JP2012507557A5 - - Google Patents
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Claims (54)
- １つまたは複数のナノボディ分子を含む単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を、ＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質とを含有する混合物から分離または精製する方法であって、
ＳＤＡＢ分子が支持体に結合または吸着することを可能にする条件下で、混合物をプロテインAに基づくまたは陽イオン交換に基づく支持体と接触させることと、
ＳＤＡＢ分子が支持体に結合したままとなる条件下で、結合した支持体を洗浄することを含む、１つまたは複数の夾雑物質を除去することと、
ＳＤＡＢ分子を支持体から選択的に溶出させることと、
を含み、前記ＳＤＡＢ分子が相補的抗体可変ドメインまたは免疫グロブリンＦｃ領域を有さない、方法。 - 混合物をプロテインAに基づく支持体と接触させる、請求項１に記載の方法。
- 夾雑物質のうちの１つまたは複数を除去するステップが、結合した支持体を少なくとも１つのプロテインA洗浄緩衝液で洗浄することを含み、前記プロテインA洗浄緩衝液が、約７〜７．５の範囲のｐＨで約１００〜約１７５ｍＭのＮａＣｌおよび約４０〜約６０ｍＭのトリスを含む、請求項１または２に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子を支持体から選択的に溶出させるステップが、吸着したＳＤＡＢ分子を少なくとも１つのプロテインA溶出緩衝液で溶出させることを含み、前記プロテインA溶出緩衝液が、ｐＨ４．０以下で約５〜約５０ｍＭのＮａＣｌおよび約５ｍＭ〜約１００ｍＭのグリシンを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、ウイルス不活性化またはウイルス除去濾過のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- 混合物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させることと、ＳＤＡＢ分子をヒドロキシアパタイト樹脂から選択的に溶出させることとをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
- 混合物を陽イオン交換カラムと接触させること、ＳＤＡＢ分子をカラムから選択的に溶出させることとがさらに含まれる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、哺乳動物宿主細胞中で産生された組換えタンパク質である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- 哺乳動物宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項８に記載の方法。
- 混合物中の夾雑物質が、高分子量タンパク質凝集体、宿主細胞タンパク質、ＤＮＡ、または浸出したプロテインAのうちの１つまたは複数を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が少なくとも９０％の純度まで精製される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
- プロテインAに基づく支持体が、固定化した組換えもしくは単離完全長ブドウ球菌プロテインA（ＳｐＡ）、またはその機能的変異体の樹脂を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- 完全長ＳｐＡが、図４Ａに示す配列番号１１のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
- ＳｐＡの機能的変異体が、ＳｐＡの少なくともドメインＢ、または１つまたは複数の置換されたアスパラギン残基を有するドメインＢの変異体を含む、請求項１２に記載の方法。
- ＳｐＡの機能的変異体が、図４Ｂに示す配列番号１２のアミノ酸配列、またはそれに少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法。
- 混合物を陽イオン交換に基づく支持体と接触させる、請求項１に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質とを含有する混合物を、少なくとも約４０ｇ／Ｌの能力を示す陽イオン交換（ＣＥＸ）樹脂と接触させることと、
ＳＤＡＢ分子を支持体に通過させ、支持体を少なくとも１つの陽イオン交換洗浄緩衝液で洗浄することと、
ＳＤＡＢ分子を溶出緩衝液で溶出させることと
を含む、請求項１６に記載の方法。 - カラムに充填するために使用される馴化培地（ＣＭ）の伝導率が約１２〜９ｍＳ／ｃｍであり、充填条件のｐＨが約４．５以下となるように調整される、請求項１６または１７に記載の方法。
- 溶出緩衝液が約５０ｍＭ以下の塩化ナトリウムであり、約５．５〜７．２のｐＨを有する、請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
- 混合物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させることと、ＳＤＡＢ分子をヒドロキシアパタイト樹脂から選択的に溶出させることとをさらに含む、請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
- 混合物を平衡化緩衝液で前処理することと、前処理した混合物をヒドロキシアパタイト樹脂に通過させることを含む、請求項２０に記載の方法。
- 混合物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させるステップおよび溶出ステップを、ｐＨ約６．４〜７．６で、約１〜２０ｍＭのリン酸ナトリウムおよび約０．２〜２．５Ｍの塩化ナトリウムを含む緩衝溶液中で行う、請求項２１に記載の方法。
- 平衡化緩衝液が、ｐＨ約６．２〜８．０で、約１〜２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約０．０１〜２．０Ｍの塩化ナトリウム、約０〜２００ｍＭのアルギニン、約０〜２００ｍＭのＨＥＰＥＳを含む、請求項２１に記載の方法。
- 精製したＳＤＡＢ分子が１０％未満の高分子量凝集体を含有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
- １つまたは複数のナノボディ分子を含む単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を、ＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質とを含有する混合物から分離または精製する方法であって、
ＳＤＡＢ分子がプロテインAに基づく支持体に結合または吸着することを可能にする条件下で、混合物をプロテインAに基づく支持体と接触させることと、
１つまたは複数の夾雑物質を除去することと、
ＳＤＡＢ分子を支持体から選択的に溶出させることによって、溶出させたＳＤＡＢ分子調製物を得ることと、
溶出させたＳＤＡＢ分子調製物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させることと、
ＳＤＡＢ分子をヒドロキシアパタイト樹脂から選択的に溶出させることと、
を含み、前記ＳＤＡＢ分子が相補的抗体可変ドメインまたは免疫グロブリンＦｃ領域を有さない、方法。 - １つまたは複数のナノボディ分子を含む単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を、ＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質とを含有する混合物から分離または精製する方法であって、
ＳＤＡＢ分子がプロテインAに基づく支持体に結合または吸着することを可能にする条件下で、混合物をプロテインAに基づく支持体と接触させることと、
１つまたは複数の夾雑物質を除去することと、
ＳＤＡＢ分子を支持体から選択的に溶出させることによって、溶出させたＳＤＡＢ分子調製物を得ることと、
溶出させたＳＤＡＢ分子調製物を平衡化緩衝液で前処理することと、
前処理した混合物をヒドロキシアパタイト樹脂に通過させることと
を含み、前記ＳＤＡＢ分子が相補的抗体可変ドメインまたは免疫グロブリンＦｃ領域を有さない、方法。 - １つまたは複数のナノボディ分子を含む単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を、ＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質とを含有する混合物から分離または精製する方法であって、
ＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質とを含有する混合物を陽イオン交換支持体と接触させ、ＳＤＡＢ分子を支持体に通過させ、支持体を少なくとも１つの陽イオン交換洗浄緩衝液で洗浄することと、
１つまたは複数の夾雑物質を除去することと、
ＳＤＡＢ分子を支持体から選択的に溶出させることによって、溶出させたＳＤＡＢ分子調製物を得ることと、
溶出させたＳＤＡＢ分子調製物をヒドロキシアパタイト樹脂と接触させることと、
ＳＤＡＢ分子をヒドロキシアパタイト樹脂から選択的に溶出させることと、
を含み、前記ＳＤＡＢ分子が相補的抗体可変ドメインまたは免疫グロブリンＦｃ領域を有さない、方法。 - ＳＤＡＢ分子が、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む単鎖ポリペプチドである、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、軽鎖を天然に欠く抗体由来の少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項２８に記載の方法。
- 抗体がラクダ科抗体である、請求項２９に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が一価、二価、または三価の分子である、請求項２８に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、単一特異性、二重特異性、または三重特異性分子である、請求項２８に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、組換えの、ＣＤＲ移植した、ヒト化した、ラクダ化した、脱免疫化した、および／またはファージディスプレイによってｉｎｖｉｔｒｏで選択したものである１つまたは複数のナノボディ分子を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、サイトカイン、成長因子および血清タンパク質からなる群から選択される１つまたは複数の標的抗原と結合する、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と結合する、請求項３４に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）と結合する、請求項３４に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、ＴＮＦαと結合する２つのラクダ科可変領域とＨＳＡと結合する１つのラクダ科可変領域との単鎖ポリペプチド融合体からなる三価の二重特異性分子である、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、Ｎ末端からＣ末端まで抗ＴＮＦαＳＤＡＢ分子−抗ＨＳＡＳＤＡＢ分子−抗ＴＮＦαＳＤＡＢ分子の順序で配列されている、請求項３７に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、ＴＮＦαと結合するＳＤＡＢ分子の少なくとも１つを含み、配列番号２（ＤＹＷＭＹ（ＣＤＲ１））、配列番号３（ＥＩＮＴＮＧＬＩＴＫＹＰＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２））および配列番号４（ＳＰＳＧＦＮ（ＣＤＲ３））のアミノ酸配列を有する、または前記ＣＤＲのうちの１つと２個未満の保存的アミノ酸置換によって異なるＣＤＲを有する３個のＣＤＲを含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、ＴＮＦαと結合するＳＤＡＢ分子の少なくとも１つを含み、図２に示す配列番号１のアミノ酸約１〜１１５のアミノ酸配列、または図２に示す配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、ＨＳＡと結合するＳＤＡＢ分子のうちの少なくとも１つを含み、ＳＦＧＭＳ（ＣＤＲ１；配列番号５）、ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ（ＣＤＲ２；配列番号６）および／またはＧＧＳＬＳＲ（ＣＤＲ３；配列番号７）のアミノ酸配列を有する、または前記ＣＤＲのうちの１つと２個未満の保存的アミノ酸置換によって異なるＣＤＲを有する３個のＣＤＲを含む、請求項４０に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が、ＨＳＡと結合するＳＤＡＢ分子の少なくとも１つを含み、図２に示す配列番号１のアミノ酸約１２５〜２３９のアミノ酸配列、または図２に示す配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する可変領域を含む、請求項４２に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子のうちの２つ以上が、少なくとも５、７、８、９、１０、１２、または１５個のグリシンおよびセリン残基を含む連結基と融合されている、請求項１〜４３のいずれかに記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子のうちの２つ以上が、配列番号９のアミノ酸配列（（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）３−Ｓｅｒ）を含む連結基と融合されている、請求項４４に記載の方法。
- １つまたは複数のナノボディ分子が含まれる組換え単一ドメイン抗原結合（ＳＤＡＢ）分子を提供する方法またはプロセスであって、
組換えＳＤＡＢ分子をコードしている核酸を含む哺乳動物宿主細胞であって生体外の細胞を準備することと、
宿主細胞を組換えＳＤＡＢ分子が発現される条件下に維持することと、
組換えＳＤＡＢ分子と１つまたは複数の夾雑物質との混合物を得ることと、
プロテインAに基づくまたは陽イオン交換に基づくクロマトグラフィーを用いて、組換えＳＤＡＢ分子を前記混合物から精製または分離することと、
１つまたは複数の夾雑物質を除去することと、
ＳＤＡＢ分子を支持体から選択的に溶出させることによって、溶出させたＳＤＡＢ分子調製物を得ることと、
を含み、前記精製または分離ステップが、ＳＤＡＢ分子が支持体に結合または吸着することを可能にする条件下で、混合物を支持体と接触させることを含み、前記ＳＤＡＢ分子が相補的抗体可変ドメインまたは免疫グロブリンＦｃ領域を有さない、方法またはプロセス。 - 溶出させたＳＤＡＢ分子調製物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、金属アフィニティークロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション、限外濾過、またはウイルス除去濾過のうちの１つまたは複数に供することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
- 組換えＳＤＡＢ分子の製剤を医薬組成物として調製することをさらに含む、請求項４６または４７に記載の方法。
- 溶出させたＳＤＡＢ分子を事前に選択された標的体積まで濃縮することをさらに含む、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
- ヒスチジン緩衝液またはトリス緩衝液の存在下で限外濾過／ダイアフィルトレーションステップを行うことによって濃縮ステップが実施される、請求項４９に記載の方法。
- ＳＤＡＢ分子が少なくとも約８０ｇ／Ｌ〜３５０ｇ／Ｌまで濃縮される、請求項１〜４９のいずれかに記載の方法。
- 請求項１〜５１のいずれかに記載の方法によって精製されたＳＤＡＢ分子。
- 請求項５２に記載のＳＤＡＢ分子を含む医薬組成物。
- 疾患を処置または予防するための請求項５２に記載のＳＤＡＢ分子を有効成分として含む医薬組成物。
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