KR20120021268A - 나이세리아 고노리아 종 검출용 키트 및 이를 이용한 나이세리아 고노리아 종의 검출 방법 - Google Patents

Abstract

테스트 시료에서 나이세리아 고노리아를 검출하는 키트를 개시한다. 또한, 상기 키트를 사용하여 테스트 시료에서 나이세리아 고노리아를 실시간으로 검출하는 방법을 개시한다. 상기 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

Description

나이세리아 고노리아 종 검출용 키트 및 이를 이용한 나이세리아 고노리아 종의 검출 방법{Kit for detecting Neisseria gonorrhoeae strains and method for detecting Neisseria gonorrhoeae strains using the same}

본 출원은 2010년 8월 30일에 출원된 미국 가출원 제61/378,090호로부터 주장되는 우선권의 이익을 향유하며, 상기 가출원의 내용은 그 전체로 참조로서 본 명세서에 삽입된다.

본 발명은 나이세리아 고노리아 검출용 키트 및 이를 이용한 나이세리아 고노리아의 검출 방법을 개시한다. 또한, 상기 방법에서 사용하기에 적합한 올리고뉴클레오티드를 개시한다.

나이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae)는 그람-음성의 호기성 쌍구균으로, 임질을 일으키는 세균으로 알려져 있다. 전세계적으로 매년 6천만명 이상의 사람이 나이세리아 고노리아에 감염되는 것으로 보고되고 있다. 임질은 감염된 여성의 30-60%, 감염된 남성의 10% 이하에서 자각 증상이 없기 때문에 인지되지 않고, 치료되지 않은 나이세리아 고노리아가 수개월 동안 숙주에서 감염성인 채로 존재할 수 있으며, 이는 임질의 만연을 촉진하는 하나의 원인이 되고 있다.

나이세리아 고노리아에 감염된 경우, 여성은 배뇨통, 질분비물, 간격을 둔 질내 출혈, 및 복통의 증상을 나타낸다. 또한, 남성은 배뇨통 및 요도로부터의 화농성 분비물이 발생하는 증상이 나타난다. 특히, 나이세리아 고노리아는 요도로부터 남성 생식관의 기타 부분으로 만연되어, 부고환염, 전립선염, 및 다양한 기타 질환, 예를 들어 요도 주위의 농양을 야기할 수 있다. 드물게는 혈액을 통해 세균이 유포되어, 관절염, 세균혈증 또는 심내막염을 야기시킬 수도 있다. 또한, 임질은 주로 성적으로 감염되나, 감염된 산도를 통하여 신생아에 감염될 수 있다. 이는 아기에게 실명, 관절 감염 또는 생명을 위협하는 혈액 감염을 야기시킬 수 있다. 따라서, 나이세리아 고노리아의 조기 검출이 감염을 제어하기 위해 필수적이다.

따라서, 나이세리아 고노리아를 신속하고 정확하게 검출하는 방법을 개발할 필요성이 요구되고 있다.

예시적인 구체예에 따르면, 나이세리아 고노리아 종의 검출용 키트를 제공한다.

일 구체예에서, 시료 중에서 나이세리아 고노리아 종의 실시간 검출 방법을 개시한다.

일 구체예에 따르면, 제1 프라이머, 제2 프라이머 및 프로브를 포함하는, 나이세리아 고노리아 종을 높은 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 나이세리아 고노리아 종의 검출용 키트를 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 3, 또는 5의 서열을 가질 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 제2 프라이머는 서열번호 2, 4, 또는 6의 서열을 가질 수 있다.

일 구체예에 따르면, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로브를 갖는 나이세리아 고노리아 종을 실시간으로 검출하기 위한 키트를 제공한다.

일 구체예에 따르면, 하기 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나이세리아 고노리아 종을 실시간으로 검출하기 위한 키트를 제공한다

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 또는

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.

일 구체예에 따르면, 하기 프라이머 세트 및 프로브로 이루어진 군으로부터 선택되는, 나이세리아 고노리아 종을 실시간으로 검출하기 위한 키트를 제공한다:

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브; 또는

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 3, 및 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:

CAGCATTCAATTTGTTCCGAGTC (서열번호 1)

CGCCATTATGGTTATCTAACGATTC (서열번호 3) 및

CTTCGGGTTGTAAAGGACTT (서열번호 5).

일 구체예에 따르면, 상기 제2 프라이머는 서열번호 2, 4, 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:

GAACTGGTTTCATCTGATTACTTTCCA (서열번호 2)

CAAGGCTGGGAGCTTTCAAT (서열번호 4) 및

CCAGTTCAGAACGCAGTT (서열번호 6).

일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 서열번호 7, 8, 및 9의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다:

CGCCTATACGCrCrUrGrCTACTTTCACGC (서열번호 7)

TTACCGCCArArArUrGCCCGACCTTC (서열번호 8) 및

CCAATrArUrCrGGCGGCCG (서열번호 9), 상기 뉴클레오티드 "rU", "rC", "rA" 및 "rG"는 리보뉴클레오티드이다.

상기 프로브는 3' 말단 및 5' 말단의 각 말단 또는 양 말단 모두에 검출가능한 표지가 연결될 수 있다.

일 구체예에서, 상기와 같이, 정방향 및 역방향 프라이머를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 키트는 상기 프로브를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시료 중 나이세리아 고노리아 종을 정확하고, 민감하고, 신속하게 검출하는데 적합하게 사용될 수 있다.

상기 키트는 역전사효소 활성, 폴리머라제 활성 및 상기 프로브 올리고뉴클레오티드의 내부 사이트를 절단할 수 있는 절단 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 절단 시약은 RNase H, 캄차카 크랩 듀플렉스 특이적 엔도뉴클레아제(Kamchatka crab duplex specific nuclease), 엔도뉴클레아제, 및 닉킹(nicking) 엔도뉴클레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 키트는 우라실-N-글리코실라제를 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 시료 중 나이세리아 고노리아 종을 검출하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 (a) 폴리머라아제 활성, 절단제(cleaving agent), 및 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 표적 핵산과 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 제1 프로브 올리고뉴클레오티드를 반응시켜 나이세리아 고노리아의 표적 핵산을 증폭시키는 단계로서, 상기 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 어닐링할 수 있으며, 제1 프로브 올리고뉴클레오티드는 분자 내에 DNA 서열 및 RNA 서열을 갖고, 제1 검출가능한 표지를 포함하며, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드의 DNA 및 RNA 서열은 상기 표적 핵산과 실질적으로 상보적인 것으로, 제1 프로브 올리고뉴클레오티드의 RNA 서열은 상기 절단제에 의해 절단될 수 있고, 상기 프로브 내의 RNA 서열의 절단은 상기 표지로부터 검출가능한 신호를 방출하도록 하며, 상기 증폭은 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 내의 RNA 서열이 상기 표적 핵산 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성하는 조건 하에서 수행되는 것인 단계; 및 (b) 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드 상의 제1 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 시료 중에 나이세리아 고노리아가 존재함을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 시료 중 나이세리아 고노리아의 실시간 검출을 개시하는 것으로, 하기 단계를 포함한다: a) 나이세리아 고노리아의 존재를 확인하고자 하는 시료를 제공하는 단계; b) 상기 시료로부터 RNA를 추출하는 단계; c) 상기 RNA와 우라실-N-글리코실라제, DNA 폴리머라제, 역전사효소, 적절한 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트, 나이세리아 고노리아 표적 DNA와 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열 및 검출가능한 표지를 포함하는 핵산 결합 프로브, 반응 완충액, 및 상류(upstream) 프라이머 및 하류(downstream) 프라이머를 혼합하여 증폭 용액을 형성하는 단계; d) 적절한 온도 및 충분한 시간동안 상기 증폭 용액을 인큐베이팅하여 우라실-N-글리코실라제를 활성화시키고, 오염된 잔량의 주형 핵산을 제거하는 단계; e) 적절한 온도 및 충분한 시간동안 상기 증폭 용액을 인큐베이팅하여 우라실-N-글리코실라제를 불활성화시키고 상기 RNA 및 하류 프라이머를 역전사효소에 접촉시켜 cDNA를 합성하는 단계; f) 적절한 온도 및 충분한 시간동안 상기 증폭 용액을 인큐베이팅하여 역전사효소를 불활성화시키고 상기 cDNA를 변성(denaturation)시키는 단계; g) 상기 프로브 내의 핵산 서열이 나이세리아 고노리아 표적 DNA의 PCR 절편 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건 하에서, 최소 변성 온도 및 신장(elongation) 온도 사이에서 상기 증폭 용액을 온도 사이클링(thermally cycling)하는 단계로서, 상기 상류 및 하류 프라이머는 조합하여 표적 핵산 또는 그의 부분(section)을 증폭하며, 상기 부분은 나이세리아 고노리아 게놈에 유일하게 존재하는 부분으로 임의의 길이로 제공되는 것인 단계; h) 제1 검출가능한 표지를 포함하는 다수의 핵산 프로브의 상기 제1 핵산 프로브가 상기 표적 핵산 또는 그의 부분과 혼성화되도록 하는 조건 하에서 각각 검출가능한 표지를 포함하는 표적 핵산 서열 및 다수의 핵산 프로브의 반응 혼합믈을 형성하는 단계; i) 상기 핵산 프로브의 구조 또는 형태(conformation)을 변화시켜 검출가능한 표지를 활성화시키는 단계; j) 상기 반응 혼합물 내의 다수의 핵산 프로브로부터 제2 핵산 프로브를 사용하여 단계 (g) 및 (h)를 반복하는 단계로서, 상기 다수의 활성화된 검출가능한 표지가 형성되어 있는 것인 단계; 및 k) 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 실시간으로 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 시료 중에 나이세리아 고노리아가 존재함을 나타내는 것인 단계.

일 양상은, 상기 프로브 상의 표지로부터 방출되는 신호의 실시간 증가는 상기 프로브 및 상기 PCR 절편의 한가닥 사이에 형성된 헤테로듀플렉스의 RNase H 절단으로부터 야기된 것이다.

다른 구체예에서, 상기 방법은 시료 중 나이세리아 고노리아의 양을 결정하는데 사용될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 나이세리아 고노리아 종을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 개시한 바와 같이 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함한다. 상기 키트는 개시한 바와 같이 프로브를 더 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 다양한 종류의 나이세리아 고노리아 종을 검출하는 나이세리아 고노리아-특이적 프라이머는 실시간 PCR에 적합하도록 증폭 산물이 50 내지 300bp의 크기를 갖도록 제조된다.

일 구체예에 따르면, 상기 키트는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP(또는 dUTP)를 포함하는 혼합물; DNA 폴리머라제; RNase H Ⅱ; 및 완충 용액을 더 포함할 수 있다.

본 명세서에 개시된 구체예의 실험은, 달리 표시되어 있지 않으면, 당업계에서 알려진 통상적인 분자 생물학적 기법을 사용하였다. 이러한 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008) 및 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조하였다.

본 명세서에서 달리 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한 본 명세서는 상세한 설명 및 청구항의 해석을 돕기 위해 용어의 정의를 제공한다. 결과적으로, 정의가 다른 정의와 일치하지 않으면, 상기 정의는 본 명세서에 설명되어 있는 것으로 규정될 것이다.

"표적 DNA" 또는 "표적 RNA" 또는 "표적 핵산" 또는 "표적 핵산 서열"은 DNA 증폭에 의해 표적이 되는 핵산을 의미한다. 표적 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공된다. 표적 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자를 포함한다. 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

용어, "뉴클레오티드(nucleotide)"는 이중 가닥 DNA 또는 cDNA, 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA이며, 달리 기재되어 있지 않는 한, 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

용어 “프로브(probe)”는 특정 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및/또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형된 모노머(monomer) 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머(oligomer)를 의미한다. 예를들어. 상기 프로브는 혼성화의 효율을 높일 수 있도록 단일 가닥일 수 있다.

일 구체예에 따른 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오티드 서열에 완전하게 (perfectly) 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다. 혼성화에 적합한 조건은 상술한 바와 같다.

본 명세서에서 사용된 용어, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열 내에서 충분히 상보적인 2개의 핵산 가닥이 어닐링되고 안정적인 듀플렉스를 형성하는 것을 의미한다. 상기 상보성은 완전할 필요는 없다; 예를 들어, 2개의 핵산 사이에 염기 쌍의 미스매치(mismatch)가 몇개 정도 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 숫자가 너무 많아서 최소한의 엄격한 혼성화 조건에서 조차 혼성화가 일어나지 않는 경우에는, 상기 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 명세서에서 2개의 서열이 "실질적으로 상보적인" 것으로 해석되면, 상기 서열은 엄격한 혼성화 조건과 같이 선택된 반응 조건 하에서 서로가 혼성화될 수 있도록 충분히 상보적인 것을 의미한다. 특이성을 달성할 수 있는 충분한 핵산의 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 실질적으로 상보적인 서열 또는 실질적으로 상보적인 가닥은, 예를 들어, 완전하게 상보적이거나 또는 예를 들어, 쌍을 이루는 서열 및 쌍을 이루지 않는 서열 사이의 차이점을 충분히 허용하는 한 1 내지 다수의 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중 가닥 구역에서 99, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50% 이하, 또는 상기 숫자 사이의 어떠한 %의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 의미할 수 있다.

용어 “실질적으로 상보적인 서열(substantially complementary sequence)”은 당업계에 공지된 엄격 조건 하에서 주형이 되는 폴리뉴클레오티드와 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다. 용어 “엄격 조건(stringent conditions)"은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., 핵산 Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있으며, 엄격 조건은 온도, 이온세기 (완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있고, 혼성화되는 서열에 따라 다르게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄격 조건은 a) 50℃ 온도 및 0.015 M 소듐 클로라이드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 설페이트로 세척하거나, b) 혼성화 완충액 (50% 포름아미드, 2 x SSC 및 10% 덱스트란 설페이트 포함)에서 55℃로 혼성화한 다음, EDTA-함유 0.1 x SSC로 55℃에서 세척하는 조건으로 이루어질 수 있다.

용어 “프라이머(primer)”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-35개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다.

일 구체예에 따른 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, 핵산 Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다.

일 구체예에 따르면, 나이세리아 고노리아 종를 검출하기 위해 다양한 나이세리아 고노리아 종 유형에 대해 공통적으로 인식할 수 있는 나이세리아 고노리아 종 특이적인 프라이머는 50 내지 300 bp가 되도록 증폭 산물의 크기를 조절하여 제작하였다.

일 구체예에 따른 나이세리아 고노리아 종 검출용 프라이머 세트 및 프로브에서 상기 프로브는 서로 상이한 검출 가능한 수단으로 표지될 수 있다. 상기 검출 가능한 수단은 프로브에 연결, 결합, 또는 부착시켜 통상적인 방식으로 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물, 생체 분자 또는 생체 분자 유사체 등을 의미한다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 형광 표지 인자, 발광물질, 생발광물질, 동위원소 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 일 구체예에 따르면, 상기 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE563 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, Iowa Black RQ-Sp 및 MGBNFQ (molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지된 것일 수 있다. 상기 형광 표지 인자는 현재 시중에 다수 종이 시판되고 있으므로, 상업적으로 용이하게 입수 가능하다. 상기 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방출 파장이 다르며, 사용 방법 또한 상이하다. 형광 표지 인자는 당업계에 알려진 통상의 방법에 따라 상기 프로브에 표지될 수 있다. 일 구체예에 따른 카타클리브 프로브는 5'말단을 형광 표지 인자(예를 들면, Texas Red 615 등)로 3'말단을 형광 억제 물질(예를 들어, Iowa Black RQ-Sp 등)로 수식하여 PCR 반응액에 첨가될 수 있다. 카타클리브 프로브의 형광 발생 과정은 상기 설명한 바와 같다.

일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 카타클리브 프로브(Catacleave^TM probe)일 수 있다. 카타클리브 프로브 기술은 DNA 중합 효소 활성을 갖고 있지 않은 두 번째 효소, 즉 RNase H에 의해 프로브의 절단이 이루어진다는 점에서 TaqMan^TM 와 다르다. 카타클리브 프로브는 프로브 분자 내에 예를 들면, 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적이 되는 염기 서열, 즉 절단 부위를 갖는다. 일 구체예에 따르면, 카타클리브 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로 이루어져 있고, 절단 부위는 RNA로 이루어진 키메라 구조를 갖는다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은 말단 또는 내부적으로 FRET 쌍으로 표지될 수 있다. 카타클리브 프로브를 포함하는 실시간 PCR 반응에서, PCR 반응물은 RNA-DNA 듀플렉스(duplex)의 RNA 서열 부분을 특이적으로 자르는 RNase H 효소를 포함할 수 있다. 상기 효소에 의해 프로브 내의 RNA 서열 부분이 절단되면, 반응 온도에서 두 개의 반쪽 프로브(즉, 도너(donor)와 억셉터(acceptor))가 표적 엠플리콘(amplicon)으로부터 분리되고 반응 완충액으로 확산된다. 도너와 억셉터가 분리되면, TaqMan^TM 프로브와 같은 방법으로 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)이 역전되고 도너의 발산이 모니터될 수 있다. 상기 절단 및 분리는 추가적인 카타클리브 프로브의 결합을 위한 위치를 엠플리콘 상에 재생성하게 된다. 이러한 방법으로 하나의 엠플리콘이 표적으로서 역할하거나, 프라이머가 카타클리브 프로브의 결합 위치를 통해 연장될 때까지 복수 회의 프로브 절단이 가능하다. 한편, 카타클리브 프로브에 대한 상세한 설명은 Anal . Biochem . 333:246-255, 2004 및 미국 특허 제6,787,304호에 자세히 개시되어 있으며, 상기 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

용어, "올리고뉴클레오티드"는 일부 경우에서, "프라이머" 또는 "폴리뉴클레오티드"와 혼용될 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(화학적 합성과 같은)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 구입할 수 있다.

용어, "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 혼용될 수 있으며, 하나의 핵산과 다른 핵산이 염기쌍 형성 상호 작용에 의해 듀플렉스, 트리플렉스(triplex), 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 일차 상호 작용은, 예를 들어, A/T 및 G/C와 같이, Watson/Crick 및 Hoogsteen-type 수소 결합에 의한 염기 특이적이다. 일 구체예에서, 또한, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호 작용이 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다.

당업자라면, 나이세리아 고노리아 종 게놈 서열로부터 원하는 PCR 프라이머를 고안할 수 있을 것이다. 합성된 올리고는 대체적으로 55℃ 근처의 Tm(melting temperature) 값에 따라 22 내지 36 bp 길이일 수 있다.

용어, "표지(lable)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 결합된 어떠한 화학적 모이어티를 의미할 수 있으며, 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하며, 본 발명의 실험자에게 검출될 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 퀀칭제(quenching agent), 색깔 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한, 임의의 유용한 링커 분자 (예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni^{2 +}, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어. 알칼라인 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제), 전자 공여체(donor)/수용체(acceptor), 아크리디늄 에스테르, 염료(dye) 및 열량 측정 기질(calorimetric substrate)를 포함한다. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우와 같이, 질량의 변화(a change in mass)를 나타내는데 검출가능한 표지가 고려될 수 있다. 당업자는 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지에 대해서도 용이하게 인식할 수 있을 것이며, 이들 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.

다른 양상은 대상 시료로부터 총 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 DNA 및 상기 키트를 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과로부터 나이세리아 고노리아 종의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 나이세리아 고노리아 종을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 나이세리아 고노리아 종을 검출하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다. 먼저, 상기 방법은, 대상 시료로부터 총 DNA를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 검출 방법은 나이세리아 고노리아 종에 감염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 상기 시료는 예를 들어, 배양된 세포, 동물 또는 인간의 간세포, 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 타액 또는 점액 등의 체액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 DNA의 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 이에 대한 구체적인 방법은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

다음으로, 상기 분리된 총 DNA 및 상기 키트를 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 실시간 PCR을 수행하는 단계 이전에 총 RNA를 대상으로 역전사 반응을 수행하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 경우, 상기 RNA는 실시간 PCR 반응에 사용될 수 있는 주형인 DNA로 변형시켜야 한다. 역전사 반응은 당업계에 잘 알려진 다양한 종류의 역전사 효소를 이용하여 실시될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 나이세리아 고노리아 종 검출용 키트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 열 순환기(thermal cycler) 및 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, DNA 중합 효소와 FRET의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 나타나는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭 산물을 비 특이적인 증폭 산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법에 사용할 수 있는 기기로는 AB 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, BioRad 사의 Chromo 4 및 Roche Lightcycler 480 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 과정에서 상기 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현할 수 있다.

일 구체예에 따른 나이세리아 고노리아 종의 검출 방법에 있어서, 실시간 PCR 반응은 당업계에 알려진 통상적인 조건으로 실시할 수 있으며, 예를 들어, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분 동안 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 10초), 어닐링 및 RNase HⅡ의 반응(55℃에서 10초) 및 신장(elongation, 72℃에서 30초)을 총 50회 실시하는 조건으로 수행할 수 있다. 상기 방법에 의해 검출할 수 있는 나이세리아 고노리아 종은 상기한 바와 같다.

마지막으로, 상기 실시간 PCR 결과로부터 나이세리아 고노리아 종의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 나이세리아 고노리아 종의 존재 유무는 상기 실시간 PCR 과정에서 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 C_t 값을 계산함으로써 확인할 수 있다. C_t 값은 예를 들어, 15 내지 50, 또는 20 내지 45인 경우에 상기 나이세리아 고노리아 종이 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 C_t 값의 계산은 상기 실시간 PCR 기기 내에 포함된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.

나이세리아 고노리아 종을 검출하는 키트 및 상기 키트를 사용하여 나이세리아 고노리아 종을 검출하는 방법에 따르면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

상기 개시된 구체예는 시료 중 나이세리아 고노리아 종 핵산 서열을 실시간으로 검출할 수 있다는 이점을 포함하여, 많은 이점을 가지고 있다. 상기 검출 방법은 신속하고, 정확하며, 고효율에 적합하다.

증폭

상기 표적 핵산이 시료로부터 분리되고, 프라이머가 선택되면, 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 Ligase Chain Reaction, Self-Sustained Sequence Replication, Strand Displacement Amplification, Transcriptional Amplification System, Q-Beta Replicase, Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), Cleavage Fragment Length Polymorphism, Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid, Ramification-extension Amplification Method 또는 다른 적절한 핵산 증폭 방법과 같은 증폭 반응을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.

"중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은, 일반적으로 원하는 뉴클레오티드 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭하는 방법을 의미한다. 상기 과정은 미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호, 및 제4,965,188호에 상세하게 설명되어 있으며, 상기 내용은 전체로서 본 명세서에 삽입된다. 일반적으로, 상기 PCR 과정은 2배 몰농도 이상 과량의, 상기 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에 넣는 단계로 이루어져 있다. 상기 반응 혼합물은 DNA 폴리머라제의 존재 하에 온도 싸이클링(thermal cycling) 프로그램에 적용하여, 상기 DNA 프라이머 세트 사이의 원하는 표적 서열을 증폭하도록 한다.

유전자 발현을 연구하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 기법 중 하나가 PCR에 의한 증폭을 위해 mRNA 서열(들)을 주형으로 최초-가닥 cDNA를 활용하는 것이다. 종종 PCR 또는 역전사 효소-PCR로서 해석되는, 상기 방법은 PCR 과정의 높은 민감성 및 특이성을 이용하며, RNA의 검출 및 정량에 광범위하게 사용된다.

종점(end-point) 또는 실시간 어세이로서 수행되는 상기 역전사 효소-PCR 과정은 두 단계의 분리된 분자적 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통해 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR와 종종 연관된 기술적인 문제를 처리하기 위한 시도로, 상기 과정의 3가지 기본적인 단계를 고려하여 다수의 프로코콜이 개발되었다: (a) RNA의 변성(denaturation) 및 역방향 프라이머의 혼성화; (b)cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "연결되지 않은(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정(예를 들어, 투 스텝(two step) 역전사 효소-PCR)에서 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적의 완충액 조건을 사용하여 독립적인 단계로서 수행된다. cDNA 합성에 이어, 상기 반응은 Taq DNA 폴리머라제 활성에 최적인 조건으로 MgCl₂ 및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 농도가 감소하도록 희석한 다음, PCR을 표준 조건(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호를 참조한다.)에 따라 수행한다. 이에 반해, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위하여 공통의 완충액을 사용한다. 제1 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 이전 분리된 단계이며, 이후 단일 반응 용기에 첨가한다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 구성 요소이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn^{2 +}의 존재 하에서 수행되며, 이후 PCR은 킬레이트 시약에 의해 Mn^{2 +}가 제거된 후에 Mg^{2 +}의 존재 하에서 수행된다. 마지막으로, 상기 "연속적인(continuous)" 방법(예를 들어, 원 스텝(one step) 역전사 효소-PCR)은 상기 역전사 효소-PCR 3 단계를 성분 또는 효소 첨가를 위한 반응 튜브의 개방을 방지하는 하나의 연속적인 반응으로 통합한다. 연속적인 역전사 효소-PCR은 DNA 폴리머라제 및 역전사 효소 활성을 사용하는 단일 효소 시스템 및 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제의 2가지의 효소를 조합한 2 효소 시스템으로서 설명된다. RNA 변성 단계는 생략한다.

CataCleave 프로브를 이용한 나이세리아 고노리아 종 표적 핵산 서열의 실시간 PCR

상기 프로브는 일반적으로 표적이 없을 경우, 두개의 발색단 사이에서 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의해 공여체 방출이 소멸될 수 있도록 설계된다. 공여체 발색단(donor chromophore)은 여기 상태(excited state)에서, 발색단 쌍이 가까운 거리에 위치시에 수용체 발색단(acceptor chromophore)에 에너지를 전달한다. 이러한 전달은 항상 비-방사선으로, 쌍극자-쌍극자 결합(dipole-dipole coupling)을 통하여 일어난다. 발색단 사이의 거리를 충분히 증가시키는 모든 공정은 FRET 효율을 감소시켜서, 공여체 발색단 방출을 방사능적으로 검출할 수 있게 된다. 일반적인 수용체 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 Texas Red 등을 포함한다. 수용체 발색단은 공여체의 방출 스펙트럼와 여기 스펙트럼(excitation spectra)이 겹칠 수 있도록 선택된다. 예를 들어, 이러한 결합 쌍에는 FAM-TAMRA가 있다. 또한, 광범위한 공여체를 퀀치(quench)하는 비형광 수용체가 있을 수 있다. 이외에도 적합한 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려져 있다.

PCR의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있는 FRET 프로브의 공통적인 예는 분자 비콘 (molecular beacons)(예를 들어, 미국 특허 제5,925,517호), Taq-Man 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CataCleave 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 비결합상태에서는 상기 프로브는 공여체와 수용체 발색단과 근접하여, 공여체 방출을 감소시킬 수 있는 이차 구조를 형성하게끔 고안되어 있다. 적절한 반응 온도에서, 비콘은 구조가 풀어져서, 특히 앰플리콘에 결합한다. 일단 풀리게 되면, 공여체와 수용체 발색단 사이의 거리가 증가하여, FRET이 바뀌게 되고, 특별한 기기를 이용하여 공여체 방출을 모니터할 수 있게 된다. Taq-Man 및 CataCleave 기법은, 이용되는 FRET 프로브가 절단되어, 공여체와 수용체 발색단이 FRET을 바꾸기에 충분할 정도로 떨어지게 된다는 점에서 분자 비콘과는 다르다.

Taq-Man 기법은 5' 말단에 공여체 발색단으로 표지되고, 3' 말단에 수용체 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭을 위해 이용되는 상기 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 가지고 있어야 한다. Taq-Man 프로브는 프라이머가 결합할 때 같이 앰플리콘의 하나의 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 동안, 폴리머라제는 결국 결합된 Taq-Man 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때, 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성이 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 Taq-Man 프로브를 분해하게 될 것이다. 상기 프로브가 분해됨에 따라, 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드는 반응 완충액으로 나오게 된다. 공여체가 수용체로부터 확산됨에 따라, FRET은 바뀌게 된다. 공여체로부터의 방출은 프로브 절단을 확인하기 위하여 모니터된다. Taq-Man의 작용 때문에, 특별한 앰플리콘은 PCR의 매 싸이클마다 오직 한번씩 검출될 수 있다. Taq-Man 표적 부위를 통한 프라이머의 신장은 이중 가닥 산물을 생성하고, 앰플리콘이 다음 PCR 싸이클에서 변성되기 전까지 Taq-Man 프로브의 추가 결합을 막는다.

본 명세서에 참조로서 결합된 미국 특허 제5,763,181호의 내용은 또 다른 실시간 검출 방법(CataCleave라고 명명함)을 개시하고 있다. CataCleave 기법은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성이 없는 2차 효소에 의해 수행된다는 점에서 Taq-Man과 다르다. CataCleave 프로브는, 예를 들어 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적 분자 내에 서열을 가지고 있다. 일 구체예에서, CataCleave 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로, 절단 부위는 RNA로 구성되어 있는, 키메릭 구조를 가지고 있다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은, 양말단이나 또는 내부에 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase H 효소를 포함한다. 절단후에, 프로브의 반쪽 모두는 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응 용액으로 분산된다. 공여체 및 수용체가 분리될수록, FRET은 Taq-Man 프로브와 같은 방법으로 바뀌게 되며, 공여체 방출은 모니터 될 수 있다. 절단 및 해리는 추가적인 CataCleave 결합을 위한 부위를 재생산하게 된다. 이러한 방법으로, 프라이머가 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 신장될 때까지, 단일 앰플리콘이 표적으로서 또는 프로브 절단을 여러회 반복할 수 있게 해준다.

나이세리아 고노리아 종-특이적인 CataCleave 프로브의 표지

용어, "프로브(probe)"는 예를 들어, 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 범위이다. 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 45개의 뉴클레오티드 범위이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 정확한 서열 및 길이는 상기 프로브가 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 성질에 따라 부분적으로 달라진다. 결합 위치 및 길이는 특정한 구체예에서 적절한 어닐링 및 변성되는 특성을 이루기 위하여 다양할 수 있다. 이러한 고안 선택을 위한 지침은 Taq-man 어세이 또는 CataCleave를 개시하는 문헌, 미국 특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에서 발견될 수 있으며, 상기 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable lebel)"는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물을 포함하는 CataCleave 프로브의 임의의 표지를 의미할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기(excitation)되는 빛을 방출하는 형광 화합물을 의미한다. 용어, "형광 공여체(fluorescent donor 또는 or fluorescence donor)"는 본 발명에 개시된 어세이에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 의미한다. 더욱 구체적으로, 형광 공여체는 형광 수용체(acceptor)에 의해 흡수되는 빛을 제공한다. 용어, "형광 수용체(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 퀀칭(quencing) 분자를 의미한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하며, 형광 공여체에 의해 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 퀀칭 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.

어떠한 발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 퀀쳐(quencher)라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 상기 발광 분자는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, 7-디에틸아미노카우마린-3-카르복실산, 플루오레세인, Oregon Green 488, Oregon Green 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노코우마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3⁺)AMCA를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 말단 뉴클레오티드는 차단되어 있거나 또는 핵산 폴리머라제에 의해 확장되지 못하도록 되어 있다. 이러한 차단은 상기 프로브의 말단 3' 지역에 리포터(reporter) 또는 퀀쳐 분자를 부착함으로서 편리하게 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 리포터 분자는 연결 모이어티를 통해 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 끝에 부착을 위해 유래된 형광 유기 염료이다. 바람직하게는, 퀀쳐 분자는 본 발명의 구체예에 따라 형광 또는 형광이 아닐 수 있는, 유기 염료이다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 퀀쳐 분자는 비-형광이다. 일반적으로 퀀쳐 분자가 형광이거나 또는 비-방사성의 분해에 의해 리포터로부터 전달되는 에너지를 단순히 방출한다면, 상기 퀀쳐의 흡수 밴드는 상기 리포터 분자의 형광 방출의 흡수 밴드와.실질적으로 겹치게 될 것이다. 본 명세서에서, 여기된 리포터 분자로부터 흡수되지만, 방사성의 에너지를 방출시키지 않는 비-형광 퀀쳐 분자를 발색성 분자(chromogenic molecule)로 해석되어진다.

리포터-퀀쳐 쌍은 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민 염료를 포함하는 잔텐 염료(xanthene dye)들로부터 선택될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 결합을 위한 결합 부위로서 또는 결합 기능성(functionality)으로서 사용될 수 있는 페닐 모이어티 상에 치환기를 갖는, 이들 화합물의 다양한 적절한 형태를 널리 상업적으로 입수할 수 있다. 형광 화합물의 다른 그룹은 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는 나프틸아민이다. 상기 나프틸아미노 화합물은 1-디메틸아미노나프틸-5-술포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 술포네이트 및 2-p-토우리디닐-6-나프탈렌 술포네이트와 같은 화합물을 포함한다. 다른 염료는 3-페닐-7-이소시아나토코우마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지과 같은 아크리딘; N-(p-(2-벤조옥사졸릴)페닐)말레이미드; 벤조옥사디아졸, 스틸벤(stilbene), 피렌(pyrene) 등을 포함한다.

일 구체예에서, 리포터 및 퀀쳐 분자는 플루오레세인 및 비-형광 퀀쳐 염료로부터 선택된다.

올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 리포터 또는 퀀쳐 분자를 부착하는 다양한 링킹 모이어티(linking moiety) 및 방법론은 하기 참고 문헌에 예시되어 있다: Eckstein, editor, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acid Research, 15: 5305-5321 (1987) (3' thiol group on oligonucleotide); Sharma et al., Nucleic Acid Research, 19: 3019 (1991) (3' sulfhydryl); Giusti et al., PCR Method and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung et al., 미국 특허 제4,757,141호 (5' phosphoamino group via Aminolink. II available from Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Stabinsky, 미국 특허 제4,739,044호 (3' aminoalkylphosphoryl group); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (attachment via phosphoramidate linkages); Sproat et al., Nucleic Acid Research, 15: 4837 (1987) (5' mercapto group); Nelson et al., Nucleic Acid Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' amino group) 등.

로다민 및 비-형광 퀀쳐 염료는 또한 고체상 합성의 시작 단계에서 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 편리하게 부착될 수 있다, 예를 들어, Woo et al., 미국 특허 제5,231,191호; 및 Hobbs, Jr., 미국 특허 제4,997,928호를 참조한다.

고체 지지체에의 나이세리아 고노리아 종-특이적 CataCleave 프로브의 부착

본 발명의 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상이한 프로브들은 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료 내의 상이한 표적 서열을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 상이한 형광 파장을 갖는 리포터 분자는 상이한 프로브에 사용될 수 있고, 따라서 상이한 프로브에 대한 혼성화가 별개로 검출되는 것을 가능하게 한다.

올리고뉴클레오티드 프로브의 고정을 위한 고체 지지체의 바람직한 형태의 예는 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 통제된 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 유리 플레이트 및 고 교차-결합(highly cross-linked) 폴리스티렌을 포함한다. 이러한 고체 지지체들은 그들의 화학적 안정성, 기능화(functionalization)의 용이함 및 잘 규정된 표면 면적 때문에 혼성화 및 진단 연구에서 바람직하다. 통제된 공극 유리 (500 Å, 1000 Å) 및 비-팽창 고 교차-결합 폴리스티렌 (1000 Å)과 같은 고체 지지체가 올리고뉴클레오티드 합성과의 그들의 친화성(compatibility) 때문에 특히 바람직하다.

올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 다양한 방식으로 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 프로브는 상기 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드를 상기 고체 지지체에 부착하는 것에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 상기 프로브는 상기 프로브를 상기 고체 지지체로부터 거리를 두도록 하는 링커에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상기 링커는 가장 바람직하게는 30 원자 길이 이상, 더 바람직하게는 50 원자 길이 이상이다.

고체 지지체에 고정된 프로브의 혼성화는 일반적으로 상기 프로브가 30 원자 이상, 더 바람직하게는 50 원자 이상에 의해 상기 고체 지지체로부터 분리되는 것을 필요로 한다. 이러한 분리를 성취하기 위해서, 링커는 일반적으로 상기 링커 및 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서(spacer)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 상기 링커 팔(arm)은 보통 염기성 시약으로 절단되어 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 자유롭게 할 수 있는 에스테르 결합에 의해 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다.

올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 지지체에 부착하는데 사용할 수 있는 다양한 종류의 링커가 당업계에 알려져 있다. 링커는 표적 서열이 고체 지지체에 부착된 프로브에 혼성화되는 것을 현저하게 방해하지 않는 임의의 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 쉽게 첨가될 수 있는 동종중합체 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 기능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 상기 링커로서 사용될 수 있다. 이러한 폴리머는 그들이 프로브의 표적 올리고뉴클레오티드에의 혼성화를 현저하게 방해하지 않기 때문에 동종중합체 올리고뉴클레오티드에 비해 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 그것이 상업적으로 구입 가능하고, 유기 및 수성 배지 모두에 용해 가능하고, 기능화하기 편리하고, 및 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성-후 상태 하에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다.

고체 지지체, 링커 및 프로브 간의 결합은 높은 온도에서의 염기 조건 하에서 염기 보호기의 제거 동안 바람직하게는 절단되지 않는다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정(immobilization)은 당업계에 잘 알려져 있고, 업계의 통상의 기술자는 고정 조건을 결정할 수 있다.

본 방법의 일 구체예에 따르면, 혼성화 프로브는 고체 지지체 상에 고정된다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 혼성화에 유리한 조건 하에서 핵산의 시료과 접촉된다. 비혼성화 상태에서는, 형광 표지는 퀀쳐(quencher)에 의해 억제된다. 표적과 혼성화되면, 형광 표지는 퀀쳐로부터 분리되어 형광을 발한다.

또한 고체 지지체에의 혼성화 프로브의 고정은 프로브에 혼성화된 표적 서열을 시료로부터 쉽게 분리될 수 있게 한다. 그 후의 단계에서, 분리된 표적 서열을 고체 지지체에서 분리하여 연구자의 특별한 필요에 따라, 당업계에 잘 알려진 방법으로 가공(예를 들어, 정제, 증폭)될 수 있다.

CataCleave 프로브를 사용한 나이세리아 고노리아 종 표적 핵산 서열의 실시간 검출.

상기 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 시료 내에서 나이세리아 고노리아 표적 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 프로브로서 사용될 수 있다.

CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브는 먼저 선택된 나이세리아 고노리아 표적 서열을 포함하는 PCR 엠플리콘 내에서 발견되는 서열과 상보적인 DNA 및 RNA 서열로 합성된다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 FRET 쌍, 예를 들면 프로브의 한 쪽 말단은 플루오레세인 분자로 및 다른 말단은 비-형광 퀀쳐 분자로 표지된다. 따라서, 상기 프로브가 PCR 엠플리콘과 혼성화 되었을 때, RNase H 활성에 의해 절단될 수 있는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 형태가 형성된다.

RNase H는 RNA-DNA 혼성체에서 RNA를 가수분해한다. 이 효소는 처음 소의 가슴샘에서 확인되었으나 그 후 다양한 생물에서 발견되었다. RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에 편재하여(ubiquitous) 나타난다. 비록 RNase H가 다양한 분자량 및 핵 용해 활성의 단백질 패밀리로 구성되나, 기질 필요물은 다양한 동형(isotype) 간에 유사하게 나타난다. 예를 들면, 지금까지 연구된 대부분의 RNase H는 엔도뉴클레아제로서 기능을 하고 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는 절단 생산물을 생산하기 위해 2가 양이온(예를 들면, Mg^{2 +}, Mn^{2 +})을 필요로 한다.

E. coli 유래의 RNase HI는 RNase H 패밀리 중 가장 잘 알려져 있다. RNase HI외에도, 2번째의 E. coli RNase H, RNase HII가 클로닝되고 특성이 확인되었다 (Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8587-8591). RNase HI은 155개의 아미노산으로 이루어져 있는데 비해, 이는 213개의 아미노산으로 이루어져 있다. E. coli RNase HII는 E. coli RNase HI과 단지 17%의 상동성(homology)를 나타낸다. S. 티피무리움으로부터 클로닝된 RNase H는 E. coli RNase HI와 단지 11개의 위치에서 상이하고 155개의 아미노산으로 이루어져 있다 (Itaya, M. and Kondo K., 핵산s Res., 1991, 19, 4443-4449).

RNase H 활성을 나타내는 단백질이 클로닝되고 여러 개의 바이러스, 다른 박테리아 및 효모로부터 정제되었다 (Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). 많은 경우에 있어서, RNase H 활성을 갖는 단백질들이 RNase H가 다른 효소, 보통 DNA 또는 RNA 폴리머라제의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된 융합 단백질로 나타난다. RNase H 도메인은 대장균 RNase HI과 높은 상동성이 있는 것으로 지속적으로 밝혀졌으나 다른 도메인이 실질적으로 다양하여, 융합 단백질의 분자량 및 다른 특성이 매우 다양하다.

고등 진핵 생물에서 RNase H의 2개 클래스는 분자량, 2가 양이온의 효과, 술프히드릴(sulfhydryl) 시약에 대한 감수성 및 면역학적 교차-반응성의 차이에 기초하여 정의되어 왔다(Busen et al., Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203-208). RNase HI 효소는 68-90 kDa 범위의 분자량을 가지고, Mn^{2 +} 또는 Mg^{2 +}에 의해 활성화되고 및 술프히드릴 시약에 무감수성인 것으로 보고되었다. 반대로, RNase H II 효소는 31-45 kDa 범위의 분자량을 갖고, Mg^{2 +}를 필요로하고, 술프히드릴 시약에 고감수성을 보이고, Mn^{2 +}에 의해 억제되는 것으로 보고되었다(Busen, W., and Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179-190; Kane, C. M., Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7106-7108.).

RNase HII 특성을 갖는 효소가 인간 태반으로부터 거의 균질하게 정제되었다 (Frank et al., 핵산s Res., 1994, 22, 5247-5254). 이 단백질은 약 33kDa의 분자량을 갖고 6.5-10의 pH 범위에서 활성화되고 최적 pH가 8.5-9인 것으로 보고된다. 상기 효소는 Mg^{2 +}를 필요로 하고 Mn^{2 +}및 n-에틸 말레이미드에 의해 억제되는 것으로 보고되었다. 절단 반응의 생성물은 3' 히드록실 및 5' 포스페이트 말단을 갖는다.

일 구체예에 따르면, 실시간 핵산 증폭은 열안정성 핵산 폴리머라제, RNase H 활성, 나이세리아 고노리아 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 PCR 증폭 프라이머 쌍, 및 표지된 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브의 존재 하에 표적 폴리뉴클레오티드에서 수행된다. 실시간 PCR 반응 동안, RNase H에 의한 프로브의 절단은 형광 퀀쳐로부터 형광 공여체를 분리시켜 시료 내의 나이세리아 고노리아 표적 DNA 서열의 실시간 검출에 따라 프로브의 형광이 실시간으로 증가하게 한다.

일 구체예에서, 실시간 핵산 증폭은 약 45회 이하의 PCR 증폭 싸이클에서 단일 표적 DNA 분자의 실시간 검출을 가능하게 한다.

시료 중 나이세리아 고노리아 종 유전자 서열의 실시간 검출의 예시

먼저, 상기 방법은, 대상 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 일 구체예에 따른 검출 방법은 나이세리아 고노리아 종에 감염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 상기 시료는 예를 들어, 배양된 세포, 동물 또는 인간의 간세포, 혈액, 혈장, 혈청, 정액, 타액 또는 점액 등의 체액을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 RNA의 분리는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 이루어질 수 있다. 이에 대한 구체적인 방법은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

다음으로, 상기 방법은 상기 분리된 총 RNA 및 관련된 반응 성분들을 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함한다.

일 구체예에 따르면, 상기 실시간 PCR을 수행하는 단계 이전에 상기 분리된 총 RNA를 대상으로 역전사 반응을 수행하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 이경우, 상기 분리된 RNA는 실시간 PCR 반응에 사용될 수 있는 주형인 cDNA로 변형시켜야 한다. 역전사 반응은 Avian Myeloblastosis Virus (AMV) 또는 Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) 등으로부터 분리된 당업계에 잘 알려진 다양한 종류의 역전사 효소를 이용하여 실시될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 온도 사이클링의 수행 및 결과물 특이적인 증폭된 산물의 실시간 검출을 위한 기기는 상업적으로 구입 가능하다. 상기 실시간 PCR 방법에 사용할 수 있는 기기로는 Applied Biosystems Incorporated 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, BioRad 사의 Chromo 4 및 Roche Lightcycler 480 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 실시간 PCR을 수행하는 동안, 이들 기기는 검출가능한 표지로부터 방출 강도의 변화를 모니터링하여 상기 정보를 표적 주형이 테스트 시료에 존재하는지 여부를 결정하는데 분석될 수 있는 그래픽 및/또는 수치 정보로 변환한다.

일 구체예에 따른 나이세리아 고노리아 종의 검출 방법에 있어서, 실시간 PCR 반응은 당업계에 알려진 통상적인 조건으로 실시할 수 있으며, 예를 들어, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분 동안 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 10초), 어닐링 및 RNase HⅡ의 반응(55℃에서 10초) 및 신장(elongation, 72℃에서 30초)을 총 60회 실시하는 조건으로 수행할 수 있다. 상기 방법에 의해 검출할 수 있는 나이세리아 고노리아 종은 상기한 바와 같다.

마지막으로, 상기 실시간 PCR 결과로부터 나이세리아 고노리아 종의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 나이세리아 고노리아 종의 존재 유무는 상기 실시간 PCR 과정에서 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 C_t 값을 계산함으로써 확인할 수 있다. C_t 값은 예를 들어, 15 내지 50, 또는 20 내지 45인 경우에 상기 나이세리아 고노리아 종이 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 C_t 값의 계산은 상기 실시간 PCR 기기 내에 포함된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.

하기 실시예에서 사용된 효소 "Hot Start" RNase HII는 가역적으로 변형된 RNase HII이다. 상기 변형된 효소가 Tris 기반의 완충액과 함께 반응에서 사용되고, 온도를 95℃로 올리면, 상기 용액의 pH는 떨어지고, RNase H 활성은 회복된다. 이 방법은 역전사의 시작 이전에 반응 혼합물에서 RNase H를 포함하도록 한다. RNase HII 및 이에 대한 자세한 내용은 2010년 5월 25일에 제출된 미국 가출원 제61/347,984호에 개시되어 있으며, 이는 전체로 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

일 구체예에 따른 나이세리아 고노리아 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 나이세리아 고노리아 종의 porA 유전자를 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다.
도 2는 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 나이세리아 고노리아 종의 NGO1849 유전자(유전자 위치 번호는 Neisseria gonorrhoeae strain FA1090에 명시됨)를 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다.
도 3은 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 나이세리아 고노리아 종의 16S rDNA 유전자를 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다.
도 4는 NG_F_16S(서열번호 5) 및 NG_R_16S(서열번호 6)의 프라이머 세트 및 NG_CC_16S(서열번호 9)의 프로브를 포함하는 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 나이세리아 고노리아 및 나이세리아 메닌지티스의 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 나이세리아 고노리아의 실시간 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작

나이세리아 고노리아의 실시간 검출을 위해 사용된 프라이머는 잠재적으로 어닐링할 수 있고, 서열 증폭을 시작할 수 있는 프라이머 세트로서, 나이세리아 고노리아의 게놈 상에 존재하는 porA 유전자, NGO1849 유전자 및 16s rDNA 유전자의 일부와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 염기 서열은 Neisseria gonorrhoeae strain FA1090 (NCBI accession number NC_002946)의 게놈으로부터 porA 유전자, NGO1849 유전자 및 16s rDNA 유전자의 뉴클레오티드 서열을 얻어 확인하였으며, 컴퓨터-기반 프라이머-디자인 프로그램인, Primer Express 3 (Applied Biosystems) 를 통해 실시간 PCR에 사용될 수 있는 프라이머 세트를 선별하였다. 상기 선별된 프라이머의 염기 서열을 다시 BLAST로 분석하여 각각의 프라이머 세트가 나이세리아 고노리아의 게놈 상에 존재하는 porA 유전자, NGO1849 유전자 및 16s rDNA 유전자의 일부만을 증폭할 수 있음을 확인하였다.

프로브는 상기 PCR의 대상이 되는 주형에 특이적으로 결합할 수 있는 카타클리브 프로브(Catacleave probe)를 제작하여 실시간 PCR에서 실시간으로 증가하는 PCR 산물의 양을 검출할 수 있도록 하였다. 상기 프로브는 PCR 과정 중, 프로브에서 발생되는 형광에 의해 PCR 산물의 양이 확인되므로, 기존의 PCR 산물을 확인하는 겔 전기 영동 방식에 비해 높은 민감도를 나타낸다. 상기 프로브는 상기 프라이머의 제작과 동일한 방법에 의해, 상기 프라이머 세트에 의해 증폭되는 주형인 나이세리아 고노리아의 게놈 상에 존재하는 porA 유전자, NGO1849 유전자 및 16s rDNA 유전자의 염기 서열 내에서 선택되었으며, FAM 또는 TYE^TM 665로 5' 말단을 표지하였고, Iowa Black^TM FQ 또는 Black^TM RQ로 3' 말단을 표지하였다. 상기 결정된 프라이머 및 프로브는 Integrated DNA Technologies, Inc에 의뢰하여 합성하였다.

한편, 본 실험에서 사용한 프라이머 및 프로브의 염기 서열을 표 1에 나타내었다.

서열 번호	프라이머/프로브 이름	서열(5'-3')
1	NG_F_A3	CAGCATTCAATTTGTTCCGAGTC
2	NG_R_A3	GAACTGGTTTCATCTGATTACTTTCCA
3	NG_F_D4	CGCCATTATGGTTATCTAACGATTC
4	NG_R_D4	CAAGGCTGGGAGCTTTCAAT
5	NG_F_16S	CTTCGGGTTGTAAAGGACTT
6	NG_R_16S	CCAGTTCAGAACGCAGTT
7	NG_CC_A3	CGCCTATACGCrCrUrGrCTACTTTCACGC
8	NG_CC_D4A	TTACCGCCArArArUrGCCCGACCTTC
9	NG_CC_16S	CCAATrArUrCrGGCGGCCG

상기 표에서 소문자 "r"은 RNA 염기를 의미하며, 예를 들어, rG는 리보구아노신이다. 프로브의 5'말단 및 3'말단은 각각 NG_CC_A3 (서열번호 7), NG_CC_D4A (서열번호 8) 및 NG_CC_16S (서열번호 9)는 FAM 및 IAbFQ (Iowa Black^TM FQ), 또는 TYE665 (TYE^TM 665) 및 IAbRQ (Iowa Black^TM RQ)로 표지되어 있다.

실시예 2: 실시간 PCR 을 이용한 나이세리아 고노리아의 검출 방법

QiaSpin DNA Miniprep Kit (Qiagen)를 사용하여 실시간 PCR에서 주형으로 사용될 porA, NGO1849 또는 16S rDNA 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 나이세리아 고노리아로부터 추출하였다. 본 실시예에서 모든 실시간 PCR 반응은 23 ㎕의 마스터 믹스 및 2 ㎕의 DNA를 포함한 혼합액으로 수행하였다. 상기 23 ㎕의 카타클리브 마스터 믹스는 2.5 ㎕의 완충액, 5 μM의 정방향 프라이머(서열번호 1, 서열번호 3, 또는 서열번호 5) 1 ㎕, 5 μM의 역방향 프라이머(서열번호 2, 서열번호 4, 또는 서열번호 6) 1 ㎕, 5 μM의 카타클리브 프로브(서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 9) 1 ㎕, dNTP 믹스(10 mM dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP) 0.2 ㎕, 0.5 ㎕의 Platinum Taq DNA 중합효소(Invitrogen), 0.1 ㎕의 우라실-N-글리코실라제(UNG)(10 U/㎕), 0.5 ㎕의 Pfu RNase HⅡ(5 U/㎕), 및 23 ㎕의 증류수를 포함한다.

상기 반응물은 먼저, 37℃에서 10분 및 95℃에서 10분 동안 우라실 DNA N-글리코실라아제 반응 및 변성 반응을 시킨 다음, ① 95℃에서 15초 동안 변성, ② 60℃ 또는 63℃에서 20초 동안 프라이머 및 카타클리브 프로브의 어닐링(annealing), RNase HⅡ의 반응, ③ 72℃에서 20초 동안 신장(elongation) 반응을 50회 반복하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반응은 Roche Lightcycler 480 기기를 사용하여 수행하였으며, PCR 증폭 유무는 LightCycler 480 Software v1.5.0를 이용하여 실시간으로 관찰하였다.

실시예 3: 나이세리아 고노리아의 검출

나이세리아 고노리아의 검출 표적을 포함하는 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다. 상기 플라스미드 DNA의 농도는 260 nm의 OD 값으로 결정하였다. 상기 DNA 표적을 10 mM Tris (pH 8.0)의 pH-완충용액에 5 또는 10 카피/㎕가 되도록 연속 희석하였다. 나이세리아 고노리아를 대상으로, NG_F_A3(서열번호 1) 및 NG_R_A3(서열번호 2)의 프라이머 세트 및 프로브(NG_CC_A3(서열번호 7))를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 및 카타클리브 반응은 실시예 2에 개시된 바와 동일한 조건으로 수행하였다. 도 1은 상기 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다. 또한, 하기 표 2는 도 1의 증폭 곡선으로부터 C_p값을 계산하여 나타낸 결과이다. 상기 실험에서 주형의 초기 카피 수는 1 x 10⁶이었으며, 10 카피까지 희석하였다. 하기 결과는 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, 10개 이하의 카피만으로도 증폭이 가능함을 보여주었다. 한편, DNA 주형 대신 증류수를 첨가한 음성 대조군에서는 형광이 검출되지 않았다.

주형의 카피수	Cp 값
증류수	N
10	37.90
100	33.05
1,000	30.57
10,000	26.44
100,000	23.01
1,000,000	17.53

실시예 4: 나이세리아 고노리아의 검출

나이세리아 고노리아의 검출 표적을 포함하는 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다. 상기 플라스미드 DNA의 농도는 260 nm의 OD 값으로 결정하였다. 상기 DNA 표적을 10 mM Tris (pH 8.0)의 pH-완충용액에 5 또는 10 카피/㎕가 되도록 연속 희석하였다. 나이세리아 고노리아를 대상으로, NG_F_D4(서열번호 3) 및 NG_R_D4(서열번호 4)의 프라이머 세트 및 프로브(NG_CC_D4A(서열번호 8))를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 및 카타클리브 반응은 실시예 2에 개시된 바와 동일한 조건으로 수행하였다. 도 2는 상기 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다. 또한, 하기 표 3은 도 1의 증폭 곡선으로부터 C_p값을 계산하여 나타낸 결과이다. 상기 실험에서 주형의 초기 카피 수는 5 x 10⁶이었으며, 5 카피까지 희석하였다. 하기 결과는 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, 5개의 카피만으로도 증폭이 가능함을 보여주었다. 한편, DNA 주형 대신 증류수를 첨가한 음성 대조군에서는 형광이 검출되지 않았다.

주형의 카피수	Cp 값
증류수	N
5	41.14
50	35.21
500	31.42
5,000	28.25
50,000	24.98
500,000	21.30
5,000,000	17.52

실시예 5: 나이세리아 고노리아의 검출

나이세리아 고노리아의 검출 표적을 포함하는 플라스미드 DNA를 분리 정제하였다. 상기 플라스미드 DNA의 농도는 260 nm의 OD 값으로 결정하였다. 상기 DNA 표적을 10 mM Tris (pH 8.0)의 pH-완충용액에 5 카피/㎕가 되도록 연속 희석하였다. 나이세리아 고노리아를 대상으로, NG_F_16S(서열번호 5) 및 NG_R_16S(서열번호 6)의 프라이머 세트 및 프로브(NG_CC_16S(서열번호 9))를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.

상기 반응물은 먼저, 37℃에서 10분 및 95℃에서 10분 동안 우라실 DNA N-글리코실라아제 반응 및 변성 반응을 시켰다. 이후, 95℃에서 15초 동안 변성, 63℃에서 20초 동안 50회 반복하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반응은 Roche Lightcycler 480 기기를 사용하여 수행하였으며, 형광의 변화는 LightCycler 480 Software v1.50을 이용하여 실시간으로 관찰하였다.

도 3은 상기 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다. 상기 실험에서 주형의 초기 카피 수는 5 x 10⁵이었으며, 5 카피/㎕ 까지 희석하였다. 하기 결과는 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, 10개 이하의 카피만으로도 증폭이 가능함을 보여주었다. 한편, DNA 주형 대신 증류수를 첨가한 음성 대조군에서는 형광이 검출되지 않았다.

실시예 6: 나이세리아 메닌지티스( Neisseria meningitidis )와의 교차 반응의 부재 실험

게놈 수준에서, 나이세리아 고노리아는 그의 가장 가까은 종인 나이세리아 메닌지티스와 약 98%의 서열 동일성을 갖는다. 특히, 두 종의 16s rDNA 서열의 얼라인먼트(alignment)는 99%의 서열 동일성을 나타낸다. 따라서, 16s rDNA에 기반한 검출 어세이를 수행하여 나이세리아 메닌지티스로부터의 위-양성(false-positive) 결과를 야기할 가능성을 평가하였다. Neisseria meningitidis strain FAM18 (ATCC700532D)의 게놈 DNA를 American Type Culture Collection로부터 구입하여, 260 nm에서 OD값을 측정하여 정량하였다. 이후, 상기 DNA 표적을 10 mM Tris (pH 8.0)의 pH-완충용액에 5 x 10⁵ 카피/㎕가 되도록 연속 희석하였다. 나이세리아 고노리아를 대상으로, NG_F_16S(서열번호 5) 및 NG_R_16S(서열번호 6)의 프라이머 세트 및 프로브(NG_CC_16S(서열번호 9))를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. PCR 및 카타클리브 반응은 실시예 5에 개시된 바와 동일하게 수행하였다.

도 4는 실시간 PCR 동안 얻어진 증폭 곡선을 나타낸다. 상기 결과로부터 나이세리아 고노리아의 검출 어세이가 나이세리아 메닌지티스와 교차 반응하지 않음을 관찰할 수 있다. 이는 면역어세이에서 통상적으로 일어날 수 있는, 나이세리아 메닌지티스와의 교차 반응성의 가능성을 배제하는 것이다.

상기 실시예의 결과로부터 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브를 이용하면, 기존의 방법에 비해 더 적은 양의 시료만으로도 나이세리아 고노리아를 효율적으로 검출할 수 있으며, 검체로부터 나이세리아 고노리아를 검출하는데 시간과 노력을 절감할 수 있다는 사실을 알 수 있다.

본 발명은 구체적으로 표현되고, 그의 예시적인 구체예에 대한 참조로 개시되어 있지만, 당업자에게 하기 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서 다양하게 설명되고 형태가 변화될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

<110> Samsung Techwin Corporation <120> KIT FOR DETECTING NEISSERIA GONORRHOEAE STRAINS AND METHOD FOR DETECTING NEISSERIA GONORRHOEAE STRAINS USING THE SAME <130> PN089134 <150> US61/378,090 <151> 2010-08-30 <150> US13/161,115 <151> 2011-06-15 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (NG_F_A3) <400> 1 cagcattcaa tttgttccga gtc 23 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (NG_R_A3) <400> 2 gaactggttt catctgatta ctttcca 27 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (NG_F_D4) <400> 3 cgccattatg gttatctaac gattc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (NG_R_D4) <400> 4 caaggctggg agctttcaat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (NG_F_16) <400> 5 cttcgggttg taaaggactt 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (NG_R_16) <400> 6 ccagttcaga acgcagtt 18 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Probe Construct <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> RNA Region <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is uracil <400> 7 cgcctatacg ccngctactt tcacgc 26 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Probe Construct <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> RNA Region <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is uracil <400> 8 ttaccgccaa angcccgacc ttc 23 <210> 9 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Probe Construct <220> <221> misc_feature <222> (5)..(8) <223> RNA Region <220> <221> misc_feature <222> (7) <223> n is uracil <400> 9 ccaatancgg cggccg 16 <210> 10 <211> 1062 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1062) <223> NGO1849 gene (strain FA1090) <400> 10 ctatttcttc tcgccgccga aaccgataac agcttgatgt ttatgctctt ggcttacagc 60 acctgctact tcattagccg cttcgccgaa aatacccaaa tgatactttt taatctcatt 120 atccttctct aacatagcca ccccttcgtt cacgccgaaa taagaaaccc ggtctttcaa 180 ccccaagctg gagccggact ctcgataagg gattctctca atagcagctt cttctaattt 240 gatcttgcca tattgttcca ttccttcaat tgagccagag ccttttctac gatcaaaatc 300 aattgtgtat ctaaatacgc cattatggtt atctaacgat tctttggata aaaccccatt 360 accgccaaat gcccgacctt catattgaaa gctcccagcc ttgggtaatt tgtcttcatc 420 tgttgccacg cctctaatgt cgcccagata caagtcaaaa ggaatctctt caggattttg 480 tccatcccct tctataggat taccgtcttt tcgactgtag ccaaaatagc ctctaaccac 540 agaatacggt tgctcataaa cccaagtttt taatagcgca taattctgtt ctttatccgc 600 accgtaaaac tcaatctttt gctcactcaa acctttgggg agaacatcta gttccccccc 660 cttactacct tcgtattttt taccattaac atatacatcc atcttctgaa gttgttcctt 720 actaaacggc tcttcgccgt ctagaaatag cattgccttg acagattcac ccttaccgag 780 cttacctgca tattgttttc gcactcctgt atattcatca cctttaacct ttaatacttt 840 ggcttgcaat tcttttggta catcttttaa tgatgatttc ttcagatatt caataacttt 900 ttcatctttc gcatcaacat ttgcattgtc tttcagttgt tccgaaacgc ttggttgaac 960 cgacatagat gaatcggaac cgccacccgc gcacgctgtt agccccatag aagcaataac 1020 agcaataaca agtttattca ttgctgattg agatactttc at 1062

Claims (21)

1. 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드를 갖는 제1 프라이머; 및
   서열번호 2, 서열번호 4, 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열의 올리고뉴클레오티드를 갖는 제2 프라이머를 포함하는, 나이세리아 고노리아(Chlamydia trachomatis) 종의 검출용 키트.
2. 제1항에 있어서, 상기 키트는 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인 키트.
3. 하기 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 프라이머 세트를 포함하는 나이세리아 고노리아 종의 검출용 키트:
   서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트;
   서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트; 및
   서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트.
4. 하기 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 나이세리아 고노리아 종의 검출용 키트:
   서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;
   서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브; 또는
   서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제1 프라이머 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.
5. 제1항에 있어서, 상기 키트는 증폭 폴리머라아제 활성 및 RNase H 활성을 더 포함하는 것인 키트.
6. 제1항에 있어서, 상기 키트는 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 키트.
7. 제2항에 있어서, 상기 프로브의 5' 말단은 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670, TYE 563 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단은 6-TAMRA, BHQ-1,2,3, Iowa Black RQ-Sp 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 형광 퀀쳐(fluorescence quencher)로 표지된 것인 키트.
8. 제1항에 있어서, 상기 키트는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물; DNA 폴리머라제; RNase H Ⅱ; 및 완충 용액을 더 포함하는 것인 키트.
9. 제2항에 있어서, 상기 키트는 우라실-N-글리코실라아제를 더 포함하는 것인 키트.
10. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 고체 지지체에 연결된 것인 키트.
11. 제2항에 있어서, 상기 프로브는 용액 내에 부유 상태(free form)으로 존재하는 것인 키트.
12. 제8항에 있어서, 상기 증폭 폴리머라아제 활성은 열안정성 DNA 폴리머라아제 활성인 것인 키트.
13. 제8항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H 활성인 것인 키트.
14. 제8항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트(hot start) RNase H 활성인 것인 키트.
15. a) 폴리머라아제 활성, 절단제(cleaving agent), 및 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재 하에 표적 핵산과 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드, 제2 프라이머 올리고뉴클레오티드, 및 제1 프로브 올리고뉴클레오티드를 반응시켜 나이세리아 고노리아의 표적 핵산을 증폭시키는 단계로서, 상기 제1 프라이머 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산과 어닐링할 수 있으며, 제1 프로브 올리고뉴클레오티드는 분자 내에 DNA 서열 및 RNA 서열을 갖고, 제1 검출가능한 표지를 포함하며, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드의 DNA 및 RNA 서열은 상기 표적 핵산과 실질적으로 상보적인 것으로, 제1 프로브 올리고뉴클레오티드의 RNA 서열은 상기 절단제에 의해 절단될 수 있고, 상기 프로브 내의 RNA 서열의 절단은 상기 표지로부터 검출가능한 신호를 방출하도록 하며, 상기 증폭은 상기 프로브 올리고뉴클레오티드 내의 RNA 서열이 상기 표적 핵산 내의 상보적인 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성하는 조건 하에서 수행되는 것인 단계; 및
    b) 상기 제1 프로브 올리고뉴클레오티드 상의 제1 표지로부터 방출되는 신호의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 시료 중에 나이세리아 고노리아가 존재함을 나타내는 것인 단계를 포함하는 시료 중 나이세리아 고노리아 종을 검출하는 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 표적 핵산은 나이세리아 고노리아 종의 DNA인 것인 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 단계 a) 및 단계 b)는 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
18. 제15항에 있어서, 상기 방법은,
    c) 제1 및 제2 표지로부터 신호의 방출 강도가 베이스라인 값 이상의 고정된 임계값에 도달하는 경우 임계 증폭반응 사이클 횟수를 결정하는 단계; 및
    d) 시료 중 나이세리아 고노리아 종에 대해 결정된 임계 증폭반응 사이클 횟수와 알려진 양의 나이세리아 고노리아 종에 대해 결정된 레퍼런스(reference) 임계 증폭반응 사이클 횟수를 비교하여 시료 중 나이세리아 고노리아의 양을 계산하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
19. 제15항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 서열번호 3, 및 서열번호 50의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    CAGCATTCAATTTGTTCCGAGTC (서열번호 1),
    CGCCATTATGGTTATCTAACGATTC (서열번호 3) 및
    CTTCGGGTTGTAAAGGACTT (서열번호 5).
20. 제15항에 있어서, 상기 제2 프라이머는 서열번호 2, 서열번호 4, 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    GAACTGGTTTCATCTGATTACTTTCCA (서열번호 2),
    CAAGGCTGGGAGCTTTCAAT (서열번호 4) 및
    CCAGTTCAGAACGCAGTT (서열번호 6).
21. 제15항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
    CGCCTATACGCrCrUrGrCTACTTTCACGC (서열번호 7),
    TTACCGCCArArArUrGCCCGACCTTC (서열번호 8) 및
    CCAATrArUrCrGGCGGCCG (서열번호 9), 상기 뉴클레오티드 "rG"는 리보뉴클레오티드이다.

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