KR101980252B1 - 질증 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 및 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2 (KCTC18346P) 균주를 포함하는 질증 치료용 조성물에 관한 것으로, 이를 통해 여성의 세균성 질증에 대하여 우수한 치료 효과를 갖는 유산균 함유 질증 치료 조성물을 제공할 수 있다.

Description

질증 치료용 조성물{Composition comprising antifungal agents for treating vulvovaginitis and vaginosis}
본 발명은 질증 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 및 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2 (KCTC18346P) 균주를 포함하는 질증 치료용 조성물에 관한 것이다.
세균성 질증(bacterial vaginosis)은 우유 빛의 악취가 나는, 균질한 냉, 대하를 주 증상으로 하며, 성적으로 활발한 가임기 여성들에서 가장 흔한 질염이다(비특허문헌1). 세균성 질증의 악취는 조건 무산소 세균인 가드네렐라 바지날리스( Gardnerella vaginalis)가 증가하면서 동시에 질 내의 정상 무리균들인 유산 생성 세균들이 절대 무산소 세균들(박테로이드 균속(Bacteroides spp.), 모빌룬커스 균속(Mobiluncus spp.), 펩토코커스 균속(Peptococcus spp.), 펩토스트렙토코커스 균속(Peptostreptococcus spp.), 프레보텔란 균속(Prevotella spp.))로 교체되면서 발생한다(비특허문헌 1).
현재까지 사용되는 치료법은 무산소 세균에 감수성이 있는 항생제인 메트로니다졸(metronidazole), 클린다마이신(clindamycin) 질좌제 혹은 요오드 계통의 살균제로 질 내의 모든 세균의 사멸을 유도하거나, 1% 유산 용액, 초산 용액으로 질 내의 pH를 낮추어서 건강한 여성의 질 내 pH인 4.5 정도를 유지하여 세균성 질증의 원인균들의 성장을 억제하고 정상 무리균들의 증가를 유도하거나, 쑥과 질경이를 비롯한 40여 가지의 민간요법들이 사용되고 있다. 그럼에도 불구하고 세균성 질증은 재발이 빈번하고 아직까지 완치할 수 있는 방법이 없는 실정이다.
주로 사용되는 항생제는 세균성 질증의 원인균들만 선택적으로 죽이는 것이 아니라 이로운 정상 무리균들까지 죽임으로서 잦은 재발의 원인이 되고 있다. 또한 지노베타딘같은 요오드 화합물로 이루어진 질 세정제들도 질 내의 모든 균종들을 죽이기 때문에 일시적인 효과는 있더라도 남아있는 균들이 다시 증식하여 재발이 되어왔다. 또한 식초요법, 유산요법, 쑥 훈증요법등 40여 가지가 넘는 민간요법들이 있으나 어느 하나도 확실한 완치를 보장하지 않고 있는 실정이다.
그래서 새로운 치료법으로 대두된 것이 프로바이오틱스(probiotics)요법으로 유산균을 질 내에 직접 투여하여 세균성 질증의 원인균들을 억제하려는 연구와 치료 시도가 있었지만(비특허문헌 2), 이 또한 치료 효과가 적고, 아직까지 치료제로 개발된 경우가 없다.
1. 한국공개특허 10-2001-0006273 2. 한국공개특허 10-2002-0020544 3. 한국공개특허 10-2002-0033643 4. 한국공개특허 10-2007-0098116 5. 한국공개특허 10-2004-0012779 6. 한국공개특허 10-2014-0029392
1. Joesoef MR, Schmid G. Bacterial vaginosis. Clin Evid 2005;13:1968-78. 2. Antonio M, Petrina M, Meyn L, Hillier S. Lactobacillus crispatus colonisation reduces risk of bacterial vaginosis (BV) acquisition. Sex Transmit Infect 2011;87:A304-5. 3. Amsel R, Totten PA, Spiegel CA, Chen KC, Eschenbach D, Holmes KK. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. Am J Med 1983; 74:14-22. 4. Yang NW, Sin SH, Chang JS. Diagnosis of bacterial vaginosis with relation to isolation of Gardnerella vaginalis. J Bactriol Virol 2002;32:109-14. 5. Yang NW, Kim JM, Choi GJ, Jang SJ. Development and evaluation of the quick anaero-system-A new disposable anaerobic culture system. Korean J Lab Med 2010;30:133-7.
본 발명은 여성의 세균성 질증에 대하여 효과적으로 치료 효과를 갖는 유산균 함유 질증 치료 조성물을 제공하고자 한다.
상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 스테로이드박터 덴트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 및 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2 (KCTC18346P) 균주를 포함하는 질증 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 조성물은 제1인산나트륨, 제2인산나트륨, 제3인산나트륨, 구연산, 구연산나트륨, 인산, 염산, 수산화나트륨, 피로인산나트륨 및 피로인산염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 완충제를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 조성물은 완충제로 제3인산나트륨 및 구연산을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 조성물은 상기 완충제를 0.01 내지 10% (W/V)로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 조성물은 상기 조성물은 pH 가 2 내지 7인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 균주수 대비 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2 (KCTC18346P) 균주수가 1:100 내지 100:1인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일예에 따르면, 상기 조성물은 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 질트리코모나스균(Trichomonas vaginalis), 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 연쇄구균(Streptococcus), 포도상구균(Staphylococcus), 대장균(Escherichia coli), 펩토스트렙토코커스 균속(Peptostreptococcus spp.), 모빌룬쿠스 균속(Mobiluncus spp.), 박테로이드 균속(Bacteroides spp.), 프리보텔라 균속(Prevotella spp.), 펩토코커스 균속(Peptococcus spp.), 및 마이코프라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)를 포함하는 군으로부터 선택되는 병원체의 존재 및/또는 활성을 감소 및/또는 제거하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 여성의 세균성 질증에 대하여 우수한 치료 효과를 갖는 유산균 함유 질증 치료 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 사용된 균주들은 세균성질증 환자의 질 내 생태계에서 주요 세균(정상 무리균)이 되고 이들이 세균성 질증의 원인균을 억제하고, 완충제로 구연산과 제3인산나트륨을 포함하는 경우 질증 원인균의 성장을 직접 억제하고 또한 본 발명의 균주의 생존을 보장하여 상기 균주의 병원균 억제력을 더욱 증가시키는 효과를 갖는다. 이를 통해 반복하여 재발되는 세균성 질증, 위축성 질증 환자의 질 내 세균 생태계를 원래의 건강한 상태로 환원하고, 재 발병률을 크게 낮출 수 있다.
도 1a은 본 발명의 균주 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1의 16s RNA에 기초한 계통수(unrooted neighbour joining phylogenetic tree) 의뢰 결과이다.
도 1b은 본 발명의 균주 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2의 16s RNA에 기초한 계통수(unrooted neighbour joining phylogenetic tree) 의뢰 결과이다.
도 2는 본 발명의 균주 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1의 질증 원인균에 대한 억제 실험 결과이다. A 는 박테로이드 프라길리스(B. fragilis), B는 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis), C는 모빌룬쿠스 물리에리스(M. mulieris), D는 펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스(P. asaccharolyticus).
도 3은 본 발명의 균주 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2의 질증 원인균에 대한 억제 실험 결과이다. A 는 박테로이드 프라길리스(B. fragilis), B는 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis), C는 모빌룬쿠스 물리에리스(M. mulieris), D는 펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스(P. asaccharolyticus).
도 4는 구연산 및 제3인산나트륨 혼합액의 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)에 대한 억제 실험 결과이다.
도 5a는 구연산 및 제3인산나트륨 혼합액의 박테로이드 프라길리스(B. fragilis)에 대한 억제 실험 결과이다.
도 5b는 구연산 및 제3인산나트륨 혼합액의 모빌룬쿠스 물리에리스(M. mulieris)에 대한 억제 실험 결과이다.
도 5c는 구연산 및 제3인산나트륨 혼합액의 펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스(P. asaccharolyticus)에 대한 억제 실험 결과이다.
도 6a은 구연산 및 제3인산나트륨 혼합액의 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1에 대한 억제 실험 결과이다.
도 6b는 구연산 및 제3인산나트륨 혼합액의 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2에 대한 억제 실험 결과이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은, 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 및 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus) YH2 (KCTC18346P) 균주를 포함하는 질증 치료용 조성물을 제공한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
상기 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans, 이하 S. denitrificans) YH1 (KCTC18345P)는 건강한 여성의 질에서 분리 동정되었으며, 그의 16s RNA는 서열목록 1에 기재된 것과 같다.
상기 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus, 이하 L. crispatus) YH2 (KCTC18346P)는 건강한 여성의 질에서 분리 동정되었으며, 그의 16s RNA는 서열목록 2에 기재된 것과 같다.
본 발명의 조성물은 해당 분야에서 통상적으로 포함될 수 있는 완충제를 포함할 수 있다. 상기 완충제는 제1인산나트륨, 제2인산나트륨, 제3인산나트륨, 구연산, 구연산나트륨, 인산, 염산, 수산화나트륨, 피로인산나트륨 및 피로인산염으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일례로 보다 바람직하게는 본 발명의 조성물은 제3인산나트륨 및 구연산을 포함할 수 있다. 상기 완충제는 0.01 내지 10% (W/V)로 포함할 수 있다. 상기 완충제를 이용하여 본 발명의 균주가 성장하기에 적정한 환경을 조성할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 유산균이 활동할 수 있는 통상적인 pH 조건이 사용될 수 있고, 일례로 pH 가 2 내지 7일 수 있다. 보다 바람직하게는 pH 4 내지 5의 조건일 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 균주를 활성을 나타낼 수 있는 유효량을 포함할 수 있으며, 조성물 1ml당 11 내지 920개의 균주를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 조성물 1ml당 13 내지 910개 정도로 포함할 수 있다.
상기 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 균주 및 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2 (KCTC18346P) 균주수를 혼합하여 포함하는 경우, 상기 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1 균주수 대비 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2 균주수가 1:100 내지 100:1일 수 있다. 보다 바람직하게는 1:10 내지 10:1의 비율로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 질증을 나타내는 세균에 대하여 그 활성을 감소시키고 수를 감소시키는 작용을 하며, 보다 구체적으로 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 질트리코모나스균(Trichomonas vaginalis), 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 연쇄구균(Streptococcus), 포도상구균(Staphylococcus), 대장균(Escherichia coli), 펩토스트렙토코커스 균속(Peptostreptococcus spp.), 모빌룬쿠스 균속(Mobiluncus spp.), 박테로이드 균속(Bacteroides spp.), 프리보텔라 균속(Prevotella spp.), 펩토코커스 균속(Peptococcus spp.), 및 마이코프라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)를 포함하는 군으로부터 선택되는 병원체의 존재 및/또는 활성을 감소 및/또는 제거할 수 있다.
본 발명에 사용된 상기 주들은 세균성질증 환자의 질 내 생태계에서 주요 세균(정상 무리균)이 되고 이들이 세균성 질증의 원인균을 억제하고, 구연산과 제3인산나트륨은 질 내의 pH를 4.0~4.5로 낮추어 질증 원인균의 성장을 직접 억제하고 또한 본 발명의 균주의 생존을 보장하여 상기 균주의 병원균 억제력을 더욱 증가시킨다. 본 발명은 이를 통해 반복하여 재발되는 세균성 질증, 위축성 질증 환자의 질 내 세균 생태계를 원래의 건강한 상태로 환원하고, 재발병률을 크게 낮출 수 있다.
이하에서는 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
[실시예]
1. 균주 획득 및 배양
세균성 질증의 진단 기준인, Amsel's composite clinical criteria (비특허문헌 3)와 Yang 등 (비특허문헌 4)의 결과를 적용하여 세균성 질증이 없는 것으로 확인된 43세의 건강한 여성의 질에서 채취한 샘플을 MRS(Man-Rogosa-Sharpe) 아가(MERCK, 독일)에 접종하고 5% 이산화탄소와 함께 일회용 무산소 배양기(Quick anaerosystem, Sindo Co., 한국)에서 48시간 무산소 배양을 하였다 (비특허문헌 5).
이후 모양과 크기가 다른 2가지 집락이 분리되어 그람 염색을 시행한 결과, 둘 다 그람 양성 막대균이었으며, 두 균주의 현미경상 형태는 서로 달랐다.
두 균주들은 무산소 상태에서 최적 성장을 하였으며, 5~10% 산소의 존재 하에서도 성장을 하였으나 무산소 상태보다는 느리게 성장하였다. 두 균주는 최적 성장에 이산화탄소를 필요로 하지는 않았으며, 5% 저산소 상태에서 냉장 보관하였을 경우, 5일 후에 균수가 감소하여 12일 후에는 모두 사멸하였다. 반면에 무산소 상태에서 냉장 보관하였을 경우, 24일 후까지도 균수의 감소가 없었다. 이러한 결과로 미루어 두 균주는 호무산소, 내기성, 비호이산화탄소 상태에서 성장하는 균주들 임을 알 수 있었다.
2. 분리된 균주의 분자생물학적 동정
상기에서 분리한 두 개의 균주들을 무산소 상태로 한국미생물보존센터 (KCCM)에 보내어 16S rRNA 부분 시퀀싱(partial sequencing)을 의뢰한 결과, 각각 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans)와 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus)로 동정되었다(Gene Bank Data homology search results: 99%),(도 1a 및 도 1b 참조). 이에 따라, 상기 균주를 각각 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1와 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2로 명명하였다.
상기 분리 균주의 16S rRNA 부분 시퀀싱(partial sequencing)은 다음과 같은 방법으로 실행하였다. 상기 균주들의 chromosomal DNA를 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, 미국)를 이용해 분리한 다음, 16S rRNA sequencing에 사용하는 범용 프라이머(universal primer)인 27F (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') 프라이머를 사용하여 MyCycler Thermal Cycler system (Bio-Rad)을 이용해 PCR 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel 및 PCR clean-up system (Promega, 미국)을 이용하여 정제하였고, 정제된 산물은 ABI PRISM BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing kits (Applied Biosystems Co.)를 사용하여 ABI PRISM 3730XL Analyzer (96 capillary type)를 통해 염기서열을 분석하였다. 그 결과를 BLASTN 프로그램을 이용하여 GENEBANK 의 리보솜 DNA 시퀀스와 비교하였으며, 시퀀스의 상동성은 Clustal X와 Mega 6 프로그램을 이용하여 비교 분석하였다.
상기 분석 결과, 각각 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1는 16s RNA 염기서열은 서열목록 1에 표시된 것과 같고, 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2의 16s RNA 염기서열은 서열목록 2에 표시된 것과 같았다.
상기의 각각 균주들은 한국생명공학연구원에 기탁하여, 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1는 기탁번호 KCTC18345P, 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2는 기탁번호 KCTC18346P로 기탁하였다.
3. 분리된 균주들의 생화학적 성상
상기 분리된 두 균주, 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1와 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2를 대상으로 API 50 CHL kit(BIOMETRIUX, 프랑스) 시험을 실시하였다. S. denitrificans YH1에 대하여 효소 활성 상태를 알기 위하여 API ZYM kit (BIOMETRIUX, 프랑스) 시험을 추가로 실시하였다. 두 균주 모두 혐기적 상태에서 배양하였다.
생화학적 검사 결과, API CHL kit 검사에서 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1는 갈락토즈(galactose), D-글루코즈(glucose), D-프럭토즈(fructose), D-만노즈(mannose), 만니톨(mannitol), N-아세틸글루코사민(acetyl glucosamine), 에스쿨린(esculine), 살리신(salicine), 셀로바이오즈(cellobiose), 말토즈(maltose), 락토즈(lactose), 사카로즈(saccharose), 트레할로즈(trehalose), 아미돈(amidon), 글리코겐(glycogen)을 가수분해 하였다.
락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2는 갈락토즈(galactose), D-글루코즈(glucose), D-프럭토즈(fructose), D-만노즈(mannose), N-아세틸 글루토사민(acetyl glucosamine), 에스쿨린(esculine), 말토즈(maltose), 락토즈(Lactose), 사카로즈(saccharose), 글리코겐(glycogen)을 가수분해 하였으나 살리신(salicine), 셀로바이오즈(cellobiose), 트레할로즈(trehalose), 아미돈(amidon) 은 분해하지 못하였다. (표 1 참조)
No. 항목 S.denitrificans YH1 L.crispatus YH2
0 대조군(Control) - -
1 글리세롤(Glycerol) - -
2 에리쓰리톨(Erythritol) - -
3 D-아라비노즈(Arabinose) - -
4 L-아라비노즈(Arabinose) - -
5 라이보즈(Ribose) - -
6 D-자일로즈(Xylose) - -
7 L-자일로즈(Xylose) - -
8 아도니톨(Adonitol) - -
9 β-메틸 자일로사이드(Methyl-xyloside) - -
10 갈락토즈(Galactose) + +
11 D-글루코즈(Glucose) + +
12 D-프럭토즈(Fructose) + +
13 D-만노즈(Mannose) + +
14 L-소르보즈(sorbose) - -
15 람노즈(Rhamnose) - -
16 둘시톨(Dulcitol) - -
17 이노시톨(Inositol) - -
18 만니톨(Mannitol) + -
19 소르비톨(Sorbitol) - -
20 α-에틸(ethyl)-D-만노시드(mannoside) - -
21 α-메틸(Methyl)-D-글루코시드(glucoside) - -
22 N-아세틸 글루코사민(acetyl glucosamine) + +
23 아미그달린(Amygdaline) - -
24 아르부틴(Arbutine) - -
25 에스쿨린(Esculine) + +
26 살리신(Salicine) + -
27 셀로바이오즈(Cellobiose) + -
28 칼토즈(Maltose) + +
29 락토즈(Lactose) + +
30 멜리바이오즈(Melibiose) - -
31 사카로즈(Saccharose) + +
32 트레할로즈(Trehalose) + -
33 이눌린(Inuline) - -
34 멜레지토즈(Melezitose) - -
35 D-라피노즈(Raffinose) - -
36 아미돈(Amidon) + -
37 글리코겐(Glycogen) + +
38 자일리톨(Xylitol) - -
39 β-젠티오바이오즈(Gentiobiose) - -
40 D-투라노즈(Turanose) - -
41 D-릭소즈(Lyxose) - -
42 D-타가토즈(Tagatose) - -
43 D-푸코즈(Fucose) - -
44 L-푸코즈(Fucose) - -
45 D-아라비톨(Arabitol) - -
46 L-아라비톨(Arabitol) - -
47 글루코네이트(Gluconate) - -
48 2-케토 글루코네이트(Keto-gluconate) - -
49 5-케토 글루코네이트(Keto-gluconate) - -
4. 균주들의 질증 원인균에 대한 성장 억제 효과
(1) 평판 도말실험 및 결과
사람 적혈구 용액은 다음과 같이 준비하였다. 농축 적혈구 혈액에 생리식염수를 첨가하여 이것을 냉장 원심분리기(Vision Scientific Co., VS-21SR, 한국)에서 3,000 rpm으로 3차례 원침하여 세척한 다음, 상청액을 제거한 적혈구에 증류수를 부가하여 사람 전혈 용량으로 환원하였다. 상기 적혈구액을 유연한 플라스틱 용기에 넣고 -80℃ 냉동고에 30분 동안 동결하고 다시 꺼내어 즉시 해동하는 과정을 3회 반복하였다. 용혈된 적혈구액을 다시 증류수로 2.5배 희석한 다음, 이를 냉장 원심분리기에서 15,000 rpm으로 원침하여 상청액만 수합하고 0.45㎛ 밀리포어 일회용 여과기로 여과 멸균하여 -80℃ 에서 냉동 보관하면서 필요할 때 해동하여 사용하였다.
가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis, ATCC 14018)에 대한 실험은 다음과 같이 수행하였다. 카스만 아가 베이스 (Casman agar base, BBL, 미국)와 MRS 아가 (Merck, 독일)를 동량으로 혼합하고 사람 적혈구 용해액을 5% 첨가하여 CMB 배지라고 약칭하였다. 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)는 사람 적혈구 용해액 5%를 첨가한 카스만 액체배지(Casman broth)에서 5% 이산화탄소, 무산소 상태로 48시간 배양하고 균액을 생리식염수로 1,000배 희석하여 면봉으로 취한 다음, CMB 아가에 도포하였다. MRS 액체배지에서 24시간 무산소 배양한 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1과 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2를 생리식염수로 100배 희석하여 10㎕ 를 취한 다음, 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)가 도포된 CMB 아가의 중앙에 각각 떨어뜨린 후, 5% 이산화탄소, 무산소 상태에서 48시간 배양하여 프로바이오틱스 주변의 성장 억제대의 직경(mm)을 측정하였다.
박테로이드 프라길리스(B. fragilis, ATCC 25285), 모빌룬쿠스 물리에리스(M. mulieris, ATCC 35239) 및 펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스(P. asaccharolyticus, KCTC 3321)에 대한 실험은 다음과 같이 수행하였다. 윌킨스-찰그렌 아가 (Wilkins-Chalgren agar, DIFCO, 미국)와 MRS 아가를 동량으로 혼합하고 WCM 배지라고 약칭하였다. 윌킨스-찰그렌 혐기성 액체배지(Wilkins-Chalgren anaerobe broth, OXOID, 영국)에서 48시간 무산소 배양한 상기 세 균주들을 생리식염수로 2,000배 희석하여 면봉으로 취한 다음, WCM 아가에 도포하였다. 생리식염수로 100배 희석한 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1과 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2 10㎕ 를 취한 다음, 상기 세 균주들이 도포된 WCM 아가의 중앙에 떨어뜨린 후, 5% 이산화탄소, 무산소 상태에서 48시간 배양하여 프로바이오틱스 주변의 성장 억제대의 직경(mm)을 측정하였다.
각각의 균주에 대하여 평판 세 개를 사용하였다. 실험 결과는 도 2 및 도 3에 도시하였으며, 각 세 개 측정판의 억제대의 크기 평균은 하기 표 2에 나타냈다.(단위 : mm, 측정값은 3회 측정의 평균값)
B. fragilis G. vaginalis M. mulieris P. asaccharolyticus
S. denitrificans YH1 35 35 25 60
L. crispatus YH2 25 30 20 40
스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1에 대한 API zym kit 효소활성검사에서 알카린 포스포파타아제(alkaline phosphatase), 트립신(trypsin), β-갈락토시다아제(galactosidase), α-글루코시다아제(glucosidase), β-글루코시다아제(glucosidase)가 활성을 나타내었다(표 3 참조).
No. 항목 결과
0 대조군(Control) -
1 알카린 포스파타아제(Alkaline phosphatase) +
2 에스터라아제(Esterase) (C4) -
3 에르터라아제 리파아제(Esterase Lipase) (C8) -
4 리파아제(Lipase) (C14) -
5 류신 아릴아미다아제(Leucine arylamidase) -
6 발린 아릴아미다아제(Valine arylamidase) -
7 크리스틴 아릴아미다아제(Crystine arylamidase) -
8 트립신(Trypsin) +
9 α-키모트립신(chymotrypsin) -
10 애시드 포스파타아제(Acid phosphatase) -
11 나프톨(Naphthol)-AS-B1-포스포하이드롤라아제(phosphohydrolase) -
12 α-갈락토시다아제(galactosidase) -
13 β-갈락토시다아제(galactosidase) +
14 β-글루쿠로니다아제(glucuronidase) -
15 α-글루코시다아제(glucosidase) +
16 β-글루코시다아제(glucosidase) +
17 N-아세틸(acetyl)-β-글루코사미니다아제(glucosaminidase) -
18 α-만노시다아제(mannosidase) -
19 α-푸코시다아제(fucosidase) -
(2) 혼합 액체 배양 실험 및 결과
두 개의 CMB 액체배지에 희석하지 않은 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis, ATCC 14018) 배양 원액 100㎕ 와 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1과 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2의 배양 원액 20㎕ 를 각각 48시간 혼합 무산소 배양한 후, 자동피펫으로 100㎕ 씩 취하여 G. vaginalis를 분리하기 위하여 카스만 혈액 아가(Casman's blood agar)에 선상 도말하고, 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1과 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2를 분리하기 위하여 MRS 아가에 선상 도말한 다음, 5% 이산화탄소와 함께 48시간 무산소배양을 하였다.
가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)와 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1을 CMB 액체배지에 혼합 배양한 후, 선상 도말법에 의해서 카스만 혈액 아가(Casman's blood agar)에서 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)를 분리 배양하였으나 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)의 집락은 전혀 분리되지 않았고, MRS 아가에서는 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1이 대량으로 배양되었다.
가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)와 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2를 CMB 액체배지에 혼합 배양한 후, 동일한 방법으로 분리 배양하였으나, 마찬가지로 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)의 집락은 전혀 분리되지 않았으며, MRS 아가에서 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2가 대량으로 배양되었다.
5. 구연산과 제3인산나트륨 혼합액의 질증 원인균에 대한 성장 억제 효과
(1) 가르드네렐라 바기날리스( G. vaginalis )에 대한 성장 억제
윌킨스-찰그렌 혐기성 액체배지(Wilkins-Chalgren anaerobe broth)에 사람 적혈구 용해액을 5% 되게 첨가한 액체배지를 기저배지로 하여, 다음과 같이 각각 실험배지를 구성하였다.
Control
(기저배지)		 WCCT-1 WCCT-2 WCCT-3
구연산
(citric acid monohydrate)		 - 0.25 % 0.5 % 1.0 %
제3인산염
(trisodium phosphate 12hydrate)		 - 0.55 % 0.8 % 2.6 %
pH 6.92 6.27 6.27 6.27
상기 배지들을 나사형 시험관(screw cap tube)에 5㎖ 씩 분주, 멸균하고 24시간 무산소 배양한 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis, ATCC 14018) 배양액 100㎕ 씩 접종하고 무산소 배양하였다. 배양 후 24시간, 48시간 후의 균액들을 취하여 생리식염수로 10배 계단 희석하고, 각 희석액을 100㎕ 씩 취하여 희석액 당 콜럼비아 아가 베이스(Columbia agar base, Merck, 독일)에 혈액을 넣은 혈액아가평판 3개에 도포하여 48시간 배양 후에 집락의 수를 계수하여 평균값을 구하는 평판 도포법(spread plate method)을 시행하였다.
상기 실험 결과는 표 5 및 도 4에 도시하였다. 배양 초기 집락수는 배양 초기 2.3 x 106/㎖이다. 배양 24시간 후에 WCCT-1 배지(pH 6.27)의 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis) 성장 억제 효과가 다른 배지, WCCT-2 (pH 6.27)와 WCCT-3 (pH 6.27)배지의 성장 억제 효과와 비슷하였다. 48시간 후에는 WCCT-1 배지에서는 전혀 성장하지 않았다.
배지 배양 24시간(/ml) 배양 48시간(/ml)
WCCT-1 6.0 x 105 무성장
WCCT-2 4.2 x 105 2.0 x 104
WCCT-3 4.2 x 105 3.3 x 103
Control (기저배지) 1.29 x 108 1.3 x 105
(2) 박테로이드 프라길리스( B. fragilis ), 모빌룬쿠스 물리에리스( M. mulieri s), 펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스( P. asaccharolyticus )에 대한 성장 억제
윌킨스-찰그렌 혐기성 액체배지(Wilkins-Chalgren anaerobe broth)를 기저배지로 하여, 다음과 같이 각각 실험배지를 구성하였다.
Control
(기저배지)		 WCCA WCCT WCHCL
구연산
(citric acid monohydrate)		 - 0.34 % 0.5 % -
제3인산염
(trisodium phosphate 12hydrate)		 - - 0.2 % -
2N 염산(HCl) 첨가 X X X O
pH 6.92 4.22 4.22 4.22
상기 배지들을 나선형 시험관(screw cap tube)에 5㎖씩 분주, 멸균하고 기저배지에서 24시간 무산소 배양한 상기 3종의 무산소 균주들의 배양액 100㎕ 씩 접종하고 무산소 배양하였다.
상기 균들은 박테로이드 프라길리스(B. fragilis, ATCC 25285), 모빌룬쿠스 물리에리스(M. mulieris, ATCC 35239) 및 펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스(P. asaccharolyticus, KCTC 3321)을 사용하였다.
배양 후 24시간, 48시간 후의 균액들을 취하여 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)처럼 윌킨스-찰그렌(Wilkins-Chalgren) 아가에서 평판 도포법을 시행하였다.
상기 실험 결과는 표 7 및 도 5에 도시하였다. (단위: /㎖)
균 B. fragils M. mulieris P. asaccharolyticus
배지 배양24시간 배양48시간 배양24시간 배양48시간 배양24시간 배양48시간
WCCA 1.6 x 105 6.0 x 103 7.6 x 103 1.08 x 104 무성장 무성장
WCCT 1.3 x 104 2.3 x 102 1.5 x 103 1.03 x 103 무성장 무성장
WCHCL 6.2 x 105 7.0 x 103 30 10 무성장 무성장
Control(기저배지) 2.2 x 109 1.4 x 109 3.6 x 108 4.6 x 109 5.5 x 106 1.0 x 107
박테로이드 프라길리스(B. fragilis)의 초기 집락수는 7.0 x 108/㎖이었다., WCCT배지에서 24시간 후에 13,000/㎖에서 48시간 후에 균수가 230/㎖로 다른 배지에 비하여 현저히 감소하였다(도 5a 참조).
모빌룬쿠스 물리에리스(M. mulieris)의 초기 집락수는 3.2 x 108/㎖이었다., 24시간 후 WCCA 배지에서 7.6 x 104/㎖이었고 48시간에 1.08 x 104/㎖로 감소하였다. WCCT 배지에서 24시간 후 WCCA보다 10배 정도 감소한 1.5 x 104/㎖, 48시간에 1.03 x 103/㎖이었다. WCHCL 배지에서는 24시간 후 30/㎖, 48시간 후 10/㎖로 크게 억제되었다(도 5b 참조).
펩토스트렙토코커스 아사카롤리티쿠스(P. asaccharolyticus)의 초기 집락수는 3.0 x 106/㎖이었다., WCCA, WCCT, WCHCL 배지에서 24시간 및 48시간 배양하였으나 전혀 성장하지 않았다. 반면에 기저배지에서는 48시간 후에 접종량보다 증가하여 육안으로 혼탁하였다 (도 5c 참조).
(3) 본 발명 균주에 대한 성장 억제
MRS 액체배지 (pH 5.7)를 기저배지로 하여, 다음과 같이 각각 실험배지를 구성하였다.
Control
(기저배지)		 MRSCA MRSCT MRSHCL
구연산
(citric acid monohydrate)		 - 1.0 % 1.5 % -
제3인산염
(trisodium phosphate 12hydrate)		 - - 0.58 % -
5N 염산(HCl) 첨가 X X X O
pH 5.7 4.2 4.2 4.2
상기 배지들을 나사형 시험관에 5㎖ 씩 분주, 멸균하고 기저배지에서 24시간 무산소 배양한 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1과 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2 배양액 100㎕ 씩 각각 접종하고 무산소 배양하였다. 배양 후 24시간, 48시간 후의 균액들을 취하여 마찬가지로 MRS 아가에서 평판 도포법을 시행하였다. (단위: /㎖)
균 S. denitrificans YH1 L. crispatus YH2
배지 배양24시간 배양48시간 배양24시간 배양48시간
MRSCA 6.8 x 106 1.25 x 108 2.5 x 103 2.6 x 107
MRSCT 6.7 x 105 1.8 x 107 3.5 x 105 4.6 x 106
MRSHCL 1.2 x 108 1.2 x 108 1.33 x 106 2.3 x 107
Control(기저배지) 1.9 x 108 2.0 x 108 3.0 x 107 7.0 x 106
스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1의 초기 집락수는 3.4 x 107/㎖ 이었다. MRSCT 배지(pH 4.2)에서 배양 후 24시간에서 MRSCA 배지(pH 4.2)와 MRSHCL 배지(pH 4.2)보다 성장이 다소 억제되었으나 48시간 후에는 거의 비슷해졌으며, 기저배지(pH 5.7)와 큰 차이가 나지 않았다(도 6a 참조).
락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2의 초기 집락수는 2.7 x 106/㎖이었다. 배양 후 24시간에 MRSCA 배지에서 보다 더 잘 성장하였으며 MRSHCL과 큰 차이가 없었다. 48시간 후에는 기저배지와 비슷하게 성장하였다(도 6b 참조).
6. 가르드네렐라 바기날리스( G. vaginalis ) 균주와 본 발명 균주들의 항균제 감수성 검사
가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis)에는 감수성이 있고 프로바이오틱스들에 대하여 내성이 있는 항균제를 스크리닝 하기 위하여 항생제 원판 확산법을 수행하였다.
가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis, ATCC 14018)는 5% 사람 적혈구 용해액을 함유하는 콜럼비아 아가(Columbia agar)를 사용하였고, 본 발명 균주(S. denitrificans YH1 및 L. crispatus YH2)들에 대해서는 MRS 아가를 사용하였다. 항생제 디스크는 옥소이드(Oxoid) 제품을 사용하였다.
실험 결과는 억제환의 직경을 측정하여 표 10에 나타냈다.(단위: mm)
G. vaginalis
표준균주
(ATCC 14018)		 S. denitrificans YH1 L. crispatus
YH2
옥사실린(Oxacillin) 0 0 0
암피실린(Ampicillin) 10 0 0
반코마이신(Vancomycin) 40 35 35
카베니실린(Carbenicillin) 40 35 35
젠타마이신(Gentamicin) 0 0 0
트리메토프림 설파메톡사졸(Trimethoprim sulfamethoxazole) 0 0 0
이미페넴(Imipenem) 40 30 25
페니실린(Penicillin) G 10 0 0
세포탁심(Cefotaxime) 10 0 0
상기와 동일한 방법으로, 세균성 질증 환자 33명에게서 얻은 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis) 야생 균주 및 표준균주(ATCC 14018)에 대하여 오구멘틴, 메트로니다졸 및 클린다마이신을 적용하여 항생제 원판 확산법을 수행한 결과는 하기 표 11에 나타냈다.(단위: mm)
G. vaginalis
균주 번호		 항생제별 억제환 직경 (㎜) 바이오
타입
오구멘틴 메트로니다졸 클린다마이신
14-1 60 27 50 1
14-2 33 0 60 5
14-3 40 40 55 4
14-4 45 35 50 6
14-5 40 35 45 4
14-6 60 32 45 1
14-7 40 0 60 5
14-8 50 0 50 3
14-9 35 0 50 2
14-10 35 0 55 3
14-11 60 0 60 2
14-12 35 0 50 5
14-13 30 0 55 5
14-14 40 35 50 4
14-15 45 0 60 5
14-16 45 25 60 8
14-17 35 0 55 5
14-19 40 0 55 5
14-20 60 0 50 7
14-21 50 30 50 8
14-23 35 33 55 8
14-24 50 20 50 8
14-25 60 25 55 5
14-26 50 0 65 5
14-27 50 0 55 4
14-28 30 0 60 5
14-29 40 0 65 5
14-30 55 0 65 5
14-32 50 0 60 5
14-33 45 0 55 7
14-34 40 0 60 5
14-36 40 0 60 5
14-37 60 20 60 1
표준균주 ATCC 14018 60 0 55
평균±SD 44.9±9.5 - 55.45±5.5
실험결과, 메트로니다졸 (50㎍/disc)은 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis) 야생주 21균주 (64%)에 대하여 전혀 억제 효과를 나타내지 않았으며, 나머지 12균주들에 20~40㎜ 의 억제대를 보였다(표 11). 바이오타입 5는 15 균주 중 14 균주 (93%)가 완전 내성을 보였으며, 바이오타입 2, 3, 7 및 6 균주도 모두 완전 내성을 보인 반면에, 바이오타입 1, 4, 6, 8은 12 균주 중 1 균주를 제외하고 11 균주가 20~40㎜의 억제대를 보임으로써 메트로니다졸 내성과 바이오타입이 밀접한 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 한편, 클린다마이신은 평균 55.45±5.5㎜의 넓은 억제대를 나타내었고, 내성을 보이는 균주는 한 균주도 없었다. 오구멘틴 역시 44.9±9.5㎜의 비교적 넓은 억제대를 보였으며, 마찬가지로 내성을 보이는 균주가 한 균주도 없었다.
상기와 동일한 방법으로, 상기 야생 균주에 대하여 본 발명의 균주들을 적용하여 항생제 원판 확산법을 수행한 결과는 하기 표 12에 나타냈다.(단위: mm)
G. vaginalis
균주 번호		 바이오
타입		 S. denitrificans YH1에 의한 억제환 직경 (mm) G. vaginalis
균주 번호		 바이오
타입		 L. crispatus YH2에 의한 억제환 직경 (mm)
14-2 5 40 14-12 5 18
14-7 5 46 14-13 5 13
14-9 2 27 14-15 5 22
14-12 5 20 14-17 5 12
14-13 5 13 14-19 5 27
14-14 4 23 14-20 7 26
14-15 5 25 14-25 5 42
14-17 5 16 14-26 5 25
14-19 5 31 14-28 5 14
14-20 7 34 14-29 5 12
14-25 5 36 14-30 5 32
14-28 5 20 14-32 5 31
14-29 5 18 14-33 7 21
14-36 5 38 14-36 5 30
14-37 1 24 14-37 1 33
평균±SD 27.4±9.7 평균±SD 23.9±8.97
실험 결과, 억제대의 평균 직경은 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1이 27.4±9.7㎜이었고, 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2는 23.9±8.97㎜이었으며, 아울러 동일한 바이오타입에 대하여 다양한 억제대를 보임으로써, 바이오타입과 프로바이오틱스의 억제 효과는 서로 상관관계가 없었다.
이를 종합해 보면, 가르드네렐라 바기날리스(G. vaginalis) 야생주들은 메트로니다졸에 내성이 심하므로, 내성이 전혀 없는 클린다마이신으로 전 치료를 한 이후에, 아목시실린 이외 다른 제제를 사용하면 치료 효과가 극대화되고 두 가지 프로바이오틱스의 질 내 정착이 안정적으로 될 것으로 예상된다.
7. 치료 조성물의 제조
MRS 액체배지(Man-Rogosa-Sharpe broth)에 구연산 1%~1.5% 넣고, 제3인산나트륨 0.5%~0.8% 넣고 수소이온 농도를 pH 4.0~4.5 정도로 조정하여, 여기에 원심 분리하여 얻은 스테로이도박터 데니트리피칸스(S. denitrificans) YH1을 1.0 x 107~109개/㎖, 락토바실러스 크리스파투스(L. crispatus) YH2를 1.0 x 107~109개/㎖ 를 혼합한다. 이를 냉동건조(freeze-drying)용 유리병에 넣고 고무마개(rubber stopper)를 장착하여 냉동 건조기(freeze-dryer)에서 수분을 제거하고 진공 상태로 포장한다.
8. 치료 조성물의 투여
진공 포장된 상기 조성물을 사용 전에 증류수 2㎖ 을 주사기로 넣고 흔들어서 재 부유한 다음, 고무마개를 제거한 후, 1회용 스포이드로 빨아들인 후 여성의 질 내에 깊숙이 넣고 주입한다. 투여 횟수는 환자에 따라 다르며 약 주 2회 내지 5회 투여할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구 항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC18345P 20150112 한국생명공학연구원 KCTC18346P 20150112
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Claims (8)

  1. 삭제
  2. 1ml당 11 내지 920개의 스테로이도박터 데니트리피칸스(Steroidobacter denitrificans) YH1 (KCTC18345P) 균주로 구성되는 세균성 질증 치료용 조성물로서, 상기 조성물은 질내의 pH를 낮추어 질증 원인균의 성장을 직접 억제하며 상기 균주의 생존을 보장하기 위하여 pH가 2내지 7인 인산나트륨 및 구연산으로 이루어진 완충제를 0.01 내지 10% (W/V)로 포함하는 것을 특징으로 하는 세균성 질증 치료용 조성물.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 가르드네렐라 바기날리스(Gardnerella vaginalis), 질트리코모나스균(Trichomonas vaginalis), 임질균(Neisseria gonorrhoeae), 연쇄구균(Streptococcus), 포도상구균(Staphylococcus), 대장균(Escherichia coli), 펩토스트렙토코커스(Peptostreptococcus spp.), 모빌룬쿠스　 균속(Mobiluncus spp.), 박테로이드 균속(Bacteroides spp.), 프리보텔라 균속(Prevotella spp.), 펩토콕커스 균속(Peptococcus spp.), 마이코프라스마 호미니스(Mycoplasma hominis)를 포함하는 군으로부터 선택되는 병원체의 존재나 활성을 감소하거나 제거하는 것을 특징으로 하는 세균성 질증 치료용 조성물.
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