JP2009539907A5 - - Google Patents
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Claims (15)
- オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、
(a) 少なくとも一つのポリGが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液Iに準備する工程、このとき該溶液Iはアルカリ性pHを含み、該pHは好ましくは8〜13、より好ましくは12であり、
(b) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、
(i) 温度Iに溶液Iの温度を調節する、 該温度Iは4〜70℃、好ましくは45〜70℃、より好ましくはおよそ50℃、そして最も好ましくは50℃であり、
(ii) 該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を110%より上に含むまで、該温度Iにて該溶液I中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iii) 温度IIに該溶液Iの温度を調整する、該温度IIは0〜70℃、好ましくは温度I未満であり、さらに好ましくは温度IIが0〜25℃、最も好ましくは0〜2℃であり、
(c) pH5〜8に該溶液IのpHを調整する工程、このとき溶液IのpHの調整は好ましくはpHが6〜7になるまで行い、そして、
(d) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、
(i) pH5〜8であり、少なくとも20mMの陽イオンを含む溶液IIに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき該陽イオンはNa+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+及びMg2+からなる群から選択されるものであり、該溶液IIは好ましくは200〜275mM、好ましくは250mMの該陽イオンを含み、
(ii) 温度IIIに溶液IIの温度を調整する、 該温度IIIは50〜99℃、好ましくは80〜90℃、より好ましくはおよそ85℃、最も好ましくは85℃であり、
(iii) 該オリゴヌクレオチドが50〜110%の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度IIIにて該溶液II中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iv) 温度IVに溶液IIの温度を調整する、該温度IVは50℃未満であり、該温度IVは好ましくは0〜25℃、より好ましくは0〜2℃である、
ことを含む方法。 - 前記溶液Iの温度を温度IIに調節する工程が、少なくとも3.6℃/分の温度勾配で行われ、及び/又は、該溶液IIの温度を温度IVに調節する工程が、少なくとも3.6℃/分の温度勾配で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記溶液Iが、アルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム、最も好ましくは水酸化ナトリウムを含み、このとき、前記水酸化物の濃度が、10mM〜200mM、好ましくはおよそ25mM、最も好ましくは25mMである、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記陽イオンがNa+又はK+であり、このとき好ましくは前記陽イオンがNa+である、請求項1から3のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液Iの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、50μM〜2mM、最も好ましくは260μMであり、及び/又は、前記溶液IIの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、50μM〜2mM、好ましくは100〜300μM、最も好ましくは175μMである、請求項1から4のいずれか一に記載の方法。
- 温度IIIにて溶液II中で前記オリゴヌクレオチドをインキュベートする工程が、前記オリゴヌクレオチドが80〜95%、好ましくは80〜90%、より好ましくは83〜90%、より好ましくは85〜90%、そして、最も好ましくは88%の相対的なピークのスタート時間を含むまで行われる、請求項1から5のいずれか一に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、その5'末端に少なくとも3、最大15のグアノシン体とその3'末端に少なくとも3、最大の15グアノシン体を含み、好ましくはパリンドローム配列を含み、さらに好ましくは該パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号:1)であり、よりさらに好ましくは、
(a) 「G4−4」GGGGGACGATCGTCGGGG (配列番号:2)、
(b) 「G5−5」GGGGGGACGATCGTCGGGGG (配列番号:3)、
(c) 「G6−6」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号:4)、
(d) 「G7−7」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (配列番号:5)、
(e) 「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号:6)、
(f) 「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (配列番号:7)、
(g) 「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号:8)、
(h) 「G11」GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (配列番号:9)
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1から6のいずれか一に記載の方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号:8)を有する、請求項1から7のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチド組成物であって、該ヌクレオチド組成物が請求項1から8のいずれか一に記載の方法によって入手可能であり、好ましくは該オリゴヌクレオチドが50〜110%、好ましくは80〜95%、より好ましくは80〜90%、より好ましくは83〜90%、より好ましくは85〜90%、そして最も好ましくは88%の相対的なピークのスタート時間を含み、さらにより好ましくは、該オリゴヌクレオチドが、核酸配列「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号:6)又は「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号:8)を有し、最も好ましくは前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号:8)を有する、ヌクレオチド組成物。
- (i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該RNAバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、
(i) このとき、該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのポリG伸展を含み、そして、
(ii) このとき、該オリゴヌクレオチドが50〜110%の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、
(c) 混合物を生成する工程、このとき該混合物が以下を含有してなるものであり、
(i) 前記コートタンパク質、このとき該混合物中の該コートタンパク質の濃度が好ましくは1〜4mg/ml、より好ましくは2.5mg/mlであり、及び/又は、さらに好ましくは該混合物中の該オリゴヌクレオチドの濃度が25〜100μM、より好ましくは62.5μMであり、
(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤、このとき該薬剤が、好ましくは尿素及びグアニジウムハイドロクロライドから選択される変性化化合物を含み、さらに好ましくは該変性化化合物が尿素であり、よりさらに好ましくは該混合物中の該尿素の濃度が0.25〜7.2M、好ましくは1Mであり、
(iii) 前記オリゴヌクレオチド
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、このとき該混合物からの薬剤の除去が、好ましくは第一のバッファによる第一バッファ交換によって行われ、このとき該第一バッファは塩化ナトリウムを含み、好ましくは該第一バッファ中の該塩化ナトリウムの濃度が0〜1M、好ましくは0〜550mM、より好ましくは0〜350mM、より好ましくは50〜350mM、最も好ましくは250mMであり、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。 - (i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該RNAバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) 請求項9に記載のヌクレオチド組成物を準備する工程、
(c) 混合物を生成する工程、このとき該混合物が以下を含有してなるものであり、
(i) 前記コートタンパク質、このとき該混合物中の該コートタンパク質の濃度が好ましくは1〜4mg/ml、より好ましくは2.5mg/mlであり、及び/又は、さらに好ましくは該混合物中の該オリゴヌクレオチドの濃度が25〜100μM、より好ましくは62.5μMであり、
(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤、このとき該薬剤が、好ましくは尿素及びグアニジウムハイドロクロライドから選択される変性化化合物を含み、さらに好ましくは該変性化化合物が尿素であり、よりさらに好ましくは該混合物中の該尿素の濃度が0.25〜7.2M、好ましくは1Mであり、
(iii) 前記オリゴヌクレオチド
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、このとき該混合物からの薬剤の除去が、好ましくは第一のバッファによる第一バッファ交換によって行われ、このとき該第一バッファは塩化ナトリウムを含み、好ましくは該第一バッファ中の該塩化ナトリウムの濃度が0〜1M、好ましくは0〜550mM、より好ましくは0〜350mM、より好ましくは50〜350mM、最も好ましくは250mMであり、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。 - 前記コートタンパク質が、RNAバクテリオファージの組み換えタンパクないしはその断片を含むか、あるいは本質的にそれから成るか、あるいはそれからなり、好ましくは前記RNAバクテリオファージが、
(a) バクテリオファージQβ、
(b) バクテリオファージR17,
(c) バクテリオファージfr、
(d) バクテリオファージGA、
(d) バクテリオファージSP、
(e) バクテリオファージMS2、
(f) バクテリオファージM11、
(g) バクテリオファージMX1、
(h) バクテリオファージNL95、
(i) バクテリオファージf2、
(j) バクテリオファージPP7、及び
(k) バクテリオファージAP205
からなる群から選択される、請求項10又は11に記載の方法。 - 前記RNAバクテリオファージがQβであり、好ましくは前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドと前記コートタンパク質のモル比が、0.5〜1.2、最も好ましくは0.7である、請求項10又は11に記載の方法。
- 前記コートタンパク質が、
(a) 配列番号:10(QβCP);
(b) 配列番号:10と配列番号:11の混合物(Qβ A1タンパク質);
(c) 配列番号:12(R17コートタンパク質);
(d) 配列番号:13(frコートタンパク質);
(e) 配列番号:14(GAコートタンパク質);
(f) 配列番号:15(SPコートタンパク質);
(g) 配列番号:15と配列番号:16の混合物;
(h) 配列番号:17(MS2コートタンパク質);
(i) 配列番号:18(M11コートタンパク質);
(j) 配列番号:19(MX1コートタンパク質);
(k) 配列番号:20(NL95コートタンパク質);
(l) 配列番号:21(f2コートタンパク質);
(m) 配列番号:22(PP7コートタンパク質);及び、
(n) 配列番号:23(AP205コートタンパク質)
からなる群から選択される配列を含むか、又は好ましくはこれからなる、請求項10又は11に記載の方法。 - タンパク質収率が少なくとも75%であり、及び/又はオリゴヌクレオチド収率が少なくとも75%である、請求項10から14のいずれか一に記載の方法。
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