JP2014522235A - セリンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 - Google Patents

セリンプロテアーゼ変異体を含む組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、セリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはそれから生産されるサブチリシン変異体を提供する。具体的には、本発明は、参照セリンプロテアーゼと比較して１つ以上の置換を有するセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を提供する。更に、本発明は上記のセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は上記のセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、セリンプロテアーゼ変異体を提供する。具体的には、本発明は、参照セリンプロテアーゼと比較して１つ以上の置換を有するセリンプロテアーゼ変異体を提供する。更に、本発明はこれらのセリンプロテアーゼ変異体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は上記のセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を少なくとも１つ含むクリーニング組成物を提供する。
セリンプロテアーゼは産業用酵素の技術分野において古くから既知であるが、特定の条件及び用途に適した加工プロテアーゼがなお必要とされている。
一部の実施形態では、本発明は単離されたサブチリシン変異体を包含し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であって、リスト１〜１９から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
一部の実施形態では、本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を包含し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、リスト１〜１９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
一部の実施形態では、本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を包含し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であって、リスト１〜１９から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一部の実施形態では、本発明は発現ベクター、宿主細胞又は上記変異体のいずれかの生産方法である。
一部の実施形態では、本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を包含し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、リスト１〜１９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。一部の実施形態では、本発明は発現ベクター、宿主細胞又は上記変異体のいずれかの生産方法である。
上記のそれぞれの実施形態において、変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＧＧ３６プロテアーゼと比較して改善された洗浄性を有することができる。
一部の実施形態では、本発明は上記変異体又は上記変異体をコードする核酸を包含し、ここで変異体の総正味電荷は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、−１、−２、−３、−４、又は−５である。
一部の実施形態では、本発明は、上記の変異体の少なくとも１つを有する組成物を包含し、この組成物は布地ケア及びホームケア製品ではない。一部の実施形態では、本発明は、上記組成物を用いたクリーニング方法である。
ＢＰＮ’（配列番号１）及びＧＧ３６（配列番号２）を包含する成熟型の参照プロテアーゼのアライメントを提供する。本明細書に記載の各種プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体の各アミノ酸位置は、各種冷水用プロテアーゼ変異体を含めて、図１に示されるように、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列をバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンプロテアーゼＢＰＮ’（配列番号１）と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。したがって、本明細書において特に指定しない限り、置換位置は、ＢＰＮ’に対する関係で与えられる。
本発明はセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を提供する。具体的には、本発明は、参照セリンプロテアーゼと比較して１つ以上の置換を有するセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を提供する。更に、本発明は上記のセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、本発明は上記のセリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を少なくとも１つ含むクリーニング組成物を提供する。
用語の定義
特に指定しない限り、本発明の実施は、当該技術分野内の分子生物学、タンパク質工学、微生物学及び組み換えＤＮＡにおいて通常使用される従来技術を伴う。このような技術は当業者に既知のものであり、当業者に広く知られている数多くの文献及び参考文献に記載されている。本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本案件に組み込まれる。
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。多くの専門用語辞典が当業者に既知である。本明細書に記載されているものと類似した又は等価な任意の方法及び材料が本発明の実施に使用されるが、本明細書には一部の好適な方法及び材料を記載する。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。同様に、本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で明示されない限り、対象物が複数個ある場合も含まれる。数範囲は、範囲を定義する数を包括する。別途記載のない限り、核酸は左から右に向かって５’から３’配向になるよう；アミノ酸配列は、左から右に向かってアミノ基からカルボキシ基という配向になるようにそれぞれ記載される。本発明は記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ることが理解されるであろう。
本発明の実施は、特に示さない限り、タンパク質精製、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ技術及びタンパク質配列決定の従来技術を採用し、これらはすべて、当該技術分野内のものである。
加えて、本明細書で提供される見出しは本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にさせる目的で、数多くの用語を以下に定義する。
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ」及び「プロテイナーゼ」は、他のタンパク質を分解する能力を有する酵素タンパク質を指す。プロテアーゼは、ペプチド鎖又はポリペプチド鎖中のアミノ酸を連結しタンパク質を形成するペプチド結合を加水分解することにより、タンパク質の異化作用を開始する、「タンパク質分解」を行なうことができる。プロテアーゼの、タンパク質消化酵素としてのこのような活性は、「タンパク質分解活性」と呼ばれる。タンパク質分解活性の測定には多くの周知の手順が存在する（例えば、Ｋａｌｉｓｚ，「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」Ｉｎ：Ｆｉｅｃｈｔｅｒ（編）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（１９８８）を参照されたい）。例えば、タンパク質分解活性は、各プロテアーゼが市販の基質を加水分解する能力を解析する、比較アッセイにより確認することができる。プロテアーゼ活性又はタンパク質分解活性の解析に有用な代表的な基質としては、限定するものではないが、ジメチルカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８０１）、ウシコラーゲン（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９８７９）、ウシエラスチン（Ｓｉｇｍａ Ｅ−１６２５）、及びウシケラチン（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ９０２１１１）が挙げられる。これらの基質を用いる比色分析が当該技術分野において周知である（例えば、いずれも参照により本案件に組み込まれる国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい）。ｐＮＡアッセイ（例えば、Ｄｅｌ Ｍａｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：３１６〜３２０［１９７９］参照）も、勾配溶出時に回収される画分の活性酵素濃度の定量に使用される。このアッセイは、可溶性の合成基質、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を酵素が加水分解した際に放出されるｐ−ニトロアニリンの放出速度を測定する。加水分解反応により黄色味が生じる速度を分光光度計で４１０ｎｍにて測定する。この速度は活性酵素濃度に比例する。加えて、２８０ナノメートル（ｎｍ）での吸光度測定を使用して、総タンパク質濃度を測定することもできる。活性酵素／総タンパク質比は酵素の純度も与える。
本明細書で使用するとき、「サブチリシン」は、ペプチダーゼデータベースのＭＥＲＯＰＳ（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＥＲＯＰＳ：ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ｄａｔａｂａｓｅ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４ Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ，Ｄ２７０〜２７２（２００６）を参照されたい）に記載されるようなＳ８セリンプロテアーゼファミリーの任意のメンバーを指す。ＭＥＲＯＰＳに記載されるペプチダーゼファミリーＳ８には、セリンエンドペプチダーゼのサブチリシン及びその相同体が包含される（Ｒａｗｌｉｎｇｓ ａｎｄ Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９０：２０５〜２１８（１９９３））。サブチラーゼファミリーとしても既知であるファミリーＳ８は、セリンペプチダーゼファミリーのうち２番目に大きいファミリーである。現在では、Ｓ８ファミリーのうちのいくつかのメンバーの立体構造が決定されている。典型的なＳ８タンパク質の構造は、２層のヘリックス鎖に挟まれた７本鎖のβシート構造の三層から構成される。サブチリシン（Ｓ０８．００１）は、ＳＢ属（ＳＢ）の構造型である。構造が異なるのにも関わらず、サブチリシン及びキモトリプシン（Ｓ０１．００１）の活性部位が重なることは、この類似性が分岐進化ではなく収束進化の結果であることを示唆する。
本明細書で使用するとき、用語「プロテアーゼ変異体（protease variant）」、「変異型プロテアーゼ（variant protease）」、「変異型セリンプロテアーゼ（variant serine protease）」、「セリンプロテアーゼ変異体（serine protease variant）」、「サブチリシン変異体（subtilisin variant）」、「変異プロテアーゼ（mutant protease）」は、参照プロテアーゼ（野生型サブチリシンプロテアーゼであり得る）と類似し、特に機能的に類似するが、配列を、野生型のプロテアーゼ、又は変異型プロテアーゼ体が誘導される開始参照プロテアーゼ（すなわち、「親」プロテアーゼ）の配列と異なるものにするような変異をアミノ酸配列中にもつプロテアーゼを参照する際に使用される。一部の実施形態では、本発明は「ＧＧ３６変異体」（又は「ＧＧ３６サブチリシン変異体」）を提供し、この変異体は、配列番号２で示される成熟型のＧＧ３６配列中に変異が存在するものである。しかしながら、参照プロテアーゼが任意の特定のアミノ酸配列に制限されることは意図しない。加えて、この用語は、親プロテアーゼの変異体を包含することを意図し、この場合、親プロテアーゼの配列は、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
本明細書で使用するとき、用語「冷水用プロテアーゼ変異体」は、親プロテアーゼのプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を意味し、ここでＢ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２のアミノ酸配列を有し、上記プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、次の特性の１つ以上を有する：ａ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法２による性能指数；ｂ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法３による性能指数；ｃ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法４による性能指数；及び／又はｄ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法６による性能指数；及び／又はｅ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１５、１．１〜約１０、又は更には１．１〜約７である試験方法７による性能指数。試験方法２、試験方法３、試験方法４、試験方法６、及び試験方法７は、以下の実施例１の表題「試験方法」の節で明記される。加えて、この用語は、親プロテアーゼの変異体を包含することを意図し、この場合、親プロテアーゼの配列は、配列番号２のアミノ酸配列に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する。
本発明の一部の実施形態では、親プロテアーゼ（すなわち、「参照」又は「開始」プロテアーゼ）は市販のプロテアーゼであり、限定するものではないが、例えば、商標名ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＮＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ）；ＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）及びＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＰＲＩＭＥ、ＰＵＲＡＭＡＸ（登録商標）（Ｄａｎｉｓｃｏ ＵＳ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）；並びにＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａから市販されているもの、即ちＢＬＡＰ（米国特許第５，３５２，６０４号の図２９に示される、変異Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを有する配列、以降ＢＬＡＰと呼ぶ）及びＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸残基が親又は参照ポリペプチド（限定するものではないが野生型ポリペプチドが挙げられる）のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を指す。
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．ブレービス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアグランス（B. coagulans）、Ｂ．サークランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、及びＢ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」と命名されたＢ．ステアロサーモフィルスのような生物を包含する。酸素存在下での耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス、アムピバチルス、アネウリニバチルス、アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、グラシリバチルス、ハロバチルス、パエニバチルス、サリバチルス、サーモバチルス、ウレイバチルス、及びバルジバチルスにも当てはまる。
本明細書で互換的に使用される用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ヌクレオチドモノマーが鎖状に共有結合している任意の長さのポリマーを指す。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、デオキシリボヌクレオチドからなるポリヌクレオチド、及びＲＮＡ（リボ核酸）、リボヌクレオチドのポリマーは、異なる生物学的機能を有するポリヌクレオチド又は核酸の例である。ポリヌクレオチド又は核酸としては、限定するものではないが、単鎖、二本鎖、又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成体、又はプリン塩基及びピリミジン塩基からなるポリマー、又は他の天然の、化学的に改変された、生物学的に改変された、非天然の又は誘導体化されたヌクレオチド塩基が挙げられる。次のものはポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、発現配列タグ（ＥＳＴ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチド、ウラシル、他の糖、並びにフルオロリボース及びチオエートなどの結合基、並びに分岐ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分により割り込まれる。
本明細書で使用するとき、用語「変異」は、開始アミノ酸又は核酸配列に生じた変化を指す。この用語には、置換、挿入及び欠失が包含されることを意図する。
本明細書で使用するとき、用語「ベクター」は、核酸又はポリヌクレオチドを、標的細胞又は組織に、導入又は移行するために使用される核酸コンストラクト又はポリヌクレオチドコンストラクトを指す。ベクターは、典型的には、外来ＤＮＡを他の細胞又は組織に導入する際に使用される。概してベクターは、導入遺伝子であるＤＮＡ配列と、ベクターの「骨格」として機能するより長いポリヌクレオチド配列と、からなる。典型的には、ベクターは、挿入された導入遺伝子などの遺伝子情報を、標的細胞又は組織で挿入断片が単離、複製、又は発現されるよう、標的細胞又は組織に移動させるよう機能する。ベクターとしては、プラスミド、クローニングベクター、バクテリオファージ、ウイルス（例えば、ウイルスベクター）、コスミド、発現ベクター、シャトルベクター、カセット、及びこれに類するものなどが挙げられる。典型的には、ベクターには複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーが挙げられる。ベクターを標的細胞に挿入するプロセスは、一般に形質移入と呼ばれる。ウイルスベクターによる細胞の形質移入は、一般に形質導入と呼ばれる。一部の実施形態では、本発明には、ＤＮＡ配列を好適なホストで発現させるよう機能し得る好適な配列（例えば、分泌型のシグナルペプチド配列など）に制御可能なように連結される、変異型プロテアーゼ（例えば、前駆型又は成熟型プロテアーゼ変異体）をコードするＤＮＡ配列を含むベクターが包含される。
本明細書で使用するとき、用語「発現カセット」、「発現プラスミド」又は「発現ベクター」は、対象とする核酸（例えば、外来核酸又は導入遺伝子）を標的細胞で発現させるにあたり組み換え的に又は合成的に生成される核酸コンストラクト又はベクターを指す。典型的には、対象とする核酸は、対象とするタンパク質を発現する。発現ベクター又は発現カセットは、典型的には外来核酸の発現を駆動又は促進するプロモーターヌクレオチド配列を含む。また、典型的には発現ベクター又はカセットは、標的細胞で特定の核酸を転写させる任意の他の特異的な核酸配列を包含する。組み換え型発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断に組み込むことができる。一部の発現ベクターは宿主細胞に異種性のＤＮＡ断片を組み込み、発現させすることができる。多くの原核及び真核細胞性発現ベクターは、市販されている。適切な発現ベクターは、当業者の知識の範囲内で選択される。発現ベクターに組み込まれた核酸配列からタンパク質を発現させるのに適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内のものである。
ＤＮＡコンストラクトは、標的細胞又は組織に導入することのできる、人工的に構築された核酸断片である。一般的には、ＤＮＡコンストラクトは、対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる、ベクターにサブクローニングされたＤＮＡの挿入断片を含む。ベクターは、バクテリア中での増殖に関係するバクテリア由来の耐性遺伝子、並びに対象とするタンパク質を微生物で発現させるためのプロモーターを含有し得る。ＤＮＡはＰＣＲによりインビトロで生成されるか、あるいは当業者に既知である任意の他の好適な技術により生成される。一部の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは対象とする核酸配列を含む。一部の実施形態では、配列は、制御要素（例えば、プロモーターなど）のような追加の要素に、制御可能なように連結される。ＤＮＡコンストラクトは、更に選択マーカーを含んでもよく、及びホメオボックスに隣接する組み込み配列を更に含んでもよい。コンストラクトは、他の相同性ではない配列を末端に組み込んで含んでもよい（例えば、スタッファー配列（stuffer sequences）又は隣接配列）。一部の実施形態では、配列末端は、ＤＮＡコンストラクトが閉環を形成するよう閉じられる。当業者に周知である技術を用いＤＮＡコンストラクトに組み込まれる、対象とする核酸配列は、野生型、変異型、又は修飾型核酸であり得る。一部の実施形態では、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞染色体と相同性である核酸配列を１種以上含む。他の実施形態においては、ＤＮＡコンストラクトは、非相同的なヌクレオチド配列を１種以上含む。ＤＮＡコンストラクトをインビトロで組み立ててから、これを、例えば：１）非相同配列を宿主細胞の所望の標的配列に挿入する工程；及び／又は２）宿主細胞の染色体領域に変異を導入する工程（すなわち、非相同配列により内在性配列を置き換える工程）；３）標的遺伝子を欠失させる工程；及び／又は４）複製プラスミドを宿主に導入する工程；に使用することもできる。「ＤＮＡコンストラクト」は、本明細書において「発現カセット」と互換可能に使用される。
本明細書で使用するとき、「プラスミド」は、染色体ＤＮＡとは独立して複製することのできる染色体外のＤＮＡ分子を指す。プラスミドは二本鎖（ｄｓ）であり、及び環状であってもよく、典型的にはクローニングベクターとして使用される。
本明細書で使用するとき、核酸配列を細胞に導入する文脈において、用語「導入」は、核酸配列を細胞に移入させるのに好適な任意の方法を指す。導入に関する方法としては、限定するものではないが、プロトプラストの融合、形質移入、形質転換、電気穿孔法、接合、及び形質導入が挙げられる（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｄｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（編），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，ｐｐ．５７〜７２［１９８９］を参照されたい）。
形質転換は、遺伝子材料（例えば、ＤＮＡ）の取り込み、遺伝的組み込み、及び発現により生じる細胞の遺伝的な変更を指す。
本明細書で使用するとき、核酸は、別の核酸配列と機能的に関連を持つよう配置された場合に、別の核酸配列と「作用可能に連結」される。例えば、プロモーターがコード配列の転写に影響を与える場合、プロモーター又はエンハンサーは、ヌクレオチドコード配列に作用可能に連結される。コード配列の翻訳が促進されるように配置される場合、リボソーム結合部位は、コード配列に作用可能に連結されてもよい。通常、「作用可能に連結された」ＤＮＡ配列は連続的な配列である。しかしながら、エンハンサーは、隣接する必要はない。連結は、好都合な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合には、従来技術に従い合成オリゴヌクレオチドアダプタ又はリンカーを使用してもよい。
本明細書で使用するとき、用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡセグメント）を指し、コード領域の前及び後に続く領域、並びにそれぞれのコード配列（エキソン）の間に存在する介在配列（イントロン）を包含する。
本明細書で使用するとき、「組み換え」が細胞に関し使用される場合、典型的には、非相同な核酸配列の導入により細胞が改質されていることを、あるいはそのように改質された細胞からその細胞が誘導されていることを意味する。例えば、組み換え細胞は、同一形態のものがネイティブ（非組み換え）形態の細胞では見られない遺伝子を含む場合があり、又は組み換え細胞は、ネイティブな遺伝子（ネイティブ形態の細胞で見られる遺伝子）ではあるが、改変されており細胞に再導入された遺伝子を含んでもよい。組み換え細胞は、細胞から核酸を移動させることなく改変された、細胞内在性の核酸を含む場合もあり、このような改変としては、遺伝子置換、部位特異的変異導入、及び当業者に既知の関連技術により得られる改変が挙げられる。組み換えＤＮＡ技術には、インビトロでの組み換えＤＮＡ生産技術、並びに組み換えＤＮＡを発現又は増殖することのできる細胞に組み換えＤＮＡを導入することによる組み換えポリペプチドの生産が包含される。ポリヌクレオチド又は核酸に関し、「組み換え（Recombination）」、「組換する（recombining）」及び「組み換えられた（recombined）」は、概して、２つ以上の核酸若しくはポリヌクレオチド鎖若しくは断片を組み立て、又は組み合わせることで、新しいポリヌクレオチド又は核酸を生成することを指す。組み換えポリヌクレオチド又は核酸は、しばしばキメラ体と呼ばれる。核酸又はポリペプチドは、人工的なもの又は設計されたものである場合、あるいは人工的な又は設計されたタンパク質又は核酸から誘導される場合「組み換え体」である。
本明細書で使用するとき、用語核酸又は遺伝子「増幅」は、増幅させた核酸又は遺伝子が、開始時にゲノム中に存在していたコピー数よりもより多くのコピー数で存在するように、特異的なＤＮＡ配列を不均一に複製させるプロセスを指す。一部の実施形態では、薬剤（例えば、阻害可能な酵素に関する阻害剤）の存在下で増殖させることによる細胞選別の結果、薬剤の存在下での増殖に必要とされる遺伝子産物をコードする内在性遺伝子が増幅されるか、あるいは核酸又は遺伝子産物又は両方をコードする外因性の（すなわち、導入）配列が増幅されることになる。
「増幅」は、核酸複製の特殊例であり、テンプレート特異性を包含する。非特異的なテンプレート複製（すなわち、複製はテンプレートに依存するものの、特定のテンプレートによるものではない）と対照的である。ここでは、テンプレート特異性は、複製の忠実度（すなわち、適切なポリヌクレオチド配列が合成された度合い）及びヌクレオチド（リボ又はデオキシリボヌクレオチド）特異性により識別される。テンプレート特異性は、しばしば「標的」特異性に関し記載される。標的配列は、探索され他の核酸から選別されるという観点から、「標的」である。主にこの選別のために増幅技術が設計されてきた。
本明細書で使用するとき、用語「プライマー」は、制限酵素による消化断片の精製物として天然由来で生じ、又は合成的に生成され、かつ核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件（すなわち、ヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、かつ好適な温度及びｐＨ）下に置かれた場合に、合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド残基のポリマー）を指す。好ましくは、プライマーは増幅効率を最大にするために単鎖であるが、あるいは、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは、伸長産物を調製するために使用される前に、その鎖を単離するように最初に処理される。一部の実施形態では、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始するのに十分な程度長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、及び使用方法などの様々な要因により異なる。
本明細書で使用するとき、用語「プローブ」は、制限酵素による消化断片の精製物として天然に生じる、又は組み換え的に若しくはＰＣＲ増幅により合成的に生産された、オリゴヌクレオチドを指し、通常、対象とする他のオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成することができる。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、識別、及び単離に有用である。本発明で使用される任意のプローブを、限定するものではないが酵素（例えば、ＥＬＩＳＡ、並びに酵素を用いる組織化学アッセイ）、蛍光、放射活性、及び発光系などの任意の検出系で検出され得るように、任意の「リポーター分子」により標識することが想到される。本発明は、任意の特定の検出系又は標識に制限されることを意図しない。
本明細書で使用するとき、用語「標的」は、ポリメラーゼ連鎖反応に関し使用する場合、ポリメラーゼ連鎖反応に使用されるプライマーにより結合される核酸領域を指す。したがって、「標的」は他の核酸配列から探索され、選別される。ヌクレオチド「断片」は、標的とする核酸配列内部の核酸領域である。
本明細書で使用するとき、用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号の方法を指し、クローニング又は精製せずにゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列断片の濃度を上昇させる方法を包含する。この標的配列の増幅プロセスは当業者に周知である。
本明細書で使用するとき、用語「増幅剤」は、プライマー、核酸テンプレート、及び増幅酵素を除く、増幅に必要とされる試薬を指す（例えば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）。通常、増幅剤は他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に配置され、収容される。
本明細書で使用するとき、用語「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、制限部位として既知であるヌクレオチドに特異的な配列に又はその配列近傍に存在する二本鎖又は一本鎖ＤＮＡを切断することのできる酵素（例えば、細菌性酵素）を指す。制限部位を含むヌクレオチド配列は、所定の制限エンドヌクレアーゼすなわち制限酵素により認識及び切断され、しばしばＤＮＡ断片の挿入部位になる。制限部位は、発現ベクター又はＤＮＡコンストラクト中に設計することができる。
「相同組み換え」は、２つのＤＮＡ分子間、又は同一の若しくはほとんど同一のヌクレオチド配列が対となった染色体間で生じる、ＤＮＡ断片の交換を指す。一部の実施形態では、染色体の組み込みは相同組み換えである。
核酸又はポリヌクレオチドが、ネイティブな状態にせよ又は当業者に既知の手法により操作された場合にせよ、転写及び／又は翻訳されてポリペプチド又はそれらの断片を生産できるのであれば、核酸又はポリヌクレオチドは、ポリペプチドを「コードする」と言われる。このような核酸のアンチセンス鎖も、同様に配列をコードすると言われる。
当該技術分野において既知であるように、ＲＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ配列を転写してＲＮＡ配列を生産することができるが、逆転写酵素によりＲＮＡ配列を逆転写してＤＮＡ配列を生産することもできる。
「宿主株」又は「宿主細胞」は、対象とするＤＮＡ配列を含む発現ベクターにとって好適な宿主を指す。対象とするＤＮＡ配列は、対象とするタンパク質を宿主株又は宿主細胞で発現することができる。
「タンパク質」又は「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマー配列からなる。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書で互換可能に使用される。ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるようなアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を本開示を通して使用する。一文字のＸは、２０種のアミノ酸のうちのいずれかを指す。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。変異は、親アミノ酸の１文字表記、続いて３桁又は２桁の数字による位置番号、次に変異アミノ酸の１文字表記により記載される。例えば、位置８７でグリシン（Ｇ）がセリン（Ｓ）に置き換わる変異が生じている場合、「Ｇ０８７Ｓ」又は「Ｇ８７Ｓ」と表される。複数の変異は、「−」を変異の間に挿入することで示される。位置８７及び９０での変異は、「Ｇ０８７Ｓ−Ａ０９０Ｙ」又は「Ｇ８７Ｓ−Ａ９０Ｙ」又は「Ｇ８７Ｓ＋Ａ９０Ｙ」、又は「Ｇ０８７Ｓ＋Ａ０９０Ｙ」のように表される。欠失については、一文字コード「Ｚ」を使用する。親配列に対する挿入については、一文字コード「Ｚ」は位置番号の左側にある。欠失については、一文字コード「Ｚ」は位置番号の右側にある。挿入については、位置番号は、挿入されるアミノ酸の前の位置番号であり、各アミノ酸に対して０．０１を加える。例えば、位置８７と８８との間へのアラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）及びチロシン（Ｙ）の３つのアミノ酸の挿入は、「Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ」のように表される。したがって、上記のすべての突然変異の組み合わせに位置１００での欠失を加えたものは、「Ｇ０８７Ｓ−Ｚ０８７．０１Ａ−Ｚ０８７．０２Ｓ−Ｚ０８７．０３Ｙ−Ａ０９０Ｙ−Ａ１００Ｚ」である。
「プロ配列」又は「プロペプチド配列」は、シグナルペプチド配列と成熟プロテアーゼ配列の間に存在し、プロテアーゼの分泌に必要とされるアミノ酸配列を指す。プロ配列又はプロペプチド配列の開裂により、活性な成熟型プロテアーゼが生じる。
用語「シグナル配列」又は「シグナルペプチド」は、成熟型又は前駆型タンパク質の分泌又は直接的な輸送に参加し得るアミノ酸残基の配列を指す。シグナル配列は、通常、前駆型又は成熟型タンパク質配列に対しＮ末端に位置する。シグナル配列は内在性のものであっても外来性であってもよい。外来性シグナル配列の一実施例は、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）（ＡＴＣＣ ２１５３６）由来のサブチリシンのシグナル配列の残部に融合させた、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のサブチリシン由来の、シグナル配列の７個のアミノ酸残基を包含する。シグナル配列は通常では成熟タンパク質には含まれない。シグナル配列は、典型的には、タンパク質の輸送後にシグナルペプチダーゼによりタンパク質から切断される。
用語「ハイブリッド型シグナル配列（hybrid signal sequence）」は、発現させる遺伝子に関するシグナル配列と融合させた発現宿主から配列の一部が得られる、シグナル配列を指す。一部の実施形態では、合成配列が用いられる。
用語、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの「成熟型」形態は、シグナルペプチド配列及びプロペプチド配列を持たないタンパク質、ポリペプチド又はペプチドの機能的形態を指す。
用語「前駆体」タンパク質又はペプチドは、タンパク質のアミノ末端又はカルボニル末端に制御可能なように連結されたプロ配列を有している、成熟型タンパク質を指す。前駆体は、プロ配列のアミノ末端に、制御可能なように連結された「シグナル」配列を有する場合もある。前駆体は、翻訳後活性に関与する追加のポリヌクレオチド（例えば、前駆体からこのポリヌクレオチドが切断されると、成熟型のタンパク質又はペプチドが得られる）を有する場合もある。
アミノ酸配列又は核酸配列に関する用語、「野生型」は、そのアミノ酸配列又は核酸配列がネイティブの又は自然発生の配列であることを示す。本明細書で使用するとき、用語「天然に生じた」は、自然に見出される（すなわち、組み換え法により操作を受けていない）任意のものを指す（例えば、タンパク質、アミノ酸、又は核酸配列）。
本明細書で使用するとき、用語「天然に生じたものではない」は、自然界に見出すことのない任意のものを指す（例えば、研究室で製造される組み換え核酸）。
本明細書でアミノ酸残基の位置に関して使用するとき、用語「対応する（「corresponding to」又は「corresponds to」又は「corresponds」）」は、タンパク質又はペプチド中の数え上げられた位置のアミノ酸残基、あるいはタンパク質又はペプチド中の数え上げられた残基に対して類似、相同、又は等価であるアミノ酸残基を指す。本明細書で使用するとき、用語「対応する領域」は、概して、関連するタンパク質又は参照タンパク質に従っての類似の位置を指す。
用語「から誘導される」及び「から得られる」は、対象とする生物株により産生されるあるいは産生され得るプロテアーゼだけでなく、このような株から単離されるＤＮＡ配列によりコードされるプロテアーゼ、及びこのようなＤＮＡ配列を含有している宿主生物で産生されるプロテアーゼも指す。更にこれらの用語は、合成ＤＮＡ配列及び／又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ対象とするプロテアーゼと同一の特徴を有する、プロテアーゼを指す。例示すると、「バチルスから誘導されるプロテアーゼ」は、バチルスにより天然に生産された、タンパク質分解活性を有する酵素、並びにバチルス供給源により生産されるが、遺伝子工学技術の使用を介して、セリンプロテアーゼをコードする核酸でバチルスではない生物を形質転換することにより生産される、セリンプロテアーゼ様の酵素を指す。
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、２つの配列中の残基が同じのものであることを指す。
本明細書で使用するとき、用語「相同の遺伝子」は、互いに対応し、かつ同一であるか又は互いに非常に類似している、異なるが通常は関連する種由来の遺伝子のペアを指す。用語は、種分化（すなわち、新種の発生）により分離される遺伝子（例えば、オルソロガス遺伝子）、並びに遺伝子複製により分離されている遺伝子（例えば、パラロガス遺伝子）を包含する。
本明細書で使用するとき、「相同性」は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ましい。相同性は当業者に既知の標準的な方法で測定することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０］；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のようなソフトウェアプログラム；及びＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５［１９８４］参照）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの累進アライメント法を単純化したものを使用する（Ｆｅｎｇ ａｎｄ Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０［１９８７］参照）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されるものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３［１９８９］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。他の有用なアルゴリズムの例はＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔ ａｌ．のＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０［１９９０］；及びＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７［１９９３］参照）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０［１９９６］参照）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメーターを使用し、これらのうちのほとんどはデフォルト値に設定される。調製可能なパラメーターは以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定の配列の構成及び、所望の配列を検索する特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体により確立される。しかしながら、これらの値は、感度を上昇させるように調整することができる。
参照配列と対象とする試験配列との配列同一率は、当業者により用意に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される同一率は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０［１９９０］参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価された（positive-valued）閾値スコアＴを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための開始点として働く。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り比較されている２つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は、次の場合に止まる：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する、累積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、感度及びアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９９２］参照）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両鎖の比較を使用する。
次いで、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、類似する２つの配列間の統計解析を実行する（例えば、上掲Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸をセリンプロテアーゼの核酸と比較した際の最小合計類似度が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。セリンプロテアーゼポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小合計類似度の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、特定のセリンプロテアーゼ核酸と類似していると考えられる。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「同一率（percent identical or percent identity）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査を用いて判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で同一であることを指すものである。参照（すなわち、クエリー）アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「アミノ酸配列同一率」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリーアミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が同一であることを意味する。
参照（すなわち、クエリー）核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、「配列同一率」又は「同一率（％）」又は「配列同一率（％）」又は「核酸配列同一率（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたってクエリー配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの同一度）だけ同一であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に対するヌクレオチド配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が同一であることを意味する。
一部の実施形態では、クエリー配列に対する対象とする配列の「配列同一性又は配列同一性（％）」、又は「同一性（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求めて一致する位置の数を比較長さ（別途記載のない限り、クエリー配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、クエリー配列に対する対象とする配列の配列同一率を算出する。
「最適アラインメント」又は「最適アラインメントを行った」は、最高の同一性パーセントスコアを与える２つ（以上）の配列のアラインメントを指す。例えば、２つのタンパク質配列の最適なアライメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基が最多数アライメントされるように、配列を手動でアライメントさせることで、あるいはソフトウェアプログラム又は本明細書に記載の若しくは当該技術分野において既知の手順を用いることで、達成することができる。２つの核酸配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のヌクレオチド残基の最大数が共にアラインメントされているように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。
一部の実施形態では、２つのポリペプチド配列は、配列対に関し可能性のある最も高い類似性スコアが得られるように、定義されたアミノ酸置換行列、ギャップ開始ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）、及びギャップ伸長ペナルティなどの定義されたパラメーターを用いてアライメントされたときに、「最適にアライメントされた」と見なされる。ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（上掲のＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆを参照されたい）は、多くの場合、ポリペプチド配列アライメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）でデフォルトのスコア置換行列として使用される。ギャップ存在ペナルティはアラインメントされた配列の１つにアミノ酸ギャップが１つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基位置に対して課される。用いられる代表的なアラインメントは以下のものである：ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、及びギャップ伸張ペナルティ＝１。アラインメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する各配列のアミノ酸位置により（例えば、アラインメントウィンドウ）、並びに、場合によっては可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に１つ若しくは複数のギャップを挿入することにより、決定される。
２つ以上の配列間の最適なアライメントは、目視検査により手動で、又はコンピュータ（限定するものではないが、例えば、アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラム、及び核酸配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムなど）を用いて、決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）参照；ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ウェブサイトも参照）。
対象とするポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる場合、参照ポリペプチドと「実質的に同一」であるものとして参照される。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つのポリペプチド配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの印は第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのペプチドが、保存的なアミノ酸置換のみ、又は１つ以上の保存的なアミノ酸置換のみで異なっている場合、このポリペプチドは第２ポリペプチドと実質的に同一である。
対象とする核酸は、対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる場合、参照核酸と「実質的に同一」であるものとして参照される。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つの核酸配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。厳密な条件下（例えば、中程度に厳密〜非常に厳密という範囲）で、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成することは、核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標になる。
核酸又はポリヌクレオチドは、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から部分的又は完全に分離されているときに「単離され」ている。同様に、ポリペプチド、タンパク質又はペプチドは、例えば他のタンパク質、核酸、細胞等が挙げられるがこれらに限定されない他の成分から部分的又は完全に分離されているときに「単離され」ている。モルベースで、単離された種は組成物中の他の種よりも豊富である。例えば、単離された種は、存在するすべての高分子種のうちの少なくとも約５０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％（モルベースで）を構成し得る。好ましくは、対象種は、本質的に均一に精製される（すなわち、従来の検出手法により組成物への他種の混入が検出されることはない）。純度及び均一度は、タンパク質又は核酸試料をアガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動後に染色により可視化するなどの、当業者に周知である数多くの手法を用い測定することができる。必要に応じて、高解像度の技術、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は同様の手法を用いて材料を精製することができる。
核酸又はポリペプチドに使用される場合、用語「精製した」は、概して、当業者に周知の解析技術により測定した場合に、核酸又はポリペプチドが他の成分を本質的に含まないことを意味する（例えば、精製ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、電気泳動ゲルで、クロマトグラフィーによる溶出で、及び／又は密度勾配遠心分離にかけた媒質中で、別個のバンドを形成する）。例えば、電気泳動ゲルで本質的に１つのバンドを生じる核酸又はポリペプチドは「精製され」ている。精製された核酸又はポリペプチドは、少なくとも約５０％純粋であり、通常は少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％又はそれ以上純粋である（例えば、モルベースの重量％）。これに関連し、本発明は、本発明の１つ以上のポリペプチド又はポリヌクレオチドのような１つ以上の本発明の分子について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に上昇している場合、この組成物はその分子について濃縮されている。本発明の、実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチド（例えば、それぞれ、本発明のプロテアーゼ変異体をコードする実質的に純粋な変異型プロテアーゼ又はポリヌクレオチド）は、典型的には、特定の組成物中で、すべての高分子種の少なくとも約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８、約９９％、又は約９９．５％以上（モルベースで）を構成する。
これに関連し、本発明は、１つ以上の本発明の分子、例えば１つ以上の本発明のポリペプチド（例えば、１つ以上の本発明の変異型プロテアーゼ）又は１つ以上の本発明の核酸（例えば、１つ以上の本発明の変異型プロテアーゼをコードする１つ以上の核酸）について組成物を濃縮する方法を提供する。精製又は濃縮技術の適用後に分子の濃度が実質的に上昇している場合、この組成物はその分子について濃縮されている。実質的に純粋なポリペプチド又はポリヌクレオチドは、典型的には、特定の組成物中で、すべての高分子種の少なくとも約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８、約９９％、又は約９９．５％以上（モルベースで）を構成する。
本明細書で使用するとき、用語「コンビナトリアルな変異導入」又は「コンビナトリアル」は、参照核酸配列の核酸変異体に関するライブラリを作成する方法を指す。これらのライブラリでは、変異体は所定の変異の組から選択された１つ以上の変異を含有している。この方法は、所定の変異の組のメンバーではないランダム変異を導入する手段も提供する。このような手法のうちのいくつかのものは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５８２，９１４号に記載されている。このようなコンビナトリアルな変異導入法のうち一部のものには、市販のキット（例えば、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（登録商標）多部位特異的変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰＣＲ融合／伸長ＰＣＲ）に組み込まれる方法が挙げられ、及び／又は包含される。
本明細書で使用するとき、変異型プロテアーゼと関連させて使用される「改善された特性を有する」は、対応する参照プロテアーゼ（例えば、野生型又は天然に生じるプロテアーゼ）と比較した場合に、変異型プロテアーゼが改善されていること、すなわち洗浄性能若しくはクリーニング性能が強化されていること、及び／又は場合により洗浄又はクリーニング性能は保持されたまま安定性が改善されていること若しくは強化されていることを意味する。変異型プロテアーゼの特性の改善には、洗浄又はクリーニング性能の改善及び／又は安定性の改善が含まれ得る。一部の実施形態では、本発明は、次の特性のうち１つ以上を呈する本発明の変異型プロテアーゼを提供する：参照プロテアーゼ（例えば、野生型サブチリシンなどの野生型プロテアーゼ）と比較した場合に、手洗い性能の改善、食器手洗い又は手動洗浄性能の改善、自動食器洗浄性能の改善、洗濯性能の改善、及び／又は安定性の改善。
本明細書で使用するとき、用語「機能アッセイ」は、タンパク質活性の指標を提供するアッセイを指す。一部の実施形態では、この用語は、タンパク質が通常の性能で機能できるかに関して解析されるアッセイ系を指す。例えば、酵素の場合、機能アッセイは反応触媒時の酵素の効力を判定することを包含する。
本明細書で使用するとき、用語「標的特性」は、開始遺伝子から変更されることになる特性を指す。本発明が、任意の特定の標的特性に制限されることは意図しない。しかしながら、一部の実施形態では、標的特性は遺伝子産物の安定性（例えば、変性、タンパク質分解性又は他の分解要因に対する抵抗性）である一方、他の実施形態では、生産宿主による生産レベルが変更される。
本明細書で使用するとき、用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、核酸に関する文脈において、選別又は検出が可能な核酸の任意の特性若しくは属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、ポリペプチドに対する結合性に影響する特性、特定の核酸を含む細胞に与えられた特性、遺伝子の転写に影響を与える特性（例えば、プロモーター強度、プロモーター認識、プロモーター制御、エンハンサー機能）、ＲＮＡのプロセシング（例えば、ＲＮＡスプライシング、ＲＮＡ安定性、ＲＮＡ認識、及び転写後修飾）に影響を与える特性、翻訳に影響を与える特性（例えば、強度、制御、リボソームタンパク質に対するｍＲＮＡの結合、翻訳後修飾）が挙げられる。例えば、核酸の、転写因子、ポリメラーゼ、制御因子などの結合部位を変更させることで、所望の特性を生成すること、又は所望されない特性を確認することができる。
本明細書で使用するとき、用語「特性」又はそれらの文法的に等価な表現は、ポリペプチド（タンパク質を含む）に関する文脈において、選別又は検出が可能なポリペプチドの任意の特性若しくは属性を指す。これらの特性としては、限定するものではないが、酸化安定性、基質特異性、触媒活性、酵素活性、熱安定性、アルカリ安定性、ｐＨ活性プロファイル、タンパク質分解耐性、ＫＭ、ｋｃａｔ、ｋｃａｔ／ｋＭ比、タンパク質フォールディング、免疫応答の誘導、リガンドに対する結合能、受容体に対する結合能、分泌され得るか否か、細胞の表面に提示され得るか否か、多量体化し得るか否か、シグナル伝達し得るか否か、細胞の増殖を阻害し得るか否か、アポトーシスを誘導し得るか否か、リン酸化又はグリコシル化により修飾され得るか否か、及び／又は病気を処置し得るか否かなどが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「スクリーニング」は、当該技術分野で通常使用される意味を有する。スクリーニングプロセスの一実施例では、変異核酸、又はこの核酸にコードされているポリペプチド変異体が提供され、変異核酸又はポリペプチド変異体の特性はそれぞれ評価され、又は測定される。変異核酸又はポリペプチド変異体の特性は、測定後にそれぞれ対応する前駆体（親）核酸又は対応する親ポリペプチドの特性と比較することもできる。
開始材料の特性に応じて、特性の変更された核酸又はタンパク質を得る際のスクリーニング手順は当事者には明白であろう。このような変異核酸の生成により、開始材料の改変が促進されることが意図される。したがって、当事者は、本発明が、スクリーニングされる任意の特定の特性に制限されるものではなく、以下の特性に関する記載は、例示目的のみで掲載されるものであることを認識する。任意の特定の特性に関するスクリーニング方法は、一般的に当該技術分野で記載されているものである。例えば、ある方法では、変異の前後の結合性、ｐＨ、特異性などを測定することができる。変化は変更を示す。好ましくは、スクリーニングは、複数の試料を同時にスクリーニングする、例えば、限定するものではないが、チップを利用するアッセイ、ファージディスプレイ、並びに複数の基質及び／又は指示薬を包含する、高スループットな方式で実施される。
本明細書で使用するとき、一部の実施形態では、スクリーニングプロセスは、対象とする変異体を変異体集団から濃縮する選別工程を一工程以上包含する。これらの実施形態の例としては、宿主生物に増殖優位性を与える変異体の選別、並びにファージディスプレイ又は任意の他のディスプレイ法が挙げられる。ディスプレイ法では、変異体の結合特性又は触媒特性に基づき、変異体を変異体集団から捕捉することができる。一部の実施形態では、変異体ライブラリはストレス（例えば、熱、プロテアーゼ、変性など）にさらされ、続いてインタクトなままの変異体がスクリーニングにより識別され、又は選別により濃縮される。この用語は、選別に関する任意の好適な手段を包含することを意図するものである。実際のところ、本発明は、任意の特定のスクリーニング方法に制限されることを意図しない。
用語「改変核酸配列」及び「改変遺伝子」は、天然に生じる（すなわち、野生型）核酸配列に欠失、挿入又は中断を包含する核酸配列を指すために、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態では、改変された核酸配列による発現産物は、切断型タンパク質である（例えば、改変が配列の欠失又は中断であった場合）。一部の実施形態では、切断型タンパク質は生物活性を保持している。代替的な実施形態では、改変された核酸配列の発現産物は、伸長されているタンパク質である（例えば、改変が核酸配列の挿入を含む場合）。一部の実施形態では、核酸配列にヌクレオチドを挿入することで切断型タンパク質が得られる（例えば、挿入により停止コドンが形成される場合）。したがって、核酸配列を挿入することにより、切断型タンパク質又は伸長型タンパク質のいずれかが発現産物として生じる可能性がある。
「変異」核酸配列は、典型的には、変異核酸配列の発現産物が、野生型タンパク質と比較してアミノ酸配列が変更されているタンパク質になるよう、宿主細胞の野生型配列中の少なくとも１つのコドンが変更されている核酸配列を指す。発現産物の機能的能力は変更されてもよい（例えば、酵素活性が増強されるなど）。
本明細書で使用するとき、語句「基質特異性の変更」は、酵素の基質特異性に生じる変化を指す。一部の実施形態では、基質特異性の変化は、酵素への変異導入、又は反応条件の変更により生じる、特定の基質に対するｋｃａｔ及び／又はＫｍの変化として定義される。酵素の基質特異性は、異なる基質に対して示す触媒効率を比較することで判定される。概して、対象とする基質に対するｋｃａｔ／Ｋｍ比がより大きい変異型酵素を生産することが所望されることからこれらの判定が酵素変異体の触媒効率を評価する特定の用途で見られる。しかしながら、本発明は、特定の基質組成物又は基質特異性に制限されることを意図しない。
本明細書で使用するとき、「表面特性」は、静電荷、並びにタンパク質の表面により示される疎水性及び親水性などの特性に関して使用される。
本明細書で使用するとき、用語「正味電荷」は、分子中に存在するすべての電荷の合計として定義される。親タンパク質分子の「正味電荷を変化」させることで、親分子とは異なる正味電荷を有する変異体が得られる（すなわち、変異体は親分子と同一ではない正味電荷を有する）。例えば、中性のアミノ酸を負に帯電しているアミノ酸により置換するか、又は正に帯電しているアミノ酸を中性のアミノ酸により置換することで、親分子に対して正味電荷が−１になる。正に帯電しているアミノ酸を負に帯電しているアミノ酸により置換することで、親分子に対して正味電荷が−２になる。中性のアミノ酸を正に帯電しているアミノ酸により置換するか、又は負に帯電しているアミノ酸を中性のアミノ酸により置換することで、親分子に対して正味電荷が＋１になる。負に帯電しているアミノ酸を正に帯電しているアミノ酸により置換することで、親分子に対して正味電荷が＋２になる。親タンパク質の正味電荷は、帯電しているアミノ酸の欠失及び／又は挿入によっても変更され得る。
用語「熱的に安定な」及び「熱安定」及び「熱安定性」は、変更された温度に曝露する際、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は本発明の他のプロセスで一般的に適用される条件下で、所定の時間にわたって所定の温度に曝露した後でも、プロテアーゼが所定の酵素活性を保持していることを意味する。「変更された温度」には、温度の上昇又は減少を包含する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、例えば、変更された温度に少なくとも約６０分、約１２０分、約１８０分、約２４０分、約３００分などの所定の時間にわたって曝露した後に、少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％のタンパク質分解活性を保持する。
酸化安定性、キレート化安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の増加」は、他のプロテアーゼ（例えば、サブチリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、一定時間経過後のタンパク質分解活性がより高く維持されていることを意味する。
酸化安定性、キレート化安定性、熱安定性及び／又はｐＨ安定性のプロテアーゼに関する文脈において、用語「安定性の減少」は、他のプロテアーゼ（例えば、サブチリシンプロテアーゼ）及び／又は野生型酵素と比較した場合に、一定時間経過後のタンパク質分解活性がより低く維持されていることを意味する。
用語「クリーニング活性」は、タンパク質分解、加水分解、クリーニング、又は他の本発明のプロセス時に一般的に適用される条件下で、変異型プロテアーゼ又は参照プロテアーゼにより得られるクリーニング性能を指す。一部の実施形態では、物品又は表面上の、１種以上の様々な酵素反応性の染み（例えば、食物、草類、血液、インク、牛乳、油及び／又は卵タンパク質など）をクリーニングする、様々なアッセイを用いることで、変異型プロテアーゼ又は参照プロテアーゼのクリーニング性能を判定することもできる。プロテアーゼ変異体又は参照プロテアーゼのクリーニング性能は、物品又は表面上の染みを標準的な洗浄条件に晒し、及び染みが除去される程度を、様々なクロマトグラフィー、分光光度法、又はその他の定量法を用い評価することで判定できる。例示的なクリーニングアッセイ及び方法は当該技術分野において既知であり、かつ限定するものではないが、例えば、国際公開第９９／３４０１１号及び米国特許第６，６０５，４５８号（いずれも本明細書に参照により組み込まれる）に記載のもの、並びに本発明の以下に提供される実施例に包含されるクリーニングアッセイ及び方法が挙げられる。
用語、変異型プロテアーゼ又は参照プロテアーゼの「クリーニングに有効な量」は、特定のクリーニング組成物中で、所望される程度の酵素活性を達成するプロテアーゼ量を意味する。このような有効量は、当業者により容易に確認され、及び使用される具体的なプロテアーゼ、クリーニング用途、クリーニング組成物の具体的な組成、及び必要とされる組成物が液体又は乾燥形態（例えば、顆粒型、錠剤型、バー型）のいずれであるのか、などの多くの要因に基づくものである。
用語「クリーニング助剤」は、クリーニング組成物に包含される、本発明のプロテアーゼ変異体以外の任意の液体、固体、又はガス状の物質を指す。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、１種以上のクリーニング助剤を包含する。各クリーニング助剤は、典型的には、クリーニング組成物の具体的な種類及び形態（例えば、液体、顆粒、粉末、バー、ペースト、スプレー、錠剤、ゲル、フォーム、又はその他の組成物）に基づいて選択される。好ましくは、各クリーニング助剤は、組成物に使用されるプロテアーゼ酵素と適合性がある。
用語「性能が増感された」は、クリーニング活性の文脈において、標準的な洗浄サイクル及び／又は複数回洗浄サイクル後に通常の評価により判定された場合に、卵、牛乳、草類、インク、油、及び／又は血液などの特定の酵素反応性の染みの酵素によるクリーニング活性が増加又は増強されていることを指す。
用語「性能が減感された」は、クリーニング活性の文脈において、標準的な洗浄サイクル後に通常の評価により判定された場合に、卵、牛乳、草類又は血液などの特定の酵素反応性の染みの酵素によるクリーニング活性が減少又は低下していることを指す。
本発明の変異型プロテアーゼのクリーニング活性に関する文脈において、用語「匹敵する性能」は、比較又は参照プロテアーゼ（例えば、市販のプロテアーゼ）、例えば、限定するものではないが、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（商標）プロテアーゼ製品（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＢＰＮ’変異体（例えば、米国再発行特許第３４，６０６号を参照されたい）、ＲＥＬＡＳＥ（商標）、ＤＵＲＡＺＹＭＥ（商標）、ＥＶＥＲＬＡＳＥ（商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（商標）プロテアーゼ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ；米国再発行特許第３４，６０６号及び米国特許第５，７００，６７６号；同第５，９５５，３４０号；同第６，３１２，９３６号；及び同第６，４８２，６２８号も参照）、並びにＢ．レンタス変異型プロテアーゼ製品（例えば、国際公開第９２／２１７６０号、国際公開第９５／２３２２１号、及び／又は国際公開第９７／０７７７０号に記載のもの）などのクリーニング活性の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％の性能を指す。クリーニング性能は、標準的な洗浄サイクル条件後に、通常の分光光度法による又は解析論的な手法を用いて測定する場合、草類、血液、インク、油、及び／又は牛乳などの酵素反応性の染みを対象とする様々なクリーニングアッセイにおいて、本発明の変異型プロテアーゼを参照サブチリシンプロテアーゼと比較することで判定することができる。
本明細書で使用するとき、用語「消費者製品」は、布地ケア製品及びホームケア製品を意味する。本明細書で使用するとき、用語「布地ケア製品及びホームケア製品」又は「布地及び家事ケア製品」は、販売された形態で使用又は消費されることが一般的に意図される、布地、硬質表面及び任意の他の表面を処理するための製品、非生物表面のケア及びクリーニングに関するすべてのクリーニング系、並びに布地コンディショナー製品及び布地のケア及び維持のために特に設計されたその他の製品、並びに空気ケア製品、例えば：エアフレッシュナー及び香り送達系などの空気ケア製品、カーケア、ペットケア、家畜ケア、パーソナルケア、ジュエリーケア、食器洗浄、布地コンディショニング（柔軟化及び／又はフレッシュニングなど）、洗濯洗剤、洗濯及びすすぎ添加剤及び／又はケア剤、前処理クリーニング組成物、硬質表面クリーニング及び／又はトリートメント剤、例えば、床及び便器クリーナー、ガラスクリーナー及び／又はトリートメント剤、タイルクリーナー及び／又はトリートメント剤、セラミッククリーナー及び／又はトリートメント剤、並びに消費者若しくは組織用の他のクリーニング剤を包含する。一部の実施形態では、布地ケア製品及びホームケア製品は、創部及び／又は皮膚への使用に好適である。「布地ケア製品及びホームケア製品」としては、消費者製品及び施設用品が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「非布地ケア製品及びホームケア製品」は、他の組成物に添加することで、布地ケア製品及びホームケア製品などの最終製品を調製し得る組成物を指す。
本明細書で使用するとき、用語「業者用クリーニング組成物」は、限定するものではないが学校、病院、工場、商店、企業、建造物、飲食店、総合オフィスビル、加工及び／又は製造プラント、動物病院、畜産場、大牧場などの業者による使用に好適な製品を指す。
本明細書で使用するとき、用語「クリーニング及び／又は処理組成物」は、別途記載のない限り、物品のクリーニング及び／又は処理に好適な組成物などが挙げられる、布地ケア製品及びホームケア製品に属する組成物である。このような製品としては、限定するものではないが、次のような布地、硬質面並びに布地ケア及びホームケアの領域の任意の他の表面処理用の製品が挙げられる：エアフレッシュナー及び香り送達系などの空気ケア、カーケア、食器洗浄、布地コンディショニング（柔軟化及び／又はフレッシュニングが挙げられる）、洗濯洗浄、洗濯時及びすすぎ時添加剤及び／又はケア剤、硬質表面洗浄及び／又は処理剤、（床及び便器クリーナー）、顆粒又は粉末形態の多目的又は「強力」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト形態の多目的洗浄剤、特にいわゆる強力液体型、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗剤又は軽質食器洗浄剤、特に高起泡型のもの、食洗機用食器洗浄剤（家庭用及び業務用の、様々な錠剤型、粒剤型、液体型及びすすぎ補助型洗浄剤）：車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む風呂場クリーナー、並びにクリーニング補助剤（漂白添加剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型、又は乾燥機用シートなどの、基材に負担をかける製品（substrate-laden product））。
実際には、本発明の「クリーニング組成物」又は「クリーニング配合物」は、クリーニングされる物体、物品又は表面から化合物（例えば望ましくない化合物）を除去又は排除するのに有用な組成物を指し、クリーニングされる物体、物品又は表面としては、これらに限定するものではないが、例えば、布地、布地物品、食器類、食卓用食器類、ガラス食器類、コンタクトレンズ、その他の固体基材、毛髪（シャンプー）（ヒト又は動物の毛髪を包含する）、皮膚（石鹸及び／又はクリーム）、歯（マウスウオッシュ、歯磨き粉）、物品又は物体の表面（例えば、テーブルの硬質表面、テーブルトップ、壁、家具、床、天井、皿以外の物品、食卓用食器以外の物品などの硬質表面）、フィルタ、薄膜（例えば、限外濾過膜を含むがこれに限定されない濾過膜）等が挙げられる。上記の用語は、組成物に使用されるプロテアーゼ及びその他の酵素にその組成物が適合する限り、所望の特定の種類のクリーニング組成物に選択されるいかなる材料及び／又は添加化合物並びに製品の形態（例えば、液体、ゲル、顆粒、スプレー、又はその他の組成物）も包含する。クリーニング組成物の成分の具体的な選別は、クリーニングされる表面、物体、物品、又は布地を考慮することにより、及び使用時のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することにより、容易に行われる。
クリーニング組成物及びクリーニング配合物は、任意の物体、物品、及び／又は表面をクリーニング、漂白、消毒、及び／又は殺菌するのに好適な任意の組成からなる。このような組成物及び配合物としては、限定するものではないが、例えば、クリーニング又は洗剤組成物（例えば、液体、錠剤、ゲル、顆粒、及び／又は固体洗濯洗浄又は洗剤組成物及びおしゃれ着用洗剤組成物など）；硬質表面クリーニング組成物及び配合物（例えば、ガラス、木、セラミック及び金属製のカウンター及び窓）；カーペットクリーナー；オーブンクリーナー；布地フレッシュナー；布地柔軟剤；及び繊維製品、洗濯用洗浄性能増進クリーニング又は洗剤組成物、洗濯用添加型クリーニング組成物、及び洗濯物の染み抜き用クリーニング組成物；食器手洗い用又は食器手動洗浄用組成物（例えば、食器「手洗い」用又は食器「手動」洗浄用の洗剤）及び食器自動洗浄用組成物（例えば、「食器自動洗浄機用の洗剤」）を包含する食器洗浄用組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、クリーニング組成物又はクリーニング配合物としては、別途記載のない限り、顆粒型又は粉末型汎用又は強力洗浄剤、特に、クリーニング洗剤；液体型、顆粒型、ゲル型、固形、錠剤型又はペースト型汎用洗浄剤、特にいわゆる強力液体（ＨＤＬ）洗剤又は強力粉末洗剤（ＨＤＤ）型；液体リネン洗剤；高起泡型のものを含む食器手洗い又は食器手洗浄剤；食器手洗い又は食器手洗浄、食器自動洗浄、又は家事用及び業務用の様々な錠剤型、粉末型、固形、顆粒型、液体型、ゲル型及びすすぎ補助型の食器類若しくは食卓用食器類洗浄剤；抗菌手洗浄型のもの、クリーニングバー、マウスウォッシュ、義歯クリーナー、カーシャンプー、カーペットシャンプー、風呂場クリーナーなどの液体クリーニング及び消毒剤；人間及び他の動物用毛髪用シャンプー及び／又は毛髪リンス；シャワージェル及びバブルバス及び金属クリーナー；加えて漂白添加剤及び「染み抜き剤」又は前処理型のクリーニング補助剤；が挙げられる。一部の実施形態では、顆粒状組成物は「コンパクト」形態であり；一部の実施形態では、液体組成物は「濃縮された」形態である。
本明細書で使用するとき、「布地クリーニング組成物」としては、洗濯用助剤組成物などの手洗い用及び自動洗濯機用洗剤組成物、並びに染みの付いた布地（例えば、衣類、下着、及び他の繊維製品）の浸け置き及び／又は前処理に使用するのに好適な組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、「非布地クリーニング組成物」としては、限定するものではないが、例えば、食器手洗い用若しくは食器手動洗浄用又は自動食器洗浄機用洗剤組成物、口腔洗浄用組成物、義歯洗浄用組成物、及びパーソナル洗浄組成物などの、非織物（すなわち、非布地）表面用のクリーニング組成物が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「布地及び／若しくは硬質表面洗浄及び／又は処理組成物」は、別途記載のない限り、顆粒又は粉末状の多目的すなわち「強力」洗浄剤、特にクリーニング用洗剤、液体、ゲル、又はペースト形態の多目的洗浄剤、特にいわゆる強力液体型、おしゃれ着用液体洗剤、食器手洗い用洗浄剤又は軽質食器洗浄剤、特に高起泡型のもの、家庭用及び業務用の各種の錠剤型、粒剤型、液剤型、及びすすぎ補助型を含む食洗機用洗剤、液体洗浄剤及び殺菌剤、車又はカーペット洗浄剤、便器クリーナーを含む浴室クリーナー、液体、固体、及び／又は乾燥機用シート形態であり得る柔軟化及び／又はフレッシュニングを含む布地コンディショニング製品、並びにクリーニング助剤（漂白剤及び「染み抜きスティック」又は前処理型、又は乾燥機用シート（dryer added sheet）などの、基材に負担をかける製品（substrate-laden product））が挙げられる洗浄及び処理組成物の部分集合である。適用可能であるこのような製品の全ては、標準形態又は濃縮形態であり得、又は特定の態様では、このような製品は、更には非水性であり得る程度に高濃縮された形態であり得る。
本明細書で使用するとき、用語「洗剤組成物」又は「洗剤配合物」は、特定の布地及び／又は非布地製の物体又は物品などの汚れた又は泥のついた物体のための、洗浄媒質に使用することが意図される、組成物を参照する際に使用される。本発明のこのような組成物は、任意の特定の洗剤組成物又は洗剤配合物に限定されない。実際に、一部の実施形態では、本発明の洗剤は少なくとも１種の本発明の変異型プロテアーゼに加え、界面活性剤、転移酵素、加水分解酵素、酸化還元酵素、ビルダー（例えば、ビルダー塩など）、漂白剤、漂白活性化剤、ブルーイング剤、蛍光染料、ケーキング防止剤、マスキング剤、酵素活性化剤、抗酸化物質、及び／又は可溶化剤を１種以上含有する。場合によっては、ビルダー塩はケイ酸塩とリン酸塩の混合物であり、好ましくはケイ酸塩（例えば、メタケイ酸ナトリウム）をリン酸塩（例えば、トリポリリン酸ナトリウム）よりも多く含む。例えば、限定するものではないが、クリーニング組成物又は洗剤組成物などの、本発明の一部の組成物は、リン酸塩（例えば、リン酸塩又はリン酸塩ビルダー）を含まない。
本明細書で使用するとき、用語「漂白」は、充分な時間にわたる並びに／あるいは適切なｐＨ下での並びに／あるいは増白（すなわち、ホワイトニング）及び／又は物質のクリーニングに効果的な温度条件下での物質（例えば、布地、洗濯物、パルプなど）又は表面の処理を指す。漂白に好適な化学物質の例としては、限定するものではないが、例えば、ＣｌＯ２、Ｈ２Ｏ２、過酸、ＮＯ２、などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、プロテアーゼ（例えば、変異型プロテアーゼ）の「洗浄性能」は、変異型プロテアーゼが、組成に変異型プロテアーゼを加えていない洗剤と比較して、追加のクリーニング性能を洗剤に提供するよう、洗浄に貢献することを指す。洗浄性能は、関連する洗浄条件下で比較される。一部の試験系では、洗剤組成物、泡濃度、水硬度、洗浄機構、時間、ｐＨ、及び／又は温度などの他の関連する要因を、特定の市場区分における典型的な家事用途の条件（例えば、食器手洗い又は食器手動洗浄、食器自動洗浄、食器クリーニング、食卓用食器類クリーニング、及び布地クリーニングなど）に限定されるような様式に調節することもできる。
本明細書で使用するとき、用語「関連する洗浄条件」は、実際に、食器手洗い、自動食器洗浄、又は洗濯洗剤市場区分に含まれる家事で使用される、特に、洗浄温度、時間、洗浄機構、泡濃度、洗剤及び水硬度の型などの条件を意味する。
用語「改善された洗浄性能」は、関連する洗浄条件下で、染み除去において、より良好な仕上がり結果が得られること、あるいは対応する野生型又は開始親プロテアーゼと比較して同様の仕上がり結果を得るにあたり必要とされる変異型プロテアーゼが重量ベースでより少量になることを意味して使用される。
本明細書で使用するとき、用語「消毒」は、表面から汚染物を除去すること、並びに物品表面上に存在する微生物を抑制又は殺傷することを指す。本発明は、任意の特定の表面、物品、又は除去される汚染物若しくは微生物に限定されることを意図しない。
本明細書では、「コンパクト」形態のクリーニング組成物は、最も密度により反映されるものであり、組成の点で言えば無機充填剤の量が反映される。無機充填剤塩は、粉末形態の洗剤組成物において一般的な成分である。一般的な洗剤組成物では、充填剤塩は、典型的には組成物の合計量の約１７〜約３５重量％相当の量で存在する。対照的に、コンパクト組成物では、充填剤塩は、組成物の合計量の約１５重量％以下の量で存在する。一部の実施形態では、充填剤塩は、組成物の約１０重量％以下、より好ましくは約５％重量以下の量で存在する。一部の実施形態では、無機充填剤塩は、硫酸及び塩酸の、アルカリ塩及びアルカリ土類金属塩から選択される。一部の実施形態では、充填剤塩は硫酸ナトリウムである。
所定のアミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置は、典型的には、本明細書において、配列番号１で示されるＢ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列の対応するアミノ酸残基の位置に対して割り振られた番号を使用して、番号付けされる。したがって、配列番号１のＢ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列は、参照配列として提供される。本明細書に記載される変異型プロテアーゼのアミノ酸配列などの、所与のアミノ酸配列を、本明細書に記載されるような整列アルゴリズムを使用してＢＰＮ’配列（配列番号１）と整列させることができ、及びサブチリシンＢＰＮ’配列中の対応するアミノ酸残基を参照することで、ＢＰＮ’配列中のアミノ酸残基と整列させた（好ましくは部分的に整列させた）所与のアミノ酸配列中のアミノ酸残基を都合よく番号付けすることができる。あるいは、サブチリシンの変異型プロテアーゼの配列のアミノ酸残基の位置が、ＧＧ３６アミノ酸配列（配列番号２）中のアミノ酸残基の位置に実際に割り振られた番号を使用して番号付けされ、整列時のＢＰＮ’配列の対応するアミノ酸位置は参照されない場合、サブチリシンの変異型プロテアーゼは、配列番号２で示されるプロテアーゼＧＧ３６のプロテアーゼ変異体として記載することができる。
概して、本明細書で使用する命名法、並びに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、分子生物学、核酸化学、及びタンパク質化学的な実験手順の多くは周知のものであり、当業者により一般的に採用される。組み換え核酸の製造及び操作法、核酸合成法、細胞培養法、及び導入遺伝子の組み込み法（例えば、形質移入、電気穿孔法）は当業者に既知のものであり、様々な一般的な文献に記載されている。オリゴヌクレオチドの合成工程及び精製工程は、典型的には本明細書に従って実施される。概して技術及び手順は、当業者に周知の従来法、並びに本文書を通して提供される様々な一般参照に従って実施される。それらの手順は当業者に周知のものであると考えることができ、読み手には便宜のため提供される。
本発明のペプチド
本発明は新規ポリペプチドを提供し、これを集合的に「本発明のポリペプチド」と呼んでもよい。本発明のポリペプチドは、酵素活性（例えばタンパク質分解活性）を有する、例えばサブチリシン変異体ポリペプチドのような、単離された、組換え型の、実質的に純粋な、又は非天然の変異型プロテアーゼポリペプチドを包含する。一部の実施形態では、サブチリシン変異体、又は配列番号２の配列を有するＧＧ３６の変異体のような本発明のポリペプチドは、その親、例えば配列番号２の配列を有するＧＧ３６プロテアーゼと比較して、改善されたクリーニング性能を有する。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドはクリーニング用途に有用であり、クリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングする方法に有用なクリーニング組成物中に組み込まれてもよい。
一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼは「変異型サブチリシン」を含む。一部の実施形態では、本発明は「バチルス属変異型プロテアーゼ」を提供する。一部の実施形態では、本発明は「バチルス属変異型サブチリシン」を提供する。一部の実施形態では、本発明は単離されたサブチリシン変異体を提供する。一部の実施形態では、本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、本発明は、単離された、組換え型の、実質的に純粋な、又は非天然の、タンパク質分解活性を有する変異型プロテアーゼを包含し、ポリペプチドは、本明細書で提供される変異型プロテアーゼをコードするアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、又は１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。
上記のように、本発明の変異型プロテアーゼのポリペプチドは酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有し、それ故、限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地、及び硬質表面を有する物品（例えば、テーブル、テーブルトップ、壁、家具、床、天井等の硬質表面）のクリーニング方法などといった、クリーニング用途に有用である。本発明の変異型プロテアーゼポリペプチドを１つ以上含む代表的なクリーニング組成物を以下に記載する。本発明の変異型プロテアーゼポリペプチドの酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性）は、当業者に周知の手順を用いて、容易に測定することができる。以下に記載される実施例は、酵素活性、クリーニング性能、及び／又は洗浄性能を評価するための方法を記載する。染み除去（例えば、タンパク性の染みの除去）、硬質表面のクリーニング、又は洗濯物、食器類若しくは食卓用食器類のクリーニング時の本発明の変異型プロテアーゼの性能は、当業者に周知の手法を用いて、及び／又は実施例に記載される手法を用いて、容易に測定することができる。
本発明のポリペプチドには、１箇所以上でのアミノ酸の保存的又は非保存的な挿入、欠失、及び／又は置換などといった様々な変更を、ポリペプチドの酵素活性を実質的に変えないような場所を含めて、加えることができる。同様に、本発明の核酸には、特定のコドンが同一の又は異なるアミノ酸をコードするように、１箇所以上で、１つ以上のコドンに含まれる１つ以上の核酸を置換して、サイレントな変化（例えば、コードされるアミノ酸が核酸変異により変更されなかった場合、ヌクレオチド配列中の変異はアミノ酸配列中にサイレント変異を生じる）を生じさせるよう、あるいは配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）を１箇所以上で欠失させて、配列中に１つ以上の核酸（又はコドン）を付加又は挿入して、及び／又は配列中の１つ以上の核酸（又はコドン）を切断又は１箇所以上でトランケーションさせて、サイレントではない変化を生じさせるよう、複数の変化を加えることもできる。核酸配列における多くのこのような変更は、得られる配列にコードされる変異型プロテアーゼの酵素活性を、元の核酸配列によりコードされている変異型プロテアーゼのものと比較して実質的に変化させなくてよい。同様に、発現系（例えば、細菌による発現系）で最適な発現をもたらすコドンが１つ以上包含されるように、必要に応じて、上記１つ以上のコドンには同一のアミノ酸をコードさせたまま、本発明の核酸を改変させてもよい。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるアミノ酸置換を有する配列を含み、かつ保存的及び非保存的置換のような更なるアミノ酸置換も１箇所以上に含む、所望の酵素活性（例えば、プロテアーゼ活性又はクリーニング性能活性）を有する変異型プロテアーゼポリペプチドを含むポリペプチドの属を提供し、このポリペプチドは所望の酵素活性（例えば、クリーニング活性又は変異型プロテアーゼの性能に反映されるようなプロテアーゼ活性又はサブチリシン活性）を示し、維持し、又はほぼ維持する。本発明に従うアミノ酸置換には、限定するものではないが、１箇所以上での非保存的置換及び／又は１箇所以上での保存的なアミノ酸置換が包含され得る。保存的なアミノ酸残基置換は、典型的には、アミノ酸残基の機能分類に含まれるアミノ酸を、同様の機能分類（同一のアミノ酸残基は、機能的に相同であるとみなされ、すなわち算出された機能的相同性％で保存されている）に属する残基と交換することを包含する。保存的なアミノ酸置換は、典型的には、機能的に類似するアミノ酸によるアミノ酸置換をアミノ酸配列中に包含する。例えば、アラニン、グリシン、セリン、及びトレオニンは機能的に類似するものであり、ひいては互いに保存的なアミノ酸置換を提供し得る。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、互いに保存的な置換を提供し得る。アスパラギン及びグルタミンは、互いに保存的な置換を提供し得る。アルギニン、リシン、及びヒスチジンは、互いに保存的な置換を提供し得る。イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリンは、互いに保存的な置換を提供し得る。フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンは、互いに保存的な置換を提供し得る。
他の保存的なアミノ酸置換基も想定され得る。例えば、アミノ酸は、機能類似性又は化学構造若しくは組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、イオウ含有）により分類することができる。例えば、脂肪族基には、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）が包含される。互いに保存的な置換であるとみなされるアミノ酸を含有する他の基には：芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；イオウ含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；非極性無電荷残基、システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）、及びプロリン（Ｐ）；親水性の無電荷残基：セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、及びグルタミン（Ｑ）が包含される。アミノ酸のその他の分類も当業者に周知であり、様々な一般的な文献に記載されている。上記の置換基と共に、本明細書においてポリペプチド配列を列挙することで、保存的に置換されたすべてのポリペプチド配列の一覧を提供する。
上記の部類のアミノ酸残基には、同様に好適であり、あるいは好適であり得るより保存的な置換が存在する。より保存的な置換のための保存的な基としては：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンが挙げられる。したがって、例えば一部の実施形態では、本発明は、タンパク質分解活性を有する、単離された、又は変異型プロテアーゼの組み換えポリペプチド（例えば、サブチリシン変異体）を提供し、上記変異型プロテアーゼのポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約９９．５％の配列相同性を有するアミノ酸配列からなる。本発明の変異型プロテアーゼにおける、他のアミノ酸によるアミノ酸の保存的な置換は、変異型プロテアーゼの酵素活性又はクリーニング性能活性を有意に変更させることを見込むものではない。得られるプロテアーゼの酵素活性又はクリーニング性能活性は、標準的なアッセイ及び本明細書に記載されるアッセイを用い、容易に測定することができる。
本発明の、ポリペプチド配列が保存的に置換された変異体（例えば、本発明の変異型プロテアーゼ）は、同様の保存的な置換基の保存的に選択されたアミノ酸による、割合の低い置換を、しばしば、ポリペプチド配列のアミノ酸のうちの約２５％、約２０％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、又は約６％未満が、又はポリペプチド配列のアミノ酸のうちの約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％未満の置換を含有する。
本明細書内の他の箇所で詳細に記載されるように、及び本明細書で提供される実施例に記載されるように、本発明のポリペプチドは、既知のサブチリシンを包含する既知のプロテアーゼに匹敵し得るクリーニング能力を有してもよい。例示的な既知のサブチリシンプロテアーゼとしては、限定するものではないが、例えば、Ｂ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’−Ｙ２１７Ｌ、及びＢ．クラウシイＰＢ９２が挙げられる。Ｂ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６の成熟タンパク質のアミノ酸配列は次のものである：
Figure 2014522235
Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’の成熟タンパク質のアミノ酸配列は次のものである：
Figure 2014522235
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、
Figure 2014522235
の位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、
Figure 2014522235
から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、
Figure 2014522235
から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、
Figure 2014522235
から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、
Figure 2014522235
から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
Figure 2014522235
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
Figure 2014522235
サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
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サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
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サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
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サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
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サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
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サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み
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サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを更に提供し、このサブチリシン変異体はバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼのプロテアーゼ変異体であり、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト２から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト３から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト４から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト５から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト６から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト７から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト８から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、このリスト１０から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１１から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１２から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１３から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１４から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１５から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１６から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１７から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１８から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含み、このサブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対する少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対する少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対する少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対する少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体を更に提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対する少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを更に提供し、ここで変異体の総正味電荷は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、−１、−２、−３、−４、又は−５である。一部の実施形態では、総正味電荷は、次から選択される１箇所以上の置換によって得られ：
Figure 2014522235
このプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体も提供し、このプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１箇所、又は更には２箇所以上の電荷変異を有し：
Figure 2014522235
好ましくは配列番号１の酵素を基準にして、０、−１、−２、−３、−４又は−５の電荷、好ましくは０、−１、−２又は−３、最も好ましく−１又は−２の電荷を有する。上記プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、本願に記載された変異体のいずれも包含することができる。
本発明は、単離されたプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体も提供し、このプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、以下からなる群から選択される１箇所又は２箇所以上の電荷変異を有し：
Figure 2014522235
好ましくは配列番号１の酵素を基準にして、０、＋１、＋２、＋３、＋４又は＋５の電荷、好ましくは＋１、＋２又は＋３、最も好ましくは＋２の電荷を有する。上記プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、本願に記載された変異体のいずれも包含することができる。
一部の実施形態では、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを水への添加に適した洗剤組成物に組み込んで、低イオン強度又は低洗剤濃度の洗浄液を作製することができる。それゆえに、本発明の好ましい態様では、これらの変異体は、手による洗浄又は機械による洗浄プロセスのいずれかについて、典型的には洗濯機内で、洗浄液を形成するために水に添加される洗剤組成物の部分を形成し、洗浄液の伝導度は、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約３ｍＳ／ｃｍ、約０．３ｍＳ／ｃｍ〜約２．５ｍＳ／ｃｍ、又は更には約０．５ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍである。低イオン強度又は低洗剤濃度への使用に適した変異体は、上記のリスト９、１４、１５又は１６、好ましくはリスト１４又は１５、最も好ましくはリスト１５のいずれかの変異体から選択される。
理論に束縛されるものではないが、所望の正味電荷を達成するこれらの変異は、低イオン強度条件下で又は低洗剤濃度の洗浄液で、分子の最適な電荷を保証することにより全体的なプロテアーゼ性能を改善すると考えられ、これらの変異は、好ましいプロテアーゼを得ることができるように、好ましい特定の変異を注意深く組み合わせることによってのみ得られる。
一部の実施形態では、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを水への添加に適した洗剤組成物に組み込んで、高イオン強度又は高洗剤濃度の洗浄液を作製することができる。それゆえに、本発明の好ましい態様では、これらの変異体は、手による洗浄又は機械による洗浄プロセスのいずれかについて、典型的には洗濯機内で、洗浄液を形成するために水に添加される洗剤組成物の部分を形成し、洗浄液の伝導度は、約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍである。高イオン強度又は高洗剤濃度への使用に適した変異体は、上記のリスト１又は１７、１８又は１９、好ましくはリスト１７又は１８、最も好ましくはリスト１７のいずれかの変異体から選択される。
理論に束縛されるものではないが、所望の正味電荷を達成するこれらの変異は、高イオン強度条件下で又は高洗剤濃度の洗浄液で、分子の最適な電荷を保証することにより全体的なプロテアーゼ性能を改善すると考えられ、これらの変異は、好ましいプロテアーゼを得ることができるように、好ましい特定の変異を注意深く組み合わせることによってのみ得られる。
好ましくは、これらのプロテアーゼは洗剤組成物の一部を形成するものであり、洗剤組成物は、手洗い又は機械洗浄のいずれかでの洗浄工程で、典型的には洗濯機内で、水に加えられ、伝導度が約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍである洗浄液を形成する。
理論に束縛されるものではないが、これらの変異箇所を所望の正味電荷にさせることで、イオン強度の高い又は洗剤濃度の高い条件下での、全般的なプロテアーゼ性能が改善されると考えられ、このような改善は、このような好ましいプロテアーゼを得ることができるように、好ましい特定の変異を注意深く組み合わせることによってのみ得られる。
本発明は、以下の特性の１つ以上を有する上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを更に提供する：ａ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法２による性能指数；ｂ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法３による性能指数；ｃ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法４による性能指数；及び／又はｄ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法６による性能指数；及び／又はｅ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１５、１．１〜約１０、又は更には１．１〜約７である試験方法７による性能指数。試験方法２、試験方法３、試験方法４、試験方法６、及び試験方法７は、以下の実施例１の表題「試験方法」の節で明記される。
本発明の核酸
本発明は、単離された核酸、非天然の核酸、又は組み換え核酸（本明細書で「ポリヌクレオチド」とも呼ばれる）を提供し、これは集合的に「本発明の核酸」又は「本発明のポリヌクレオチド」と呼ばれることもあり、本発明のポリペプチドをコードする。本発明の核酸は、以下に記載のすべてのものを含めて、本発明のポリペプチドの組み換え体の産生（例えば発現）、典型的には、対象とするポリペプチドをコードする配列又はそれらの断片を含むプラスミド発現ベクターの発現を介した産生に有用である。上述のように、ポリペプチドには、例えば、酵素活性（例えば、タンパク質分解活性）を有する、変異型サブチリシンのポリペプチドなどの変異型プロテアーゼのポリペプチドが包含され、プロテアーゼ変異体ポリペプチドは、クリーニング用途、及びクリーニングする必要のある物品又は表面（例えば、物品の表面）をクリーニングするためのクリーニング組成物に有用である。
一部の実施形態では、本発明は、上記の表題「本発明のポリペプチド」と付けられた節及び本明細書の他の場所に記載される、任意のポリペプチド（任意の融合タンパク質などが包含される）をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸又は非天然の核酸を提供する。本発明は、上記及び本明細書の他の箇所に記載の、本発明の任意のポリペプチドの２つ以上の組み合わせをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸、又は非天然の核酸も提供する。
タンパク質分解活性を有する変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸、組み換え核酸、実質的に純粋な核酸、又は非天然の核酸も提供され、上記変異型プロテアーゼ（例えば、変異型サブチリシン）は、配列番号２のアミノ酸配列とは５０個以下、４０個以下、３０個以下、３５個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、又は１個以下のアミノ酸残基により異なるアミノ酸配列を含み、変異型サブチリシンのアミノ酸位置は、変異型プロテアーゼのアミノ酸配列を配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト２から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト３から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト４から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト５から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト６から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト７から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト８から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト９から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１０から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１１から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１２から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１３から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１４から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１５から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１６から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１７から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１８から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であり、リスト１９から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかをコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体はバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼのプロテアーゼ変異体であり、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト２から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト３から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト４から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト５から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト６から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト７から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト８から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１０から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１１から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１２から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１３から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１４から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１５から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１６から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１７から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１８から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２で示されるアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体は配列番号２に対する少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性及びタンパク質分解活性を有し、かつリスト１９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対して少なくとも９８％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記のように、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を提供し、このサブチリシン変異体は配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対して少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有する。
本発明は、上記の単離されたサブチリシン変異体をコードする核酸を更に提供し、ここで変異体の総正味電荷は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、−１、−２、−３、−４、又は−５である。一部の実施形態では、総正味電荷は、次から選択される１箇所以上の置換によって得られ：
Figure 2014522235
このプロテアーゼ変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、単離されたプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体をコードする核酸を更に提供し、このプロテアーゼ変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１箇所、又は更には２箇所以上の電荷変異を有し：
Figure 2014522235
好ましくは配列番号１の酵素を基準にして、０、−１、−２、−３、−４又は−５の電荷、好ましくは０、−１、−２又は−３、最も好ましく−１又は−２の電荷を有する。上記プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、本願に記載された変異体のいずれも包含することができる。
本発明は、単離されたプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体も提供し、このプロテアーゼ変異体は以下からなる群から選択される１又は２箇所又はそれ以上の電荷変異を有し：
Figure 2014522235
配列番号１の酵素を基準にして、好ましくは０、＋１、＋２、＋３、＋４又は＋５の電荷、好ましくは＋１、＋２又は＋３、最も好ましくは＋２の電荷を有する。上記プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、本願に記載された変異体のいずれも包含することができる。
本明細書で記載するとき、好適な冷水用プロテアーゼ変異体、又はサブチリシン変異体は、親プロテアーゼの変異体であり、この親プロテアーゼの配列は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９９％又は１００％同一であり、プロテアーゼ変異体は、次の特性の１つ以上を有する：
ａ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法２による性能指数；ｂ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法３による性能指数；ｃ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法４による性能指数；及び／又はｄ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法６による性能指数；及び／又はｅ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１５、１．１〜約１０、又は更には１．１〜約７である試験方法７による性能指数。試験方法２、試験方法３、試験方法４、試験方法６、及び試験方法７は、以下の実施例１の表題「試験方法」の節で明記される。本明細書で引用されるすべての変異は、図１に示されるようなＢＰＮ’番号付けスキームを利用する。一部の実施形態では、本明細書で参照される変異体は、ＢＰＮ’番号付与スキームを用い配列番号２のアミノ酸配列と比較されるアミノ酸配列を有する変異体を指す。
一部の実施形態では、上記のイオン強度の高い冷水用プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、（典型的には、洗濯機内で）水に希釈される洗剤組成物の一部となり、伝導度が約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの洗濯用洗剤洗浄液を形成する。
ＧＧ３６冷水用プロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体の電荷は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢ．レンタスサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼ野生型を基準として表される。単一の負電荷を付与するアミノ酸はＤ及びＥであり、単一の正電荷を付与するアミノ酸はＲ、Ｈ及びＫである。配列番号２に対する任意のアミノ酸の電荷を変更することになる変更により、冷水用プロテアーゼ変異体の電荷を算出する。例えば、野生型の、電荷が中性である位置に負電荷の変異を導入すると、正味−１の電荷が冷水用プロテアーゼ変異体に加えられる一方で、野生型の正電荷のアミノ酸残基（Ｒ、Ｈ、又はＫ）に負電荷変化（Ｄ又はＥ）を導入すると、正味−２の電荷が加えられることになる。配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型のＢ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６のプロテアーゼと比較した場合に異なっている、冷水用プロテアーゼ変異体のすべてのアミノ酸残基の電荷変化の合計は、冷水用プロテアーゼ変異体の電荷変化として与えられる。理論に束縛されるものではないが、伝導度の低い洗濯洗剤溶液で使用される冷水用プロテアーゼに好適な電荷範囲は−５、−４、−３、−２、−１、０、特に−２、−１であり；伝導度の高い洗濯洗剤溶液で使用される冷水用プロテアーゼに好適な電荷範囲は＋５、＋４、＋３、＋２、＋１、０、特に＋２、＋１であると考えられている。電荷を正しく選択することにより、予想外にレベルの改善された冷水クリーニング性能を得ることができる。「伝導度の低い洗濯洗剤溶液」は、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約３ｍＳ／ｃｍ、約０．３ｍＳ／ｃｍ〜約２．５ｍＳ／ｃｍ、又は更には約０．５ｍＳ／ｃｍ〜約２ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものとして定義される。「伝導度の高い洗濯洗剤溶液」は、約３ｍＳ／ｃｍ〜約３０ｍＳ／ｃｍ、約３．５ｍＳ／ｃｍ〜約２０ｍＳ／ｃｍ、又は更には約４ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍの伝導度を有するものとして定義される。上記の実施例は非限定的なものであることが意図される。冷水性能を最適化するために変異が組み合わされる場合にも、酵素電荷は更なる位置における変異により均衡が得られ得る。
一部の実施形態では、本発明は、タンパク質分解活性を有する単離された変異型プロテアーゼ、変異型組み換えプロテアーゼ、実質的に純粋な変異型プロテアーゼ又は非天然の変異型プロテアーゼ（例えば、変異型サブチリシン）を提供し、この変異型プロテアーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列とは５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下、又は８個以下のアミノ酸残基により異なるアミノ酸配列を含み、アミノ酸位置は、変異型プロテアーゼのアミノ酸配列を配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮの対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明の核酸は、任意の好適な合成、操作、及び／又は単離手法、又はこれらの組み合わせを用いて作製できる。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当業者に周知の固相合成法などの標準的な核酸合成技術を用い製造することもできる。このような技術では、典型的には５０個まで又はそれ以上のヌクレオチド塩基の断片が合成され、次いで連結されることで（例えば、酵素的な若しくは化学的な連結方法、又はポリメラーゼによる組み換え方法）、本質的に任意の所望の連続的な核酸配列が形成される。本発明の核酸の合成は、古典的なホスホルアミダイト法を用いる化学合成が挙げられるがこれに限定されない当該技術分野において既知の任意の好適な方法（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９〜６９［１９８１］参照）；又は自動化合成法において典型的に実践されているように、Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．が記載した方法（Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１〜８０５［１９８４］参照）によって、促進（又は別の方法としては達成）することができる。本発明の核酸は、自動ＤＮＡ合成装置を使用しても作製できる。カスタマイズされた核酸は、各種供給業者（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ、ｔｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．及びＤＮＡ２．０）に発注することができる。その他の核酸合成手法及び関連原理は当該技術分野において既知である（例えば、Ｉｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３［１９８４］；及びＩｔａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６［１９８４］参照）。
上記のように、核酸の改変に有用な、ＤＮＡの組み換え技術は、当該技術分野において周知である。例えば、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、及びｃＤＮＡ生産、並びにポリメラーゼ連鎖反応（例えば、ＰＣＲ）などの技法が知られており、当業者により容易に選択される。本発明のヌクレオチドは、本発明の変異型プロテアーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成することのできる、又はこれをＰＣＲ増幅することのできるオリゴヌクレオチドプローブを１つ以上用い、ｃＤＮＡライブラリ（例えば、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野で一般的に使用される変異導入技術を用いて生成されたｃＤＮＡライブラリ）をスクリーニングすることでも得られる。ｃＤＮＡクローンのスクリーニング及び単離手順、及びＰＣＲによる増幅手順は当業者に周知のものであり、当業者に既知の一般的な参考文献に記載される。本発明の核酸のいくつかは、天然のポリヌクレオチド主鎖（例えば、酵素又は親プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド）を、例えば既知の変異導入法（例えば、部位特異的変異導入、部位飽和変異導入、及びインビトロでの組み換え）を用いて改変することによって得ることができる。
本発明の改変された変異型プロテアーゼの製造方法
本発明の改変ポリヌクレオチドを生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、こうした方法としては、限定するものではないが、例えば、部分飽和変異導入、系統的変異導入、挿入変異導入、欠失変異導入、ランダム変異導入、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。改変されたポリヌクレオチド及びタンパク質（例えば、変異型プロテアーゼ）の製造方法としては、遺伝子の非相同組み換えに基づく方法、例えばＩＴＣＨＹ（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，７：２１３９〜４４［１９９９］を参照されたい）、ＳＣＲＡＣＨＹ（Ｌｕｔｚ ｅｔ ａｌ．９８：１１２４８〜５３［２００１］を参照されたい）、ＳＨＩＰＲＥＣ（Ｓｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９：４５６〜６０［２００１］を参照されたい）、及びＮＲＲ（Ｂｉｔｔｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０：１０２４〜９［２００１］；Ｂｉｔｔｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１０１：７０１１〜６［２００４］）を参照されたい、並びにランダムな及び標的とされる変異、欠失及び／又は挿入を組み込むためにオリゴヌクレオチドを使用することに基づく方法（Ｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０：１２５１〜５［２００２］；Ｃｏｃｏ ｅｔ ａｌ．，２０：１２４６〜５０［２００２］；Ｚｈａ ｅｔ ａｌ．，４：３４〜９［２００３］；Ｇｌａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１４９：３９０３〜１３［１９９２］を参照されたい）などのＤＮＡシャフリング法が挙げられる。
本発明の変異型プロテアーゼを製造するためのベクター、細胞、及び方法
本発明は、本明細書に記載の少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の本発明の変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド）を含む単離された又は組み換えベクター、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された又は組み換え発現ベクター又は発現カセット、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む単離された、実質的に純粋の、又は組み換えＤＮＡコンストラクト、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む単離された又は組み換え細胞、少なくとも１種の本発明のポリヌクレオチドを含む細胞を含む細胞培養物、少なくとも１種の本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含む細胞培養物、並びにこのようなベクター、核酸、発現ベクター、発現カセット、ＤＮＡコンストラクト、細胞、細胞培養物、又はこれらの任意の組み合わせ又はこれらの混合物を１種以上含む組成物を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の少なくとも１種の核酸又はポリヌクレオチドを含む本発明のベクター（例えば、発現ベクター又はＤＮＡコンストラクト）を少なくとも１つ含む組み換え細胞を提供する。このような組み換え細胞の一部のものは、このような少なくとも１つのベクターにより形質転換又は形質移入される。このような細胞は、典型的には宿主細胞と呼ばれる。このような細胞の一部のものは、細菌細胞、例えば、限定するものではないが、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）細胞などのバチルス種（Bacillus sp.）細胞を含む。本発明は、本発明の少なくとも１種の変異型プロテアーゼを含む組み換え細胞（例えば、組み換え宿主細胞）も提供する。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の核酸又はポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、本発明の変異型プロテアーゼをコードする本発明のポリヌクレオチド配列が、効果的な遺伝子の発現に必要とされる核酸断片に、又は追加の核酸断片に、制御可能なように連結される発現ベクター又は発現カセットである（例えば、プロモーターは、本発明の変異型プロテアーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドに、制御可能なように連結される）。ベクターには、転写終結配列、及び／又は抗菌剤を含有している培地で増殖させた場合に、プラスミドを感染させた宿主細胞を持続的に維持培養することを可能にする、抗菌剤耐性遺伝子などの選別遺伝子を含ませてもよい。
発現ベクターは、プラスミド又はウイルスＤＮＡから誘導することができ、あるいは代替的な実施形態では、これらの両方の要素を含有する。例示的なベクターとしては、限定するものではないが、ｐＸＸ、ｐＣ１９４、ｐＪＨ１０１、ｐＥ１９４、ｐＨＰ１３が挙げられる（Ｈａｒｗｏｏｄ ａｎｄ Ｃｕｔｔｉｎｇ［編］，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ［１９９０］；ｐ．９２に掲載されるものなどのＢ．サブチリス用の好適な複製プラスミドを参照；同様に、Ｐｅｒｅｇｏ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ，ｉｎ Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，［編］Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．［１９９３］，ｐｐ．６１５〜６２４も参照）。
対象とするタンパク質（例えば、変異型プロテアーゼ）を細胞により発現及び生産する際、改変プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドのコピーを少なくとも１つ及び好ましくは複数含む発現ベクターを少なくとも１つ用い、プロテアーゼの発現に好適な条件下で細胞を形質転換する。本発明の一実施形態では、変異型プロテアーゼ（並びにベクターに含まれる他の配列）をコードするポリヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムに組み込まれ、一方、他の実施形態では、変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列からなるプラスミドベクターは自律性の染色体外配列として細胞内に留まる。本発明は、染色体外の核酸要素、並びに宿主細胞のゲノムに組み込まれる組み込みヌクレオチド配列の両方を提供する。本明細書に記載のベクターは、本発明の変異型プロテアーゼの生産に有用である。一部の実施形態では、変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドコンストラクトは、変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを細菌染色体に組み込み及び任意選択で増幅することのできるベクター上に存在する。組み込むための部位の例は、当業者に周知である。一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドの転写は、選択されたプロテアーゼ前駆体用の野生型プロモーターであるプロモーターによりもたらされる。一部の他の実施形態では、プロモーターは、プロテアーゼ前駆体と非相同的なものであるものの、宿主細胞中で機能するものである。具体的には、細菌宿主細胞で使用するのに好適なプロモーターの例としては、限定するものではないが、例えば、ａｍｙＥ、ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、ｐｓｔＳ、ｓａｃＢ、ｐＳＰＡＣ、ｐＡｐｒＥ、ｐＶｅｇ、ｐＨｐａＩＩプロモーター、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）マルトース生成型アミラーゼ遺伝子、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）（ＢＡＮ）アミラーゼ遺伝子、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）アルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）アルカリプロテアーゼ遺伝子、Ｂ．プミリス（B. pumilis）キシロシダーゼ遺伝子、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）ｃｒｙＩＩＩＡ、及びＢ．リケニフォルミス（B. licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子が挙げられる。追加のプロモーターとしては、限定するものではないが、Ａ４プロモーター、並びにファージλ ＰＲ又はＰＬプロモーター、及び大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターが挙げられる。
本発明の変異型プロテアーゼは、微生物及び真菌を包含する任意の好適なグラム陽性細菌の宿主細胞で生産され得る。例えば、一部の実施形態では、変異型プロテアーゼは真菌及び／又は微生物由来の宿主細胞で生産される。一部の実施形態では、宿主細胞は、バチルス種（Bacillus sp.）、ストレプトマイセス種（Streptomyces sp.）、エシェリキア種（Escherichia sp.）、又はアスペルギルス種（Aspergillus sp.）である。一部の実施形態では、変異型プロテアーゼは、バチルス種（Bacillus sp.）の宿主細胞により生産される。本発明の変異型プロテアーゼの生産での使用が見出されるバチルス種（Bacillus sp.）宿主細胞の例としては、限定するものではないが、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、Ｂ．サブチリス（B.subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、Ｂ．レンタス（B.lentus）、Ｂ．ブレービス（B. brevis）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．プミリス（B. pumilis）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、及びＢ．メガテリウム（B. megaterium）、並びにバチルス（Bacillus）属内の他の生物が挙げられる。一部の実施形態では、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）宿主細胞は、変異型プロテアーゼの生産に使用される。米国特許第５，２６４，３６６号及び同第４，７６０，０２５号（再発行特許第３４，６０６号）は、本発明の変異型プロテアーゼの生産に使用することができる様々なバチルス宿主株を記載するが、他の好適な株も使用することができる。
本発明の変異型プロテアーゼの生産に使用することができるいくつかの工業用の菌種としては、非組み替え型（すなわち、野生型）のバチルス種株、並びに天然に生じる変異体株及び／又は組み換え株が挙げられる。一部の実施形態では、宿主株は組み換え株であり、宿主には、対象とするポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されている。一部の実施形態では、宿主株はＢ．サブチリス宿主株であり、特に組み換え型のバチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）宿主株である。数多くのＢ．サブチリス株が既知であり、限定するものではないが、例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３〜ＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ ３９，０８７）、ＡＴＣＣ ２１３３２、ＡＴＣＣ ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ １１０、及びＰＥＰ ２１１株が挙げられる（例えば、Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７３：２１５〜２２８［１９７３］を参照されたい；同様に、米国特許第４，４５０，２３５号及び同第４，３０２，５４４号、並びに欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい、これらの各々は参照によりその全文が組み込まれる）。発現宿主細胞としてのＢ．サブチリスの使用は当業者に周知である（例えば、Ｐａｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １９：８１〜８７［１９８２］；Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ ａｎｄ Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：７９６〜８０４［１９８６］；並びにＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ６９：３９〜４７［１９８８］を参照されたい）。
一部の実施形態では、バチルス宿主細胞は、次の遺伝子：ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ及びｄｅｇＱのうちの少なくとも１つの遺伝子において変異又は欠失を含むバチルス種のものである。好ましくは、変異はｄｅｇＵ遺伝子にあり、より好ましくは変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（例えば、Ｍｓａｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７２：８２４〜８３４［１９９０］；及びＯｌｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：５６２〜５６７［１９９７］参照）。変異ｄｅｇＵ３２（Ｈｙ）を保有しているバチルス・サブチルスも好適な宿主株である。一部の実施形態では、バチルス宿主は、ｓｃｏＣ４に突然変異又は欠失を含む（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：７３２９〜７３４０［２００１］参照）；ｓｐｏＩＩＥ（例えば、Ａｒｉｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３１：１４０７〜１４１５［１９９９］）；及び／又はｏｐｐＡ若しくはその他のｏｐｐオペロンの遺伝子（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５：１７３〜１８５［１９９１］参照）。実際に、本発明の改変バチルス株の一部の実施形態での使用が見出される、ｏｐｐＡ遺伝子の変異と同様の表現型を生じる、ｏｐｐオペロンにおける任意の変異が想到される。一部の実施形態では、これらの変異は単独で生じるものの、他の実施形態では複数の変異が組み合わさって存在する。一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼの生産に使用することができる改変されたバチルス宿主細胞株は、上記の遺伝子のうちの１つ以上に予め変異を包含しているバチルス宿主株である。加えて、内因性のプロテアーゼ遺伝子に関する変異及び／又は欠失を包含するバチルス種宿主細胞の使用も見出される。一部の実施形態では、バチルス宿主細胞はａｐｒＥ及びｎｐｒＥ遺伝子の欠失を包含する。他の実施形態では、バチルス種宿主細胞は５つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含み、一方で他の実施形態では、バチルス種宿主細胞は９つのプロテアーゼ遺伝子の欠失を含む（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０２０２５３５号参照）。
宿主細胞は、本発明の少なくとも１種の変異型プロテアーゼをコードする核酸を少なくとも１つ用い、当該技術分野において既知の任意の好適な手段により形質転換される。ベクターに組み込まれる場合でも、あるいはプラスミドＤＮＡを存在させずに使用される場合でも、いずれにせよ、核酸は典型的には微生物に導入され、一部の実施形態では、好ましくは大腸菌細胞又は形質転換受容性のバチルス細胞に導入される。プラスミドＤＮＡコンストラクト又はベクターを利用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をバチルス細胞又は大腸菌細胞に導入する方法、及びこのようなプラスミドＤＮＡコンストラクト又はベクターにより細胞を形質転換する方法は周知である。一部の実施形態では、プラスミドは、続いて大腸菌細胞から単離され、バチルス細胞に導入される。しかしながら、必ずしも大腸菌などの微生物を介在させることは本質的ではなく、一部の実施形態では、ＤＮＡコンストラクト又はベクターは直接バチルス宿主に導入される。
当業者は、本発明の核酸又はポリヌクレオチド配列をバチルス細胞に導入する好適な方法を十分承知している（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，」ｉｎ Ｈａｒｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．［編］，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．［１９８９］，ｐｐ．５７〜７２；Ｓａｕｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５７：７１８〜７２６［１９８４］；Ｈｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３：１９２５〜１９３７［１９６７］；Ｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：１３１〜１３５［１９８６］；Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：９７［１９８５］；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８：１１〜１１５［１９７９］；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．７：２６１〜２６３［１９８０］；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５１：６３４［１９８６］；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３９：２１３〜２１７［１９８１］；及びＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３０：２０３［１９８４］参照）。実際に、プロトプラスト形質転換及び会合（congression）を包含する形質転換、形質導入、及び原形質融合などの方法は周知であり、本発明への使用に適する。本発明の変異型プロテアーゼをコードする核酸を含むＤＮＡコンストラクト又はベクターを宿主細胞に導入するために、形質転換法が使用される。当該技術分野において既知のバチルス細胞の形質転換方法としては、部分的に相同である常在性プラスミドを保持する形質転換受容性細胞によるドナープラスミドの取り込みを伴う、プラスミドマーカーレスキュー形質転換などの方法が挙げられる（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ２：５５５〜５７１［１９７９］；Ｈａｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：１８５〜１９１［１９９０］；Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：１０７７〜１０８７［１９８３］；及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：１２０５〜１２１１［１９８７］参照）。この方法では、導入するドナープラスミドは、染色体の形質転換を模倣する方法で、常在性の「ヘルパー」プラスミドの相同領域を組み換える。
一般的に使用される方法に加えて、一部の実施形態では、宿主細胞は、本発明の変異型プロテアーゼをコードする核酸を含むＤＮＡコンストラクト又はベクターにより直接的に形質転換される（すなわち、宿主細胞への導入前にＤＮＡコンストラクト又はベクターを増幅ないしは他の加工を行うために、中間細胞を使用しない）。本発明のＤＮＡコンストラクト又はベクターの宿主細胞への導入法には、プラスミド又はベクター中に挿入せずに核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を宿主細胞に導入するための、当該技術分野において既知の物理的及び化学的方法が包含される。このような方法としては、限定するものではないが、塩化カルシウム沈殿、電気穿孔法、ネイキッドＤＮＡ法、及びリポソーム法などが挙げられる。更なる実施形態では、ＤＮＡコンストラクト又はベクターは、プラスミドに挿入されず、プラスミドと共に同時形質転換に使用される。加えて、更なる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野において既知の方法により、改変バチルス株から削除される（Ｓｔａｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：４１１〜４１８［１９８４］；及びＰａｌｍｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ２４７：２５５〜２６４［２０００］参照）。
一部の実施形態では、本発明の形質転換細胞は、一般的な栄養培地で培養される。温度及びｐＨなどの好適な具体的な培養条件は当業者に既知であり、科学文献に詳しく記載されている。一部の実施形態では、本発明は、本発明の少なくとも１種の変異型プロテアーゼ又は本発明の少なくとも１種の核酸を含む培養物（例えば、細胞培養物）を提供する。同様に、本発明の核酸、ベクター、又はＤＮＡコンストラクトを少なくとも１つ含む組成物も提供する。
一部の実施形態では、本発明の少なくとも１種の変異型プロテアーゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、本発明のプロテアーゼの発現を可能にする条件下で、好適な栄養培地で培養した後、得られたプロテアーゼを培養物から回収する。細胞培養に使用する培地には、宿主細胞を増殖させるのに好適な、適切な添加剤を含有している最少培地又は複合培地などといった任意の一般的な培地を含む。好適な培地は、販売元から入手することができ、又は公開されている処方に従って調製することもできる（例えば、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログを参照されたい）。一部の実施形態では、細胞により生産されたプロテアーゼは、限定するものではないが、例えば、遠心沈降又は濾過による培地からの宿主細胞の分離、上清のタンパク質成分の沈殿又は塩（例えば、硫酸アンモニウム）を用いる濾過、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、親和性など）などの従来法により培養培地から回収される。本発明で使用するにあたり、変異型プロテアーゼを回収又は精製するための任意の好適な方法を選択することができる。
一部の実施形態では、組み換え宿主細胞により生産された変異型プロテアーゼは、培養培地に分泌される。精製を促進するドメインをコードする核酸配列を使用して、可溶性タンパク質の精製を容易にすることもできる。変異型プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクター又はＤＮＡコンストラクトには、変異型プロテアーゼの精製を促進するドメインをコードする核酸配列を更に含ませて、精製を容易にすることもできる（例えば、Ｋｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：４４１〜５３［１９９３］参照）。このような精製を促進するドメインとしては、限定するものではないが、例えば、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレート化ペプチド（Ｐｏｒａｔｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３〜２８１［１９９２］参照）、固定化された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、及びＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製システムで使用されるドメイン（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から入手可能なプロテインＡドメイン）が挙げられる。精製ドメインと非相同的なタンパク質との間に、ファクターＸＡ又はエンテロキナーゼなどの、開裂させることのできるリンカー配列（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から得られる配列）を包含させることによっても精製が促進されることが見出されている。
本発明の変異型プロテアーゼなどの酵素の酵素活性の検出及び測定アッセイは周知である。プロテアーゼ（例えば、本発明の変異型プロテアーゼ）の活性を検出及び測定するための様々なアッセイも当業者には既知である。特に、このようなアッセイは、２８０ｎｍでの吸光度として測定されるカゼイン又はヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出測定、あるいは当業者に周知であるフォリンを用いる比色測定方法に基づき、プロテアーゼの活性を測定するのに有効である。他の例示的なアッセイは、発色性基質の可溶化を包含する（例えば、Ｗａｒｄ，「Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，」ｉｎ Ｆｏｇａｒｔｙ（編）．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，［１９８３］，ｐｐ．２５１〜３１７を参照されたい）。他の例示的なアッセイとしては、限定するものではないが、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラニトロアニリドアッセイ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩アッセイ（ＴＮＢＳアッセイ）が挙げられる。当該技術分野において既知の多数のその他の文献が、好適な方法を提供している（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：７９１１〜７９２５［１９８３］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２３：１１９〜１２９［１９９４］；及びＨｓｉａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４２：２２１〜２２７［１９９９］参照）。
宿主細胞での成熟プロテアーゼ（例えば、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体）の生産レベルを判定するために、様々な方法を使用することができる。このような方法としては、限定するものではないが、例えば、プロテアーゼに特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを利用する方法が挙げられる。例示的な方法としては、限定するものではないが、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、及び蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。これらのアッセイ及びその他のアッセイは当該技術分野において周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］参照）。
一部の他の実施形態では、本発明は、本発明の成熟型のプロテアーゼ変異体を製造又は生産する方法を提供する。成熟型のプロテアーゼ変異体は、シグナルペプチド配列又はプロペプチド配列を含有しない。この方法の一部のものは、例えば、バチルス種細胞（例えば、バチルス・サブチルス）などの、組み換え細菌宿主細胞において、本発明の変異型プロテアーゼを製造又は生産することを含む。一部の実施形態では、本発明は、本発明の変異型プロテアーゼの生産方法を提供し、方法は、本発明の変異型プロテアーゼをコードする核酸を含む組み換え発現ベクターを含む組み換え宿主細胞を、変異型プロテアーゼの生産を誘導する条件下で培養することを含む。このような方法の一部のものは、更に、培養物から変異型プロテアーゼを回収することを含む。
一部の実施形態では、本発明は、本発明の変異型プロテアーゼの生産方法を提供し、方法は：（ａ）本発明の変異型プロテアーゼをコードする核酸を含む組み換えプロテアーゼ発現ベクターを細胞集団（例えば、Ｂ．サブチルス細胞などの細菌細胞）に導入すること；及び（ｂ）発現ベクターによりコードされている変異型プロテアーゼの生産を誘導する条件下で、培養培地中で細胞を培養する工程、を包含する。このような方法のうち一部のものは、（ｃ）細胞又は培養培地から変異型プロテアーゼを単離する工程、を更に含む。
布地ケア及びホームケア製品
一部の実施形態では、本発明のプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体は、助剤とプロテアーゼ変異体とを含む組成物に使用することができ、ここで、組成物は布地ケア及びホームケア製品である。
一部の実施形態では、布地ケア及びホームケア製品組成物は、少なくとも１つのサブチリシン変異体を含み、このサブチリシン変異体はタンパク質分解活性を有する成熟型であって、リスト１〜１９から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、サブチリシン変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
本発明は、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを更に提供し、ここでサブチリシン変異体はバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼのプロテアーゼ変異体であり、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、布地ケア及びホームケア製品組成物は、少なくとも１つのバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼのサブチリシン変異体を含み、このバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼは配列番号２に示すアミノ酸配列を示し、このＧＧ３６プロテアーゼはタンパク質分解活性を有する成熟型であって、リスト１〜１９から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、プロテアーゼ変異体のアミノ酸位置は、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
一部の実施形態では、布地ケア及びホームケア製品組成物は、上記の単離されたサブチリシン変異体のいずれかを更に含んでもよく、その際変異体の総正味電荷は、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、−１、−２、−３、−４、又は−５である。一部の実施形態では、総正味電荷は、次から選択される１箇所以上の置換によって得られ：
Figure 2014522235
このプロテアーゼ変異体のアミノ酸位置は、配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
一部の実施形態では、布地ケア製品及びホームケア製品組成物のサブチリシン変異体は、市販の親サブチリシン（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／ＳのＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＩＮＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、又はＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｃｏｒ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌのＭＡＸＡＣＡＬ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）及びＰＵＲＡＦＥＣＴ ＯＸＰ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＰＲＩＭＥ、又はＰＵＲＡＭＡＸ（登録商標））、並びにＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａから利用可能な、いわゆるＢＬＡＰ（次の変異Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを有する、米国特許第５，３５２，６０４号の図２９に示される配列、本明細書において以降ＢＬＡＰと呼ぶ）及びＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）から誘導される。
一部の実施形態では、布地ケア製品及びホームケア製品組成物は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、このプロテアーゼ変異体の親プロテアーゼはタンパク質分解活性を有し、この変異型プロテアーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは５０個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下、１０個以下、９個以下又は８個以下のアミノ酸残基により異なるアミノ酸配列からなり、プロテアーゼ変異体のアミノ酸配列を配列番号１で示されるバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列と整列させることで決定される、バチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮの対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる。
クリーニング組成物及び／又は処理組成物
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物を含む消費者製品、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１つのプロテアーゼ変異体、特にサブチリシン変異体と少なくとも１つの助剤とを含む。一部の実施形態では、これらの助剤は、例えば、クリーニングされる基材を処理する際のクリーニング性能を補助又は強化させるために、あるいは香料、着色剤、又は染料などの場合にはクリーニング組成物の美観を改善するために組み込まれる。これらの助剤が本発明の変異型プロテアーゼに添加されることは理解されたい。このような追加的成分の正確な性質及びその添加濃度は、組成物の物理的形態、及び組成物が使用される洗浄操作の性質によって決まる。クリーニング及び／又は処理助剤は、これらに限定するものではないが、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、漂白活性剤、漂白触媒、その他の酵素、酵素安定系、キレート剤、汚れ放出ポリマー、染料移行剤、分散剤、抑泡剤、染料、香料、着色剤、充填剤塩、ヒドロトロープ、光活性化剤、蛍光剤、布地コンディショナー、布地柔軟剤、加水分解性界面活性剤、防腐剤、酸化防止剤、縮み防止剤、しわ防止剤、殺菌剤、殺真菌剤、カラースペックル、シルバーケア、黄ばみ防止及び／又は腐食防止剤、アルカリ源、可溶化剤、キャリア、加工助剤、顔料、及びｐＨ調節剤、並びに香料、色相剤、界面活性剤、ビルダー、キレート剤、移染防止剤、分散剤、追加酵素、酵素安定剤、触媒材料、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予形成過酸、分散剤ポリマー、泥汚れ除去／再付着防止剤、増白剤、抑泡剤、染料、香料、構造弾性化剤、布地柔軟剤、ヒドロトロープ、溶媒及びこれらの混合物を含むカプセル剤を包含するリストから１つ以上選択されてもよい（例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，６０５，４５８号、同第５，７０５，４６４号、同第５，７１０，１１５号、同第５，６９８，５０４号、同第５，６９５，６７９号、同第５，６８６，０１４号、及び同第５，６４６，１０１号参照）。クリーニング組成物材料の具体例は以下に詳細に例示する。クリーニング及び／又は処理助剤が、クリーニング組成物中の本発明の変異型プロテアーゼと適合しない実施形態では、２つの成分を組み合わせることが適切になるまでの間、クリーニング助剤及びプロテアーゼを分離した（すなわち、互いに接触させない）ままにしておくという好ましい方法が使用される。このような分離手法には、当該技術分野において既知の任意の好適な方法が包含される（例えば、ゲルキャップ法、カプセル封入、錠剤、物理的分離など）。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、サブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）；トリプシン様又はキモトリプシン様プロテアーゼ；メタロプロテアーゼ；及びこれらの混合物から選択される、少なくとも１種の追加の免疫当量でないプロテアーゼを更に含む。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、Ｂ．サブチリス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．プミラス（B. pumilus）及びＢ．ギブソニィ（B. gibsonii）由来のサブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）；セルロモナス（Cellulomonas）由来のトリプシンプロテアーゼ及び／又はキモトリプシンプロテアーゼ；バチルス・アミロリケファシエンス由来のメタロプロテアーゼ；及びこれらの混合物から選択される、少なくとも１種の追加の免疫当量でないプロテアーゼを更に含む。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、リケナーゼ、グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、アミラーゼ、及びこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の追加酵素を更に含む。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、第１洗浄リパーゼ；α−アミラーゼ；細菌性洗浄セルラーゼ；及びこれらの混合物から選択される少なくとも１種の追加酵素を更に含む。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、次のうちの少なくとも１つを更に含む：香料マイクロカプセルを含む香料を含むカプセル剤；塩基性染料、酸性染料、疎水性染料、直接染料及び高分子染料から選択される物質を含む色相剤、及び吸収波長のピークが５５０ｎｍ〜６５０ｎｍの染料複合体及びこれらの混合物；アニオン性の洗浄性界面活性剤、非イオン性の洗浄性界面活性剤、カチオン性の洗浄性界面活性剤、双極イオン性の洗浄性界面活性剤及び両性の洗浄性界面活性剤、及びこれらの混合物から選択される物質を含む洗浄性界面活性剤；ゼオライト、リン酸塩、及びこれらの混合物から選択される物質を含むビルダー；ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム及びこれらの混合物から選択される物質を含むケイ酸塩；冷水溶解性増白剤及びこれらの混合物から選択される物質を含む増白剤；マレエート／アクリレートランダムコポリマー又はポリアクリレートホモポリマー及びこれらの混合物から選択される物質を含むカルボキシレートポリマー；テレフタレートコポリマー及びこれらの混合物から選択される物質を含む汚れ放出ポリマー；アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロース及びこれらの混合物から選択される物質を含むセルロース系ポリマー；漂白触媒であって、イミニウムカチオン、イミニウムポリイオン；双極性イミニウムイオン；修飾アミン；修飾アミンオキシド；Ｎ−スルホニルイミン；Ｎ−ホスホニルイミン；Ｎ−アシルイミン；チアジアゾールジオキシド；ペルフルオロイミン；環状糖ケトン及びこれらの混合物から選択される物質を含むもの；ドデカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、デカノイルオキシオキシ安息香酸又はこれらの塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホン酸塩、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）、ノナノイルオキシベンゼンスルホン酸塩（ＮＯＢＳ）及びこれらの混合物から選択される物質を含む漂白活性化剤；無機過水和物塩、例えば、過ホウ酸ナトリウム塩（通常、一水和物又は四水和物）などのアルカリ金属塩、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩、及びこれらの混合物から選択される材料を含む過酸化水素源；ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンジホスホン酸）、ＤＴＰＭＰ（ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸））、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）、１，２−ジヒドロキシベンゼン−３，５−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物から選択される材料を含むキレート剤、上記キレート剤の誘導体；及びこれらの混合物。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、染料；少なくとも１種のカチオン性−塩基性染料及びスメクタイト粘土を含む染料−粘土共役体；及びこれらの混合物からなる群から選択される布地色相剤を含む。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、小分子染料及び高分子染料並びにこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の布地色相剤を任意追加的にスメクタイト粘土と共に含む。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、単区画又は多区画単位用量で提供される。一部の実施形態では、組成物は多区画単位用量であり、プロテアーゼ変異体は任意の過酸化水素供給源及び／又はキレート剤及び／又は追加の酵素の区画とは異なる区画の中に存在する。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含み、以下の成分のうち１つ以上（組成物の総重量を基準にして）：約０．０００５重量％〜約０．１重量％、約０．００１重量％〜約０．０５重量％、又は更には約０．００２重量％〜約０．０３重量％の上記プロテアーゼ変異体；と、以下のうち１つ以上とを含む：約０．００００３重量％〜約０．１重量％の布地色相剤；約０．００１重量％〜約５重量％の香料カプセル；約０．００１重量％〜約１重量％の冷水可溶性増白剤；約０．００００３重量％〜約０．１重量％の漂白触媒；約０．００００３重量％〜約０．１重量％の一次洗浄リパーゼ（first wash lipases）；約０．００００３重量％〜約０．１重量％の微生物由来のクリーニング用セルラーゼ；及び／又は約０．０５重量％〜約２０重量％のゲルベ型非イオン性界面活性剤。
一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、液体洗濯洗剤、食器洗浄洗剤である。
クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、流体又は固体を包含する任意の好適な形態で提供されることを意図する。クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、特に液体の形態の場合に、単位用量パウチの形態であってもよく、典型的には、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、少なくとも部分的に、又は更には完全に、水溶性パウチに封入されている。更に、少なくとも１種のプロテアーゼ変異体を含むクリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品の一部の実施形態では、クリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品は、上記に詳述されたパラメータ及び／又は特徴のいずれの組み合わせを有してもよい。特記のない限り、本明細書で提供されるすべての成分又は組成物のレベルは、その成分又は組成物の活性レベルを基準にしており、市販供給源に存在する可能性のある不純物、例えば残留溶媒又は副生成物を含まない。酵素成分の重量は活性タンパク質の合計に基づくものである。比率（％）及び比はすべて、特に断らない限りは重量で計算している。比率（％）及び比はすべて、特に断らない限りは全組成物を基準として計算している。例示された洗剤組成物において、酵素濃度は、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ特に記載のない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表現される。
本発明のクリーニング組成物は、例えば、洗濯用途、硬質表面クリーニング用途、食器洗浄用途、並びに義歯、歯、毛髪、及び皮膚などの化粧用途に好都合に採用される。加えて、低温の溶液中で作用が増大するという独特の利点を有することから、本発明の酵素は洗濯用途に理想的なものである。更に本発明の酵素は、顆粒及び液体組成物での使用が見出される。
本発明の変異型プロテアーゼは、クリーニング添加物製品にも使用される。一部の実施形態では、低温溶液を用いるクリーニング用途での使用が見出される。一部の実施形態では、本発明は、本発明の酵素を少なくとも１種含むクリーニング添加剤製品を提供し、添加剤製品は、更に漂白効果が所望される場合に、洗浄過程で包含させるのに理想的なものである。このような場合の例としては、限定するものではないが、例えば、低温溶液を用いるクリーニング用途が挙げられる。一部の実施形態では、添加剤製品は最も単純な形態であり、すなわち１種以上のプロテアーゼである。一部の実施形態では、添加剤は、クリーニング過程で添加するために、単位用量形態でパッケージングされている。一部の実施形態では、添加剤には過酸素源が採用され、漂白効果の増加が所望され、かつクリーニング過程で添加するために単位用量形態でパッケージングされている。本発明は、限定するものではないが、例えば、丸剤、錠剤、ゲルキャップ、又は予め計量された粉末若しくは液体などの他の一回用量単位が挙げられる、任意の好適な一回用量単位形態での使用が見出される。一部の実施形態では、このような組成物を増量するために充填剤又はキャリア材料が用いられる。好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、様々な硫酸塩、炭酸塩及びケイ酸塩並びにタルク、及び粘土などが挙げられる。液体組成物に好適な充填剤又はキャリア材料としては、限定するものではないが、例えば、水、又はポリオール及びジオールなどの低分子量の一級及び二級アルコールが挙げられる。このようなアルコールの例としては、限定するものではないが、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は、このような材料を約５％〜約９０％含有する。酸性充填剤はｐＨを減少させるための使用が見出される。あるいは、一部の実施形態では、以下により詳細に記載されるような補助成分がクリーニング添加剤として挙げられる。
本発明のクリーニング組成物及びクリーニング添加剤は、有効量の本明細書で提供される少なくとも１種のプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体を、単独で、あるいは他のプロテアーゼ及び／又は追加酵素と組み合わせて必要とする。必要とされる酵素濃度は、１種以上のプロテアーゼ変異体、より具体的には本発明のサブチリシン変異体を加えることにより達成される。典型的には、本発明のクリーニング組成物は、少なくとも約０．０００１重量％、約０．０００１〜約１０重量％、約０．００１〜約１重量％、又は更には約０．０１〜約０．１重量％の、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む。
本明細書のクリーニング組成物は、典型的には、水性クリーニング操作で使用した場合に、洗浄水のｐＨを約５．０〜約１１．５又は更には約７．５〜約１０．５にするように配合される。液体製品組成物は、典型的には、約３．０〜約９．０又は更には約３〜約５の正味ｐＨを有するよう配合される。顆粒状洗濯製品は、典型的にはｐＨが約９〜約１１になるよう配合される。推奨される使用レベルにｐＨを調節する技術としては、緩衝剤、アルカリ、酸などの使用が挙げられ、これらは当業者には周知のものである。
好適な「低ｐＨのクリーニング組成物」は、典型的には、未希釈ｐＨが約３〜約５のものであり、典型的には、このようなｐＨ環境で加水分解される界面活性剤を含まない。このような界面活性剤としては、エチレンオキシド部分を少なくとも１つ又は更にはエチレンオキシド部分を約１〜約１６モル含むアルキル硫酸ナトリウム界面活性剤が挙げられる。このようなクリーニング組成物は、典型的には、未希釈のクリーニング組成物のｐＨを約３〜約５にするのに十分な量のｐＨ調整剤、例えば、水酸化ナトリウム、モノエタノールアミン、又は塩酸などを含む。このような組成物は、典型的には、酸に安定な酵素を少なくとも１種含む。一部の実施形態では、組成物は液体である一方、他の実施形態では固体である。このような液体組成物のｐＨは、典型的には未希釈時のｐＨとして測定される。このような固形組成物のｐＨは、上記組成物の固形分１０％の溶液として測定され、ここで、その溶媒は蒸留水である。これらの実施形態では、別途記載のない限り、ｐＨの測定はすべて２０℃で行われた。
一部の実施形態では、変異型プロテアーゼが顆粒状組成物又は液体組成物に採用された場合、保存時に変異型プロテアーゼを他の粒状組成物の成分から保護するために、変異型プロテアーゼはカプセル封入された粒子の形態であることが望ましい。加えて、カプセル封入は、クリーニング過程で変異型プロテアーゼの利用能を制御する手段でもある。一部の実施形態ではカプセル封入は、変異型プロテアーゼ及び／又は追加の酵素の性能を上昇させる。この観点から、本発明の変異型プロテアーゼは、当該技術分野において既知の任意の好適な封入材によりカプセル封入される。一部の実施形態では、封入材は、典型的には、本発明の変異型プロテアーゼに関する触媒の少なくとも一部を封入する。一般的には、封入材は、水溶性及び／又は水分散性である。一部の実施形態では、封入材のガラス転移温度（Ｔｇ）は０℃以上である。ガラス転移温度は、国際公開第９７／１１１５１号により詳細に記載される。封入材は、一般的には、炭水化物、天然又は合成ゴム、キチン、キトサン、セルロース及びセルロース誘導体、ケイ酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、パラフィンワックス、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。封入材が炭水化物である場合、典型的には、単糖、オリゴ糖、多糖、及びこれらの組み合わせから選択される。一部の典型的な実施形態では、封入材はデンプンである（例えば、欧州特許第０ ９２２ ４９９号；米国特許第４，９７７，２５２号、同第５，３５４，５５９号、及び同第５，９３５，８２６号を参照されたい）。一部の実施形態では、封入材は、熱可塑性プラスチック、アクリロニトリル、メタクリロニトリル、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリロニトリル及びこれらの混合物から製造されるプラスチック製のマイクロスフェア、並びに限定するものではないが、使用が見出される、ＥＸＰＡＮＣＥＬ（登録商標）（Ｓｔｏｃｋｖｉｋｓｖｅｒｋｅｎ，Ｓｗｅｄｅｎ）により供給されるもの、並びにＰＭ ６５４５、ＰＭ ６５５０、ＰＭ ７２２０、ＰＭ ７２２８、ＥＸＴＥＮＤＯＳＰＨＥＲＥＳ（登録商標）、ＬＵＸＳＩＬ（登録商標）、Ｑ−ＣＥＬ（登録商標）、及びＳＰＨＥＲＩＣＥＬ（登録商標）（ＰＱ Ｃｏｒｐ．，Ｖａｌｌｅｙ Ｆｏｒｇｅ，ＰＡ）などの市販のマイクロスフェアである。
本明細書に記載のように、本発明の変異型プロテアーゼは、限定するものではないが、洗濯用洗剤及び食器用洗剤などのクリーニング産業において具体的用途が見出される。これらの用途では、様々な環境ストレス下に酵素を配置する。本発明の変異型プロテアーゼは、様々な条件下で安定であることから、現在使用されている多数の酵素よりも有利である。
実際に、洗剤の配合が変更され、洗浄水の容量が変更され、洗浄水の温度が変更され、及び洗浄時間の長さが変更される各種洗浄条件が存在し、洗浄に関与するプロテアーゼがこれらの条件に晒される。加えて、異なる地理的条件下で使用される洗剤配合物では、洗浄水中に、関連する成分が異なる濃度で存在する。例えば、欧州の洗剤は一般的には４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有する一方、日本の洗剤は一般的には６６７ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水に有する。北米、特に合衆国では、一般的には約９７５ｐｐｍの洗剤成分を洗浄水中に有する。
低濃度洗剤系には、約８００ｐｐｍ未満の洗剤成分が洗浄水に存在する洗剤が包含される。洗浄水中におよそ６６７ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、日本の洗剤は、一般に洗剤濃度の低い系としてみなされる。
中間濃度の洗剤には、約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤成分が洗浄水中に存在する洗剤が包含される。洗浄水中におよそ９７５ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、北米の洗剤は、一般に中間濃度の洗剤系であるとみなされる。ブラジルでは、一般的に洗浄水中におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。
高濃度洗剤系には、約２０００ｐｐｍ超の洗剤成分が洗浄水中に存在しているものが包含される。洗浄水中におよそ４５００〜５０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、欧州の洗剤は、一般に高濃度の洗剤系であるとみなされる。
南米の洗剤は、概して高起泡性のリン酸ビルダー洗剤であり、洗浄水中におよそ１５００〜６０００ｐｐｍの洗剤成分が存在していることから、南米で使用されている洗剤の範囲は、中間濃度及び高濃度洗剤の両方に包含される。上記されるように、ブラジルでは、洗浄水中に一般的におよそ１５００ｐｐｍの洗剤成分が存在する。しかしながら、高起泡性のリン酸ビルダー洗剤が使用されている他の地域では、例えば、限定するものではないが、他の南米の国々では、洗浄水中に、洗剤成分が最大で約６０００ｐｐｍ存在している高濃度洗剤系が使用されている場合がある。
前述の内容を考慮すると洗剤組成物の濃度は、典型的には、世界中の洗浄溶液で、約８００ｐｐｍ未満の洗剤組成物（「洗剤濃度が低い地域」）、例えば、日本の約６６７ｐｐｍのものから、中間では約８００ｐｐｍ〜約２０００ｐｐｍの洗剤組成物（「洗剤濃度が中程度の地域」）、例えば、米国の約９７５ｐｐｍ及びブラジルの約１５００ｐｐｍのもの、そして約２０００ｐｐｍ超の洗剤組成物（「洗剤濃度が高い地域」）、例えば、欧州の約４５００ｐｐｍ〜約５０００ｐｐｍのもの、及び高起泡性リン酸ビルダーの地域では約６０００ｐｐｍのものへと幅広く変化することが明白である。
一般的な洗浄溶液の濃度は経験的に判断される。例えば、米国では、一般的な洗濯機の洗浄液容量は約６４．４Ｌである。したがって、洗剤濃度が約９７５ｐｐｍの洗浄溶液を得るためには、６４．４Ｌの洗浄溶液に約６２．７９ｇの洗剤組成物を添加しなくてはならない。この量は、消費者により、洗浄水に洗剤用の軽量カップを用い量り入れられる典型的な量である。
更なる例として、異なる地域では異なる洗浄温度が使用される。日本で使用されている洗浄水の温度は、一般的に、欧州で使用されているものよりも低い。例えば、北米及び日本の洗浄水の温度は、典型的には約１０〜約３０℃（例えば、約２０℃）である一方、欧州の洗浄水の温度は、典型的には約３０〜約６０℃（例えば、約４０℃）である。しかしながら、エネルギーの節約の観点から、多くの消費者は冷水を用いる洗浄法に切り替えている。加えて、一部の更なる地域では、一般的に洗濯並びに食器洗浄用途には冷水が使用されている。一部の実施形態では、本発明の「冷水洗浄」は、約１０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃、又は約１５℃〜約２５℃、並びに約１５℃〜約３５℃の範囲内のすべてのその他の組み合わせ、並びに１０℃〜４０℃のすべての範囲の洗浄温度に好適な「冷水用洗剤」を用いる。
更なる例では、異なる地理条件下では、一般に異なる硬度の水が用いられている。水の硬度は、通常、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計のグレイン毎ガロン単位で記述される。硬度は、水に含まれるカルシウム（Ｃａ２＋）及びマグネシウム（Ｍｇ２＋）の尺度である。米国ではほとんどの水は硬水であるが、硬水の程度は異なる。中硬水（６０〜１２０ｐｐｍ）〜硬水（１２１〜１８１ｐｐｍ）は、６０〜１８１ｐｐｍ（百万分率をＵＳガロンあたりのグレインに変換したものは、ｐｐｍ数を１７．１当量のグレイン毎ガロンで除算したものに相当する）の無機物を含有する。
Figure 2014522235
欧州の水の硬度は、典型的にはＣａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．１８ｇ／Ｌ超（１０．５超（例えば０．１８〜約０．３４ｇ／Ｌ（約１０．５〜約２０．０）グレイン毎ガロン）である（例えば、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が０．２６ｇ／Ｌ（１５グレイン毎ガロン））。北米の水硬度は、一般的には日本の水硬度よりも高いものの、欧州の水硬度未満である。例えば、北米の水の硬度は約０．０５〜約０．１７ｇ／Ｌ、約０．０５〜約０．１４ｇ／Ｌ又は約０．１０ｇ／Ｌ（約３〜約１０グレイン、約３〜約８グレイン又は約６グレイン）であり得る。日本の水の硬度は、一般的に北米の水の硬度よりも低く、通常はＣａ２＋／Ｍｇ２＋の合計が約０．０７ｇ／Ｌ（４ｇｐｇ）未満、例えば約０．０５ｇ／Ｌ（３グレイン毎ガロン）である。
したがって、一部の実施形態では、本発明は少なくとも１組の洗浄条件（例えば、水温、水の硬度、及び／又は洗剤濃度）において驚くべき洗浄性能を示す変異型プロテアーゼを提供する。一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼの洗浄性能は、他のサブチリシンプロテアーゼの洗浄性能に匹敵する。一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼは、市販されている現行のサブチリシンプロテアーゼの洗浄性能を上回る洗浄性能を呈する。したがって、本発明の一部の実施形態では、本明細書に提供される変異型プロテアーゼは、酸化安定性、熱安定性、様々な条件下でのクリーニング性能、及び／又はキレート化安定性が改善されている。加えて、本発明の変異型プロテアーゼは、洗剤を単独で含まず、あるいは洗剤をビルダー及び安定剤との組み合わせとしても含まないクリーニング組成物での使用が見出されている。
本発明の一部の実施形態では、クリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の少なくとも１種の本発明の変異型プロテアーゼと、クリーニング助剤を含む残部（例えば、組成物の約９９．９９９重量％〜約９０．０重量％）とを含む。本発明の一部の他の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度の変異型プロテアーゼを少なくとも１種と、クリーニング助剤を含むクリーニング組成物の残部（例えば、約９９．９９９９重量％〜約９０．０重量％、約９９．９９９重量％〜約９８重量％、約９９．９９５重量％〜約９９．５重量％）とを含む。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、クリーニング性能及び／又は布地ケア及び／又は食器洗浄利益を提供する追加の洗剤用酵素を１種以上含む。好適な酵素の例としては、限定するものではないが、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの任意の組み合わせ又はこれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、及び／又はアミラーゼと共に使用されるセルラーゼなど、一般的に適用可能な酵素を含む酵素混合物（すなわち、「カクテル」）が使用される。
本明細書で提供されるプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体に加えて、任意の他の好適なプロテアーゼが本発明の組成物に使用される。適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。一部の実施形態では、微生物由来のプロテアーゼが使用される。一部の実施形態では、化学修飾された又は遺伝子操作された変異体が包含される。一部の実施形態では、プロテアーゼはセリンプロテアーゼであり、好ましくはアルカリ性微生物由来のプロテアーゼ又はトリプシン様プロテアーゼである。アルカリ性プロテアーゼの例としては、サブチリシン、特にバチルス由来のサブチリシンが挙げられる（例えば、サブチリシン、Ｂ．レンタスのサブチリシン、Ｂ．アミロリケファシエンスのサブチリシン、サブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇ、サブチリシン３０９、サブチリシン１４７、及びサブチリシン１６８）。更なる例としては、米国再発行特許第３４，６０６号、同第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号に記載される変異型プロテアーゼが挙げられる。これらの各々は参照により本案件に組み込まれる。追加のプロテアーゼとしては、例えば、限定するものではないが、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ由来）、及び国際公開第８９／０６２７０号に記載のフサリウムプロテアーゼが挙げられる。一部の実施形態では、本発明に使用できる市販のプロテアーゼ酵素としては、限定するものではないが、ＭＡＸＡＴＡＳＥ（登録商標）、ＭＡＸＡＣＡＬ（商標）、ＭＡＸＡＰＥＭ（商標）、ＯＰＴＩＣＬＥＡＮ（登録商標）、ＯＰＴＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＯＰＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）、ＰＵＲＡＦＥＣＴ（登録商標）ＯＸＰ、ＰＵＲＡＭＡＸ（商標）、ＥＸＣＥＬＬＡＳＥ（商標）、及びＰＵＲＡＦＡＳＴ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＡＬＣＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（登録商標）、ＰＲＩＭＡＳＥ（登録商標）、ＤＵＲＡＺＹＭ（商標）、ＰＯＬＡＲＺＹＭＥ（登録商標）、ＯＶＯＺＹＭＥ（登録商標）、ＫＡＮＮＡＳＥ（登録商標）、ＬＩＱＵＡＮＡＳＥ（登録商標）、ＮＥＵＴＲＡＳＥ（登録商標）、ＲＥＬＡＳＥ（登録商標）及びＥＳＰＥＲＡＳＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；ＢＬＡＰ（商標）及びＢＬＡＰ（商標）変異体（Ｈｅｎｋｅｌ Ｋｏｍｍａｎｄｉｔｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ａｕｆ Ａｋｔｉｅｎ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、並びにＫＡＰ（Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）サブチリシン；花王株式会社、日本国東京）が挙げられる。種々のプロテアーゼが、国際公開第９５／２３２２１号、国際公開第９２／２１７６０号、米国特許第２００８／００９０７４７号、及び米国特許第５，８０１，０３９号、同第５，３４０，７３５号、同第５，５００，３６４号、同第５，８５５，６２５号、米国再発行特許第３４，６０６号、米国特許第５，９５５，３４０号、同第５，７００，６７６号、同第６，３１２，９３６号、及び同第６，４８２，６２８号、並びに他の多様な特許に記載されている。一部の更なる実施形態では、本発明への使用が見出されるメタロプロテアーゼは、限定するものではないが、国際公開第０７／０４４９９３号に記載の中性のメタロプロテアーゼである。
加えて、任意の好適なリパーゼが本発明への使用を見出される。好適なリパーゼとしては、限定するものではないが、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。化学修飾された又は遺伝子操作された変異体は本発明に包含される。有用なリパーゼの例としては、ヒュミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginosa）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２５８ ０６８号、及び同第３０５ ２１６号参照）、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２３８ ０２３号参照）、カンジダ（Candida）のリパーゼ、例えば、Ｃ．アンタルクチカ（C. antarctica）のリパーゼ（例えば、Ｃ．アンタルクチカ（C. antarctica）のリパーゼＡ又はＢ；例えば、欧州特許第２１４ ７６１号参照）、シュードモナス（Pseudomonas）のリパーゼ、例えば、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）のリパーゼ及びＰ．シュードアルカリゲネス（P. pseudoalcaligenes）のリパーゼ（例えば、欧州特許第２１８ ２７２号参照）、Ｐ．セパシア（P. cepacia）のリパーゼ（例えば、欧州特許第３３１ ３７６号参照）、Ｐ．スタッツェリ（P. stutzeri）のリパーゼ（例えば、英国特許第１，３７２，０３４号参照）、Ｐ．フルオレッセンス（P. fluorescens）のリパーゼ、バチルス（Bacillus）のリパーゼ（例えば、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）のリパーゼ［Ｄａｒｔｏｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１３１：２５３〜２６０［１９９３］）；Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のリパーゼ［例えば、日本国特許第６４／７４４９９２号参照］；及びＢ．プミラス（B. pumilus）のリパーゼ［例えば、国際公開第９１／１６４２２号参照］）が挙げられる。
加えて、様々なクローン化リパーゼを本発明の一部の実施形態に使用することも見出されており、こうしたリパーゼとしては、限定するものではないが、例えば、ペニシリウム・カメンベルチ（Penicillium camembertii）のリパーゼ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０３：６１〜６７［１９９１］参照）、ジオトリカム・カンディダム（Geotricum candidum）のリパーゼ（Ｓｃｈｉｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０６：３８３〜３８８［１９８９］参照）、及び様々なクモノスカビのリパーゼ、例えば、Ｒ．デレマー（R. delemar）のリパーゼ（Ｈａｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０９：１１７〜１１３［１９９１］参照）、Ｒ．ニベウス（R. niveus）のリパーゼ（Ｋｕｇｉｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：７１６〜７１９［１９９２］参照）、及びＲ．オリザエ（R. oryzae）のリパーゼなどが挙げられる。
クチナーゼなどの他の種類の脂肪分解酵素も本発明の一部の実施形態での使用が見出されており、限定するものではないが、例えば、シュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）由来のクチナーゼ（国際公開第８８／０９３６７号を参照されたい）、及びフザリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼ（国際公開第９０／０９４４６号を参照されたい）が挙げられる。
その他の好適なリパーゼとしては、Ｍ１ ＬＩＰＡＳＥ（商標）、ＬＵＭＡ ＦＡＳＴ（商標）、及びＬＩＰＯＭＡＸ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）；ＬＩＰＥＸ（登録商標）、ＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）及びＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）ＵＬＴＲＡ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）；及びＬＩＰＡＳＥ Ｐ（商標）「アマノ」（天野エンザイム，日本）などの市販のリパーゼが挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の追加のリパーゼ、並びに組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤を更に含む。本発明の一部の他の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のリパーゼも含む。
本発明の一部の実施形態では、任意の好適なアミラーゼは、本発明への使用が見出される。一部の実施形態では、アルカリ性溶液に使用するのに好適である任意のアミラーゼ（例えば、α及び／又はβ）も使用が見出される。好適なアミラーゼとしては、限定するものではないが、微生物由来のもの又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学修飾された又は遺伝子操作された変異体が包含される。本発明への使用が見出されるアミラーゼとしては、限定するものではないが、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）から得られるα−アミラーゼが挙げられる（例えば、英国特許第１，２９６，８３９号を参照されたい）。本発明への使用が見出される市販のアミラーゼとしては、限定するものではないが、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、及びＢＡＮ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、並びにＰＯＷＥＲＡＳＥ（商標）、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）及びＭＡＸＡＭＹＬ（登録商標）Ｐ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）が挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、更に組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度のアミラーゼ並びに組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤を更に含む。同様に、本発明の一部の他の実施例では、本発明のクリーニング組成物は組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のアミラーゼを含む。
一部の更なる実施形態では、任意の好適なセルラーゼが、本発明のクリーニング組成物での使用を見出される。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学修飾された又は遺伝子操作された変異体が包含される。好適なセルラーゼとしては、限定するものではないが、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）のセルラーゼ（例えば、米国特許第４，４３５，３０７号を参照されたい）。特に好適なセルラーゼは、色ケア効果を有するセルラーゼである（例えば、欧州特許第０ ４９５ ２５７号を参照されたい）。本発明への使用が見出される市販のセルラーゼとしては、限定するものではないが、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）、ＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、及びＫＡＣ−５００（Ｂ）（商標）（花王株式会社）が挙げられる。一部の実施形態では、セルラーゼは、野生型又は変異型成熟セルラーゼの一部又は断片として組み込まれ、変異型ではＮ末端の一部が欠損している（例えば、米国特許第５，８７４，２７６号を参照されたい）。本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の追加のセルラーゼ、並びに組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤を更に含む。本発明の一部の他の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のセルラーゼも含む。
洗剤組成物で使用するのに好適な任意のマンナナーゼも同様に本発明において使用が見出される。好適なマンナナーゼとしては、限定するものではないが、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学修飾された又は遺伝子操作された変異体が包含される。様々なマンナナーゼが本発明で使用を見出されることが既知である（例えば、米国特許第６，５６６，１１４号、同第６，６０２，８４２号、及び同第６，４４０，９９１号を参照されたい、これらの各々は参照により本案件に組み込まれる）。本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の追加のマンナナーゼ、並びに組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤を更に含む。本発明の一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度のマンナナーゼも含む。
一部の実施形態では、ペルオキシダーゼは過酸化水素又は過酸化酸素供給源（例えば、過炭酸塩、過ホウ酸塩又は過硫酸塩）と組み合わせて本発明の組成物に使用される。一部の代替的な実施形態では、オキシダーゼは酸素と組み合わせて使用される。これらの種類の酵素は両方とも「溶液を漂白」する（すなわち、布地を一緒に洗浄溶液で洗浄する場合に、布地の染料が、その染料で染色されている布から他の布へと色移りするのを予防する）ために、好ましくは増感剤と共に使用される（例えば、国際公開第９４／１２６２１号及び国際公開第９５／０１４２６号を参照されたい）。好適なペルオキシダーゼ／オキシダーゼとしては、限定するものではないが、植物、微生物又は真菌由来のものが挙げられる。一部の実施例では、化学修飾された又は遺伝子操作された変異体が包含される。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．００００１重量％〜約１０重量％の濃度の追加のペルオキシダーゼ、並びに組成物の重量に基づき残部のクリーニング助剤を更に含む。本発明の一部の他の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．００１重量％〜約５重量％、約０．００１重量％〜約２重量％、約０．００５重量％〜約０．５重量％の濃度でペルオキシダーゼ及び／又はオキシダーゼ酵素を含む。
一部の実施形態では、使用が見出される追加の酵素としては、限定するものではないがペルヒドロラーゼが挙げられる（例えば、国際公開第０５／０５６７８２号を参照されたい）。加えて、一部の実施形態では、上述の酵素、特に、１種以上の追加のプロテアーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、及び／又は少なくとも１種のセルラーゼなどの酵素の混合物が、本発明に包含される。実際に、これらの酵素の多様な混合物が本発明への使用を見出され得ることは想到される。変異型プロテアーゼ及び１種以上の追加の酵素の濃度は、いずれも独立して約１０％までの範囲で変化し、クリーニング組成物の残部はクリーニング助剤からなることも想到される。具体的なクリーニング助剤の選別は、処理される表面、物品、又は布地、並びに使用時（例えば、洗浄洗剤を用いる）のクリーニング条件に所望される組成物の形態を考慮することで容易になされる。
一部の実施形態では、本明細書で提供される有効な量の１種以上の変異型プロテアーゼは、タンパク質性の染みを除去する必要のある各種表面をクリーニングするのに有用な組成物中に含まれる。このようなクリーニング組成物としては、硬質表面、布地、及び皿などのクリーニング用途向けのクリーニング組成物が挙げられる。実際に、一部の実施形態では、本発明は布地クリーニング組成物を提供するが、他の実施形態では、本発明は非布地用クリーニング組成物を提供する。特に、本発明は、口腔ケア組成物（歯磨き剤、歯磨き粉、マウスウォッシュなど、並びに義歯洗浄用組成物を包含する）、皮膚クリーニング組成物及び毛髪クリーニング組成物などのパーソナルケアに好適なクリーニング組成物も提供する。本発明は、任意の形態（すなわち、液体、顆粒状、棒状、半固形、ゲル、乳濁液、錠剤、カプセル剤など）の洗剤組成物を包含することを意図する。
例として、本発明の変異型プロテアーゼの使用が見出される数種類のクリーニング組成物が以下により詳細に記載される。本発明のクリーニング組成物が、洗濯機を用いる洗浄用途に使用するのに好適な組成物として配合される一部の実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、少なくとも１種のビルダー化合物と、並びに好ましくは、有機高分子化合物、漂白剤、追加の酵素、抑泡剤、分散剤、石鹸カス分散剤、汚れ懸濁剤及び再付着防止剤、及び腐食防止剤から選択される１種以上のクリーニング助剤と、を含有する。一部の実施形態では、洗濯用組成物は柔軟剤も含有する（すなわち、追加のクリーニング助剤として）。本発明の組成物は、固形又は液体形態の洗剤助剤として使用することも見出される。このような洗濯助剤製品は、従来の洗剤組成物の性能を補う及び／又は強化することが意図されるものであり、クリーニングプロセスの任意の工程で添加できる。組成物を２０℃で測定した場合に、一部の実施形態では洗濯洗剤組成物の密度は約４００〜約１２００ｇ／リットルであり、一方で他の実施形態では約５００〜約９５０ｇ／リットルの範囲である。
食器手洗い用途に使用する組成物として配合される実施形態では、本発明の組成物は、好ましくは少なくとも１種の界面活性剤と、好ましくは有機高分子化合物、起泡剤、第２族金属イオン、溶媒、ヒドロトロープ、及び追加の酵素から選択される少なくとも１種の追加のクリーニング助剤と、を含有する。
一部の実施形態では、米国特許第６，６０５，４５８号に提供されるものなどの様々なクリーニング組成物を本発明の変異型プロテアーゼと併用することが見出される。したがって、一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含有する組成物は、コンパクトな顆粒状布地クリーニング組成物である一方、他の実施形態では、組成物は着色された布地を洗濯するのに有用な顆粒型布地洗浄組成物であり、他の実施形態では、組成物は洗浄性能により柔軟効果を提供する顆粒型布地クリーニング組成物であり、更なる実施形態では、組成物は強力液体布地クリーニング組成物である。一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの布地クリーニング組成物である。加えて、本発明の変異型プロテアーゼは、欧州又は日本の洗浄条件下で特に有用な顆粒型洗濯洗剤組成物での使用が見出される（例えば、米国特許第６，６１０，６４２号を参照されたい）。
一部の代替的な実施形態では、本発明は、本明細書で提供される変異型プロテアーゼを少なくとも１種含有する硬質表面クリーニング組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、同第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの硬質表面クリーニング組成物である。
更に他の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む食器洗浄用組成物を提供する。したがって、一部の実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，６１０，６４２号、及び同第６，３７６，４５０号に記載されるものなどの硬質表面クリーニング組成物である。更に他の一部の実施形態では、本発明は、本明細書で提供される変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む食器洗浄用組成物を提供する。一部の更なる実施形態では、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含む組成物は、米国特許第６，３７６，４５０号及び同第６，３７６，４５０号に記載のものなどの口腔ケア組成物を含む。上記の米国特許第６，３７６，４５０号、同第６，６０５，４５８号、同第６，６０５，４５８号、及び同第６，６１０，６４２号に包含される、化合物及びクリーニング助剤の配合及び記載を、本明細書で提供される変異型プロテアーゼと併用することが見出される。
本発明のクリーニング組成物は、任意の好適な形態に配合され、好ましくは配合者により選択される、例えば、限定するものではないが米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、及び同第５，４８６，３０３号に記載のものなどの任意のプロセスにより調製される。これらの各々は参照により本案件に組み込まれる。低ｐＨのクリーニング組成物が所望される場合、組成物のｐＨは、モノエタノールアミン又は酸性材料（例えば、ＨＣｌ）などの追加の材料により調整される。
本明細書で開示されるクリーニング組成物は、部位のクリーニングでの使用が見出される（例えば、表面、物品、食器類又は布地）。典型的には、このような部位の少なくとも一部を、未希釈形態又は洗浄溶液に希釈された状態の、本発明のクリーニング組成物と接触させ、そしてその後、任意選択で、その部位を洗浄及び／又はすすぎ洗いしてもよい。本発明の目的に関し、「洗浄」には擦ること及び機械的撹拌が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、典型的には約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度の溶液として採用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃であり、部位が布地を含む場合、水と布地との質量比は典型的には、約１：１〜約３０：１である。
好適なクリーニング及び／又は処理助剤に関する更なる詳細を以下に示す。
布地色相剤
チオフェンアゾ染料に加えて、追加の布地シェーディング染料を組み込むことは好ましくないが、組成物は１つ以上の追加の布地色相剤を含んでもよい。好適な布地色相剤としては、染料、染料−粘土共役体、及び顔料が挙げられる。好適な染料としては、ポリエステル及び／又はナイロンのような合成織物への付着と比較して、綿織物により多く付着するものが挙げられる。更なる好適な染料としては、綿と比較してポリエステル及び／又はナイロンのような合成繊維により多く付着するものが挙げられる。適切な染料としては、小分子染料及びポリマー染料が挙げられる。適切な小分子染料としては、色指数分類（Colour Index（Ｃ．Ｉ．））において、ダイレクト・ブルー、ダイレクト・レッド、ダイレクト・バイオレット、アシッド・ブルー、アシッド・レッド、アシッド・バイオレット、ベーシック・ブルー、ベーシック・バイオレット及びベーシック・レッド、又はそれらの混合物に適合する染料からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。小分子染料の例としては、色指数（イギリス、ブラッドフォードの英国染料染色学会（Society of Dyers and Colourists））番号でダイレクトバイオレット９，ダイレクトバイオレット３５、ダイレクトバイオレット４８、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトバイオレット６６、ダイレクトバイオレット９９、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１、ダイレクトブルー８０、ダイレクトブルー２７９、アシッドレッド１７、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドバイオレット１５、アシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット２４、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドバイオレット４９、アシッドバイオレット５０、アシッドブルー１５、アシッドブルー１７、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４０、アシッドブルー４５、アシッドブルー７５、アシッドブルー８０、アシッドブルー８３、アシッドブルー９０及びアシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ベーシックバイオレット１、ベーシックバイオレット３、ベーシックバイオレット４、ベーシックバイオレット１０、ベーシックバイオレット３５、ベーシックブルー３、ベーシックブルー１６、ベーシックブルー２２、ベーシックブルー４７、ベーシックブルー６６、ベーシックブルー７５、ベーシックブルー１５９からなる群から選択されるもの、色指数（イギリス、ブラッドフォードの英国染料染色学会（Society of Dyers and Colourists））番号でアシッドバイオレット１７、アシッドバイオレット４３、アシッドレッド５２、アシッドレッド７３、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２５、アシッドブルー２９、アシッドブルー４５、アシッドブルー１１３、アシッドブラック１、ダイレクトブルー１、ダイレクトブルー７１からなる群から選択される小分子染料が挙げられる。ダイレクトバイオレット小分子染料が好ましい場合もある。アシッドバイオレット１７、ダイレクトブルー７１、ダイレクトバイオレット５１、ダイレクトブルー１、アシッドレッド８８、アシッドレッド１５０、アシッドブルー２９、アシッドブルー１１３及びこれらの混合物から選択される染料が好ましい場合もある。
好適なポリマー染料としては、共有結合した色原体を含有するポリマー（染料ポリマー共役体）及び色原体がポリマーの主鎖に共重合されたポリマー並びにこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料、及びＬｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ（Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ））の名前で販売される布地染色性着色剤（fabric-substantive colorants）、少なくとも１つの反応染料と、ヒドロキシル部分、一級アミン部分、二級アミン部分、チオール部分、及びこれらの混合物からなる群から選択される部分を含むポリマーからなる群から選択されるポリマーと、から形成される染料ポリマー共役体、からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。更に別の態様では、適切なポリマー染料としては、Ｌｉｑｕｉｔｉｎｔ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｋｅｎ，Ｓｐａｒｔａｎｂｕｒｇ，Ｓｏｕｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ，ＵＳＡ）バイオレットＣＴ、及びリアクティブブルー、リアクティブバイオレット、又はリアクティブレッド染料で共役されているカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（例えば、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）からＡＺＯ−ＣＭ−ＣＥＬＬＵＬＯＳＥという商標名（製品コードＳ−ＡＣＭＣ）で市販されているＣ．Ｉ．リアクティブブルー１９で共役されているＣＭＣなど）、アルコキシル化トリフェニルメタンポリマー着色料、アルコキシル化チオフェンポリマー着色料、及びこれらの混合物からなる群から選択されるポリマー染料が挙げられる。好ましい追加の色調染料として、国際公開第０８／８７４９７ Ａ１号に含まれる増白剤が挙げられる。これらの増白剤は以下の構造（Ｉ）によって特徴付けることができる：
Figure 2014522235
 式中、Ｒ１及びＲ２は次から独立して選択できる：
ａ）［（ＣＨ２ＣＲ’ＨＯ）ｘ（ＣＨ２ＣＲ”ＨＯ）ｙＨ］、式中、Ｒ’はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びこれらの混合物からなる群から選択され、Ｒ”はＨ、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びこれらの混合物からなる群から選択され、ｘ＋ｙ≦５であり、ｙ≧１であり、ｚ＝０〜５である。
ｂ）Ｒ１＝アルキル、アリール又はアリールアルキル、かつＲ２＝［（ＣＨ２ＣＲ’ＨＯ）ｘ（ＣＨ２ＣＲ”ＨＯ）ｙＨ］
式中、Ｒ’はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びそれらの混合物からなる群から選択され、Ｒ”はＨ、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びそれらの混合物からなる群から選択され、ｘ＋ｙ≦１０であり、ｙ≧１であり、ｚ＝０〜５である。
ｃ）Ｒ１＝［ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ３）ＣＨ２ＯＲ４］及びＲ２＝［ＣＨ２ＣＨ（ＯＲ３）ＣＨ２ＯＲ４］
式中、Ｒ３はＨ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びこれらの混合物からなる群から選択され、ｚ＝０〜１０であり、
Ｒ４は（Ｃ１〜Ｃ１６）アルキル、アリール基、及びこれらの混合物からなる群から選択される。
ｄ）Ｒ１及びＲ２は、スチレンオキシド、グリシジルメチルエーテル、イソブチルグリシジルエーテル、イソプロピルグリシジルエーテル、ｔ−ブチルグリシジルエーテル、２−エチルヘキシルグリシジルエーテル及びグリシジルヘキサデシルエーテルの、アミノ付加生成物に１〜１０個のアルキレンオキシド単位を付加したものから独立して選択することができる。
本発明の組成物に組み込んでもよい好ましい追加的な布地色相剤は、以下の構造（ＩＩ）を特徴とする：
Figure 2014522235
 式中、Ｒ’はＨ、ＣＨ３、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びこれらの混合物からなる群から選択され、Ｒ”はＨ、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＨ、及びこれらの混合物からなる群から選択され、ｘ＋ｙ≦５であり、ｙ≧１であり、ｚ＝０〜５である。
更なる好ましい追加的な色調染料は、以下の構造（ＩＩＩ）を特徴とする：
Figure 2014522235
この染料は典型的には、１分子につき平均３〜１０個のＥＯ基、好ましくは５個のＥＯ基を有する化合物の混合物である。
更なる追加のシェーディング染料は、米国特許出願公開第２００８ ３４５１１ Ａ１号（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）に記載されている染料である。好ましい剤は、「ソルベントバイオレット１３」である。
適切な染料粘土共役体には、少なくとも１つのカチオン性／塩基性染料とスメクタイト粘土を含む群から選択される染料粘土共役体、及びこれらの混合物が挙げられる。別の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下のＣ．Ｉ．からなる群から選択される１つのカチオン性／塩基性染料からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる。ベーシックイエロー１〜１０８、Ｃ．Ｉ．ベーシックオレンジ１〜６９、Ｃ．Ｉ．ベーシックレッド１〜１１８、Ｃ．Ｉ．ベーシックバイオレット１〜５１、Ｃ．Ｉ．ベーシックブルー１〜１６４、Ｃ．Ｉ．ベーシックグリーン１〜１４、Ｃ．Ｉ．ベーシックブラウン１〜２３、ＣＩベーシックブラック１〜１１、及びモンモリロナイト粘土、ヘクトライト粘土、サポナイト粘土、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される粘土。更に別の態様では、好適な染料粘土共役体としては、以下からなる群から選択される染料粘土共役体が挙げられる：モンモリロナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、モンモリロナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、モンモリロナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、モンモリロナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、モンモリロナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、モンモリロナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、ヘクトライトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、ヘクトライトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、ヘクトライトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、ヘクトライトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、ヘクトライトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体、サポナイトベーシックブルーＢ７ Ｃ．Ｉ．４２５９５共役体、サポナイトベーシックブルーＢ９ Ｃ．Ｉ．５２０１５共役体、サポナイトベーシックバイオレットＶ３ Ｃ．Ｉ．４２５５５共役体、サポナイトベーシックグリーンＧ１ Ｃ．Ｉ．４２０４０共役体、サポナイトベーシックレッドＲ１ Ｃ．Ｉ．４５１６０共役体、サポナイトＣ．Ｉ．ベーシックブラック２共役体及びこれらの混合物。
好適な顔料としては、フラバントロン（flavanthrone）、インダントロン、１〜４個の塩素原子を有する塩素化インダントロン、ピラントロン（pyranthrone）、ジクロロピラントロン（dichloropyranthrone）、モノブロモジクロロピラントロン（monobromodichloropyranthrone）、ジブロモジクロロピラントロン（dibromodichloropyranthrone）、テトラブロモピラントロン（tetrabromopyranthrone）、ペリレン−３，４，９，１０−テトラカルボン酸ジイミド（イミド基はＣ１〜Ｃ３−アルキル又はフェニル又は複素環ラジカルで置換されていなくても置換されていてもよく、フェニル及び複素環ラジカルは更に水溶性を付与しない置換を有していてもよい）、アントラピリミジンカルボン酸アミド、ビオラントロン（violanthrone）、イソビオラントロン（isoviolanthrone）、ジオキサジン染料、銅フタロシアニン（１分子当たり２個以下の塩素原子を含有していてもよい）、ポリクロロ−銅フタロシアニン、又はポリブロモクロロ−銅フタロシアニン（１分子当たり１４個以下の臭素原子を含有する）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。特に好ましいのは、ピグメントブルー１５〜２０、とりわけピグメントブルー１５及び／又は１６である。好適な顔料には、ウルトラマリンブルー（Ｃ．Ｉ．ピグメントブルー２９）、ウルトラマリンバイオレット（Ｃ．Ｉ．ピグメントバイオレット１５）、及びこれらの混合物からなる群から選択される顔料が挙げられる。好適な色調剤については、詳しくは米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
カプセル剤。組成物は、カプセル剤を含み得る。一態様では、カプセル剤は、コア、内面及び外面を有するシェルを含み、上記シェルは、上記コアを封入する。コアはいかなる洗濯物ケア助剤を含んでもよく、典型的にはコアは香料、増白剤、染料、防虫剤、シリコーン、ワックス、香味料、ビタミン、布地用柔軟剤、スキンケア剤（一態様ではパラフィン）、酵素、抗菌剤、漂白剤、感覚剤、及びこれらの混合物なる群から選択される材料を含んでもよく、シェルはポリエチレン、ポリアミド、ポリビニルアルコール（任意にその他のコモノマーを含有する）、ポリスチレン、ポリイソプレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリアクリレート、アミノ樹脂（一態様では、アミノ樹脂は、ポリウレア、ポリウレタン、及び／又はポリウレアウレエタンを含んでもよく、一態様では、ポリウレアはポリオキシメチレンウレア及び／又はメラミンホルムアルデヒドを含んでもよい）、ポリオレフィン、多糖（一態様では、多糖はアルギネート及び／又はキトサンを含んでもよい）、ゼラチン、セラック、エポキシ樹脂、ビニルポリマー、水溶性無機物、シリコーン、及びこれらの混合物からなる群から選択される材料を含んでもよい。好ましいカプセル剤は香料を含む。好ましいカプセル剤は、メラミンホルムアルデヒド及び／又は架橋メラミンホルムアルデヒドを含んでもよいシェルを含む。コア材料とシェルとを含み、シェルがコア材料を少なくとも部分的に取り囲む、好適なカプセル剤が開示される。上記カプセル剤の少なくとも７５％、８５％又は更には９０％は、０．２ＭＰａ〜１０ＭＰａの破壊強度、及び最初の全封入有益剤を基準にして、０％〜２０％、又は更には１０％若しくは５％未満の有益剤漏出率を有してもよい。好ましくは、上記カプセル剤の少なくとも７５％、８５％又は更には９０％が（ｉ）１ミクロン〜８０ミクロン、５ミクロン〜６０ミクロン、１０ミクロン〜５０ミクロン、又は更には１５ミクロン〜４０ミクロンの粒径を有してもよく、及び／又は（ｉｉ）上記カプセル剤の少なくとも７５％、８５％又は更には９０％が３０ｎｍ〜２５０ｎｍ、８０ｎｍ〜１８０ｎｍ、又は更には１００ｎｍ〜１６０ｎｍの粒子壁厚を有してもよい。ホルムアルデヒドスカベンジャーをカプセル剤と共に（例えばカプセルスラリーに）使用してもよく、及び／又は、その添加はこのような組成物にカプセル剤を加える前、最中、又は後に行われてもよい。好適なカプセル剤は、米国特許第２００８／０３０５９８２（Ａ１）号、及び／又は同第２００９／０２４７４４９（Ａ１）号の教示に従うことにより、製造することができる。あるいは、好適なカプセル剤は、Ａｐｐｌｅｔｏｎ Ｐａｐｅｒｓ Ｉｎｃ．（Ａｐｐｌｅｔｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ ＵＳＡ）から購入することもできる。
好ましい態様において、組成物は付着助剤を、好ましくはカプセル剤に追加して、含んでもよい。好ましい付着助剤は、カチオン性ポリマー及び非イオン性ポリマーからなる群から選択される。好適なポリマーとしては、カチオン性デンプン、カチオン性ヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルホルムアルデヒド、イナゴマメゴム、マンナン、キシログルカン、タマリンドガム、ポリエチレンテレフタレート並びにジメチルアミノエチルメタクリレート樹脂を任意にアクリル酸及びアクリルアミドを含む群から選択される１つ以上のモノマーと共に含有するポリマーが挙げられる。
香料。好ましい本発明の組成物は、香料を含む。典型的には、組成物は、国際公開第０８／８７４９７号に記載されているような群から選択される１つ以上の香料原料を含む香料を含む。しかし、洗濯物ケア組成物に有用ないかなる香料も使用してもよい。香料を本発明の組成物に組み込む好ましい方法は、水溶性のヒドロキシル化合物若しくはメラミン−ホルムアルデヒド又は変性ポリビニルアルコールのいずれかを含む封入された香料粒子による方法である。一態様において、カプセル剤は、（ａ）１つ以上の水溶性ヒドロキシル化合物、好ましくはデンプンを含む少なくとも部分的に水溶性の固体マトリックスと、（ｂ）この固体マトリックスに封入された香油と、を含む。更なる態様では、香料は、シッフ塩基を形成するように、ポリアミン、好ましくはポリエチレンイミンと予め複合されてもよい。
ポリマー。本組成物は１つ以上のポリマーを含んでもよい。例には、任意に変性されたカルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニル−ピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−Ｎ−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリアクリル酸塩等のポリカルボン酸塩、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、及びメタクリル酸ラウリル／アクリル酸コポリマーがある。
組成物は、次の一般構造を有する化合物、又はその硫酸化若しくはスルホン化変異体のような１つ以上の両親媒性クリーニングポリマーを含んでもよい：ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ）（ＣＨ３）−Ｎ＋−ＣｘＨ２ｘ−Ｎ＋−（ＣＨ３）−ビス（（Ｃ２Ｈ５Ｏ）（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｎ））（式中、ｎは２０〜３０であり、ｘは３〜８である）。一態様では、このポリマーは硫酸化又はスルホン化されて、双極性イオン固体懸濁ポリマーを提供する。
本組成物は好ましくは、布地及び表面からグリース粒子を除去するように親水性と疎水性の特性が釣り合っている両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーを含む。好ましい両親媒性アルコキシル化グリース洗浄ポリマーは、コア構造とそのコア構造に結合した複数のアルコキシレート基とを含む。上記ポリマーは、アルコキシル化ポリアルキレンイミン、好ましくは内側のポリエチレンオキシドブロック及び外側のポリプロピレンオキシドブロックを有するものを含んでもよい。典型的には上記ポリマーは本発明の組成物に０．００５〜１０重量％、一般的には０．５〜８重量％の量で組み込まれてもよい。
ポリアクリル酸塩から調製されるものなどの、アルコキシル化ポリカルボン酸塩は、追加的なグリース除去性能を提供するために本明細書で有用である。このような材料はＷＯ ９１／０８２８１号及びＰＣＴ ９０／０１８１５号に記載されている。化学的に、これらの材料は、７〜８のアクリレート単位ごとに１つのエトキシ側鎖を有するポリアクリレートを含む。側鎖は、式−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ（ＣＨ２）ｎＣＨ３のものであり、ここで、ｍは、２〜３であり、ｎは、６〜１２である。側鎖はポリアクリレート「主鎖」にエステル結合され、「櫛形」ポリマータイプの構造を提供する。分子量は通常は約２０００〜約５０，０００の範囲内で変動し得る。このようなアルコキシル化ポリカルボン酸塩は、本明細書に記載の組成物の約０．０５重量％〜約１０重量％を構成し得る。
界面活性剤及びその他の補助成分の混合物は、両親媒性グラフトコポリマーとの使用に特に適している。好ましい両親媒性グラフトコポリマーは、（ｉ）ポリエチレングリコール主鎖、及び（ｉｉ）ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物から選択される少なくとも１つのペンダント部分を含む。好ましい両親媒性グラフトコポリマーは、ＢＡＳＦから供給されるＳｏｋａｌａｎ ＨＰ２２である。好適なポリマーとしては、ランダムグラフトコポリマー、好ましくはポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーが挙げられる。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は好ましくは約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。典型的には上記ポリマーは本発明の組成物に０．００５〜１０重量％、より一般的には０．０５〜８重量％の量で組み込まれる。好ましくは、本組成物は、マレエート／アクリレートランダムコポリマー又はポリアクリレートホモポリマーのような１つ以上のカルボキシレートポリマーを含む一態様では、カルボキシレートポリマーは、４，０００Ｄａ〜９，０００Ｄａ、又は６，０００Ｄａ〜９，０００Ｄａの分子量を有するポリアクリレートホモポリマーである。典型的には上記ポリマーは本発明の組成物に０．００５〜１０重量％、又は０．０５〜８重量％の量で組み込まれる。
好ましくは、本組成物は１つ以上の汚れ放出ポリマーを含む。例としては、次の式（ＩＶ）、（Ｖ）又は（ＶＩ）の１つによって定義される構造を有する汚れ放出ポリマーが挙げられる：
（ＩＶ） −［（ＯＣＨＲ１−ＣＨＲ２）ａ−Ｏ−ＯＣ−Ａｒ−ＣＯ−］ｄ
（Ｖ） −［（ＯＣＨＲ３−ＣＨＲ４）ｂ−Ｏ−ＯＣ−ｓＡｒ−ＣＯ−］ｅ
（ＶＩ） −［（ＯＣＨＲ５−ＣＨＲ６）ｃ−ＯＲ７］ｆ
式中、
ａ、ｂ、及びｃは、１〜２００であり、
ｄ、ｅ、及びｆは、１〜５０であり、
Ａｒは、１，４−置換フェニレンであり、
ｓＡｒは、位置５をＳＯ３Ｍｅにより置換された、１，３−置換フェニレンであり、
Ｍｅは、Ｌｉ、Ｋ、Ｍｇ／２、Ｃａ／２、Ａｌ／３、アンモニウム、モノ−、ジ−、トリ−、若しくはテトラアルキルアンモニウム（アルキル基は、Ｃ１〜Ｃ１８アルキル又はＣ２〜Ｃ１０ヒドロキシアルキル）、又はこれらの混合物であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、独立して、Ｈ、又はＣ１〜Ｃ１８ ｎ−若しくはイソ−アルキルから選択され；
Ｒ７は、直鎖若しくは分枝鎖Ｃ１〜Ｃ１８アルキル、又は直鎖若しくは分枝鎖Ｃ２〜Ｃ３０アルケニル、又は炭素原子を５〜９個有するシクロアルキル基、又はＣ８〜Ｃ３０アリール基、又はＣ６〜Ｃ３０アリールアルキル基である。
好適な汚れ放出ポリマーは、Ｒｈｏｄｉａにより供給されているＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘ ＳＦ、ＳＦ−２及びＳＲＰ６が挙げられるＲｅｐｅｌ−ｏ−ｔｅｘポリマーなどのポリエステル汚れ放出ポリマーである。他の好適な汚れ放出ポリマーとしては、Ｃｌａｒｉａｎｔにより供給されているＴｅｘｃａｒｅ ＳＲＡ１００、ＳＲＡ３００、ＳＲＮ１００、ＳＲＮ１７０、ＳＲＮ２４０、ＳＲＮ３００及びＳＲＮ３２５などのＴｅｘｃａｒｅポリマーが挙げられる。他の好適な汚れ放出ポリマーは、Ｓａｓｏｌにより供給されているＭａｒｌｏｑｕｅｓｔ ＳＬなどのＭａｒｌｏｑｕｅｓｔポリマーである。
好ましくは、組成物は、アルキルセルロース、アルキルアルコキシアルキルセルロース、カルボキシアルキルセルロース、アルキルカルボキシアルキルセルロースから選択されるものなどの１つ以上のセルロースポリマーを含む。好ましいセルロース系ポリマーは、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、メチルカルボキシメチルセルロース及びこれらの混合物を含む群から選択される。一態様では、カルボキシメチルセルロースは、０．５〜０．９のカルボキシメチル置換度と、１００，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａの分子量とを有する。
酵素。好ましくは、組成物は１つ以上の酵素を含む。好ましい酵素は、クリーニング性能及び／又は布地ケア効果を提供する。好適な酵素の例としては、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、ペクテートリアーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ及びアミラーゼ、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。典型的な組み合わせは、例えば、プロテアーゼ及びリパーゼをアミラーゼとともに含んでよい酵素反応混液である。上述の追加酵素は、本組成物に存在する場合、組成物の約０．００００１重量％〜約２重量％、約０．０００１重量％〜約１重量％、又は更には約０．００１重量％〜約０．５重量％の酵素タンパク質の濃度で存在してよい。
プロテアーゼ。好ましくは、本組成物は１つ以上のプロテアーゼを含む。好適なプロテアーゼとしては、メタロプロテアーゼ及びセリンプロテアーゼが挙げられ、後者にはサブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）などの、中性又はアルカリ性微生物セリンプロテアーゼが挙げられる。適当なプロテアーゼとしては、動物、植物又は微生物由来のものが挙げられる。一態様では、そのような好適なプロテアーゼは、微生物起源のものとすることができる。好適なプロテアーゼとしては、前述の好適なプロテアーゼの化学修飾又は遺伝子組み換えの突然変異体が挙げられる。一態様では、好適なプロテアーゼは、アルカリ性微生物プロテアーゼ又は／及びトリプシン型プロテアーゼなどのセリンプロテアーゼであり得る。好適な中性又はアルカリ性プロテアーゼの例としては、以下のものが挙げられる：
（ａ）サブチリシン（ＥＣ ３．４．２１．６２）（バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．サブチリス（B. subtilis）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）及びバチルス・ギブソニィ（Bacillus gibsonii）などのバチルスから誘導されたものを含む）（米国特許第６，３１２，９３６（Ｂ１）号、同第５，６７９，６３０号、同第４，７６０，０２５号、同第７，２６２，０４２号及び国際公開第０９／０２１８６７号に記載）。
（ｂ）トリプシン（例えばブタ又はウシ由来）などのトリプシン型又はキモトリプシン型プロテアーゼ（国際公開第８９／０６２７０号に記述されているフサリウムプロテアーゼ、及び同第０５／０５２１６１号及び同第０５／０５２１４６号に記述されているＣｅｌｌｕｍｏｎａｓに由来するキモトリプシンプロテアーゼを含む）。
（ｃ）メタロプロテアーゼ（国際公開第０７／０４４９９３（Ａ２）号に記述されているバチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）から誘導されたものを含む）。
好ましいプロテアーゼとしては、バチルス・ギブソニィ（Bacillus gibsonii）又はバチルス・レンタス（Bacillus Lentus）から誘導されるものが挙げられる。
好適な市販のプロテアーゼ酵素としては：Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｄｅｎｍａｒｋ）より、Ａｌｃａｌａｓｅ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｒｉｍａｓｅ（登録商標）、Ｄｕｒａｚｙｍ（登録商標）、Ｐｏｌａｒｚｙｍｅ（登録商標）、Ｋａｎｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ（登録商標）、Ｌｉｑｕａｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｓａｖｉｎａｓｅ Ｕｌｔｒａ（登録商標）、Ｏｖｏｚｙｍｅ（登録商標）、Ｎｅｕｔｒａｓｅ（登録商標）、Ｅｖｅｒｌａｓｅ（登録商標）及びＥｓｐｅｒａｓｅ（登録商標）の商標名で販売されているもの、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌより、Ｍａｘａｔａｓｅ（登録商標）、Ｍａｘａｃａｌ（登録商標）、Ｍａｘａｐｅｍ（登録商標）、Ｐｒｏｐｅｒａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｐｒｉｍｅ（登録商標）、Ｐｕｒａｆｅｃｔ Ｏｘ（登録商標）、ＦＮ３（登録商標）、ＦＮ４（登録商標）、Ｅｘｃｅｌｌａｓｅ（登録商標）及びＰｕｒａｆｅｃｔ ＯＸＰ（登録商標）の商標名で販売されているもの、Ｓｏｌｖａｙ Ｅｎｚｙｍｅｓより、Ｏｐｔｉｃｌｅａｎ（登録商標）及びＯｐｔｉｍａｓｅ（登録商標）の商標名で販売されているもの、Ｈｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａより入手可能なもの、すなわちＢＬＡＰ（以下の変異Ｓ９９Ｄ＋Ｓ１０１Ｒ＋Ｓ１０３Ａ＋Ｖ１０４Ｉ＋Ｇ１５９Ｓを有する、米国特許第５，３５２，６０４号の図２９で示される配列、以降ＢＬＡＰと呼ぶ）、ＢＬＡＰ Ｒ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）、ＢＬＡＰ Ｘ（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ｖ２０５Ｉを有するＢＬＡＰ）及びＢＬＡＰ Ｆ４９（Ｓ３Ｔ＋Ｖ４Ｉ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｖ１９９Ｍ＋Ｖ２０５Ｉ＋Ｌ２１７Ｄを有するＢＬＡＰ）（以上、全てＨｅｎｋｅｌ／Ｋｅｍｉｒａ）、並びに花王のＫＡＰ（変異Ａ２３０Ｖ＋Ｓ２５６Ｇ＋Ｓ２５９Ｎを有するバチルス・アルカロフィルス（Bacillus alkalophilus）のサブチリシン）が挙げられる。
アミラーゼ。好ましくは、本組成物はアミラーゼを含んでもよい。好適なアルファ−アミラーゼとしては、細菌又は真菌由来のものが挙げられる。化学的又は遺伝子学的に改変された変異型（変異体）が含まれる。好ましいアルカリ性α−アミラーゼはバチルスの菌種から、例えば、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・ズブチルス、又は他のバチラス種、例えばバチルス種ＮＣＩＢ １２２８９、ＮＣＩＢ １２５１２、ＮＣＩＢ １２５１３、ＤＳＭ ９３７５（米国特許第７，１５３，８１８号）、ＤＳＭ １２３６８、ＤＳＭＺ ｎｏ．１２６４９、ＫＳＭ ＡＰ１３７８（国際公開第９７／００３２４号）、ＫＳＭ Ｋ３６又はＫＳＭ Ｋ３８（欧州特許第１，０２２，３３４号）に由来する。好ましいアミラーゼには次のものが挙げられる。
（ａ）国際公開第９４／０２５９７号、同第９４／１８３１４号、同第９６／２３８７４号、及び同第９７／４３４２４号に記載の変異体、特に、国際公開第９６／２３８７４号の配列番号２としてリストされた酵素に対して、以下の位置：１５、２３、１０５、１０６、１２４、１２８、１３３、１５４、１５６、１８１、１８８、１９０、１９７、２０２、２０８、２０９、２４３、２６４、３０４、３０５、３９１、４０８及び４４４のうちの１つ以上が置換された変異体。
（ｂ）米国特許第５，８５６，１６４号及び国際公開第９９／２３２１１号、同第９６／２３８７３号、同第００／６００６０号、及び同第０６／００２６４３号に記載の変異型、特に国際公開第０６／００２６４３号で配列番号１２として記載のＡＡ５６０酵素に対して、以下の位置：２６、３０、３３、８２、３７、１０６、１１８、１２８、１３３、１４９、１５０、１６０、１７８、１８２、１８６、１９３、２０３、２１４、２３１、２５６、２５７、２５８、２６９、２７０、２７２、２８３、２９５、２９６、２９８、２９９、３０３、３０４、３０５、３１１、３１４、３１５、３１８、３１９、３３９、３４５、３６１、３７８、３８３、４１９、４２１、４３７、４４１、４４４、４４５、４４６、４４７、４５０、４６１、４７１、４８２、４８４のうちの１つ以上が置換された変異体であって、好ましくはＤ１８３＊及びＧ１８４＊の欠損を含有する変異体。
（ｃ）国際公開第０６／００２６４３号での配列番号４（バチルスＳＰ７２２からの野生型酵素）と少なくとも９０％の同一性を呈し、特に位置１８３及び１８４で欠損を有する変異体、並びに本明細書に参照により組み込まれる国際公開第００／６００６０号に記載の変異体。
（ｄ）バチルス種７０７（米国特許第６，０９３，５６２号の配列番号７）からの野生型酵素と少なくとも９５％の同一性を呈する変異体、特に以下の変異Ｍ２０２、Ｍ２０８、Ｓ２５５、Ｒ１７２及び／又はＭ２６１を１つ以上含むもの。好ましくはこのアミラーゼは、Ｍ２０２Ｌ、Ｍ２０２Ｖ、Ｍ２０２Ｓ、Ｍ２０２Ｔ、Ｍ２０２Ｉ、Ｍ２０２Ｑ、Ｍ２０２Ｗ、Ｓ２５５Ｎ及び／又はＲ１７２Ｑのうちの１つ以上を含む。特に好ましくは、Ｍ２０２Ｌ又はＭ２０２Ｔ突然変異を含むものである。
（ｅ）国際公開第０９／１４９１３０号に記載されている変異体、好ましくは国際公開第０９／１４９１３０号での配列番号１又は配列番号２、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Geobacillus Stearophermophilus）からの野生型酵素又はその切断型と少なくとも９０％の同一性を呈するもの。
好適な市販のα−アミラーゼとしては、ＤＵＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＬＩＱＵＥＺＹＭＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ ＵＬＴＲＡ（登録商標）、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＵＰＲＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）、ＦＵＮＧＡＭＹＬ（登録商標）及びＢＡＮ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））、ＫＥＭＺＹＭ（登録商標）ＡＴ ９０００（Ｂｉｏｚｙｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｔｒａｄｉｎｇ ＧｍｂＨ（Ｗｅｈｌｉｓｔｒａｓｓｅ ２７ｂ Ａ−１２００ Ｗｉｅｎ Ａｕｓｔｒｉａ））、ＲＡＰＩＤＡＳＥ（登録商標）、ＰＵＲＡＳＴＡＲ（登録商標）、ＥＮＺＹＳＩＺＥ（登録商標）、ＯＰＴＩＳＩＺＥ ＨＴ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＰＯＷＥＲＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＳＴＡＲ ＯＸＡＭ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））、並びに、ＫＡＭ（登録商標）（花王株式会社（日本、１０３−８２１０、東京都中央区日本橋茅場町１丁目１４−１０））が挙げられる。一態様では、好適なアミラーゼとしては、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ（登録商標）及びＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、並びにこれらの混合物が挙げられる。
リパーゼ。好ましくは、本発明は米国特許第６，９３９，７０２ Ｂ１号及び米国特許出願公開第２００９／０２１７４６４号に記載されるもののような、「第１サイクルリパーゼ」を包含する、１つ以上のリパーゼを含む。好ましいリパーゼは第１洗浄リパーゼである。本発明の１つの実施形態では、組成物は第１洗浄リパーゼを含む。第１洗浄リパーゼは、以下のアミノ酸配列を有するポリペプチドであるリパーゼを包含する：（ａ）フミコーラ・ラヌギノーサ（Humicola lanuginosa）株ＤＳＭ ４１０９由来の野生型リパーゼに対して少なくとも９０％の同一性を有する；（ｂ）上記野生型リパーゼと比較して、Ｅ１又はＱ２４９の１５Ａ内の三次元構造の表面において電気的に中性又は負に帯電したアミノ酸の置換を含む；（ｃ）Ｃ末端でのペプチド付加を含む、（ｄ）Ｎ末端でのペプチド付加を含む、及び／又は（ｅ）以下の制限に適合する：ｉ）上記野生型リパーゼの位置Ｅ２１０に負のアミノ酸を含む；ｉｉ）上記野生型の位置９０〜１０１に対応する領域に負に帯電したアミノ酸を含む；ｉｉｉ）Ｎ９４又は上記野生型リパーゼに対応する位置に中性又は負のアミノ酸を含む及び／又は上記野生型の位置９０〜１０１に対応する領域に負又は中性の正味電荷を有する。Ｔ２３１Ｒ及びＮ２３３Ｒ変異の１つ以上を含む、子嚢菌（Thermomyces lanuginosus）由来の野生型リパーゼの変異体が好ましい。野生型配列は、Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔの受け入れ番号Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｏ５９９５２の、（子嚢菌（好温性糸状菌（Humicola lanuginosa））由来の）２６９個のアミノ酸（アミノ酸２３〜２９１）である。好ましいリパーゼは、商標名Ｌｉｐｅｘ（登録商標）、Ｌｉｐｏｌｅｘ（登録商標）及びＬｉｐｏｃｌｅａｎ（登録商標）で販売されているリパーゼを包含するであろう。
エンドグルカナーゼ。他の好ましい酵素としては、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）を呈する微生物由来のエンドグルカナーゼ、例えば米国特許第７，１４１，４０３Ｂ２号の配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９４％、９７％及び更には９９％同一の配列を有するバチルス属細菌に内因性の細菌ポリペプチド、及びこれらの混合物が挙げられる。好適なエンドグルカナーゼは、商標名Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）及びＷｈｉｔｅｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））で販売されている。
ペクテートリアーゼ。他の好ましい酵素には、商標名Ｐｅｃｔａｗａｓｈ（登録商標）、Ｐｅｃｔａｗａｙ（登録商標）、Ｘｐｅｃｔ（登録商標）で販売されているペクチン酸リアーゼ、及び商標名Ｍａｎｎａｗａｙ（登録商標）（以上すべてＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））、及びＰｕｒａｂｒｉｔｅ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））で販売されているマンナナーゼが含まれる。
漂白剤。１つ以上の漂白剤を含むことが組成物に好ましい場合がある。漂白触媒以外の適切な漂白剤としては、光漂白剤、漂白活性化剤、過酸化水素、過酸化水素源、予備形成過酸、及びこれらの混合物が挙げられる。一般的に、漂白剤が使用される場合、本発明の組成物は、標記洗浄組成物の約０．１重量％〜約５０重量％、又は更には約０．１重量％〜約２５重量％の漂白剤又は漂白剤の混合物を含んでもよい。適切な漂白剤の例としては、以下のものが挙げられる。
（１）光漂白剤、例えば、スルホン化亜鉛フタロシアニン、スルホン化アルミニウムフタロシアニン、キサンテン染料、及びこれらの混合物。
（２）予備形成過酸：好適な予備形成過酸としては、予備形成過酸又はその塩、典型的にはペルオキシカルボン酸及び塩、過炭酸及び塩、ペルイミド酸及び塩、ペルオキシ一硫酸及び塩（例えば、Ｏｘｏｎｅ（登録商標））、並びにこれらの混合物からなる群から選択される化合物が挙げられるが、これらに限定されない。好適な例として、ペルオキシカルボン酸又はその塩、又はペルオキシ一硫酸又はその塩が挙げられる。本明細書に用いるのに好適な典型的なペルオキシカルボン酸塩は、以下の化学式に対応する化学構造を有する：
Figure 2014522235
 式中：Ｒ１４は、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール又は複素環式基から選択され、Ｒ１４基は、直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換のいずれでもよく、過酸が疎水性の場合は６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子を有し、過酸が親水性の場合は６個未満の炭素原子又は更には４個未満の炭素原子を有し、Ｙは電気的中性を得るのに適した対イオンであり、好ましくはＹは水素、ナトリウム又はカリウムから選択される。好ましくは、Ｒ１４は、直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換Ｃ６〜９アルキルである。好ましくは、ペルオキシ酸又はその塩は、ペルオキシヘキサン酸、ペルオキシヘプタン酸、ペルオキシオクタン酸、ペルオキシノナン酸、ペルオキシデカン酸、任意のその塩、又は任意のこれらの組み合わせから選択される。特に好ましいペルオキシ酸は、フタルイミドペルオキシアルカン酸、特にε−フタルイミドペルオキシヘキサン酸（ＰＡＰ）である。好ましくは、ペルオキシ酸又はその塩は、３０℃〜６０℃の範囲の融点を有する。
事前形成されたペルオキシ酸又はその塩はまた、ペルオキシスルホン酸又はその塩とすることができ、典型的に、以下の化学式に対応する化学構造を有する：
Figure 2014522235
 式中、Ｒ１５は、アルキル、アラルキル、シクロアルキル、アリール、又は複素環基から選択され、Ｒ１５基は、直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換であることができ、Ｚは、電気的中性を達成する任意の好適な対イオンであり、好ましくは、Ｚは、水素、ナトリウム、又はカリウムから選択される。好ましくは、Ｒ１５は直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換のＣ４〜１４、好ましくはＣ６〜１４アルキルである。好ましくは、このような漂白組成物は、本発明の組成物に０．０１〜５０％、最も好ましくは０．１％〜２０％の量で存在してもよい。
（３）アルカリ金属塩、例えば、過ホウ酸塩（通常は、一又は四水和物）、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過ケイ酸塩、及びこれらの混合物のナトリウム塩を含む、過酸化水素供給源（例えば、無機過酸化水素化塩類）。本発明の一態様では、無機過酸化水素化塩類は、過ホウ酸塩、過炭酸塩、及びこれらの混合物のナトリウム塩からなる群から選択される。採用される場合、無機過水和物塩は、典型的にはクリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品の全体の０．０５〜４０重量％、又は１〜３０重量％の量で存在し、典型的にはこのようなクリーニング及び／又は処理組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品中に結晶性固体として組み込まれ、この結晶性固体はコーティングされていてもよい。好適なコーティングとしては、無機塩（アルカリ金属ケイ酸塩、炭酸塩若しくはホウ酸塩、又はこれらの混合物など）、又は有機物質（水溶性若しくは分散性ポリマー、ワックス、油又は脂肪石鹸など）が挙げられる、及び、
（４）Ｒ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｌを有する漂白活性化剤（式中、Ｒはアルキル基であり、所望により分枝状であり、漂白活性化剤が疎水性の場合には、６〜１４個の炭素原子、又は８〜１２個の炭素原子を有し、漂白活性化剤が親水性の場合、６個未満の炭素原子、又は更に４個未満の炭素原子を有し、Ｌは脱離基である）。好適な脱離基の例は、安息香酸及びそれらの誘導体−特にベンゼンスルホネートである。好適な漂白活性化剤としては、ドデカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシベンゼンスルホネート、デカノイルオキシ安息香酸又はその塩、３，５，５−トリメチルヘキサノイルオキシベンゼンスルホネート、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）及びノナノイルオキシベンゼンスルホネート（ＮＯＢＳ）が挙げられる。好適な漂白活性化剤はまた、国際公開第９８／１７７６７号に開示されている。任意の好適な漂白活性化剤を使用してもよいが、発明の一態様では、対象組成物は、ＮＯＢＳ、ＴＡＥＤ又はこれらの混合物を含んでよい。
（５）漂白触媒。本発明の組成物は、ペルオキシ酸及び／又はその塩から酸素原子を受け取り、その酸素原子を酸化可能な基材に移送することができる漂白触媒も１つ以上包含してもよい。好適な漂白触媒としては、イミニウムカチオン及びポリイオン、イミニウム双性イオン、修飾アミン、修飾アミンオキシド、Ｎ−スルホニルイミン、Ｎ−ホスホニルイミン、Ｎ−アシルイミン、チアジアゾールジオキシド、ペルフルオロイミン、環状糖ケトン、及びα−アミノケトン並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。好適なα−アミノケトンは、例えば、国際公開第２０１２／０００８４６ Ａ１号、国際公開第２００８／０１５４４３ Ａ１号、及び国際公開第２００８／０１４９６５ Ａ１号に記載されているものである。好適な混合物は、米国特許出願公開第２００７／０１７３４３０ Ａ１号に記載のようなものである。
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、この上述の記載のように求電子性及び疎水性を制御することによって、実質的に、より疎水性の布地領域であり、かつ高度に求電子性の酸化剤による漂白を受けやすい、可視発色団を含めた電子豊富な汚れを含む布地領域のみに、漂白成分を供給することが可能になると考える。
一態様では、漂白触媒は、以下の一般式による構造を有する：
Figure 2014522235
 式中、Ｒ１３は、２−エチルヘキシル、２−プロピルへプチル、２−ブチルオクチル、２−ペンチルノニル、２−ヘキシルデシル、ｎ−ドデシル、ｎ−テトラデシル、ｎ−ヘキサデシル、ｎ−オクタデシル、イソ−ノニル、イソ−デシル、イソ−トリデシル及びイソ−ペンタデシルである。
（６）本組成物は、好ましくは触媒金属錯体を含んでもよい。好ましい金属含有漂白触媒の１つの種類は、定義された漂白触媒活性の遷移金属カチオン（例えば、銅、鉄、チタン、ルテニウム、タングステン、モリブデン又はマンガンのカチオン）、漂白触媒活性をほとんど又は全く有さない補助金属カチオン（例えば、亜鉛又はアルミニウムのカチオン）並びに触媒金属及び補助金属のカチオンに対して定義された安定度定数を有する金属イオン封鎖剤、特にエチレンジアミン四酢酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）及びこれらの水溶性の塩を含む触媒系である。このような触媒は、米国特許第４，４３０，２４３号に開示されている。
所望する場合、本明細書の組成物はマンガン化合物を用いて触媒可能である。このような化合物及び使用濃度は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，５７６，２８２号に開示されるマンガン系触媒が挙げられる。
本明細書において有用なコバルト漂白触媒は既知であり、例えば、米国特許第５，５９７，９３６号、米国特許第５，５９５，９６７号に記載される。このようなコバルト触媒は、例えば米国特許第５，５９７，９３６号及び米国特許第５，５９５，９６７号に教示されているような、既知の手順によって容易に調製される。
本明細書の組成物は、また、配位子の遷移金属錯体（例えば、ビスピドン（bispidone）（国際公開第０５／０４２５３２（Ａ１）号））及び／又は大多環状剛性配位子（「ＭＲＬ」と略される）を適切に含んでもよい。実際問題として、限定するためではないが、本明細書の組成物及び方法は、水性洗浄媒体において、少なくとも１億分の１のオーダーの活性ＭＲＬ種を提供するように調整することができ、通常、約０．００５ｐｐｍ〜約２５ｐｐｍ、約０．０５ｐｐｍ〜約１０ｐｐｍ、又は更に約０．１ｐｐｍ〜約５ｐｐｍのＭＲＬを洗浄溶液中に提供する。
本遷移金属漂白触媒における好適な遷移金属としては、例えばマンガン、鉄及びクロムが挙げられる。好適なＭＲＬとしては、５，１２−ジエチル−１，５，８，１２−テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカンが挙げられる。
適した遷移金属ＭＲＬは、既知の手順、例えば、国際公開第００／３２６０１号、及び米国特許第６，２２５，４６４号にて教示される手順によって容易に調製される。
存在する場合、過酸化水素／過酸供給源及び／又は漂白活性化剤は、一般に、クリーニング及び／又は処置組成物、例えば布地ケア及びホームケア製品を基準にして、約０．１〜約６０重量％、約０．５〜約４０重量％又は更には約０．６〜約１０重量％の量で組成物中に存在する。１つ以上の疎水性の過酸又はそれらの前駆体は、１つ以上の親水性過酸又はそれらの前駆体と組み合わせて使用してもよい。
典型的には、過酸化水素供給源及び漂白活性化剤は一緒に組み込まれる。過酸化水素供給源及び過酸又は漂白活性化剤の量は、（過酸化物供給源からの）有効酸素対過酸のモル比が、１：１〜３５：１、又は更に２：１〜１０：１となるように選択し得る。
界面活性剤。好ましくは、組成物は界面活性剤又は界面活性剤システムを含む。界面活性剤は、非イオン性、アニオン性、カチオン性、両性（ampholytic）、両性（amphoteric）、両親媒性物質、双極性、半極性非イオン性界面活性剤及びこれらの混合物から選択できる。好ましい組成物は、界面活性剤／界面活性剤システムの混合物を含む。好ましい界面活性剤システムは、１つ以上のアニオン性界面活性剤を、最も好ましくは共界面活性剤と組み合わせて、最も好ましくは非イオン性及び／又は両性及び／又は双極性界面活性剤と組み合せて含む。好ましい界面活性剤システムは、アニオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤の両方を、好ましくは９０：１〜１：９０の重量比で含む。場合によっては、アニオン性界面活性剤対非イオン性界面活性剤の重量比は少なくとも１：１が好ましい。しかし、１０：１未満の比が好ましい場合もある。存在する場合、全界面活性剤濃度は、好ましくは対象組成物の０．１重量％〜６０重量％、１重量％〜５０重量％、又は更には５重量％〜４０重量％である。
好ましくは、組成物はアニオン性洗浄界面活性剤、好ましくはサルフェート及び／又はスルホネート界面活性剤を含む。好ましい例としては、アルキルベンゼンスルホネート、アルキルサルフェート、及びアルキルアルコキシル化サルフェートが挙げられる。好ましいスルホネートはＣ１０〜１３アルキルベンゼンスルホネートである。好適なアルキルベンゼンスルホネート（ＬＡＳ）は、市販の直鎖アルキルベンゼン（ＬＡＢ）をスルホン化することによって得ることができ、好適なＬＡＢとしては、Ｓａｓｏｌにより商標名Ｉｓｏｃｈｅｍ（登録商標）で供給されているもの、又はＰｅｔｒｅｓａにより商標名Ｐｅｔｒｅｌａｂ（登録商標）で供給されているものなどの低級２−フェニルＬＡＢが挙げられ、他の好適なＬＡＢとしては、Ｓａｓｏｌにより商標名Ｈｙｂｌｅｎｅ（登録商標）で供給されているものなどの、高級２−フェニルＬＡＢが挙げられる。好適なアニオン性洗浄界面活性剤は、ＤＥＴＡＬ触媒方法によって得られるアルキルベンゼンスルホネートであるが、ＨＦなどの他の合成経路もまた好適な場合がある。一態様では、ＬＡＳのマグネシウム塩が使用される。
好ましいサルフェート洗浄性界面活性剤には、アルキルサルフェート、典型的にはＣ８〜１８アルキルサルフェート、又は主にＣ１２アルキルサルフェートが挙げられる。更なる好ましいアルキルサルフェートは、アルキルアルコキシル化サルフェート、好ましくはＣ８〜１８アルキルアルコキシル化サルフェートである。好ましくは、アルコキシル化基はエトキシル化基である。典型的には、アルキルアルコキシル化サルフェートは、０．５〜３０若しくは２０、又は０．５〜１０の平均アルコキシル化度を有する。特に好ましいのは、平均エトキシル化度が０．５〜１０、０．５〜７、０．５〜５又は更には０．５〜３のＣ８〜１８アルキルエトキシル化サルフェートである。
アルキルサルフェート、アルキルアルコキシル化サルフェート及びアルキルベンゼンスルホネートは、直鎖又は分枝鎖であってもよく、置換又は非置換であってもよい。界面活性剤が分枝状の場合、好ましくは界面活性剤は中鎖分枝状サルフェート又はスルホネート界面活性剤を含むであろう。好ましくは、分枝鎖基はＣ１〜４アルキル基、典型的にはメチル及び／又はエチル基を含む。
好ましくは、組成物は非イオン性洗浄界面活性剤を含む。好適な非イオン性界面活性剤は、ＳｈｅｌｌのＮＥＯＤＯＬ（登録商標）非イオン性界面活性剤などのＣ８〜Ｃ１８アルキルエトキシレート；アルコキシレート単位がエチレンオキシ単位、プロピレンオキシ単位又はこれらの混合物であり得る、Ｃ６〜Ｃ１２アルキルフェノールアルコキシレート；ＢＡＳＦのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）などの、エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロックポリマーとの、Ｃ１２〜Ｃ１８アルコール縮合物及びＣ６〜Ｃ１２アルキルフェノール縮合物；Ｃ１４〜Ｃ２２中鎖分枝状アルコール；典型的には１〜３０の平均アルコキシル化度を有するＣ１４〜Ｃ２２中鎖分枝状アルキルアルコキシレート；アルキル多糖、一態様ではアルキルポリグルコシド；ポリヒドロキシ脂肪酸アミド；エーテル末端保護ポリ（オキシアルキル化）アルコール界面活性剤；並びにこれらの混合物からなる群から選択される。
好適な非イオン性洗浄界面活性剤としては、アルキルポリグルコシド及び／又はアルキルアルコキシル化アルコールが挙げられる。
一態様では、非イオン性洗浄界面活性剤としては、アルキルアルコキシル化アルコール、一態様ではＣ８〜１８アルキルアルコキシル化アルコール、例えば、Ｃ８〜１８アルキルエトキシル化アルコールが挙げられ、このアルキルアルコキシル化アルコールは、１〜８０、好ましくは１〜５０、最も好ましくは１〜３０、１〜２０、又は１〜１０の平均アルコキシル化度を有してもよい。一態様では、このアルキルアルコキシル化アルコールは、１〜１０、又は１〜７、更には１〜５又は３〜７、又は更には３若しくは２未満の平均エトキシル化度を有する、Ｃ８〜１８アルキルエトキシル化アルコールであってもよい。
アルキルアルコキシル化アルコールは、直鎖又は分枝鎖であってもよく、置換又は非置換であってもよい。
好適な非イオン性界面活性剤としては、ＢＡＳＦからの商標名Ｌｕｔｅｎｓｏｌ（登録商標）が挙げられる。
好適なカチオン性洗浄性界面活性剤としては、アルキルピリジニウム化合物、アルキル四級アンモニウム化合物、アルキル四級ホスホニウム化合物、アルキル三級スルホニウム化合物、及びこれらの混合物が挙げられる。
好適なカチオン性洗浄界面活性剤は、次の一般式を有する第四級アンモニウム化合物である。
（Ｒ）（Ｒ１）（Ｒ２）（Ｒ３）Ｎ＋Ｘ−
式中、Ｒは直鎖又は分枝鎖、置換又は非置換の、Ｃ６〜１８アルキル又はアルケニル部分であり、Ｒ１及びＲ２は、独立して、メチル又はエチル部分から選択され、Ｒ３は、ヒドロキシル、ヒドロキシメチル、又はヒドロキシエチル部分であり、Ｘは、電気的中性を提供するアニオンであり、好適なアニオンとしては、例えば、塩化物といったハロゲン化物、サルフェート、及びスルホネートが挙げられる。好適なカチオン性洗浄界面活性剤は、モノＣ６〜１８アルキルモノヒドロキシエチルジメチル第四級アンモニウムクロリドである。非常に好適なカチオン性洗浄界面活性剤は、モノ−Ｃ８〜１０アルキルモノヒドロキシエチルジメチル四級アンモニウムクロリド、モノ−Ｃ１０〜１２アルキルモノヒドロキシエチルジメチル四級アンモニウムクロリド、及びモノ−Ｃ１０アルキルモノヒドロキシエチルジメチル四級アンモニウムクロリドである。
好適な両性／双極性界面活性剤としては、アミンオキシド及びベタインが挙げられる。
アミンで中和されたアニオン性界面活性剤−本発明のアニオン性界面活性剤及び補助的なアニオン性共界面活性剤は、酸形態で存在してもよく、この酸形態が中和されて本洗剤組成物への使用に望ましい界面活性剤塩を形成してもよい。典型的な中和剤には、水酸化物（例えばＮａＯＨ又はＫＯＨ）のような金属対イオン塩基が挙げられる。酸形態にある本発明のアニオン性界面活性剤及び補助アニオン性界面活性剤又は共界面活性剤を中和するための更に好ましい剤としては、アンモニア、アミン、又はアルカノールアミンが挙げられる。アルカノールアミンが好ましい。好適な非限定例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、及び当該技術分野において既知のその他の直鎖又は分枝鎖アルカノールアミンが挙げられ、例えば、非常に好ましいアルカノールアミンとしては、２−アミノ−１−プロパノール、１−アミノプロパノール、モノイソプロパノールアミン、又は１−アミノ−３−プロパノールが挙げられる。アミンの中和は全体的に又は部分的な範囲でされてもよく、例えば、アニオン性界面活性剤混合物の一部はナトリウム若しくはカリウムで中和されてもよく、アニオン性界面活性剤混合物の一部はアミン若しくはアルカノールアミンで中和されてもよい。
ビルダー。好ましくは、本組成物は１つ以上のビルダー又はビルダーシステムを含む。ビルダーを使用する際、本発明の組成物は典型的には少なくとも１％、２％〜６０％のビルダーを含むであろう。本組成物は、低濃度、例えば１〜１０又は５重量％のリン酸塩及び／又はゼオライトを含むことが好ましい。本組成物は、強力なビルダーを実質的に含まなくてもよく、強力なビルダーを実質的に含まないとは、ゼオライト及び／又はリン酸塩が「意図的に添加されていない」ことを意味する。典型的なゼオライトビルダーとしては、ゼオライトＡ、ゼオライトＰ及びゼオライトＭＡＰが挙げられる。典型的なリン酸塩ビルダーは、トリポリリン酸ナトリウムである。
キレート剤。好ましくは、本組成物はキレート剤及び／又は結晶成長阻害物質を含む。好適な分子としては、銅、鉄及び／又はマンガンキレート剤、並びにこれらの混合物が挙げられる。好適な分子としては、アミノカルボキシレート、アミノホスホネート、サクシネート、それらの塩、及びこれらの混合物が挙げられる。本明細書に用いるのに好適なキレート剤のその他の非限定例としては、エチレンジアミン四酢酸、Ｎ−（ヒドロキシエチル）エチレンジアミン三酢酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミンテトラプロピオネート、トリエチレンテトラミン六酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、エタノールジグリシン、エチレンジアミンテトラキス（メチレンホスホネート）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）（ＤＴＰＭＰ）、エチレンジアミンジサクシネート（ＥＤＤＳ）、ヒドロキシエタンジメチレンホスホン酸（ＨＥＤＰ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、これらの塩、及びこれらの混合物が挙げられる。本発明で使用するキレート剤の非限定例は、米国特許第７４４５６４４号、同第７５８５３７６号、及び同第２００９／０１７６６８４Ａ１号に記載されている。本明細書で用いるのに好適な他のキレート剤は、市販されているＤＥＱＵＥＳＴシリーズ、並びにＭｏｎｓａｎｔｏ、ＤｕＰｏｎｔ、及びＮａｌｃｏ，Ｉｎｃ．のキレート剤である。
移染阻害剤（ＤＴＩ）。組成物は１つ以上の移染防止剤を含んでもよい。本発明の１つの実施形態で、発明者は、驚くべきことに、高分子移染防止剤を特定の染料に追加して含む組成物が改善された性能を与えることを見出した。これらのポリマーは染料付着を防止することから、これは意外である。好適な移染防止剤としては、ポリビニルピロリドンポリマー、ポリアミンＮ−オキシドポリマー、Ｎ−ビニルピロリドンとＮ−ビニルイミダゾールのコポリマー、ポリビニルオキサゾリドン及びポリビニルイミダゾール又はこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。このような例としては、Ａｓｈｌａｎｄ ＡｑｕａｌｏｎからのＰＶＰ−Ｋ１５、ＰＶＰ−Ｋ３０、ＣｈｒｏｍａＢｏｎｄ Ｓ−４００、ＣｈｒｏｍａＢｏｎｄ Ｓ−４０３Ｅ及びＣｈｒｏｍａｂｏｎｄ Ｓ−１００、並びにＢＡＳＦからのＳｏｋａｌａｎ ＨＰ１６５、Ｓｏｋａｌａｎ ＨＰ５０、Ｓｏｋａｌａｎ ＨＰ５３、Ｓｏｋａｌａｎ ＨＰ５９、Ｓｏｋａｌａｎ（登録商標）ＨＰ ５６Ｋ、Ｓｏｋａｌａｎ（登録商法）ＨＰ６６が挙げられる。その他の好適なＤＴＩは国際特許第２０１２／００４１３４号に記載されている。移染防止剤は、対象組成物に存在する場合、組成物の約０．０００１重量％〜約１０重量％、約０．０１重量％〜約５重量％又は更に約０．１重量％〜約３重量％の濃度で存在してもよい。
蛍光増白剤。好ましくは、本組成物は１つ以上の蛍光増白剤を含む。本発明に有用であり得る市販の光学的増白剤は下位に分類することができ、これはスチルベン、ピラゾリン、クマリン、カルボン酸、メチンシアニン、ジベンゾチオフェン−５，５−ジオキシド、アゾール、５員及び６員環の複素環、及び他の様々な剤の誘導体を含むが、これに限定されない。特に好ましい増白剤は、２（４−スチリル−３−スルホフェニル）−２Ｈ−ナフトール［１，２−ｄ］トリアゾールナトリウム、４，４’−ビス｛［（４−アニリノ−６−（Ｎメチル−Ｎ−２ヒドロキシエチル）アミノ１，３，５−トリアジン２−イル）］アミノ｝スチルベン−２−２−ジスルホン酸二ナトリウム、４，４’−ビス｛［（４−アニリノ−６−モルホリノ−１，３，５−トリアジン−２−イル）］アミノ｝スチルベン−２−２’ジスルホン酸二ナトリウム、及び４，４’−ビス（２−スルホスチリル）ビフェニル二ナトリウムから選択される。このような増白剤のその他の例は、「Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｂｒｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ａｇｅｎｔｓ」（Ｍ．Ｚａｈｒａｄｎｉｋ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）より出版）に開示されている。本発明の組成物に有用である光学的な増白剤の具体的な非限定例は、米国特許第４，７９０，８５６号及び同第３，６４６，０１５号に特定されているものである。
好ましい増白剤は以下の構造を有する：
Figure 2014522235
好適な蛍光増白剤濃度としては、約０．０１重量％、約０．０５重量％、約０．１重量％、更には約０．２重量％の低い濃度から、０．５重量％又は更に０．７５重量％の高い濃度までが挙げられる。
一態様では、増白剤は粘土上に置かれて粒子を形成してもよい。
好ましい増白剤は、全部又は大部分（典型的には少なくとも５０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９９重量％）がα−結晶質形態である。非常に好ましい増白剤は、Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤２６０を含み、好ましくは以下の構造を有する：
Figure 2014522235
上記増白剤は、冷水、例えば３０℃又は２５℃又は更には２０℃未満で溶解することから特に有用となり得る。
好ましくは増白剤は、微粉化粒子形態、最も好ましくは重量平均一次粒径が３〜３０マイクロメートル、３〜２０マイクロメートル、又は３〜１０マイクロメートルで、組成物に組み込まれる。
組成物は、β−結晶質形態のＣ．Ｉ．蛍光増白剤２６０を含んでもよく、（ｉ）α−結晶質形態のＣ．Ｉ．蛍光増白剤２６０の、（ｉｉ）β−結晶質形態のＣ．Ｉ．蛍光増白剤２６０に対する、重量比率は、少なくとも０．１又は少なくとも０．６であり得る。
ＢＥ６８０８４７は、α−結晶質形態のＣ．Ｉ．蛍光増白剤２６０の製造プロセスに関する。
ケイ酸塩。本組成物は、好ましくはケイ酸ナトリウム又はカリウムのような、ケイ酸塩も含有する。組成物は、０重量％〜１０重量％未満、９重量％以下又は８重量％以下又は７重量％以下又は６重量％以下又は５重量％以下又は４重量％以下又は３重量％以下又は更には２重量％以下のケイ酸塩、好ましくは０重量％超又は５重量％以上、又は更には１重量％以上のケイ酸塩を含み得る。好適なケイ酸塩は、ケイ酸ナトリウムである。
分散剤。本組成物は、好ましくは分散剤も含有する。好適な水溶性有機物質としては、ホモポリマー又はコポリマーの酸又はそれらの塩が挙げられ、それらのうちのポリカルボン酸は、互いに炭素原子２個を超えない程度に離れている少なくとも２個のカルボキシルラジカルを含む。
酵素安定剤。本組成物は、好ましくは酵素安定剤を含んでもよい。いかなる従来の酵素安定剤も使用してもよく、例えば水溶性のカルシウム及び／又はマグネシウムイオン供給源が、このようなイオンを酵素に提供する完成した布地ケア及びホームケア製品中に存在することによる使用でもよい。プロテアーゼを含む水性組成物の場合、可逆的プロテアーゼ阻害剤、例えばホウ酸塩、又は好ましくは４−ホルミルフェニルボロン酸、フェニルボロン酸及びその誘導体などのホウ素化合物、又ギ酸カルシウム、ギ酸ナトリウム及び１，２−プロパンジオールを添加して安定性を更に改善できる。
溶媒系。本組成物の溶媒系は、水のみ又は有機溶媒の混合物を水なしで又は好ましくは水と共に含有する溶媒系であることができる。好適な有機溶媒には１，２−プロパンジオール、エタノール、グリセロール、ジプロピレンジグリコール、メチルプロパンジオール、及びこれらの混合物が挙げられる。その他の低級アルコール、モノエタノールアミン及びトリエタノールアミンのようなＣ１〜Ｃ４アルカノールアミンも使用できる。溶媒系は、例えば本発明の無水固形物実施形態の実施例のように、無くてもよいが、より典型的には約０．１％〜９８％の範囲にある濃度で存在でき、好ましくは少なくとも約１％〜約５０％、より通常的には約５％〜約２５％で存在する。
本発明の一部の実施形態では、組成物は構造化液体の形態である。このような構造化液体は、例えば増粘剤として使用するため、一次成分（例えば界面活性剤物質）によって構造が形成されるように内部的に構造化されることも、二次成分（例えばポリマー、粘土及び／又はケイ酸塩物質）を使用する三次元マトリックス構造を提供することによって外部的に構造化されることもできる。本組成物は、構造剤を含んでもよく、好ましくは、０．０１重量％〜５重量％、０．１重量％２．０重量％の構造剤を含んでもよい。好適な構造剤の例は、米国特許出願公開第２００６／０２０５６３１Ａ１号、同２００５／０２０３２１３Ａ１号、米国特許第７２９４６１１号、同第６８５５６８０号に与えられている。構造化剤は典型的には、ジグリセリド及びトリグリセリド、エチレングリコールジステアレート、微結晶セルロース、セルロース系材料、マイクロファイバーセルロース、Ｐｏｌｙｇｅｌ Ｗ３０（３ＶＳｉｇｍａ）のような疎水変性アルカリ膨潤性エマルション、バイオポリマーからなる群から選択され、キサンタンガム、ジェランガム、硬化ヒマシ油、硬化ヒマシ油の誘導体、例えば非エトキシ化誘導体及びこれらの混合物、特に硬化ヒマシ油、硬化ヒマシ油の誘導体、マイクロファイバーセルロース、ヒドロキシ官能結晶性材料、長鎖脂肪族アルコール、１２−ヒドロキシステアリン酸、粘土及びこれらの混合物の群から選択される。好ましい構造化剤は、好適なヒドロキシ官能結晶性材料を詳細に定義した米国特許第６，８５５，６８０号に記載されている。好ましいものは、硬化ヒマシ油である。有用な構造剤の非限定例としては以下が挙げられる。このような構造剤はある範囲のアスペクト比を有する糸状構造システムを有する。他の好適な構造剤、及びそれらの構造剤を作製するためのプロセスは、国際公開第２０１０／０３４７３６号に記載されている。
本発明の組成物は、高融点脂肪族化合物を含んでもよい。本明細書において有用な高融点脂肪族化合物は、２５℃以上の融点を有し、脂肪族アルコール、脂肪酸、脂肪族アルコール誘導体、脂肪酸誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択される。そのような低融点の化合物は、この項には含まれないものとする。高融点化合物の非限定的な例は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９３、及びＣＴＦＡ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９２に見出される。存在する場合、高融点脂肪族化合物は、好ましくは改善されたコンディショニング効果、例えば、濡れた毛髪へ塗布している間のぬるぬるした感じ、並びに乾いた毛髪での柔らかさ及びしっとり感をもたらす観点から、組成物の約０．１重量％〜約４０重量％、好ましくは約１重量％〜約３０重量％、より好ましくは約１．５重量％〜約１６重量％、１．５重量％〜８重量％の濃度で組成物中に包含される。
カチオン性ポリマー。本発明の組成物は、カチオン性ポリマーを含有してよい。組成物中のカチオン性ポリマーの濃度は、典型的には、約０．０５％〜約３％、別の実施形態では約０．７５％〜約２．０％、なおも別の実施形態では、約０．１％〜約１．０％の範囲である。好適なカチオン性ポリマーは、組成物の意図される使用でのｐＨ（通常約ｐＨ ３〜約ｐＨ ９、一実施形態では約ｐＨ ４〜約ｐＨ ８の範囲のｐＨ）において、少なくとも約０．５ｍｅｑ／ｇｍ、別の実施形態では少なくとも約０．９ｍｅｑ／ｇｍ、別の実施形態では少なくとも約１．２ｍｅｑ／ｇｍ、なおも別の実施形態では少なくとも約１．５ｍｅｑ／ｇｍ、しかし一実施形態では約７ｍｅｑ／ｇｍ未満、及び別の実施形態では約５ｍｅｑ／ｇｍ未満のカチオン性電荷密度を有する。本明細書においてポリマーの「カチオン電荷密度」とは、ポリマーの分子量に対する、ポリマー上の正電荷数の比を指す。このような好適なカチオン性ポリマーの平均分子量は一般に、約１０，０００〜１０，０００，０００であり、一実施形態では、約５０，０００〜約５，０００，０００であり、別の実施形態では、約１００，０００〜約３，０００，０００である。
本発明の組成物に用いるのに好適なカチオン性ポリマーは、第四級アンモニウムのようなカチオン性窒素含有部分又はカチオン性プロトン化アミノ部分を含有する。カチオン性ポリマーに関連して、いかなるアニオン性対イオンも使用することができるが、ポリマーが、水、組成物、又は組成物のコアセルベート相に可溶性であり、また、対イオンが、組成物の必須成分と物理的及び化学的に適合性があり、さもなければ製品の性能、安定性、又は審美性を過度に損なわないことを条件とする。このような対イオンの非限定例としては、ハロゲン化物（例えば、塩化物、フッ化物、臭化物、ヨウ化物）、サルフェート及び硫酸メチルが挙げられる。
このようなポリマーの非限定例は、Ｅｓｔｒｉｎ、Ｃｒｏｓｌｅｙ及びＨａｙｎｅｓ編のＣＴＦＡ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｔｈｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，Ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８２））に記載されている。
組成物に使用するための他の好適なカチオン性ポリマーには、多糖類ポリマー、カチオン性グアーガム誘導体、四級窒素含有セルロースエーテル、合成ポリマー、エーテル化セルロースのコポリマー、グアー、及びデンプンが含まれる。使用される場合、本発明におけるカチオン性ポリマーは、組成物中で可溶性であるか、又は上述のカチオン性ポリマー並びにアニオン性、両性、及び／又は双極性イオン性界面活性剤構成成分によって形成された組成物中の複合コアセルベート相中で可溶性であるかのいずれかである。カチオン性ポリマーの複合コアセルベートはまた、本組成物中の他の帯電物質で形成することもできる。
好適なカチオン性ポリマーは、米国特許第３，９６２，４１８号、同第３，９５８，５８１号、及び米国特許出願公開第２００７／０２０７１０９（Ａ１）号に記載される。
非イオン性ポリマー。本発明の組成物は、コンディショニング剤として非イオン性ポリマーを含んでもよい。１０００を超える分子量を有するポリアルキレングリコールが本明細書において有用である。以下の一般式を有するものが有用である：
Figure 2014522235
 式中、Ｒ９５はＨ、メチル、及びこれらの混合物からなる群から選択される。コンディショニング剤、及び特にシリコーンが組成物に含まれてもよい。本発明の組成物に有用なコンディショニング剤は、典型的には、乳化液体粒子を形成する非水溶性の水分散性不揮発性液体を含む。本組成物に用いるのに好適なコンディショニング剤は、一般にシリコーン（例えば、シリコーンオイル、カチオン性シリコーン、シリコーンガム、屈折率の高いシリコーン、及びシリコーン樹脂）、有機コンディショニングオイル（例えば、炭化水素油、ポリオレフィン、及び脂肪酸エステル）若しくはこれらの組み合わせとして特徴付けられるコンディショニング剤、又はさもなければ本明細書の水性界面活性剤マトリックス中に液状の分散した粒子を形成するコンディショニング剤である。これらのコンディショニング剤は、物理的及び化学的に組成物の必須成分と適合すべきであり、さもなければ過度に製品の安定性、審美性、又は性能を損なうべきではない。
組成物中のコンディショニング剤の濃度は、所望のコンディショニング利益を提供するために十分であるべきである。このような濃度は、コンディショニング剤、所望のコンディショニング性能、コンディショニング剤粒子の平均粒径、その他の構成成分の種類及び濃度、並びにその他の同様の要因により様々であり得る。
シリコーンコンディショニング剤の濃度は、典型的には、約０．０１％〜約１０％の範囲に及ぶ。好適なシリコーンコンディショニング剤、及びシリコーン用の任意の懸濁化剤の非限定例は、米国再発行特許第３４，５８４号、米国特許第５，１０４，６４６号、同第５，１０６，６０９号、同第４，１５２，４１６号、同第２，８２６，５５１号、同第３，９６４，５００号、同第４，３６４，８３７号、同第６，６０７，７１７号、同第６，４８２，９６９号、同第５，８０７，９５６号、同第５，９８１，６８１号、同第６，２０７，７８２号、同第７，４６５，４３９号、同第７，０４１，７６７号、同第７，２１７，７７７号、米国特許出願第２００７／０２８６８３７（Ａ１）号、同第２００５／００４８５４９（Ａ１）号、同第２００７／００４１９２９（Ａ１）号、英国特許第８４９，４３３号、ドイツ特許第１００３６５３３号（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）、「Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９６８））、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃのシリコーンゴム製品データシートＳＥ ３０、ＳＥ ３３、ＳＥ ５４、及びＳＥ ７６、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ｐｅｔｒａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（１９８４）、並びに「Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（ｖｏｌ．１５，２ｄ ｅｄ．，ｐｐ ２０４〜３０８，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８９））に記載されている。
有機コンディショニング油。本発明の組成物はまた、コンディショニング剤として、単独で又はシリコーン（本明細書に記載される）のような他のコンディショニング剤と組み合わせて、約０．０５％〜約３％の少なくとも１つの有機コンディショニング油を含み得る。好適なコンディショニング油には、炭化水素油、ポリオレフィン及び脂肪酸エステルが挙げられる。Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏｍｐａｎｙの米国特許第５，６７４，４７８号及び同第５，７５０，１２２号に記載のコンディショニング剤も、本明細書の組成物への使用に好適である。同様に本明細書で使用するのに好適であるのは、米国特許第４，５２９，５８６号、同第４，５０７，２８０号、同第４，６６３，１５８号、同第４，１９７，８６５号、同第４，２１７、９１４号、同第４，３８１，９１９号、及び同第４，４２２、８５３号に記載されているコンディショニング剤である。
衛生剤。本発明の組成物は、リシノール酸亜鉛、チモール、四級アンモニウム塩、例えばＢａｒｄａｃ（登録商標）、ポリエチレンイミン（例えばＢＡＳＦからのＬｕｐａｓｏｌ（登録商標））及びその亜鉛錯体、銀及び銀化合物、特にＡｇ＋をゆっくりと放出するよう設計されたもの又はナノシルバー分散液のうちの１つ又はそれ以上のような、衛生及び／又は悪臭面の利益を送達する組成物も含んでもよい。
プロバイオティクス。本発明は、国際公開第２００９／０４３７０９号に記載されているもののような、プロバイオティクスを含んでもよい。
泡促進剤。本組成物は、好ましくは、大量の泡立ちが望ましい場合には泡促進剤を含んでもよい。好適な例はＣ１０〜Ｃ１６アルカノールアミド又はＣ１０〜Ｃ１４アルキルサルフェートであり、好ましくは１％〜１０％の濃度で組み込まれる。Ｃ１０〜Ｃ１４モノエタノール及びジエタノールアミドは、このような泡促進剤の典型的な部類を示す。上述の、アミンオキシド、ベタイン及びスルタインなどの高起泡補助界面活性剤を含む泡促進剤を使用することも有益である。所望される場合、追加的な泡を提供するため、及びグリース除去性能を増大させるために、ＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４、ＣａＣｌ２、ＣａＳＯ４等のような水溶性マグネシウム及び／又はカルシウム塩を、典型的には、０．１％〜２％の濃度で添加することができる。
抑泡剤。泡の形成を低減又は抑制するための化合物を、本発明の組成物中に組み込んでもよい。抑泡制は、米国特許第４，４８９，４５５号及び同第４，４８９，５７４号に記載されているようないわゆる「高濃度洗浄プロセス」において、並びにフロント・ローディング方式の洗濯機において、特に重要なものとなり得る。抑泡剤として多種多様な材料を使用してよく、抑泡剤は当業者には周知である。例えば、「Ｋｉｒｋ Ｏｔｈｍｅｒ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ ７，ｐ．４３０〜４４７（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９７９））を参照のこと。抑泡剤の例には、モノカルボン脂肪酸及びその中の可溶性塩、高分子量炭化水素、例えばパラフィン、脂肪酸エステル（例えば脂肪酸トリグリセリド）、一価アルコールの脂肪酸エステル、脂肪族Ｃ１８〜Ｃ４０ケトン（例えばステアロン（stearone））、Ｎ−アルキル化アミノトリアジン、好ましくは約１００℃以下の融点を有するワックス状炭化水素、シリコーン抑泡剤、及び第２級アルコールが挙げられる。抑泡剤は、米国特許第２，９５４，３４７号、同第４，２６５，７７９号、同第４，２６５，７７９号、同第３，４５５，８３９号、同第３，９３３，６７２号、同第４，６５２，３９２号、同第４，９７８，４７１号、同第４，９８３，３１６号、同第５，２８８，４３１号、同第４，６３９，４８９号、同第４，７４９，７４０号、及び同第４，７９８，６７９号、同第４，０７５，１１８号、欧州特許出願第８９３０７８５１．９号、欧州特許第１５０，８７２号、並びにＤＯＳ ２，１２４，５２６号に記載されている。
自動洗濯機で使用されるべき任意の洗剤組成物について、泡は、それらが洗濯機から溢流する程度まで形成されるべきでない。使用する場合、抑泡剤は、好ましくは「抑泡量」で存在する。「抑泡量」によって、自動洗濯機で使用する際に、低起泡性洗濯洗剤となるように配合者が選択できる、起泡を十分に制御するような抑泡剤量を意味する。本明細書の組成物は、概して、０％〜１０％の抑泡剤を含むであろう。抑泡剤として利用されるとき、モノカルボン脂肪酸、及びその塩は、典型的には、最大で洗剤組成物の５重量％の量で存在するであろう。好ましくは、０．５％〜３％の脂肪モノカルボン酸塩抑泡剤が利用される。シリコーン抑泡剤は、典型的には、最大で洗剤組成物の２．０重量％の量で利用されるが、より高い量が使用されてもよい。モノステアリルリン酸塩泡抑制剤は、概して、組成物の０．１重量％〜２重量％の範囲の量で利用される。炭化水素抑泡剤は、典型的には、０．０１％〜５．０％の範囲の量で利用されるが、より高い濃度を使用することができる。アルコール石鹸泡抑制剤は、典型的には、完成した組成物の０．２％〜３重量％で使用される。
真珠光沢剤。国際公開第２０１１／１６３４５７号に記載のような真珠光沢剤を本発明の組成物に組み込んでもよい。
香料。好ましくは、本組成物は香料を、好ましくは０．００１〜３重量％、最も好ましくは０．１〜１重量％の範囲で含む。香料の多数の好適な例がＣＦＴＡ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ発行のＣＴＦＡ（Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９２ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｙｅｒｓ Ｇｕｉｄｅ、及びＳｃｈｎｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．発行のＯＰＤ １９９３ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｂｕｙｅｒｓ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ ８０ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎに提供されている。例えば４、５、６、７種又はそれ以上の複数の香料成分が本発明の組成物中に存在するのが通常である。香料混合物において、好ましくは１５〜２５重量％はトップノートである。トップノートはＰｏｕｃｈｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ ６（２）：８０［１９９５］）に定義されている。好ましいトップノートとしては、ローズオキシド、柑橘油、酢酸リナリル、ラベンダー、リナロール、ジヒドロミルセノール及びシス−３−ヘキサノールが挙げられる。
クリーニング組成物の製造及び使用プロセス
本発明は、上記の変異体の少なくとも１つを得る工程と、それを助剤又はその混合物と混合する工程とを含む、上記の組成物の製造方法も提供する。
本発明のクリーニング組成物は、固体、粉末、液体、錠剤又はゲルのような任意の好適な形態で配合され、変異体及び助剤の混合は、配合者が選択した任意の好適なプロセスによって実施され得る（米国特許第５，８７９，５８４号、同第５，６９１，２９７号、同第５，５７４，００５号、同第５，５６９，６４５号、同第５，５６５，４２２号、同第５，５１６，４４８号、同第５，４８９，３９２号、同第５，４８６，３０３号、同第４，５１５，７０５号、同第４，５３７，７０６号、同第４，５１５，７０７号、同第４，５５０，８６２号、同第４，５６１，９９８号、同第４，５９７，８９８号、同第４，９６８，４５１号、同第５，５６５，１４５号、同第５，９２９，０２２号、同第６，２９４，５１４号及び同第６，３７６，４４５号参照）。
一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、錠剤、カプセル、分包剤、パウチ、及び多区画パウチなどの単位用量形態で提供される。一部の実施形態では、単位用量形式は、多区画パウチ（すなわち他の単位用量形式）内の成分を制御放出するよう設計される。好適な単位用量及び制御放出形式は、当該技術分野において既知である（単位用量及び制御放出形式での使用に好適な材料に関しては、例えば、欧州特許第２ １００ ９４９号、国際公開第０２／１０２９５５号、米国特許第４，７６５，９１６号及び同第４，９７２，０１７号、及び国際公開第０４／１１１１７８号を参照されたい）。一部の実施形態では、単位用量形態は、水溶性フィルム又は水溶性パウチで包装された錠剤として提供される。様々な形態の単位投与法が欧州特許第２ １００ ９４７号に提供され、及び当該技術分野において既知である。好ましい多区画パウチにおいて、プロテアーゼ変異体は、更なるプロテアーゼ酵素、第１洗浄リパーゼ酵素、セルラーゼ酵素、アミラーゼ酵素、漂白剤成分、ｐＨ調節剤、布地色調染料、光学的光沢剤及び非イオン性界面活性剤、又はこれらの混合物の１つ以上とは別の区画にある。
使用方法
本発明は、表面、特に布地を処理する方法も提供し、この方法は上記の変異体の少なくとも１つと助剤とを含む水性リカーを表面に接触させる工程を含む。典型的には、プロテアーゼ変異体及び助剤は、本発明の組成物を水に添加することによって洗浄液を形成するため水に添加される。本発明の方法で処理される表面は、食器、洗濯物、硬質表面、コンタクトレンズ等のようないかなる布地ケア又はホームケアの洗浄対象表面であってもよい。一部の実施形態では、未希釈形態の又は好ましくは洗浄液に希釈された状態の本発明のクリーニング組成物の少なくとも１つの実施形態に表面の少なくとも一部を接触させた後、この表面を任意追加的に洗浄及び／又はすすぐ。本発明の目的上、「洗浄すること」は、浸漬すること、擦ること、及び機械的洗浄を包含するがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本発明のクリーニング組成物は、溶液中約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度で使用される。洗浄溶媒が水である一部の実施形態では、水温は、典型的には約５℃〜約９０℃の範囲である。
本発明は、クリーニングの必要がある物品又は表面（例えば、硬質表面）をクリーニング又は洗浄する方法を提供し、こうした方法としては、これらに限定するものではないが、食器類、食卓用食器類、布地物品、洗濯物物品、パーソナルケア物品等のクリーニング又は洗浄方法、及び硬質若しくは軟質表面（例えば、物品の硬質表面）のクリーニング又は洗浄方法が挙げられる。
一部の実施形態では、本発明は、クリーニングの必要がある物品、物体、又は表面をクリーニングする方法を提供し、この方法は、物品又は表面（又は物品又は表面のクリーニングが望ましい部分）を、少なくとも１種の本発明の変異型サブチリシンプロテアーゼ又は本発明の組成物に、十分な時間にわたって及び／又は物品、物体若しくは表面を望ましい程度まで洗浄するために好適な及び／又は有効な条件下で、接触させる工程を含む。このような方法の一部は、物品、物体、又は表面を水ですすぐ工程を更に含む。このような方法の一部では、クリーニング組成物は食器洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は食器類又は食卓用食器類である。本明細書で使用するとき、「食器類」は、食品を給仕する際又は食べる際に一般的に使用される物品である。食器類は、これらに限定するものではないが、例えば深皿、小皿、カップ、椀等のようなものであり得る。本明細書で使用するとき、「食卓用食器」はより広義の用語であり、これらに限定するものではないが、例として深皿、刃物類、ナイフ、フォーク、スプーン、箸、ガラス食器、水差し、ソース入れ、飲用容器、給仕用具等が挙げられる。「食卓用食器類」は食品を給仕する又は食べるための上記又は類似物品を包含することを意図する。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物及び／又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品又は物体は、食器又は食卓用食器類である。このような方法の一部では、クリーニング組成物は、洗濯洗剤組成物（例えば、粉末洗濯洗剤組成物又は液体洗濯洗剤組成物）であり、クリーニングされる物品は布地物品である。その他の一部の実施形態では、クリーニング組成物は洗濯物前処理用組成物である。クリーニング組成物は、硬質表面クリーナーを含んでもよい。
一部の実施形態では、本発明は、それぞれに任意追加的にクリーニング又は洗浄が必要な布地物品をクリーニング又は洗浄する方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、布地又は洗濯物洗浄組成物を包含するがこれに限定されない変異型プロテアーゼを含む組成物、及びクリーニングが必要な布地物品又は洗濯物物品とを準備する工程と、この布地物品又は洗濯物物品（又は物品のクリーニングが望ましい部分）を、布地又は洗濯物物品を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するために十分及び／又は有効な条件下で、組成物に接触させる工程とを含む。
一部の実施形態では、本発明は、任意追加的にクリーニングの必要がある物品又は表面（例えば硬質表面）をクリーニング又は洗浄する方法を提供し、この方法は、クリーニング又は洗浄すべき物品又は表面を準備する工程と、この物品又は表面（又は物品又は表面のクリーニング又は洗浄が望ましい部分）を、少なくとも１種の本発明のサブチリシン変異体又はこのようなサブチリシン変異体を少なくとも１種含む本発明の組成物に、十分な時間にわたって及び／又はその物品若しくは表面を望ましい程度まで洗浄するために十分及び／又は有効な条件下で、接触させる工程とを含む。このような組成物としては、これらに限定するものではないが、例えば、本発明のクリーニング組成物又は洗剤組成物（例えば、食器手洗い用洗剤組成物、食器手洗い用クリーニング組成物、洗濯洗剤又は布地洗剤又は洗濯物若しくは布地クリーニング組成物、液体洗濯洗剤、液体自動食器洗浄用洗剤組成物、洗濯用補助クリーニング又は洗剤組成物、洗濯物クリーニング添加剤、及び洗濯物部分前処理用組成物（laundry pre-spotter composition）等が挙げられる。一部の実施形態では、本方法は、特に追加のクリーニング又は洗浄が望ましい場合に、１回以上繰り返される。例えば、場合によっては、本方法は任意に、物品又は表面を、その物品又は表面を望ましい程度にクリーニング又は洗浄するために十分又は有効な時間にわたって、少なくとも１種の変異型プロテアーゼ又は組成物に接触させ続ける工程を更に含む。一部の実施形態では、本方法は、物品又は表面を水及び／又は別の液体ですすぐ工程を更に含む。一部の実施形態では、本方法は、物品又は表面を少なくとも１種の本発明の変異型プロテアーゼ又は本発明の組成物と再度接触させる工程と、その物品又は表面を、望ましい程度にクリーニング又は洗浄するために十分又は有効な時間にわたって、少なくとも１種の変異型プロテアーゼ又は組成物に接触させ続ける工程とを更に含む。一部の実施形態では、クリーニング組成物は食器洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法の一部の実施形態では、クリーニング組成物は、自動食器洗浄用洗剤組成物又は食器手洗い用洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は食器又は食卓用食器類である。本方法の一部の実施形態では、クリーニング組成物は洗濯洗剤組成物であり、クリーニングされる物品は布地物品である。
本発明は、食卓用食器又は食器類を自動食器洗浄機内で洗浄する方法も提供し、この方法は、自動食器洗浄機を準備する工程と、本発明のサブチリシン変異体又は本発明の組成物を少なくとも１種含む自動食器洗浄用組成物を、食卓用食器又は食器類を洗浄機内で洗浄するのに十分な量で配置する（例えば、組成物を、洗浄機内の、適切な又は備え付けの洗剤区画又はディスペンサーに配置することによって）工程と、洗浄機内に食器又は食卓用食器類を配置する工程と、食卓用食器又は食器が洗浄されるように洗浄機を操作する工程（例えば、製造元の取扱説明書に従って操作する工程）とを含む。一部の実施形態では、本方法は本明細書に記載されているいかなる自動食器洗浄用組成物も包含し、この組成物は、限定するものではないが、本明細書で提供されるサブチリシン変異体を少なくとも１種含む。自動食器洗浄用組成物の使用量は、製造業者の指示又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含むいかなる形態の自動食器洗浄用組成物（例えば、液体、粉末、固体、ゲル、錠剤等）も使用できる。
本発明は、任意追加的にクリーニングの必要がある表面、物品又は物体をクリーニングする方法も提供し、この方法は、物品又は表面（又は物品又は表面のクリーニングが望ましい部分）を、未希釈形態又は洗浄液に希釈した状態の少なくとも１種の本発明の変異型サブチリシンプロテアーゼ又は本発明のクリーニング組成物に、十分な時間にわたって及び／又は物品若しくは表面を望ましい程度までクリーニング又は洗浄するために十分又は有効な条件下で、接触させる工程を含む。所望の場合には、その後、表面、物品、又は物体を（任意に）洗浄し及び／又はすすいでもよい。本発明の目的に関し、「洗浄」には、例えば擦ること及び機械的撹拌が包含されるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、クリーニング組成物は、約５００ｐｐｍ〜約１５，０００ｐｐｍの濃度の溶液（例えば水溶液）として採用される。洗浄溶媒が水である場合、水温は、典型的には、約５℃〜約９０℃であり、表面、物品又は物体が布地を含む場合、水と布地との質量比は、典型的には約１：１〜約３０：１である。
本発明は、洗濯物又は布地物品を洗濯機でクリーニングする方法も提供し、この方法は、洗濯機を準備する工程と、洗濯物又は布地物品を洗濯機内でクリーニングするのに十分な量の本発明のサブチリシン変異体を少なくとも１種含む洗濯洗剤組成物を配置する工程（例えば、組成物を、洗濯機内の、適切な又は備え付けの洗剤区画又はディスペンサーに配置する工程）と、洗濯機内に洗濯物又は布地物品を配置する工程と、洗濯物又は布地物品がクリーニングされるように洗濯機を操作する工程（例えば、製造元の取扱説明書に従って操作する工程）とを含む。本発明の方法は、限定するものではないが、本明細書で提供される少なくとも１種の任意のサブチリシン変異体を含有する本明細書に記載の任意の洗濯物洗浄用洗剤組成物を包含する。洗濯洗剤組成物の使用量は、製造業者の指示又は提案に従って容易に決定することができ、本明細書に記載のものを含めて、本発明の変異型プロテアーゼを少なくとも１種含むいかなる形態の洗濯組成物（例えば、固体、粉末、液体、錠剤、ゲル等）も使用できる。
実験
本発明は、以降の実施例により、更に詳細に記載されるが、この記載により本発明の範囲が請求されたものとして、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
以降の実験についての開示では、以下の略記が適用される：ＰＩ（性能指数）、ｐｐｍ（１００万分率）、Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）、ｎＭ（ナノモル濃度）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、μｌ及びμＬ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメートル）、ｎｍ（ナノメートル）、Ｕ（ユニット）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈ及びｈｒ（時間）、℃（セルシウス度）、ＱＳ（十分量）、ＮＤ（実施せず）、ｒｐｍ（毎分回転数）、ＧＨ（ドイツ硬度）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｃＤＮＡ（コピー又は相補的ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（単鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ｗ／ｖ（体積対重量）、ｖ／ｖ（体積対体積）、ｗ／ｗ（重量対重量）、ｇ（重さ）、ＯＤ（光学密度）、ｐｐｍ（１００万分率）、ダルベッコリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）、ＳＯＣ（２％バクトトリプトン、０．５％バクト酵母抽出物、１０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＫＣｌ）、テリフィック培地（ＴＢ、１２ｇ／Ｌバクトトリプトン、２４ｇ／Ｌグリセロール、２．３１ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、及び１２．５４ｇ／Ｌ Ｋ２ＨＰＯ４）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）、Ａ４０５（４０５ｎｍでの吸光度）、Ｖｍａｘ（酵素触媒反応の飽和最大速度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水［１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのナトリウムリン酸緩衝液、ｐＨ ７．２］）、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、トリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ−［２−エタンスルホン酸］）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水）、トリス−ＨＣｌ（トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン−塩酸塩）、トリシン（Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−グリシン）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロ−ヘキシルアミノ）エタン−スルホン酸）、ＴＡＰＳ（３−［トリス−（ヒドロキシメチル）−メチル］−アミノ−プロパンスルホン酸）、ＣＡＰＳ（３−（シクロ−ヘキシルアミノ）−プロパン−スルホン酸、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ＤＴＴ（１，４−ジチオ−ＤＬ−トレイトール）、ＳＡ（シナピン酸（ｓ，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシケイ皮酸）、ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）、Ｇｌｕｔ及びＧＳＨ（還元グルタチオン）、ＧＳＳＧ（酸化グルタチオン）、ＴＣＥＰ（トリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン）、Ｃｉ（キュリー）、ｍＣｉ（ミリキュリー）、μＣｉ（マイクロキュリー）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（逆相高速液体クロマトグラフィー）、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離／イオン化法−飛空時間型）、Ｔｓ（トシル）、Ｂｎ（ベンジル）、Ｐｈ（フェニル）、Ｍｓ（メシル）、Ｅｔ（エチル）、Ｍｅ（メチル）、Ｔａｑ（サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼ）、クレノウ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント（クレノウ）フラグメント）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ｂｌａ（β−ラクタマーゼ又はアンピシリン耐性遺伝子）、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）、Ｂａｓｅｃｌｅａｒ（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ ＢＶ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｉｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、Ａｒｇｏ（Ａｒｇｏ ＢｉｏＡｎａｌｙｔｉｃａ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ，ＮＪ）、Ｓｅｉｔｚ ＥＫＳ（ＳｅｉｔｚＳｃｈｅｎｋ Ｆｉｌｔｅｒｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ｂａｄ Ｋｒｅｕｚｎａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐａｌｌ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ ａｎｄ Ｂａｄ Ｋｒｅｕｚｎａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｒａｎｃｈｏ，ＣＡ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）、Ａｃｃｅｌｒｙｓ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）、Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃｏ．，Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）、ＣＦＴ（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｐ＆Ｇ ａｎｄ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ（Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ，Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈａｌｆｏｎｔ Ｓｔ．Ｇｉｌｅｓ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）、ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）、ＯＸＯＩＤ（Ｏｘｏｉｄ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、Ｍｅｇａｚｙｍｅ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｒｅｌａｎｄ Ｌｔｄ．，Ｂｒａｙ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｐａｒｋ，Ｂｒａｙ，Ｃｏ．，Ｗｉｃｋｌｏｗ，Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ Ｏｙ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、Ｋｅｌｃｏ（ＣＰ Ｋｅｌｃｏ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）、Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）、（ＮＥＮ（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａ ＡＳ（Ｐｈａｒｍａ ＡＳ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、Ｄｙｎａｌ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ，ＴＸ）、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ及び／又はＣｌｏｎｔｅｃｈ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ，ＮＣ）、Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ（Ｏｌｉｇｏｓ Ｅｔｃ．Ｉｎｃ，Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ，ＯＲ）、Ｂａｃｈｅｍ（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）、Ｏｘｏｉｄ（Ｏｘｏｉｄ Ｉｎｃ．，Ｏｇｄｅｎｓｂｕｒｇ，ＮＹ）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＮＥＢ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｔａｋａｒａ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．Ｏｔｓｕ，Ｊａｐａｎ）、Ｒｏｃｈｅ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｌ．，Ｓａｃｏ，Ｍａｉｎｅ）、Ａｐｔａｇｅｎ（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ）、Ｓｏｒｖａｌｌ（Ｓｏｒｖａｌｌ ｂｒａｎｄ，ｆｒｏｍ Ｋｅｎｄｒｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａｓｈｅｖｉｌｌｅ，ＮＣ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ Ｈａｎｄｅｌ（Ｓｉｅｇｆｒｉｅｄ Ｈａｎｄｅｌ ＡＧ，Ｚｏｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｍａｒｓｈ（Ｍａｒｓｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｎｅａｒｔ ＧｍｂＨ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｉｏ−Ｔｅｋ（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）、（Ｂｉａｃｏｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、ＳｙｎＰｅｐ（ＳｙｎＰｅｐ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｂｒａｎｄ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｎｇｏｅｓ，ＮＪ）、Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、Ｄｉｏｎｅｘ（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）、Ｍｏｎｓａｎｔｏ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ（Ｗｉｎｔｅｒｓｈａｌｌ ＡＧ，Ｋａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＢＡＳＦ（ＢＡＳＦ Ｃｏ．，Ｆｌｏｒｈａｍ Ｐａｒｋ，ＮＪ）、Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ Ｐｅｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）、Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，
Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）、Ｓｔｅｐａｎ（Ｓｔｅｐａｎ，Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、Ｃｌａｒｉａｎｔ（Ｃｌａｒｉａｎｔ，Ｓｕｌｚｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｅｏｌｉｔｅ（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｅｏｌｉｔｅ Ｌｔｄ．，Ｇｒａｙｓ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）、Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ（Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｓｏｌｖａｙ（Ｓｏｌｖａｙ，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、３Ｖ Ｓｉｇｍａ（３Ｖ Ｓｉｇｍａ，Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）、Ｉｎｎｏｓｐｅｃ（Ｉｎｎｏｓｐｅｃ，Ｅｌｌｅｓｍｅｒｅ Ｐｏｒｔ，ＵＫ）、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ（Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓ，Ｖｌｉｓｓｉｇｇｅｎ−Ｏｓｔ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｂａｒｒｙ，ＵＫ）、Ｅｎｉｃｈｅｍ（Ｅｎｉｃｈｅｍ Ｉｂｅｒｉｃａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ，ＮＶ，Ｄｅｌｆｔ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ）、Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ Ｉｎｃ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）、ＲＢ（Ｒｅｃｋｉｔｔ−Ｂｅｎｃｋｉｓｅｒ，Ｓｌｏｕｇｈ，ＵＫ）、及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）。
本明細書で使用するとき、一部の記載では３桁の数値表記を提供する目的で冒頭の各桁に「０」が示される（例えば、「００１」は「１」と同じであり、すなわち「Ａ００１Ｃ」は「Ａ１Ｃ」と同じである）。一部の一覧では、冒頭の「０」は記載されない。加えて、本明細書で使用するとき、「Ｘ」は任意のアミノ酸を指す。
本明細書で提供される、例示された洗剤組成物において、酵素濃度は、組成物の合計重量に基づき純粋な酵素濃度として表現され、かつ別途記載のない限り、洗剤成分は組成物の合計重量に基づき表現される。本明細書で略記され識別される用語は以下の意味を持つ：
Figure 2014522235
Figure 2014522235
Figure 2014522235
北米（ＮＡ）及び西ヨーロッパ（ＷＥ）の強力液体洗濯（ＨＤＬ）洗剤に関しては、予め計量した液体洗剤（ガラス瓶内）を、９５℃のウォーターバスに２時間にわたって配置することで、市販の洗剤中に存在する酵素の加熱不活性化を実施する。ＮＡ及びＷＥの自動食器洗浄（ＡＤＷ：auto dish washing）洗剤を加熱不活性化するためのインキュベート時間は８時間である。不活性化率を正確に測定するために、未加熱及び加熱洗剤のどちらも、洗剤を溶解させて５分以内にアッセイにする。酵素活性はＡＡＰＦアッセイにより試験する。
加熱不活性化した洗剤の酵素活性の試験に関しては、洗剤の希釈標準溶液は加熱不活性化母液から調製した。所望の条件に一致するよう、適量の水硬度（例えば、０．１０ｇ／Ｌ又は０．２１ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ又は１２ｇｐｇ））及び緩衝剤を洗剤溶液に加える。瓶をボルテックスにかけるか反転させるかして溶液を混合する。下の表Ａはいくつかの洗浄組成物に関する情報を与える。一部の実験では、追加の及び／又は他の市販の洗剤が以下の実施例で使用されることが見出される。
表Ａは、布地の洗濯に好適な本発明に従って製造された顆粒型洗濯洗剤組成物を提供する。
Figure 2014522235
 １ ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
２ −ＮＨにつき２０個のエトキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）。
３ 両親媒性グリース洗浄ポリマーは、−ＮＨにつき２４個のエトキシル基、及び−ＮＨにつき１６個のプロポキシル基を有するポリエチレンイミン（ＭＷ＝６００）である。
４ 次の構造を有する可逆性プロテアーゼ抑制剤。
Figure 2014522235
 ５エトキシル化チオフェン色調染料については米国特許第７，２０８，４５９（Ｂ２）号に記述されている。
表Ａ中、製品に添加した活性タンパク質の割合（％）として表される冷水用プロテアーゼ（本発明のもの）を除き、すべての酵素濃度は酵素原材料の割合（％）として表される。
表Ｂは、トップローディング式自動洗濯機に好適な顆粒洗濯洗剤組成物（洗剤組成物７〜９）、及びフロントローディング式洗濯機に好適な顆粒型洗濯洗剤組成物（洗剤組成物１０〜１１）を提供する。試験したＧＧ３６プロテアーゼ変異体、及び／又は本発明の冷水用プロテアーゼ変異体をこれらの配合物に別個に加える。
Figure 2014522235
Figure 2014522235
表Ｂにおいて、界面活性剤成分は、限定するものではないがＢＡＳＦ（例えば、ＬＵＴＥＮＳＯＬ（登録商標））、Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔｅｐａｎ、Ｈｕｎｔｓｍａｎ、及びＣｌａｒｉａｎｔ（例えば、ＰＲＡＥＰＡＧＥＮ（登録商標））が挙げられる、任意の好適な供給元から得ることができる。ゼオライトはＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｅｏｌｉｔｅなどの供給元から得ることができる。クエン酸及びクエン酸ナトリウムは、Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒなどの供給元から得ることができる。過炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及びセスキ炭酸ナトリウムは、Ｓｏｌｖａｙなどの供給元から得ることができる。アクリル酸／マレエートコポリマーは、ＢＡＳＦなどの供給元から得ることができる。カルボキシメチルセルロース及び疎水変性カルボキシメチルセルロースは、ＣＰＫｅｌｃｏなどの供給元から得ることができる。Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤２６０は、３Ｖ Ｓｉｇｍａから得ることができる（例えば、ＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）、ＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）２Ｍ／Ｇ、ＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）２ＭＧ／ＬＴ Ｅｘｔｒａ、又はＯＰＴＩＢＬＡＮＣ（登録商標）Ｅｃｏｂｒｉｇｈｔ）。Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン二コハク酸四ナトリウムは、Ｉｎｎｏｓｐｅｃなどの供給元から得ることができる。テレフタレートコポリマーは、Ｃｌａｒｉａｎｔから得ることができる（例えば、ＲＥＰＥＬＯＴＥＸ ＳＦ ２）。加えて、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸は、Ｔｈｅｒｍｐｈｏｓから得ることができる。オキサジリジン系漂白増進剤は、式中、Ｒ１＝２−ブチルオクチルである以下の構造を有するものであり、米国特許第２００６／００８９２８４（Ａ１）号に従って製造される。
Figure 2014522235
酵素、ＮＡＴＡＬＡＳＥ（登録商標）、ＴＥＲＭＡＭＹＬ（登録商標）、ＳＴＡＩＮＺＹＭＥ ＰＬＵＳ（登録商標）、ＣＥＬＬＵＣＬＥＡＮ（登録商標）及びＭＡＮＮＡＷＡＹ（登録商標）は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓから得ることができる。フタロシアニンテトラスルホン酸亜鉛は、Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから得ることができる（例えば、ＴＩＮＯＬＵＸ（登録商標）ＢＭＣ）。抑泡剤粒は、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇから得ることができる。これらの洗剤組成物において、ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
表Ｃ〜Ｅは、洗濯機に好適な更なる顆粒型洗剤組成物を提供する（洗剤３６ａ〜ｎ）。試験したＧＧ３６プロテアーゼ変異体、及び／又は本発明の冷水用プロテアーゼ変異体をこれらの配合物に別個に加える。
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表Ｃ、Ｄ、Ｅ中の洗剤組成物３６ａ〜ｎに関する注記：
界面活性剤材料は、次の企業から得ることができる：ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（Ｌｕｔｅｎｓｏｌ（登録商標））；Ｓｈｅｌｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）；Ｓｔｅｐａｎ（Ｎｏｒｔｈｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）；Ｈｕｎｔｓｍａｎ（Ｈｕｎｔｓｍａｎ，Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ，Ｕｔａｈ，ＵＳＡ）；Ｃｌａｒｉａｎｔ（Ｓｕｌｚｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ（Ｐｒａｅｐａｇｅｎ（登録商標）））。
ゼオライトはＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｚｅｏｌｉｔｅ（ＵＫ）Ｌｔｄ（Ｇｒａｙｓ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）から得ることができる。
クエン酸及びクエン酸ナトリウムは、Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から得ることができる。
過炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム及びセスキ炭酸ナトリウムは、Ｓｏｌｖａｙ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から得ることができる。
アクリル酸／マレエートコポリマーは、ＢＡＳＦ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得ることができる。
カルボキシメチルセルロース及び疎水変性カルボキシメチルセルロースは、ＣＰＫｅｌｃｏ（Ａｒｎｈｅｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得ることができる。
Ｃ．Ｉ．蛍光増白剤２６０は、３Ｖ Ｓｉｇｍａ（Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）からＯｐｔｉｂｌａｎｃ（登録商標）Ｏｐｔｉｂｌａｎｃ（登録商標）２Ｍ／Ｇ，Ｏｐｔｉｂｌａｎｃ（登録商標）２ＭＧ／ＬＴ Ｅｘｔｒａ，又はＯｐｔｉｂｌａｎｃ（登録商標）Ｅｃｏｂｒｉｇｈｔとして得ることができる。
Ｓ，Ｓ−エチレンジアミン二コハク酸四ナトリウムは、Ｉｎｎｏｓｐｅｃ（Ｅｌｌｅｓｍｅｒｅ Ｐｏｒｔ，ＵＫ）から得ることができる。
テレフタレートコポリマーは、Ｃｌａｒｉａｎｔから商標名Ｒｅｐｅｌｏｔｅｘ ＳＦ ２として入手することができる。
１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸はＴｈｅｒｍｐｈｏｓ（Ｖｌｉｓｓｉｎｇｅｎ−Ｏｏｓｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得ることができる。
オキサジリジン系漂白増進剤は、式中、Ｒ１＝２−ブチルオクチルである以下の構造を有するものであり、米国特許第２００６／００８９２８４（Ａ１）号に従って製造される。
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酵素Ｎａｔａｌａｓｅ（登録商標）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（登録商標）、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ（登録商標）、Ｃｅｌｌｕｃｌｅａｎ（登録商標）及びＭａｎｎａｗａｙ（登録商標）は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から得ることができる。
亜鉛フタロシアニンテトラスルホネートは、Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からＴｉｎｏｌｕｘ（登録商標）ＢＭＣとして入手することができる。
抑泡剤顆粒はＤｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｂａｒｒｙ，ＵＫ）から得ることができる。
ランダムグラフトコポリマーは、ポリエチレンオキシド主鎖と複数のポリビニルアセテート側鎖とを有する、ポリビニルアセテートグラフト化ポリエチレンオキシドコポリマーである。ポリエチレンオキシド主鎖の分子量は約６０００であり、ポリエチレンオキシドとポリビニルアセテートとの重量比は約４０：６０であり、５０個のエチレンオキシド単位当たりのグラフト点は１以下である。
（実施例１）
アッセイ及び試験方法
本実施例は、本発明の展開に使用される様々な試験方法及びアッセイを記載する。提供されるプロトコール由来の任意の変法が関連する実施例に示される。
アッセイはＢｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｒｏｂｏｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）又はマルチチャンネルピペット（例えば、Ｒａｉｎｉｎ ＰｉｐｅｔＬｉｔｅ，Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ）及びＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ＭＴＰリーダー（ｔｙｐｅ ３４０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて実施された。
Ａ．試験方法
試験方法１
染料又は顔料材料が本発明の意図する布地色相剤であるか否かを定義するためのプロトコールを以下に記載する。
１）２つのターゴトメーターポットに英国Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ ｕｐｏｎ Ｔｙｎｅの水道水（総硬度約０．２１ｇ／Ｌ（約１２グレイン／米ガロン）、英国ダラム市のＮｏｒｔｈｕｍｂｒｉａｎ Ｗａｔｅｒ，Ｐｉｔｙ Ｍｅ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｃｏ．から供給）を８００ｍＬ注ぎ入れる。
２）ポットをターゴトメーターに挿入する。試験中は水温を３０℃に制御し、撹拌を４０ｒｐｍに設定する。
３）各ポットにＩＥＣ−Ｂ洗剤（ＩＥＣ ６０４５６ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｂａｓｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ Ｔｙｐｅ Ｂ）、ｗｆｋ（Ｂｒｕｇｇｅｎ−Ｂｒａｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から供給）を４．８ｇ加える。
４）２分後、第１のポットに活性着色剤を２．０ｍｇ加える。
５）１分後、５０ｇの平坦な綿肌着（Ｗａｒｗｉｃｋ Ｅｑｕｅｓｔ，Ｃｏｎｓｅｔｔ，Ｃｏｕｎｔｙ Ｄｕｒｈａｍ，ＵＫから供給）を５ｃｍ×５ｃｍの材料見本へと切断して各ポットに加える。
６）１０分後、ポットから排水し、硬度１４．４（イギリスクラーク硬度）を有しカルシウム対マグネシウムのモル比が３：１の冷水（１６℃）を再充填する。
７）２分間すすいだ後、布地を取り出す。
８）同じ処理を用いて工程３〜７を更に３サイクル繰り返す。
９）布地を回収し、屋内で１２時間自然乾燥させる。
１０）Ｄ６５光源及びＵＶＡ遮断フィルタを取り付けたハンターミニスキャン（Hunter Miniscan）スペクトロメーターを使用して材料見本を分析し、ハンターａ（赤−緑軸）及びハンターｂ（黄−青軸）値を得る。
１１）各組の布地についてハンターａ及びハンターｂ値の平均値を計算する。着色剤で処理した評価対象布地がａ軸又はｂ軸のいずれかにおいて平均で０．２単位より大きい色相の差を示した場合、本発明の目的のための布地色相剤であると判断される。
試験方法２
試験方法２では、顆粒型洗剤組成物１０（上記表Ｄを参照されたい）を用い、以下に記載のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施した。洗濯洗剤を、０．２１ｇ／Ｌ（１２ｇｐｇ）の硬度を有する水に溶解させ、１６℃の温度に調整し、所望のプロテアーゼ変異体酵素を添加する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイに従って酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、プロテアーゼ変異体酵素の性能を、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢ．レンタスのＧＧ３６サブチリシン酵素と比較することで決定する。すべての条件で、酵素の使用濃度は０．１〜５ｐｐｍ範囲である。プロテアーゼ変異体酵素のうち、性能指数１．１以上のものが冷水用プロテアーゼとして示される。
試験方法３
試験方法３では、顆粒型洗剤組成物７（上記表Ｄを参照されたい）を用い、以下に記載のＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。洗濯洗剤を、０．１０ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）の硬度を有する水に溶解させ、１６℃の温度に調整し、所望のＧＧ３６プロテアーゼ変異体酵素を添加する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイに従ってプロテアーゼＧＧ３６の酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、プロテアーゼＧＧ３６の変異型酵素の性能を、配列番号２のアミノ酸配列を有するＢ．レンタスのＧＧ３６サブチリシン酵素と比較することで決定する。すべての条件で、酵素の使用濃度は０．１〜５ｐｐｍ範囲である。プロテアーゼＧＧ３６の変異体のうち、性能指数１．１以上のものが冷水用プロテアーゼとして示される。
試験方法４
試験方法４では、顆粒型洗剤組成物７（上記表Ｄを参照されたい）を用い、ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。洗濯洗剤を、０．１０ｇ／Ｌ（６ｇｐｇ）の硬度を有する水に溶解させ、１６℃の温度に調整し、所望のＧＧ３６プロテアーゼ変異体酵素を添加する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイに従ってプロテアーゼＧＧ３６の酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、ＧＧ３６プロテアーゼ変異体酵素の性能を参照酵素ＧＧ３６−Ａ１５８Ｅの性能と比較することによって決定され、ＧＧ３６−Ａ１５８Ｅ参照酵素は配列番号２のＢ．レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼのアミノ酸配列の位置１５８でアラニンがグルタミン酸へと単独置換（すなわち、Ａ１５８Ｅ変異）されており、すべての場合で酵素投与量は０．１〜５ｐｐｍの範囲である。性能指数１．０以上のプロテアーゼＧＧ３６変異体が、冷水用プロテアーゼとして示される。
試験方法６
試験方法６では、表１〜２の洗剤３６ａ〜３６ｎのうちのいずれか１種を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。表１〜２に記載の水硬度を有する水に洗剤を溶解させ、水温を１６℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイに従って酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、変異体の性能を配列番号２の酵素の性能と比較することで決定され、すべての場合で酵素投与量は０．１〜５ｐｐｍの範囲である。酵素のうち、性能指数１．１以上のものが冷水用プロテアーゼとして示される。
試験方法７
試験方法７では、表１の洗剤のいずれか１種を用いてＢＭＩマイクロスウォッチアッセイを実施する。表１に記載の水硬度及び緩衝剤を有する水に洗剤を溶解し、水温を１６℃又は２５℃に調整する。次いで、記載されるＢＭＩマイクロスウォッチアッセイに従って酵素変異体の性能を測定する。性能指数は、変異体の性能を配列番号２の酵素の性能と比較することで決定され、すべての場合で酵素投与量は０．１〜５ｐｐｍの範囲である。酵素のうち、性能指数１．１以上のものが冷水用プロテアーゼとして示される。
Ｂ．アッセイ
タンパク質含量を測定するためのＴＣＡアッセイ
加湿条件下でエアレーションしながら２５０〜３００ｒｐｍで振盪し、Ｂ．サブチリスを３７℃で２〜３日増殖させた。酵素を含有している培養上清から遠心沈降及び／又はろ過により細胞を除去した。ＴＣＡ沈降アッセイを用い、プロテアーゼ／タンパク質／酵素濃度を測定した。１００μＬ／ウェルの０．２５ＮのＨＣｌを含有させた９６ウェルの平底マイクロタイタープレート（ＭＴＰ；Ｃｏｓｔａｒ ９０１７中結合型透明ポリスチレンプレート）に培養上清のアリコート（２０〜２５ｕＬ）を移した。読み取り「基底値」は、試料を混合した５秒後に４０５ｎｍで光散乱／吸光を読み取ることで測定した。ＨＣｌを含有しているプレートに１００μＬ／ウェルの３０％（重量／体積）のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加え、室温で１０分間インキュベートし、タンパク質の沈殿を促進させた。試料を混合した５秒後に、４０５ｎｍでこの「試験」プレートの光散乱／吸光度を測定した。試料における濁度／光散乱の増加は、培養上清中の沈殿可能なタンパク質の合計量に相関する。「基底」読み取り値（ＨＣｌの添加後に得られる）を「試験」読み取り値（ＴＣＡの添加後に得られる）から減算することで算出し、存在する総タンパク質を相対的に測定した。タンパク質沈殿とタンパク質濃度を関連づける換算率を、既知濃度のＧＧ３６標準について求めた。沈殿は濃度と線形関係にあることから、この換算率はすべての変異体に使用できる。必要に応じて、ＴＣＡ読み取り値を比活性が既知であるクローンのＡＡＰＦプロテアーゼアッセイ（以下に記載）により較正することで、検量線を作成することができる。しかしながら、ＴＣＡ結果は、５０〜５００百万分率のタンパク質濃度（ｐｐｍ）（ここで、１ｐｐｍは１ｍｇ／Ｌに相当する）に対して線形であることから、所望の性能を有する変異体を選択するために、酵素性能に対して直接プロットすることができる。
ＡＡＰＦプロテアーゼアッセイ
セリンプロテアーゼ変異体、より具体的にはサブチリシン変異体のプロテアーゼ活性を測定するために、Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニル−ｐ−ニトロアニリド（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ）の加水分解を計測した。使用した試薬溶液は、以下のものであった：０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ ８．６）（トリス希釈緩衝液）、１ｍＭのＣａＣｌ２及び０．００５％のＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０を含有している１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ ８．６）（トリス／Ｃａ緩衝液）、並びに１６０ｍＭのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ／ＤＭＳＯ（ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ保存溶液）（Ｓｉｇｍａ：Ｓ−７３８８）。ｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液を調製するために、１ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ原液を１００ｍＬのトリス／Ｃａ緩衝液に加え、少なくとも１０秒にわたってウェルをよく混合した。１０μＬの希釈プロテアーゼ溶液を９６ウェルＭＴＰの各ウェルに加え、直ちに１ｍｇ／ｍＬのｓｕｃ−ＡＡＰＦ−ｐＮＡ希釈標準溶液１９０μＬを加えてアッセイを実施した。溶液を５秒にわたって混合し、吸光度の変化を、２５℃にて、４０５ｎｍで、ＭＴＰリーダーの動的解析モードにより読み取りした（５分毎に２５回読み取り）。プロテアーゼ活性はＡＵとして表記される（活性＝ΔＯＤ・ｍｉｎ−１ ｍｌ−１）。
ＢＭＩマイクロスウォッチアッセイ（ＢＭＩアッセイ）
９６ウェルのマイクロタイタープレート（ＭＴＰ；Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６４１）中に入れる、予洗し、パンチで型通りに切り取り、血液、ミルク及びインク（ＢＭＩ）により染色した直径５．５ミリメートルのマイクロスウォッチ（ＥＭＰＡ１１６）を、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｅｓｔｍａｔｅｒｉａｌｓ ＢＶ（Ｖｌａａｒｄｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得た。
表１に示すように、表１の洗剤は、洗剤組成物１０４及び１０５については適切なレベルの水硬度（３：１ Ｃａ：Ｍｇ．−ＣａＣｌ２：ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）のＭｉｌｌｉ−Ｑ水中で、また洗剤組成物１０１、１０２、１０３、１０６及び１０７については２ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ １０．３中で、少なくとも３０分間撹拌することによって調製した。この洗剤を遠心分離及び濾過して沈殿を除去し、１６℃で実施するアッセイに使用する前に氷上で３０分冷却した。
酵素濃度は、精製ＧＧ３６標準と比較することで、２０〜５０ｐｐｍの範囲の所望の一定濃度に均一化させた。ＡＡＰＦを基質として用いた場合のＧＧ３６の比活性を使用して、ＴＣＡ値を減算した基底値を酵素濃度（ｐｐｍ）に変換した。酵素濃度をｐｐｍで測定してから、単純な公式を利用して、所望の貯蔵酵素濃度を得るために一定量（３００〜６００μＬ）の緩衝液に加えるのに必要とされる各変異体の量を算出した：
ｘ＝（対象ｐｐｍ）（ｖｂ）／（ｙ−対象ｐｐｍ）
式中、ｘ＝酵素量，ｙ＝酵素濃度，ｖｂ＝緩衝液量
Ｖｅｒｓｉｓｐａｎ ８チャンネルアームを持つＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｊａｎｕｓロボットを使用し、コンダクティブチップを用い原液プレート（ＴＣＡ酵素濃度アッセイで使用し回収した変異体をプールした、Ａｘｙｇｅｎの深さ半分のウェルプレート）から緩衝液を入れた試験プレートへと様々な容量の酵素を分注した。試料を上下に３回ピペッティングして混合した。均等化したプレートのＡＡＰＦ活性を測定し、母液プレートと比較することで、酵素希釈の正確さを評価し、性格な希釈がなされたか検証した。
均等化させた後、洗剤を充填したＢＭＩマイクロスウォッチプレートに、最終濃度がおよそ２００μＬになるように５〜１５μＬの酵素溶液を添加した。場合によっては、酵素試料は均等化せず、保存用プレートからすべて等しく希釈して濃度範囲０．１〜５ｐｐｍに調製した。この範囲内の濃度の所定の洗剤に対し、クリーニング活性を測定する用量反応曲線から各アッセイに最適な標的濃度を決定した。
ＭＴＰを箔（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で封止し、４℃に設定した冷室中の予め１６℃に設定したｉＥＭＳインキュベーター／振盪器（Ｔｈｅｒｍｏ／Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）において、又はベンチトップで２５℃にて、１４００ｒｐｍで１５〜３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１２０μＬの上清を新しいＭＴＰ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ９０１７）に移し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｒｅａｄｅｒにより６００ｎｍで読み取りした。各値からブランク対照（酵素不含有）の値を減算することで正しい吸光度を得た。
各変異体に関し性能指数（ＰＩ）を算出した。性能指数は、固定酵素濃度でのＧＧ３６クリーニングにより生成された吸光度に対する酵素変異体クリーニングにより生成された上清の吸光度の比率である。ＰＩ値は、所与のプレート上で得られる変異体の吸光度を、対照の吸光度により除算することで算出される。実験室でのスクリーニングで同じ変異体の複数の型が得られた場合、そのＰＩ値を平均して１つの代表値を導出する。１を超える性能指数（ＰＩ）（ＰＩ＞１）は、標準（例えば、ＧＧ３６）と比較して変異体によるより優れたクリーニングを示し、一方、１に等しいＰＩ（ＰＩ＝１）は、変異体が標準と同じに機能することを示し、１未満であるＰＩ（ＰＩ＜１）は、標準よりも劣って機能する変異体を示す。
Figure 2014522235
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 ＊ 文中で記載されるような（３：１ Ｃａ：Ｍｇ）濃度。
性能指数
性能指数は、同じタンパク質濃度下で変異体性能（実測値）と標準酵素性能（理論値）とを比較する。加えて、理論値は、標準プロテアーゼの性能用量反応曲線のパラメーターを用いて算出することができる。
（実施例２）
ＧＧ３６の変異体及びコンビナトリアルライブラリの構築
本例は、Ｂ．サブチリス発現プラスミドｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６を用いてＢ．サブチリスに構築されたＧＧ３６変異体及びライブラリの冷水クリーニングについて記載する。このＢ．サブチリスの発現プラスミドは、以下に示すＧＧ３６発現カセット、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）のＬＡＴプロモーター（Ｐｌａｔ）、並びにレプリカーゼ遺伝子（ｒｅｐｐＵＢ）、ネオマイシン／カナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）及びブレオマイシン耐性マーカー（ｂｌｅｏ）等のｐＵＢ１１０由来の更なる要素（ＭｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１５：９３〜１０３，１９８６）（米国特許第６，５６６，１１２号、図４を参照）を含有する。ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミドマップは国際公開第２０１１１４０３６４号に提供されている。ＧＧ３６発現カセット配列は以下に提供されるものである。
ＧＧ３６のＤＮＡ配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６成熟配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
Figure 2014522235
ＧＧ３６のタンパク質配列（シグナル配列は小文字で示され、プロペプチドは下線の引かれている小文字で示され、及びＧＧ３６成熟型プロテアーゼ配列は大文字で示される）は以下に提供されるものである：
Figure 2014522235
ＤＮＡライブラリ及び変異体は、エクステンションＰＣＲ（国際公開第２０１１１４０３６４号）、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ変異導入（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によって作製されるか、又はＤＮＡ２．０，Ｉｎｃ．又はＧｅｎｅＡｒｔで合成された。ｐＨＰＬＴ−ＧＧ３６プラスミドは、ＧＧ３６変異体遺伝子のクローン化又は変異導入反応に使用された。Ｂ．サブチリスにおけるライブラリ及び変異体の効率的な形質転換のために、１マイクロリットルのライゲーションされたライブラリ産物又は変異導入反応をＩｌｌｕｓｔｒａ Ｔｅｍｐｌｉｐｈｉキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるローリング・サークル増幅を用いて製造業者の指示に従って増幅し、バチルス・サブチリスの形質転換のための多重結合ＤＮＡを作製した。ローリング・サークル増幅産物を１００倍希釈し、Ｂ．サブチルス細胞の形質転換に用いた（遺伝子型：ΔａｐｒＥ，ΔｎｐｒＥ，ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）。形質転換混合物のアリコートを、１．６％のスキムミルク及び１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有しているＬＢプレートに蒔き、３７℃で一晩インキュベートした。続いて、ハローを生じたコロニーを、プラスミドＤＮＡを抽出するため１０μｇ／ｍＬのネオマイシンを含有している１２０μＬのルリアブロス培地に接種した（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎミニプレップキット、Ｑｉａｇｅｎ）。抽出したプラスミドを配列決定して、所望の変異が存在しているか確認した。実施例１（ＴＣＡアッセイ）に記載のようにＢ．サブチルス細胞（遺伝子型：ΔａｐｒＥ、ΔｎｐｒＥ、ａｍｙＥ：：ｘｙｌＲＰｘｙｌＡｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏ）で変異体を発現させ、実施例１に記載のようにＢＭＩマイクロスウォッチクリーニングアッセイを用いて更に特性決定した。下の表中で、洗剤組成物（「洗剤」）は、上記表１に示されるものと対応する。同様に、記載のように、アミノ酸位置はＢＰＮ’の番号付けに従って列挙される。
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Claims (52)

  1. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：
    Figure 2014522235
    サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  2. 前記アミノ酸置換の位置が
    Figure 2014522235
    であり、前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が、配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項１に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  3. 前記アミノ酸置換の位置が
    Figure 2014522235
    から選択され、前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項１に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  4. 前記アミノ酸置換の位置が次から選択され：
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項１に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  5. 前記アミノ酸置換の位置が次から選択され：
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項１に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  6. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体が、タンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択される位置にアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：
    Figure 2014522235
    Figure 2014522235
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  7. 前記アミノ酸置換の位置が次から選択され：
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項６に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  8. 前記アミノ酸置換の位置が次から選択され：
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項６に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  9. 前記アミノ酸置換の位置が次から選択され：
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項６に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  10. 前記アミノ酸置換の位置が次から選択され：
    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項６に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  11. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体が、タンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：
    Figure 2014522235

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    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  12. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：

    Figure 2014522235

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    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  13. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：

    Figure 2014522235

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    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  14. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：

    Figure 2014522235

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    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  15. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：

    Figure 2014522235

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    Figure 2014522235

    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  16. 単離されたサブチリシン変異体であって、前記サブチリシン変異体がタンパク質分解活性を有する成熟型であり、かつ次から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含むアミノ酸配列を含み：

    Figure 2014522235

    Figure 2014522235

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    Figure 2014522235
    前記サブチリシン変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、単離されたサブチリシン変異体。
  17. 前記サブチリシン変異体がバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼのサブチリシン変異体であり、前記バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼが配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  18. 前記サブチリシン変異体が配列番号２に示すアミノ酸配列を含むバチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼに対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  19. 前記変異体の総正味電荷が、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、０、＋１、＋２、＋３、＋４、＋５、−１、−２、−３、−４、又は−５である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  20. 前記変異体の総正味電荷が、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、−１、０、＋１、＋２、＋３、＋４、又は＋５である、請求項１９に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  21. 前記変異体の総正味電荷が、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、−１、０、＋１、＋２、＋３、又は＋４である、請求項２０に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  22. 前記変異体の総正味電荷が、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、＋１、０、−１、−２、−３、−４、又は−５である、請求項１９に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  23. 前記変異体の総正味電荷が、バチルス・レンタスのサブチリシンＧＧ３６プロテアーゼの総正味電荷を基準にして、＋１、０、−１、−２、−３、又は−４である、請求項２２に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  24. 前記総正味電荷が次から選択される１つ以上の置換によって得られ：
    Figure 2014522235

    前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  25. 前記総正味電荷が次から選択される１つ以上の置換によって得られ：
    Figure 2014522235

    前記プロテアーゼ変異体のアミノ酸位置が配列番号１に示すバチルス・アミロリケファシエンスのサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列の対応するアミノ酸位置に割り振られた番号に従って番号付けされる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  26. 前記単離されたサブチリシン変異体が次の特性：ａ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法２による性能指数；ｂ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１０、１．１〜約８、又は更には１．１〜約５である試験方法３による性能指数；ｃ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法４による性能指数；及び／又はｄ）少なくとも１．０、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．０〜約１０、１．０〜約８、又は更には１．０〜約５である試験方法６による性能指数；及び／又はｅ）少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、１．１〜約１５、１．１〜約１０、又は更には１．１〜約７である試験方法７による性能指数、の１つ以上を有する、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の単離されたサブチリシン変異体。
  27. 請求項１〜２６のいずれか一項で提供されるサブチリシン変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離された核酸。
  28. 請求項２７に記載の核酸を含む発現ベクター。
  29. 前記少なくとも１つの核酸がプロモーターと作用可能に連結された、請求項２８に記載の発現ベクター。
  30. 請求項２８又は２９のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  31. 少なくとも１種のバチルス・サブチリシンのサブチリシン変異体を生産する方法であって：
    ａ）請求項１〜２６のいずれか一項に記載のサブチリシン変異体の少なくとも１種をコードする核酸を少なくとも１種含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換宿主細胞を生産する工程と；
    ｂ）前記形質転換宿主細胞を、少なくとも１種のサブチリシン変異体の生産に適した条件下で培養し、少なくとも１種のサブチリシン変異体を生産する工程と、を含む方法。
  32. 産生されたサブチリシン変異体を回収する工程を更に含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記宿主細胞がバチルス種である、請求項３０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記バチルス種がＢ．サブチリスである、請求項３３に記載の方法。
  35. 請求項１〜２６のいずれか一項に記載のサブチリシン変異体を少なくとも１種含む組成物であって、布地ケア及びホームケア製品ではない組成物。
  36. 前記組成物がクリーニング組成物である、請求項３５に記載の組成物。
  37. 前記クリーニング組成物が顆粒、粉末、固体、バー、液体、錠剤、ゲル、又はペースト組成物である、請求項３５又は３６に記載の組成物。
  38. 少なくとも１種の漂白剤を更に含む、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含まない、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記クリーニング組成物がリン酸塩を含有する、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
  41. 少なくとも１種の追加酵素を更に含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
  42. 前記少なくとも１種の追加酵素が、ヘミセルラーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記サブチリシン変異体が冷水用プロテアーゼ変異体ではない、請求項３５〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 表面又は物品を請求項１〜２６のいずれか一項に記載のサブチリシン変異体を少なくとも１種含むクリーニング組成物に接触させる工程を含む、クリーニングの方法。
  45. 表面又は物品を請求項３５〜４３のいずれか一項に記載のクリーニング組成物に接触させる工程を含む、クリーニングの方法。
  46. 前記表面又は物品のそれぞれと前記クリーニング組成物とを接触させた後に前記表面又は物品のすすぎを更に含む、請求項４４〜４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記表面又は物品を前記クリーニング組成物に接触させる工程の後に前記表面又は物品をすすぐ工程を更に含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記表面又は物品をすすぐ工程の後に前記表面又は物品を乾燥する工程を更に含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 表面又は物品をクリーニングする方法であって、請求項３５〜４３のいずれか一項に記載のクリーニング組成物及びクリーニングが必要な表面又は物品を準備する工程と；前記クリーニング組成物と、前記クリーニングが必要な表面又は物品とを、前記表面又は物品の洗浄に適した条件下で接触させ、洗浄された表面又は物品を製造する工程と、を含む方法。
  50. 前記洗浄された表面又は物品をすすいで、すすがれた表面又は物品を製造する工程を更に含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記すすがれた表面又は物品を乾燥する工程を更に含む、請求項４９〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記サブチリシン変異体が冷水用プロテアーゼ変異体ではない、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の方法。
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