JP2014528698A5 - - Google Patents
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Description
一実施形態において、試料から、ヒトパルボウイルス遺伝子型1、2及び3標的核酸並びにA型肝炎ウイルス標的核酸のマルチプレックス増幅及び検出を行うための方法が提示される。この実施形態の一態様において、ヒトパルボウイルス遺伝子型1、2及び3の増幅及び検出のための増幅オリゴマーは、表3に記述される1つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される2つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される3つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される4つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される5つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される6つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される7つ以上の増幅オリゴマーを含む。この実施形態の一態様において、HAVの増幅及び検出のための増幅オリゴマーは、表3に記述される1つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される2つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される3つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される4つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される5つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される6つ以上の増幅オリゴマーを含む。別の一態様では、表3に記述される7つ以上の増幅オリゴマーを含む。この実施形態の一態様において、ヒトパルボウイルス遺伝子型1、2及び3から生成された増幅産物の検出のための検出プローブオリゴマー、並びにHAVから生成された増幅産物の検出のための検出プローブオリゴマーは、表3に記載される1つ以上のパルボウイルス検出プローブと、及び表3に記載される1つ以上のHAV検出プローブを含む。別の一態様において、この検出プローブオリゴマーは、リアルタイム検出のための増幅中に存在している。別の一態様において、この検出プローブオリゴマーは、エンドポイント検出のため、増幅反応の後に増幅産物と合わせられる。この実施形態の一態様において、ヒトパルボウイルス遺伝子型1、2及び3標的核酸並びにHAV標的核酸のマルチプレックス増幅及び検出は、定量的マルチプレックス増幅及び検出反応である。この実施形態の一態様において、ヒトパルボウイルス遺伝子型1、2及び3標的核酸は、他の試料構成成分から分離される。別の一態様において、この分離は、標的キャプチャーオリゴマーを用いて実施される。この実施形態の一態様において、HAV標的核酸は、他の試料構成成分から分離される。別の一態様において、この分離は、標的キャプチャーオリゴマーを用いて実施される。この実施形態の一態様において、増幅及び検出反応には、内部制御が含まれる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するためのオリゴマー組み合わせであって、前記オリゴマー組み合わせが、
(I)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)第1 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマー組み合わせ。
(項目2)
前記オリゴマー組み合わせが、(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを含む、項目1に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目3)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目4)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183又は配列番号117の配列を含む、項目3に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目5)
(I)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75〜80からなる群から選択される配列を有する、項目4に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目6)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目7)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81〜84からなる群から選択される、項目6に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目8)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目9)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82〜84からなる群から選択される、項目8に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目10)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目2〜9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目11)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目10に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目12)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108〜113からなる群から選択される、項目11に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目13)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目2〜9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目14)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目13に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目15)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118〜121からなる群から選択される、項目14に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目16)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目2〜15のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目17)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目16に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目18)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目17に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目19)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、項目18に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目20)
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)該第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む
、項目2〜19のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目21)
前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目3〜9のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目20に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目22)
前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目10〜19のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目20又は21に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目23)
不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132〜135からなる群から選択される、項目2〜22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目24)
前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128〜131からなる群から選択される配列を有する、項目23に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目25)
前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目2〜24のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目26)
長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目2〜25のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目27)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目26に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目28)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、項目27に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目29)
前記オリゴマー組み合わせが、(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを含む、項目1〜22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目30)
(II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目29に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目31)
(II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目30に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目32)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される、項目31に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目33)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目30に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目34)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、項目33に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目35)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目29〜34のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目36)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される、項目35に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目37)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目29〜36のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目38)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目37に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目39)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目38に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目40)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目39に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目41)
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む、項目29〜40のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目42)
前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて項目30〜34のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目41に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目43)
前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて項目35〜40で示されているオリゴマーである、項目41又は42に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目44)
不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52〜57からなる群から選択される、項目29〜43のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目45)
前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46〜51からなる群
から選択される配列を有する、項目44に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目46)
前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目29〜45のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目47)
長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目29〜46のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目48)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目47に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目49)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、項目48に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目50)
項目1〜49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含むキット。
(項目51)
項目1〜49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含む反応混合物。
(項目52)
試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するための方法であって、前記方法が、
(A)ヒトパルボウイルスとHAVのうち少なくとも1つを含むことが疑われる試料を提供する工程と、
(B)該試料を、ヒトパルボウイルス核酸標的領域及びHAV核酸標的領域のうち少なくとも1つを増幅するためのオリゴマー組み合わせに接触させる工程であって、このオリゴマー組み合わせは、
(I)パルボウイルス標的領域について、(a)配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1パルボウイルス増幅オリゴマーと、(b)(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む第2パルボウイルス増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV標的領域について、(a)配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1 HAV増幅オリゴマーと、(b)配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第2 HAV増幅オリゴマーと、を含む、工程と、
(C)試料中に存在する任意のパルボウイルス及び/又はHAVの標的核酸が、パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施する工程と、
(D)パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物の存在又は不在を検出することにより、前記試料中のパルボウイルス及び/又はHAVの存在又は不在を示す工程と、を含む、方法。
(項目53)
前記方法が、ヒトパルボウイルス標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーに接触する、項目52に記載の方法。
(項目54)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号117又は配列番号179の配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、項目54に記載の方法。
(項目56)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75〜80からなる群から選択される配列を有する、項目55に記載の方法。
(項目57)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目53に記載の方法。
(項目58)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81〜84からなる群から選択される、項目57に記載の方法。
(項目59)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目60)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82〜84からなる群から選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目53〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108〜113からなる群から選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目53〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118〜121からなる群から選択される、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目53〜66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、項目69に記載の方法。
(項目71)
工程(B)が、前記試料を、
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで(a)前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の該第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーとを接触させる工程を更に含む、項目53〜70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目54〜60のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目61〜70のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目71又は72に記載の方法。
(項目74)
工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記パルボウイルス標的核酸を精製する工程を更に含む、項目53〜73のいずれか一項に記載されている方法。
(項目75)
前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132〜135からなる群から選択される、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128〜131からなる群から選択される配列を有する、項目75に記載の方法。
(項目77)
工程(B)が、前記試料を、前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目53〜76のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物の存在又は不在が決定される条件にお
いて、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルスの存在又は不在を示す工程を含む、項目53に記載の方法。
(項目79)
前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でパルボウイルス特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、項目78〜81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記試料を、前記パルボウイルス増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目78〜82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目78〜81のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、項目78〜84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、項目78〜85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目78〜87のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、項目90に記載の方法。
(項目92)
工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目53〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、項目53〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目92又は93に記載の方法。
(項目95)
前記方法が、ヒトHAV標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーに接触する、項目52に記載の方法。
(項目96)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目95に記載の方法。
(項目97)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される、項目97に記載の方法。
(項目99)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目100)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、項目99に記載の方法。
(項目101)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目95〜100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目95〜102のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目105に記載の方法。
(項目107)
工程(B)が、前記試料を、
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、
ここで、(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーと接触させる工程を更に含む、項目95〜106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて項目96〜100のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて項目101〜106で示されているオリゴマーである、項目107又は108に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目110)
工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記HAV標的核酸を精製する工程を更に含む、項目95〜109のいずれか一項に記載されている方法。
(項目111)
前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52〜57からなる群から選択される、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46〜51からなる群から選択される配列を有する、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目95〜112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
検出工程(D)が、前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記HAV増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のHAVの存在又は不在を示す工程を含む、項目95に記載の方法。
(項目115)
前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でHAV特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、項目114〜117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
前記試料を、前記HAV増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記HAV特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目114〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目114〜117のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記HAV特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、項目114〜120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、項目114〜121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記HAV特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記HAV特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記HAV特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目114〜123のいずれか一項に記載の方法。
(項目126)
前記HAV特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、項目126に記載の方法。
(項目128)
工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目95〜127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、項目95〜127のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目128又は129に記載の方法。
(項目131)
前記試料が、一個人患者からのものである、項目52〜130のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記試料がプールされている、項目52〜130のいずれか一項に記載の方法。
(項目133)
前記プールされている試料が、プールされた血漿試料である、項目132に記載の方法。
(項目134)
前記方法が、前記ヒトパルボウイルス標的核酸と前記HAV標的核酸の両方を検出するためのものであり、前記検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物及び前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物と前記HAV増幅産物に対してそれぞれ特異的にハイブリダイズするよう構成されている、パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーとHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルス及びHAVの存在又は不在を示す工程を含む、項目52に記載の方法。
(項目135)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーが、区別されて標識される、項目135に記載の方法。
(項目136)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、独立して(a)化学発光標識及び(b)蛍光標識からなる群から選択される標識を含む、項目135に記載の方法。
(項目137)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、化学発光標識を含む、項目135に記載の方法。
(項目138)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの前記化学発光標識が、パルボウイルス特異的化学発光信号とHAV特異的化学発光信号との間を区別するのに十分な、異なる発光キネティクスによって特徴付けられる、項目137に記載の方法。
(項目139)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの化学発光標識のそれぞれが、アクリジニウムエステル(AE)を含む、項目138に記載の方法。
(項目140)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、項目134〜139のいずれか一項に記載の方法。
(項目141)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、項目140に記載の方法。
(項目142)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75〜80からなる群から選択される配列を有する、項目141に記載の方法。
(項目143)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目134〜139のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81〜84からなる群から選択される、項目143に記載の方法。
(項目145)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目134〜139のいずれか一項に記載の方法。
(項目146)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82〜84からなる群から選択される、項目145に記載の方法。
(項目147)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目134〜146のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目147に記載の方法。
(項目149)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108〜113からなる群から選択される、項目148に記載の方法。
(項目150)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目134〜146のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目150に記載の方法。
(項目152)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118〜121からなる群から選択される、項目151に記載の方法。
(項目153)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目134〜152のいずれか一項に記載の方法。
(項目154)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目153に記載の方法。
(項目155)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、項目155に記載の方法。
(項目157)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目134〜156のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目157に記載の方法。
(項目159)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される、項目158に記載の方法。
(項目160)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目157に記載の方法。
(項目161)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、項目160に記載の方法。
(項目162)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目134〜161のいずれか一項に記載の方法。
(項目163)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目134〜163のいずれか一項に記載の方法。
(項目165)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目166に記載の方法。
(項目168)
前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目134〜167のいずれか一項に記載の方法。
(項目169)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目168に記載の方法。
(項目170)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、項目169に記載の方法。
(項目171)
前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目134〜170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目171に記載の方法。
(項目173)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、項目172に記載の方法。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するためのオリゴマー組み合わせであって、前記オリゴマー組み合わせが、
(I)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV核酸標的領域を増幅するための第1及び第2増幅オリゴマーであって、ここで
(a)第1 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第2 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第1及び第2増幅オリゴマーと、を含む、オリゴマー組み合わせ。
(項目2)
前記オリゴマー組み合わせが、(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを含む、項目1に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目3)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目4)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183又は配列番号117の配列を含む、項目3に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目5)
(I)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75〜80からなる群から選択される配列を有する、項目4に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目6)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目7)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81〜84からなる群から選択される、項目6に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目8)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目2に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目9)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82〜84からなる群から選択される、項目8に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目10)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目2〜9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目11)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目10に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目12)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108〜113からなる群から選択される、項目11に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目13)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目2〜9のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目14)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目13に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目15)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118〜121からなる群から選択される、項目14に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目16)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目2〜15のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目17)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目16に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目18)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目17に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目19)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、項目18に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目20)
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)該第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、
(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び
(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む
、項目2〜19のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目21)
前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目3〜9のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目20に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目22)
前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目10〜19のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目20又は21に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目23)
不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132〜135からなる群から選択される、項目2〜22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目24)
前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128〜131からなる群から選択される配列を有する、項目23に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目25)
前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目2〜24のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目26)
長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目2〜25のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目27)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目26に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目28)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、項目27に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目29)
前記オリゴマー組み合わせが、(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを含む、項目1〜22のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目30)
(II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目29に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目31)
(II)(a)の前記第1標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目30に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目32)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される、項目31に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目33)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目30に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目34)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、項目33に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目35)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目29〜34のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目36)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される、項目35に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目37)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目29〜36のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目38)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目37に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目39)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目38に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目40)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目39に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目41)
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで
(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーを更に含む、項目29〜40のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目42)
前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて項目30〜34のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目41に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目43)
前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて項目35〜40で示されているオリゴマーである、項目41又は42に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目44)
不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーを更に含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52〜57からなる群から選択される、項目29〜43のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目45)
前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46〜51からなる群
から選択される配列を有する、項目44に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目46)
前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目29〜45のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目47)
長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的検出プローブオリゴマーを更に含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目29〜46のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目48)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目47に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目49)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、項目48に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目50)
項目1〜49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含むキット。
(項目51)
項目1〜49のいずれか一項に記載のオリゴマー組み合わせを含む反応混合物。
(項目52)
試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するための方法であって、前記方法が、
(A)ヒトパルボウイルスとHAVのうち少なくとも1つを含むことが疑われる試料を提供する工程と、
(B)該試料を、ヒトパルボウイルス核酸標的領域及びHAV核酸標的領域のうち少なくとも1つを増幅するためのオリゴマー組み合わせに接触させる工程であって、このオリゴマー組み合わせは、
(I)パルボウイルス標的領域について、(a)配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1パルボウイルス増幅オリゴマーと、(b)(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む第2パルボウイルス増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV標的領域について、(a)配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1 HAV増幅オリゴマーと、(b)配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第2 HAV増幅オリゴマーと、を含む、工程と、
(C)試料中に存在する任意のパルボウイルス及び/又はHAVの標的核酸が、パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施する工程と、
(D)パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物の存在又は不在を検出することにより、前記試料中のパルボウイルス及び/又はHAVの存在又は不在を示す工程と、を含む、方法。
(項目53)
前記方法が、ヒトパルボウイルス標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーに接触する、項目52に記載の方法。
(項目54)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号117又は配列番号179の配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目55)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、項目54に記載の方法。
(項目56)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75〜80からなる群から選択される配列を有する、項目55に記載の方法。
(項目57)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目53に記載の方法。
(項目58)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81〜84からなる群から選択される、項目57に記載の方法。
(項目59)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目53に記載の方法。
(項目60)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82〜84からなる群から選択される、項目59に記載の方法。
(項目61)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目53〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目62)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目61に記載の方法。
(項目63)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108〜113からなる群から選択される、項目62に記載の方法。
(項目64)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目53〜60のいずれか一項に記載の方法。
(項目65)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目64に記載の方法。
(項目66)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118〜121からなる群から選択される、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目53〜66のいずれか一項に記載の方法。
(項目68)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目67に記載の方法。
(項目69)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、項目69に記載の方法。
(項目71)
工程(B)が、前記試料を、
(III)ヒトパルボウイルス核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、ここで(a)前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーは、配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、
(b)前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーは、(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(III)(a)の該第3標的ハイブリダイズ配列は、(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(III)(b)の第4標的ハイブリダイズ配列は、(I)(b)の第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーとを接触させる工程を更に含む、項目53〜70のいずれか一項に記載の方法。
(項目72)
前記第3パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第1パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目54〜60のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目71に記載の方法。
(項目73)
前記第4パルボウイルス増幅オリゴマーが、前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーについて項目61〜70のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目71又は72に記載の方法。
(項目74)
工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記パルボウイルス標的核酸を精製する工程を更に含む、項目53〜73のいずれか一項に記載されている方法。
(項目75)
前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132〜135からなる群から選択される、項目74に記載の方法。
(項目76)
前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128〜131からなる群から選択される配列を有する、項目75に記載の方法。
(項目77)
工程(B)が、前記試料を、前記第1又は第2パルボウイルス増幅オリゴマーより上流の前記パルボウイルス標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目53〜76のいずれか一項に記載の方法。
(項目78)
検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物の存在又は不在が決定される条件にお
いて、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルスの存在又は不在を示す工程を含む、項目53に記載の方法。
(項目79)
前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目78に記載の方法。
(項目80)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目79に記載の方法。
(項目81)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、項目80に記載の方法。
(項目82)
前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でパルボウイルス特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、項目78〜81のいずれか一項に記載の方法。
(項目83)
前記試料を、前記パルボウイルス増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目78〜82のいずれか一項に記載の方法。
(項目84)
前記試料を、前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目78〜81のいずれか一項に記載の方法。
(項目85)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、項目78〜84のいずれか一項に記載の方法。
(項目86)
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、項目78〜85のいずれか一項に記載の方法。
(項目87)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、項目86に記載の方法。
(項目88)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、項目87に記載の方法。
(項目89)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目78〜87のいずれか一項に記載の方法。
(項目90)
前記パルボウイルス特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、項目89に記載の方法。
(項目91)
前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、項目90に記載の方法。
(項目92)
工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目53〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目93)
工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、項目53〜91のいずれか一項に記載の方法。
(項目94)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目92又は93に記載の方法。
(項目95)
前記方法が、ヒトHAV標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーに接触する、項目52に記載の方法。
(項目96)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目95に記載の方法。
(項目97)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目98)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される、項目97に記載の方法。
(項目99)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目96に記載の方法。
(項目100)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、項目99に記載の方法。
(項目101)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目95〜100のいずれか一項に記載の方法。
(項目102)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される、項目101に記載の方法。
(項目103)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目95〜102のいずれか一項に記載の方法。
(項目104)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目103に記載の方法。
(項目105)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目104に記載の方法。
(項目106)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目105に記載の方法。
(項目107)
工程(B)が、前記試料を、
(IV)HAV核酸標的領域を増幅するための第3及び第4増幅オリゴマーであって、
ここで、(a)前記第3 HAV増幅オリゴマーは、配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第3標的ハイブリダイズ配列を含み、(b)第4 HAV増幅オリゴマーは、配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第4標的ハイブリダイズ配列を含み、
ここで、(IV)(a)の前記第3標的ハイブリダイズ配列は、(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なり、
(IV)(b)の前記第4標的ハイブリダイズ配列は、(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列とは異なる、第3及び第4増幅オリゴマーと接触させる工程を更に含む、項目95〜106のいずれか一項に記載の方法。
(項目108)
前記第3 HAV増幅オリゴマーが、前記第1 HAV増幅オリゴマーについて項目96〜100のいずれか一項で示されているオリゴマーである、項目107に記載の方法。
(項目109)
前記第4 HAV増幅オリゴマーが、前記第2 HAV増幅オリゴマーについて項目101〜106で示されているオリゴマーである、項目107又は108に記載のオリゴマー組み合わせ。
(項目110)
工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記HAV標的核酸を精製する工程を更に含む、項目95〜109のいずれか一項に記載されている方法。
(項目111)
前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52〜57からなる群から選択される、項目110に記載の方法。
(項目112)
前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46〜51からなる群から選択される配列を有する、項目111に記載の方法。
(項目113)
前記第1又は第2 HAV増幅オリゴマーより上流の前記HAV標的核酸に対してハイブリダイズするよう構成された標的ハイブリダイズ配列を含むディスプレーサーオリゴマーを更に含む、項目95〜112のいずれか一項に記載の方法。
(項目114)
検出工程(D)が、前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記HAV増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のHAVの存在又は不在を示す工程を含む、項目95に記載の方法。
(項目115)
前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目114に記載の方法。
(項目116)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目115に記載の方法。
(項目117)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、項目116に記載の方法。
(項目118)
前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーを用いて前記インビトロ核酸増幅反応において増幅され得る擬似標的オリゴマーに接触させて、前記検出反応条件下でHAV特異的検出プローブに対して特異的にハイブリダイズしない第2増幅産物を生成する工程を更に含む、項目114〜117のいずれか一項に記載の方法。
(項目119)
前記試料を、前記HAV増幅産物に対してハイブリダイゼーションするための前記HAV特異的検出プローブオリゴマーと競合するコールドプローブオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目114〜118のいずれか一項に記載の方法。
(項目120)
前記試料を、前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマー両方に特異的にハイブリダイズするよう構成されたチューナーオリゴマーに接触させる工程を更に含む、項目114〜117のいずれか一項に記載の方法。
(項目121)
前記HAV特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、項目114〜120のいずれか一項に記載の方法。
(項目122)
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こる、項目114〜121のいずれか一項に記載の方法。
(項目123)
前記HAV特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含む、項目122に記載の方法。
(項目124)
前記HAV特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコンである、項目123に記載の方法。
(項目125)
前記HAV特異的検出プローブが、非標的ハイブリダイズ配列を更に含む、項目114〜123のいずれか一項に記載の方法。
(項目126)
前記HAV特異的検出プローブが、ヘアピン検出プローブである、項目125に記載の方法。
(項目127)
前記ヘアピン検出プローブが、分子ビーコン又は分子トーチである、項目126に記載の方法。
(項目128)
工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、項目95〜127のいずれか一項に記載の方法。
(項目129)
工程(C)の前記増幅反応が、PCR増幅反応である、項目95〜127のいずれか一項に記載の方法。
(項目130)
前記増幅反応が、リアルタイム増幅反応である、項目128又は129に記載の方法。
(項目131)
前記試料が、一個人患者からのものである、項目52〜130のいずれか一項に記載の方法。
(項目132)
前記試料がプールされている、項目52〜130のいずれか一項に記載の方法。
(項目133)
前記プールされている試料が、プールされた血漿試料である、項目132に記載の方法。
(項目134)
前記方法が、前記ヒトパルボウイルス標的核酸と前記HAV標的核酸の両方を検出するためのものであり、前記検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物及び前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物と前記HAV増幅産物に対してそれぞれ特異的にハイブリダイズするよう構成されている、パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーとHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルス及びHAVの存在又は不在を示す工程を含む、項目52に記載の方法。
(項目135)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーが、区別されて標識される、項目135に記載の方法。
(項目136)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、独立して(a)化学発光標識及び(b)蛍光標識からなる群から選択される標識を含む、項目135に記載の方法。
(項目137)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、化学発光標識を含む、項目135に記載の方法。
(項目138)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの前記化学発光標識が、パルボウイルス特異的化学発光信号とHAV特異的化学発光信号との間を区別するのに十分な、異なる発光キネティクスによって特徴付けられる、項目137に記載の方法。
(項目139)
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの化学発光標識のそれぞれが、アクリジニウムエステル(AE)を含む、項目138に記載の方法。
(項目140)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号182の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号179の配列を含む、項目134〜139のいずれか一項に記載の方法。
(項目141)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号183の配列を含む、項目140に記載の方法。
(項目142)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号75〜80からなる群から選択される配列を有する、項目141に記載の方法。
(項目143)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号184の配列に包含される、項目134〜139のいずれか一項に記載の方法。
(項目144)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号81〜84からなる群から選択される、項目143に記載の方法。
(項目145)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号185の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号180の配列を含む、項目134〜139のいずれか一項に記載の方法。
(項目146)
(I)(a)の前記第1パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号82〜84からなる群から選択される、項目145に記載の方法。
(項目147)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号187の配列に包含され、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む、項目134〜146のいずれか一項に記載の方法。
(項目148)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号186の配列を含む、項目147に記載の方法。
(項目149)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号108〜113からなる群から選択される、項目148に記載の方法。
(項目150)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号191の配列に包含される、項目134〜146のいずれか一項に記載の方法。
(項目151)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号190の配列を含む、項目150に記載の方法。
(項目152)
(I)(b)の前記第2パルボウイルス標的ハイブリダイズ配列が、配列番号118〜121からなる群から選択される、項目151に記載の方法。
(項目153)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目134〜152のいずれか一項に記載の方法。
(項目154)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目153に記載の方法。
(項目155)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目154に記載の方法。
(項目156)
前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、項目155に記載の方法。
(項目157)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含される、項目134〜156のいずれか一項に記載の方法。
(項目158)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含む、項目157に記載の方法。
(項目159)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される、項目158に記載の方法。
(項目160)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含む、項目157に記載の方法。
(項目161)
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、項目160に記載の方法。
(項目162)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含される、項目134〜161のいずれか一項に記載の方法。
(項目163)
(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含む、項目134〜163のいずれか一項に記載の方法。
(項目165)
前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列である、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有する、項目165に記載の方法。
(項目167)
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、項目166に記載の方法。
(項目168)
前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目134〜167のいずれか一項に記載の方法。
(項目169)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含される、項目168に記載の方法。
(項目170)
前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、項目169に記載の方法。
(項目171)
前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されている、項目134〜170のいずれか一項に記載の方法。
(項目172)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含される、項目171に記載の方法。
(項目173)
前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、項目172に記載の方法。
Claims (15)
- 試料中のヒトパルボウイルス標的核酸及びA型肝炎ウイルス(HAV)標的核酸のうち少なくとも1つを検出するための方法であって、前記方法が、
(A)ヒトパルボウイルスとHAVのうち少なくとも1つを含むことが疑われる試料を提供する工程と、
(B)該試料を、ヒトパルボウイルス核酸標的領域及びHAV核酸標的領域のうち少なくとも1つを増幅するためのオリゴマー組み合わせに接触させる工程であって、このオリゴマー組み合わせは、
(I)パルボウイルス標的領域について、(a)配列番号181の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号117、配列番号179、又は配列番号180の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1パルボウイルス増幅オリゴマーと、(b)(i)配列番号189の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号188の配列を含む配列、及び(ii)配列番号193の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号192の配列を含む配列、からなる群から選択される第2標的ハイブリダイズ配列を含む第2パルボウイルス増幅オリゴマーと、
並びに/又は
(II)HAV標的領域について、(a)配列番号174の配列に包含される約14〜約27の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号173の配列を含む、第1標的ハイブリダイズ配列を含む、第1 HAV増幅オリゴマーと、(b)配列番号177の配列に包含される約14〜約30の連続ヌクレオチドであり、かつ少なくとも配列番号175の配列を含む、第2標的ハイブリダイズ配列を含む、第2 HAV増幅オリゴマーと、を含む、工程と、
(C)試料中に存在する任意のパルボウイルス及び/又はHAVの標的核酸が、パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物を生成するためのテンプレートとして使用される、インビトロ核酸増幅反応を実施する工程と、
(D)パルボウイルス及び/又はHAV増幅産物の存在又は不在を検出することにより、前記試料中のパルボウイルス及び/又はHAVの存在又は不在を示す工程と、を含む、方法。 - 前記方法が、ヒトパルボウイルス標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(I)の前記第1及び第2パルボウイルス増幅オリゴマーに接触する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含み、
好ましくは前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列であり、
好ましくは前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有し、
好ましくは前記第2パルボウイルス増幅オリゴマーが、配列番号88〜93及び98〜101からなる群から選択される配列を有する、請求項2に記載の方法。 - 工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記パルボウイルス標的核酸を精製する工程を更に含み、
好ましくは前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのパルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号132〜135からなる群から選択され、
好ましくは前記パルボウイルス特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号128〜131からなる群から選択される配列を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているパルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルスの存在又は不在を示す工程を含み、
好ましくは前記パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号199内のヌクレオチド位置約2921〜約2966、又はヌクレオチド位置約2921〜約3067に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されており、
好ましくは前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号194又は195の配列内に包含され、
好ましくは前記パルボウイルス特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号137〜169からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。 - 前記パルボウイルス特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含み、並びに/或いは
前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こり、
好ましくは前記パルボウイルス特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含み、
好ましくは前記パルボウイルス特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコン又は分子トーチである、請求項5に記載の方法。 - 前記方法が、ヒトHAV標的核酸を検出するためのものであり、前記試料が(II)の前記第1及び第2 HAV増幅オリゴマーに接触し、
好ましくは(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号172の配列に包含され、
好ましくは(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号170の配列を含み、
好ましくは(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6及び11からなる群から選択される;或いは、
(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、少なくとも配列番号171の配列を含み、
好ましくは(II)(a)の前記第1 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号1〜6からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。 - (II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号176の配列に包含され、
必要に応じて(II)(b)の前記第2 HAV標的ハイブリダイズ配列が、配列番号29〜38及び45からなる群から選択される;並びに/或いは
前記第2 HAV増幅オリゴマーが、プロモータープライマー又はプロモータープロバイダーであり、前記標的ハイブリダイズ配列に対して5’の位置にプロモーター配列を更に含み、
好ましくは前記プロモーター配列が、T7プロモーター配列であり、
好ましくは前記T7プロモーター配列が、配列番号196に示される配列を有し、
好ましくは前記第2 HAV増幅オリゴマーが、配列番号12〜21及び28からなる群から選択される配列を有する、請求項7に記載の方法。 - 工程(B)の前に、前記試料中の他の構成成分から前記HAV標的核酸を精製する工程を更に含み、
好ましくは前記精製工程が、前記試料を、不動化されたプローブに結合する配列又は部分に共有結合する標的ハイブリダイズ配列を含む少なくとも1つのHAV特異的キャプチャープローブオリゴマーに接触させる工程を含み、ここで前記標的ハイブリダイズ配列は、配列番号52〜57からなる群から選択され、
好ましくは前記HAV特異的キャプチャープローブオリゴマーが、配列番号46〜51からなる群から選択される配列を有する、請求項7または請求項8に記載の方法。 - 検出工程(D)が、前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記HAV増幅産物に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されているHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のHAVの存在又は不在を示す工程を含み、
好ましくは前記HAV特異的検出プローブオリゴマーが、長さ約14〜約40のヌクレオチドである標的ハイブリダイズ配列を含み、配列番号198内のヌクレオチド位置約5965〜約6028に包含される標的配列に対して特異的にハイブリダイズするよう構成されており、
好ましくは前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号178の配列内に包含され、
好ましくは前記HAV特異的検出プローブ標的ハイブリダイズ配列が、配列番号58〜74からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。 - 前記HAV特異的検出プローブが、
(a)化学発光標識、
(b)蛍光標識、
(c)消光剤、並びに
(d)(a)、(b)、及び(c)のうち1つ以上の組み合わせ、からなる群から選択される標識を含む、請求項10に記載の方法。 - 前記検出工程(D)が、前記増幅工程(C)中に起こり、
好ましくは前記HAV特異的検出プローブが、蛍光標識、消光剤、又は両方を含み、
好ましくは前記HAV特異的検出プローブが、TaqMan検出プローブ又は分子ビーコン又は分子トーチである、請求項10又は11に記載の方法。 - 工程(C)の前記増幅反応が、等温増幅反応である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試料が、一個人患者からのものである;又は
前記試料がプールされており、
好ましくは前記プールされている試料が、プールされた血漿試料である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。 - 前記方法が、前記ヒトパルボウイルス標的核酸と前記HAV標的核酸の両方を検出するためのものであり、前記検出工程(D)が、前記パルボウイルス増幅産物及び前記HAV増幅産物の存在又は不在が決定される条件において、前記インビトロ核酸増幅反応物を、前記パルボウイルス増幅産物と前記HAV増幅産物に対してそれぞれ特異的にハイブリダイズするよう構成されている、パルボウイルス特異的検出プローブオリゴマーとHAV特異的検出プローブオリゴマーに接触させ、これにより、前記試料中のパルボウイルス及びHAVの存在又は不在を示す工程を含み、
好ましくは前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーが、区別されて標識され、
好ましくは前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、独立して(a)化学発光標識及び(b)蛍光標識からなる群から選択される標識を含む;或いは
前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーのそれぞれが、化学発光標識を含み、
好ましくは前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの前記化学発光標識が、パルボウイルス特異的化学発光信号とHAV特異的化学発光信号との間を区別するのに十分な、異なる発光キネティクスによって特徴付けられ、
好ましくは前記パルボウイルス特異的及びHAV特異的検出プローブオリゴマーの化学発光標識のそれぞれが、アクリジニウムエステル(AE)を含む、請求項1に記載の方法。
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