JP2014503581A

JP2014503581A - 膣感染症を処置するため膣適用において使用するための固体形態にある発泡組成物

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Publication number: JP2014503581A
Application number: JP2013550962A
Authority: JP
Inventors: ジョヴァンニ・モニャ; ジャン・パオロ・ストロッツィ; ルカ・モニャ
Original assignee: Probiotical SpA
Current assignee: Probiotical SpA
Priority date: 2011-01-28
Filing date: 2012-01-24
Publication date: 2014-02-13
Anticipated expiration: 2032-01-24
Also published as: CO6771428A2; BR112013018953A2; MX2013008547A; ITMI20110107A1; DK2667849T3; RU2587717C2; ES2751416T3; MA34926B1; IT1403661B1; EP2667849A1; NZ614002A; CN104519866A; BR112013018953B1; ECSP13012844A; US9492377B2; PT2667849T; PE20180413A1; UA114888C2; KR20140029392A; CL2013002148A1

Abstract

本発明は、膣感染症を処置するため膣適用において使用するための固体形態にある発泡組成物に関する。

Description

（説明）
本発明は、膣感染症を処置するため膣適用に使用するための固体形態にある発泡組成物に関する。腸および泌尿生殖器の微生物叢の構成は、個人の健康および満足のいく生活にとって重要であることがよく知られている。膣環境体系は、膣および子宮をつなぐ上皮細胞、臓器内腔中に分泌する腺細胞および様々な微生物種により構成される複雑な細菌叢からなる。

これらの微生物は、結果として乳酸産生を伴う、富栄養性の膣粘膜の副基体細胞の分解物に由来するグリコーゲンを発酵させる能力を有しており、この最終的な効果は、酸性膣環境（生理学的条件の下でｐＨ値４〜４.５）の確立および維持である。

乳酸から生じるＨ^＋は、過酸化水素の形成に寄与する。この分子は、カタラーゼ酵素を持たない多くの細菌種にとって毒性である。膣の分泌レベルでは、０.７５〜５μｇ/ｍｌの濃度が容易に達成されて、毒性効果が出現されるにはきわめて十分な量である。

過酸化水素、子宮のペルオキシダーゼ（頸部および子宮内膜により産生される）ならびにＣｌ⁻およびＩ⁻イオンの複合作用もまた、上皮の細胞内腔中で殺細菌作用を発揮する多形核細胞(polymorphonucleates)を直接活性化することにより細菌増殖を制限する。

女性には、様々な外因性および内因性ファクター、例えば抗生物質の摂取、ストレス状態、妊娠と関連があるホルモン調節および月経サイクルまたは高濃度エストロゲンの摂取などにより、膣環境体系におけるアンバランスが頻繁におこる。膣環境体系のバランスにおける変化は、カンジタ症、膣炎または膣症などの原因となり得るいわゆる「日和見感染性」微生物（例えば、Candida albicans および Candida glabrata）および／または病原性微生物（例えば、Neisseria gonorrheae および Trichomonas vaginalis）を蔓延させる。

疫学データは、膣感染症が、現在、社会経済的見地から、世界中で毎年１０億人以上の女性に深刻な影響を及ぼすことを示す。

一般的に採用される療法は、抗生物質および／または殺真菌剤療法であり、これは短期間で良好な結果を通常与えるが、病原体の耐性がさらに増強するために再発感染を予防できないことを示す。さらに、処置が必要な全ての患者が、抗生物質または殺真菌治療を受けることができるわけでも、耐用可能であるというわけでもない。

膣微生物叢の正しい組成を回復させることができる微生物の使用は知られている。

しかし、その微生物を膣環境に送達する手法は、非常に重要なファクターである。例えば、プロバイオティクス成分を油性マトリクスに懸濁することが必要であるソフトゲルとして通常知られる軟ゼラチンカプセルは、製品適用後に、該プロバイオティクス成分が膣粘膜に定着する能力を低減またはほぼ完全に阻害し得る物理的バリアーを形成する傾向があることが知られている。さらに、この油性マトリクスは、微生物の数および生存性を大きく低下させるような程度まで、微生物に対する毒性効果を発揮する可能性がある。

例えば、カプセルは、溶解するまでに比較的長い時間を要し、いずれの場合においてもそれらは膣環境全体にわたる活性成分の十分な分散を保証しない。

例えば、親水性懸濁液またはヒドロゲルは、簡易でもなく、また快適でもない適用手段を要する。実際に、患者は、製品の漏出を防止するために、適用後に少なくとも２０〜３０分間横臥しなければならない。

結局のところ、慣習的膣錠剤類は、製造中に微生物死亡率が高いという問題をもたらす上に、それらは膣環境中で微生物を十分に分布させることができない。

このため、膣環境にプロバイオティクス細菌を送達し、かつそれを完全に分散／分布させる組成物が依然として必要である。

さらに、容易に投与でき、かつ実用的である医薬形態が依然として必要である。

特に、抗生物質および／または殺真菌療法に対する価値のある代替療法を示し、また同時に、既知の投与形態よりも改善を示す組成物を提供する必要性が残っている。

驚くべきことに、我々は、好適に調製された固形組成物形態のプロバイオティクス製剤が、当分野に現存する課題を解決できることを見出した。

本発明の対象は、添付の特許請求の範囲に記載したような固体形態にある発泡組成物である。

本発明の好ましい他の実施形態は、添付の特許請求の範囲に記載したようなものである。

表１は、我々が試験した本発明の技術対象を形成する細菌株を示す。

表２は、本発明の組成物の例を示す。

表３は、異なる適用圧力によるプロバイオティクス細菌についての死亡率データと２年間２５℃で貯蔵した後の錠剤の安定性(担持細菌の半減期として表す）を示す。

表４は、本発明によるものではない組成物を示す。

表５は、本発明によるものではない錠剤形態の組成物を示す。

我々は、本発明の組成物を製造するため、ならびにその製造のための操作条件について最適な質的および量的組成を同定するという目的で、長期にわたり熱心に研究に取り組んだ。

本発明の組成物は、発泡組成物である。この発泡性は、有機酸、ならびに炭酸および／または重炭酸アニオンの塩を含む酸-塩基系が、膣腔内に存在する水/湿気と接触する場合に起こる二酸化炭素の形成によるものである。この酸-塩基系は、膣内のｐＨを３〜５.５の間、好ましくは４〜５に安定に維持できる。有利には、膣内のｐＨは４.２〜４.５である。

本発明の組成物は、固体形態にある発泡組成物である。好ましい実施形態において、有機酸は、固体形態、好ましくは粉末または顆粒であって、炭酸および／または重炭酸アニオンの塩は、固体形態、好ましくは粉末または顆粒である。

好ましい実施形態において、固体形態にある発泡組成物は、錠剤、膣用坐剤（ovule）、ロセンジまたは顆粒の形態にある。

有機酸は、下記からなる群から選択されるか、または下記を含む：クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、乳酸およびその混合物。好ましい実施形態において、有機酸はクエン酸である。

我々は、該酸-塩基系に存在する有機酸としてアジピン酸および／またはアスコルビン酸の使用は、微生物に対して毒性効果を与えて、固体形態の組成物（例えば、粉末または顆粒として）を調製する時点で既に微生物の死をもたらすことを見出した。従って、錠剤製造の場合には、かかる死亡は、圧縮前であっても、固体形態の組成物（例えば粉末または顆粒として）とするために成分を混合した後にも起こる。従って、本発明の組成物は、アジピン酸および／またはアスコルビン酸を含まない。

炭酸および／または重炭酸アニオンの塩は、下記からなる群から選択されるか、または下記を含む：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ナトリウムグリシン炭酸塩、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸マグネシウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、炭酸塩、乳酸塩、およびその混合物。好ましくは、該塩は、重炭酸アニオンの塩からなる群から選択されるか、または重炭酸アニオンの塩を含む。好ましい実施形態において、該塩は重炭酸ナトリウムである。

好ましい実施形態において、炭酸または重炭酸アニオンの塩の量は、該組成物の全重量に対して１〜１５重量％を含む。好ましくは、それは該組成物の全重量に対して３〜１３重量％を含む；さらにより好ましくは、それは該組成物の全重量に対して４〜１２重量％を含む。有利には、それは該組成物の全重量に対して５〜１０重量％を含む。

好ましい実施形態において、重炭酸ナトリウムの量は、該組成物の全重量に対して、１〜１５重量％を含む。好ましくは、それは該組成物の全重量に対して３〜１３重量％を含む；さらにより好ましくは、それは該組成物の全重量に対して５〜１０重量％を含む。有利には、それは該組成物の全重量に対して５〜１０重量％を含む。

好ましい実施形態において、酸-塩基系は、上記した重量にてクエン酸および重炭酸ナトリウムからなる。

我々は、炭酸または重炭酸アニオンの塩（例えば、重炭酸ナトリウム）が、該組成物の全重量に対して１５重量％以上である場合、浸透圧の影響によって、微生物に対して毒性効果が現れることを見出した。

酸-塩基系で使用される有機酸の量は、上記濃度に従って使用される炭酸または重炭酸アニオンの塩の量を決定してから計算される。使用される有機酸の量は、化学量論的であって、使用される塩に応じ、二酸化炭素を形成する目的にのみ役立つ。該塩の存在において、該有機酸は、膣腔内部で水和後に二酸化炭素の形成による発泡を起こすことができる。

好適に処方された発泡性錠剤は、上皮および膣粘膜全体の迅速なコロニー形成のために大量の乳酸細菌を送達することができる。ｐＨコントロールおよび安定な発泡体系のおかげで、乳酸細菌は、増殖および増加し得る良好な生理条件の下で膣腔へと送達される。

有利には、発泡性錠剤の形態にある本発明の組成物は、膣粘膜にわたり細菌の最適な分布を確実にできる。さらに、該組成物は、二酸化炭素の形成により、膣腔内部の嫌気的または微好気性環境を確保および維持できる。

我々は、粉末形態の組成物から錠剤を得たい場合には、好ましくは１：１〜３：１の重量比で、[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]を含むか、あるいは[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]からなる混合物が、微生物細胞の数および生存性を保持できることを見出した。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、１：１〜３：１の重量比で[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]を含有する混合物を含む。

好ましくは、植物由来のアラビノガラクタンが使用される。有利には、カラマツから得たアラビノガラクタン（例えばFiberAid^{(登録商標)}、Larex^{(登録商標)}社からのLonza Inc．USAにより販売された製品系列）を使用する。

我々は、粉末形態の組成物を使用して錠剤を製造する場合、粉末を圧縮した後に得られる錠剤がキャッピングされるため、本発明の組成物中の凝集剤としてトウモロコシデンプンを用いると、満足のいかない結果となることをさらに見出した。

一方で、１：１〜１：３の重量比にて[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]を含む混合物または[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]からなる混合物は、むしろキャッピングをおこさずに錠剤を得ることができた。

それ故に、本発明の組成物から得られる錠剤は、トウモロコシデンプンを含有しない。トウモロコシデンプンの代わりに、[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]を含有する混合物は、好ましくは１：１〜３：１の重量比で使用される。

微晶質セルロースは、粉末形態のセルロースにより、部分的または完全に置換されてもよい。微晶質セルロースおよび粉末形態のセルロースの双方は、食品添加物の一覧においてはＥ４６０として表示される。

アラビノガラクタンは、アラビノースおよびガラクトースモノマーからなるバイオポリマーである。アラビノガラクタンの２つの分類が存在する：植物起源および微生物起源のものである。

微晶質セルロース（または、粉末形態のセルロース）は、該組成物の全重量に対して２〜４５重量％、好ましくは５〜２５％重量％を含む量で存在する。

アラビノガラクタンは、該組成物の全重量に対して５〜３０重量％、好ましくは１０〜２０重量％を含む量で存在する。

好ましくは、本発明の組成物は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、無水リン酸水素カルシウムおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースから選択される、少なくとも１つの追加の成分をさらに含むことができる。

該少なくとも１つの追加成分は、組成物の全重量に対して、３〜７０％ｗ/ｗ、より好ましくは６〜４０％ｗ/ｗ、さらにより好ましくは１０〜２５％ｗ/ｗの範囲で本発明の組成物全量中に存在する。

本発明の好ましい実施形態に従って、本発明の組成物は、該組成物の全重量に対して、ステアリン酸マグネシウムを０.５％〜７％ｗ/ｗ、好ましくは１％〜３.５％ｗ/ｗの量でさらに含む。

本発明の好ましい実施形態に従って、本発明の組成物は、該組成物の全重量に対して、シリコンジオキシドを、０.５％〜４％ｗ/ｗ、好ましくは１％〜２％ｗ/ｗの量でさらに含むことができる。

本発明の好ましい実施形態に従って、本発明の組成物は、該組成物の全重量に対して、パルミチン酸スクロースを、０.５％〜７％ｗ/ｗ、好ましくは１％〜３.５％ｗ/ｗの量でさらに含むことができる。

本発明の好ましい実施形態に従って、本発明の組成物は、該組成物の全重量に対して、グリセリド（ケン化性の脂肪）の混合物を、０.５％〜１０％ｗ/ｗ、好ましくは２％〜７％ｗ/ｗの量でさらに含むことができる。

本発明の好ましい実施形態に従って、該組成物は、スクロースエステルの０.５％〜１０％ｗ/ｗ、好ましくは１％〜５％ｗ/ｗをさらに含むことができ、該パーセントは、該組成物の全重量に対して表される。

本発明の組成物は、膣感染症（例えば、膣炎、膣症、カンジタ症、淋病、ヘルペスおよび性病性の潰瘍）を処置するための膣適用用である。

好ましい実施形態において、該組成物は、錠剤の形態である。あるいは、該錠剤は、当分野では既知の１以上のポリマー物質により被覆され得る。

本発明の製剤の微生物群に関して、プロバイオティクス微生物を使用することが有利であり、異なる属または種から構成されるものであっても、個別あるいは混合物にて使用される。

プロバイオティクス微生物とは、定義上、十分な量および十分な時間にて定期的に摂取されれば有価な効果を誘導できる微生物、一般的にはヒト起源の細菌である。

本発明の組成物は、下記を含む群から選択される病原性物質の存在を減少および／または除去する能力を有する少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株を含む：Candida albicans、Candida glabrata、Candida parapsilosis、Candida krusei、Candida tropicalis、Gardnerella vaginalis、Trichomonas vaginalis、Neisseria gonorrhoeae、Escherichia coli、Herpex simplex および Haemophilus ducreyi。

好ましくは、該菌株は、下記からなる群から選択される少なくとも１つの種に属する：Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus casei、Lactobacillus casei ssp． paracasei、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii ssp． bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii ssp．delbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus reuteri、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium animalis ssp． lactis、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Bifidobacterium catenulatum または Bifidobacterium infantis。

上記細菌種の中で、表１に挙げた細菌株が、特に好ましいものとして明示する。
好ましい実施形態において、細菌株は、Lactobacillus salivarius CRL 1328、Lactobacillus paracasei CRL 1289、Lactobacillus gasseri CRL 1259、Lactobacillus crispatus CRL 1251、Lactobacillus crispatus CRL 1266、Lactobacillus acidphilus CRL 1294、Lactobacillus paracasei LPC 00、Lactobacillus plantarum LP 02 および Lactobacillus fermentum LF 10、から選択される。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは錠剤の形態にて、上記群から選択される少なくとも２つの株を含む。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは錠剤の形態にて、上記群から選択される少なくとも３つの株を含む。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、好ましくは錠剤の形態にて、上記群から選択される少なくとも４つの株を含む。

Lactobacillus salivarius CRL 1328、Lactobacillus paracasei CRL 1289、Lactobacillus gasseri CRL 1259、Lactobacillus crispatus CRL 1266 および Lactobacillus fermentum LF 10 の中から選択された株が、有利であることを実証した。

本発明の錠剤中、好ましくは、一般的に１００〜２０００億のコロニー形成単位（CFU）/グラムを含む生菌数を有する凍結乾燥した培養物の形態で使用される微生物は、好ましくは、錠剤の全重量に対して、好ましくは０.５〜２０％ｗ/ｗ、より好ましくは１〜１５％ｗ/ｗ、さらにより好ましくは３〜１０％ｗ/ｗの量で存在する。

好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の製剤のプロバイオティクス効果を増強させるために、特定のプレバイオティクス成分を、共生的な組み合わせとなるように粉末混合物に導入する。このプレバイオティクス成分は、一般的には、少なくとも部分的に水または水溶液に可溶性のサッカリド様性質の非消化性混合物であって、これは上記したような１以上のプロバイオティクス細菌株の成長および／または活動を刺激する。これらのプレバイオティクス物質のうち、食物繊維が好ましい。

好ましくは、該プレバイオティクス繊維は、互いに変更可能な比率にて、下記からなる群から選択される：フルクトオリゴサッカリド（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴサッカリド（ＧＯＳ）、トランス-ガラクトオリゴサッカリド（ＴＯＳ）、キシロオリゴサッカリド（ＸＯＳ）、キトサンオリゴサッカリド（ＣＯＳ）、α-ガラクトシド（例えば、ラフィノースおよびスタキオース）、ペクチン、ガム、部分加水分解ガム、イヌリン、オオバコ、アカシア、イナゴマメ、オートムギまたは竹繊維、柑橘類繊維および可溶性および非可溶性部分を含有する一般的な繊維。

有利には、該プレバイオティクス繊維は、フルクトオリゴサッカリド（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴサッカリド（ＧＯＳ）およびキシロオリゴサッカリド（ＸＯＳ）の中から選択される。これらの繊維は、Candida genera 酵母には利用されないため、本発明の組成物中に存在する細菌株にとって拮抗的利点を与える。

好ましくは、プレバイオティクス成分は、該組成物の全重量に対して、７０％ｗ/ｗまで、好ましくは５〜５０％ｗ/ｗ、さらにより好ましくは１０〜３０％ｗ/ｗの量で組成物中に存在している。

好ましい実施形態において、本発明の組成物は、追加の有効成分、例えばビタミン、無機成分、野菜抽出物、または本発明の製剤中に存在する微生物集団と相乗的または相補的な効果を有する他の化合物を含有できる。

好ましくは、追加の有効成分は、該組成物の全重量に対して、７０％ｗ/ｗまで、好ましくは０.５〜４０％ｗ/ｗ、さらにより好ましくは１〜２０％ｗ/ｗの量で組成物中に存在している。

本発明の圧縮および発泡に関する技術的な賦形剤の組み合わせは、錠剤粉末の十分な密着性を確実にし、その摂取後に活性成分の所望の放出動態をもたらす。

一般的に粉末形態の様々な成分の混合は、いずれの順序であれ、過剰な混合時間により細菌の細胞壁に物理的衝撃を誘導し得る可能性、結果として最終製品の安定性が損なわれかつ低下する可能性を避けるために、好ましくは凍結乾燥物の形態で、微生物の培養物を最終成分として添加することに注意して、これらの成分を添加することより行い得る。

本発明の方法に従って製造される製剤は、ダイ（即ち、この空間は、圧縮される粉末の特定量を入れるために割り当てられる）の均一な充填を支持するパラメーターである圧縮機器内での優れた流動性を特徴とする。該圧縮機は、通常、ダイに充填するための装置（一般的には、粉末混合物を運搬するためのホッパを意味する）および好適な半径の金属ディスク(ダイ自体がこの厚さで得られる)を含む；これらは、機器に拠って様々な数にて存在し、粉末を圧縮するステップは、打錠として規定され、機械の２つの動作部の同時におこる相乗的動作の結果そこで行われる。

圧縮ステップ中、この下段の打錠機は、その位置、ダイの容量（即ち、各回毎に充填される粉体の量）を規定し、一方で、粉末混合物と共にその充填中にダイの外側に位置する上段の打錠機は、圧縮ステップ中に下げられ、ダイ中に存在する粉末との接触を開始する、即ち、行使した圧力により、粉末を構成している粒子に対して大体著しい機械的変形を課す。圧縮ステップの終了時に、上段の打錠機は上昇して、ダイから射出され、その後さらに下段の打錠機が上昇して、新たに形成した錠剤をダイから射出する。

該圧縮機器は、さらに、主な運転パラメーター（圧縮サイクルの開始時の下段の打錠機の位置、圧縮サイクル中において上段の打錠機に到達する最下段の位置、ダイが存在しているディスクの回転速度など）を制御するための多くの装置を含む。

代替物および回転圧縮機が存在しており、結果として機械全体の運転モードに従って、所定の時間単位内で錠剤数を提供できる。錠剤は、このように当分野では既知の圧縮機および形状を変更し得る打錠機、好ましくは二重半円の円形凸面および楕円形の打錠機を用いて提供され得る。

製造中に適用される圧縮力は、錠剤を崩壊させるのに要した力を、硬度試験機を用いて定量して評価される。この力は、Ｋｐ（キロポンド）[１Ｋｐ＝９.８０７ニュートン（Ｎ）]で算定される。微生物集団に対する圧縮の負の効果は、用いた力が強い場合（例えば、硬度１０〜１２Ｋｐの錠剤）、およびそれらが弱い場合（例えば、硬度５〜６Ｋｐの錠剤）の双方で現れる。強い力を用いる欠点は、微生物数の大きな低下であり、一方で低い力を用いると一般的に錠剤の凝集低下となる。有利には、本発明の錠剤は、所望とする錠剤のタイプによるが、５〜１２Ｋｐの圧縮力を示す。

L. paracasei LPC 00、L. acidphilus LA 02 および L. salivarius CRL 1328（表２）を含有する錠剤に対する製造試験において、我々は、生存性およびその後の安定性の双方に対して正の結果を得た。

特に、適用される圧縮力が、例えば、５〜６Ｋｐからなる硬度を有する錠剤を得るような場合には、４〜１５％の死亡率が観察され、また適用される圧縮力が、例えば、１０〜１２Ｋｐからなる硬度を有する錠剤を得るような場合には、１０〜２５％の死亡率が観察された。本発明の方法の別の利点は、低い圧縮力であっても、例えば５〜６Ｋｐの硬度を有する錠剤であっても十分に密着した錠剤を製造できる点である。

本発明に従って製造した錠剤を、ヨーロッパ薬局方(Ed．X, 参照2．9．1)に従って崩壊時間を評価するために試験した。非被覆錠剤の摩損度を、参照2．9．7に従って試験し、また参照2．9．8に従って破砕耐性を試験した。

表２は、本発明の組成物の例示を示す。
表３は、２５℃で貯蔵２年後の、行使した様々な圧力のプロバイオティクス細菌（表２に示す組成物）の死亡率データおよび錠剤安定性（担持細菌の半減期として表す）を示す。

本発明の製剤により得た錠剤は、高い硬度を有する錠剤の場合には約７.７mmの厚さを有し、低い硬度を有する錠剤の場合には約８.４mmを有する。

表３において、安定性は、製剤のプロバイオティクス成分の半減期、即ち最初の生菌細胞数が半分になる前に経過する時間として表す。

以下のものを測定した：
（１）生存細胞数１ｘ１０^９ＣＦＵ/０時点で予測される粉末のｇ
（２）生存細胞数１ｘ１０^９ＣＦＵ/０時点で存在する粉末のｇ
（３）圧縮による死亡率％
（４）生存細胞数１ｘ１０^９ＣＦＵ/２５℃で２年後の錠剤
（５）半減期の日数。

上記データを、当業者には既知の方法に従って、生存プレート計測方法を用いる圧縮後の粉末組成物および組成物中に存在するプロバイオティクス細菌の数を評価することにより得た。

粉末組成物の場合には、１〜４ｇからなる量の試料を、好適な容量の滅菌液体培地（一般的には、細菌用ペプトンを１ｇ/リットルの比率で添加した０.８５％塩化ナトリウム生理食塩水溶液）に再懸濁した。

粉末の溶解後およびその後の好適なピストン駆動機器を用いる均質化後に、細胞数/ｍｌを、順次、ベースの１０連続希釈により減少させる。

実際には、最も高濃度の希釈物（１ｍｌ）を、各時点で滅菌ピペットを用いて９ｍｌの希釈液へと移す；この操作を、希釈液１ｍｌあたりに存在する微生物の量が１０〜３００の数となるまで十分な回数行う、そうしてペトリ皿への微生物の移行および好適な寒天培養培地の添加後に、それらは独立したコロニー、即ち計測できるコロニーを形成できる。

錠剤の場合には、３〜５個の錠剤の事前破砕および粉末組成物について上記したとおりの分析の継続を提供するプロトコールを見た。

実験データは、高い硬度を有する錠剤（開始集団のおおよそ１６.４％）および低い硬度を有する錠剤（開始集団のおよそ８.２％）双方で低い死亡率を実証する。本発明の組成物のさらなる利点は、従来の製剤の典型的な安定性と比較して、錠剤中に存在するプロバイオティクス微生物（プロバイオティクス成分）の改善された安定性である。この利点は、好ましくは１：１〜３：１の重量比で、[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]を含有する混合物の使用を理由とする。この混合物は、圧縮ステップにより生じるプロバイオティクス細菌の細胞に対する機械的ダメージを大幅に制限することができ、キャッピングの出現なしに錠剤を得ることができる。

我々は、粉末組成物中および本発明の処方により製造した各種硬度の錠剤中のプロバイオティクス成分の半減期が非常に類似していることを見出し、使用した技術的成分種が、圧縮ステップにより生じる機械的ダメージを最小とすることができるという事実を示した。

有利には、本発明の錠剤は、圧縮ステップ後であっても、プロバイオティクス微生物の高い生存率を示す。

さらなる有利な態様は、錠剤崩壊剤として二酸化炭素を放出する能力であり、結果として使用したプロバイオティクスによる膣コロニー形成にとって特に好ましい嫌気性または微好気性環境を創出する。

さらにこの発泡は、コロニー形成の効果を増強することにより、膣環境内のプロバイオティクス活性成分の十分かつ均一な分布を確保することができる。

本発明の組成物は、冷蔵温度でない温度であっても、長時間有効かつ安定であるプロバイオティクス微生物を含有する錠剤を得ることができる。これは、該組成物を形成する成分が、粉末の凝集性を損なわずに、混合に起因する死亡率を低下すること、および圧縮に起因する死亡率を低下することを目的として選抜および選択されているためである。このために、本発明の組成物は、好ましくは錠剤の形態にてアジピン酸またはアスコルビン酸のいずれも含有せず、存在する炭酸塩または重炭酸アニオンの塩の量が、該組成物の全重量に対して１５重量％よりも低く、そして微晶質セルロースおよびアラビノガラクタンの混合物をトウモロコシデンプンの代わりに用いる。

我々は、不十分な結果を示した組成物（表４）から開始して、これらの結果に到達した。

表４の組成物は、以下の値を示す：混合による８０.８％の死亡率、圧縮による４０.５％死亡率、および８８.６％の全死亡率（混合＋圧縮）。

表４の組成物は、圧縮前の粉末レベルにて既に高い死亡率を示す。第一製剤についてはほぼ５.２２であり、第二製剤についてはほぼ５.５３であるため、崩壊に関するｐＨ（生理食塩水中、１：１０の割合）は問題ではない。

アジピン酸は毒性であることが判った。しかし、この毒性は、観察される死亡率（全死亡率の約６０％）のある一部のみを説明するものである。アスコルビン酸は毒性であることが判った。しかし、この毒性は、死亡率の別の一部分を説明するものである。表４の組成物からアスコルビン酸を除くと、７３.８から２６.７％に死亡率が低下する。アジピン酸自体は、あらゆる場合において毒性であった（ｐＨ４.２４で４５.８％）；その毒性は、アスコルビン酸の存在下では増強すると考えられる。そのため、アスコルビン酸は、アジピン酸の毒性と相乗毒性を示す。

しかしながら、アジピン酸およびアスコルビン酸による毒性の合計は観察された全体の死亡率を説明するものではないことに注目することが重要である。

このために、我々は、表４の組成物中で観察される全ての毒性を説明することを目的として、毒性効果を有し得る他の成分の存在を調べた。

従って、その他の（既に検討したｐＨとは異なる）幾つかの成分は、アジピン酸およびアスコルビン酸と同様に、残存する毒性について説明されるべきである。

ある程度の死亡率は、過剰量にて存在する重炭酸塩により提供される浸透圧に拠る事が判明した。この死亡率は、約２０％であることが判った。アジピン酸、アスコルビン酸、および重炭酸塩により媒介される浸透圧効果が、観察される毒性に関与している。重炭酸塩それ自体は毒性ではない：それは単に浸透圧効果により毒性となる。

従って、組成物（表５）を、アジピン酸およびアスコルビン酸を含まずに、かつ該組成物の全重量に対して、１５重量％未満の重炭酸アニオンの塩（例えば、重炭酸ナトリウム）の量を含めて製造した。

例えば、８４ｍｇの重炭酸ナトリウムは、１ミリモルを構成し、放出されるＣＯ_２は３７℃および大気圧下で全容量２５.４ｍｌを占める。クエン酸の量を、錠剤崩壊後に観察したｐＨ値で、ＣＯ₂が重炭酸ナトリウムから完全に放出されるような様式で選択した。

表５の組成物は、錠剤を製造するために、圧縮ステップに付した場合に問題を示した。

この粉末（表５）は、水分含量が低い製剤中にトウモロコシデンプンを使用することにより乏しい凝集特性を示した。圧縮機より射出した全ての錠剤は、除塵機を通過する前であってもキャッピングを生じた。

この圧縮試験の後に、我々は、トウモロコシデンプンを、好ましくは１：１〜３：１の重量比にて、[微晶質セルロース：アラビノガラクタン]を含有する混合物に置き換えて行った。

表４：不十分な組成物

表５：１,３００ｍｇ組成物

Claims

下記のもの：
−有機酸、ならびに炭酸および／または重炭酸アニオンの塩を含む酸-塩基系、
該塩は、該組成物の全重量に対して１〜１５重量％の量で存在している；
−微晶質セルロースおよびアラビノガラクタンを含む混合物；
−Candida albicans、Candida glabrata、Candida parapsilosis、Candida krusei、Candida tropicalis、Gardnerella vaginalis、Trichomonas vaginalis、Neisseria gonorrhoeae、Escherichia coli、Herpes simplex および Haemophilus ducreyi を含む群から選択される、病原性物質の存在を減少および／または除去する能力を有する少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株；
を含む、膣感染症を処置するため膣適用において使用するための固体形態にある発泡組成物。
錠剤、膣用坐剤（ovule）、ロゼンジまたは顆粒の形態にある、請求項１に記載の使用のための組成物。
有機酸が、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、乳酸およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、有機酸がクエン酸である、請求項１または２に記載の使用のための組成物。
炭酸および／または重炭酸アニオンの塩が、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、ナトリウムグリシン炭酸塩、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、重炭酸カルシウム、重炭酸マグネシウム、乳酸ナトリウム、乳酸カリウム、炭酸塩、乳酸塩およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは重炭酸アニオンの塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
炭酸および／または重炭酸アニオンの塩が、該組成物の全重量に対して、３〜１３重量％の量で存在し、好ましくは該組成物の全重量に対して、４〜１２重量％の量で存在し、さらにより好ましくは該組成物の全重量に対して、５〜１０重量％の量で存在している、請求項５に記載の使用のための組成物。
酸-塩基系が、重炭酸ナトリウムおよびクエン酸からなり、該重炭酸ナトリウムは、該組成物の全重量に対して、３〜１３重量％の量で存在し、好ましくは該組成物の全重量に対して、４〜１２重量％の量で存在し、さらにより好ましくは該組成物の全重量に対して、５〜１０重量％の量で存在する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
微晶質セルロースおよびアラビノガラクタンが、１：１〜３：１の重量比で存在する、請求項１に記載の使用のための組成物。
少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株が、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus casei、Lactobacillus casei ssp．paracasei、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii ssp． bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii ssp．delbrueckii、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus reuteri、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium animalis ssp． lactis、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium pseudocatenulatum、Bifidobacterium catenulatum および Bifidobacterium infantis からなる群から選択される少なくとも１つの種に属しており、該少なくとも１つの細菌株が、好ましくはLactobacillus salivarius CRL 1328、Lactobacillus paracasei CRL 1289、Lactobacillus gasseri CRL 1259、Lactobacillus crispatus CRL 1251、Lactobacillus crispatus CRL 1266、Lactobacillus acidophilus CRL 1294、Lactobacillus paracasei LPC 00、Lactobacillus plantarum LP 02 または Lactobacillus fermentum LF 10 の中から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
膣炎、膣症、カンジタ症、淋病、ヘルペスおよび性病性潰瘍の処置のためのものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
下記のもの：
−重炭酸ナトリウムおよびクエン酸を含む酸-塩基系、
該重炭酸塩は、該組成物の全重量に対して、１〜１５重量％の量で存在している；
−微晶質セルロースおよびアラビノガラクタンを、１：１〜３：１の重量比で含む混合物；
−Candida albicans、Candida glabrata、Candida parapsilosis、Candida krusei、Candida tropicalis、Gardnerella vaginalis、Trichomonas vaginalis、Neisseria gonorrhoeae、Escherichia coli、Herpes simplex および Haemophilus ducreyi を含む群から選択される、病原物質の存在を減少および／または除去する能力を有する少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株；
を含む、膣感染症を処置するため膣適用において使用するための固体形態にある発泡組成物。