．８，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝５．４，１Ｈ），７．９２（ｄ，Ｊ＝５．５，１Ｈ），７．８６−７．７９（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．２３（ｄｄｄ，Ｊ＝７．３，４．８，１．０，１Ｈ），３．３２（ｑ，Ｊ＝５．９，６Ｈ），３．１４（ｄｑ，Ｊ＝１１．８，５．９，４Ｈ），２．９９（ｔ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝６．６，２Ｈ），２．２８（ｔ，Ｊ＝６．６，２Ｈ），１．２４（ｓ，６Ｈ）。エレクトロスプレー／ＡＰＣＩデュアルモードＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ１９Ｈ２８Ｎ３Ｏ６Ｓ２（Ｍ−Ｈ）＋に対する分子量、計算値：４５８．２、実測値：４５８．０。
化合物９０９の合成：化合物９０８（３８５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のＤＣＭ溶液（８ｍＬ）を化合物９０７（２４８ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．１７ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、およびＨＢＴＵ（２０５ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液（８ｍＬ）に一度に全て添加し、混合物を１時間室温で撹拌した。水による後処理、次いで、カラムクロマトグラフィによって、無色油として純粋９０９（４８８ｍｇ、７８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．５８−８．４１（ｍ，１Ｈ），７．７７−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．１２（ｄｄｄ，Ｊ＝６．７，４．９，１．８，１Ｈ），７．０５（ｓ，１Ｈ），６．３１（ｓ，１Ｈ），６．２０（ｓ，１Ｈ），５．４５−５．２１（ｍ，８Ｈ），４．２７−４．１５（ｍ，１Ｈ），４．１３−４．０３（ｍ，１Ｈ），３．６０−３．３４（ｍ，９Ｈ），３．２２（ｄｄ，Ｊ＝１３．１，６．９，２Ｈ），３．０９（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），２．７８（ｔ，Ｊ＝６．５，４Ｈ），２．６６（ｔ，Ｊ＝６．８，２Ｈ），２．５９−２．４７（ｍ，５Ｈ），２．４７−２．３１（ｍ，３Ｈ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．１３−１．９８（ｍ，８Ｈ），１．６８−１．５４（ｍ，８Ｈ），１．５４−１．４２（ｍ，４Ｈ），１．４２−１．１９（ｍ，４２Ｈ），０．９０（ｔ，Ｊ＝６．９，６Ｈ）。エレクトロスプレー／ＡＰＣＩデュアルモードＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ６６Ｈ１１６Ｎ５Ｏ７Ｓ２（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：１１５４．８、実測値：１１５４．８。
実施例４
Figure 2017214383
化合物１１２の合成：０℃のＤＣＭ（１２．０ｍｌ）中の化合物１１１（１．０ｇ、１．６２９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（０．４６ｇ、２．１ｍｍｏｌ、１．３当量）の懸濁液に、アルゴン下で、０℃のＤＣＭ（３．０ｍｌ）中の化合物１１０（０．２８ｇ、１．７９ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を添加し、反応を１時間室温で継続した。出発物質の完全反応後、反応を１ＮのＭａＨＣＯ３で反応停止処理をし、ＤＣＭで希釈し、２つの層に分離し、混合有機物を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（５％）：トリエチルアミン（０．５％）を用いたカラムクロマトグラフィによって精製し、純粋な０．８７ｇ（７０％）のエステル化合物１１２を得た。ＭＳ：Ｃ４９Ｈ８９Ｎ２Ｏ４に対する計算質量：７５６．６８実測値：７５７．７（ＭＨ）＋。
化合物１１４の合成：ジクロロメタン（４０．０ｍｌ）中の化合物１１３（３．０ｇ、４．１２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、固体Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（０．５２ｇ、４．５３ｍｍｏｌ、１．１当量）、続いて、ＤＣＣ（０．９３ｇ、４．５３ｍｍｏｌ、１．１当量）、ＤＭＡＰ（０．０５ｇ、０．４５ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、反応をアルゴン雰囲気下の室温で継続した。尿素誘導体の白色沈殿物が反応物中にゆっくりにと現れ、一晩反応を継続し、出発物質の完全な消費後、ジクロロメタンを蒸発させた。反応混合物を酢酸エチル（２５．０ｍｌ）中に溶解し、氷浴温度に冷却し、ＤＣＣ尿素誘導体を完全に沈殿させた。固体を濾過し、固体を冷たい酢酸エチル（２×６．０ｍｌ）で洗浄し、溶媒を蒸発させ、真空で乾燥させ、定量的収率で３．４ｇの化合物１１４の純粋ＮＨＳエステルを得、これをさらなる精製なしで次のステップに直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．５０−５．１６（ｍ，８Ｈ），４．５２（ｂｒｓ，１Ｈ），４．２５−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝７．９，１Ｈ），２．９５−２．５２（ｍ，１６Ｈ），２．１１−１．９７（ｍ，８Ｈ），１．８２−１．７６（ｍ，３Ｈ），１．６４−１．４２（ｍ，６Ｈ），１．４０−１．１１（ｍ，３８Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；ＭＳ：Ｃ５１Ｈ８８Ｎ２Ｏ６に対する計算質量：８２４．６実測値：８２５．５（ＭＨ）＋。
実施例５
Figure 2017214383
化合物１１６の合成：ＤＭＦ（２００ｍＬ）中の６−ブロモ−１−ヘキサノール１１５（５５．２ｍｍｏｌ、１０ｇ）、アジ化ナトリウム（１３２ｍｍｏｌ、８．６ｇ）の懸濁液を１５時間、オートクレーブで１００℃まで加熱した（ＴＬＣ）。次いで、反応混合物を室温まで冷却し、ジエチルエーテル（５００ｍｌ）で希釈し、水（４×１００ｍｌ）、続いて塩水（１×１００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させ、所望の生成物を得た。粗生成物をさらなる精製なしで次の段階に移した。収率（７．５ｇ、９４．５％、淡黄色油として）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．４１（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝３．６Ｈｚ），１．６１（ｍ，４Ｈ），３．２８（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。
化合物１１７の合成：シリカゲル（１７ｇ）に吸収されたＰＣＣ（１７ｇ、７８．６ｍｏｌ）を、室温で、ジクロロメタン（７５ｍＬ）中の１１６（７．５ｇ、５２．４ｍｍｏｌ）生成物の溶液に５分間にわたって添加した。添加後、反応混合物を４０分間撹拌した（ＴＬＣ）。反応質量をセライト床を通して濾過し、濾液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧で蒸発させ、淡黄色油として必要な生成物を得た。粗生成物をそのまま、さらなる精製なしで次の段階に移した（収率、６．６０ｇ、９０％）１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１．４２（ｍ，２Ｈ），１．６５（ｍ，４Ｈ），２．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．２９（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），９．７８（ｓ，１Ｈ）。
化合物１１８の合成：ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド（５．３６ｇ、２４．３６）を、ＤＣＭ（１８０ｍｌ）中の１１１（１２ｇ、１９．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で５分間にわたって少量ずつ添加した。この懸濁液に、１１７（３．０３ｇ、２１．４８ｍｍｏｌ）生成物を０℃で滴下添加した。全て添加後、反応混合物を室温まで温め、さらに３０分間撹拌した（ＴＬＣ）。反応混合物を１ＮのＮａＨＣＯ３（１×５０ｍｌ）で反応停止処理をし、ＤＣＭ（２００ｍｌ）で希釈した。有機層を分離し、水（２×１００ｍｌ）、塩水（１×１００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧で蒸発させ、粗生成物を得、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィによって精製した。必要な生成物を７％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンで溶出した（１２．２０ｇ、８４％、淡緑色として）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８９（ｓ，６Ｈ），１．２７（ｓ，４０Ｈ），１．４７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），１．５８（ｔ，６Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ），２．０５（ｄ，８Ｈ，Ｊ＝６Ｈｚ），２．２７（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｍ，３Ｈ），２．５６（ｍ，１Ｈ），２．７７（ｔ，４Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），３．２６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．５３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．０８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），４．２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），５．３３ｍ，８Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１４．１，２２．６，２３．７，２５．６，２７．０，２７．１，２７．２，２８．８，２９．２，２９．３，２９．３２，２９．５，２９．６，２９．７，２９．９，３１．５，３７．３，３７．７，４３．１，５１．４，５８．３，６０．１，６９．１，７４．４，７６．７，７７．０，７７．７。ＭＳ：Ｃ４７Ｈ８６Ｎ４Ｏ２に対する計算質量：７３８．６８、実測値：７３９．６５（ＭＨ）＋。
化合物１１９の合成：無水ＴＨＦ（１２．０ｍｌ）中アジド化合物１１８（１．０ｇ、１．３５ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＴＨＦ中１ＭのＬＡＨ（２．０３ｍｌ、２．０３ｍｍｏｌ、１．５当量）の溶液を、アルゴン下０°で滴下添加した。反応温度をゆっくり上昇させ、室温で２時間反応を継続した。出発物質の完全な消費後、０℃で、反応物を飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の滴下添加で反応停止処理をした。固体から溶液を分離し、酢酸エチル（２５．０ｍｌ）に抽出し、生成物が現れなくなるまで、水溶液を酢酸エチルで抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で混合有機物を乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させ、さらに真空下で乾燥させ、０．８２ｇ（８６％）の純生成物１１９を得、さらなる精製なしで次のステップに直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４６−５．２２（ｍ，８Ｈ），４．２４−４．１４（ｍ，１Ｈ），４．０８−４．０５（ｍ，１Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．４，４Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝６．９，２Ｈ），２．５４（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，６．２，１Ｈ），２．４６−２．３０（ｍ，３Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．１０−１．９６（ｍ，８Ｈ），１．５７−１．５２（ｍ，４Ｈ），１．４５−１．４０（ｍ，４Ｈ），１．３９−１．１６（ｍ，４２Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ４７Ｈ８８Ｎ２Ｏ２に対する質量：７１２．６、絶対質量：７１３．７（ＭＨ）＋。
化合物１２０の合成：化合物９０３（０．２６ｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を２．５ｍｌのＤＭＦ中に溶解し、ＨＢＴＵ（０．２７ｇ、０．７２ｍｍｏｌ、１．２当量）、続いてＤＩＰＥＡ（０．３３ｍｌ、１．８ｍｍｏｌ、３．０当量）を室温で添加し、アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌した。ＤＭＦ：ＤＣＭ（１：２、３．０ｍｌ）中の化合物１１９（０．４２ｇ、０．６ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を、室温で上記の混合物にゆっくりと添加し、出発物質がなくなるまで反応を継続した。２時間後、反応混合物を氷に注ぎ、ＤＣＭで抽出し、有機層を過量の水で洗浄し、有機溶液中に存在する全ＤＭＦを除去し、ＮａＨＣＯ３でさらに洗浄し、ＭｇＯＳ４で乾燥させ、濃縮し、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（５％）：トリエチルアミン（０．５％）を使用したカラムクロマトグラフィによって精製し、０．５７ｇ（８５％）の純粋化合物１２０を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．６３（ｓ，１Ｈ），８．４３（ｄｄ，Ｊ＝４．８，０．８，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６４−７．５９（ｍ，２Ｈ），７．０７−７．００（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．９，２Ｈ），５．５２（ｓ，１Ｈ），５．４３−５．１９（ｍ，８Ｈ），４．２７−４．１２（ｍ，１Ｈ），４．０５（ｄｄ，Ｊ＝１３．２，７．０，３Ｈ），３．５２（ｔ，Ｊ＝７．７，１Ｈ），３．３０−３．１１（ｍ，６Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．４，４Ｈ），２．５３（ｄｄ，Ｊ＝１２．７，６．２，１Ｈ），２．４５−２．３１（ｍ，５Ｈ），２．２５（ｓ，３Ｈ），２．１９−２．１０（ｍ，５Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝６．７，８Ｈ），１．６４−１．４０（ｍ，９Ｈ），１．３７−１．１８（ｍ，４０Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ６７Ｈ１０９Ｎ５Ｏ５Ｓ２に対する質量：１１２７．７、絶対質量：１１２８．５（ＭＨ）＋。
実施例６
Figure 2017214383
化合物６ｂの合成：火炎乾燥した５００ｍＬ ＲＢフラスコに、新しく活性化された削り屑状Ｍｇ（２．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコに磁気撹拌バー、添加漏斗、および還流冷却器を取り付けた。この設定を脱気し、アルゴンで洗い流し、シリンジを介して１０ｍＬの無水エーテルをフラスコに添加した。臭化物３（２６．５ｇ、８０．４７ｍｍｏｌ）を無水エーテル（５０ｍＬ）中に溶解し、添加漏斗に添加した。激しく撹拌しながら、約５ｍＬのこのエーテル溶液を削り屑状Ｍｇに添加した。発熱反応が見られ（Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬形成を確認／促進するために、５ｍｇのヨードを添加し、即座の脱色が観察され、Ｇｒｉｇｎａｒｄ試薬の形成を確認した）、エーテルは、還流を開始した。水中でフラスコを冷却することによって、緩やかな還流下で反応を保持しながら、臭化物の溶液の残りを滴下添加した。添加終了後、反応混合物を１時間３５℃で保持し、次いで、氷浴で冷却した。ギ酸エチル（２．６８ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）を無水エーテル（４０ｍＬ）中に溶解し、添加漏斗に移し、撹拌しながら反応混合物に滴下添加した。発熱反応が観察され、反応混合物は、還流を開始した。反応開始後、ギ酸塩のエーテル溶液の残りを流れとして添加し、反応混合物を周囲温度でさらに１時間撹拌した。１０ｍＬのアセトン滴下、続いて氷のように冷たい水（６０ｍＬ）を添加することによって、反応物を反応停止処理をした。溶液が均質になり、層が分離するまで、反応混合物をＨ２ＳＯ４水溶液（１０容量％、３００ｍＬ）で処理した。水相をエーテル（２×１００ｍＬ）で抽出した。混合エーテル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、粗生成物を得、カラム（シリカゲル、ヘキサン中０〜１０％エーテル）クロマトグラフィで精製した。極性がわずかに少ない画分を濃縮し、ギ酸塩６ａ（１．９ｇ）を得、純粋生成物画分を蒸発させ、無色油として純粋生成物６ｂ（１４．６ｇ、７８％）を得た。
化合物７の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）中アルコール６ｂ（３ｇ、５．６８ｍｍｏｌ）の溶液に、新しく活性化された４Ａ分子篩（５０ｇ）を添加し、この溶液に、粉末ＰＣＣ（４．９ｇ、２２．７ｍｍｏｌ）を２０分間にわたって一部ずつ添加し、混合物を１時間さらに撹拌し（注：長期の反応時間はより低い収率をもたらすため、良好な収率を得るために、反応の注意深い監視が必要である）、続いて反応混合物のＴＬＣを１０分毎に行った（ヘキサン中５％エーテル）。反応終了後、シリカゲルのパッドを通して反応混合物を濾過し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）で洗浄した。濾液を濃縮し、それによて得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ヘキサン中１％Ｅｔ２Ｏ）によってさらに精製し、無色油として純粋生成物７（２．９ｇ、９７％）を単離した。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ＝５．３３−５．２１（ｍ，８Ｈ），２．６９（ｔ，４Ｈ），２．３０（ｔ，４Ｈ），２．０５−１．９５（ｍ，８Ｈ），１．５５−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．３５−１．１５（ｍ，１８Ｈ），０．８２（ｔ，３Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ＝２１１．９０，１３０．６３，１３０．５４，１２８．４７，１２８．４１，４３．２７，３３．０４，３２．０１，３０．９３，２９．８９，２９．８６，２９．７５，２９．７４，２７．６９，２６．１１，２４．３５，２３．０６，１４．０５。ＭＳ：Ｃ３７Ｈ６６Ｏに対して計算された分子量、計算値：５２６．９２、実測値：５２８．０２（ＭＨ）＋。
Figure 2017214383
化合物９の合成：化合物８（１０．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）、化合物７（１０．５４ｇ、２０ｍｍｏｌ）、およびＰＴＳＡ（０．１当量）の混合物を、活性化４Å分子篩を含有するＳｏｘｈｌｅｔ抽出器を用いたトルエン還流下で、３時間加熱した。溶媒の除去、次いで、カラム精製（シリカゲル、ヘキサン中０〜３０％ＥｔＯＡｃ）によって、無色油として化合物９（１１ｇ、９０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４５−５．２４（ｍ，８Ｈ），４．３０−４．１７（ｍ，１Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝７．８，６．１，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，５．０，３Ｈ），３．５３（ｔ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．４，５Ｈ），２．２９−２．１８（ｍ，１Ｈ），２．０５（ｑ，Ｊ＝６．７，９Ｈ），１．８６−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．５９（ｄｄ，Ｊ＝１８．３，９．７，５Ｈ），１．４２−１．１８（ｍ，４３Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３０．３９，１３０．３６，１３０．３５，１２８．１４，１１２．８０，７７．５４，７７．２２，７６．９０，７５．７４，７０．１４，６１．０８，３７．９７，３７．５０，３５．５６，３１．７４，３０．１４，３０．１３，２９．８８，２９．８０，２９．７３，２９．５７，２９．５３，２７．４５，２７．４１，２５．８４，２４．２０，２４．００，２２．７９，１４．３０。
化合物１０の合成：ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の化合物９（１０．５ｇ、１７ｍｍｏｌ）およびＮＥｔ３（５ｍＬ）の氷のように冷たい溶液に、ＤＣＭ（２０ｍＬ）中のＭｓＣｌ（２．９６ｇ、２０．５ｍｍｏｌ）の溶液を、撹拌しながら滴下添加した。室温で１時間後、水による後処理により、１０の淡黄色油を得、カラム精製し（シリカゲル、ヘキサン中０〜３０％ＥｔＯＡｃ）、無色油として純粋メシラート（１１．１ｇ、９４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４４−５．２６（ｍ，８Ｈ），４．３７（ｍ，２Ｈ），４．２６−４．１３（ｍ，１Ｈ），４．１０（ｍ，１Ｈ），３．５３（ｍ，１Ｈ），３．０２（ｓ，３Ｈ），２．７６（ｄ，Ｊ＝６．４，４Ｈ），２．０５（ｄ，Ｊ＝６．９，１０Ｈ），１．５５（ｓ，４Ｈ），１．２９（ｄ，Ｊ＝９．８，３４Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．９，６Ｈ）。エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４２Ｈ７６Ｏ５Ｓ（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：６９３．５、実測値：６９３．４。
実施例７
Figure 2017214383
化合物１１の合成：Ｐａｒｒ反応器内で、エタノール(２０．０ｍｌ）中化合物１０（１２．０ｇ、１７．３１ｍｍｏｌ、１．０当量）のメタンスルホニル誘導体の溶液に、エタノール(２００ｍｌ）中の過量の３３％メチルアミンを添加し、反応を７０℃で４時間継続し、出発物質の完全な消費後、反応を冷却し、丸底フラスコに移し、濃縮した。反応生成物を酢酸エチル中に溶解し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、蒸発させ、真空下でさらに乾燥させ、１０．３ｇ（９５％）の純粋生成物１１を得、これをさらなる精製なしで次のステップに使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４７−５．２１（ｍ，８Ｈ），４．１４−４．０４（ｍ，２Ｈ），３．４９（ｔ，Ｊ＝７．６，１Ｈ），３．００−２．８３（ｍ，１Ｈ），２．８０−２．７４（ｍ，５Ｈ），２．６０（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝６．８，８Ｈ），１．９４−１．８１（ｍ，２Ｈ），１．６０−１．５２（ｍ，４Ｈ），１．４１−１．１５（ｍ，３７Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ４２Ｈ７７ＮＯ２に対する質量：６２７．６、絶対質量：６２８．５（ＭＨ）＋。
化合物１３：０℃のＤＣＭ（１２．０ｍｌ）中の化合物１１（１．０ｇ、１．５９ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（０．４４ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．３当量）の懸濁液に、アルゴン下０℃で、ＤＣＭ（３．０ｍｌ）中の化合物１２（０．２５ｇ、１．７５ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を添加し、反応を１時間室温で継続した。出発物質の完成反応後、反応物を１ＮのＭａＨＣＯ３で反応停止処理をし、ＤＣＭで希釈し、２つの層に分離し、混合有機物を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（５％）：トリエチルアミン（０．５％）を使用したカラムクロマトグラフィによって精製し、純粋な０．８６ｇ（７２％）のエステル化合物１３を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４７−５．２４（ｍ，８Ｈ），４．０９−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝７．０，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．４，４Ｈ），２．４４−２．４１（ｍ，１Ｈ），２．３１（ｔ，Ｊ＝７．５，４Ｈ），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝６．７，８Ｈ），１．８８−１．７４（ｍ，１Ｈ），１．７１−１．５２（ｍ，７Ｈ），１．４９−１．４５（ｍ，２Ｈ），１．４０−１．１６（ｍ，３９Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ４９Ｈ８９ＮＯ４に対する質量：７５５．６、絶対質量：７５６．５（ＭＨ）＋。
化合物１４の合成：ＴＨＦ（４．０ｍｌ）中の化合物１３（０．８６ｇ、１．１２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、水（２．０ｍｌ）中のＬｉＯＨ．Ｈ２Ｏ（０．１４ｇ、３．３６ｍｍｏｌ、３．０当量）の水溶液を、０℃で滴下添加し、出発物質がなくなるまで室温で反応を継続した。出発物質の完全な消費後、ＴＨＦを蒸発させ、酢酸の滴下添加によって、水性反応混合物をｐＨ６．０に酸性化した。反応生成物を酢酸エチルに抽出し、有機層を水、塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、真空下でさらに乾燥させ、０．７３ｇ（８９％）の純生成物１４を得、これをさらなる精製なしで直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４６−５．２４（ｍ，８Ｈ），４．０８（ｄｄ，Ｊ＝８．２，４．３，２Ｈ），３．５３（ｓ，１Ｈ），３．２３−２．９３（ｍ，４Ｈ），２．７７−２．７１（ｍ，７Ｈ），２．３７−２．１４（ｍ，３Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝６．８，８Ｈ），１．９７−１．７７（ｍ，３Ｈ），１．７０−１．４７（ｍ，６Ｈ），１．４４−１．１４（ｍ，３８Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ４８Ｈ８７ＮＯ４に対する質量：７４１．６、絶対質量：７４２．５（ＭＨ）＋。
化合物１５の合成：ジクロロメタン（８．０ｍｌ）中の化合物１４（０．７３ｇ、０．９８ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、固体Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）（０．１２ｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．１当量）、続いてＤＣＣ（０．２２ｇ、１．０８ｍｍｏｌ、１．１当量）、ＤＭＡＰ（０．０１２ｇ、０．０９８ｍｍｏｌ、０．１当量）を添加し、反応をアルゴン下、室温で継続した。尿素誘導体の白色沈殿物が反応中にゆっくりにと現れ、一晩反応を継続した。出発物質の完全な消費後、ジクロロメタンを蒸発させ、反応混合物を酢酸エチル（６．０ｍｌ）中に溶解し、氷浴温度に冷却し、ＤＣＣ尿素誘導体を完全に沈殿させた。固体を濾過し、固体を冷たい酢酸エチル（２×２．０ｍｌ）で洗浄し、溶媒を蒸発させ、真空で乾燥させ、定量的収率で０．８２ｇの化合物１５の純粋ＮＨＳエステルを得、これをさらなる精製なしで次のステップに直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４５−５．２２（ｍ，８Ｈ），４．１３−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．５６−３．４４（ｍ，１Ｈ），２．９５−２．７９（ｍ，６Ｈ），２．７６（ｔ，Ｊ＝６．４，４Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝７．１，２Ｈ），２．５７（ｓ，２Ｈ），２．０３（ｑ，Ｊ＝６．８，８Ｈ），１．９５−１．８６（ｍ，２Ｈ），１．８３−１．６３（ｍ，５Ｈ），１．６１−１．４０（ｍ，６Ｈ），１．３９−１．１５（ｍ，３８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ５２Ｈ９０Ｎ２Ｏ６に対する質量：８３８．６、絶対質量：８３９．５（ＭＨ）＋。
実施例８
Figure 2017214383
化合物１７の合成：０℃のＤＣＭ（１５．０ｍｌ）中の化合物１１（２．０ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（０．８７ｇ、４．１３ｍｍｏｌ、１．３当量）の懸濁液に、アルゴン下０℃で、ＤＣＭ（５．０ｍｌ）中の化合物１６（０．４９ｇ、３．５ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を添加し、反応を１時間室温で継続した。反応終了後、反応物を１ＮのＭａＨＣＯ３で反応停止処理をし、ＤＣＭで希釈し、２つの層を分離し、混合有機物を塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（５％）：トリエチルアミン（０．５％）を使用したカラムクロマトグラフィによって精製し、１．８５ｇ（７７％）の純粋エステル化合物１７を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４４−５．２５（ｍ，８Ｈ），４．１４−３．９５（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝７．１，１Ｈ），３．２６（ｔ，Ｊ＝６．９，２Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．４，３Ｈ），２．４９−２．２５（ｍ，３Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．０５（ｑ，Ｊ＝６．７，８Ｈ），１．８６−１．７６（ｍ，１Ｈ），１．７１−１．５１（ｍ，７Ｈ），１．４９−１．１３（ｍ，４４Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ４８Ｈ８８Ｎ４Ｏ２に対する質量：７５２．７、絶対質量：７５３．５（ＭＨ）＋。
化合物１８の合成：無水ＴＨＦ（１２．０ｍｌ）中のアジド誘導体１７（１．５ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、アルゴン下０℃で、ＴＨＦ中のＬＡＨ（３．０ｍｌ、３．０ｍｍｏｌ、１．５当量）の１Ｍの溶液を滴下添加した。反応温度はゆっくりと上昇し、反応を２時間室温で継続した。出発物質の完全な消費後、反応を０℃で、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液の滴下添加で反応停止処理をした。固体から溶液を分離し、酢酸エチル（２５．０ｍｌ）に抽出し、生成物が現れなくなるまで、水溶液を酢酸エチルで抽出した。Ｎａ２ＳＯ４で混合有機物を乾燥させ、濾過し、溶媒を蒸発させ、さらに真空下で乾燥させ、１．３１ｇ（９０％）の純生成物１８を得、さらなる精製なしで次のステップに直接使用した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４５−５．２４（ｍ，８Ｈ），４．１３−３．９６（ｍ，２Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝７．１，１Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．４，４Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝６．９，２Ｈ），２．４９−２．２６（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，３Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝６．７，８Ｈ），１．８８−１．７３（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．５１（ｍ，５Ｈ），１．５０−１．４０（ｍ，４Ｈ），１．３９−１．１９（ｍ，４０Ｈ），０．８９（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ４８Ｈ９０Ｎ２Ｏ２に対する質量：７２６．７、絶対質量：７２７．８（ＭＨ）＋。
化合物１９の合成：化合物９０３（０．６ｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１．０当量）を３．０ｍｌのＤＭＦに溶解し、ＨＢＴＵ（０．３７ｇ、０．９９ｍｍｏｌ、１．２当量）、続いてＤＩＰＥＡ（０．４５ｍｌ、２．４７ｍｍｏｌ、３．０当量）を室温で添加し、アルゴン雰囲気下で１０分間撹拌した。ＤＭＦ：ＤＣＭ（１：２、３．０ｍｌ）中の化合物１８（０．３５ｇ、０．８２ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液を室温で上記の混合物にゆっくりと添加し、出発物質がなくなるまで反応を継続した。２時間後、反応混合物を氷に注ぎ、ＤＣＭで抽出し、有機層を過量の水で洗浄し、有機層中に存在する全ＤＭＦを除去し、ＮａＨＣＯ３でさらに洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮し、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（５％）：トリエチルアミン（０．５％）を使用したカラムクロマトグラフィによって精製し、０．８１ｇ（８６％）の純粋化合物１９を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ８．６３（ｓ，１Ｈ），８．４７−８．３６（ｍ，１Ｈ），７．７６（ｄ，Ｊ＝８．１，１Ｈ），７．６１（ｄ，Ｊ＝８．８，２Ｈ），７．０７−６．９９（ｍ，１Ｈ），６．８７（ｄ，Ｊ＝８．９，２Ｈ），５．５２（ｓ，１Ｈ），５．４３−５．２５（ｍ，８Ｈ），４．１３−３．９５（ｍ，４Ｈ），３．４６（ｔ，Ｊ＝６．９，１Ｈ），３．２８−３．１３（ｍ，６Ｈ），２．８０−２．７５（ｍ，４Ｈ），２．４２−２．２８（ｍ，６Ｈ），２．１６（ｄｄ，Ｊ＝１９．３，９．６，８Ｈ），２．０４（ｑ，Ｊ＝６．７，８Ｈ），１．８６−１．７４（ｍ，１Ｈ），１．７０−１．４０（ｍ，８Ｈ），１．３９−１．１８（ｍ，４２Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝６．８，６Ｈ）；計算値：Ｃ６８Ｈ１１１Ｎ５Ｏ５Ｓ２に対する質量：１１４１．８、絶対質量：１１４２．７（ＭＨ）＋。
実施例９
Figure 2017214383
化合物３０１の合成：コレステロール酸３００（４．１０ｇ、７．５３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（１．２９ｇ、１１．２９ｍｍｏｌ）、およびＥＤＡＣ（２．１６ｇ、１１．２６ｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦの混合物に取り込んだ。それにＤＭＡＰ（０．１８３ｇ）を添加し、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。溶媒を除去し、残渣をＤＣＭ中に溶解し、水で数回洗浄した。ＴＬＣは、出発物質の完全な転換を示した。これをさらなる精製なしで次の反応に使用した（白色固体、４．４０ｇ、９２％）。ＭＳ：Ｃ３８Ｈ６０Ｎ２Ｏ６に対する計算値：６４０．４５；実測値６４１．４０（ＭＨ）＋。
化合物３０２の合成：化合物３０１（２．００ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中に溶解し、それにヒドラジン水和物（０．２００ｍＬ、１．２当量）およびＴＥＡ（１ｍＬ、過剰）を添加し、一晩撹拌した。ＴＬＣは、溶媒を確認および除去した。残渣をＥｔＯＡｃ／ヘキサンの混合物で洗浄し、一晩乾燥させ、白色固体として化合物（２．１０ｇ、９５％）を得た。ＭＳ：Ｃ３４Ｈ５９Ｎ３Ｏ３に対する計算値：５５７．４６；実測値：５５８．４４（ＭＨ＋）。
化合物３０３の合成：化合物３０２（１．８１ｇ、３．２４ｍｍｏｌ）およびケトン（０．７２２ｇ、３．２４ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）中に取り込んだ。それにＡｃＯＨ（２ｍＬ）を添加し、混合物を５０℃で６時間撹拌した。反応混合物を冷却し、フリーザー内で一晩保持した。濾過し、ＥｔＯＡｃおよび無水エーテルで洗浄した。真空下で乾燥させ、白色固体として化合物（１．６８ｇ、７１％）を得た。この化合物をさらなる精製なしで次の反応に使用した。ＭＳ：Ｃ４６Ｈ７１Ｎ３Ｏ６に対する計算値：７６１．５３実測値：７６０．５２（Ｍ−Ｈ）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１１．９５（ｂｓ，１Ｈ），９．７３（ｍ，１Ｈ），７．９３−７．４８（ｍ，５Ｈ），７．０９−６．８０（ｍ，８Ｈ），５．２９（ｓ，２Ｈ），４．２６（ｓ，２Ｈ），４．０９−３．８７（ｍ，６Ｈ），３．４８−２．０２（ｍ，２０），２．０２−０．５５（ｍ，２０Ｈ）。
化合物３０４の合成：化合物３０３（０．５００ｇ、０．６５６ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド（０．１１３ｇ、１．５当量）、およびＥＤＡＣ（０．１８８ｇ、１．５当量）をＤＣＭ中に取り込んだ。それにＤＭＡＰ（２０ｍｇ）を添加し、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水で数回洗浄し、乾燥させた。ＴＬＣは、出発物質の完全な転換を示した。溶媒を除去し、残渣を一晩乾燥させ、白色固体（４８０ｍｇ、９２％）を得た。ＭＳ：Ｃ５０Ｈ７４Ｎ４Ｏ８に対する計算値：８５８．５５；実測値：８５９．５３（ＭＨ）＋。
実施例１０
Figure 2017214383
５０２の合成：プテロイン酸前駆体５００（１．８８ｇ、３ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、ＨＢＴＵ（１．１４ｇ、１当量）、続いてＤＩＥＡ（１．３ｇ、３当量）を添加し、２０分間撹拌した。この反応混合物に、アミン５０１（０．９６１ｇ、３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中の溶液として添加した。反応をＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ、ＰＭＡ染色）によって監視した。反応混合物のＴＬＣは、１時間後に反応の終了を示した。激しく撹拌しながら、反応混合物をゆっくりと氷に注いだ。混合物を酢酸エチルで抽出し、混合有機層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、粗生成物を得た。それによって得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィ（シリカゲル、ＤＣＭ中０〜１０％ＭｅＯＨ）によってさらに精製し、白色発泡体として５０２を得た（収率＝２．４ｇ、８７％）。ＭＳ。Ｃ４１Ｈ５６Ｆ３Ｎ９Ｏ１２に対して計算された分子量、計算値：９２３．４０、実測値：９２４．５（ＭＨ）＋。
５０３の合成：Ｂｏｃ保護されたプテロイン酸５０２（２．３ｇ）をエーテル（１００ｍＬ）中の２ＭのＨＣｌで処理し、出発物質がなくなるまで、溶液を一晩撹拌した。反応混合物を濃縮し、乾燥させ、ワックス状固体としてアミン塩酸塩を単離した（１．９ｇ、１００％）。ＭＳ。Ｃ３６Ｈ４８Ｆ３Ｎ９Ｏ１０に対して計算された分子量、計算値：８２３．３５、実測値：８２４．３５（ＭＨ）＋。
５０４の合成：アミン塩酸塩５０３（１．８ｇ）を１００ｍＬのＴＨＦ／ＭｅＯＨ（１：１）中に溶解し、それにＬｉＯＨの水溶液（１０ｍＬの水中０．４ｇ）を添加し、混合物を室温で２時間撹拌した。反応混合物のＭＳは、出発物質の完全な消失を示し、生成物ピークのみが見られた。反応混合物を濃縮し、有機溶媒を除去し、酢酸を添加することによって、残りの水溶液をｐＨ６．８に中和した。それによって得られた水溶液をフリーズドライし、酢酸エチルで粉砕し、橙色結晶性固体として５０４（無機不純物と合わせて２．１ｇ）を得た。ＬＣ検査は、アミンが９１％純粋であることを示し、ＭＳは、正確な質量を示した。これを次のステップにそのまま使用した。ＭＳ。Ｃ２９Ｈ４１Ｎ９Ｏ８に対して計算された分子量、計算値：６４３．３１、実測値：６２４．３５（ＭＨ）＋。
５０５の合成：無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のアミン５０４（６４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（０．３ｍＬ）、続いて活性化エステル９０４（６３ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、その後、ＭＳは、出発物質の完全な消失を示した。反応混合物を濃縮し、残渣を酢酸エチルで粉砕し、黄色固体として生成物（６７ｍｇ、５２％）を得た。ＭＳ。Ｃ４９Ｈ６２Ｎ１２Ｏ１１Ｓ２に対して計算された分子量、計算値：１０５８．４１、実測値：１０５７．４（Ｍ−Ｈ−）。
実施例１１
Figure 2017214383
化合物５２の合成：ベンジルアルコール（２４ｍＬ）中の化合物５１１（３．７８ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）の溶液に、アクリル酸ベンジル（１．２２ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）および飽和ホウ酸水溶液（０．５ｍＬ）を滴下添加した。反応混合物を室温で５時間撹拌した。次いで、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（２．４６ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）を混合物に添加した。撹拌を一晩継続し、反応混合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜２：１）によって直接精製し、５２（４．４５ｇ、５．８２ｍｍｏｌ、７７％、Ｒｆ＝０．２６、ヘキサン：酢酸エチル＝２：１で展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ７．３４−７．３６（ｍ，５Ｈ），６．７６（ｂｒｓ，１Ｈ），５．０８（ｓ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０９（ｂｒｓ，１０Ｈ），２．８８（ｄｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．５４−２．６１（ｍ，２Ｈ），１．３７−１．６２（ｍ，４４Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）δ１７１．１，１５５．４，１５４．５，１５４．４，１５４．３，１３５．９，１２８．３，１２７．９，１２７．８，７８．６，７８．２，７８．１，７７．３，６５．５，４４．３，４４．２，４２．７，３７．５，２８．１，２７．９。Ｃ４０Ｈ６８Ｎ４ＮａＯ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：７８７．４８、実測値：７８７．４。
（１）（ａ）Ｇｅａｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｂｌａｇｂｒｏｕｇｈ，Ｉ．Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９８），３９，４４３−４４６．（ｂ）Ｇｅａｌｌ，Ａ．Ｊ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｒ．Ｊ．，Ｅａｒｌｌ，Ｍ．Ｅ．，Ｅａｔｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｗ．，Ｂｌａｇｂｒｏｕｇｈ，Ｉ．Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２０００），１１，３１４−３２６。
化合物５３の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（１２０ｍＬ）中の５２（４．２０ｇ、５．４９ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）を氷浴で冷却しながらゆっくり添加した。反応混合物を１５分間、次いで室温で２時間撹拌し続けた。溶媒を除去し、トルエンと共蒸発させ、真空内で乾燥させ、粗物質を得た。粗物質を氷浴で冷却しながらＣＨ２Ｃｌ２中に再懸濁し、次いで、トリフルオロ酢酸無水物（６．８７ｍＬ、４９．４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（９．１８ｍＬ、６５．９ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。反応混合物を氷浴で１５分間、および室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１５０ｍＬ）で抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：酢酸エチル＝４：１〜１：１）によって精製し、５３（３．６１ｇ、４．８２ｍｍｏｌ、８８％、Ｒｆ＝０．３６、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１で展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４５−９．５２（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．３７（ｍ，５Ｈ），５．１１（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．６１−３．６９（ｍ，２Ｈ），３．３４−３．３９（ｍ，１０Ｈ），３．２１−３．２２（ｍ，２Ｈ），２．７９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），２．７１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），１．７５−１．９１（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．５４（ｍ，４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−６８．１５，−６８．１９，−６８．２１，−６８．２６，−６８．２９，−６８．３１，−６８．３３，−６８．３８，−６８．４０，−６８．４１，−６８．４８，−６８．４９，−７４．４７，−７４．４９，−７４．５０，−７４．６１。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）δ１７０．７，１７０．３，１５６．８，１５６．５，１５６．４，１５６．１，１５６．０，１５５．９，１５５．８，１５５．７，１５５．６，１５５．５，１５５．３，１５５．２，１５４．９，１５４．８，１３５．８，１３５．７，１２９．２，１２８．８，１２８．４，１２８．１，１２７．６，１２７．３，１２０．６，１２０．４，１２０．１，１１７．７，１１７．６，１１７．５，１１７．３，１１４．８，１１４．７，１１４．６，１１２．０，１１１．８，１１１．６，６６．６，６６．４，６５．８，６５．７，６４．９，６４．８，６４．２，６１．２，６１．１，５９．８，５９．７，５８．３，５４．９，４６．８，４６．７，４６．６，４６．０，４５．９，４５．８，４５．７，４５．５，４５．４，４５．３，４５．２，４５．０，４４．９，４４．７，４４．６，４４．５，４４．４，４４．２，４４．１，４４．０，４３．９，４３．７，４３．６，４２．８，４２．７，４２．６，４０．５，４０．３，４０．２，３６．８，３６．４，３２．７，３２．６，３１．６，３１．５，３１．２，３１．１，３１．０，３０．０，２９．６，２７．７，２７．４，２６．５，２６．４，２６．２，２５．８，２５．４，２５．３，２５．１，２５．０，２４．６，２３．９，２３．５，２３．４，２３．３，２０．２，１９．８，１８．９，１４．６，１４．０，１３．４，１２．２。Ｃ２８Ｈ３２Ｆ１２Ｎ４ＮａＯ６（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：７７１．２０、実測値：７７１．０。
化合物５４の合成：ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中５３（３．５７ｇ、４．７７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭素上のパラジウム（１０重量％、Ｄｅｇｕｓｓａ型Ｅ１０１ＮＥ／Ｗ：６００ｍｇ）を添加した。反応混合物をＨ２雰囲気下で１６時間撹拌した。セライトを通した濾過後、濾液を真空内で除去し、５４（３．０４ｇ、４．６２ｍｍｏｌ、９７％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４５−９．５５（ｍ，１Ｈ），３．５４−３．６３（ｍ，２Ｈ），３．３６−３．３９（ｍ，１０Ｈ），３．１９−３．２４（ｍ，２Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５６（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），１．７５−１．９１（ｍ，４Ｈ），１．５２−１．５５（ｍ，４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−６８．１９，−６８．２２，−６８．２３，−６８．２４，−６８．３３，−６８．３５，−６８．３８，−６８．４１，−６８．４４，−６８．４８，−６８．５０，−６８．５１，−７４．５０，−７４．５２，−７４．５３，−７４．６４。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）δ１７２．４，１７２．０，１５６．５，１５６．４，１５６．２，１５６．１，１５５．９，１５５．８，１５５．６，１５５．５，１５５．４，１５５．３，１５５．２，１５４．９，１２０．６，１２０．５，１２０．２，１１７．７，１１７．６，１１７．３，１１４．９，１１４．８，１１４．５，１１２．０，１１１．６，４６．７，４６．１，４６．０，４５．９，４５．８，４５．０，４４．６，４４．２，４４．０，４３．７，４２．９，４０．１，３９．９，３９．７，３９．５，３９．３，３９．１，３８．９，３６．９，３６．４，３３．１，３１．２，２７．７，２７．５，２５．８，２５．４，２５．１，２４．０，２３．６，２３．３。Ｃ２１Ｈ２５Ｆ１２Ｎ４Ｏ６（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値：６５７．１６、実測値：６５７．０。
化合物５６の合成：ＤＭＦ（５０ｍＬ）中の化合物５４（３．０ｇ、４．５７ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１．９１ｇ、５．０３ｍｍｏｌ）の溶液を、ｉＰｒ２ＮＥｔ（３．９８ｍＬ、２２．９ｍｍｏｌ）および化合物５５（２．６８ｇ、５．０３ｍｍｏｌ）で連続的に処理し、次いで、室温で１４時間撹拌した。Ｅｔ２Ｏおよび飽和ＮａＨＣＯ３水溶液での抽出、次いで、カラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜５％）によって、化合物５６（３．７０ｇ、３．１５ｍｍｏｌ、６９％、Ｒｆ＝０．５９、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４４−９．５２（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９８（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３２（ｍ，９Ｈ），６．８６−６．８９（ｍ，４Ｈ），４．８８−４．９８（ｍ，１Ｈ），４．２８−４．４０（ｍ，１Ｈ），４．０９−４．１５（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．５４−３．６２（ｍ，３Ｈ），３．２９−３．３６（ｍ，１０Ｈ），３．１３−３．２３（ｍ，３Ｈ），２．９９−３．０２（ｍ，３Ｈ），２．３６−２．４４（ｍ，２Ｈ），１．７４−２．２１（ｍ，９Ｈ），１．２３−１．５３（ｍ，１０Ｈ）。１９ＦＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−６８．１７，−６８．１９，−６８．２２，−６８．２３，−６８．２６，−６８．２９，−６８．３２，−６８．３４，−６８．４０，−６８．４２，−６８．４９，−６８．５１，−７４．４９，−７４．５１，−７４．５２，−７４．６３。１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１００ＭＨｚ）ｄ１７０．９，１７０．８，１６９．４，１６９．０，１５８．１，１５８．０，１５６．５，１５６．２，１５５．６，１５５．３，１４５．１，１４４．７，１３５．９，１３５．７，１３５．５，１３５．４，１２９．６，１２９．５，１２７．９，１２７．８，１２７．６，１２６．７，１２６．６，１１７．７，１１７．３，１１４．９，１１４．５，１１３．２，１１３．１，８５．８，８５．１，６８．６，６７．４，６５．２，６３．３，５５．９，５３．４，４６．７，４６．０，４５．９，４５．８，４５．１，４４．７，４４．２，４４．１，４３．９，４３．７，４３．６，３８．４，３８．０，３６．９，３６．４，３６．３，３４．５，３４．１，３２．６，３２．５，２８．９，２７．７，２７．５，２６．２，２５．９，２５．８，２５．４，２５．１，２４．５，２４．１，２３．９，２３．６，２３．３。Ｃ５３Ｈ６４Ｆ１２Ｎ６ＮａＯ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：１１９５．４４、実測値：１１９５．２。
化合物５７の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（１４ｍＬ）中の化合物５６（１．００ｇ、０．８５２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジイソプロピルエチルアミン（０．７４２ｍＬ、４．２６ｍｍｏｌ）および２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．２４８ｍＬ、１．１１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で３０分間、次いで、アルゴン雰囲気下の室温で３０分間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾液を濃縮し、得られた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：４〜１００％ＥｔＯＡｃ）によって精製し、５７（８９２ｍｇ、０．６５０ｍｍｏｌ、７６％、Ｒｆ＝０．１８、ＥｔＯＡｃで展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．３４−９．５２（ｍ，１Ｈ），７．９２−７．９５（ｍ，１Ｈ），７．１６−７．３１（ｍ，９Ｈ），６．８３−６．８７（ｍ，４Ｈ），４．６２−４．６４（ｍ，１Ｈ），４．１１−４．１７（ｍ，１Ｈ），３．６５−３．７２（ｍ，９Ｈ），３．４９−３．５６（ｍ，５Ｈ），３．３０−３．４２（ｍ，９Ｈ），３．１５−３．２１（ｍ，３Ｈ），２．９５−３．０２（ｍ，３Ｈ），２．７２−２．７６（ｍ，２Ｈ），２．３７−２．４０（ｍ，２Ｈ），２．１０−２．２０（４Ｈ），１．７５−１．８７（ｍ，５Ｈ），１．０７−１．５４（ｍ，２２Ｈ）。３１Ｐ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，１６２ＭＨｚ）δ１４６．９３，１４６．７１，１４６．５１，１４６．２０。Ｃ６２Ｈ８１Ｆ１２Ｎ８ＮａＯ１１Ｐ（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：１３９５．５５、実測値：１３９５．２。
化合物５８の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中の化合物５６（１．０１ｇ、０．８６１ｍｍｏｌ）をＤＭＡＰ（３１４ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ）およびコハク酸無水物（１７１ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ）で処理し、次いで、室温で１６時間撹拌した。水による後処理なしで、粗混合物のカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中４％ＭｅＯＨ／４％Ｅｔ３Ｎ）によって、対応するトリエチルアンモニウム塩として化合物５８（１．１８ｇ、９９．８％、Ｒｆ＝０．ＣＨ２Ｃｌ２中２１、４％ＭｅＯＨ／４％Ｅｔ３Ｎで展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．５１−９．５８（ｍ，１Ｈ），８．０１−８．１０（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．３２（ｍ，９Ｈ），６．８４−６．８８（ｍ，４Ｈ），５．２２−５．３３（ｍ，１Ｈ），４．１８−４．１９（ｍ，１Ｈ），３．７２（ｓ，６Ｈ），３．５４−３．６２（ｍ，３Ｈ），３．３５−３．３７（ｍ，１０Ｈ），３．１８−３．２２（ｍ，３Ｈ），２．９９−３．０６（ｍ，３Ｈ），２．３４−２．４４（ｍ，６Ｈ），１．７４−２．２２（ｍ，９Ｈ），１．１０−１．５３（ｍ，１０Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７３．９，１７２．３，１７０．７，１７０．６，１６９．３，１６８．９，１５８．０，１５７．９，１５６．５，１５６．１，１５６．０，１５５．９，１５５．８，１５５．５，１５５．４，１５５．３，１５５．２，１５５．１，１４４．９，１４４．６，１３５．７，１３５．５，１３５．３，１２９．６，１２９．５，１２９．４，１２７．８，１２７．７，１２７．５，１２６．７，１２６．５，１２０．５，１１７．７，１１７．６，１１７．３，１１４．８，１１４．７，１１４．４，１１３．１，１１３．０，１１１．９，８５．９，８５．２，７２．６，６３．２，５４．９，５４．８，５２．１，５１．９，４６．７，４６．６，４６．５，４５．４，４３．６，３８．３，３６．８，３６．４，３４．４，３３．９，３３．０，３２．５，３２．４，２９．８，２９．７，２９．４，２８．９，２８．８，２７．７，２６．０，２５．９，２５．８，２５．７，２５．３，２５．１，２５．０，２４．４，２４．０，２３．５，２３．３，７．１１。Ｃ５７Ｈ６７Ｆ１２Ｎ６Ｏ１３（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値：１２７１．４６、実測値：１２７１．２。
化合物５９の合成：化合物５８（１．１５ｇ、０．８３７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８０ｍＬ）中に溶解した。ＨＢＴＵ（３５０ｍｇ、０．９２１ｍｍｏｌ）、次いで、ｉＰｒ２ＮＥｔ（０．７３０ｍＬ、４．１９ｍｍｏｌ）、および最後にＣＰＧ−ＮＨ２（Ｐｒｉｍｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＣＰＧ−５００、ＮＨ２負荷＝１４７μｍｏｌ／ｇ）（６．２７ｇ、０．９２１ｍｍｏｌ）を連続して添加した。混合物を室温で２．５時間震盪し、次いで、固体を濾過によって回収し、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）、次いで、５０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で洗浄し、真空内で乾燥させた。残存アミノ基を、１時間の撹拌によって、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／Ｅｔ３Ｎ（２５ｍＬ／７５ｍＬ／５ｍＬ）でキャップした。濾過、およびＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）、次いで５０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）での洗浄、次いで、一晩真空内での乾燥によって、化合物５９（６．５６ｇ、５３μｍｏｌ／ｇ）を得た。
実施例１２：合成後共役のためのスペルミンアジド誘導体
Figure 2017214383
化合物６３の合成：スペルミン６０（１１．２５ｇ、５５．６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５０ｍＬ）中に溶解した。次に、撹拌しながら、硫酸銅五水和物（１３９ｍｇ、０．５５６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１５．５ｍＬ、１１１．２ｍｍｏｌ）を溶液に添加した。混合物を氷浴で冷却し、次に、すでに報告されている方法２によって調製されたアセトニトリル（０．５５Ｍ、１００ｍＬ）中のトリフリックアジド６１の溶液を混合物にゆっくり添加した。反応混合物を室温まで温め、一晩処理した。ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（６０．７ｇ、２７８ｍｍｏｌ）を溶液にゆっくり添加し、反応混合物を２時間撹拌した。蒸発後、粗物質をＥｔＯＡｃおよびＨ２Ｏで抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１、Ｒｆ＝０．４６）によって精製し、６３（１３．１２ｇ、２４．８ｍｍｏｌ、４５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ６．７７（ｂｒｓ，１Ｈ），３．３０−３．３４（ｍ，２Ｈ），３．１１−３．１９（ｍ，８Ｈ），２．８６−２．９０（ｍ，２Ｈ），１．７１−１．７２（ｍ，２Ｈ），１．５４−１．５６（ｍ，２Ｈ），１．３７−１．３９（ｍ，２９Ｈ）。Ｃ２５Ｈ４８Ｎ６ＮａＯ６（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：５５１．３５、実測値：５５１．２。
（２）Ｙａｎ，Ｒ．Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｗｕ，Ｙ．，Ｚｈａｎｇ，Ｌ．Ｈ．，Ｙｅ，Ｘ．Ｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００５），４６，８９９３−８９９５。
化合物６４の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（３６ｍＬ）中の化合物６３（１．３７ｇ、２．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（４ｍＬ）を、氷浴で冷却しながらゆっくり添加した。混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物を蒸発させ、次いで、トルエンと共蒸発させた。残渣をエーテルで沈殿させ、白色固体（６４のＴＦＡ塩）を回収した。収率：９５０ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、６４％。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ３．４８（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），２．９３−２．９６（ｍ，１０Ｈ），１．６２−１．９３（ｍ，８Ｈ）。Ｃ１０Ｈ２５Ｎ６（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：２２９．２１、実測値：２２９．３。
化合物６５の合成：ピリジン（５ｍＬ）中の化合物６４（３２４ｍｇ、０．５６８ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（０．３６１ｍＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を氷浴で冷却しながらゆっくり添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２および飽和ＮａＨＣＯ３水溶液で抽出し、次いで、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾液を濃縮し、得られた粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝４：１〜１：１）によって精製し、６５（２１４ｍｇ、０．４１４ｍｍｏｌ、７３％、Ｒｆ＝０．３３、ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１で展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ９．４８−９．５３（ｍ，１Ｈ），３．３２−３．４３（ｍ，１０Ｈ），３．１８−３．２３（ｍ，２Ｈ），１．７５−１．８４（ｍ，４Ｈ），１．５１−１．５４（ｍ，４Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−７０．９２，−７０．９５，−７０．９８，−７１．０２，−７１．０５，−７１．１５，−７１．１８，−７７．２３，−７７．２６，−７７．３８，−７７．３８。Ｃ１０Ｈ２５Ｎ６（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：２２９．２１、実測値：２２９．３。
実施例１３
Figure 2017214383
化合物６８の合成：化合物６３に関して記載するように、化合物６６３から化合物６８を調製した。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ６．７３（ｂｒｓ，１Ｈ），３．０５−３．３３（ｍ，１８Ｈ），２．８６−２．８８（ｍ，２Ｈ），１．３６−１．７０（ｍ，５７Ｈ）。Ｃ４１Ｈ７８Ｎ８ＮａＯ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：８６５．５７、実測値：８６５．５。
（３）Ｍｉｌｌｅｒ，Ｋ．Ａ．，Ｓｕｒｅｓｈ Ｋｕｍａｒ，Ｅ．Ｖ．Ｋ．，Ｗｏｏｄ，Ｓ．Ｊ．，Ｃｒｏｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｄａｔｔａ，Ａ．，Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ａ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００５），４８，２５８９−２５９９。
化合物６９の合成：化合物６４に関して記載するように、化合物６８（２７５ｍｇ、０．３２６ｍｍｏｌ）から化合物６９を調製した。収率：２３５ｍｇ（０．２５７ｍｍｏｌ、７９％）。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）δ３．５０（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０９−３．１５（ｍ，１８Ｈ），２．０６−２．１０（ｍ，６Ｈ），１．９６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），１．７５−１．７７（ｍ，４Ｈ）。Ｃ１６Ｈ３９Ｎ８（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：３４３．３３、実測値：３４３．２。
実施例１４
Figure 2017214383
化合物７０の合成：偽ウリジンのＮ１位置におけるアルキル化のために、２'−デオキシ偽ウリジン類似体に関してＳｅｅｌａ ｅｔ ａｌ ．によって報告された方法を使用した４。１Ｍの重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝剤（ｐＨ８．５、７８０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（９４０ｍＬ）中の偽ウリジン（２０ｇ、８１．９ｍｍｏｌ）の溶液に、メチルアクリレートを滴下添加した。反応混合物を一晩撹拌した。１６時間後、ＴＬＣは、完全な反応を示した。溶媒を除去し、真空内で乾燥させ、白色発泡体を得た。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨ、Ｒｆ＝０．２３）によって精製し、７０（２６．６ｇ、８０．５ｍｍｏｌ、９８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ７．７７（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，１Ｈ），４．１５（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０５（ｔ，Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ），３．９８−４．０２（ｍ，２Ｈ），３．９１−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．８０（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，３．３Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，３．３Ｈｚ，１Ｈ），２．７３−２．７７（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＨ−ｄ４）δ１７３．１，１６５．４，１５２．５，１４５．８，１１２．９，８５．６，８１．５，７５．６，７２．６，６３．３，５２．５，４６．２，３３．７。Ｃ１３Ｈ１９Ｎ２Ｏ８（ＭＨ）＋に対する分子量、計算値：３３０．１１、実測値：３３１．０。
（４）Ｒａｍｚａｅｖａ，Ｎ．；Ｒｏｓｅｍｅｙｅｒ，Ｈ．；Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｐ．；Ｍｕｈｌｅｇｇｅｒ，Ｋ．；Ｂｅｒｇｍａｎｎ，Ｆ．；Ｖｏｎ ｄｅｒ Ｅｌｔｚ，Ｈ．；Ｓｅｅｌａ，Ｆ．Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２０００，８３，１１０８−１１２６。
化合物７１の合成：ＴＨＦ（１００ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２０ｍＬ）中の化合物７０（５．００ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）の溶液に、水酸化リチウム一水和物（１．０３ｇ、２５．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩撹拌した。さらなる水酸化リチウム一水和物（５００ｍｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、反応混合物をアンバーライトＩＲ−１２０（プラス）イオン交換樹脂で処理した。樹脂を濾過し、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏで洗浄した。濾液を蒸発させ、白色固体として化合物７１（４．７８ｇ、定量的に）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３４（ｓ，１Ｈ），７．７５（ｓ，１Ｈ），４．９２−４．９３（ｍ，１Ｈ），４．７０−４．７２（ｍ，１Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．８０−３．９３（ｍ，４Ｈ），３．６８−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．６１（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，３．２Ｈｚ，１Ｈ），３．４７（ｄｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．１７（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１７２．１，１６３．０，１５０．４，１４３．６，１１１．４，８３．２，７９．０，７３．７，７０．４，６１．３，４４．１，３２．７。Ｃ１２Ｈ１５Ｎ２Ｏ８（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値：３１５．０８、実測値：３１５．１。
化合物７２の合成：ＤＭＦ（１５０ｍＬ）中の化合物７１（４．７８ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＨＢＴＵ（６．８９ｇ、１８．１７ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１３．１９ｍＬ、７．５７ｍＬ）を添加した。１０分間の撹拌後、ＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中の化合物５１の溶液を添加した。反応混合物を１６時間撹拌した。水による後処理およびシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１０％）によって、化合物７２（７．５１ｇ、９．３８ｍｍｏｌ、６２％、Ｒｆ＝０．３０、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３４（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｂｒｓ，１Ｈ），７．６７（ｓ，１Ｈ），６．７６（ｂｒｓ，１Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７２−４．７５（ｍ，２Ｈ），４．４３（ｄ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），３．８１−３．９４（ｍ，４Ｈ），３．６８−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．５７−３．６２（ｍ，１Ｈ），３．４４−３．４９（ｍ，１Ｈ），３．０９（ｓ，８Ｈ），２．９９（ｄｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．８８（ｄｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４３（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），１．３７−１．５６（ｍ，３５Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６９．５，１６３．２，１５５．８，１５４．９，１５０．５，１４４．０，１１１．４，８３．５，７９．１，７８．６，７７．８，７３．８，７０．７，６１．５，５４．９，４６．７，４６．６，４６．２，４５．０，４４．６，４４．５，３７．６，３６．４，３４．３，２８．４，２８．２，２５．８，２５．７，２５．４，２５．３，２５．２，２２．４。Ｃ３７Ｈ６４Ｎ６ＮａＯ１３（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：８２３．４４、実測値：８２３．２。
化合物７４の合成：ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中の７２（２．４８ｇ、３．１０ｍｍｏｌ）の溶液に、トリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を氷浴で冷却しながらゆっくり添加した。反応混合物を１０分間、次いで、室温で１時間撹拌し続けた。溶媒を除去し、トルエンと共蒸発させ、真空内で乾燥させ、粗物質７３を得た（Ｃ２２Ｈ４１Ｎ６Ｏ７（Ｍ＋Ｈ）＋に対する分子量、計算値：５０１．３０、実測値：５０１．２）。粗物質をピリジン（３０ｍＬ）中に溶解し、次いで、トリフルオロ酢酸無水物（２．１５ｍＬ、１５．５ｍｍｏｌ）を氷浴で冷却しながらゆっくり添加した。反応混合物を１６時間撹拌し、次いで、Ｈ２Ｏ（１５ｍＬ）の添加によって反応停止処理をした。１時間の撹拌後、混合物を蒸発させ、真空内で乾燥させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜２０％ＭｅＯＨ）によって化合物７４（１．３４ｇ、１．７０ｍｍｏｌ、５５％、Ｒｆ＝０．５６、ＣＨ２Ｃｌ２中２０％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３５（ｓ，１Ｈ），９．４５−９．５３（ｍ，１Ｈ），８．００−８．０８（ｍ，１Ｈ），７．６６（ｓ，１Ｈ），４．９２（ｂｒｓ，１Ｈ），４．７４（ｂｒｓ，１Ｈ），４．４２（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，１Ｈ），３．８３−４．１０（ｍ，６Ｈ），３．５８−３．７１（ｍ，２Ｈ），３．３４−３．４８（ｍ，１０Ｈ），３．１９−３．２４（ｍ，２Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），１．５２−１．８２（ｍ，８Ｈ）．１９ＦＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−６８．１８，−６８．１９，−６８．２４，−６８．２７，−６８．３１，−６８．３８，−６８．４１，−７４．４７，−７４．５０，−７４．６３。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１６９．４，１６９．３，１６３．０，１５０．４，１４６．０，１４３．６，１４０．９，１２５．４，１１１．３，８３．３，７８．９，７３．７，７０．５，６１．４，４６．８，４６．７，４６．６，４６．０，４５．８，４５．６，４５．０，４４．７，４４．６，４４．５，４４．２，３６．８，３６．４，３６．１，３５．７，３４．２，３４．１，２８．５，２７．７，２６．５，２５．８，２５．４，２５．１，２３．５，２３．３。Ｃ２８Ｈ３７Ｆ９Ｎ６ＮａＯ１０（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：８１１．２３、実測値：８１１．２。
化合物７５の合成：ピリジン（４ｍＬ）中の化合物７４（４５０ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＴｒＣｌ（１９３ｍｇ、０．５７１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、次いで全て蒸発させた。粗物質をＣＨ２Ｃｌ２およびＨ２Ｏで抽出し、無水Ｎａ２ＳＯ４で蒸発させ、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（ＣＨ２Ｃｌ２中０〜１０％ＭｅＯＨ）によって精製し、７５（３００ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ、４８％、Ｒｆ＝０．４４、ＣＨ２Ｃｌ２中１０％ＭｅＯＨで展開）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ１１．３３（ｓ，１Ｈ），９．４２−９．５３（ｍ，１Ｈ），７．９１−８．００（ｍ，１Ｈ），７．１８−７．４３（ｍ，１０Ｈ），６．８７−６．８９（ｍ，４Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，４．６Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），４．５０−４．５１（ｍ，１Ｈ），３．７９−３．９２（ｍ，３Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．５３−３．７１（ｍ，２Ｈ），２．９８−３．３７（ｍ，１４Ｈ），２．３６（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ），１．４８−１．８２（ｍ，８Ｈ）。１９Ｆ ＮＭＲ（３７６ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ−６８．１７，−６８．１８，−６８．１９，−６８．２４，−６８．２８，−６８．３１，−６８．３４，−６８．３７，−６８．４０，−７４．４５，−７４．４８，−７４．６０，−７４．６１。Ｃ４９Ｈ５５Ｆ９Ｎ６ＮａＯ１２（Ｍ＋Ｎａ）＋に対する分子量、計算値：１１１３．３６、実測値：１１１４．２；Ｃ４９Ｈ５４Ｆ９Ｎ６Ｏ１２（Ｍ−Ｈ）−に対する分子量、計算値：１０８９．３７、実測値：１０８９．３。
実施例１５
Figure 2017214383
化合物３０７の合成：ジリノレイルアルコール６ｂ（５．６０ｇ、１０．５０ｍｍｏｌ）およびＤＳＣ（４．００ｇ、１５．８７ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に取り込み、氷−水混合物で冷却した。ＴＥＡ（４．２７ｍｌ、３当量）を添加し、混合物を２日間撹拌した。反応をＴＬＣによって監視した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、水で洗浄し（２回）、硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去し、残渣を一晩乾燥させた。この物質をいかなる精製なしで次の反応にそのまま使用した。ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の上記の反応からの化合物３０５（１０．５０ｍｍｏｌ）およびヒドロキシルプロリン誘導体５５（５．５９ｇ、１０．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、ピリジン（１０ｍＬ）を添加し、混合物を周囲温度で一晩撹拌した。反応をＴＬＣによって監視し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭ中に溶解し、水、重炭酸ナトリウム溶液、および塩水で洗浄した。粗生成物をクロマトグラフィ（３０〜８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、必要な生成物（６．６４ｇ、５４％）を得た。ＭＳ：Ｃ７０Ｈ１０６Ｎ２Ｏ７に対して計算された分子量：１０８６．８０実測値：１１０９．７９（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物３０８の合成：ＤＣＭ中の化合物３０７（１．４２ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＡＰ（０．４７５ｇ、３．９０ｍｍｏｌ）、続いてコハク酸無水物（０．２０１ｇ、２当量）を添加し、反応をアルゴン下の室温で一晩継続した。反応終了後、反応を氷冷温度下で冷却し、冷却した反応混合物を１０％の冷たいクエン酸溶液、続いて、冷水で洗浄した。混合有機物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１０％）：トリエチルアミン（０．５％）を使用した小さいシリカゲル床を用いて混合物を精製し、純粋な３０８（１．５０ｇ、定量的収率）を得た。ＭＳ：Ｃ７４Ｈ１１０Ｎ２Ｏ１０に対して計算された分子量：１１８６．８２、実測値：１１８５．７８（Ｍ−１）。
ＣＰＧ誘導体３０９の合成：ＤＭＦ中の化合物３０８（１．５０ｇ、１．３０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（０．７００ｍｌ、３．０当量）、ＨＢＴＵ（０．７４０ｇ、１．５当量）、続いて長鎖アルキルアミノＣＰＧ（１０ｇ、負荷：１２４μｍｏｌ／ｇ）を添加し、震盪を４時間継続した。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（×２）、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（×２）、ＤＣＭ（×２）、最後にエーテル（×２）で洗浄し、真空で乾燥させた。キャッピング：乾燥した樹脂をピリジン：無水酢酸（２０％）混合物（１００ｍｌ）の溶液中にキャップし、震盪を４５分間継続した。終了後、樹脂を濾過し、ＤＣＭ（×２）、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（×２）、ＤＣＭ（×２）、最後にエーテル（×２）で洗浄し、真空で乾燥させた（負荷：７３μｍｏｌ／ｇ）。
実施例１６
Figure 2017214383
化合物３１０の合成：ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の化合物３０７（３．１２ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１．００ｍＬ、２当量）、続いてクロロアミダイト試薬（０．８５０ｍｌ、１．３０当量）を添加し、混合物をアルゴン下で撹拌した。反応をＴＬＣによって監視し、１５分間後、混合物をＤＣＭで希釈し、重炭酸ナトリウム溶液、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をクロマトグラフィ（１％ＴＥＡを有する４０〜８０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、必要な化合物（２．８６ｇ、７８％）を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ１５１．８７，１５１．６９，１５１．５２，１５１．２０。
実施例１７
Figure 2017214383
化合物３１３の合成：ＤＣＭ中の化合物３１１（６．２８ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＤＩＰＥＡ（８．３ｍｌ、４５．０ｍｍｏｌ、３．０当量）の溶液に、ＤＣＭ中の化合物３１２（６．３３ｇ、１５．０ｍｍｏｌ、１．０当量）の活性化エステルの溶液を室温で添加し、反応を４時間継続し、反応終了後、溶媒を蒸発させ、勾配としてヘキサン：酢酸エチル：トリエチルアミン（０．５％）を使用したシリカゲル上で直接精製し、９．４７ｇ（８７％）の純粋生成物３１３を得た。Ｍｓ：Ｃ４０Ｈ４２Ｎ２Ｏ７Ｓ２に対する計算質量：７２６．２実測値：７４９．２（Ｍ＋Ｎａ）。
化合物３１４の合成：ＤＣＭ中の化合物３１３（９．４６ｇ、１３．０３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＤＭＡＰ（４．７６ｇ、３９．０９ｍｍｏｌ、３．０当量）、続いてコハク酸無水物（２．６ｇ、２６．０６ｇ、２．０当量）を添加し、反応をアルゴン下の室温で一晩継続した。反応終了後を氷冷温度下で冷却し、冷却した反応混合物を１０％クエン酸溶液、続いて冷水で洗浄した。混合有機物を塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させ、勾配としてＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１０％）：トリエチルアミン（０．５％）を使用した小さいシリカゲル床を用いて混合物を精製し、純粋な１０．７ｇ（定量的収率）の化合物３１４を得た。ＭＳ：Ｃ４４Ｈ４６Ｎ２Ｏ１０Ｓ２に対する計算質量：８２６．２、実測値：８２６．２。
化合物３１５の合成（ＣＰＧ−ＮＨ２への負荷）：ＤＭＦ中の化合物３１４（１０．６５ｇ、１２．９ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（６．９８ｍｌ、３７．９２ｍｍｏｌ、３．０当量）、ＨＢＴＵ（７．１９ｇ、１８．９６ｍｍｏｌ、１．５当量）、続いてＣＰＧ−ＮＨ２（１０５ｇ、１３．０２ｍｍｏｌ、１．０１当量、負荷：１２４μｍｏｌ／ｇ）を添加し、震盪を４時間継続した。樹脂を濾過し、ＤＣＭ（×２）、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（×２）、ＤＣＭ（×２）、最後にエーテル（×２）で洗浄し、真空で乾燥させた。キャッピング：乾燥した樹脂をピリジン：無水酢酸（２０％）混合物（４００ｍｌ）の溶液中にキャップし、震盪を４５分間継続した。終了後、樹脂を濾過し、ＤＣＭ（×２）、ＤＣＭ中の１０％ＭｅＯＨ（×２）、ＤＣＭ（×２）、最後にエーテル（×２）で洗浄し、真空で乾燥させ、樹脂３１５（１１０ｇ、負荷：６６μｍｏｌ／ｇ）を得た。
実施例１８
Figure 2017214383
化合物３１６の合成：ＤＣＭ（５０ｍＬ）中の化合物３１３（５．３６、７．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（３．３０ｍＬ、２．５当量）、続いてクロロアミダイト試薬（２．１４ｍｌ、１．３０当量）を添加し、混合物をアルゴン下で撹拌した。反応をＴＬＣによって監視し、１５分後、混合物をＤＣＭで希釈し、重炭酸ナトリウム溶液、水で洗浄し、乾燥させた。粗生成物をクロマトグラフィ（１％ＴＥＡを有する４０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）によって精製し、必要な化合物（５．６３、８２％）を得た。３１Ｐ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）ｄ１５１．９２，１５１．７４，１５１．５３，１５１．２８。
実施例１９：スペルミンおよびコレステロールオリゴヌクレオチド共役の合成
Figure 2017214383
実施例２に概説されるように、標準的なホスホラミダイト化学を使用した、４０μｍｏｌスケールのＡＢＩ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置上で、オリゴヌクレオチド（Ａ−４０８６７：ＡＡＵＣｕｕＡｕＡｕｕｕＧＡＵＣｃＡＡｓＱ９４Ｌ１０（標的ＡｐｏＢ）を合成した。次いで、固体支持体をアセトニトリル中の０．５Ｍのピペルジンで５〜１０分間処理し、続いてアセトニトリルで３回洗浄した。固体支持体からの開裂および核酸塩基脱保護を、５５℃で５時間、アンモニア／エタノールの３：１の混合物で行った。反応混合物を冷却および濾過し、支持体を３倍の容積のＤＭＳＯで洗浄した。１．５倍の容積のＴＥＡ３ＨＦを反応混合物に添加し、４０℃で１．５時間加熱した。粗生成物を逆相ＨＰＬＣで精製し、サイズ排除カラムで脱塩した。計算ＭＷ：８０１０．８、実測ＭＷ：８００９．１。
実施例２０：オリゴヌクレオチドへのヒドラゾン連結とのＤＬｉｎｋ−ＤＭＡの共役
Figure 2017214383
実施例２に概説される標準的なプロトコルを使用して、オリゴヌクレオチド（Ａ３０８６１）を合成および精製した。精製されたＡ３０８６１を５０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝剤（ｐＨ＝７）に溶解し、２〜３当量のＴＣＥＰ（水中０．１Ｍ）を添加した。４０℃で３０分間、または室温で一晩インキュベートした。Ｃ１８カラム上で過剰なＴＣＥＰを除去し、２５％アセトニトリルを有する５０ｍＭのＴＥＡＡ緩衝剤にＲＮＡを回収した。２〜３当量のＤＬｉｎｋ−ＤＭＡピリジルジスルフィドを、ＤＭＳＯおよびアセトニトリルの１：１の混合物中に溶解し、ＲＮＡ溶液に添加した。カップリング反応を室温で３０分間実施した。計算ＭＷ：８０５６．１、実測ＭＷ：８０５３．８（主要不純物：８０３８．６）。
実施例２１：チオール修飾オリゴヌクレオチドとの活性化ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡの合成後共役
Figure 2017214383
実施例２に概説される標準的なプロトコルを使用して、オリゴヌクレオチド（４０３７７．１：ＡｃＡｕＧＡＡＧｃＡＧｃＡＣＧＡＣｕＵｄＴｓｄＴＱ８Ｌ９９，Ｑ８，＝Ｈｙｐ−アミノ，Ｌ９９＝Ｈｙｐ−Ｓ−Ｓ−アミノ）を合成および精製した。次いで、ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡをオリゴヌクレオチドと以下のように共役した。
ジスルフィド結合の還元：オリゴヌクレオチド（１０ｍｇ）を１．０ｍｌの０．５Ｍの酢酸アンモニウム中に溶解した。０．２ＭのＴＣＥＰ溶液（２８０ｕｌ）を添加し、４５℃で９０分間加熱ブロックに配置した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ Ｎａｐ−２５カラムを使用して、過剰なＴＣＥＰを除去した。イオン交換分析ならびにＬＣ−ＭＳ分析によって、化合物の同定を確認した。
酸開裂可能なＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡとのチオール修飾オリゴヌクレオチドの共役。チオール含有試料を４５０μｌの０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ８．５）中に溶解した。溶解されたオリゴヌクレオチドに、５０μｌのＤＭＦ中の活性化された酸開裂可能なＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ（１０当量）を添加し、反応混合物を室温で一晩震盪した。反応の進行をＨＰＬＣによって分析した。共役されたオリゴヌクレオチドのＬＣ−ＭＳ分析は、進行中である。
実施例２２
Figure 2017214383
アミノＲＮＡ３５０を塩基性ｐＨ下で化合物１５で処理し、化合物３５１を得る。それを精製し、対応する相補的な配列でアニールし、二本鎖３５２を得る。この化合物を全ての生物学的実験に使用する。
実施例２３
Figure 2017214383
チオールＲＮＡ３５３を塩基性ｐＨ下で化合物１９で処理し、化合物３５４を得る。それを精製し、対応する相補的な配列でアニールし、二本鎖３５５を得る。この化合物を全ての生物学的実験に使用する。
実施例２４
Figure 2017214383
二官能性ＲＮＡ３５７を対応する相補的な鎖でアニールし、二本鎖３５８を得る。この化合物を、最初に塩基性ｐＨ下で化合物５０６で処理し、中間体を得る。次いで、中間体をＮＨＳエステル１１４で処理し、最終化合物３５９を得る。それを精製し、全ての生物学的実験に使用する。
実施例２５
Figure 2017214383
報告された手順（Ｐａｒａｍｏｎｏｖ，Ｓ．Ｅ．；Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ，Ｅ．Ｍ．；Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ，Ｔ．Ｔ．；Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．；Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃ．；Ｄａｓｈｅ，Ｊ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊｅａｎ Ｍ．Ｊ．Ｆｕｌｌｙ Ａｃｉｄ−Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｏｌｙａｃｅｔａｌ Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８），１９（４），９１１−９１９）を使用して、ケタール３６６を合成した。最初に１当量のトリフルオロ酢酸エチルで、続いて１当量のＣｂｚ−ＯＳｕでジアミンを処理することによって、１つのポット内で、２つのステップで、ケタールの過渡保護を実施し、カラム精製後、８０％の収率でジ保護誘導体３６７を得た。保護アミン３６７を水性ＬｉＯＨで処理することによって、定量的収率でアミン３６８を得た。保護葉酸１１３（１ｇ）とこのアミン３６８（０．５ｇ）とのカップリングによって、カップリングされた生成物３６９（１．１ｇ）を得、水素化によって、定量的収率でアミン３７０を得た。マレイミドプロピオン酸３７１とアミン３７０のカップリングを実施し、良好な収率でカップリングされた生成物３７２を得た。ＴＨＦ中の氷冷ＬｉＯＨ水溶液を使用して、３７２における保護基の全ての最終脱保護を実施し、橙色固体として前駆体３７３を得た。
実施例２６
Figure 2017214383
別の実施形態では、ジメチルアセタール基をシクロペンテニル基で置き換えた。以下のスキームに示されるように、ＴＦＡ誘導体３７５を介して、ケタール３７４をモノ保護アミン３７６に転換する。アミン３７６を酸５００で処理することによって、カップリングされた生成物３７７を得、それを水素化し、アミン３７８を得、それをマレイミド３７９とカップリングし、脱保護し、誘導体３８１を得る。
実施例２７
Figure 2017214383
別の実施形態では、ジメチルアセタール基をシクロヘキシル基で置き換えた。以下のスキームに示されるように、ＴＦＡ誘導体３８３を介して、ケタール３８２をモノ保護アミン３８４に転換する。アミン３８４を酸５００で処理することによって、カップリングされた生成物３８５を得、それを水素化し、アミン３８６を得、それをマレイミド３８７とカップリングし、脱保護し、誘導体３８９を得る。
実施例２８
Figure 2017214383
別の実施形態では、ジメチルアセタール基をメチルｔ−ブチル基で置き換えた。以下のスキームに示されるように、ＴＦＡ誘導体３９１を介して、ケタール３９０をモノ保護アミン３９２に転換する。アミン３９２を酸５００で処理することによって、カップリングされた生成物３９３を得、それを水素化し、アミン３９４を得、それをマレイミド３９５とカップリングし、脱保護し、誘導体３９７を得る。
実施例２９
Figure 2017214383
化合物４０３を上で概説するように調製し、次いで、核酸に共役する。
実施例３０
Figure 2017214383
化合物４０７を上記に概説するように調製し、次いで、核酸に共役する。
実施例３１
Figure 2017214383
化合物４１１を上記に概説するように調製し、次いで、核酸に共役する。
実施例３２
Figure 2017214383
化合物４１５を上記に概説するように調製し、次いで、核酸に共役する。
実施例３３
Figure 2017214383
化合物４１６、４１７、４１８、４１９を上記に概説するように調製し、次いで、核酸に共役する。
化合物４１６、４１７、４１８、４１９を上記に概説するように調製し、次いで、核酸
に共役する。
他の実施態様
１．核酸と、少なくとも１つのエンドソーム分解性成分と、少なくとも１つの標的リガンドとを含み、下記式を有するモジュラー構成物：
Figure 2017214383
 式中、
Figure 2017214383
は、核酸であり、
Ｅは、エンドソーム分解性成分であり、
Ｌは、標的リガンドであり、
ｘは存在ごとに独立して、０または１を表し、
ｙは存在ごとに独立して、１、２、３、４、５、または６を表し、
ｚは存在ごとに独立して、０、１、２、３、４、５、または６を表し、
Ａは、
Figure 2017214383
 から成る群より選択される連結部分であり、式中、
Ｚ １ は存在ごとに独立して、ＯまたはＳを表し、
Ｚ ２ は存在ごとに独立して、−ＯＨ、−ＯＭ、−Ｏアルキル、−Ｏアリール、−Ｏアラルキル、−ＳＨ、−ＳＭ、−サルキル、−サリール、−アラルキル、−Ｎ（Ｒ ３ ）Ｒ ４ 、−Ｃ（Ｒ １１ ） ２ ） ｍ Ｎ（Ｒ １１ ） ２ 、−Ｎ（Ｒ １１ ）（Ｃ（Ｒ １１ ） ２ ） ｍ Ｎ（Ｒ １１ ） ２ 、またはアルキルを表し、
Ｒ ３ およびＲ ４ は独立して、Ｈもしくはアルキルを表すか、またはＲ ３ およびＲ ４ は一緒になって、３、４、５、６、もしくは７員環を形成し、
Ｒ １１ は存在ごとに独立して、水素またはアルキルを表し、
Ｍは存在ごとに独立して、＋１の総電荷を有するアルカリ金属または遷移金属を表し、
Ｒ ８ は存在ごとに独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキル、アシル、シリル、核酸への結合、または、Ｂ １０ と組み合わされる場合には連結部分間の結合を表し、
Ｂ １０ は、Ａと核酸との間の結合、または、Ｒ ８ と組み合わされる場合には連結部分間の結合を表し、
Ａ'は、式：−［（Ｐ−Ｑ−Ｒ） ｑ −Ｘ−（Ｐ'−Ｑ'−Ｒ'） ｑ' ］ ｑ" −Ｔ−を有する直接結合またはテザーであり、式中、
Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ'、およびＲ'はそれぞれ独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ ２ 、ＣＨ ２ ＮＨ、ＣＨ ２ Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒ ａ ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒ ａ ）−ＮＨ−、Ｃ（Ｏ）−（置換されたまたは未置換のアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2017214383
 シクリル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
Ｒ ５０ およびＲ ５１ は独立して、アルキル、置換アルキルであるか、またはＲ ５０ およびＲ ５１ が一緒になって環式環を形成し、
ＱおよびＱ'はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ ２ ） ｎ −、−Ｃ（Ｒ ４０ ）（Ｒ ４１ ）（ＣＨ ２ ） ｎ −、−（ＣＨ ２ ） ｎ Ｃ（Ｒ ４０ ）（Ｒ ４１ ）−、−（ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ） ｍ ＣＨ ２ ＣＨ ２ −、−（ＣＨ ２ ＣＨ ２ Ｏ） ｍ ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨ−、アリール、ヘテロアリール、シクリル、またはヘテロシクリルであり、
Ｘは、存在しないか、または開裂可能な連結基であり、
Ｒ ａ は、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり、
Ｒ ４０ およびＲ ４１ はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ ３ 、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（Ｒ Ｘ ） ２ であり、
Ｒ Ｘ は、存在ごとに、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
ｑ、ｑ'、およびｑ”はそれぞれ独立して、０〜３０であり、
ｎは、存在ごとに、１〜２０の整数であり、
ｍは、存在ごとに、０〜５０の整数であり、
ＥおよびＬがそれぞれ、少なくとも１つは存在することを条件とする。
２．下記式を有する、実施態様１記載の構成物：
Figure 2017214383
 ３．下記式を有する、実施態様１記載の構成物：
Figure 2017214383
 式中、各ｚは独立して、１、２、３、４、５、または６である。
４．下記式を有する、実施態様１記載の構成物：
Figure 2017214383
 式中、ｚは、１、２、３、４、５、または６であるか、あるいは、０、１、２、３、４、５、または６である。
５．前記Ａ'テザーが、アルキルジラジカル、ヘテロアルキルジラジカル、アルケニルジラジカル、アルキニルジラジカル、アルキルアルキニルジラジカル、アミノアルキルジラジカル、チオエーテル、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ） ２ −、−Ｃ（Ｒ） ２ −であるか、または、
Figure 2017214383
 から成る群より選択される式を有し、式中、
ｍは存在ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、または８を表し、
ｍ １ は存在ごとに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、または８を表し、
ｐは存在ごとに独立して、１、２、３、または４を表し、
Ｒは存在ごとに独立して、水素またはアルキルを表す、実施態様１記載の構成物。
６．前記Ａ'テザーが、下記から成る群より選択される、実施態様１記載の構成物。
Figure 2017214383
 ７．前記エンドソーム分解性成分が、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、直鎖または分岐鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖および分岐鎖ポリアミン、カチオン性直鎖および分岐鎖ポリアミン、ポリカルボン酸塩、ポリカチオン、マスク化オリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール、ポリケタール、オルトエステル、マスク化または非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有する直鎖または分岐鎖ポリマー、マスク化または非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣薬、ｐＨ感受性ペプチド、ならびに天然または合成融合性脂質から成る群より選択される、実施態様１記載の構成物。
８．前記エンドソーム分解性成分が、ポリアニオン性ペプチドまたはポリアニオン性ペプチド模倣薬である、実施態様１記載の構成物。
９．前記融合性脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オル（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）、およびＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（ＸＴＣ）から成る群より選択される、実施態様７記載の構成物。
１０．前記エンドソーム分解性成分が、ＧＡＬＡ、ＥＡＬＡ、ＩＮＦ−７、Ｉｎｆ ＨＡ−２、ｄｉＩＮＦ−７、ｄｉＩＮＦ３、ＧＬＦ、ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３、ＩＮＦ−５、ＪＴＳ−１、ｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０、ＫＡＬＡ、ＨＡ、メリチン、およびヒスチジンに富んだペプチドＣＨＫ ６ ＨＣから成る群より選択される、実施態様１記載の構成物。
１１．前記標的リガンドが、抗体、受容体のリガンド結合部分、受容体のためのリガンド、アプタマー、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質、葉酸、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン、炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスフォネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、血漿タンパク結合を強化する親油性部分、ステロイド、胆汁酸、ビタミンＢ １２ 、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣薬、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、葉酸、ならびにそれらの類似体および誘導体から成る群より選択される、実施態様１記載の構成物。
１２．前記標的リガンドが、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ２、およびＧａｌＮＡｃ３、コレステロール、葉酸、ならびにそれらの類似体および誘導体から成る群より選択される、実施態様１１記載の構成物。
１３．前記核酸が、ｉＲＮＡ剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、活性化ＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、アプタマー、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ模倣体、ａｎｔｉｍｉｒ、活性化ＲＮＡ（ＲＮＡａ）、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、Ｕ１アダプター、およびリボザイムから成る群より選択される、実施態様１記載の構成物。
１４．前記核酸が少なくとも１つの糖修飾を含有する、実施態様１記載の構成物。
１５．前記糖修飾が２'修飾である、実施態様１４記載の構成物。
１６．前記２'修飾が、２'−Ｏ−Ｍｅ（２'−Ｏ−メチル）、２'−Ｏ−ＭＯＥ（２'−Ｏ−メトキシエチル）、２'−Ｆ、２'−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２'−Ｏ−ＮＭＡ）、２'−ＮＨ ２ 、２'−Ｏ−アミン、２'−ＳＨ、２'−Ｓ−アルキル、２'−Ｏ−ＣＨ ２ −（４'−Ｃ）（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−ＣＨ ２ ＣＨ ２ −（４'−Ｃ）（ＥＮＡ）、２'−Ｏ−アミノプロピル（２'−Ｏ−ＡＰ）、２'−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２'−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２'−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２'−Ｏ−ＤＭＡＰ）、および２'−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２'−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）から成る群より選択される、実施態様１５記載の構成物。
１７．前記核酸が、少なくとも１つの骨格修飾を含有する、実施態様１記載の構成物。
１８．前記骨格修飾が、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、ホスホネート、アルキルホスホネート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンアミノカルボニル、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ（ＭＤＨ）、およびメチレンオキシメチルイミノから成る群より選択される、実施態様１７記載の構成物。
１９．前記核酸が、少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む、実施態様１記載の構成物。
２０．前記核酸塩基修飾が、ジフルオロトリル、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、２−（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ ２ −置換プリン、Ｎ ６ −置換プリン、およびＯ ６ −置換プリンから成る群より選択される、実施態様１９記載の構成物。
２１．前記核酸が、標的遺伝子の発現を下方制御する、実施態様１記載の構成物。
２２．前記核酸が、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を下方制御する、実施態様２１記載の構成物。
２３．前記核酸が一本鎖オリゴヌクレオチドである、実施態様１記載の構成物。
２４．前記核酸がヘアピンオリゴヌクレオチドである、実施態様１記載の構成物。
２５．前記核酸が二本鎖オリゴヌクレオチドである、実施態様１記載の構成物。
２６．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、前記核酸の同じ末端にある、実施態様１記載の構成物。
２７．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、前記核酸の反対側の末端にある、実施態様１記載の構成物。
２８．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドのうちの一方が、前記核酸の末端にあり、他方は、前記核酸の内部非末端位置にある、実施態様１記載の構成物。
２９．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドの両方が、前記核酸の内部非末端位置にある、実施態様１記載の構成物。
３０．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが両方、同一鎖にある、実施態様２５記載の構成物。
３１．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、異なる鎖にある、実施態様２５記載の構成物。
３２．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端に位置する、実施態様３１記載の構成物。
３３．前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの反対側の末端に位置する、実施態様３１記載の構成物。
３４．前記テザーが、少なくとも１つのレドックス開裂可能な連結基を含む、実施態様１記載の構成物。
３５．前記テザーが、少なくとも１つのｐＨ感受性成分を含む、実施態様１記載の構成物。
３６．モジュラー構成物を細胞に送達する方法であって、
（ａ）細胞に実施態様１記載のモジュラー構成物を接触させ、
（ｂ）前記モジュラー構成物を前記細胞に取り込ませる、
各工程を有してなる方法。
３７．前記標的リガンドが、前記核酸を前記細胞内に蓄積させるのに十分な透過性および滞留性を提供する、実施態様３６記載の方法。
３８．インビトロで実施される、実施態様３６記載の方法。
３９．インビボで実施される、実施態様３６記載の方法。
４０．エクスビボで実施される、実施態様３６記載の方法。
４１．１つ以上の遺伝子の発現を阻害する方法であって、１つ以上の細胞に、有効量の実施態様１記載のモジュラー構成物を接触させる工程を有してなり、前記有効量が、前記１つ以上の遺伝子の発現を抑制する量である、方法。

Claims (41)

  1. 核酸と、少なくとも１つのエンドソーム分解性成分と、少なくとも１つの標的リガンドとを含み、下記式を有するモジュラー構成物：
    Figure 2017214383
     式中、
    Figure 2017214383
    は、核酸であり、
    Ｅは、エンドソーム分解性成分であり、
    Ｌは、標的リガンドであり、
    ｘは存在ごとに独立して、０または１を表し、
    ｙは存在ごとに独立して、１、２、３、４、５、または６を表し、
    ｚは存在ごとに独立して、０、１、２、３、４、５、または６を表し、
    Ａは、
    Figure 2017214383
     から成る群より選択される連結部分であり、式中、
    Ｚ１は存在ごとに独立して、ＯまたはＳを表し、
    Ｚ２は存在ごとに独立して、−ＯＨ、−ＯＭ、−Ｏアルキル、−Ｏアリール、−Ｏアラルキル、−ＳＨ、−ＳＭ、−サルキル、−サリール、−アラルキル、−Ｎ（Ｒ３）Ｒ４、−Ｃ（Ｒ１１）２）ｍＮ（Ｒ１１）２、−Ｎ（Ｒ１１）（Ｃ（Ｒ１１）２）ｍＮ（Ｒ１１）２、またはアルキルを表し、
    Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈもしくはアルキルを表すか、またはＲ３およびＲ４は一緒になって、３、４、５、６、もしくは７員環を形成し、
    Ｒ１１は存在ごとに独立して、水素またはアルキルを表し、
    Ｍは存在ごとに独立して、＋１の総電荷を有するアルカリ金属または遷移金属を表し、
    Ｒ８は存在ごとに独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキル、アシル、シリル、核酸への結合、または、Ｂ１０と組み合わされる場合には連結部分間の結合を表し、
    Ｂ１０は、Ａと核酸との間の結合、または、Ｒ８と組み合わされる場合には連結部分間の結合を表し、
    Ａ'は、式：−［（Ｐ−Ｑ−Ｒ）ｑ−Ｘ−（Ｐ'−Ｑ'−Ｒ'）ｑ'］ｑ"−Ｔ−を有する直接結合またはテザーであり、式中、
    Ｐ、Ｒ、Ｔ、Ｐ'、およびＲ'はそれぞれ独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｏ；ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、Ｃ（Ｏ）−（置換されたまたは未置換のアルキル）−ＮＨ−、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
    Figure 2017214383
     シクリル、ヘテロシクリル、アリール、またはヘテロアリールであり、
    Ｒ５０およびＲ５１は独立して、アルキル、置換アルキルであるか、またはＲ５０およびＲ５１が一緒になって環式環を形成し、
    ＱおよびＱ'はそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、−（ＣＨ２）ｎ−、−Ｃ（Ｒ４０）（Ｒ４１）（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＣ（Ｒ４０）（Ｒ４１）−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−、アリール、ヘテロアリール、シクリル、またはヘテロシクリルであり、
    Ｘは、存在しないか、または開裂可能な連結基であり、
    Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖であり、
    Ｒ４０およびＲ４１はそれぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＯＨ、ＳＨ、またはＮ（ＲＸ）２であり、
    ＲＸは、存在ごとに、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、またはベンジルであり、
    ｑ、ｑ'、およびｑ”はそれぞれ独立して、０〜３０であり、
    ｎは、存在ごとに、１〜２０の整数であり、
    ｍは、存在ごとに、０〜５０の整数であり、
    ＥおよびＬがそれぞれ、少なくとも１つは存在することを条件とする。
  2. 下記式を有する、請求項１記載の構成物：
    Figure 2017214383
  3. 下記式を有する、請求項１記載の構成物：
    Figure 2017214383
     式中、各ｚは独立して、１、２、３、４、５、または６である。
  4. 下記式を有する、請求項１記載の構成物：
    Figure 2017214383
     式中、ｚは、１、２、３、４、５、または６であるか、あるいは、０、１、２、３、４、５、または６である。
  5. 前記Ａ'テザーが、アルキルジラジカル、ヘテロアルキルジラジカル、アルケニルジラジカル、アルキニルジラジカル、アルキルアルキニルジラジカル、アミノアルキルジラジカル、チオエーテル、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｒ）２−であるか、または、
    Figure 2017214383
     から成る群より選択される式を有し、式中、
    ｍは存在ごとに独立して、１、２、３、４、５、６、７、または８を表し、
    ｍ１は存在ごとに独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、または８を表し、
    ｐは存在ごとに独立して、１、２、３、または４を表し、
    Ｒは存在ごとに独立して、水素またはアルキルを表す、請求項１記載の構成物。
  6. 前記Ａ'テザーが、下記から成る群より選択される、請求項１記載の構成物。
    Figure 2017214383
  7. 前記エンドソーム分解性成分が、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、直鎖または分岐鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、直鎖および分岐鎖ポリアミン、カチオン性直鎖および分岐鎖ポリアミン、ポリカルボン酸塩、ポリカチオン、マスク化オリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール、ポリケタール、オルトエステル、マスク化または非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有する直鎖または分岐鎖ポリマー、マスク化または非マスク化カチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマー、ポリアニオン性ペプチド、ポリアニオン性ペプチド模倣薬、ｐＨ感受性ペプチド、ならびに天然または合成融合性脂質から成る群より選択される、請求項１記載の構成物。
  8. 前記エンドソーム分解性成分が、ポリアニオン性ペプチドまたはポリアニオン性ペプチド模倣薬である、請求項１記載の構成物。
  9. 前記融合性脂質が、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ），（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オル（Ｄｉ−Ｌｉｎ）、Ｎ−メチル（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）メタンアミン（ＤＬｉｎ−ｋ−ＤＭＡ）、およびＮ−メチル−２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）エタンアミン（ＸＴＣ）から成る群より選択される、請求項７記載の構成物。
  10. 前記エンドソーム分解性成分が、ＧＡＬＡ、ＥＡＬＡ、ＩＮＦ−７、Ｉｎｆ ＨＡ−２、ｄｉＩＮＦ−７、ｄｉＩＮＦ３、ＧＬＦ、ＧＡＬＡ−ＩＮＦ３、ＩＮＦ−５、ＪＴＳ−１、ｐｐＴＧ１、ｐｐＴＧ２０、ＫＡＬＡ、ＨＡ、メリチン、およびヒスチジンに富んだペプチドＣＨＫ６ＨＣから成る群より選択される、請求項１記載の構成物。
  11. 前記標的リガンドが、抗体、受容体のリガンド結合部分、受容体のためのリガンド、アプタマー、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、多価Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、コレステロール、脂肪酸、リポタンパク質、葉酸、チロトロピン、メラノトロピン、サーファクタント・タンパク質Ａ、ムチン、炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスフォネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、血漿タンパク結合を強化する親油性部分、ステロイド、胆汁酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣薬、イブプロフェン、ナプロキセン、アスピリン、葉酸、ならびにそれらの類似体および誘導体から成る群より選択される、請求項１記載の構成物。
  12. 前記標的リガンドが、Ｄ−ガラクトース、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトース（ＧａｌＮＡｃ）、ＧａｌＮＡｃ２、およびＧａｌＮＡｃ３、コレステロール、葉酸、ならびにそれらの類似体および誘導体から成る群より選択される、請求項１１記載の構成物。
  13. 前記核酸が、ｉＲＮＡ剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ａｎｔａｇｏｍｉｒ、活性化ＲＮＡ、デコイオリゴヌクレオチド、アプタマー、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ模倣体、ａｎｔｉｍｉｒ、活性化ＲＮＡ（ＲＮＡａ）、ｓｕｐｅｒｍｉｒ、Ｕ１アダプター、およびリボザイムから成る群より選択される、請求項１記載の構成物。
  14. 前記核酸が少なくとも１つの糖修飾を含有する、請求項１記載の構成物。
  15. 前記糖修飾が２'修飾である、請求項１４記載の構成物。
  16. 前記２'修飾が、２'−Ｏ−Ｍｅ（２'−Ｏ−メチル）、２'−Ｏ−ＭＯＥ（２'−Ｏ−メトキシエチル）、２'−Ｆ、２'−Ｏ−［２−（メチルアミノ）−２−オキソエチル］（２'−Ｏ−ＮＭＡ）、２'−ＮＨ２、２'−Ｏ−アミン、２'−ＳＨ、２'−Ｓ−アルキル、２'−Ｏ−ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＬＮＡ）、２'−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−（４'−Ｃ）（ＥＮＡ）、２'−Ｏ−アミノプロピル（２'−Ｏ−ＡＰ）、２'−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２'−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２'−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２'−Ｏ−ＤＭＡＰ）、および２'−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２'−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）から成る群より選択される、請求項１５記載の構成物。
  17. 前記核酸が、少なくとも１つの骨格修飾を含有する、請求項１記載の構成物。
  18. 前記骨格修飾が、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、ホスホネート、アルキルホスホネート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンアミノカルボニル、メチレンメチルイミノ（ＭＭＩ）、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ（ＭＤＨ）、およびメチレンオキシメチルイミノから成る群より選択される、請求項１７記載の構成物。
  19. 前記核酸が、少なくとも１つの核酸塩基修飾を含む、請求項１記載の構成物。
  20. 前記核酸塩基修飾が、ジフルオロトリル、５−ニトロインドール、３−ニトロピロール、２−（アミノ）プリン、２，６−（ジアミノ）プリン、５−置換ピリミジン、Ｎ２−置換プリン、Ｎ６−置換プリン、およびＯ６−置換プリンから成る群より選択される、請求項１９記載の構成物。
  21. 前記核酸が、標的遺伝子の発現を下方制御する、請求項１記載の構成物。
  22. 前記核酸が、ＲＮＡ干渉機構によって標的遺伝子の発現を下方制御する、請求項２１記載の構成物。
  23. 前記核酸が一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１記載の構成物。
  24. 前記核酸がヘアピンオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の構成物。
  25. 前記核酸が二本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項１記載の構成物。
  26. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、前記核酸の同じ末端にある、請求項１記載の構成物。
  27. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、前記核酸の反対側の末端にある、請求項１記載の構成物。
  28. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドのうちの一方が、前記核酸の末端にあり、他方は、前記核酸の内部非末端位置にある、請求項１記載の構成物。
  29. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドの両方が、前記核酸の内部非末端位置にある、請求項１記載の構成物。
  30. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが両方、同一鎖にある、請求項２５記載の構成物。
  31. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、異なる鎖にある、請求項２５記載の構成物。
  32. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの同じ末端に位置する、請求項３１記載の構成物。
  33. 前記エンドソーム分解剤および前記標的リガンドが、二本鎖オリゴヌクレオチドの反対側の末端に位置する、請求項３１記載の構成物。
  34. 前記テザーが、少なくとも１つのレドックス開裂可能な連結基を含む、請求項１記載の構成物。
  35. 前記テザーが、少なくとも１つのｐＨ感受性成分を含む、請求項１記載の構成物。
  36. モジュラー構成物を細胞に送達する方法であって、
    （ａ）細胞に請求項１記載のモジュラー構成物を接触させ、
    （ｂ）前記モジュラー構成物を前記細胞に取り込ませる、
    各工程を有してなる方法。
  37. 前記標的リガンドが、前記核酸を前記細胞内に蓄積させるのに十分な透過性および滞留性を提供する、請求項３６記載の方法。
  38. インビトロで実施される、請求項３６記載の方法。
  39. インビボで実施される、請求項３６記載の方法。
  40. エクスビボで実施される、請求項３６記載の方法。
  41. １つ以上の遺伝子の発現を阻害する方法であって、１つ以上の細胞に、有効量の請求項１記載のモジュラー構成物を接触させる工程を有してなり、前記有効量が、前記１つ以上の遺伝子の発現を抑制する量である、方法。
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