JP2016522230A - 安定化された可溶性融合前rsv fポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
(a)位置161のアミノ酸残基の突然変異;
(b)位置182のアミノ酸残基の突然変異;
(c)位置173のアミノ酸残基の突然変異;および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む。
(a)位置161のアミノ酸残基EのP、Q、またはGへの突然変異(E161P、E161Q)またはE161G);
(b)位置182のアミノ酸残基SのPへの突然変異(S182P);
(c)位置173のアミノ酸残基S、T、またはNのPへの突然変異(S173P);および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む。
(a)位置161のアミノ酸残基の突然変異;
(b)位置182のアミノ酸残基の突然変異;
(c)位置173のアミノ酸残基の突然変異;および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる突然変異を含む。
(a)位置161のアミノ酸残基EのP、Q、またはGへの突然変異(E161P、E161Q)またはE161G);
(b)位置182のアミノ酸残基SのPへの突然変異(S182P);
(c)位置173のアミノ酸残基S、T、またはNのPへの突然変異(S173P);および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる突然変異を含む。
(a)位置161のアミノ酸残基EのP、Q、またはGへの突然変異(E161P、E161Q)またはE161G);
(b)位置182のアミノ酸残基SのPへの突然変異(S182P);
(c)位置173のアミノ酸残基S、T、またはNのPへの突然変異(S173P)、および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む。
(a)位置161のアミノ酸残基EのP、Q、またはGへの突然変異(E161P、E161Q)またはE161G);
(b)位置182のアミノ酸残基SのPへの突然変異(S182P);
(c)位置173のアミノ酸残基S、T、またはNのPへの突然変異(S173P);および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つのさらなる突然変異を含む。
(a)位置46のアミノ酸残基の突然変異;
(b)位置77のアミノ酸残基の突然変異;
(c)位置80のアミノ酸残基の突然変異;
(d)位置92のアミノ酸残基の突然変異;
(e)位置184のアミノ酸残基の突然変異;
(f)位置185のアミノ酸残基の突然変異;
(g)位置201のアミノ酸残基の突然変異;
(h)位置209のアミノ酸残基の突然変異;
(i)位置421のアミノ酸残基の突然変異;
(j)位置426のアミノ酸残基の突然変異;
(k)位置465のアミノ酸残基の突然変異;
(l)位置486のアミノ酸残基の突然変異;
(m)位置487のアミノ酸残基の突然変異;および
(n)位置508のアミノ酸残基の突然変異
からなる群から選択される、1つまたは複数のさらなる突然変異(野生型のRSV Fタンパク質に対して)を含む。
(a)位置46のアミノ酸残基SのGへの突然変異(S46G);
(b)位置77のアミノ酸残基KのEへの突然変異(K77E);
(c)位置80のアミノ酸残基KのEへの突然変異(K80E);
(d)位置92のアミノ酸残基EのDへの突然変異(E92D);
(e)位置184のアミノ酸残基GのNへの突然変異(G184N);
(f)位置185のアミノ酸残基VのNへの突然変異(V185N);
(g)位置201のアミノ酸残基KのQへの突然変異(K201Q);
(h)位置209のアミノ酸残基KのQへの突然変異(K209Q);
(i)位置421のアミノ酸残基KのNへの突然変異(K421N);
(j)位置426のアミノ酸残基NのSへの突然変異(N426S);
(k)位置465のアミノ酸残基KのEまたはQへの突然変異(K465Q);
(l)位置486のアミノ酸残基DのNへの突然変異(D486N);
(m)位置487のアミノ酸残基EのQ,N、またはIへの突然変異(E487Q/N/I);および
(n)位置508のアミノ酸残基KのEへの突然変異(K508E)
からなる群から選択される。
(a)融合後F中の大きなコイルドコイルに変換される、融合前F中の二次構造要素間のHRA領域中の安定化突然変異;および
(b)三量体中のF1サブユニットを共有結合架橋する、融合前基部(残基493〜525)、HRBのN末端)に対して融合前RSV−F頭部N末端の下部にある3回軸に近接する2つのシステイン残基の導入。
安定な融合前RSV Fポリペプチドの調製−リンカーおよび三量体形成ドメイン
同時係属中特許出願PCT/EP2014/058353号明細書では、可溶性融合前Fタンパク質(sF)の安定化された変異体を、リフォールディングを惹起する2つの主要な領域を安定化することにより設計した。最初の戦略は、短いループによりF1−F2ドメインを固定しかつ連結することによって、融合ペプチドをその位置に拘束し、融合ペプチドが頭部領域から放出されるのを防止することであった。融合ペプチドの放出は、F1のN末端のF2のC末端への共有結合形成を再構築することにより防止することができる。この実施例で示すように、いくつかの異なるリンカーを試みた。具体的にはアミノ酸配列GSGSG(配列番号5)を含む、F1とF2の間への5アミノ酸ループの挿入が最も好結果が得られた。
コンストラクトF18は、F1ドメインのアミノ酸残基513に連結されたフィブリチン三量体形成ドメイン(配列番号4)を含んだ。
コンストラクトF19は、F1ドメインのアミノ酸残基499に連結されたフィブリチン三量体形成ドメイン(配列番号4)を含んだ。
コンストラクトF20は、F1ドメインのアミノ酸残基516に連結されたイソロイシンジッパー(L)ドメイン(配列番号8)を含み、7つ組位置の疎水性を最適化し、IZドメインとのインフレーム融合を容易にするような追加の改変を含んだ。
コンストラクトF21もまた、イソロイシンジッパー(L)ドメイン(配列番号8)を含んだが、それはF1ドメインのアミノ酸残基501に連結されたものであり、またHRB領域に追加の改変はなかった。
コンストラクトF22は、F1ドメインのアミノ酸残基495に連結されたイソロイシンジッパー(L)ドメイン(配列番号8)を含み、HRBに追加の改変を含んだ。
コンストラクトF23は、アミノ酸残基495に連結されたイソロイシンジッパー(S)ドメイン(配列番号3)を含んだ。
コンストラクトF46もまた、イソロイシンジッパー(S)ドメイン(配列番号3)を含んだが、それはより長いRSV−F外部ドメインに連結されたものであった、すなわち、F1ドメインは、アミノ酸残基513の後で短縮されたものであった。
すべてのコンストラクトはHISタグを含んだ。
安定な融合前RSV Fポリペプチドの調製−安定化突然変異
三量体含量(コンストラクトF47について)および保存安定性(コンストラクトF24について)が最適ではなかったので、発現レベル、安定性、および天然三量体構造を増大させるための点突然変異を含有するさらなる変異体を作製した。結果を表7および8に示す。
融合前コンフォメーションの高発現および良好な安定性を示すいくつかの突然変異を、他の株のRSV Fタンパク質に適用し、またフューリン切断部位突然変異を含まないRSV A2 F変異体(F18:配列番号71)に適用して、この改変がRSV融合前Fを安定化するための汎用の解決策であるか否かを評価した(表11)。
外部ドメインに対応するRSV−Fの可溶性バージョンにおいて融合前コンフォメーションの高発現および良好な安定性を示すいくつかの突然変異を、完全長RSV−Fタンパク質に適用した。これらの突然変異を、フューリン切断部位の突然変異を含むまたは含まない完全長RSV−Fに導入した。三量体形成ドメインはこれらの変異体に融合しなかった(表12)。
本発明による安定な融合前RSV Fポリペプチドの調製
本発明に導いた研究では、可溶性融合前Fタンパク質(sF)のさらに安定化された変異体を、リフォールディングを惹起する2つの主要な領域を安定化することにより設計した。第1の戦略は、HRA領域のコイルドコイルへのリフォールディングを妨げることであった。第2の戦略は、N末端からHRBへのジスルフィド架橋を構築して、HRAコイルドコイル上にドッキングすることにより6ヘリックスバンドルを形成するHRBの再配置を妨げることであった。
融合前から融合後のコンフォメーションにリフォールディングするためには、残基160と215の間の領域は、ヘリックス、ループ、およびストランドの集合から長い連続ヘリックスに変換しなければならない。この領域は最も劇的な構造移行を示す。この領域の一部については、実際に最も高いαヘリックス予測がある。融合前結晶構造における実際のヘリックス構造を、灰色で強調して以下に示す。この領域全体は、融合後コンフォメーションにリフォールディングすると、1つの大きなヘリックスに変換される。下位配列では、Agadir(http://agadir.crg.es/)に基づいて最も高いヘリックス予測をされた残基を灰色で強調している。融合前コンフォメーションにおいてβ−ヘアピン、連結ループ、およびヘリックスで維持されているC末端部分(残基187〜202)がα−ヘリックスを形成する傾向が高いことが、この比較から明らかになる。
−このターンでは、Glu163の負電荷に近接してGlu161の負電荷が配置されるため、負電荷反発による不安定化が生じる:
−ラマチャンドランプロットから、残基161が悪い/好ましくない二面角を有していることが示される;
−残基161は、高い運動性を反映する(また不安定性を示唆する)高いB因子を有する;
−残基160〜172は高いヘリックス傾向を示す。
負電荷のアミノ酸残基486、487、および489は、融合前と融合後のRSV−F構造間の移行を制御するスイッチ機構の一部である。Glu487のGlnへの突然変異により、このスイッチは損なわれ、三量体中のプロトマー間の接触が安定化されることになる。これらの同じ残基位置はまた、プロトマー間のジスルフィド架橋を操作するために使用することができる。上記に記載する、システインによる2つの残基の突然変異により、負電荷反発が低減し、融合前三量体をさらに安定化することになるジスルフィド架橋が可能になる。
負電荷のアミノ酸残基486、487、および489は、融合前および融合後のRSV−F構造間の移行を制御するスイッチ機構の一部である。Glu487のGlnへの突然変異により、このスイッチは損なわれ、三量体中のプロトマー間の接触が安定化されることになる(以前の特許P00)。これらの同じ残基位置はまた、プロトマー間のジスルフィド架橋を操作するために使用することができる。1つが負電荷の残基486、486、または489である2つの残基のシステインへの突然変異により、負電荷反発が低減し、融合前三量体をさらに安定化することになるジスルフィド架橋が可能になる。このような変異体のいくつかについて、融合前コンフォメーションの発現レベルおよび安定性を試験した(表16)。
ウエスタンブロッティング
培養上清を、4〜12%(w/v)Bis‐Tris NuPAGEゲル(Life Technology)上で還元泳動し、iBlot技術(Life Technology)を用いてブロットした。ブロットをCR9503(下記の表18に示す配列)でプローブし、コンジュゲートマウス抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)またはIRDye800CWコンジュゲート親和性精製抗ヒトIgG(ウサギ)(Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,PA)で検出した。図1では、DM=二重突然変異体(N67I+S215P=配列番号21)およびDM+CC=二重突然変異体+DE486CC=配列番号94)の発現を見ることができる。還元および非還元で分析すると、2つのタンパク質間の明確な差を観察することができよう。還元されると、両タンパク質は、55kDa近辺の単量体化学種として泳動する。非還元の場合、DMの大部分は依然として単量体として見出されるが、DM+CCの主たる化学種ははるかに大きく、主として三量体である。これから、残基486および487をシステインに置換することにより、主としてプロトマー間のジスルフィド架橋を有する三量体が生じることが証明される。
NativePAGE
本発明による融合前Fポリペプチドの多量体状態の初期測定のために、一過性にトランスフェクトされた細胞からの培養上清を、NativePAGE Bis−Trisゲルシステム(Life Technologies)で分析した。次いで、ゲルを、製造業者の説明書に従い、iBlot技術(Life Technologies)を用いてブロットした。RSV Fタンパク質特異的抗体CR9503(下記の表18に示す配列)を、融合前RSV Fタンパク質の検出用一次プローブとして使用し、次いでHRPコンジュゲートマウス抗ヒトIgG(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)またはIRDye800CWコンジュゲート親和性精製抗ヒトIgG(ウサギ)(Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,PA)を使用した。ブロットは、標準フィルム(Codak)またはOdyssey CLx赤外線イメージングシステムを用いて検出した。図2に、レーン2:DM=二重突然変異体(N67I+S215P=配列番号21)およびレーン1:DM+CC=二重突然変異体+DE486CC=配列番号5A)からの上清のNativePAGE分析を示す。DMおよびDM+CCは両方とも、native page上で主として三量体であることから、ジスルフィドの導入により三量体間架橋を形成させなくてもよいことが示される。DM+CCは、DMよりも発現性がよくないので、単量体(矢印)が見当たらないことは、検出限界未満であるという事実による可能性がある。
融合前Fタンパク質の発現
組換え融合前RSV Fタンパク質をコードする発現プラスミドを、部位特異的突然変異誘発およびPCRを含む、当技術分野内に広く知られる標準的方法により作製した。使用した発現プラットフォームは、293Freestyle細胞(Life Technologies,Renfreshire,UK)とした。製造業者の説明書に従い、293Fectin(Life Technologies)を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、37℃および10%CO2で5日間、振盪インキュベーター中で培養した。培養上清を回収し、300gで5分間遠心して、細胞および細胞デブリを除去した。次いで、0.22umの真空フィルターを用いて、遠心上清を滅菌濾過し、使用するまで4℃に保存した。
融合前RSV Fタンパク質の精製
組換えポリペプチドを、初期精製用の陽イオンイオン交換カラム、次いで残存する混入物を除去する洗練ステップ用のセファデックス200カラムを適用する2ステップ精製プロトコールによって精製した。初期イオン交換ステップのために、培養上清を2容量の50mM NaOAc、pH5.0で希釈し、5mlのHiTrap Capto Sカラムに毎分5mlで通した。次いで、カラムを、10カラム容量(CV)の20mM NaOAc、50mM NaCl、0.01%(v/v)tween20、pH5で洗浄し、2CVの20mM NaOAc、1M NaCl、0.01%(v/v)tween20、pH5で溶出した。スピン濃縮器を用いて溶出液を濃縮し、ランニング緩衝液として40mM Tris、500mM NaCl、0.01%(v/v)tween20、pH7.4を用い、セファデックス200カラムを使用してタンパク質をさらに精製した。図3Aに、ゲル濾過カラムからのクロマトグラムを示すが、主要ピークに融合前RSV Fタンパク質が含有される。このピークを含有する画分を再びプールし、OD280を用いてタンパク質濃度を測定し、使用するまで4℃に保存した。図3Bに、最終タンパク質調製物の還元SDS−PAGE分析を示すが、見てわかるように、純度は95%超であった。バンドの同一性はウエスタンブロッティングおよびタンパク質F特異的抗体を用いて確認した(図示せず)。次に、精製したタンパク質を、NativePAGE上で試験し、参照となる安定な三量体融合前Fタンパク質(配列番号21)と比較した(図3C)。
終了点安定性アッセイ
本発明による発現ポリペプチドの融合前コンフォメーションの確認は、融合前特異的抗体CR9501もしくはCR9502、または市販抗体モタビズマブの重鎖および軽鎖可変領域を含む非コンフォメーション特異的抗体CR9503を用い、Octet技術を使用して行った。標準プロトコールにより抗体をビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセンサー(ForteBio,Portsmouth,UK)上に固定した。手順は以下のとおり。カイネティック緩衝液(ForteBio)中で60秒間、センサーを平衡化した後、チップを、5ug/mlの所望の抗体を含むPBSに移した。負荷を250秒間行った。次いで、カイネティック緩衝液中で200秒間のさらなる平衡化ステップを入れた。最後に、融合前RSV Fポリペプチドを含有する発現培養上清にチップを移し、1200秒後に全結合シグナルを記録した。この段階は結合段階とも呼ばれる。これを、回収直後(1日目)および5日後(5日目)に行い、CR9501結合の差を、融合前コンフォメーションを安定化することができる突然変異を同定するためのスクリーニングツールとして使用した。5日目に20%未満しか結合減少が観察されなかった場合、コンストラクトは安定であると考えられ、そうでなければ、不安定であると考えられた。次いで、必要に応じて、よりストリンジェントな安定性試験を安定なコンストラクトに課すこともあった。データ解析は、ForteBioデータ解析6.4ソフトウェア(ForteBio)を用いて行った。
熱安定性アッセイ
RSV Fポリペプチドに導入した形質の安定化能を、熱ストレスにより評価した。この目的のために、一過性にトランスフェクトされた細胞からの培養上清または精製されたタンパク質を一連の温度を用いて加熱した。次いで、さらなる熱誘導コンフォメーション変化を防止するために、試料を氷上で冷却し、実施例11に記載のように、octet技術プラットフォーム上でCR9501抗体を用いてプローブした。種々の温度での結合段階の終了時に得られた応答を、温度の関数としてプロットし、Prismソフトウェアを用いて、非線形回帰によりフィットさせた。これにより、抗体結合レベルが最大の50%である温度を評価し、この値を使用して、融合前熱安定性の点から、種々のコンストラクトを比較することができる。
結合段階安定性アッセイ
種々の点突然変異の安定性を評価するために、結合段階解析を使用することにより、octet結合アッセイを開発した。CR9501抗体またはCR9502抗体を、RSV−Fタンパク質の融合前コンフォメーションに対するプローブとして使用した。終了点アッセイの濃度バイアスの可能性を低減するために、実験の結合段階全体からのデータポイントを使用した。データはチップ上の結合抗体の量について補正した。測定は1、5、および33日目に行い、この3日の曲線の形状を比較した。同一の曲線が得られた場合、このコンストラクトは、安定であると考えられ、そうでなければ、不安定と考えられる。
定量的Octet
細胞培養上清中の融合前RSV Fタンパク質の濃度を測定するために、定量的Octetベースの方法を使用した。CR9501およびCR9503抗体を標準プロトコールによりビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセンサー(ForteBio,Portsmouth,UK)上に固定した。その後、コーティングされたバイオセンサーをmock細胞培養上清でブロックした。定量的実験を以下のとおりに行った:温度30℃、振盪速度1000rpm、アッセイ時間300秒。標準曲線を用いて細胞培養上清中のタンパク質濃度を算出した。mock細胞培養上清で希釈したA2_F24_N67I+S215P(配列番号21)タンパク質を用いて、コーティング抗体それぞれについて標準曲線を作成した。測定は、上清回収日(1日目)および4℃で5日間以上の上清保存後に行った。CR9501またはCR9502で測定した濃度の差を、融合前コンフォメーションを安定化することができる突然変異を同定するためのスクリーニングツールとして使用した。5日目に20%未満しか測定濃度の減少が観察されなかった場合、コンストラクトは安定であると考えられた。データ解析は、ForteBioデータ解析6.4ソフトウェア(ForteBio)を用いて行った。
融合前F免疫原性の前臨床評価
安定化された融合前RSV F(A2F24、N67I、S215P)(配列番号21)の免疫原性を評価するために、0週目および4週目の初回免疫−追加免疫レジメンで、0.5または5ugを用い、表19に従ってマウスを免疫した。図4に示すように、融合前Fで免疫されたマウスは、融合後RSV Fで免疫されたマウスよりも高いVNA力価を示した。
RSV Fタンパク質A2の完全長配列(配列番号1)
RSV Fタンパク質B1の完全長配列(配列番号2)
配列番号3
配列番号4
配列番号5
F8:RSV A2、野生型外部ドメイン(配列番号13)
F11:RSV B1、野生型外部ドメイン(配列番号14)
F47:RSV A2、リンカー安定化、IZ(S)(配列番号15)
F47−:RSV A2、リンカー安定化、IZ(S)(配列番号16)
F43:RSV B1、リンカー安定化、IZ(S)(配列番号17)
F24:RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号18)
A2_F24:RSV A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号19)
F24−:RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号20)
A2_F24 N67I+S215P:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号21)
F24−N67I+S215P:RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号22)
A2_F24 N67I+E92D:RSV A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号23)
F24− N67I+E92D RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号24)
A2_F24 N67I+K465Q RSV A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号25)
F24− N67I+K465Q RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号26)
A2_F24 N67I+S46G RSV A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号27)
F24− N67I+S46G RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号28)
A2_F24 E92D+S215P:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号29)
F24−E92D+S215P:RSV B1、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号30)
A2_F24 N67I+S215P+K508E:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号31)
A2_F24 N67I+S215P+E487I:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号32)
A2_F24 N67I+S215P+E487Q:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号33)
A2_F24 N67I+S215P+E487N:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号34)
A2_F24 N67I+S215P+D486N:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号35)
A2_F24 N67I+S215P+K465E:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号36)
A2_F24 N67I+S215P+K465Q:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号37)
A2_F24 N67I+S215P+N426S:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号38)
A2_F24 N67I+S215P+K421N:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号39)
A2_F24 N67I+S215P+K209Q:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号40)
A2_F24 N67I+S215P+K201Q:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号41)
A2_F24 N67I+S215P+V185N:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号42)
A2_F24 N67I+S215P+G184N:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号43)
A2_F24 N67I+S215P+N175P:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号44)
A2_F24 N67I+S215P+E92D:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号45)
A2_F24 N67I+S215P+K80E:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号46)
A2_F24 N67I+S215P+K77E:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号47)
A2_F24 N67I+S215P+S46G:A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号48)
A2_F24:RSV S46G A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号49)
A2_F24:RSV K465Q A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号50)
A2_F24:RSV N67I A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号51)
A2_F24:RSV E92D A2、リンカー安定化、フィブリチン(配列番号52)
RSV Fタンパク質CL57−v224完全長配列(配列番号69)
外部ドメイン、RSV CL57−v224(配列番号70)
PreF、RSV A2、フィブリチン(配列番号71)
PreF N67I S215P、RSV A2、フィブリチン(配列番号72)
PreF N67I S215P、RSV B1、フィブリチン(配列番号73)
RSV N67I S215P、RSV CL57−v224、フィブリチン(配列番号74)
PreFL N67I S215P、RSV B1、フィブリチン、ループ(配列番号22)
PreFL N67I S215P、RSV CL57−v224、フィブリチン、ループ(配列番号75)
PreF N67I S215P E487Q、RSV A2、フィブリチン(配列番号76)
PreF N67I S215P K201N、RSV A2、フィブリチン(配列番号77)
PreF N67I S215P E92D、RSV A2、フィブリチン(配列番号78)
PreF N67I S215P D486N、RSV A2、フィブリチン(配列番号79)
Fwt N67I S215P、膜結合型RSV F、A2、(配列番号80)
Fsl N67I S215P、膜結合型RSV F、A2、(配列番号81)
Fwt N67I S215P E92D、膜結合型RSV F、A2、(配列番号82)
Fsl N67I S215P E92D、膜結合型RSV F、A2、(配列番号83)
Fwt N67I S215P E487Q、膜結合型RSV F、A2、(配列番号84)
Fsl N67I S215P E487Q、膜結合型RSV F、A2、(配列番号85)
Fwt N67I S215P D486N、膜結合型RSV F、A2、(配列番号86)
Fsl N67I S215P D486N、膜結合型RSV F、A2、(配列番号87)
Fwt N67I S215P S46G、膜結合型RSV F、A2、(配列番号88)
Fsl N67I S215P S46G、膜結合型RSV F、A2、(配列番号89)
CR9501重鎖(配列番号53):
CR9501軽鎖(配列番号61):
CR9502重鎖(配列番号57):
CR9502軽鎖(配列番号65):
PreF N67I E161P S215P E487Q、RSV A2、フィブリチン(配列番号90)
PreF N67I E161P S215P、RSV A2、フィブリチン(配列番号91)
PreF N67I S173P S215P、RSV A2、フィブリチン(配列番号92)
PreF N67I S182P S215P、RSV A2、フィブリチン(配列番号93)
PreF N67I S215P D486C E487C、RSV A2、フィブリチン(配列番号94)
Claims (20)
- 組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)ポリペプチドであって、融合前コンフォメーションFタンパク質に特異的な少なくとも1つのエピトープを含み、前記少なくとも1つのエピトープが、配列番号54の重鎖CDR1領域、配列番号55の重鎖CDR2領域、配列番号56の重鎖CDR3領域と、配列番号62の軽鎖CDR1領域、配列番号63の軽鎖CDR2領域、および配列番号64の軽鎖CDR3領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに/または配列番号58の重鎖CDR1領域、配列番号59の重鎖CDR2領域、配列番号60の重鎖CDR3領域と、配列番号66の軽鎖CDR1領域、配列番号67の軽鎖CDR2領域、および配列番号68の軽鎖CDR3領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体により認識され、前記ポリペプチドが、F1ドメインおよびF2ドメインを含み、かつ前記ポリペプチドが、野生型F1およびF2ドメインに比較して、
(a)位置161のアミノ酸残基の突然変異;
(b)位置182のアミノ酸残基の突然変異;
(c)位置173のアミノ酸残基の突然変異;および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を含む、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)ポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが三量体である、請求項1に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記少なくとも1つの突然変異が、
(a)位置161のアミノ酸残基EのP、Q、またはGへの突然変異(E161P、E161Q)またはE161G);
(b)位置182のアミノ酸残基SのPへの突然変異(S182P);
(c)位置173のアミノ酸残基S、T、またはNのPへの突然変異(S173P);および
(d)位置489のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D489C)または位置487のアミノ酸残基EのCへの突然変異(E487C)と組み合わせた位置486のアミノ酸残基DのCへの突然変異(D486C)
からなる群から選択される、請求項1または2に記載の融合前RSV Fポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、位置67のアミノ酸残基の突然変異および/または位置215のアミノ酸残基の突然変異をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、位置67のアミノ酸残基NまたはTの突然変異および/または位置215のアミノ酸残基Sの突然変異を含む、請求項4に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記F1ドメインとF2ドメインを連結する、1〜10アミノ酸を含む連結配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記短縮されたF1ドメインに連結された異種三量体形成ドメインを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、前記短縮されたF1ドメインに連結された異種三量体形成ドメインを含む、請求項7に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記異種三量体形成ドメインが、アミノ酸配列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(配列番号4)を含む、請求項8に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記三量体形成ドメインが、前記RSV Fタンパク質のアミノ酸残基513に連結している、請求項12に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記F1ドメインおよび/または前記F2ドメインがRSV A株由来である、請求項1〜10のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記F1ドメインおよび/または前記F2ドメインがRSV B株由来である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号90〜配列番号94からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチドをコードする核酸分子。
- 前記核酸分子が、哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項14に記載の核酸分子。
- 請求項14または請求項15に記載の核酸分子を含むベクター。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド、請求項14もしくは請求項15に記載の核酸分子、および/または請求項16に記載のベクターを含む組成物。
- RSV Fタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド、請求項14もしくは請求項15に記載の核酸分子、および/または請求項16に記載のベクター。
- ワクチンとして使用するための請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド、請求項14もしくは請求項15に記載の核酸分子、および/または請求項16に記載のベクター。
- RSV感染の予防および/または処置に使用するための請求項1〜13のいずれか一項に記載の融合前RSV Fポリペプチド、請求項14もしくは請求項15に記載の核酸分子、および/または請求項16に記載のベクター。
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