JP2011139708A - 新生物疾患又は免疫不全を処置するためのヒト化免疫調節性モノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】免疫賦活性効果を有するヒト化モノクローナル抗体の提供。
【解決手段】本発明の抗体は、Ｂリンパ芽球腫細胞に特異的に結合し、末梢血リンパ球の増殖及び活性化を誘発し、癌を罹患している対象に投与した際に抗腫瘍効果を誘発する能力を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は免疫療の分野に関し、より詳細には、本発明は、様々な症状の治療、特に癌の処置に有用なヒト化モノクローナル抗体に関する。

様々な形態の癌は、ヒトの主な死亡原因である。癌において最も幅広く使用されている治療的処置は、手術、放射線療法及び化学療法である。近年の免疫制御の分子レベル及び細胞レベルの知識の急増、特にＴ細胞応答レベルでの知識の急増が、腫瘍ワクチンの開発を含めた免疫療法的手法の新しい宝庫を提供している。一部のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｔ細胞の表面上の決定基に結合する能力及びこれらの細胞の増殖、活性化又は分化を誘導する能力を含む免疫調節性活性を有することが示されている。

マウスハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体は、ヒト患者に注入された時に免疫原性のアミノ酸配列のストレッチを相当量含んでおり、しばしば、初回処置後の抗体の治療効果を消失する。いわゆる「キメラ抗体」（即ちヒト定常領域に結合したマウス可変領域）の産生が多少有用であることが示されたが、顕著な免疫原性の障害が依然として残ったままである。

ドナーのマウス又はラット免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と組み合わせたヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む免疫グロブリンを産生させるために、組換えＤＮＡ技術が利用されてきた。このような新しいタンパク質は「再構成」又は「ヒト化」免疫グロブリンと呼ばれ、ドナー免疫グロブリンのＣＤＲをヒトフレームワークと組み合わせてヒト様免疫グロブリンに変換するプロセスは「ヒト化」と呼ばれる。ヒト化抗体は、元の抗体と同じ抗原に結合するがヒトに注射した際に免疫原性がより低いので重要である。

米国特許第６，２９４，６５４号は、改変免疫グロブリン分子或いはその（Ｉｇ）機能的断片又は一部を開示しており、これらは１つ又は複数の非ＣＤＲループに組み込まれている、Ｉｇに対する外来抗原性ペプチドを有しており、定常ドメインの主な骨格が維持されている。さらに、治療用途又は予防用途における改変抗体の使用が開示されている。

米国特許第６，０７４，６３５号は、抗原の非存在下で、Ｔ細胞を、インターロイキン−２、インターロイキン−６、及び腫瘍壊死因子αからなる群から選択される少なくとも２つのサイトカインの組合せ、又は機能的に等価なその断片と接触させることを含む、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原に依存せずに活性化させる方法を開示している。

米国特許第５，６５８，７４１号は、Ｔ細胞の活性化及び増殖を誘発させる方法であって、（ａ）複数のＴ細胞特異的モノクローナル抗体を、７〜２０重量％のアミン基を有し分子量が少なくとも１００，０００ダルトンのアミノデキストラン分子と、前記抗体と前記アミノデキストランとのモル比２以上で結合させ；（ｂ）前記結合体と前記Ｔ細胞を含む試料とを反応させて、前記結合させた抗体を前記Ｔ細胞に結合させ、前記Ｔ細胞の活性化及び増殖を誘発させる、ことを含む方法を開示している。

Ｑｕｅｅｎ他の米国特許第５，５８５，０８９号は、少なくとも１０^７Ｍ^−１且つドナー免疫グロブリンの約４倍未満の親和性定数で抗原に特異的に結合する、ドナー免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒトアクセプター免疫グロブリン重鎖及び軽鎖由来の重鎖及び軽鎖可変領域フレームワークとを有するヒト化免疫グロブリンであって、前記ヒト化免疫グロブリンはカバット（Ｋａｂａｔ）及びコーチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）ＣＤＲの外にあるドナー免疫グロブリンフレームワーク由来のアミノ酸を含み、ドナーアミノ酸がアクセプター免疫グロブリン重鎖又は軽鎖フレームワーク中の対応するアミノ酸を置換しており、前記ドナーアミノ酸のそれぞれが（Ｉ）ドナー免疫グロブリン配列内のＣＤＲに隣接している、又は（ＩＩ）前記ヒト化免疫グロブリン中のＣＤＲの原子を４Åの距離内に含んでいる、ヒト化免疫グロブリンを開示している。

Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号は、抗体の可変ドメイン又はその抗原結合断片が第１の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域と第２の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインの相補性決定領域とを有しており、前記第２の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインの抗原結合特異性、抗原結合親和性、種、クラス又はサブクラスが前記第１の免疫グロブリン重鎖又は軽鎖可変ドメインとは異なっている、改変型抗体又はその抗原結合断片を開示している。

米国特許第５，２２５，５３９号及び米国特許第５，５８５，０８９号は、当業者が改変型抗体、特にヒト化抗体の合成を実施するために十分な手段も、包括的な説明も提供していない。

本明細書中に参考として組み込まれる、本発明の発明者の１人による米国特許第５，８９７，８６２号は、モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、（ｉ）Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）に寄託番号Ｉ−１３９７号として寄託されているハイブリドーマ細胞系に分泌されている、又は（ｉｉ）（ｉ）の抗体と同じ抗原性エピトープを認識するモノクローナル抗体、或いはその抗原結合断片を開示している。米国特許第５，８９７，８６２号に開示されているモノクローナル抗体は、ヒトＢリンパ芽球腫細胞系である「ダウディ」細胞に対するものであり、ネズミリンパ球及びヒト末梢血Ｔ細胞を刺激することが示されている（Ｈａｒｄｙ他、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１８：２２、１９８９）。このネズミ抗体は、本明細書中でも以降ｍＢＡＴ−１と呼ぶ。ｍＢＡＴ−１はまた、ヒト起源の腫瘍（Ｈａｒｄｙ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：５７５６、１９９７）を含めた様々な腫瘍型で抗腫瘍性及び免疫賦活活性効果を示す（Ｈａｒｄｙ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．、１９：８９７、２００１）。

本明細書中に参考として組み込まれる、本発明の発明者の１人による国際公開公報ＷＯ００／５８３６３号は、ｍＢＡＴ−１の重鎖可変領域及び／又はκ軽鎖可変領域、或いはｍＢＡＴ−１の重鎖可変領域及び／又はκ軽鎖可変領域に少なくとも７０％同一である重鎖可変領域及び／又はκ軽鎖可変領域を含む可変領域を有するモノクローナル抗体を開示している。

ネズミ由来のＣＤＲとヒト由来のＦＲとを含むヒト化モノクローナル抗体が免疫応答性を誘発し得、さらに抗癌活性を示し得ることは、背景技術のどこにも教示も示唆もされていない。さらに、本発明のヒト化抗体の合成が背景技術に基づき予想することも定常的に行うこともできないことは当分野で周知であるので、機能的なヒト化抗体を設計する信頼できる方法の必要性は未だ満たされていない。

本発明の目的は、Ｂリンパ芽球腫細胞に結合して末梢血リンパ球の増殖及び活性化を誘発させる、ヒト化モノクローナル免疫調節性抗体（本明細書中で以降ｈＢＡＴ−１と呼ぶ）を提供することである。当該ｈＢＡＴ−１は、Ｂリンパ芽球腫細胞に結合して末梢血リンパ球の増殖及び活性化を誘発させ、さらに腫瘍を有する対象に注入した場合に抗腫瘍効果を誘発させる、既知のネズミモノクローナル免疫調節性抗体（本明細書中で以降ｍＢＡＴ−１と呼ぶ）に基づいている。

本発明は、ｍＢＡＴ−１のヒト化方法の包括的な説明及び各合成ステップの原理を提供する。したがって本発明で提供するヒト化方法の説明は、当業者によるｍＢＡＴ−１以外のＢＡＴ抗体のヒト化にも適している。

ヒト化ＢＡＴ−１抗体を投与することにより、癌の治療的予防、検出又は処置方法が提供される。本発明によって提供されるＢＡＴ−１抗体のヒト化形態を用いた、それを必要としている対象の処置は、キメラＢＡＴ−１抗体を用いた処置よりも相当に有効であり、有害な免疫原性応答が避けられる。

本発明は、一部、ヒト化ＢＡＴ−１抗体が親ネズミＢＡＴ−１抗体に誘発される抗腫瘍効果よりも大きな効果を誘発しているようであるという予想外の発見に基づいている。

第一態様によれば、本発明は、ドナー免疫グロブリン由来の少なくとも１つのＣＤＲとアクセプター免疫グロブリン由来のＦＲとを含むヒト化モノクローナル抗体を提供する。

一実施形態によれば、本発明は、ドナー免疫グロブリン由来の少なくとも１つのＣＤＲとアクセプター免疫グロブリン由来のＦＲとを含むヒト化モノクローナル免疫調節性抗体を提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、ＣＤＲのドナーがネズミモノクローナルＢＡＴ−１抗体（ｍＢＡＴ−１）であるモノクローナル免疫調節性抗体を提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、ＦＲが由来するアクセプターがヒト免疫グロブリンであるモノクローナル免疫調節性抗体を提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、ヒト化抗体がｍＢＡＴ−１モノクローナル抗体の生物活性を保持しており、ヒト対象において前記ネズミ抗体よりも免疫原性が低い、ドナーネズミモノクローナルＢＡＴ−１抗体（ｍＢＡＴ−１）由来の少なくとも１つのＣＤＲとアクセプターヒト免疫グロブリン由来のＦＲとを含むモノクローナル免疫調節性抗体を提供する。

さらに別の実施形態によれば、ヒト化ＢＡＴ−１抗体の軽鎖可変領域は以下の式によって特徴付けられる：
ＦＲ_Ｌ１−ＣＤＲ_Ｌ１−ＦＲ_Ｌ２−ＣＤＲ_Ｌ２−ＦＲ_Ｌ３−ＣＤＲ_Ｌ３−ＦＲ_Ｌ４
（式中、各ＦＲはそれぞれ独立にヒト抗体のフレームワーク領域であり、各ＣＤＲはそれぞれ独立にモノクローナルｍＢＡＴ−１抗体の相補性決定領域である）。

さらに別の実施形態によれば、ヒト化ＢＡＴ−１抗体の重鎖可変領域は以下の式によって特徴付けられる：
ＦＲ_Ｈ１−ＣＤＲ_Ｈ１−ＦＲ_Ｈ２−ＣＤＲ_Ｈ２−ＦＲ_Ｈ３−ＣＤＲ_Ｈ３−ＦＲ_Ｈ４
（式中、各ＦＲはそれぞれ独立にヒト抗体のフレームワーク領域であり、各ＣＤＲはそれぞれ独立にモノクローナルｍＢＡＴ−１抗体の相補性決定領域である）。

特定の実施形態によれば、本発明は、ヒトＴＥＬ９抗体の軽鎖可変領域由来のＦＲを含むモノクローナル抗体を提供する。

別の特定の実施形態によれば、本発明は、ＦＲ_Ｌ１、［ＥＩＶＬＴ ＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶ ＧＤＲＶＴ ＩＴＣ；配列番号１］；ＦＲ_Ｌ２、［Ｗ（Ｆ又はＹ）ＱＱＫＰＧ ＫＡＰＫＬ（Ｗ又はＬ）ＩＹ；配列番号２］；ＦＲ_Ｌ３、［ＧＶＰＳＲ ＦＳＧＳＧ ＳＧＴ（Ｄ又はＳ）（Ｙ又はＦ）（Ｃ又はＴ）ＬＴＩＮＳ ＬＱＰＥＤ ＦＡＴＹＹ Ｃ；配列番号３］；ＦＲ_Ｌ４、［ＦＧＧＧＴ ＫＬＥＩＫ；配列番号４］からなる群から選択される、ヒトＴＥＬ９抗体の軽鎖可変領域由来のＦＲアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の特定の実施形態によれば、本発明は、ヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５抗体の重鎖可変領域由来のＦＲを含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の特定の実施形態によれば、本発明は、ＦＲ_Ｈ１、［Ｑ（Ｉ又はＶ）ＱＬＶ ＱＳＧＳＥ ＬＫＫＰＧ ＡＳＶＫＩ ＳＣＫＡＳ ＧＹ（Ｔ又はＳ）Ｆ（Ｔ又はＳ）；配列番号５］；ＦＲ_Ｈ２、［ＷＶ（Ｒ又はＫ）ＱＡＰＧＱ ＧＬ（Ｑ又はＫ）ＷＭＧ；配列番号６］；ＦＲ_Ｈ３、［ＲＦ（Ｖ又はＡ）ＦＳＬＤＴ ＳＶ（Ｎ又はＳ）ＴＡＹＬＱ ＩＴＳＬ（Ｔ又はＮ）ＡＥＤＴＧ ＭＹＦＣ（Ｖ又はＡ）（Ｒ又はＫ）；配列番号７］；ＦＲ_Ｈ４、［ＷＧＱＧＴ ＬＶＴＶＳ Ｓ；配列番号８］からなる群から選択される、ヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５抗体の重鎖可変領域由来のＦＲアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＣＤＲ_Ｌ１［ＳＡＲＳＳ ＶＳＹＭＨ；配列番号９］；ＣＤＲ_Ｌ２［ＲＴＳＮＬ ＡＳ；配列番号１０］；ＣＤＲ_Ｌ３［ＱＱＲＳＳ ＦＰＬＴ；配列番号１１］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を提供する（式中、ＣＤＲはネズミＢＡＴ−１抗体に由来し、下付き文字「Ｌ」及び「Ｈ」はそれぞれ重鎖及び軽鎖領域を意味する）。

さらに別の特定の実施形態によれば、本発明は、ＣＤＲ_Ｈ１［ＮＹＧＭＮ；配列番号１２］；ＣＤＲ_Ｈ２［ＷＩＮＴＤ ＳＧＥＳＴ ＹＡＥＥＦ ＫＧ；配列番号１３］；ＣＤＲ_Ｈ３［ＶＧＹＤＡ ＬＤＹ；配列番号１４］からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン定常領域を有する完全長抗体、モノクローナルＩｇＧ、特にサブクラスγ１又はγ４のもの、単鎖抗体、それだけには限定されないがＦ（ａｂ’）_２断片若しくはＦ（ａｂ）又はＦｖを含めた抗体断片、標識抗体、固定抗体、外来化合物に結合させた抗体からなる群から選択される。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＢＡＴＲκ_Ａ（配列番号１５）、ＢＡＴＲκ_Ｂ（配列番号１６）、ＢＡＴＲκ_Ｃ（配列番号１７）、ＢＡＴＲκ_Ｄ（配列番号１８）からなる群から選択される軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＢＡＴＲＨ_Ａ（配列番号２０）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ（配列番号２１）、ＢＡＴＲＨ_Ｃ（配列番号２２）、ＢＡＴＲＨ_Ｄ（配列番号２３）又はＢＡＴＲＨ_Ｅ（配列番号２４）からなる群から選択される重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ＢＡＴＲＨ_Ａ／ＢＡＴＲκ_Ａ（配列番号２０／配列番号１５）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ａ（配列番号２１／配列番号１５）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｂ（配列番号２１／配列番号１６）、ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｂ（配列番号２２／配列番号１６）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｄ（配列番号２１／配列番号１８）、又はＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ（配列番号２２／配列番号１８）からなる群から選択される可変領域を含むモノクローナル抗体を提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明のヒト化モノクローナル抗体は、ＣＤＲ移植を利用して組換えＤＮＡ技術によって作製する。

第二態様によれば、本発明は、本発明のヒト化抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ヒト化抗体全体、或いはヒト化抗体の可変領域の軽鎖若しくは重鎖可変領域又は両方の鎖をコードすることができる。本発明はさらに、本発明のヒト化抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。したがって、ヒト化ＢＡＴ−１抗体は、重鎖及び軽鎖ベクターの同時トランスフェクション、又は軽鎖及び重鎖ポリヌクレオチド配列をどちらも含む単一ベクターのトランスフェクションの後、宿主細胞内で発現させ得る。

別の実施形態によれば、本発明は、本発明のヒト化モノクローナル抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチド配列を提供する。

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、本発明のヒト化抗体のκ軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を提供し、κ軽鎖可変領域は配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８からなる群から選択される。

別の好ましい実施形態によれば、本発明のヒト化抗体の軽鎖をコードしているポリヌクレオチド配列は配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９からなる群から選択される。

別の好ましい実施形態によれば、本発明は、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を提供し、重鎖可変領域は配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４からなる群から選択される。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明のヒト化抗体の重鎖をコードしているポリヌクレオチド配列は配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２からなる群から選択される。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、ヒト化ＢＡＴ−１抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、本発明のヒト化抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、ヒト化抗体全体、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、可変領域の両方の鎖からなる群から選択される、本発明のヒト化抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、本発明のヒト化抗体のκ軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供し、κ軽鎖可変領域は配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８からなる群から選択される。

さらに別の実施形態によれば、ベクターは、耐性遺伝子、プロモーター、シグナルペプチド、ポリＡ転写ターミネーター、選択マーカー、ゲノムヒトκ定常領域からなる群から選択される構成要素をコードしている少なくとも１つの配列をさらに含む。

さらに別の好ましい実施形態によれば、ベクターの構成要素は、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ＨＣＭＶ最初期プロモーター（ＨＣＭＶ Ｉｍｍｅｄｉａｔｅ Ｅａｒｌｙ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ゲノムヒトκ定常領域、マウス免疫グロブリンシグナルペプチド配列、コザック配列、シグナル配列イントロン、ＢＧＨポリＡ転写ターミネーター、Ｎｅｏ／Ｇ４１８選択マーカー、ハムスターｄｈｆｒ選択マーカーからなる群から選択される。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供し、重鎖可変領域は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４からなる群から選択される。

さらに別の実施形態によれば、ベクターは、耐性遺伝子、プロモーター、シグナルペプチド、ポリＡ転写ターミネーター、選択マーカー、ゲノムヒトＩｇ定常領域からなる群から選択される構成要素をコードしている少なくとも１つの配列をさらに含む。

さらに別の好ましい実施形態によれば、ベクターの構成要素は、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ＨＣＭＶ最初期プロモーター、ゲノムヒトＩｇＧ１定常領域、マウス免疫グロブリンシグナルペプチド配列、コザック配列、シグナル配列イントロン、ＢＧＨポリＡ転写ターミネーター、Ｎｅｏ／Ｇ４１８選択マーカー、ハムスターｄｈｆｒ選択マーカーからなる群から選択される。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ａ、ｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ｂ及びｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ｄからなる群から選択される、本発明のヒト化抗体のκ軽鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ａ、ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ｂ、ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ｃからなる群から選択される、本発明のヒト化抗体の重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明は、配列番号９３に記載の、本発明の完全なヒト化抗体をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。

第三態様によれば、本発明は、保管、増殖、抗体産生及び治療用途を目的とする、本発明の抗体又は断片をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む細胞を提供する。

別の実施形態によれば、宿主細胞はＣＨＯ、ＣＨＯｄｈｆｒ、ＮＳＯ、ＣＯＳ、ＣＯＳ７からなる群から選択され得る。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、診断及び治療で使用するための、本発明の抗体を活性成分として含む薬剤組成物を提供する。

さらに別の実施形態によれば、活性成分として本発明の抗体を含む薬剤組成物は、好ましくは癌の処置に使用する。

さらに別の実施形態によれば、薬剤組成物は、対象において原発腫瘍若しくは二次腫瘍が検出された後に、又は癌を発生する危険性の高い対象の予防治療として投与し得る。

さらに別の好ましい実施形態によれば、本発明のヒト化抗体は様々な腫瘍において抗腫瘍効果を誘発する。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、本発明の抗体を活性成分として含む薬剤組成物を有効量でそれを必要としている対象に投与することを含む、疾病又は疾患、特に癌を診断又は治療する方法を提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体は、それと一緒になって付加的又は相乗的に作用できる他の薬剤の投与と同時に、その投与前に、又はその投与後に投与する。

さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体は、サイトカイン、ＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α（インターフェロン−α）、細胞ワクチン、抗体、Ｔ細胞刺激抗体、抗腫瘍治療用抗体からなる群から選択される薬剤の投与と同時に、その投与前に、又はその投与後に投与する。

本発明の特定の実施形態によれば、ヒト化ＢＡＴモノクローナル抗体は、その機能又は活性がＡＴＣＣ＃（ＰＴＡ−５１８９）の下に寄託されている細胞により産生される抗体と同じである。

本発明の他の目的、特徴及び利点は以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。

ネズミＢＡＴ−１抗体のκ軽鎖可変領域（Ｖκ）のＤＮＡ配列及びペプチド配列を示す図である。 ネズミＢＡＴ−１のＶκ領域内のＣＤＲの標準クラスを示す図である。「コーチア標準クラス」とはコーチアと共同研究者が定義した標準クラスを使用した場合を示し（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７、１９８９、１９９２、同上；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：１７５、１９９０）、「マーチン標準クラス」とはマーチン及びソーントンが定義した標準クラスを使用した場合を示す（Ｍａｒｔｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６３：８００、１９９６）。ＦＲ残基を太字で強調した。 ネズミＢＡＴ−１抗体の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）のＤＮＡ配列及びペプチド配列を表す図である。 ネズミＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域内のＣＤＲの標準クラスを示す図である。「コーチア標準クラス」とはコーチアと共同研究者が定義した標準クラスを使用した場合を示し（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７、１９８９、１９９２、同上；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、同上）、「マーチン標準クラス」とはマーチン及びソーントンが定義した標準クラスを使用した場合を示す（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）。ＦＲ残基を太字で強調した。 提案されているヒト化ＢＡＴ−１のＶκ領域の様々な変型のアミノ酸配列を示す図である（配列番号１５〜１８）。ＢＡＴ−１のＶκ領域の残基とヒトＴＥＬ９のＶκ領域の配列とが一致する場合は点［．］で示した。特定の残基位置でアミノ酸が存在しない場合は長音記号［−］で示した。ＴＥＬ９のＦＲ内のアミノ酸がヒト化ＢＡＴ−１のＶκ領域で変化している場合は太字で強調した。ＣＤＲは術語［＝＝Ｌ１＝＝］を使用して記載した。使用した番号はカバットに従うものである（Ｋａｂａｔ他、免疫学上関心が持たれているタンパク質の配列、第５版（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、米国保健社会福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、米国政府印刷局（Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｏｆｆｉｃｅ）、１９９１）。 提案されているヒト化ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域の様々な変型のアミノ酸配列を表す図である（配列番号２０〜２４）。ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域の残基とヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のＶ_Ｈ領域の配列とが一致する場合は点［．］で示した。特定の残基位置でアミノ酸が存在しない場合は長音記号［−］で示した。ｈｓｉｇｈｖ１２９５のＦＲ内のアミノ酸がヒト化ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域で変化している場合は太字で強調した。ＣＤＲは術語［＝＝Ｈ１＝＝」を使用して記載し、［−−−−−］はＨ１ループ構造の一部を示す。使用した記号はカバットに従うものである（Ｋａｂａｔ他、同上）。 ヒト化ＢＡＴ−１抗体の再構成ヒトκ軽鎖可変領域の変型Ａ（ＢＡＴＲκ_Ａ）のＤＮＡ配列（配列番号８７）及びペプチド配列（配列番号１５）を示す図である。 ヒト化ＢＡＴ−１抗体の再構成ヒトκ軽鎖可変領域の変型Ｂ（ＢＡＴＲκ_Ｂ）のＤＮＡ（配列番号８８）及びペプチド（配列番号１６）を示す図である。 ヒト化ＢＡＴ−１抗体の再構成ヒトκ軽鎖可変領域の変型Ｄ（ＢＡＴＲκ_Ｄ）のＤＮＡ配列（配列番号８９）及びペプチド配列（配列番号１８）を表す図である。 ｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ｄベクター構築体の略図である。 ＢＡＴ−１軽鎖発現ベクターに挿入されたＢＡＴ−１軽鎖カセットの略図である。 ｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃベクター構築体の略図である。 ＢＡＴ−１重鎖発現ベクターに挿入されたＢＡＴ−１重鎖カセットの略図である。 ｐＧ１Ｄ２００γ−１免疫グロブリン重鎖哺乳動物発現ベクターの略図である。 ｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨＣ／ＲＫＤ単一発現ベクターの略図である（配列番号９３）。 完全ＢＡＴ−１抗体を発現させるための単一発現ベクターに挿入されたＢＡＴＲκ_Ｄ／ＢＡＴＲＨ_Ｃ重鎖及び軽鎖カセットの略図である。 ＢＡＴ−１キメラ抗体に対するヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｂ変異体のダウディ細胞ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＢＡＴ−１キメラ抗体に対するヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ａ及びＢＡＴＲＨ_Ａ／ＢＡＴＲκ_Ａ変異体のダウディ細胞ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＢＡＴ−１キメラ抗体に対するヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｂ及びＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ変異体のダウディ細胞ＥＬＩＳＡを示す図である。 ＢＡＴ−１キメラ抗体に対するヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｄ変異体のダウディ細胞ＥＬＩＳＡを示す図である。 ネズミＢＡＴ−１ ｍＡｂ及びヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂのダウディ細胞への用量依存結合曲線である。 対照（処置なし）及び元のネズミＢＡＴ−１ ｍＡｂで処置したものに対する、ネズミＢ１６肺腫瘍中のヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂ（ｈＢＡＴ）の用量依存的な転移抑制活性を例示する図である。全ての処置は腫瘍接種後１４日目に静脈内投与し、処置の１０日後に肺を検査した。 ヒトリンパ球を移植したＳＣＩＤマウス中のヒト黒色腫（ＳＫ−２８）に対するヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂの阻害効果を表す図である。腫瘍増殖に対するヒト化ＢＡＴ−１の効果を、対照（処置なし）又はネズミＢＡＴ−１ ｍＡｂ（ｍＢＡＴ−１）で処置したものと比較した。 ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに移植したネズミ腫瘍モデル（ＨＭ７）におけるヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂの転移抑制活性を実証する図である。 リンパ球にゲートをかけたフローサイトメトリーによって決定したヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂ（ｈＢＡＴ）とＣＤ４（Ａ）及びＣＤ８（Ｂ）との共局在を示す図である。 ヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂの、正常なドナーから単離したＢリンパ球の細胞マーカーＣＤ１９（Ａ）及びＣＤ２０（Ｂ）への結合を表す図である。 ヒト化ＢＡＴ ｍＡｂの、不活性（０日目、Ａ；５日目、Ｃ）及び活性（２日、Ｂ；５日、Ｄ）ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合を表す図である。 ヒト化ＢＡＴ ｍＡｂの、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８に結合させたビーズで活性化させたＣＤ６９^＋Ｔ細胞の用量依存的な結合を示す図である（活性化なし、Ａ；０．２５μｌ、Ｂ；０．５μｌ、Ｃ）。 ヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂとＴ細胞のＣＤ２５マーカーとの時間依存的な共局在を表す図である：０日目、Ａ；活性化２日目及び５日目、それぞれＢ及びＤ；活性化なしの５日目、Ｃ。 ヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂとＴ細胞のＣＤ４０−リガンドマーカーとの時間依存的な共局在を示す図である：０日目、Ａ；活性化の１日目、２日目及び５日目、それぞれＢ〜Ｃ及びＥ；活性化なしの５日目、Ｄ。 ｈＢＡＴに誘発された、２人の別個のドナー（Ａ及びＢ）から単離した生ＣＤ４＋細胞数の増加を表す図である。 ダウディ（Ａ）及びジャーカット（Ｂ）細胞系に結合しているｈＢＡＴを表す図である。 癌患者のＰＢＬに結合しているｈＢＡＴを実証する図である。

１．定義
便宜上、明細書、実施例及び特許請求の範囲内で用いる特定の用語を述べる。

用語「抗体」は、その最も広い意味で使用し、具体的にはモノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含める）及び所望する生物活性を示す限りは抗体断片を包含する。「抗体断片」は完全長抗体の一部分、一般にはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；単鎖抗体分子；並びに抗体から形成した多重特異性抗体が含まれる。

本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」とは、単一の抗原部位に対するものであり特異性が非常に高い抗体をいう。本発明に従って使用するモノクローナル抗体は組換えＤＮＡ法によって作製し得る（例えばＣａｂｉｌｌｙ他の米国特許第４，８１６，５６７号参照）。

用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」残基とは、本明細書中で定義する超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。本明細書中で使用する用語「超可変領域」とは、抗原の結合を司っている抗体のアミノ酸残基である。超可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは主に抗原のエピトープへの結合を司っている。ＦＲ及びＣＤＲの範囲は明確に定義されている（Ｋａｂａｔ他、同上参照）。

本明細書中で使用する用語「ヒト化抗体」とは、ヒト抗体由来のフレームワーク領域と非ヒト（通常はマウスやラット）免疫グロブリン由来の１つ又は複数のＣＤＲとを含む抗体をいう。場合によってはＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンの各部は天然ヒト免疫グロブリンの配列の対応する部分と実質的に同じである。重要なことに、ヒト化抗体はＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合することが予想される。さらなる詳細には、例えばＭｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ、英国の米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。

表現「ヒト抗体」とは、ヒトで実際に存在する遺伝子、又はその対立遺伝子、変異体若しくは突然変異体にコードされている抗体を意味することを意図する。

本明細書中で使用する用語「ドナー」又は「親」免疫グロブリンとは、ＣＤＲを提供している非ヒト免疫グロブリンをいう。

本明細書中で使用する用語「アクセプター」免疫グロブリンとは、フレームワークを提供しているヒト免疫グロブリンをいう。

本明細書中で使用する用語「発現ベクター」とは、所望するコード配列と、発現可能に連結されたコード配列の特定の宿主細胞内での発現に必要な適切な核酸配列とを含む組換えＤＮＡ分子をいう。宿主細胞ゲノムに組み込まれる発現ベクターだけでなく、宿主ゲノムに組み込まれないままでいるベクターも本発明に包含されることが企図される。

本明細書中でいう用語「遺伝子改変した細胞」は、ベクター、例えば目的ポリペプチドをコードしているウイルスによってトランスフェクション又は感染させた細胞に関し、この細胞は前記ポリペプチドを発現させる能力を有する。特に本発明においては、遺伝子改変した細胞は本発明の抗体を発現及び分泌する能力を有する。

用語「トランスフェクション」とは、宿主細胞へのＤＮＡの導入をいう。トランスフェクションした細胞内でコード配列が発現され得ることが企図される。数々のトランスフェクションの方法、例えばＣａＰＯ_４及び電気穿孔が当業者に知られている。

本明細書中で使用する用語「抗腫瘍効果」とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の低下、転移数の低下、推定寿命の上昇、又は癌の状態に関連する様々な生理的症状の寛解によって明示することができる生物学的効果をいう。「抗腫瘍効果」はまた、腫瘍が発生すること自体を予防する本発明の抗体の能力によっても明示することができる。その特性を考えると、本発明の抗体は急性癌の処置及び癌の予防のどちらにも使用することができる。

本明細書中では、「賦形剤」とは、化合物の投与をさらに容易にするために薬剤組成物に加える不活性物質をいう。賦形剤の例には、それだけには限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖及びデンプンの種類、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油及びポリエチレングリコールが含まれる。薬剤組成物はまた、１つ又は複数の追加の活性成分も含み得る。

用語「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号に開示されている方法をいう。

ＩＩ．発明を実施するための好ましい形態
ａ．抗体の調製
ＢＡＴ−１抗体をヒト化するために、ヒト化変異体を設計及び調製した後、非ヒト抗体出発物質、即ちｍＢＡＴ−１を調製する。ドナー非ヒト抗体可変ドメインの選択、抗体遺伝子配列のヒト化及び所望のヒト化抗体の産生を含めた本発明の一部の態様を以下のセクションに記載する。

（ｉ）非ヒト化抗体の調製
ネズミＢＡＴ−１モノクローナル抗体は以前に米国特許第５，８９７，８６２号に記載されている。それによると、モノクローナルネズミＢＡＴ−１抗体を産生する代表的なハイブリドーマ細胞系がＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐａｓｔｅｕｒ、２５，Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、７５７２４、パリ、セデックス１５に、寄託番号Ｉ−１３９７の下、１９９４年１月２８日に寄託されている。

或いは、ネズミＢＡＴ−１から産生させるようなキメラγ１／κＢＡＴ−１抗体をヒト化ＢＡＴ−１の調製に使用し得る。キメラＢＡＴ−１抗体及びその産生法はＰＣＴ出願ＷＯ００／５８３６３号に記載されている。

（ｉｉ）ヒト化抗体の設計戦略
本発明は、ドナー抗体、好ましくはマウス抗体のＣＤＲとヒトフレームワークとを組み合わせることによってドナー抗体をヒト様抗体に変換する方法によって、ＢＡＴ−１抗体をヒト化する手順を開示する。特定の実施形態では、ヒト化抗体のアミノ酸配列変異体を産生させることが望まれることがあり、これは、特にこれらがヒト化抗体の結合親和性又は他の特性を向上させる場合である。アクセプターであるヒト抗体の選択を含めて、ドナーＢＡＴ−１抗体と選択したヒトアクセプター抗体の両方について置換、挿入又は欠失のための部位を選択するために適用する方法を詳細に記載する。本明細書中に以下で提供する抗体のヒト化の大規模な解析及び指針は背景技術に開示されておらず、活性のある変更された抗体の調製に重要である。

ヒト化抗体の設計は、非ヒト抗体可変領域の重鎖及び軽鎖（本明細書中で以降それぞれＶ_Ｈ及びＶ_Ｌと呼ぶ）の配列解析によって開始することが好ましい。このような解析は、非ヒト化抗体と他のマウス可変領域とのＶ_Ｌ及びＶ_Ｈのアミノ酸配列の比較を含む。好ましい実施形態では、サブグループのコンセンサス配列でさらに比較を行うことができ、そこでは可変領域をカバットデータベース（Ｋａｂａｔ他、同上）に細分化した。可変領域の様々な要素の分類により、本発明の非ヒト化抗体のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈに類似しており構造が解明されている免疫グロブリン可変領域の選択が容易になる。

ヒトκ軽鎖可変領域（本明細書中で以降Ｖκとも呼ぶ）の選択、及びヒト化抗体の可変領域の基礎として役割を果たすＶ_Ｈ（アクセプター抗体とも呼ぶ）の選択は、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列に従って非ヒト抗体のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈの分類によって開始することが好ましい。具体的には、非ヒト化抗体のＶ_Ｌをカバット（Ｋａｂａｔ他、同上）に定義された４つのヒトκ軽鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列と比較し、次いでそれに従って分類する。同様に、非ヒト化抗体のＶ_Ｈを３つのヒト重鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列と比較し、それに従って分類する。

アクセプターヒトＶκ及びＶ_Ｈの選択は、本発明の親非ヒト抗体のＶ_Ｌ及びＶ_Ｈと公的に公開されているヒト可変領域の個別の配列の記録例とを比較することによって進めることが好ましい。適切なヒトＶκ及びＶ_Ｈは、親の非ヒト抗体に最も近い適合性に基づいて選択される。

ドナー及びヒト化抗体の配列解析並びに適切なモデルへの参照は、どの残基が抗原の結合や正しい抗体構造の維持に関与している可能性があるか、またヒト化抗体の構造を改善するためにどの残基を除去又は置換すべきかを識別するのに役立つことができる。

したがって、ヒト化抗体の設計を補助するために非ヒト抗体及びヒト化抗体の可変領域の分子モデルをどちらも準備する。これらの構造のモデリングは解析手順で決定された可変領域要素の分類に基づいており、例えば相同性及びａｂ ｉｎｉｔｉｏ技法を使用することによって得ることができる。対応するＸ線結晶解析による構造はブルックヘブン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）データベースから得ることができる。

ＦＲ、ＣＤＲ、及びループ構造などの本発明の非ヒト抗体の可変領域内の要素を、類似の構造が解明されている免疫グロブリン可変領域の要素からモデリングした。モデル内の立体衝突を同定し、ミスマッチの側鎖を選択して置換した。特に好ましい構造コンホメーションの手法には、コーチアと共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７、１９８９、１９９２、同上；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、同上）が記載したものに基づいた、標準（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）クラスに従った構造要素の分類が含まれる。構造予測の好ましい手法には、データベース検索、即ちＣＯＮＧＥＮ検索（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ，Ｒ．Ｅ．他、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２６：１３７、１９８７）が含まれる。ヒト化抗体の基礎として役割を果たすであろう選択されたヒトＶκ及びＶ_Ｈを同様にモデリングし、その残基のうちのいずれかが結合特異性に悪影響を与える可能性があるかどうかを決定するために、そのアミノ酸配列を調査する。

モデルの明らかな立体衝突を調整した後に、エネルギー最小化法を適用することが好ましい。エネルギー最小化は、望ましくない原子の接触を軽減すること並びにファンデルワールス及び静電気的相互作用を最適化することのどちらのためにも実施する。

上記設計手順の結果、ＢＡＴ−１のヒト化抗体変異体は、レシピエント抗体中にもドナー抗体中にも見い出されない、追加の又は置換された保存的アミノ酸残基を含ませることができる。元のアクセプター又はドナー抗体に含まれるアミノ酸の欠失を適用させてもよい。このような改変は抗体の性能を洗練させるために行い、抗原結合性や他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を与えない。改変において最も関心が持たれている部位には超可変性ループが含まれるが、ＦＲの変更も企図される。抗原の結合に関与する超可変領域残基又はＦＲ残基は一般に比較的保存された形で置換される。本発明で適用させ得る保存的置換には以下の選択肢が含まれる：Ｖａｌ、Ｉｌｅ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；Ｐｈｅ、Ｔｙｒ；Ｔｒｐ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｓｅｒ；Ｃｙｓ、Ｔｈｒ；Ｇｌｎ、Ｌｙｓ；Ｖａｌ、Ａｌａ；Ａｓｎ、Ｓｅｒ；Ｔｈｒ、Ａｓｎ。

（ｉｉｉ）ヒト化抗体変異体の構築
一般に、以下に詳述するように、ＢＡＴ−１抗体変異体は、従来組換え細胞培養において調製されていた。ここでは組換え合成が好ましいが、化学合成によってペプチドを調製すること、又はペプチドを天然源から精製することが知られている。

本明細書中に記載のように本発明を実施するのに適した分子生物学的技術及びＣＤＲ移植プロトコルは当業者に知られている。適切な教示は、とりわけ、付録を含めてその全体を参照として本明細書中に組み込むＳａｍｂｒｏｏｋ他（分子クローニング：実験の手引き、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌ他（分子生物学のプロトコル（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９８７、１９８８、１９８９）；米国特許第５，２２５，５３９号及び第５，５８５，０８９号を含めた数々の手引き及び主要な出版物に記載されている。

ＢＡＴ−１軽鎖及び重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を本明細書中で定義し、図５及び６に例示する：図５及び６：ＣＤＲ_Ｌ１（図５配列番号９及び図５配列Ｌ１）：ＳＡＲＳＳ ＶＳＹＭＨ；ＣＤＲ_Ｌ２（配列番号１０及び図５の配列Ｌ２）：ＲＴＳＮＬ ＡＳ；ＣＤＲ_Ｌ３（配列番号１１及び図５の配列Ｌ３）：ＱＱＲＳＳ ＦＰＬＴ；ＣＤＲ_Ｈ１（配列番号１２及び図６の配列Ｈ１）：ＮＹＧＭＮ；ＣＤＲ_Ｈ２（配列番号１３及び図６の配列Ｈ２）：ＷＩＮＴＤ ＳＧＥＳＴ ＹＡＥＥＦ ＫＧ；ＣＤＲ_Ｈ３（配列番号１４及び図６の配列Ｈ３）：ＶＧＹＤＡ ＬＤＹ。

これらのアミノ酸配列を使用して、本発明中で使用するためにこれらのＣＤＲをコードしているオリゴヌクレオチドを合成することができる。また、オリゴヌクレオチドは、例えばクローニングを容易にするために又は制限部位を導入するために、ＢＡＴ−１のＣＤＲのヌクレオチドに加えて別のヌクレオチドを含んでいてもよい。本発明のこの態様に適したオリゴヌクレオチド合成技術は当業者に周知であり、いくつかの市販されている自動合成機のうち任意のものを使用して実施し得る。さらに、本明細書中に示すＣＤＲをコードしているＤＮＡは、商業的なＤＮＡ合成業者のサービスを通じて得ることもできる。したがって、ＢＡＴ−１のＣＤＲを天然源から再クローニングする必要はない。

ｍＢＡＴ−１のＣＤＲをヒト抗体中に移植してヒト化ＢＡＴ−１変異体を生じさせる。この文脈におけるヒト抗体とは、ヒトに存在する任意の抗体、又はヒト免疫系と適合するようにある程度遺伝子操作した抗体をいうことを理解されたい。この目的に特に好ましいのは、広くいうと、患者において有害な免疫応答を引き起こさない抗体である。

ＣＤＲを移植したヒト化ＢＡＴ−１抗体を構築するために、上記参考文献に記載されているものなどの周知の組換え技法を用いて、ＢＡＴ−１のＣＤＲをコードしているオリゴヌクレオチドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている他のＤＮＡ並びにその断片中に組み込むことができる。具体的には、本発明に従ってＢＡＴ−１のＣＤＲを実用的なＦＲの任意の組合せに導入することができる。様々なヒト抗体遺伝子が公的にアクセス可能な寄託物の形で利用可能であり、これらの配列から上記の記載とほぼ同様に適切な抗体遺伝子を合成することができる。この観点からポリヌクレオチドのクローニング及び遺伝子操作に採用される好ましい技術は、ここに述べる方法及び実施例によって例示される。

ｍＢＡＴ−１及び再構成ＢＡＴ−１の軽鎖（図５）及び重鎖（図６）ＦＲ並びに改変ＦＲのアミノ酸配列を本明細書中で同定する：

ＢＡＴ−１のＣＤＲ及び／又はヒト抗体由来の特定のＦＲ残基をコードしているオリゴヌクレオチドを使用して、ヒト化ＢＡＴ−１変異体のＶκ又はＶ_ＨをコードしているＤＮＡにコドンを導入し得る。本発明のこの態様に従って、追加のコドンにはＢＡＴ−１のＣＤＲ由来でないものとＣＤＲを構成するものとが含まれ得る。これら追加の塩基は、ＣＤＲと外来源由来のＦＲとの連結を促進するために含め得る。これらは、この目的のために制限部位又は重複している相補領域を含んでいてもよい。鋳型ＤＮＡは通常一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ベクターである。

クローニング又は合成したＤＮＡ又はＲＮＡ中の塩基の欠失、挿入及び変更のために、特に周知の組換えＤＮＡ技法を用いてヒト化抗体中に取り込ませた後にＢＡＴ−１重鎖及び軽鎖のＣＤＲも改変し得る。この目的に適した部位特異的突然変異誘発技術は当業者に周知であり、組換えＤＮＡ技術の前述の参考文献中に例示されている。このような方法を使用して、事実上任意の所望する変更を、ＢＡＴ−１のＣＤＲをコードしているポリヌクレオチド内又は閉じた重鎖若しくは軽鎖遺伝子の他の領域内に導入することができる。

より短い、重複している一本鎖ＤＮＡからの、より長い二本鎖ＤＮＡの合成は当業者に周知である。同様に、平滑末端ＤＮＡ及び少なくとも部分的に重複している相補末端を有するＤＮＡを含めたＤＮＡの末端間連結も周知である。このような技術は、例えば組換えＤＮＡ技術に関する前述の参考文献中に例示されている。

ヒトＢＡＴ−１可変領域の全ての変型の構築は、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｓｔｅｍｍｅｒ他、ＧＥＮＥ、１６４：４９、１９９５）に記載のように実施することが好ましい。本質的には、この方法は多数のオリゴデオキシリボヌクレオチド（オリゴ）由来の長いＤＮＡ配列を合成する場合に好まれる。この方法は慣用のＰＣＲ技術を用いたＤＮＡポリメラーゼに依存しており、これによりアセンブリ形成過程中にますます長いＤＮＡ断片が構築される。新しい可変領域遺伝子を合成した後は、これを優先的にベクター内にサブクローニングし、上記参考文献中に記載のようにこれをコンピテント細胞に形質転換させる。推定陽性クローンは、適切なプライマーを用いた且つ／又は制限消化によるＰＣＲスクリーニングによって同定することができる。確認された陽性クローンから選択した個々のクローンを二本鎖ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡ）内にシーケンシングしてもよい。好ましくは、ＰＣＲにより生じたエラーについて生じたｄｓ−ＤＮＡを配列決定によって再確認し、他のクローンから正しい断片をサブクローニングすることによって修正することができる。

ＢＡＴ−１変異体のヒト化Ｖκ又はＶ_Ｈを含む、確認された陽性クローンからの選択したクローンのＤＮＡを、それぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域を含む発現ベクター内に直接挿入し得る。ヒト化ＢＡＴ−１のＣＤＲを移植した完全な抗体の変異体、又はヒト化ＢＡＴ−１のＣＤＲを移植した抗体の軽鎖若しくは重鎖領域をコードしているＤＮＡをアセンブリ形成させた後、慣用の技法による増殖及び発現のためにこれをベクター内に挿入することができる。このようにして、所望の量の抗体を得ることができる。

（ｉｖ）ヒト化ＢＡＴ−１抗体変異体の発現
本発明はまた、完全なヒト化ＢＡＴ−１抗体、軽鎖完全領域又は可変領域、重鎖完全領域又は可変領域配列をコードしている単離したポリヌクレオチド配列、並びにコード核酸を含むベクターや宿主細胞も提供する。

ＢＡＴ−１抗体の組換え産生には、前記抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチド配列を単離し、さらなるクローニング、増幅又は発現のために複製可能なベクター内に挿入する。抗体をコードしているＤＮＡは容易に単離され、慣用の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を用いて配列決定を行う。多くのベクターが利用可能であり、これには一般的に、それだけには限定されないが、シグナル配列、複製起点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、及び転写終結配列のうち１つ又は複数が含まれる。

発現のために、ヒト化ＢＡＴ−１抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングしてもよい。このようなベクターは当業者に周知である。免疫グロブリンやウイルスプロモーターなどの発現制御配列をポリヌクレオチドの上流に導入する。ｄｈｆｒ遺伝子などの選択マーカー、又は当業者に周知の他の適切な選択マーカーを、ベクター内に含まれる前記ポリヌクレオチドを発現している宿主細胞の選択を可能にするためにベクターに含める。

一実施形態では宿主細胞は内生的に抗体を産生し、代替実施形態では細胞は抗体を産生するように遺伝子改変されている。内生的に抗体を産生する細胞の例には、それだけには限定されないが、ハイブリドーマ、リンパ腫、プラズマ細胞腫及びＥＢＶ形質転換細胞が含まれる。細胞は、抗体分子をコードしているベクターを用いたトランスフェクションなどの慣用の方法によって、抗体を産生するように遺伝子改変することができる。

使用の際には、ヒト化ＢＡＴ−１抗体又はその断片をコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞内にトランスフェクションさせる。トランスフェクション方法は当分野で周知であり、このような方法は本発明での使用に適している。発現ベクター又は同時トランスフェクションに使用したベクターに組み込んだ選択マーカーを用いて発現ベクターを発現している細胞を選択する。抗体を発現している細胞は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）アッセイ又は当業者に周知の他の適切な方法によってスクリーニングすることができる。

ヒト化ＢＡＴ−１抗体変異体は、完全な抗体又は抗体のＦｖ断片をコードしているポリヌクレオチドを含むベクターのトランスフェクションによって、宿主細胞内に導入される。ヒト化ＢＡＴ−１抗体変異体も、（ｉ）抗体の可変領域又は完全軽鎖領域をコードしているポリヌクレオチドを含むベクター、及び（ｉｉ）抗体の可変領域又は完全重鎖領域をコードしているポリヌクレオチドを含むベクターの同時トランスフェクションによって宿主細胞内に導入される。

最も好ましい実施形態では、本発明の抗体は、抗体の軽鎖及び重鎖可変領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含む単一のベクターのトランスフェクションによって産生させる。最も好ましくは、このベクターは、それぞれが再構成ＢＡＴ−１の軽鎖及び重鎖領域をコードしているポリヌクレオチド配列に発現可能に連結されている２つのプロモーターをさらに含む。トランスフェクション及び同時トランスフェクションを同様の宿主細胞内で実施した場合、上記の結果生じるＢＡＴ−１抗体の発現は、それぞれが抗体軽鎖又は重鎖領域をコードしている２つのベクターを用いた同時トランスフェクション後の発現よりも高い。

ヒト化ＢＡＴ−１抗体変異体は、それだけには限定されないが、哺乳動物、トリ、昆虫、細菌又は酵母の細胞を含めた任意の適切な細胞型で発現させることができる。哺乳動物細胞の例には、それだけには限定されないが、ヒト、ウサギ、げっ歯類（例えばマウス、ラット）及びウシの細胞が含まれる。好ましい実施形態では、細胞は骨髄腫細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ７細胞又は線維芽細胞である。

抗体を産生する細胞系は、当業者に周知の技術を用いて培養し得る。このような技術は様々な実験の手引き及び出版物に記載されている。例えば、本発明で使用するのに適した技術は、付録を含めてその全体で参照として本明細書中に組み込まれる免疫学における最新プロトコル（ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｉｇａｎ他、（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、１９９１）に記載されている。

本発明のヒト化モノクローナル抗体は凍結又は凍結乾燥して保管し、使用前に適切な担体中で再構成することができる。この技術は従来の免疫グロブリンで有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥及び再構成技術を採用することができる。凍結乾燥及び再構成は様々な度合の抗体活性の損失をもたらす可能性があり、それを補うために使用レベルを調節せざるを得ないかもしれないことは、当業者には理解されよう。

（ｖ）ヒト化ＢＡＴ−１抗体の精製
組換え技術を使用して、抗体を細胞内又はペリプラズム空間で産生させるか、培地中に直接分泌させることができる。抗体を細胞内で産生させる場合は、第１ステップとして宿主細胞又は溶解断片のいずれかの粒子状の細胞片を、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ他、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３、１９９２）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のペリプラズム空間に分泌される抗体を単離する手順を記載している。手短に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分間かけて解凍する。細胞片は遠心分離によって除去することができる。

最も好ましい実施形態では、本発明の抗体は培地中に分泌され、このような発現系からの上清は一般に、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅの限外濾過ユニットを用いて濃縮する。タンパク質分解を阻害するために前述のステップのうち任意のものにプロテアーゼ阻害剤を含めてもよく、外来混入物の増殖を阻止するために抗生物質を含めてもよい。

細胞から調製した抗体組成物は、当分野で周知の方法、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、特にタンパク質Ａではアフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。親和性リガンドが結合しているマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）やポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの力学的に安定なマトリックスにより、アガロースで実現され得るよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。抗体がＣ_Ｈ ^３ドメインを含む場合は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、ニュージャージー州フィリップスバーグ）が精製に有用である。イオン交換カラム、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ヘパリンセファロース（商標）によるクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換樹脂（例えばポリアスパラギン酸カラム）によるクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ｐａｇｅ、及び硫酸アンモニウム沈殿による分画などタンパク質精製の他の技法も、回収する抗体に応じて利用可能である。

（ｖｉ）細胞系の寄託
本発明の代表的な実施形態によれば、ヒト化ＢＡＴモノクローナル抗体は、その機能又は活性が、２００３年５月９日にＡＴＣＣ＃（ＰＴＡ−５１８９）の下に寄託された細胞によって産生される抗体と同じである。

ＩＩＩ．薬理学
（ｉ）薬剤組成物
本発明はまた、本発明の抗体を含む組成物も提供する。

別の実施形態によれば、本発明は、診断及び治療で使用するための、活性成分として本発明の抗体を含む薬剤組成物を提供する。前記組成物は、それだけには限定されないが、溶液、懸濁液、使用前に適切なベヒクル又は希釈剤で再構成する凍結乾燥散剤、カプセル及び錠剤を含めた、患者への投与に適した任意の薬剤形態であり得る。本発明で開示する薬剤組成物は、とりわけ診断、予後及び治療用の治療剤と共に抗体を含む生理的に許容される結合を提供するために、任意の製薬上許容される希釈剤又は担体をさらに含み得る。

本発明の薬剤組成物は、当分野で周知の方法、例えば慣用の混合、溶解、顆粒化、粉砕、微粉砕、糖衣錠作製、湿式粉砕、乳化、カプセル封入、混入（ｅｕｔｒａｐｐｉｎｇ）又は凍結乾燥法によって製造し得る。

したがって、本発明により使用する薬剤組成物は、活性化合物の薬剤として使用できる調製物への加工を容易にする、賦形剤及び補助剤を含む１つ又は複数の生理的に許容される担体を使用して慣用の方法で配合し得る。適切な配合は選択する投与経路に依存する。

注射には、本発明の化合物を水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、又は生理食塩緩衝液などの生理的に適合性のある緩衝液中で配合し得る。経粘膜投与には、浸透させる隔膜に適切な浸透剤を配合物中に使用する。このような浸透剤、例えばポリエチレングリコールは当分野で一般に知られている。経口使用できる薬剤組成物には押し込み型のカプセルが含まれる。

吸入による投与には、本発明に従って使用する分子は、適切な噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ−テトラフルオロエタン又は二酸化炭素を用いた加圧パック又は噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で便利に送達される。加圧エアロゾルの場合、計量された量を送達するために弁を設けることによって単位用量を決定し得る。例えば吸入器又は吹込器で使用するゼラチンのカプセル及び薬包は、ポリペプチドとラクトースやデンプンなど適切な散剤基質との散剤混合物を含むように配合し得る。

非経口投与用の薬剤組成物には、水溶性形態にある活性成分の水溶液が含まれる。さらに、活性化合物の懸濁液を適切な油状の注射用懸濁液として調製し得る。適切な天然又は合成の担体は当分野で周知である。任意選択で、懸濁液は、化合物の可溶性を高めてより濃縮された溶液の調製を可能にする適切な安定剤又は薬剤も含んでいてよい。或いは、活性成分は、使用前に適切なベヒクル、例えば発熱物質を含まない滅菌水で再構成する散剤形態にあってよい。

本発明の状況下での使用に適した薬剤組成物には、活性成分が意図する目的を実現するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。投与する配合物は全て、選択した投与経路に適した用量にあるべきである。より具体的には、「治療上有効な」用量とは、処置する対象の疾病の症状を予防、緩和又は寛解するのに有効な化合物の量を意味する。治療上有効な量の決定は、特に本明細書中に提供した詳細な開示を鑑みると十分に当業者の能力範囲内にある。

本明細書中に記載の組成物の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準の製薬手順によって、例えば目的化合物のＩＣ_５０（５０％阻害をもたらす濃度）及び最大耐量を決定することによって決定することができる。これらの細胞培養物のアッセイ及び動物の研究から得られたデータは、ヒトで用いる用量範囲の処方に使用することができる。用量は用いる剤形及び利用する投与経路に応じて変化し得る。正確な配合、投与経路及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師が選択し得る。処置する状態の重篤度及び応答性に応じて、処置経路の期間を数日間から数週間、又は治癒するまで若しくは疾病状態が軽減するまでとして、投薬は徐放性組成物の単一投与であることもできる。投与する組成物の量は、もちろん、処置する対象、病気の重篤度、投与様式、処方する医師の判断、及び関連する他の要素全てに依存する。

（ｉｉ）処置方法
本発明による抗体は様々な治療的効能で有用であるが、本発明の現在好ましい実施形態に従って癌の処置に用いる。本発明によるモノクローナル抗体は、様々な腫瘍中で抗腫瘍効果を誘発させることが判明している。本発明の範囲内で、対象に本発明の抗体を有効量で投与することによって腫瘍を処置する、新規ｈＢＡＴ−１を使用する方法が提供されている。用語「有効量」とは、治療効果を実現するために必要な抗体の量を意味すると理解されるべきである。治療の最終結果を実現するために必要な有効量は、例えば腫瘍型及び患者の状態の重篤度（即ち癌の状態）、並びに抗体と付加的又は相乗的な様式で作用する別の薬剤を抗体と一緒に同時投与するかどうかを含めた、いくつかの要素に依存し得る。抗体は、対象において原発腫瘍又は二次腫瘍を検出した後に、又は放射線に曝された個体若しくは遺伝的素因をもつ個体などの癌を発生する危険性が高い対象における予防治療として投与し得る。

本発明はさらに、ヒト化ＢＡＴ−１抗体変異体又は前記抗体を活性成分として含む組成物を用いた、それを必要としている対象を処置する方法を提供する。

さらに別の実施形態によれば、本発明は、本発明の抗体を活性成分として含む薬剤組成物を有効量で、それを必要としている対象に投与することを含む、疾病又は疾患、特に癌を診断又は処置する方法を提供する。

処置方法は、本発明の抗体又は組成物を対象に投与することを含む。処置方法はまた、本発明の抗体又は組成物を、ＩＬ−１（インターロイケン−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＦＮ−α（インターフェロン−α）などのサイトカイン又は任意のＴ細胞刺激抗体や他の抗腫瘍治療用抗体などの他の抗体を含む、追加の活性組成物を用いた処置と平行して、その処置前に、又はその処置後に投与することも含む。一実施形態では、対象はヒトである。別の実施形態では、予防、処置又は検出する疾病は癌である。

前記組成物の投与は通常、非経口投与、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）又は筋肉内（ｉ．ｍ．）で行うことができる。処置方法は本発明による抗体の薬剤組成物を含み得る。その替わりに又はそれに加えて、処置方法は、細胞が自己由来又は同種異系であるｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｖｏの細胞療法を含み得る。

抗体の抗腫瘍活性をブーストするために、場合によっては、抗体と付加的又は相乗的に作用できる他の薬剤の投与と同時に、その投与前に、又はその投与後に本発明の抗体を投与することが有利である。例には、それだけには限定されないがＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＦＮ−α（インターフェロン−α）を含めた様々なサイトカイン、並びにそれだけには限定されないがＴ細胞刺激抗体又は抗腫瘍治療用抗体を含めた細胞ワクチンや追加の抗体が含まれる。

本発明の抗体は、免疫系の増殖活性、細胞溶解活性又は刺激活性に対する抗体の活性化又は他の効果が、例えばＨＩＶ感染の初期段階や血算によりＣＤ４＋Ｔ細胞（ＡＩＤＳ、後天性免疫不全症候群の原因ウイルス）の減少が示される患者、様々な自己免疫疾患、又は遺伝的若しくは後天性免疫不全の一部の症例などにおいて治療効果を得る、癌以外の様々な疾病の治療に有用であり得る。ＡＩＤＳ患者では、抗体を感染しているがまだ疾病の症状を全く発生していない個体、又はＨＩＶ感染過程の初期段階にある感染した個体に投与し得る。

対象に投与する抗体又は組成物の用量は、本発明の状況下では、対象において有益な治療応答を経時的に実現する又は腫瘍の増殖を阻害するのに十分であるべきである。したがって、疾病を緩和、軽減、治癒又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で抗体又は組成物を対象に投与し得る。

用量は、生じた治療組成物の活性及び対象の状態、並びに処置する対象の体重及び表面積によって決定される。用量の量及び投薬レジメントはまた、特定の対象に特定の治療組成物を投与することに付随して有害な副作用が存在するかどうか、並びにその性質及び程度によっても決定される。投与する治療組成物の有効量を決定する際に、医師は循環血漿レベル、毒性、及び疾病の進行を評価しなければならない。

以上本発明を全体的に説明したので、例示として提供し、本発明を限定することを意図しない以下の実施例を参照することによって本発明はより容易に理解されるであろう。

マウスＢＡＴ−１のκ軽鎖可変領域（Ｖκ）の配列解析
ＢＡＴ−１のＶκ領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図１に示す。アミノ酸配列を他のマウス可変領域と比較し、可変領域がカバットデータベース（Ｋａｂａｔ他、同上）に細分化されたサブグループのコンセンサス配列とも比較した。この解析から、ＢＡＴ−１のＶκ領域がマウスκサブグループＩＶ（同一性＝８８．３８％；類似度＝９２．４５）及びマウスκサブグループＶＩ（同一性＝８７．７４％；類似度＝８９．６２）の２つのコンセンサス配列と最も近くマッチしていたことが判明した。ＢＡＴ−１のκ軽鎖可変領域のＦＲのみ（即ちＣＤＲのアミノ酸なし）をマウスサブグループＩＶ及びＶＩと比較した場合は、同一性の割合はどちらについても正確に９０．００％まで増加し、類似度の割合も、どちらのコンセンサス配列についても９２．５０％まで上昇した。しかし、どちらのカバットサブグループに対しても類似性が高かったが、ネズミＢＡＴ−１のＶκ領域はマウスサブグループＶＩとして分類されるべきと判断した。

マウスサブグループＶＩを選択した理由は、コーチアと共同研究者が定義した（Ｃｈｏｔｈｉａ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１、１９８７；Ｎａｔｕｒｅ、３４：８７７、１９８９；Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７９９、１９９２；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、同上）ＢＡＴ−１のＶκ領域の超可変性ループの標準クラスに関連していた。コーチアによれば、ＣＤＲのそれぞれ、即ちＣＤＲ１（Ｌ１）、ＣＤＲ２（Ｌ２）及びＣＤＲ３（Ｌ３）は標準クラス１であった（図２）。重大なことに、１０個のアミノ酸の標準クラス１のＬ１超可変性ループは、カバットサブグループＶＩに当てはまるマウスＶκ領域でのみ見つかった。

ＣＤＲ関連のループ構造の最も限定的な標準クラスが最近になってマーチン及びソーントンによって定義され（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）、これらも図２に記載されている。これらの新しい標準クラスの定義の有用性はその厳密性にあり、これは各クラス内により多くのいわゆるフレームワーク標準残基が存在することに関連している。これらの「余分」な、潜在的に重要な残基の重要性は、その後にヒト化ＢＡＴ−１抗体を設計する際に考慮された。ループＬ１及びＬ２はそれぞれマーチン標準クラス１／１０Ａ及び１／７Ａに容易に割り当てられたが、Ｌ３ループは割当可能などのクラスとも完全にマッチしなかった。最も近くマッチしたクラスはクラス１／９Ａであったが、このクラスに当てはめるにはＢＡＴ−１のＶκ領域の位置２８に残基が存在していなければならず、これが実際には存在していなかった。ＢＡＴ−１のＶκに最も近いマウスκ軽鎖可変領域生殖系遺伝子はＨ４であり、これも１０個のアミノ酸のＬ１ループ（表１）も含んでいた。Ｈ４生殖系列配列とＢＡＴ−１のＶκ領域との間には１２個のミスマッチしか見つからなかった。これらのミスマッチのほとんどはＣＤＲ内に位置し、ＦＲ内には４つの差異しか位置していなかった。ＦＲ３内の位置７２（カバット番号）のシステイン以外は、これらのミスマッチのほとんどは高度に保存的変化であった。これが重要な標準残基（位置７１）のすぐ隣に位置していることから、このシステインが抗原の結合に重要な役割を果たしているかもしれないことが示唆された。それでもやはり、総合すると、上記例はＢＡＴ−１配列がマウスＶκ可変領域の典型であることを明らかに示唆している。

^１ＢＡＴ配列と同一である残基数
^２点［．］はＢＡＴのＶκとマウス生殖系列のＶκとのマッチを示し、線［−］はアミノ酸が存在しないことを示す

マウスＢＡＴ−１重鎖可変領域の配列解析
ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域のＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を図３に示す。実施例１に示したものと類似の解析をＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域で実施し、これにより、これがカバットデータベース（Ｋａｂａｔ他、同上）のマウス重鎖の種々のサブグループのコンセンサス配列に最も近いマッチを示したことが決定された。ｍＢＡＴ−１のマウス重鎖可変領域アミノ酸配列と種々のサブグループコンセンサス配列との同一性の測定値は６０．６４％であり、類似度の計算値は６９．２３％であり、また次に近いカバットサブグループのコンセンサス配列はサブグループＩＩａであった（同一性＝５９．８３％；類似度＝６６．６７％）。しかし、ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域のＦＲのみをマウスサブグループＩＩａと比較した場合、同一性の割合は５４．０２％まで減少し、類似度は６２．０６％まで低下した。逆に、マウスの種々のサブグループに対して行った同一性の比較では、ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域のＦＲが６５．５２％の同一性及び７４．７１％の類似度を示したことが判明した。

コーチアと共同研究者が定義したＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域の超可変性ループの標準クラスを解析すると（図４）、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ループ（Ｈ１）がコーチア標準クラス１ループとマッチした。しかし、Ｈ３ループが示すことができる広範囲のサイズ及びアミノ酸構成により、ＣＤＲ３ループ構造（Ｈ３）にはどのクラスも割り当てられなかった。

マーチン及びソーントン（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）が定義したＣＤＲループ構造のより厳密な標準クラスを使用して、Ｈ１ループがマーチン標準クラス１／１０Ａにマッチしたことを決定するのは単純なことであった。しかし、Ｈ２ループでは最も近いマーチン標準クラスはクラス２／１０Ａであったが、クラスを割り当てるのがより困難であった。残念なことに、Ｈ２ループ内のアミノ酸Ａｓｐ５３がこの位置で予測された残基（即ちＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｙｒ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ｔｈｒ又はＡｓｎ）とマッチしなかったので、このマッチも完全ではなかった。

同定されたｍＢＡＴ−１のＶ_Ｈに最も近いマウス重鎖可変領域生殖系列遺伝子はＶＭＳ２／ＶＧＫ４であった（表２）。したがって上記例は、ｍＢＡＴ−１配列がマウスＶ_Ｈ可変領域の典型であることを明白に示唆している。

^１ＢＡＴ配列と同一である残基数
^２点［．］はＢＡＴのＶ_Ｈとマウス生殖系列のＶ_Ｈとのマッチを示し、線［−］はアミノ酸が存在しないことを示す

ヒト化ＢＡＴ−１のＶκ抗体変異体の設計
ＢＡＴ−１抗体のヒト化可変領域の設計における第１のステップは、ヒト化ＢＡＴ−１のＶκ領域の基礎として役割を果たすヒトκ軽鎖可変領域の選択であった。このプロセスの補助として、ＢＡＴ−１のＶκ領域をまずカバットと共同研究者が定義した（Ｋａｂａｔ他、同上）４つのヒトκ軽鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列と比較した。

マウスＢＡＴ−１軽鎖可変領域はヒトκ軽鎖サブグループＩ及びヒトκ軽鎖サブグループＩＩＩのコンセンサス配列に最も類似していた。ヒトκ軽鎖サブグループＩの場合、マウスＢＡＴ−１のＶκ領域は可変領域全体で６３．２１％、ＦＲ内のみで７０．００％の同一性を示した。類似度に関して測定すると、これらの値は全体で７１．７０％、ＦＲ内のみで８０．００％まで上昇した。ヒトκ軽鎖サブグループＩＩＩの場合、マウスＢＡＴ−１のＶκ領域は可変領域全体で６５．０９％の同一性、ＦＲ内のみで６８．７５％の同一性を示した。類似度に関して測定すると、これらの値は全体で７４．５３％、ＦＲ内のみで８０．００％まで上昇した。したがって、これは一般に広範囲のヒトκ軽鎖可変領域配列と良好にマッチすると考えられるが、とりわけＦＲに関しては、ヒトκ軽鎖サブグループＩ内で見つかったものに対して同一性が僅かに高かった。

その後、マウスＢＡＴ−１のＶκ領域を公的に公開されているヒト可変領域の個別の配列の全ての記録例と比較した。表３は、この解析によって同定したマウスＢＡＴ−１のＶκ領域に対する１５個の最も良好なマッチを示す。全体としては、検索アルゴリズムにより抗体ＴＥＬ９由来のヒトＶκ領域（Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１、１９９１）がマウスＢＡＴ−１のＶκ領域に最も近いマッチとして選択された（表４）。このヒト配列はＢＡＴ−１のＶκ領域に対して全体で６７．９３％、ＦＲ内のみで７２．５０％の全体的な同一性であった。類似度に関して測定すると、これらの値は全体で７７．３６％、ＦＲ内のみで８２．５０％まで上昇した。したがって、ＴＥＬ９κ軽鎖可変領域のＦＲをＢＡＴ−１抗体κ軽鎖可変領域のヒト化のヒトアクセプター配列として選択した。その後、これをＢＡＴ−１のκ軽鎖の第１のヒト化変型（ＢＡＴＲκ_Ａ）の基礎とし、これは本質的にＢＡＴ−１のＶκ領域のＣＤＲ及びＴＥＬ９のＶκ領域のＦＲを含んでいた。

設計プロセスの次のステップは、これらのアミノ酸残基のうちいずれかが抗原との相互作用によって直接、又はＣＤＲループのコンホメーション若しくは配向を変更することによって間接的に抗原への結合に悪影響を与える可能性があるかどうかを決定するために、ヒトアクセプターＴＥＬ９のＶκ領域のＦＲのアミノ酸配列を研究することであった。これは、ＢＡＴ−１可変領域、即ちＶκ及びＶ_Ｈ領域のいずれのモデルも利用可能であったことで初めて可能になった、困難なプロセスであった。モデリングの手順は実施例５で詳細に示す。それでもやはり、抗原の結合性に影響を与えると考えられるマウスＢＡＴ−１のＦＲ内のアミノ酸は全て、その後ヒト化ＢＡＴ−１抗体中で保存することを検討した。どのネズミ残基を保存するかの決定には、以下の点を検討した：

^１ＩＤ−ヒトＶκ配列のネズミＢＡＴのＶκ領域に対する同一性の割合
^２点［．］はＢＡＴのＶκとマウス生殖系のＶκとのマッチを示し、線［−］はアミノ酸が存在しないことを示し、ヒトＶκ配列内の下線を引いた残基はその最も近いヒトＶκ遺伝子と異なる
^３Ｓ／ＣはＦｖの表面又はコア上のＣＤＲから５Å以内に位置するアミノ酸を示し、ｓ／ｃはＦｖの表面又はコア上のＣＤＲから５Åよりも離れて位置するアミノ酸を示す
^４ｖはＦＲ内に位置するバーニア残基（Ｆｏｏｔｅｒ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２４：４８７、１９９２）を示す

^１ＩＤ−ヒトＶκ配列のネズミＢＡＴのＶκ領域に対する同一性の割合^２全て−ネズミＢＡＴのＶκ領域全体と比較した場合の、ヒトＶκ領域全体中の同一残基数
^３表面（ＦＲ表面）−表面上の同一（ＦＲ）残基数
^４コア（ＦＲコア）−Ｆｖドメインの（ＦＲ）コア内の同一残基数
^５ＣＤＲ／ＦＲ−ＣＤＲ又はＦＲ内の同一残基数；
^６ＣＤＲ近くのＦＲ−ＣＤＲの５Å以内のＦＲアミノ酸の間の同一残基数を表す；
^７バーニア−１４個のバーニアアミノ酸（Ｆｏｏｔｅ他、同上）間の同一残基数；
^８Ｖκ（Ｊ鎖）−Ｖκ（Ｊ鎖）遺伝子内の同一残基数
^９Ｌ１〜Ｌ３サイズ−各ＣＤＲ内の残基数
^１０Ｌ１〜Ｌ３クラス−マーチン＆ソーントン（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）によるＣＤＲの標準クラス

ａ．超可変性ループの標準構造（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７、１９８９、１９９２、同上；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、同上）が保存されていたことは非常に重要であった。したがって、ヒト化ＢＡＴ−１可変領域内でこれらの標準構造の一部であったマウスＦＲ残基を全て保存することが重要であった。

ｂ．抗原の結合において重要な役割を示していたかもしれない例外的な又は稀少な残基を同定するために、ｍＢＡＴ−１抗体可変領域の配列を他のマウス抗体由来の類似した配列と比較した。その後、ＢＡＴ−１可変領域遺伝子のモデルを用いてこれを調査した。

ｃ．ヒト化ＦＲ内に存在しない他のマウスＦＲ残基のいずれかが何らかの方法で抗原の結合に影響を与える可能性があるかどうかを予測してみるために、モデルの直接解析も行った。

ｄ．κ軽鎖及び重鎖可変領域の個々のヒトアクセプター配列とアクセプター配列が属するヒト可変領域サブグループのコンセンサス配列との比較も行った。ヒトドナー配列内のどの特異体質性アミノ酸の同定も、これらが抗原の結合に悪影響を与えた可能性があるので、重要であった。

ｅ．選択したヒト軽鎖及び重鎖可変領域は２つの異なるヒト抗体に由来するので（ヒトＶ_Ｈアクセプター配列の選択には実施例４を参照されたい）、ドナー及びアクセプターのκ軽鎖可変領域のどちらのドメイン間パッキング残基でも丁寧な解析を行うべきである。これは、ヒト化ＢＡＴ−１抗体のＣＤＲループ構造のコンホメーションにかかわらず、この領域内のミスパッキングは全て抗原の結合に劇的な影響を与えた可能性があったからである。

ｆ．この設計プロセスに従うことにより、ネズミＢＡＴ−１のＶκのＦＲ内のいつかのアミノ酸を、ヒト化ＢＡＴ−１抗体の第２の変型（ＢＡＴＲκ_Ｂ）中で保存するために同定した（表５）。表５は、ＢＡＴ−１抗体κ軽鎖可変領域の第１（ＢＡＴＲκ_Ａ）及び第２（ＢＡＴＲκ_Ｂ）の再構成ヒト変型の設計をもたらすアミノ酸配列のアラインメントを提供する。ドナーマウスＢＡＴ−１のＶκ領域とアクセプターヒトＴＥＬ９のＶκ領域とのＦＲで２１個のアミノ酸の差異が存在していた。しかし、ヒトＦＲ内に存在するアミノ酸を元のマウスＦＲ内に存在するアミノ酸に変換する必要があると考えられたヒト化ＦＲ内には、５個の残基しか存在していなかった。

コーチアと共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１８６：６５１、１９８５）が定義したＶκ／Ｖ_Ｈの境界面に位置するＶκ領域のアミノ酸を、例外的な又は稀少な残基について確認した。この解析から、少しでも懸念を引き起こした残基位置はＦＲ２の位置３６（Ｐｈｅ３６）のＰｈｅのみであった。（ＴＥＬ９で見つかったように）通常はこの位置にＴｙｒが見つかるが、ｍＢＡＴ−１ではＰｈｅが存在していた。さらに、位置３６はバーニアアミノ酸（Ｆｏｏｔｅ他、同上）の認識された位置である。バーニア残基はＣＤＲループのコンホメーションを維持するために重要であると考えられていた。さらに、Ｐｈｅは一般にカバットマウスサブグループＶＩでは見られないが（^２１／_１５３）、ＴｙｒはマウスサブグループＶＩ（^１３１／_１５３）及びヒトサブグループＩ（^６６／_７４）のいずれでも非常によく見られた（Ｋａｂａｔ他、同上）。したがって、Ｔｙｒ３６Ｐｈｅの変化は、２つの外来ヒトアクセプター可変領域間のＢＡＴ−１で見つかるドメイン間パッキングを模倣するためにも、ＣＤＲループのコンホメーションを維持するためにも適切であると考えられた。

ＦＲ２内の位置４７で第２の変更も決定した。ヒトＴＥＬ９のκ軽鎖可変領域に見つかる高度に保存されているＬｅｕを、マウスＢＡＴ−１のκ軽鎖可変領域で見つかったようにＴｒｐに変更した。別の認められたバーニア残基位置は位置４７であり、これも分子モデルに従ってＶ_Ｈ境界面の近くに配置した。具体的には、これはＨ２内のＡｌａ５５に近く、これと相互作用していたかもしれない。したがって、ヒトＶ_Ｈ配列内のこのコア残基位置でＴｒｐが見られたことはなかったが、Ｌｅｕ４７Ｔｒｐの改変を行うことでこれをＢＡＴＲκ_Ｂ内で保存することが賢明であると考えられた。

ＢＡＴＲκ_Ｂに導入した第３のＦＲの変更は位置７１にあり、これは、バーニア残基位置（Ｆｏｏｔｅ他、同上）として同定されているだけでなく、Ｌ１ループ構造の重要な標準残基位置の１つとしても認識されていた。これらの標準残基は、コーチアと共同研究者（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７、１９８９、１９９２、同上；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、同上）に、ＣＤＲループ構造の保存に不可欠であると定義されている。標準アミノ酸の多くがＣＤＲ内に位置するが、いくつか（７１Ｔｙｒなど）はＦＲ内にも位置していた。アミノ酸の変更は保存的であったが、Ｐｈｅ７１Ｔｙｒの変更はＢＡＴ−１のκ軽鎖のヒト化の成功に重要であるとみなされた。

ヒト化Ｖκ領域の他の変型は以下の通りである：
ＢＡＴＲκ_Ｃ：Ｃｙｓ及びＳｅｒは大きさ及び特徴が類似しており、モデルから、ＦＲ３内の位置７２にあるいずれのアミノ酸も適度に埋まっており、Ｌ１ループとは反対方向を指していると考えられた。しかし、Ｃｙｓアミノ酸の場合、モデルによれば硫黄側鎖が曝露しており、一方、カバットデータベース（Ｋａｂａｔ他、同上）によればこの位置にＣｙｓが存在することは独特の事象であり、一般的にはこの位置でＳｅｒが見られる（^４２１／_１２３４）。したがって、ＢＡＴＲκ_Ｃは（ＢＡＴＲκ_Ｂのように）Ｔｙｒ３６Ｐｈｅ、Ｌｅｕ４７Ｔｒｐ及びＰｈｅ７１Ｔｙｒでの変更、並びにアクセプターＴＥＬ９抗体のＶκＦＲ残基のＳｅｒ７２Ｃｙｓの改変を含んでいた。
ＢＡＴＲκ_Ｄ：ネズミＢＡＴ−１Ｆｖモデルからの証拠により、表面に曝された７０ＳｅｒがＬ１ループと相互作用し得る残基であることが示唆される。ヒトＴＥＬ９κ軽鎖では、この位置のアミノ酸はＡｓｐであり、これはＳｅｒよりも大きく、正に帯電している。ヒトＶκ領域内ではこの位置でＳｅｒが見られることはない（Ａｓｐが圧倒的に最も一般的なアミノ酸である）。７０ＳｅｒがＬ１ループに近いこと及び表面に曝された性質であることは、これがＬ１と相互作用しているかもしれない、又は抗原と直接相互作用さえしているかもしれないことを仮定的に示唆している。したがって、ＢＡＴＲκ_ＤでＡｓｐ７０Ｓｅｒの変更を行うことを決定し、これはこの変更以外はＢＡＴＲκ_Ｃと同じである。

上で提案した全てのヒト化ＢＡＴ−１抗体のＶκ領域変異体のアミノ酸配列の説明を図５に示す。

潜在的なＮ結合グリコシル化部位、即ちＡｓｎ−Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｘａａ（Ｇａｖｅｌ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、３：４３、１９９０）を、ドナーマウス及びアクセプターヒトＶκ領域、並びにヒト化構築体自体について検索したが、いずれも同定されなかった。

ヒト化ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ抗体変異体の設計
ここでも、マウスＢＡＴ−１抗体のヒト化Ｖ_Ｈ領域の設計の第１のステップは、ヒト化ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域の基礎として役割を果たすアクセプターヒト重鎖可変領域の選択であった。最初にｍＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域を３つのヒト重鎖可変領域サブグループのコンセンサス配列と比較した際、ヒト重鎖サブグループＩのコンセンサス配列と最も類似していることが判明し、全体で６１．５４％の同一性、ＦＲ間のみで６７．８２％の同一性であった。類似度に関して測定すると、これらの値も全体で７０．０９％、ＦＲ内のみで７７．０１％まで上昇した。

その後、マウスＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域を公的に公開されているヒト可変領域の個別の配列の全ての記録例と比較した。表６及び７は、この解析によって同定したマウスＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域に対する１５個の最も良好なマッチを示す。全体としては、検索アルゴリズムにより抗体ｈｓｉｇｈｖ１２９５由来のヒトＶ_Ｈ領域（Ｆａｎｇ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：１４４５、１９９４）がマウスＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域に最も近いマッチとして選択された。このヒトＶ_Ｈ領域はＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域に対して全体で６９．２３％の同一性であり（表７）、この値はＦＲ内のみで比較した場合に７４．７１％まで上昇した。類似度に関して測定すると、これらの値は全体で７５．２１％、ＦＲ内のみで７９．３１％まで上昇した。したがって、このヒトＦＲをＢＡＴ−１重鎖のヒト化変型の基礎とした。

^１ＩＤ−ヒトＶ_Ｈ配列のネズミＢＡＴのＶ_Ｈ領域に対する同一性の割合^２全て−ネズミＢＡＴのＶ_Ｈ領域全体と比較した場合の、ヒトＶ_Ｈ領域全体中の同一残基数
^３表面（ＦＲ表面）−表面上の同一（ＦＲ）残基数
^４コア（ＦＲコア）−Ｆｖドメインの（ＦＲ）コア内の同一残基数
^５ＣＤＲ／ＦＲ−ＣＤＲ又はＦＲ内の同一残基数
^６ＣＤＲ近くのＦＲ−ＣＤＲの５Å以内のＦＲアミノ酸の間の同一残基数；
^７バーニア−１４個のバーニアアミノ酸（Ｆｏｏｔｅ他、同上）間の同一残基数；
^８Ｖ_Ｈ（Ｊ鎖）−Ｖ_Ｈ（Ｊ鎖）遺伝子内の同一残基数
^９Ｌ１〜Ｌ３サイズ−各ＣＤＲ内の残基数
^１０Ｌ１〜Ｌ３クラス−マーチン＆ソーントン（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）によるＣＤＲの標準クラス

設計プロセスの次のステップは、これらのアミノ酸残基のうちいずれかが抗原への結合に悪影響を与える可能性があるかどうかを決定するために、ヒトアクセプターｈｓｉｇｈｖ１２９５のＶ_Ｈ領域のＦＲのアミノ酸配列を研究することであった。ここでも、ＯＭＬにより構築された分子モデル（実施例５参照）がこの設計プロセスに重要であり、これからネズミＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域のＦＲ内のいくつかのアミノ酸を、第１の（ＢＡＴＲＨ_Ａ）及び続くヒト化ＢＡＴ−１抗体の変型の保存について同定した（表８）。ドナーマウスＢＡＴ−１のＦＲとアクセプターヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のＶ_Ｈ領域との間には２２個のアミノ酸の差異があり、９個までのネズミ残基をヒト化ＦＲ内で保存することを検討した。

したがって、ＢＡＴＲＨ_Ａはヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５抗体のＶ_Ｈ領域のＦＲに遺伝子挿入したマウスＢＡＴ−１抗体のＶ_Ｈ領域のＣＤＲからなっていた。これはヒト化ＢＡＴ−１抗体のＶ_Ｈ領域のＣＤＲを移植した変型であり、いかなるＦＲアミノ酸の変更も含んでいなかった。

ＢＡＴＲＨ_Ｂでは、マウスＢＡＴ−１配列のＦＲ１内の位置２８及び３０のアミノ酸（即ちそれぞれＴｈｒ及びＴｈｒ）をヒト化ＢＡＴ−１重鎖可変領域内で対応するヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のアミノ酸（即ちそれぞれＳｅｒ及びＳｅｒ）に置き換えた。これを行ったのは、これらがＨ１超可変性ループコンホメーションに重要な標準残基の一部を表していたからである（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９９２、同上）。標準残基は超可変性ループの正しい配向及び構造に不可欠であるとみなされ、一般にヒト化可変領域内で必ず保存した。さらに、残基位置２７〜３０はＨ１ループ自体の一部であり、したがってこのループの正しいコンホメーション及び配向においてより一層重要であるとみなされ、その保存がより強力に正当化された。したがって、これら２つの残基位置はＢＡＴＲＨ_Ｂ内のヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５配列のＦＲに行った変更の合計である。

設計プロセスの次のステップは、これらのアミノ酸残基のうちいずれかが抗原への結合に悪影響を与える可能性があるかどうかを決定するために、ヒトアクセプターｈｓｉｇｈｖ１２９５のＶ_Ｈ領域のＦＲのアミノ酸配列を研究することであった。ここでも、ＯＭＬにより構築された分子モデル（実施例５参照）はこの設計プロセスに重要であり、これからネズミＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域のＦＲ内のいくつかのアミノ酸を、第１の（ＢＡＴＲＨ_Ａ）及び続くヒト化ＢＡＴ−１抗体の変型の保存について同定した（表８）。ドナーマウスＢＡＴ−１のＦＲとアクセプターヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のＶ_Ｈ領域との間には２２個のアミノ酸の差異があり、９個までのネズミ残基をヒト化ＦＲで保存することを検討した。

したがって、ＢＡＴＲＨ_Ａはヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５抗体のＶ_Ｈ領域のＦＲに遺伝子挿入したマウスＢＡＴ−１抗体のＶ_Ｈ領域のＣＤＲからなっていた。これはヒト化ＢＡＴ−１抗体のＶ_Ｈ領域のＣＤＲを移植した変型であり、いかなるＦＲアミノ酸の変更も含んでいなかった。

ＢＡＴＲＨ_Ｂでは、マウスＢＡＴ−１配列のＦＲ１内の位置２８及び３０のアミノ酸（即ちそれぞれＴｈｒ及びＴｈｒ）がヒト化ＢＡＴ−１重鎖可変領域内で対応するヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のアミノ酸（即ちそれぞれＳｅｒ及びＳｅｒ）に置き換えた。これを行ったのは、これらがＨ１超可変性ループコンホメーションに重要な標準残基の一部を表していたからである（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９９２、同上）。標準残基は超可変性ループの正しい配向及び構造に不可欠であるとみなされ、一般にヒト化可変領域内で必ず保存した。さらに、残基位置２７〜３０はＨ１ループ自体の一部であり、したがってこのループの正しいコンホメーション及び配向においてより一層重要であるとみなされ、その保存がより強力に正当化された。したがって、これら２つの残基位置はＢＡＴＲＨ_Ｂ内のヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５配列のＦＲに行った変更の合計である。

ヒト化ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域（ＢＡＴＲＨ_Ｃ）の第３の変型にはＢＡＴＲＨ_Ｂで行った全ての置換が組み込まれており、それに加えて、対応するヒト残基の替わりにヒトＦＲ内に挿入されたさらに３つのネズミアミノ酸が含まれていた。１つめはＦＲ３の位置７６に位置するＡｓｎアミノ酸であった。ＢＡＴ−１のＦｖ領域の分子モデルによれば、Ａｓｎ残基はＣＤＲのＨ１に近く、ループ構造を支持していた可能性がある。さらにマウスＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域では、Ａｓｎは表面に曝されており、ヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のＦＲ内のＳｅｒよりも大きかった。したがって、ＦＲにＳｅｒ７６Ａｓｎの置換を行った。

Ｃｈｏｔｈｉａ他（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９９２、同上）並びにマーチン及びソーントン（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）によってＨ３ループのコンホメーションに重要であると以前に同定された残基位置である、Ｖ_Ｈ領域のＦＲ３の位置９４でアミノ酸にさらなる変更を行った。さらに、分子モデルにより、ＣＤＲのＨ３内でＡｒｇ９４がＡｓｐ１０１と塩橋を形成することができ、ループ構造を安定化させることが示された。したがって、マウス中のＡｒｇでこの残基位置でヒト中のＬｙｓを置き換えた。最後の改変はＦＲ３内の位置９３で行い、ヒトＡｌａをネズミＶａｌアミノ酸で置き換えた。この残基はコーチア（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８５、同上）が定義するようにパッキング残基であるとみなされ、Ｖκ及びＶ_Ｈ領域の正しいパッキングに重要である。さらに、これはバーニア残基位置と同定され、したがって分子モデルの解析によって確認された分類であるＣＤＲループのコンホメーションの維持に重要である。総合すると、全てのデータ及び分子解析は、これら３つのネズミ残基をＢＡＴＲＨ_Ｃのヒト化Ｖ_Ｈ領域内で保存すること、即ちＳｅｒ７６Ａｓｎ、Ａｌａ９３Ｖａｌ及びＬｙｓ９４Ａｒｇが適切であることを示唆している。

ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域の次の２つのヒト化変異体の構築は、これらの第１の３つのヒト化変型、即ちＢＡＴＲＨ_Ａ、ＢＡＴＲＨ_Ｂ及びＢＡＴＲＨ_Ｃの結合親和性に依存していた。これら３つのどれもが十分な結合レベルを示せなかった場合は、変型ＢＡＴＲＨ_Ｄ及びＢＡＴＲＨ_Ｅを合成して試験する。

ヒト化ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域の変型Ｄ（ＢＡＴＲＨ_Ｄ）にはＢＡＴＲＨ_Ｃで行った全ての置換が組み込まれており、それに加えてＦＲ１の位置２に位置する１つのさらなるマウスアミノ酸が含まれていた。この位置は標準（Ｍａｒｔｉｎ他、同上）及びバーニア（Ｆｏｏｔｅ他、同上）残基位置のいずれとしても定義された。さらに、ＢＡＴ−１可変領域のモデルから、それ自体がＨ１ループ構造の一部であるネズミＩｌｅアミノ酸はＦＲ１のＴｙｒ２７に近かった。逆に、マウス及びヒトのＦＲでこの位置にあるネズミＩｌｅ及びヒトＶａｌアミノ酸は、特徴が類似しており大きさが僅かしか異なっていなかった、即ち、Ｉｌｅは余分なメチル基を有していた。したがって、ヒト化手順のこの段階でのみＶａｌ２Ｉｌｅの変更を行い、変異を変型ＢＡＴＲＨ_Ｄに組み込むことを決定した。

ヒト化ＢＡＴ−１重鎖可変領域（ＢＡＴＲＨ_Ｅ）の最後の変型にはＢＡＴＲＨ_Ｄで行った全てのマウスＦＲの置換に加えて、位置３８（ＦＲ２）、４６（ＦＲ２）及び６８（ＦＲ３）で３つのさらなるアミノ酸の変更を組み込んだ。

Ａｒｇ３８Ｌｙｓの改変は、Ｖ_Ｈ領域のコアに深く埋まっているＡｒｇがＣＤＲのＨ２のＰｈｅ６３に近いことを示唆していたので行った。しかし、これは以前に同定された標準又はバーニア残基位置ではなかった。さらに、Ａｒｇの方が大きいが、ＡｒｇとＬｙｓは構造が比較的類似しており、どのアミノ酸変更も有為性の判断が困難であった。したがって、これは仮定的な可能性としてのみ考慮され、ヒト化ＢＡＴ−１抗体の結合親和性が乏しいと判明した場合にのみ置換を行うこととした。同じ原理がＧｌｎ４６Ｌｙｓの改変を選択した背景にもあった。分子モデルによればＬｙｓアミノ酸は半分埋まっていたが、ＣＤＲのＨ２内でＧｌｕ６２及びＰｈｅ６３に近かった。より大きな、帯電したＬｙｓ４６残基が抗原と直接相互作用できる可能性が僅かにあったので、これをＢＡＴＲＨ_Ｅ中で保存した。ネズミ６８Ａｌａアミノ酸を保存する事例では、それがＣＤＲのＨ２、特にＨ２ループ内の残基Ｔｙｒ５９に近接すること、及びその結果それがループ構造に影響を与えている可能性に関連していた。Ａｌａは小さいので重要である可能性が低いが、ヒトｈｓｉｇｈｖ１２９５のＦＲ内で見つかるより大きなＶａｌはＨ２ループ構造に有害な影響を与えた可能性があるので、ネズミＡｌａ残基で置き換えた。

上記で提案した全てのヒト化Ｖ_Ｈ領域変異体のアミノ酸配列の説明を図６に示す。

潜在的なＮ結合グリコシル化部位、即ちＡｓｎ−Ｘａａ−（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）−Ｘａａ（Ｇａｖｅｌ他、同上）を、ドナーマウス及びアクセプターヒトＶ_Ｈ領域、並びにヒト化構築体自体について検索したが、いずれも同定されなかった。

ネズミ及びヒト化ＢＡＴ−１Ｆｖドメインの分子モデリング
ＢＡＴ−１抗体のヒト化可変領域の設計を補助するために、ネズミ及びヒト化抗体の可変領域の分子モデルをどちらも構築した。これらの構造のモデリングは、相同性によるモデリング及びａｂ ｉｎｉｔｉｏ技術の確立された方法のいずれも使用して実現した。これは、Ｏｘｆｏｒｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ（ＯＭＬ）が提供及び利用するＡｂＭ分子モデリングパッケージを用いて行った。ＡｂＭを用いたモデリングで使用可能にするために、利用可能なブルックヘブンデータベースからの抗体Ｘ線結晶解析構造を整えた。

ＢＡＴ−１可変領域のＦＲを、類似の構造が解明されている免疫グロブリン可変領域由来のＦＲからモデリングした。同一のアミノ酸側鎖は元の配向に維持したが、ミスマッチの側鎖は元のＢＡＴ−１のＦｖ領域と同じように置換した。ＦＡＢ１７−ＩＡのＶκ領域のバックボーン原子はＢＡＴ−１のＶκ領域のモデルに使用し、４０９．５．３のＶ_Ｈ領域のＦＲはＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域をモデリングするために使用した（それぞれブルックヘブンＰＤＢコード１ｆｏｒ及び１ｉａｉ）。これらの配列はどちらもネズミＢＡＴ−１抗体の可変領域配列及びそのヒト化変異体に対して良好なマッチを示した。ｍＢＡＴ−１及びヒト化配列の同一性は、Ｖκ領域配列で７３％〜９２％、Ｖ_Ｈ領域配列で６５％〜７９％の範囲であった。モデリングする配列へのマッチが乏しいＦＲ構造を使用するとＣＤＲループ構造の位置及び配向に顕著且つ有害に影響が与えられたので、ＡｂＭを既知の構造で試験することにより、ＦＲバックボーンの相同性がどのモデルの品質にも重要な要素であることが示された。

Ｌ１ループ、ネズミＢＡＴ−１のＶκ領域のループコンホメーション及びヒト化ＢＡＴＲκ_Ｂ配列のバックボーン構造（図５）を、ＡｂＭが使用する標準クラスからとった。これらの標準クラスはコーチアと共同研究者が記載したものに基づいているが、元の論文（Ｃｈｏｔｈｉａ他、１９８７、１９８９、１９９２、同上；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、同上）が公開された後に利用可能になった構造も考慮に入れるように改変されている。既知のループ構造におけるＡｂＭ予測の性能の試験により、このように作製されたＣＤＲループは通常非常に正確に、即ち１〜１．５ÅのＲＭＳ偏差内までにモデリングされることが示された。Ｖκ領域配列ＢＡＴＲκ_Ａでは、位置７１でＰｈｅをＴｙｒで置換すること（ＦＲ３内）は、これがもはやネズミのＶκ領域及びヒト化ＢＡＴＲκ_ＢのＶκ領域で見られる標準クラス（クラス１）に当てはまらないことを意味する。Ｔｙｒ７１はＬ１ループのコンホメーションに重要な役割を果たしていたが、モデリングした構造の解析により、この残基の主な特徴はＴｙｒの芳香環に対するＬ１ループのパッキングであったことが示唆された。したがって、Ｐｈｅもこの機能を実行できると信じる理由があった。さらに、モデルからはＴｙｒ７１のヒドロキシル基との強い相互作用があるように見えなかった。したがって、ＴｙｒをＰｈｅで置換することはＬ１ループの実際のコンホメーションに影響を与えなかった可能性が高い。

ＣＤＲであるＬ２、Ｌ３、Ｈ１及びＨ２のバックボーン構造には、全てのモデルのコンホメーションをＡｂＭに定義される標準クラスから改変せずにとった。

ＢＡＴ−１のＶ_Ｈ領域内のＨ３ループは８残基超であり、Ｈ３ループ構造を予想するために２つの方法を使用した。いずれの方法でもバックボーンコンホメーションのデータベース検索を使用したが、それに加えて、モデルの中心の５個の残基のコンホメーションをＣＯＮＧＥＮ検索（Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ、同上）を用いてより徹底的に検索した。これの計算にはより長い時間がかかったが、データベース検索から同定されたものと非常に類似したコンホメーションがしっかりと生じた。

モデルの明らかな立体衝突を調整した後に、最後にこれを、望ましくない原子の接触を軽減すること並びにファンデルワールス及び静電気的相互作用を最適化することのいずれのために、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬで実施したようにエネルギー最小化に供した。

ヒト化ＢＡＴ−１軽鎖変異体の構築
すべての実施例で、厳密なＰＣＲクローニング及び配列決定プロトコルに従った。これは、ヒト化変型にエラーが導入される可能性を最小限にするために行った。ヒト化ＢＡＴ−１のκ軽鎖可変領域遺伝子（即ちＢＡＴＲκ_Ａ、ＢＡＴＲκ_Ｂ及びＢＡＴＲκ_Ｄ）の構築により約４２５ｂｐの産物が生じ、その後これをｐＣＲ２．１（商標）内にサブクローニングした。ＰＣＲ反応は表９及び１０に記載のプライマーを使用して行った。

^１オリゴヌクレオチド配列は表９に示す。
^２オリゴヌクレオチドプライマーＢＡＴＲκ．１及びＢＡＴＲκ．２０も外部増幅プライマーとして使用した。

推定陽性形質転換体をＰＣＲスクリーニングアッセイで同定し、制限消化を行い、その後、ｄｓ−ＤＮＡ配列決定を行った。その後、ヒト化Ｖκ遺伝子（図７〜９；配列番号１５、１６及び１８）を発現プラスミド内にサブクローニングした。

軽鎖ｐＫＮ１１０構築体はアンピシリン及びネオマイシン耐性遺伝子を含んでいた。ＢＡＴ−１のヒト化Ｖκ遺伝子変異体（即ちＢＡＴＲκ_Ａ、ＢＡＴＲκ_Ｂ及びＢＡＴＲκ_Ｄ）をＨＣＭＶ最初期プロモーターとゲノムヒトκ定常領域との間に挿入し、それぞれ発現ベクターｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ａ、ｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ｂ及びｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ｄを生じさせた（代表的なｐＫＮ１１０−ＢＡＴＲκ_Ｄベクターには図１０を参照されたい）。

発現ベクター内に挿入したＢＡＴ−１軽鎖発現カセットは、マウス免疫グロブリンシグナルペプチド配列をコードしているＤＮＡ断片、コザック配列及びＢＡＴ−１のヒト化Ｖκ遺伝子変異体の両側に付加したシグナル配列イントロンを含んでいた（図１１）。このカセットは、ＨＣＭＶ最初期プロモーターとゲノムヒトκ定常領域との間に挿入した。完全な軽鎖発現ベクターは、ＢＧＨポリＡ転写ターミネーター及びＮｅｏ／Ｇ４１８選択マーカーも含んでいた。正しい挿入物の存在を確認するために、全ての構築体で制限消化を行い、ｄｓ−ＤＮＡ配列決定を行った。

ヒト化ＢＡＴ−１重鎖変異体の構築
再構成ヒトＢＡＴ−１重鎖可変領域遺伝子の様々な変型（即ちＢＡＴＲＨ_Ａ、ＢＡＴＲＨ_Ｂ、ＢＡＴＲＨ_Ｃ）の構築により約４５０ｂｐの産物が生じ、その後これをｐＣＲ２．１（商標）内にサブクローニングした。ＰＣＲ反応は表１１及び１２に記載のプライマーを使用して行った。

ここでも推定陽性形質転換体をＰＣＲスクリーニングで同定し、その後ｄｓ−ＤＮＡ配列決定を行った。その後、ヒト化Ｖ_Ｈ遺伝子（配列番号２０〜２２）を発現ベクター内にサブクローニングした。

重鎖ｐＧ１Ｄ１１０構築体はアンピシリン耐性遺伝子及びハムスターｄｈｆｒを選択マーカーとして含んでいた。ＢＡＴ−１のヒト化Ｖ_Ｈ遺伝子変異体をＨＣＭＶ最初期プロモーターとゲノムヒトＩｇＧ１定常領域との間に挿入し、発現ベクターｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ａ、ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ｂ、ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ｃを生じさせた（代表的なｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃベクターには図１２を参照されたい）。

発現ベクター内に挿入したＢＡＴ−１重鎖発現カセットは、マウス免疫グロブリンシグナルペプチド配列をコードしているＤＮＡ断片、コザック配列及びＢＡＴ−１のヒト化Ｖκ遺伝子変異体の両側に付加したシグナル配列イントロンを含んでいた（図１３）。このカセットは、ＨＣＭＶ最初期プロモーターとゲノムヒトＩｇＧ１定常領域との間に挿入した。完全な軽鎖発現ベクターは、ＢＧＨポリＡ転写ターミネーター及びｄｈｆｒ選択マーカーも含んでいた。

正しい挿入物が存在することを確認するために、生じた発現ベクターの制限消化を行った。

^１オリゴヌクレオチド配列は表１１に示す。
^２オリゴヌクロチドプライマーＢＡＴＲＨ．１及びＢＡＴＲＨ．２２も外部増幅プライマーとして使用した。

単一発現ベクター内でのＢＡＴ−１ ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄγ１完全抗体の構築
ＢＡＴ−１γ１抗体の実現可能な発現レベルを最大にするために、ＢＡＴ−１γ１単一ベクター構築体を作製する前にｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ構築体からイントロンを除去することを決定した（実施例７に記載、図１２参照）。この手順は以下のように行った。

ｐＧ１Ｄ２００とは、別のγ１免疫グロブリン重鎖哺乳動物発現ベクター（ＡＥＲＥＳ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；図１４）である。このベクターは、ｐＧ１Ｄ１１０ベクターのＶ_Ｈ：Ｃ_Ｈγ１イントロン無しの変型である（即ちＶ_Ｈ：Ｃ_Ｈ接合点で７１ｂｐのイントロンを有さない）。

ｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ構築体を構築体へと変換するために、ＢｓｔＥＩＩ断片（２１９ｂｐ）をｐＧ１Ｄ２００ベクターから切除し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出／精製キットを用いてゲル精製を行った。この断片はイントロン無しのＶ_Ｈ：Ｃ_Ｈ接合点を含んでいた。

ｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ構築体（図１２）もＢｓｔＥＩＩで制限消化を行い、イントロン有りのＶＨ：ＣＨ接合点を含む２９０ｂｐの断片が放出された。Ｑｉａｇｅｎゲル抽出／精製キットを用いて残りのベクター断片（〜７２０７ｂｐ）のゲル精製を行った。

その後、ｐＧ１Ｄ２００ベクターの消化からのイントロン無しのＢｓｔＥＩＩ断片（２１９ｂｐ）を〜７２０７ｂｐのＢｓｔＥＩＩで消化したｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃベクター内にライゲーションした。２μｌのライゲーションしたＤＮＡを、製造元の指示に従ってＤＨ５α細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた。１０個のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列解析によってそれぞれのプラスミドＤＮＡを正しいＢｓｔＥＩＩ断片の存在について解析した。

完全なクローンを同定した後、新しいイントロン無しの構築体（ｐＧ１Ｄ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ）及び軽鎖構築体ｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ（図１０参照）を用いてｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ単一発現ベクター（配列番号９３）を構築した。

配列番号９３内のこのｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ単一発現ベクターの構成要素は以下のように局在している：
１．ヌクレオチド範囲：１〜２５０２−ｐＢＲ３２２（Ａｍｐ耐性遺伝子及びＣｏｌＥ１複製起点並びにＳＶ４０複製起点及び不能ＳＶ４０初期プロモーターを含む、ｐＢＲ３２２に基づいた配列）
２．ヌクレオチド範囲：２０６〜１０６７−Ａｍｐ（アンピシリン耐性遺伝子）
３．位置：１８２４−ＣｏｌＥ１
４．ヌクレオチド範囲：２５０２〜３２２７−ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）
５．ヌクレオチド範囲：３２３３〜４０７４−ＳＶ４０ポリＡ（ＳＶ４０ポリＡ配列など）
６．ヌクレオチド範囲：４１０９〜５６４９−ＨＣＭＶｉ（ＨＣＭＶｉプロモーター）
７．ヌクレオチド範囲：５６６２〜６０６７−ＢＡＴ ｒＫｄ
再構成ＢＡＴκ軽鎖可変領域。
８．ヌクレオチド範囲：６０７３〜６７２０−ＨｕＫ（ヒトκ定常領域（Ｋｍ（３））遺伝子のｃＤＮＡコピー）
９．ヌクレオチド範囲：６７２６〜６９４３−ｓｐａＣ２人工ｓｐａＣ２終結配列
１０．ヌクレオチド範囲：６９４９〜８４８９−ＨＣＭＶｉ（ＨＣＭＶｉプロモーター）
１１．１２．ヌクレオチド範囲：８５０２〜８９２３−ＢＡＴ ｒＨｃ
再構成ＢＡＴ重鎖可変領域
１３．ヌクレオチド範囲：８９２４〜１０２９７−ＨＧ１（前に６０ｂｐのイントロンがあり、後に「アーニー」終結配列があるヒトγ−１定常領域）

ＨＣＭＶｉプロモーター、ＢＡＴ−１のκ軽鎖可変領域遺伝子、及びκ軽鎖定常領域遺伝子を含むＢＡＴ−１のκ軽鎖発現カセットを、ｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ構築体から制限消化によって取り出し（ＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ）、次いで単一のＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限部位によってｐＧ１Ｄ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ構築体中にライゲーションした。このライゲーションにより、ＢＡＴ−１ヒト化抗体ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄの重鎖及びκ軽鎖をどちらも含む単一発現ベクターｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／ＲＫ_Ｄの構築がもたらされた（図１５）。２μｌのライゲーションしたＤＮＡを、製造元の指示に従ってＤＨ５α細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた。１０個のコロニーからミニプレップＤＮＡを調製し、制限消化解析によってそれぞれのプラスミドＤＮＡを正しい単一発現構築体の存在について解析した。ＣＯＳ細胞内でのＢＡＴ−１γ−１抗体の一過性発現に正しい単一発現構築体の１つのクローンを選択し、これを実施例１１に例示する。

単一発現ベクター内でのＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄγ−１（γ１）完全抗体の変異体の構築
ＢＡＴＲＨ_Ｃ重鎖可変領域をＸｈｏ１とＨｉｎｄ１１１断片とを一緒にした（単一）発現ベクターとして導入した。ＢＡＴＲκ_Ｄ軽鎖可変領域をＸｂａ１とＢａｍＨ１断片とを一緒にした（単一）発現ベクターに導入した。アミノ酸配列を変更せずに軽鎖遺伝子中の内部Ｘｂａ１部位を除去した。このベクター内のＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ／ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ重鎖及び軽鎖可変領域の配列を確認した。このベクターはゲノムヒトＩｇＧ１及びκ定常領域を含む。重鎖及び軽鎖遺伝子のどちらもをＨＣＭＶ最初期プロモーターの制御下に置いた。このベクターはマウスｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして含む（図１６参照）。２つのベクター発現系と同じコザック配列、シグナルペプチド配列及びイントロンを付加した（実施例６及び７参照）。

単一ベクター内でのＢＡＴ−１γ−４（γ４）ＰＧ４ＫＤ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄの構築
ＢＡＴ−１γ４単一発現ベクター構築体の構築における第１のステップは、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限消化によって改変ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ遺伝子をｐＧ１Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ構築体（図１４）からクローニングして取り出し、やはりＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位によってこの４３０ｂｐ断片をγ−４免疫グロブリン重鎖発現ベクターｐＧ４Ｄ１１０内にライゲーションすることであった。

２μｌのライゲーションしたＤＮＡを、製造元の指示に従ってＤＨ５α細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた。１０個のコロニーからプラスミドＤＮＡを調製し、ＤＮＡ配列解析によってそれぞれのプラスミドＤＮＡを正しいＢＡＴ−１．ＲＨ_ＣのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の存在について解析した。

完全なクローンが示された後、新しいγ−４構築体（ｐＧ４Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ）及び軽鎖構築体ｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ（図１０）を使用して、以下の方法でｐＧ４ＫＤ１１０．ＢＡＴ−１．ＨＲ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ単一発現ベクターを構築した。

ＨＣＭＶｉプロモーター、ＢＡＴ−１のκ軽鎖可変領域遺伝子、及びκ軽鎖定常領域遺伝子を含むＢＡＴ−１のκ軽鎖発現カセットを、ｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ構築体から制限消化によって取り出し（ＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩ）、次いで単一のＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ制限部位によってｐＧ４Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ構築体中にライゲーションした。このライゲーションにより、ＢＡＴ−１ヒト化抗体ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ変異体の重鎖及びκ軽鎖をどちらも含む単一発現ベクター構築体ｐＧ４ＫＤ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄの構築がもたらされた。２μｌのライゲーションしたＤＮＡを、製造元の指示に従ってＤＨ５α細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換させた。１０個のコロニーからミニプレップＤＮＡを調製し、制限消化解析によってそれぞれのプラスミドＤＮＡを正しい単一発現ベクター構築体の存在について解析した。ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化した正しい単一発現ベクター構築体は２８６４ｂｐの断片を放出し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化では２８４０ｂｐの断片が放出された。ＣＯＳ細胞内でのＢＡＴ−１γ−４抗体の一過性発現に１つのクローンを選択した。

ヒト化ＢＡＴ−１軽鎖及び重鎖ベクターの同時トランスフェクション、並びにＣＯＳ７細胞内でのヒト化ＢＡＴ−１変異体の一過性発現
ヒト化ＢＡＴ−１の重鎖（ｐＧ１Ｄ１１０）及び軽鎖（ｐＫＮ１１０；実施例７）発現ベクターを様々な組合せでＣＯＳ７細胞内に同時トランスフェクションさせ、７２時間インキュベートした後、培地を回収し、細胞片を除去するために遠心し、濾過し、ヒト化抗体の産生についてＥＬＩＳＡによって解析した。ＣＯＳ７細胞上清中のヒト化抗体の濃度は、試験した再構成ヒトＢＡＴ−１抗体構築体の組合せのそれぞれで異なった（表１３）。例えば、変型ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ａが最も高い抗体レベルを発現し（４８００ｎｇ／ｍｌ）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｄの変型の発現が最も乏しかった（３５７ｎｇ／ｍｌ）。

ＣＯＳ７細胞からのヒト化ＢＡＴ−１変異体の精製
１回の同時トランスフェクションあたり約８ｍｌが採取され（実施例１１参照）、２００ｍｌ以上のＣＯＳ７上清が回収されるまで一連のトランスフェクションを行った。３０ｋＤａの分子量カットオフのＰＭ３０濾過膜を備えた攪拌限外濾過セルに上清を通すことによって、この上清の体積を１０ｍｌまで減らした。

Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（著作権）（Ａ）ＩｇＧ精製キットは、本質的に固定したタンパク質Ａのセファロースカラムの２ｍｌカラムからなる。５ｍｌの溶出緩衝液を用いて抗体をカラムから溶出させ、その溶出液を１ｍｌの画分で回収した。その後、ＥＬＩＳＡ法を用いてそれぞれの画分中のヒト化ＢＡＴ−１抗体の濃度をアッセイした。表１３は、回収されたタンパク質Ａで精製した抗体構築体の最終濃度を示す。平均すると、精製ステップにより抗体濃度が約１５０倍上昇した。

ＣＯＳ７細胞内で産生されたヒト化ＢＡＴ−１変異体のダウディ細胞への結合の解析
ダウディ細胞のＥＬＩＳＡを用いると、タンパク質Ａで精製したヒト化ＢＡＴ−１抗体の様々な変型が様々な度合でダウディ細胞に結合したことが明らかであった。図１７〜２０は、これらの結合実験の典型的な例を示す。組換え抗体によるダウディ細胞の結合のＳ字型の用量−応答曲線もプロットし、これらの結合曲線の傾斜面を計算した。傾斜面データとキメラ抗体用量−応答曲線に対するこの用量−応答曲線立場との組合せにより、試験した様々なヒト化ＢＡＴ−１抗体構築体間でダウディ細胞の結合に関して定性的な階層が示唆された（表１４）。この階層の一番上にあるのは明らかに構築体ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ（即ち０．８８１８±０．１１０７）であり、これはそのキメラＢＡＴ−１抗体対照（即ち０．８２４８±０．１２１０）に非常に類似した傾斜面を示し、キメラ対照の用量−応答曲線に近い軌道であった。利用可能な結合データから計算すると構築体ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｂ（即ち０．６４０８±０．１６２２）は同じキメラＢＡＴ−１抗体対照（即ち０．８２４８±０．１２１０）よりも急な傾斜面を示したが、その差は統計的に有意ではなかった。さらに、図１９から、この構築体の用量−応答曲線はＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ構築体でそれほど良好ではなく、したがって結合階層で２位に位置付けられたことが明らかである。

逆に、構築体ＢＡＴＲＨ_Ａ／ＢＡＴＲκ_Ａは試験した全てのヒト化ＢＡＴ−１抗体構築体のなかで明らかに最も低い結合特徴を有しており（表１４）、結合階層で６位に位置付けられた。変型で計算した傾斜面（即ち１．２７３０±０．２６８８）は非常に類似したヒト化構築体ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ａ（即ち１．７７１０±０．６４６１）よりも明らかに良好であったが、この差もやはり統計的に有意ではなかった。さらに、図１８から、ＣＤＲを移植したＢＡＴＲＨ_Ａ／ＢＡＴＲＨκ_ＡＢＡＴ−１抗体が、結合階層で５位に位置付けられたヒト化構築体ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ａよりもはるかに低いレベルでその最大結合応答に達していることが明らかである。

構築体ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｂ（図１７；４位）及びＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｄ（図２０；３位）はこれら２組の端値の中間レベルの結合性を示す。ここでも、これらの位置付けは主に利用可能な結合データの主観的な解釈及びこれまでの経験に基づいている。

^ａダウディ細胞のＥＬＩＳＡのデータをＳ字型の用量−応答曲線に当てはめた後に計算した、３つ組のＥＬＩＳＡの標準誤差の平均。

ＣＯＳ細胞の同時トランスフェクション又は単一トランスフェクションによるＢＡＴ−１Ｒκ_Ｄ／ＲＨ_Ｃ変異体の一過性発現
Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈの方法（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３：２０６、１９９３）に従って哺乳動物発現構築体をＣＯＳ細胞内にトランスフェクションさせた。手短に述べると、ＤＮＡ（それぞれ１０μｇのκ軽鎖発現構築体ｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ及び重鎖発現構築体ｐＧ１Ｄ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ、又は１３μｇの単一ベクター構築体ｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ）を１ｍｌのＰＢＳあたり１０^７個の細胞の０．７ｍｌのアリコートに加え、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置を用いて１９００Ｖ、２５μＦの電気容量でパルスを当てた。室温で１０分間回復させた後、電気穿孔した細胞を１０％のＦＣＳを含む８ｍｌのＤＭＥＭを入れたペトリ皿に移し、５％のＣＯ_２、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間インキュベートした後、培地を回収し、細胞片を除去するために遠心し、抗体の産生について捕捉ＥＬＩＳＡによって解析した。軽鎖発現ベクター及び重鎖発現ベクターを用いた同時トランスフェクション、並びに軽鎖及び重鎖をどちらも発現している単一ベクターを用いたトランスフェクションを、３つ組で実施した。結果を表１５に示す。この結果は、単一ベクターからの発現レベルが同時トランスフェクションで観察された発現レベルよりも〜６倍高い示している。

^＊ｐＧ１Ｄ１１０及びｐＫＮ１１０ベクターを用いた同時トランスフェクションからのヒト化ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_ＤＢＡＴ−１変異体のトランスフェクションレベルは０．７１８μｇ／ｍｌであった

単一ベクターｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄを用いたＣＨＯｄｈｆｒ−哺乳動物細胞の安定なトランスフェクション及び安定な細胞系の産生
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞を、１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ ＩＩ及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含むα−ＭＥＭからなる非選択培地中で増殖させた。１ｍｌのＰＢＳあたり１０^７個の細胞の０．７ｍｌのアリコートを、１３μｇのｐＧ１ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄを用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いて１９００Ｖ、２５μＦの電気容量でトランスフェクションさせた。細胞を室温で１０分間回復させた後、１０ｃｍのペトリ皿の８ｍｌの非選択培地に移し、５％のＣＯ_２、３７℃で４８時間インキュベートした。

トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシン処理し、遠心し、１５０ｍｌの予熱した選択培地（１０％の透析したＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加した、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ又は５００ｎＭのメトトレキセートを含む、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まないα−ＭＥＭ）中に再懸濁させた後、１５個の１０ｃｍのペトリ皿に等分した。その後、これらを５％のＣＯ_２中、３７℃で、病巣がはっきりと見えるまで選択培地を３〜４日毎に交換して２０〜３０日間インキュベートした。最初のトランスフェクションの２週間後、病巣が１０ｎＭのプレートに発生しはじめた。８日後、１つの病巣が５０ｎＭのプレートに発生した。３５日以降は５０ｎＭのプレートに他の病巣は発生せず、１００ｎＭや５００ｎＭのプレートには病巣が全く発生しなかった。

病巣を「拾う」ために、１ｍｍ四方のワットマン１ＭＭ濾紙をまず０．０５％のトリプシン、０．０２％のＥＤＴＡ溶液に浸した。選択培地を培養皿から丁寧に取り除き、その後これを５ｍｌのＰＢＳで丁寧に洗浄した。その後、ＰＢＳを取り除き、無菌鉗子を用いて、予浸した正方形の濾紙を個々の細胞の病巣上に丁寧に置いた。正方形の濾紙を病巣上に１５秒間放置した後、１ｍｌの適切な選択培地を含む２４ウェルの組織培養プレートの個別のウェルに移した。

合計３１個のγ−１病巣を拾い、そのうち３０個が１０ｎＭのＭＴＸのプレートからで、１個が５０ｎＭのプレートからであった。これらの細胞をほぼコンフルエントになるまで選択培地中で増殖させ、個々のウェルを抗体の産生について試験した。その後、ヒト抗体を産生しているクローンを、拡大及び特異的産生の解析に選択した。特異的産生アッセイの結果を表１６に示す。

最も良好な特異的産生レベルを示した３つの細胞系（Ｂ９、Ｂ１３及びＢ１５）を、正確な倍加時間についてさらに解析且つモニタリングした（表１７参照）。

特異的産生レベル及び倍加時間に基づいて、Ｂ１５細胞系を用いて５００μｇの量のＢＡＴ−１γ１抗体の産生を始めることを決定した。

単一トランスフェクション及び同時トランスフェクションによる、ＣＯＳ細胞内のＢＡＴ−１γ４ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ変異体の一過性発現
Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ他の方法に従って、哺乳動物発現構築体をＣＯＳ細胞内にトランスフェクションさせた。手短に述べると、ＤＮＡ（それぞれ１０μｇのκ軽鎖発現構築体ｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．Ｒκ_Ｄ及び重鎖発現構築体ｐＧ４Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ、又は１３μｇのスーパーベクター構築体ｐＧ４Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ）を１ｍｌのＰＢＳあたり１０^７個の細胞の０．７ｍｌのアリコートに加え、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ装置を用いて１９００Ｖ、２５μＦの電気容量でパルスを当てた。室温で１０分間回復させた後、電気穿孔した細胞を１０％のＦＣＳを含む８ｍｌのＤＭＥＭを入れたペトリ皿に移し、５％のＣＯ_２、３７℃で７２時間インキュベートした。７２時間インキュベートした後、培地を回収し、細胞片を除去するために遠心し、抗体の産生について捕捉ＥＬＩＳＡによって解析した。

同時トランスフェクション及びトランスフェクションをどちらも３つ組で実施した。結果を表１８に示す。この結果は、この単一ベクターからの発現レベルが同時トランスフェクションで観察された発現レベルよりも〜４倍高いことを示している。

単一ベクターｐＧ４ＫＤ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄを用いたＣＨＯｄｈｆｒ−哺乳動物細胞の安定なトランスフェクション及び安定な細胞系の産生
ＣＨＯｄｈｆｒ−細胞を、１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ ＩＩ及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加したリボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含むα−ＭＥＭからなる非選択培地中で増殖させた。１ｍｌのＰＢＳあたり１０^７個の細胞の０．７ｍｌのアリコートを、１３μｇのｐＧ４ＫＤ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄを用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを用いて１９００Ｖ、２５μＦの電気容量でトランスフェクションさせた。細胞を室温で１０分間回復させた後、１０ｃｍのペトリ皿の８ｍｌの非選択培地に移し、５％のＣＯ_２、３７℃で４８時間インキュベートした。このインキュベーションの２日後、細胞をトリプシン処理し、遠心し、１５０ｍｌの予熱した選択培地（１０％の透析したＦＢＳ及び５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加した、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ又は５００ｎＭのメトトレキセートを含む、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まないα−ＭＥＭ）中に再懸濁させた後、１５個の１０ｃｍのペトリ皿に等分した。その後、これらを５％のＣＯ_２中、３７℃で、病巣がはっきりと見えるまで選択培地を３〜４日毎に交換して２０〜３０日間インキュベートした。

２週間後、病巣が１０ｎＭのプレートに発生しはじめた。３５日以降は５０ｎＭのプレートに他の病巣は発生せず、１００ｎＭや５００ｎＭのプレートには病巣が全く発生しなかった。病巣は既に記載のように拾い（実施例１５）、その後、ヒト抗体を産生しているクローンを、拡大及び特異的産生の解析に選択した。特異的産生アッセイの結果を表１９に示す。

ＢＡＴＨ_Ｃ重鎖及びＢＡＴκ_Ｄ軽鎖増幅ベクターを用いたＮＳＯ細胞の同時トランスフェクション並びに抗体産生細胞系の選択
ＢＡＴＲＨ_Ｃ重鎖カセット（図１３）及びＢＡＴＲκ_Ｄ軽鎖カセット（図１１）をそれぞれ含む発現ベクターを混合し、電気穿孔によってＮＳＯ宿主細胞系にトランスフェクションさせた。

トランスフェクションさせた細胞を、１０個の９６ウェルプレート中の１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ゲンタマイシン）培地を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に分配した。１０〜１４日間後にトランスフェクションさせた細胞のコロニーが発生した後、ウェルからの調整培地の試料を、ヒト化ＢＡＴ−１抗体についてアッセイした。産生が最も高いウェルから細胞を拾い、Ｇ４１８を含む培地で拡大させた。

予備として、また選択用のトランスフェクションさせた細胞クローンをさらに多く提供するために、１週間後にトランスフェクションを繰り返した。１０日後、トランスフェクションさせた細胞の目に見えるコロニーが発生しており、ウェルからの調整培地を抗体の産生についてスクリーニングした。ＥＬＩＳＡプレートをヒツジ抗ヒトκ抗体でコーティングした。ウェルからの培地の２５μｌの試料をＥＬＩＳＡプレートに移し、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ（ＰＥＳＴ）で１００μｌまで希釈した。二次抗体はＨＲＰに結合させたヒツジ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）であり、色はｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）で発色させた。陽性のウェルを顕微鏡で検査し、産生が最も高いウェルから細胞を拾って２４ウェルプレート中の１０％のＦＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加した１．５ｍｌのＤＭＥＭに入れた。合計１５個の産生が高いコロニーを２つのトランスフェクション体から拾った（表２０）。２つの独立した細胞系から約４０μｇ／ｍｌ以上の抗体産生レベルが得られた。

重鎖ベクター内でｄｈｆｒ遺伝子を用いた増幅では、最初の２つの産生が高い細胞系を０．０２μＭのメトトレキセートを加えた培地（１０％のＦＣＳ及び１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む）に移した。

ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄγ１遺伝子を含む単一増幅ベクターを用いたＮＳＯ宿主細胞系のトランスフェクション及び抗体産生細胞系の選択
実施例９に記載の組み合わせた（単一）抗体発現ベクターを、電気穿孔によってＮＳＯ宿主細胞系内にトランスフェクションさせた。

トランスフェクションさせた細胞を１０個の９６ウェルプレート中の１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭに分配した。２日後、０．１μＭのメトトレキセートを含む等量の培地を加えた。培地の半分を、トランスフェクション８日後まで２日毎に同体積の０．１μＭのＭＴＸ含有培地で交換した。予備として、また選択用のトランスフェクションさせた細胞クローンをさらに多く提供するために、１週間後にトランスフェクションを繰り返した。１４〜２１日後、トランスフェクションさせた細胞の目に見えるコロニーが発生しており、上記実施例に記載のようにウェルからの調整培地を抗体の産生についてスクリーニングした。陽性のウェルを顕微鏡で検査し、産生が最も高いウェルから細胞を拾って２４ウェルプレート中の１０％のＦＢＳ及び０．１μＭのメトトレキセートを添加した１．５ｍｌのＤＭＥＭに入れた。合計１３個の産生が高いコロニーを２つのトランスフェクション体から拾い、液体窒素中で冷凍しておいた（表２０）。６つの独立した細胞系から４０μｇ／ｍｌを超える抗体産生レベルが得られた。異なる選択により、単一ベクターを含む細胞系は、２つの異なるベクター上に抗体遺伝子を含むものよりも発生するのが遅かった。

ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄγ１遺伝子を含む単一増幅ベクターを用いたＮＳＯ宿主細胞系のトランスフェクション及び抗体産生細胞系の選択の後、即ちクローニングした細胞系１Ｂ７の、ヒト化ＢＡＴ産生細胞の代表的な例は、ブダペスト条約の寄託形式を用いて、２００３年５月９日に寄託番号ＡＴＣＣ＃（ＰＴＡ−５１８９）の下でＡＴＣＣ細胞バンクに寄託されている。

ヒト化ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄγ１変異体によるマウスＢＡＴ−１の阻害
ヒト化ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄγ１変異体が元のネズミＢＡＴ−１と同じエピトープを認識できることを確認するために、ＢＡＴ−１結合性エピトープを発現するダウディ細胞への結合の競合アッセイを実施した。

ダウディ細胞を段階的に多い量のヒト化ＢＡＴ−１又は対照としてマウスＢＡＴ−１と共にインキュベートした（０〜８０μｇ／ｍｌ）。結合しなかった抗体を廃棄し、ビオチン標識したネズミ−ＢＡＴ−１（２０μｇ／ｍｌ）を細胞に加え、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで染色した。図２１は、ヒト化及び元のマウスのｍＡｂのどちらもで濃度の増加に伴ってネズミＢＡＴ−１の結合が減少したことを示し、これは、予測した通りに同じエピトープを認識していることを支持している。どちらの抗体も約１０μｇ／ｍｌのＩＣ_５０で類似した用量依存性を示しており、類似した抗原結合親和性が示唆される。

ネズミ腫瘍モデルにおけるヒト化ＢＡＴ−１のＩｎ ｖｉｖｏ効果
実施例２０で示したように、ヒト化ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ γ１ｍＡｂの形成をもたらしたＣＤＲ移植ではＢＡＴ−１抗原の認識が保たれた。この結合がネズミＢＡＴ−１の生物学的効果の特徴を伝えることができるかどうかを検査するために、ヒト化ＢＡＴ−１の有効性をｉｎ ｖｉｖｏで研究した。これは、マウスｍＡｂとヒトｍＡｂとの間のアイソタイプの差に関して特に重要である。

肺転移を誘発させるためにＣ５７ＢＬマウスにＢ１６黒色腫細胞を接種した。段階的に多い量（１、１０及び２０μｇ）のヒト化ｍＡｂを腫瘍接種後１２日目に注射し、最適用量である１０μｇのネズミ−ＢＡＴ−１と比較した。腫瘍接種後２４日目に測定した肺重量を図２２に示し、これは腫瘍の確立に対応する。処置なしのマウス及びアイソタイプがマッチした非関連のヒトＩｇＧ１で処置したマウスのどちらも、０．９ｇｒの平均肺重量を有していた。ヒト化ＢＡＴ−１は用量依存性の転移の増殖の阻害を示し、最も高い阻害が１μｇ／マウスの低用量で起こっていた。これにより腫瘍質量の６７％の減少がもたらされ、最適用量のネズミＢＡＴ−１でもたらされるものに類似していた（６２％）。重要なことは、この最大効果は１０倍低い用量のヒト化ｍＡｂでもたらされたことで、元のネズミＢＡＴ−１ ｍＡｂと比較した場合にこの抗体の治療有効性が高いことが示唆される。

ｈＢＡＴ−１によるＳＣＩＤマウス中のヒト黒色腫（ＳＫ−２８）の阻害
マウス−ＢＡＴ−１ ｍＡｂは、ヒト末梢血リンパ球（ｈＰＢＬ）の存在下でヒト−腫瘍転移の形成を阻害することが示されている。ヒト癌の阻害におけるヒト化ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ／Ｒκ_Ｄ γ１ｍＡｂの有効性を推定するために、ヒト化抗体を腫瘍及びヒト由来のリンパ球のどちらもを組み合わせたモデルで調査した。免疫能力を修復するために重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤ）にｈＰＢＬを移植した。マウスにヒト黒色腫細胞（ＳＫ−２８）を接種し、腫瘍接種後１１日目に単一のｉ．ｖ．用量として投与した段階的に多い濃度のヒト化抗体で処置した。図２３は、２３日目に測定した、観察された転移の数に関連する肺重量を示す。どちらの濃度のヒト化抗体もｈＰＢＬの存在下で腫瘍の阻害を誘発した。上述したマウス腫瘍モデルで観察されたように、ヒト化抗体は、マウスＢＡＴ−１に比べて腫瘍増殖をｉｎ ｖｉｖｏでより効率的に阻害することができた。このヒト化抗体の１μｇの単一用量で腫瘍増殖が６８％阻害され、１０μｇのマウスＢＡＴ−１抗体よりも高い有効性が示された（３０％）。

ヌードマウスにおけるｈＢＡＴ−１モノクローナル抗体によるヒト結腸直腸癌の肝転移の免疫療法
ＬＩＭ６及びＨＭ７は、その高いムチン合成及び転移の潜在性により選択された、ヒトＣＲＣ細胞系ＬＳ１７４Ｔの２つのサブクローンである。腫瘍細胞を麻酔したヌードマウスの露出した脾臓に注射した。１分後、脾臓を取り出して切除痕を閉じた。１２日後に低用量のネズミ及びヒト化ＢＡＴ−１抗体を投与し、腫瘍接種後３５日目にマウスを屠殺した。肝臓を秤量し、転移結節数を数え、肝臓組織を組織学及び免疫組織化学的な研究用に処理した。

ＢＡＴ−１、ネズミ及びヒト化抗体を用いた処置は、ネズミモデルにおいて肝臓転移の確立の阻害に有効であることが判明した。マウスＢＡＴ−１抗体による処置は、ＬＩＭ−６異種移植片の発生を予防した。ＢＡＴ−１で処置したマウス及び対照の異種移植片の平均重量はそれぞれ０．１４±０．１７ｇｒ及び０．９８±１．１２ｇｒであった（Ｐ＝０．００４）。ヌードマウスに注射したＨＭ７細胞は肝臓に多数の大きな転移性病変をもたらし、これはネズミＢＡＴ−１及びヒト化ＢＡＴ−１の単一投与によって予防された（図２４）。転移結節数の主要な（４０％を超える）減少、即ち対照マウスで１３４．５±３４からネズミＢＡＴ−１ヒト化ＢＡＴ−１で処置したマウスでそれぞれ８．３６±３及び４．８８±２の減少が観察された。ＢＡＴ−１を用いた処置により腫瘍の端部にリンパ球が蓄積することが予防された。転移結節周辺におけるリンパ球の浸潤の役割は癌の結果に関連しているかもしれず、ＢＡＴ−１治療の機構を示唆し得る。

ｈＢＡＴの、ＣＤ４及びＣＤ８との共局在
マウスＢＡＴ−１はＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットのどちらも認識し、ヒトリンパ球に結合することが示されている。ヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂ（ｈＢＡＴ）の結合特異性を確立するために、本明細書中で以下に記載するようにヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を正常ドナーの血液から単離し、既知のリンパ球マーカーを用いてｈＢＡＴの共局在について解析した。

末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコールによって単離し、接着細胞を除去するために組織培養プレート中でインキュベートした。単離したＰＢＬをサイズ及び顆粒度に応じてリンパ球に、またヨウ化プロピジウム（ＰＩ）に応じて生細胞にゲートをかけた。結合は４℃、１時間で行い、リンパ球にゲートをかけたフローサイトメトリーによって決定した。

検査した全ての試料で、ＰＢＬの少なくとも２０％がｈＢＡＴへの結合を示した。図２５は、単離したＰＢＬの５０％がｈＢＡＴに陽性であった選ばれたドナーのリンパ球への結合例を示し、これにはＣＤ４＋細胞（２５％）及びＣＤ８＋細胞（１５％）がどちらも含められる。これらの部分集団内では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のほとんどがｈＢＡＴ ｍＡｂに結合した（それぞれ５８％及び７１％）。

ｈＢＡＴのＢリンパ球への結合
ヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂ（ｈＢＡＴ）をヒトＢリンパ腫細胞系であるダウディ細胞の膜に対して産生させた。上述のように、正常なドナー由来のＰＢＬをフィコ−ルによって、次いで組織培養プレートへの接着によって単離した。非接着細胞を、ＣＤ１９及びＣＤ２０を含めたＢ細胞マーカーも用いてｈＢＡＴの共局在について検査した。結合は４℃、１時間で行い、リンパ球にゲートをかけたフローサイトメトリーによって決定した。図２６は、代表的な正常ドナー細胞の結合の評価を示す。

試料中のリンパ球の２５〜２９％がヒト化ＢＡＴ ｍＡｂに陽性であった。これらの細胞にはＢ細胞のほとんど（７０〜７５％）が含まれていたことが両方の独立したマーカーによって実証された。ＣＤ２０＋の７０％がヒト化ＢＡＴ ｍＡｂに陽性であり（Ｒ１にゲートをかけ、ＰＩに陰性；図２６Ａ）、ＣＤ１９＋の７５％がヒト化ＢＡＴ ｍＡｂに陽性であった（Ｒ１にゲートをかけ、ＰＩに陰性）。これらの結果は、細胞表面上のＢＡＴ結合部分が末梢Ｂ細胞に一般的である可能性を示唆している。

細胞を活性化させるとｈＢＡＴのＣＤ４＋Ｔ細胞への結合が増加する
マウスＢＡＴ抗体の結合は、以前はリンパ球の活性化に関連付けられていた。この結合活性をヒトｍＡｂについてさらに研究した。ヒトＢＡＴ ｍＡＢの活性化させたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する結合レベルを検査した。陰性選択によって細胞を正常なドナーから単離し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８に結合させたビーズで刺激した（５μｌ／ｍｌ）。Ｔ細胞受容体及び同時刺激性分子によってポリクローナル活性化を及ぼすためにこの処置を選択した。

細胞を、活性化後０、２及び５日目におけるヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂ（ｈＢＡＴ）と抗ＣＤ４との結合（４℃、１時間）について検査した（図２７Ａ、Ｂ及びＤ）。解析はＰＩ染色に陰性の細胞を用いたフローサイトメトリーによって行った。象限はアイソタイプ対照によって決定した。

ヒト化ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ γ１ｍＡｂのＣＤ４＋細胞への結合は、活性化後に劇的に増加した（図２７）。不活性細胞は、０日目（図２７Ａ）及び５日目（図２７Ｃ）に１７〜２０％のｈＢＡＴに対する陽性結合を示したが、ＣＤ４＋細胞の５２％及び７７％が活性化のそれぞれ２日目（図２７Ｂ）及び５日目（図２７Ｄ）にｈＢＡＴに結合した。複数の試料で同様の結果が得られ、これはＣＤ８＋細胞でも実証された。これは、Ｔ細胞に対するｈＢＡＴの結合がＴＣＲ活性化を活性化すると増加することを実証している。

この活性化の用量依存性は、ｈＢＡＴとＣＤ６９との共局在によって実証された。Ｔ細胞の活性化は、様々な分子の細胞表面での発現によって特徴付けられており、その一部は活性化過程に関与していることが示されている。ｈＢＡＴの同時発現について、初期及び後期活性化分子をどちらも含めた様々なマーカーを用いて調査した。初期活性化マーカーであるＣＤ６９は、活性化されるとＴ細胞により上方制御される。活性化の４日後、細胞をｈＢＡＴと抗ＣＤ６９との結合（４℃、１時間）について検査した。解析は、ＰＩ染色に陰性の細胞を用いたフローサイトメトリーによって行った。象限はアイソタイプ対照によって決定した。

正常なドナー由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の用量依存性の活性化を図２８に示す。強い活性化の際（５μｌ／ｍｌの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８に結合させたビーズ；図２８Ｂ）、ｈＢＡＴに結合する能力を有する細胞のほとんどが（９３％）活性細胞となり、ＣＤ６９発現によって同定された。活性化時間を増加すると、活性化の１日目から始まるｈＢＡＴへの結合の増加も生じた。活性化の時間依存性も実証することができ、活性化の１日目に始まるｈＢＡＴの結合の増加がもたらされた。興味深いことに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞のいずれにも対するｈＢＡＴの結合はＣＤ６９の低下後も高いまま維持され（５日目）、これは、結合とリンパ球の活性化の複数段階との関連を示唆している。ＣＤ６９＋細胞に対するｈＢＡＴの結合は、ｈＢＡＴ結合性タンパク質の発現が初期活性化に関連していることを示唆している。

ｈＢＡＴの、ＣＤ２５及びＣＤ４０−リガンドを発現している活性Ｔ細胞への結合
ＩＬ２の高親和性受容体であるＣＤ２５はＴ細胞の拡大に重要であり、通常活性細胞の表面上で増殖される。時間的にはこれはＣＤ６９の出現に続き、その発現はＣＤ６９の下方制御の後数日間に及ぶ。

ＣＤ４＋Ｔ細胞は陰性選択によって正常なドナーから単離し、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８に結合させたビーズを用いて数日間刺激した（５μｌ／ｍｌ）。細胞を、活性化の０日目（図２９Ａ）、１日目（図２９Ｂ）、及び５日目（図２９Ｄ）に、対照（活性化なしの０日目、図２９Ａ及び５日目、図２９Ｃ）に対して、ｈＢＡＴ及び抗ＣＤ２５の結合（４℃、１時間）について検査した。解析はＰＩ染色に陰性の細胞を用いたフローサイトメトリーによって行った。象限はアイソタイプ対照によって決定した。

ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれもが抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８刺激の際に、刺激の１日目から始まってＣＤ２５の発現の時間依存性の増加を示した。これらの活性細胞でｈＢＡＴはＣＤ２５と共局在していた（図２９）。

ＣＤ２５の発現は、活性化後１日目に細胞の５５％（図２９Ｂ）から５日目に９３％（図２９Ｄ）まで増加した。どちらの時点でも、ｈＢＡＴ結合細胞のほとんどがＣＤ２５＋であった（それぞれ８５％及び９８％）。

活性化マーカーとの関連性を、後期活性化マーカーのＣＤ４０−リガンドまで拡張した（図３０）。ｈＢＡＴの結合は、ＣＤ４＋（図３０）及びＣＤ８＋Ｔ細胞内で時間依存的な様式でＣＤ４０−リガンドの発現に肯定的に関連していた。これらの結果は、Ｔ細胞の活性化により、様々な活性化段階に関連する様式でｈＢＡＴ結合タンパク質の発現が誘発されることを示唆する結果となっている。

ｈＢＡＴが活性ＣＤ４＋細胞の生存率を増加させる
活性Ｔ細胞をｈＢＡＴでさらに刺激することができるかどうかを検査するために、ヒトＣＤ４＋細胞を陰性選択によって正常なドナーから単離し、最適以下の濃度（０．２５μｌ／ｍｌ）の抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで活性化した（図３１）。活性化の２日後にｈＢＡＴ（０．５μｇ／ｍｌ）を加え、生細胞数を決定することによってその効果を評価した。結果により、ｈＢＡＴが２つの別個のドナー由来の生ＣＤ４＋細胞数の有意な増加を誘発させたことが示された（図３１Ａ及びＢ）。対照の非刺激細胞は単離の８日以内に死滅したが、活性細胞はリンパ球に典型的な様式で拡大した、即ち細胞増殖から始まり、次いで安定した細胞数の段階、次いで細胞死が優勢になる段階があった。ｈＢＡＴを加えることによりＣＤ４＋細胞の拡大が増強され、ｍＡｂが存在しない細胞に対して細胞数が１．５倍増加した。

ＢＡＴ抗体のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性が腫瘍の存在下で増大することと本明細書中の結果とがあいまって、増大した有効性は活性ＢＡＴ標的細胞の存在に依存し得ることが示唆される。腫瘍増殖の阻害が不十分であるにもかかわらず腫瘍抗原に向けられたリンパ球が癌患者で観察されており、これはＢＡＴ活性の標的細胞として役割を果たし得る。したがって、結果を考慮すると、細胞増殖の刺激及び／又は細胞死の阻害によってｈＢＡＴがＣＤ４＋細胞を活性化させるといえるかもしれない。

ｈＢＡＴのダウディ及びジャーカット細胞系への結合
マウスＢＡＴ−１をダウディＢ細胞系の膜に対して産生させ、これはヒトＴ細胞に結合することが示されている。このヒト化抗体の特異性を確認するために、ｈＢＡＴを、骨髄由来の２つのヒト細胞系、即ちヒトＢ細胞リンパ腫系であるダウディ細胞及びヒトＴ細胞白血病系であるジャーカット細胞への結合について検査した。ＦＩＴＣに結合させたｈＢＡＴを１５０ｕｇ／ｍｌの濃度のダウディ及びジャーカット細胞と共にインキュベートした（４℃で１時間）。結合はフローサイトメトリーによって決定した。

ダウディ（図３２Ａ）及びジャーカット（図３２Ｂ）のどちらの細胞系もヒト化抗体に結合した。さらに、どちらの系でも培養中のほとんどの細胞が抗体を結合する能力を有していた。アイソタイプがマッチしたヒト−ＩｇＧ１が陰性対照として役割を果たし（図３２；アイソタイプ対照）、読取閾値が設定された。どちらの細胞系も同様の抗体染色の強度を示し、これにより、これらが同様の数のｈＢＡＴ結合分子を発現することが示唆された。

ｈＢＡＴの癌患者のＰＢＬへの結合
ｈＢＡＴが正常なドナー由来のヒトＴ細胞に結合する能力を有するという観察の後、癌患者から採取したリンパ球に結合するその能力を比較した。ＰＢＬをフィコールによって、次いで組織培養プレートへの接着によって前立腺癌患者の血液から単離した。非接着細胞を、ｈＢＡＴ及びリンパ球マーカーの結合について検査した。結合は４℃、１時間で行い、リンパ球にゲートをかけたフローサイトメトリーによって決定した。象限の決定にはアイソタイプ対照を使用した。これらの患者は以前に、しばしばリンパ球の存在及び表現型に影響を与える治療を受けている。これらの細胞に結合するｈＢＡＴはその活性に必須であり、図３３に示すように、正常なドナーのリンパ球への結合に類似している。全リンパ球数は低いが、ｈＢＡＴはそれでもＣＤ４＋細胞の３９％、ＣＤ８＋細胞の６０％及びＢ細胞の６８％を含めて検査したリンパ球部分集団の大部分に結合することができた。

ｈＢＡＴのヒト、霊長類及びネズミ組織との交差反応性
本研究の目的は、ｈＢＡＴ−１モノクローナル抗体の様々な正常ヒト組織との交差反応性を検査することであった。本研究は、様々なヒト組織に対するモノクローナル抗体の免疫組織化学試験を含んでいた。カニクイザル及びＣＤ−１マウス由来の組織中でのｉｎ ｖｉｔｒｏ交差反応性の比較も行った。

（ｉ）組織供給源
本研究で使用した組織は、抗体結合に影響を与えるドナー特異的因子を最小限にするために、それぞれ３人の血縁関係のないドナーから得た。ヒト組織は道徳的な出所から得た。本研究で使用した霊長類及びネズミの組織はそれぞれの種で２匹の動物から、倫理的な供給元から得た。ネズミ及び霊長類は前臨床の毒性研究で評価し得る潜在的な試験システムである。選択した組織はＦＤＡのヒトで使用するためのモノクローナル抗体製品の製造及び試験における検討材料（Ｐｏｉｎｔｓ ｔｏ Ｃｏｎｓｉｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ）、（生物製剤研究審査局、ＦＤＡ生物製剤評価センター（Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＦＤＡ）、１９９７）及びＥＣ薬事規則第３ａ巻（ｔｈｅ Ｒｕｌｅｓ Ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ Ｖｏｌ．３ａ）、（モノクローナル抗体の産生及び品質管理（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、１９９４年１２月、３ＡＢ４ａ）に規定されたものであった。本調査で使用したすべての組織は液体窒素で瞬間冷凍し、必要になるまで−７０℃以下で保存した。クライオスタット切片を５μｍ〜８μｍの基準の厚さで調製した。陽性対照はジャーカットＥ６細胞であった。使用日に新鮮な血液試料を３人のドナーから採取してスメアを調製した。

（ｉｉ）ＦＩＴＣの結合形成
本研究を開始する前にＳｅｒｏｔｅｃ社のオーダーメイド抗体サービス部門（Ｃｕｓｔｏｍ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）（ＩＳＯ９００１認定書）によってヒト化モノクローナルｈＢＡＴ−１抗体をＦＩＴＣに結合させた。結合させた抗体の最終濃度は１．９９ｍｇ／ｍｌであった。

本方法の最初の妥当性確認は、抗体−組織と冷凍切片との結合の力価濃度及び抗体−組織結合の正しい性能に関連する他の条件を決定するために対照組織（ジャーカットＥ６細胞系）で行った。スライドを顕微鏡で検査し、抗体特異性に対して相対的にスコアをつけた（表２１）。これらのデータに基づいて、本研究に渡って使用したｈＢＡＴ−１の濃度は１：１００、１：２５０及び１：５００であった。

^１符号：３は強い陽性の染色を示し、２は陽性の染色を示し、１は弱い陽性の染色を示し、０は染色／シグナルなしを示す。＋＋＋は強い可視シグナルを示し、＋＋は良好な可視シグナルを示し、＋は弱い可視シグナルを示す。

（ｉｉｉ）対照
抗体を緩衝液で置換した陰性対照反応を各組織で行った。それぞれの検出反応は、陽性対照細胞であるジャーカットＥ６を含み、抗体の３つの所定の希釈率で反応させた。これにより、反応の一貫性をモニタリングすることが可能となった。抗アクチン抗体とインキュベートした甲状腺の切片を検出システムの対照として各アッセイの実行に含めた。

（ｉｖ）交差反応性の評価
各組織の切片を、その同一性及び本研究に適しているかを確認するためにヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。また、切片を抗平滑筋アクチン（ＳＭＡ；表２２）又はウサギ抗ヒトトランスフェリン対照血清ともインキュベートし、これにより組織が免疫組織化学に適していることが示された。各組織の３つの切片を調製し、妥当性確認段階で決定された１：１００、１：２５０及び１：５００の濃度でＦＩＴＣに結合させた抗体とインキュベートした。緩衝液で洗浄し、正常血清でブロッキングした後、切片をアルカリホスファターゼ検出に適切な二次及び三次抗体と共にインキュベートし、結合部位を決定するために顕微鏡で検査する前にヘマトキシリンで対比染色した。

アルカリホスファターゼ検出を用いたＦＩＴＣ結合染色方法は以下のステップを含んでいた：
１．クライオスタット切片の空気乾燥。
２．１０分間、室温でアセトンに浸すことによる固定。
３．空気乾燥。
４．緩衝液での洗浄。
５．１：５の正常血清、少なくとも２０分間。
６．緩衝液での洗浄
７．１：１００、１：２５０及び１：５００の１０２２２９２試験ＦＩＴＣに結合させた抗体：終夜、２〜８℃。
８．緩衝液での洗浄。
９．モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体、１：５０、３０分間。
１０．緩衝液での洗浄。
１１．アルカリホスファターゼに結合させた抗体、１：２００、２時間。
１２．緩衝液での洗浄。
１３．ベクターレッド（Ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｄ）及びレバミゾール、２０分間。
１４．緩衝液での洗浄。
１５．対比染色及び装着。

色素原内に組み込んだレバミゾールを使用して内在性アルカリホスファターゼを最小限にした。内在性アルカリホスファターゼ活性を抑制することができなかった組織では（ヒトの結腸、回腸、胎盤及び内皮、ネズミの結腸及び膵臓、霊長類の胃、回腸及び前立腺）、１：２００の西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗体を２時間、次いでジアミノベンジデン（ＤＡＢ）試薬を２０分間で使用した。

（ｖ）結果
Ｈ＆Ｅで染色した個々の組織試料を、組織の質、正常な組織学的特徴の存在及び保存の妥当性について検査した。試験したすべての試料は本研究の目的に適していると考えられた。ジャーカットＥ６細胞系中ではｈＢＡＴ−１で、また平滑筋アクチンで処置した甲状腺切片で陽性の染色が起こった。対照が予測された結果を示したので、試験は妥当であると考えられた。

ｈＢＡＴ−１及びヒト組織の個々の交差反応性の結果を表２２に示す。陽性の染色は血管ヒト内皮で１：１００の希釈率で検出され、これは恐らくｈＢＡＴ−１がリンパ球に結合した結果である。陽性の染色は、ヒト化モノクローナルｈＢＡＴ−１抗体の組織結合の可能性を示している。染色、即ちｈＢＡＴ−１との交差反応性は脾臓切片、血液スメア又は他のヒト組織で観察されなかった（ヒト内皮−血管を除く）。ネズミ及び霊長類組織はどれもｈＢＡＴ−１との交差反応性の証拠を示さなかった。

^１Ｎ／Ａ−結果は該当なし

特定の実施形態の前述の説明は、他者が現在の知識を適用することによって、過度の実験なしに且つ全体的な概念から逸脱せずにこのような特定の実施形態を様々な用途に容易に改変及び／又は適応させることができるように本発明の全体的な性質を完全に明らかにしており、したがって、このような適応及び改変は開示した実施形態の等価物の意味及び範囲内に包含されるべきであり、そう意図されている。本明細書中で使用する表現や術語は説明を目的とし、限定を目的とするものではないことを理解されたい。様々な開示した機能を手段、材料、及びステップは、本発明から逸脱せずに様々な代替形態をとり得る。したがって、上記明細書及び／又は以下の特許請求の範囲で見つかり得る、表現「〜する手段」及び「〜するための手段」、又はすべての方法ステップの言葉及び続く機能の記述には、上記明細書中に開示した実施形態又は複数の実施形態に正確に等価であるかどうかにかかわらず、列挙した機能を実行する現在又は将来存在し得る全ての構造的、物理的、科学的若しくは電気的な要素又は構造、或いは全ての方法ステップを定義及び包含することを意図する、即ち同一機能を実施するために他の手段又はステップを使用することができ、また、このような表現には最も広い解釈を与えることを意図する。

Claims (40)

1. ネズミモノクローナル抗体ＢＡＴ−１（ｍＢＡＴ−１）の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とアクセプターヒト免疫グロブリン由来のフレームワーク領域（ＦＲ）とを有するヒト化モノクローナル抗体であって、
   該ヒト化抗体が、ｍＢＡＴ−１モノクローナル抗体の抗腫瘍活性を保っており、ヒト対象において該ネズミ抗体よりも免疫原性が低く、
   該ヒト化モノクローナル抗体は、
   ａ ＢＡＴＲκ_Ａ（配列番号１５）、ＢＡＴＲκ_Ｂ（配列番号１６）、ＢＡＴＲκ_Ｃ（配列番号１７）及びＢＡＴＲκ_Ｄ（配列番号１８）からなる群から選択される軽鎖可変領域、及び
   ｂ ＢＡＴＲＨ_Ａ（配列番号２０）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ（配列番号２１）、ＢＡＴＲＨ_Ｃ（配列番号２２）、ＢＡＴＲＨ_Ｄ（配列番号２３）及びＢＡＴＲＨ_Ｅ（配列番号２４）からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、上記ヒト化モノクローナル抗体。
2. 前記ヒト化抗体が前記親ネズミＢＡＴ−１抗体よりも大きな抗腫瘍効果を誘発させる、請求項１に記載のヒト化モノクローナル抗体。
3. 前記ヒト化抗体が、ネズミＢＡＴ−１モノクローナル抗体よりも大きな転移抑制効果を誘発させる、請求項１に記載のヒト化抗体。
4. 前記抗体が完全長抗体である請求項１に記載のヒト化抗体。
5. 前記抗体がアイソタイプＩｇＧである請求項４に記載のヒト化抗体。
6. 前記アイソタイプサブクラスがＩｇＧ１又はＩｇＧ４から選択される、請求項５に記載のヒト化抗体。
7. ヒトκ定常領域を有する請求項１に記載のヒト化抗体。
8. 前記抗体断片がＦｖ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）_２及び単鎖抗体からなる群から選択される、請求項１に記載のヒト化抗体の抗体断片。
9. 前記抗体が、さらに検出可能な標識で標識されているか、固相上に固定されているか、又は外来化合物に結合されている、請求項１に記載のヒト化抗体。
10. 前記可変領域がＢＡＴＲＨ_Ａ／ＢＡＴＲκ_Ａ（配列番号２０／配列番号１５）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ａ（配列番号２１／配列番号１５）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｂ（配列番号２１／配列番号１６）、ＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｂ（配列番号２２／配列番号１６）、ＢＡＴＲＨ_Ｂ／ＢＡＴＲκ_Ｄ（配列番号２１／配列番号１８）、及びＢＡＴＲＨ_Ｃ／ＢＡＴＲκ_Ｄ（配列番号２２／配列番号１８）からなる群から選択される、請求項１に記載のヒト化抗体。
11. 前記ヒト化抗体が、ネズミＢＡＴ−１モノクローナル抗体よりも大きな抗腫瘍効果を誘発させる、請求項１０に記載のヒト化抗体。
12. ＣＤＲ移植を利用して組換えＤＮＡ技術によって作製した請求項１に記載の抗体。
13. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片をコードしている単離したポリヌクレオチド構築体。
14. 配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１３に記載の単離したポリヌクレオチド構築体。
15. 配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２からなる群から選択される核酸配列を含有する、請求項１３に記載の単離したポリヌクレオチド構築体。
16. 請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
17. 前記抗体をコードしているポリヌクレオチドに発現可能に連結されたプロモーター、１つ又は複数の耐性遺伝子、コザック配列、複製起点、１つ又は複数の選択マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、シグナルペプチド、ゲノムヒトκ定常領域、ゲノムヒトＩｇＧ定常領域からなる群から選択される構成要素をコードしている少なくとも１つのポリヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１６に記載のベクター。
18. 前記ベクターがプラスミド又はウイルスである、請求項１７に記載のベクター。
19. プラスミドが、ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ａ； ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ｂ； ｐＧ１Ｄ１１０−ＢＡＴＲＨ_Ｃ； ｐＧ１Ｄ２１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ； ｐＧ４Ｄ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＨ_Ｃ； 及びｐＫＮ１１０．ＢＡＴ−１．ＲＫ_Ｄからなる群から選択される、請求項１８に記載のベクター。
20. 配列番号９３のポリヌクレオチド配列を含む請求項１６に記載のベクター。
21. 請求項１６〜２０までのいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。
22. 抗体又はその断片を発現する能力を有する請求項２１に記載の宿主細胞。
23. 前記細胞が真核細胞及び原核細胞から選択される、請求項２１に記載の宿主細胞。
24. ＣＨＯ、ＣＨＯｄｈｆｒ、ＮＳＯ、ＣＯＳ及びＣＯＳ７細胞からなる群から選択される、請求項２１に記載の宿主細胞。
25. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体又は抗体断片を活性成分として含む薬剤組成物。
26. 生理的に許容される担体、希釈剤、又は安定剤をさらに含む、請求項２５に記載の薬剤組成物。
27. サイトカイン、ＩＬ−１（インターロイキン−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α（インターフェロン−α）、細胞ワクチン、抗体、Ｔ細胞刺激抗体、及び抗腫瘍治療用抗体からなる群から選択される追加の治療剤をさらに含む、請求項２５又は２６に記載の薬剤組成物。
28. 癌を処置するための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
29. 前記癌が黒色腫、肺腫瘍、結腸直腸癌又は肝転移から選択される、請求項２８に記載の薬剤組成物。
30. （ｉ）前記抗体をコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクターを用いて宿主細胞を形質移入させること、又はそれぞれが前記抗体の重鎖若しくは軽鎖領域をコードしているポリヌクレオチド配列を含む２つのベクターを用いて前記宿主細胞を同時形質移入させること；
    （ｉｉ）前記抗体が発現されるように（ｉ）の宿主細胞を培養すること；及び
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）の宿主細胞培養物から前記抗体を回収すること
    を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体を産生させる方法。
31. ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖活性を誘導するための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
32. ＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞溶解活性を誘導するための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
33. ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性を刺激するための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
34. 活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の生存率を増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ）ための、請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
35. 請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒト化モノクローナル抗体に、ｅｘ ｖｉｖｏで活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を接触させることを含む、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の生存率を増加させる方法。
36. 癌を治療するための、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
37. ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少に関連する遺伝性又は後天性の免疫不全症を治療するための、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の薬剤組成物。
38. ＨＩＶ感染の初期段階を治療するための、請求項３７に記載の薬剤組成物。
39. 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を治療するための、請求項３７に記載の薬剤組成物。
40. 前記癌がＣＤ４＋Ｔ細胞の減少を示す血球数を有する患者中に存在する、請求項３６に記載の薬剤組成物。

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