JP5437797B2 - Ｒｎａバクテリオファージのウイルス様粒子にオリゴヌクレオチドをパッケージ化するための方法 - Google Patents
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- C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
- C12N2795/18111—Leviviridae
- C12N2795/18123—Virus like particles [VLP]
Description
本発明は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法を提供する。さらに、本発明は、前記の方法において用いられるのに適したオリゴヌクレオチドを含有してなるヌクレオチド組成物を作製するための方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の方法によって入手可能なヌクレオチド組成物とその使用を提供する。さらに、本発明は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなり、本発明の方法によって入手可能であり、好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を含む組成物を提供する。
オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は、免疫系の強力な刺激因子であって(国際公開２００３／０２４４８１Ａ２)、現代のワクチン接種治療において広く使われている。(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法は、例えば国際公開２００３／０２４４８１Ａ２、国際公開２００４／０００３５１Ａ１、国際公開２００４／０８４９４０Ａ１及び国際公開２００４／００７５３８Ａ２に記載されている。組み換えウイルス様粒子の分解、コートタンパク質の精製及び核酸の存在下での該コートタンパク質の再集合化に基づく方法が、最も一般的に用いられる。ＲＮＡバクテリオファージの組み換えウイルス様粒子の産生のための効率的かつ拡張可能な方法は、国際公開２００５／１１７９６３Ａ１に開示されている。エンドトキシンを含まないインタクトなウイルス様粒子の大規模な精製のための方法は、国際公開２００７／０３９５５２Ａ１に開示されている。組み換えて産生したウイルス様粒子(「分解(disassembly)」)からのコートタンパク質の調製のための方法は、とりわけ、国際公開２００３／０２４４８１Ａ２において、そして、本出願の実施例の項目において開示されている。従来開示される核酸の存在下におけるコートタンパク質の集合体化(「再集合体化(reassembly)」)のための方法は、効率、拡張性及び集合体化した生成物の純度に関して最適化されない。特に、従来技術は、「再集合体化」方法の効率が特定の粒子の大きさを含有する凝集したオリゴヌクレオチドを用いることによって劇的に改善されうることを示すものではない(本明細書において、相対的なピークのスタート時間によって特徴付けられる、下記参照)。本出願は、非常に高い純度のパッケージ化生成物を生じる劇的に効率が改善されている「再集合体化」方法を提供する。典型的にそして好ましくは、本明細書中で開示される「再集合体化」方法はタンパク質収率及び少なくともおよそ７５％のオリゴヌクレオチド収率を含み、典型的にそして好ましくは少なくとも９９％の純度である生成物(オリゴヌクレオチドをパッケージ化したウイルス様粒子を含む組成物)が生じる。
本発明は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法に関する。前記方法の間、前記ウイルス様粒子は、オリゴヌクレオチドの存在下にて、前記ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質の自己集合体化(self assembly)によって形成される。驚くべきことに、コートタンパク質の自己集合体化が凝集されたオリゴヌクレオチド(aggregated oligonucleotide)の存在下にて行われる場合には、方法の効率が有意に改善されうることを、発見した。通常、少なくとも一つのポリＧ伸展(stretch)を含むオリゴヌクレオチドは凝集(aggregation)が可能である。オリゴヌクレオチドの集合状態は、前記ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドを標準物質として用いたサイズ排除ＨＰＬＣにおいて相対的なピークのスタート時間に特徴がある。５０〜１１０％、好ましくは８０〜９５％の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドが、最適であることを発見した。これは、前記ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドの見かけの分子量の範囲、又はわずかにそれより下である見かけの分子量を含むオリゴヌクレオチド集合体に一致する。所望の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドが、前記オリゴヌクレオチドを凝集方法にかけることによって得られうることを発見した。
ゆえに、本発明の第一の態様は、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、好ましくは該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含み、(a) 少なくとも一つのポリＧが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液ＩＩに準備する工程、このとき該溶液ＩＩは５〜８のｐＨを含み、そしてこのとき該溶液ＩＩは陽イオンを含み、好ましくは該溶液ＩＩ中の該陽イオンの濃度は少なくとも２０ｍＭであり、このとき該陽イオンは好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、(b) ５０〜９９℃である温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する工程、そして、(c) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする工程、そして、(d) ５０℃未満である温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整する工程を含み、好ましくはこれらの工程が所定の順序で行われる方法である。
オリゴヌクレオチド調製物が最適の粒子サイズと狭いサイズの分布を有する集合体を含む場合に、前記コートタンパク質の自己集合体化は最も効率が良い。さらに驚くべきことに、オリゴヌクレオチドを凝集(aggregate)工程の前に解離(disaggregate)工程を行うと、オリゴヌクレオチドの集合状態がより効率良く制御されうること、サイズ分布がより狭いオリゴヌクレオチド調製物が得られることを発見した。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
オリゴヌクレオチド調製物が最適の粒子サイズと狭いサイズの分布を有する集合体を含む場合に、前記コートタンパク質の自己集合体化は最も効率が良い。さらに驚くべきことに、オリゴヌクレオチドを凝集(aggregate)工程の前に解離(disaggregate)工程を行うと、オリゴヌクレオチドの集合状態がより効率良く制御されうること、サイズ分布がより狭いオリゴヌクレオチド調製物が得られることを発見した。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
ゆえに、本発明の第二の態様は、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、好ましくは該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含み、(a) 少なくとも一つのポリＧが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液Ｉに準備する工程、このとき該溶液Ｉはアルカリ性ｐＨを含み、(b) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、(i) ４〜７０℃である温度Ｉに溶液Ｉの温度を調節する、(ii) 該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を１１０％より上に含むまで、該温度Ｉにて該溶液Ｉ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(iii) ０〜７０℃である温度ＩＩに該溶液Ｉの温度を調整する、(c) ｐＨ５〜８に該溶液ＩのｐＨを調整する工程、そして、(d) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、(i) ｐＨ５〜８であり、好ましくは少なくとも２０ｍＭの濃度の陽イオンを含む溶液ＩＩに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき該陽イオンは好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、(ii) ５０〜９９℃である温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する、(iii) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(iv) ５０℃未満である温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整することを含み、好ましくはこれらの工程が所定の順序で行われる方法である。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
本発明の第三の態様は、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物であって、このとき該ヌクレオチド組成物は前記の方法のいずれかによって入手可能であり、好ましくは該オリゴヌクレオチドは５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含む。前記ヌクレオチド組成物は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
本発明の第四の態様は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) 本発明の第一及び第二の態様のいずれかの方法によって入手可能である、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を準備する工程、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含む方法である。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
本発明の第五の態様は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、(i) このとき該オリゴヌクレオチドにおいて少なくとも一つのポリＧが伸展しており、そして、(ii) このとき、該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含む方法である。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
本発明の第六の態様は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) 以下の工程を含む準備によって、オリゴヌクレオチドを準備する工程、このとき好ましくは該オリゴヌクレオチドは５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、(i) ｐＨ５〜８であり、好ましくは少なくとも２０ｍＭの濃度の陽イオンを含む溶液ＩＩにオリゴヌクレオチドを準備する、このとき好ましくは該陽イオンはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、(ii) ５０〜９９℃である温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する、(iii) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(iv) ５０℃未満である温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整し、このとき工程(i)から(iv)を好ましくは所定の順序で行い、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含む方法である。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
本発明の第七の態様は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、このとき好ましくは該オリゴヌクレオチドは５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、(i) 少なくとも一つのポリＧが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液Ｉに準備する工程、このとき該溶液Ｉはアルカリ性ｐＨを含み、(ii) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、(1) ４〜７０℃である温度Ｉに溶液Ｉの温度を調節する、(2) 該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を１１０％より上に含むまで、該温度Ｉにて該溶液Ｉ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(3) ０〜７０℃である温度ＩＩに該溶液Ｉの温度を調整する、(iii) ｐＨ５〜８に該溶液ＩのｐＨを調整する工程、そして、(iv) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、(1) ｐＨ５〜８であり、好ましくは少なくとも２０ｍＭの濃度の陽イオンを含む溶液ＩＩに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき好ましくは該陽イオンはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、(2) ５０〜９９℃である温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する、(3) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(4) ５０℃未満である温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整し、このとき工程(i)から(iv)を好ましくは所定の順序で行い、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含む方法である。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
本発明の第八の態様は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法における、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能なヌクレオチド組成物の使用である。
本発明の第九の態様は、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能な組成物であって、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなり、好ましくは該ＲＮＡバクテリオファージがＱβであり、さらに好ましくは該オリゴヌクレオチドが、Ｇ８−８(配列番号：６)又はＧ１０(配列番号：８)、好ましくはＧ１０(配列番号：８)であり、ここでさらに好ましくは該組成物の純度が少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．２％である組成物である。
特別に言及しない限り、以下に記載の定義及び実施態様は、本発明の特定の方法、組成物、ヌクレオチド組成物及び使用においていずれかの態様及び実施態様に当てはめることができる。特に定義しない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと、同じ意味を有する。
「オリゴヌクレオチド」：本明細書中で用いるオリゴヌクレオチドなる用語は一本鎖デオキシリボヌクレオチドを指す。以下に定められるように、好適なオリゴヌクレオチドは少なくとも一つのポリＧ(stretch)伸展を含む。より好適なオリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０の前記ポリＧ伸展を含む。非常に好適なオリゴヌクレオチドはちょうど２つのポリＧ伸展を含み、このとき好ましくは該２つのポリＧ伸展のうちの一つは該オリゴヌクレオチドの５'末端又は３'末端に位置する。さらにより好適なオリゴヌクレオチドはちょうど２つのポリＧ伸展を含み、このとき該２つのポリＧ伸展のうちの一つは該オリゴヌクレオチドの５'末端に位置し、該２つのポリＧ伸展のうちの一つは該オリゴヌクレオチドの３'末端に位置する。典型的にかつ好ましくは、本明細書中で用いるオリゴヌクレオチドは、６〜１０００、好ましくは１０〜１０００、より好ましくは１０〜２００、さらにより好ましくは１０〜１００、さらにより好ましくは２０〜４０、そして最も好ましくは３０のヌクレオチドからなる。さらに好適なオリゴヌクレオチドは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０のヌクレオチドからなる。さらにより好適なオリゴヌクレオチドは、２４〜３２のヌクレオチド、より好ましくはおよそ３０のヌクレオチドからなる。
また、オリゴヌクレオチドなる用語は、少なくとも一の修飾されたヌクレオチドを含む分子を指し、このとき該修飾されたヌクレオチドは(a)ヌクレオチドアナログ又は(b)骨格修飾を含むヌクレオチドから選択されるのが好ましい。一実施態様では、オリゴヌクレオチドは、(a)ペプチド核酸、(b)イノシン、(c)トリチル化塩基、(d)ホスホロチオエート、(e)アルキルホスホロチオエート、(f)５−ニトロインドールデオキシリボフラノシル、(g)５−メチルデオキシシトシン、及び(h)５,６−ジヒドロ−５,６−ジヒドロキシデオキシチミジンからなる群から選択される修飾ヌクレオチドの少なくとも一を含む。更なる実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ホスホチオエート化されたヌクレオチドを含むか、あるいはこれからなる。ホスホチオエート化されたヌクレオチドは細胞又は生物体内での分解を受けないので、好適なヌクレオチド修飾体である。さらに、典型的に天然で発見されるポリヌクレオチドの化学的、酵素的、又は代謝的に修飾された形態が好適である。しかしなから、好適なオリゴヌクレオチドはもっぱら修飾されていないヌクレオチド、すなわちアデノシン、チミジン、グアノシン及び／又はシチジンからなる。なお更なる好適なオリゴヌクレオチドはもっぱらホスホジエステル結合したヌクレオチドからなる。
非常に好適なオリゴヌクレオチドは、少なくとも１、好ましくは１、２、３、又は４のＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを有するメチル化されていないＣｐＧである。さらにより好適なオリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、このとき該パリンドローム配列が少なくとも１、好ましくは１、２、３又は４のＣｐＧモチーフを含むことが好ましい。さらにより好適なオリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、このとき該パリンドローム配列が配列GACGATCGTC(配列番号：１)を含む、好ましくは配列GACGATCGTC(配列番号：１)からなることが好ましい。さらにより好適なオリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、このとき該パリンドローム配列が５'末端でポリＧ伸展に隣接しており、該パリンドローム配列が３'末端でポリＧ伸展に隣接しており、このとき該パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号：１)であることが好ましい。非常に好適なオリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、このとき該パリンドローム配列が５'末端で少なくとも３〜１０、好ましくは４〜１０のグアノシン自体に隣接しており、該パリンドローム配列が３'末端で少なくとも３〜１０、好ましくは４〜１０のグアノシン自体に隣接しており、このとき該パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号：１)であることが好ましい。
「ポリＧ伸展(poly G stretch)」：ポリＧ伸展なる用語はオリゴヌクレオチドのセグメントを指し、このとき該セグメントは少なくとも３の連続するグアノシン残基からなる。好適なポリＧ伸展は、３〜２５、好ましくは４〜２０、より好ましくは４〜１５、そして最も好ましくは４〜１０の連続するグアノシン自体からなる。さらに好適なポリＧ伸展は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０の連続するグアノシン自体からなる。
「ＣｐＧモチーフ」：本明細書中で用いる「ＣｐＧモチーフ」なる用語は、短いＤＮＡ配列、好ましくは一本鎖のＤＮＡ配列であって、シトシン(Ｃ)−グアノシン(Ｇ)ジヌクレオチドを含むものを指し、このときＣはメチル化されておらず、該ＣＧジヌクレオチドがホスホジエステル結合であることが好ましい。好ましくは、ＣｐＧモチーフは少なくとも１、好ましくは１、２又は３の、付加的なヌクレオチド５'及び／又は３'の該ＣＧジヌクレオチドを含み、このとき該付加的なヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まないことがさらに好ましい。
「相対的なピークのスタート時間」：「相対的なピークのスタート時間」なる用語はオリゴヌクレオチドの集合状態を表すパラメーターである。オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間は分析的サイズ排除ＨＰＬＣによって測定され、このとき基本的に、好ましくは厳密に以下のパラメーターによって該ＨＰＬＣを実施する。
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ５０００ ＰＷＸＬ ７．８ｍｍ×３０．０ｃｍ (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤： ＰＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２)
注射体積： ４０．０μｌ(およそ２０μＭ〜およそ５００μＭの濃度を含むのが好ましい)
流速： ０．８ｍｌ／分
勾配： アイソクラチック
ランタイム： ２０分
波長： ２１５、２６０及び２８０ｎｍ、２６０ｎｍでのデータ評価
カラムオーブン温度： ２５℃
自動回収装置の温度： ８℃、
そして、前記ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドを標準物質として用いる。前記ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドと比較したときの前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間Ｘ％は以下の通りに算出される。Ｘ％＝オリゴヌクレオチドのピークのスタート時間[分]÷標準物質[分]の持続時間×１００％、このときオリゴヌクレオチドのピークのスタート時間はオリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になる時間として測定し、標準物質の持続時間は該標準物質の最大のピークが生じる時間として測定した。したがって、前記ＲＮＡバクテリオファージが例えばバクテリオファージＡＰ２０５である実施態様では、ＡＰ２０５のキャプシドを前記ＨＰＬＣの標準物質として用い、前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間は該ＡＰ２０５標準物質と比較して算出される。重要なことには、ＲＮＡバクテリオファージでない実施態様では、相対的なピークのスタート時間は、バクテリオファージＱβのキャプシドを標準物質として用いて常に決定される。さらに、前記ＨＰＬＣの適切な標準物質の選択に関していくらか不確定である場合には、バクテリオファージＱβのキャプシドが標準物質として用いられ、相対的なピークのスタート時間は該バクテリオファージＱβのキャプシドと比較して決定される。ゆえに、非常に好適な実施態様では、前記相対的なピークのスタート時間は前記ＨＰＬＣによって測定され、このとき該標準物質はバクテリオファージＱβのキャプシドであることが好ましく、該相対的なピークのスタート時間は該バクテリオファージＱβのキャプシドと比較して決定されることがさらに好ましい。
「ＣｐＧモチーフ」：本明細書中で用いる「ＣｐＧモチーフ」なる用語は、短いＤＮＡ配列、好ましくは一本鎖のＤＮＡ配列であって、シトシン(Ｃ)−グアノシン(Ｇ)ジヌクレオチドを含むものを指し、このときＣはメチル化されておらず、該ＣＧジヌクレオチドがホスホジエステル結合であることが好ましい。好ましくは、ＣｐＧモチーフは少なくとも１、好ましくは１、２又は３の、付加的なヌクレオチド５'及び／又は３'の該ＣＧジヌクレオチドを含み、このとき該付加的なヌクレオチドはＣＧジヌクレオチドを含まないことがさらに好ましい。
「相対的なピークのスタート時間」：「相対的なピークのスタート時間」なる用語はオリゴヌクレオチドの集合状態を表すパラメーターである。オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間は分析的サイズ排除ＨＰＬＣによって測定され、このとき基本的に、好ましくは厳密に以下のパラメーターによって該ＨＰＬＣを実施する。
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ５０００ ＰＷＸＬ ７．８ｍｍ×３０．０ｃｍ (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤： ＰＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２)
注射体積： ４０．０μｌ(およそ２０μＭ〜およそ５００μＭの濃度を含むのが好ましい)
流速： ０．８ｍｌ／分
勾配： アイソクラチック
ランタイム： ２０分
波長： ２１５、２６０及び２８０ｎｍ、２６０ｎｍでのデータ評価
カラムオーブン温度： ２５℃
自動回収装置の温度： ８℃、
そして、前記ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドを標準物質として用いる。前記ＲＮＡバクテリオファージのキャプシドと比較したときの前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間Ｘ％は以下の通りに算出される。Ｘ％＝オリゴヌクレオチドのピークのスタート時間[分]÷標準物質[分]の持続時間×１００％、このときオリゴヌクレオチドのピークのスタート時間はオリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になる時間として測定し、標準物質の持続時間は該標準物質の最大のピークが生じる時間として測定した。したがって、前記ＲＮＡバクテリオファージが例えばバクテリオファージＡＰ２０５である実施態様では、ＡＰ２０５のキャプシドを前記ＨＰＬＣの標準物質として用い、前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間は該ＡＰ２０５標準物質と比較して算出される。重要なことには、ＲＮＡバクテリオファージでない実施態様では、相対的なピークのスタート時間は、バクテリオファージＱβのキャプシドを標準物質として用いて常に決定される。さらに、前記ＨＰＬＣの適切な標準物質の選択に関していくらか不確定である場合には、バクテリオファージＱβのキャプシドが標準物質として用いられ、相対的なピークのスタート時間は該バクテリオファージＱβのキャプシドと比較して決定される。ゆえに、非常に好適な実施態様では、前記相対的なピークのスタート時間は前記ＨＰＬＣによって測定され、このとき該標準物質はバクテリオファージＱβのキャプシドであることが好ましく、該相対的なピークのスタート時間は該バクテリオファージＱβのキャプシドと比較して決定されることがさらに好ましい。
「パッケージ化(packaged)」：本明細書中で用いる「パッケージ化」なる用語は、ウイルス様粒子との関係において、オリゴヌクレオチドの状態を指す。「ＶＬＰにパッケージ化されるオリゴヌクレオチド」又は「オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＶＬＰ」なる用語は同様に用いられる。本明細書中で用いる「パッケージ化」なる用語は、非共有結合、好ましくはイオン性相互作用、疎水性相互作用、水素結合を指す。非常に好ましくは、本明細書中で用いる「パッケージ化」なる用語は、ＶＬＰ内への前記オリゴヌクレオチドの封入、又は部分的な封入を指す。例えば、オリゴヌクレオチド、好ましくは５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドは、共有的でも非共有的でもなく実際に結合することなく、又は非共有的な結合によって、ＶＬＰに封入されうる。典型的にかつ好ましくは、オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＶＬＰは、該オリゴヌクレオチドを分解から、好ましくはＤＮアーゼ加水分解から保護する。したがって、好適な意味では、「パッケージ化」なる用語は、パッケージ化された状態のオリゴヌクレオチドがＤＮアーゼ加水分解にアクセスできないことを示す。より好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、オリゴヌクレオチドがＤＮアーゼ加水分解にアクセスできないことを示し、このときＤＮアーゼはＤＮアーゼＩ又はベンゾナーゼであることがさらに好ましい。さらにより好ましくは、「パッケージ化」なる用語は、オリゴヌクレオチドがベンゾナーゼ加水分解にアクセスできないことを示す。
ＤＮアーゼ(例えばＤＮアーゼＩ又はベンゾナーゼ)へのオリゴヌクレオチドのアクセス容易性は、国際公開２００３／０２４４８１Ａ２の実施例１１〜１７(ｐ．１１１を参照)に記載されるようにアッセイされるのが好ましい。好適な意味では、ベンゾナーゼで処理した後(２ｍＭ ＭｇＣｌ２, ｐＨ７.２を含むバッファ中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇコートタンパク質、２０〜２５℃、１８時間)にオリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％がＶＬＰから回収される場合(例えばエチジウムブロマイド染色ゲルにおいて)に、該ＶＬＰは該オリゴヌクレオチドをパッケージ化しているとみなされる。このようなアッセイは適切なコントロールが必要であり、ＶＬＰ及びオリゴヌクレオチドの特定の組合せに応用することが必要であることは当業者に明らかである。好適な意味では、ベンゾナーゼで処理した後(２ｍＭ ＭｇＣｌ２, ｐＨ７.２を含むバッファ中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇコートタンパク質、２０〜２５℃、１８時間)にオリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％がＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰから回収される場合に、該オリゴヌクレオチドは該ＶＬＰにパッケージ化されているとみなされる。非常に好適な意味では、ベンゾナーゼで処理した後(２ｍＭ ＭｇＣｌ２, ｐＨ７.２を含むバッファ中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇコートタンパク質、２０〜２５℃、１８時間)にＧ１０の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％がＶＬＰから回収される場合に、オリゴヌクレオチドＧ１０(配列番号：８)はＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰにパッケージ化されているとみなされる。より具体的な意味では、ベンゾナーゼで処理した後(２ｍＭ ＭｇＣｌ２, ｐＨ７.２を含むバッファ中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇコートタンパク質、２０〜２５℃、１８時間)にＧ１０の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％がＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰから回収される場合に、オリゴヌクレオチドＧ１０(配列番号：８)はＲＮＡバクテリオファージＱβ、ＡＰ２０５、ＧＡ又はｆｒのＶＬＰにパッケージ化されているとみなされる。非常に具体的な意味では、ベンゾナーゼで処理した後(２ｍＭ ＭｇＣｌ２, ｐＨ７.２を含むバッファ中の１９０Ｕベンゾナーゼ／ｍｇコートタンパク質、２０〜２５℃、１８時間)にメチル化されていないＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９８％がＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰから回収される場合に、オリゴヌクレオチドＧ１０(配列番号：８)はＲＮＡバクテリオファージＱβのＶＬＰにパッケージ化されているとみなされる。
「コートタンパク質」：本明細書中で用いる「コートタンパク質」なる用語は、バクテリオファージ又はＲＮＡバクテリオファージのキャプシド集合体内に取り込むことができる、ＲＮＡバクテリオファージのタンパク質(一又は複数)を指す。ゆえに、コートタンパク質なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのキャプシド又はＲＮＡバクテリオファージのＶＬＰを形成しているタンパク質を指す。典型的にかつ好ましくは、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質は二量体構造を有する。本明細書中で用いられる、組み換えコートタンパク質の特定の断片において「(組み換え)コートタンパク質の断片」は、野生型コートタンパク質又は野生型組み換えタンパク質のそれぞれの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の長さであり、好ましくはＶＬＰを形成する能力を保持するポリペプチドとして定義される。好ましくは、断片は、少なくとも一つの内部欠損、少なくとも一つの切断又はこれらの少なくとも一つの組合せによって得られる。さらに「組み換えコートタンパク質の断片」又は「コートタンパク質の断片」なる用語は、それぞれ野生型コートタンパク質と少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸配列同一性を有し、ウイルス様粒子に集合体化することができることが好ましいポリペプチドを包含する。「変異コートタンパク質」なる用語は、野生型組み換えタンパク質又はコートタンパク質のそれぞれから得られるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、このとき該アミノ酸配列は野生型配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％の同一性であって、好ましくはＶＬＰに集まる能力を保持する。
本明細書中で用いる「ウイルス様粒子(ＶＬＰ)」なる用語は、非複製性の又は非感染性の、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子を指すか、又は非複製性の又は非感染性の、好ましくは非複製性かつ非感染性のウイルス粒子、好ましくはウイルスのキャプシドに似た構造を指す。本明細書中で用いる「非複製性」なる用語はＶＬＰに包含されるゲノムを複製することができないことを指す。本明細書中で用いる「非感染性」なる用語は宿主細胞に侵入することができないことを指す。好ましくは、本発明に係るウイルス様粒子は、ウイルスゲノムないしはゲノム機能のすべてないし一部を欠いているので、非複製性及び／又は非感染性である。一実施態様では、ウイルス様粒子はウイルス粒子であり、このウイルスゲノムは分解と再集合によって、又はＶＬＰへの精製されたタンパク質の集合によって、物理的又は化学的に不活性化され、取り除かれている。典型的かつより好ましくは、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムの複製及び感染の構成成分のすべてないし一部を欠いている。本発明に係るウイルス様粒子はそれらのゲノムとは異なる核酸を含有してもよい。本発明に係るウイルス様粒子の典型的かつ好適な実施態様は、対応するウイルス、バクテリオファージ、好ましくはＲＮＡバクテリオファージのウイルスキャプシドなどのウイルスキャプシドである。「キャプシド」なる用語は、ウイルスタンパク質サブユニットからなる高分子集合に関する。一般的に、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０及び３６０以上のウイルスタンパク質サブユニットがある。典型的かつ好ましくは、これらサブユニットの相互作用により、固有の反復編成である構造を有するウイルスキャプシドが形成され、この構造は典型的かつ好ましくは球状である。例えば、ＲＮＡバクテリオファージのキャプシド、正二十面体対称の球状形状を有する。
「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」：本明細書中で用いる「ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子」なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質、その変異体ないしは断片を含んでなる、好ましくは基本的にこれからなる、あるいはこれからなるウイルス様粒子を指す。さらに、ＲＮＡバクテリオファージの構造に類似するＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子は非複製性及び／又は非感染性であり、ＲＮＡバクテリオファージの複製機構をコードする少なくとも一の遺伝子又は複数の遺伝子を欠損しており、及び典型的には、宿主にウイルスが接着するか侵入するためのタンパク質又はそれに関与するタンパク質をコードする一又は複数の遺伝子を欠損する。ＲＮＡバクテリオファージ由来の好適なＶＬＰは、正二十面体の対称性を表し、１８０のサブユニットからなる。本発明では、ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子なる用語は、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えコートタンパク質、又はその断片ないしは変異体の自己集合体化によって得られる高分子構造を指すことが好ましく、このときこの自己集合体化はオリゴヌクレオチドの存在下で起こるのが好ましい。
「コートタンパク質の自己集合体化(self assembly)を予防することが可能な薬剤」：コートタンパク質の自己集合体化を予防することが可能な薬剤は、前記混合物中のウイルス様粒子の自然形成を予防する薬剤である。当業者は、例えば実施例９に開示したように、サイズ排除クロマトグラフィによって前記混合物を分析することによって、実験的に前記薬剤の化学的性質及び適切な濃度を決定することができる。前記混合物を室温、好ましくは２２℃で少なくとも１時間インキュベートした後に、実施例９に開示したサイズ排除クロマトグラフィによって非ウイルス様粒子が検出可能である場合に、薬剤はコートタンパク質の自己集合体化を予防することができる。しかしながら、コートタンパク質の自己集合体化を予防することが可能な薬剤は該コートタンパク質を不可逆的に修飾せず、前記混合物から該薬剤を除去するとウイルス様粒子が自然に形成される。コートタンパク質の自己集合体化を予防することができる好適な薬剤は、界面活性剤、グアニジウムハイドロクロライド及び尿素、最も好ましくは尿素を含む。好適な界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、トリトンＸ１００などである。典型的にかつ好ましくは、、コートタンパク質の自己集合体化を予防することが可能な薬剤は、還元された状態の前記コートタンパク質のシステイン残基によって形成される分子間ジスルフィド結合を保つ還元剤を更に含む。
「タンパク質収率」：本発明の方法のタンパク質収率は、前記混合物に含まれるコートタンパク質の量と比較したときの、該方法の最終工程後にウイルス様粒子として回収されるコートタンパク質の量として決定され、このとき好ましくは、該コートタンパク質の量はブラッドフォードタンパク質アッセイによって決定される。典型的にかつ好ましくは、前記混合物に含有されるコートタンパク質の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％は、前記方法の最終工程の後にウイルス様粒子として回収されるものであり、該最終工程は前記滅菌濾過であることが好ましい。
「オリゴヌクレオチド収率」：本発明の方法のオリゴヌクレオチド収率は、前記混合物に含まれるオリゴヌクレオチドの量と比較したときの、該方法の最終工程後にウイルス様粒子から回収されうるオリゴヌクレオチドの量として決定され、このとき好ましくは、ウイルス様粒子から回収されるオリゴヌクレオチドの量は基本的に又は好ましくは厳密に実施例９に開示したように決定される。典型的にかつ好ましくは、前記混合物に含有されるオリゴヌクレオチドの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％は、前記方法の最終工程の後にウイルス様粒子から回収されるものであり、該最終工程は前記滅菌濾過であることが好ましい。
「オリゴヌクレオチド収率」：本発明の方法のオリゴヌクレオチド収率は、前記混合物に含まれるオリゴヌクレオチドの量と比較したときの、該方法の最終工程後にウイルス様粒子から回収されうるオリゴヌクレオチドの量として決定され、このとき好ましくは、ウイルス様粒子から回収されるオリゴヌクレオチドの量は基本的に又は好ましくは厳密に実施例９に開示したように決定される。典型的にかつ好ましくは、前記混合物に含有されるオリゴヌクレオチドの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％は、前記方法の最終工程の後にウイルス様粒子から回収されるものであり、該最終工程は前記滅菌濾過であることが好ましい。
「純度」：(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる本発明の組成物の純度は、分析的サイズ排除ＨＰＬＣによって測定され、該ＨＰＬＣは基本的に、好ましくは厳密に実施例４に開示される条件下で行われる。前記組成物の純度は、同じクロマトグラムの総ピーク領域と比較したときの、該組成物に含まれる前記ウイルス様粒子のピーク領域の割合として決定される。典型的にかつ好ましくは、本発明の組成物の純度は、少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％である。
「ｏｎｅ」、「ａ／ａｎ」：「ｏｎｅ」、「ａ」又は「ａｎ」なる用語を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
「およそ」：本出願の意味の範囲内でおよそなる表現は±１０％の意味を有するであろう。例えば、およそ１００は９０〜１１０を意味する。
「ｏｎｅ」、「ａ／ａｎ」：「ｏｎｅ」、「ａ」又は「ａｎ」なる用語を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
「およそ」：本出願の意味の範囲内でおよそなる表現は±１０％の意味を有するであろう。例えば、およそ１００は９０〜１１０を意味する。
本発明は、凝集したオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を生成するための方法を提供する。更に詳細には、本発明は、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、好ましくは該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含み、(a) オリゴヌクレオチドを溶液ＩＩに準備する工程、このとき該オリゴヌクレオチドはその５'末端に少なくとも３のグアノシン自体を、その３'末端に少なくとも３のグアノシン自体を含むことが好ましく、そして該溶液ＩＩは５〜８のｐＨを含み、そして該溶液ＩＩは陽イオンを含み、好ましくは該溶液ＩＩ中の該陽イオンの濃度は少なくとも２０ｍＭであり、このとき該陽イオンは好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、(b) ５０〜９９℃である温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する工程、そして、(c) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする工程、そして、(d) ５０℃未満である温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整する工程を含み、好ましくはこれらの工程が所定の順序で行われる方法を提供する。以下に記載のすべての実施態様はいずれかの組み合わせで本方法に応用可能である。
上記したように、前記オリゴヌクレオチドに前記凝集工程の前に解離工程を行うことに利点があることを発見した。このとき該オリゴヌクレオチドは完全に解離されていることが好ましい。オリゴヌクレオチドの完全な解離とは、好ましくは基本的に実施例４に記載のように行われるサイズ排除ＨＰＬＣにおけるオリゴヌクレオチドの見かけの分子量が、該オリゴヌクレオチドの配列から得られる分子量に相当することを意味する。ゆえに、本発明はさらに、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、好ましくは該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含み、(a) 少なくとも一つのポリＧが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液Ｉに準備する工程、このとき該溶液Ｉはアルカリ性ｐＨを含み、(b) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、(i) ４〜７０℃である温度Ｉに溶液Ｉの温度を調節する、(ii) 該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を１１０％より上に含むまで、該温度Ｉにて該溶液Ｉ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(iii) ０〜７０℃である温度ＩＩに該溶液Ｉの温度を調整する、(c) ｐＨ５〜８に該溶液ＩのｐＨを調整する工程、そして、(d) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、(i) ｐＨ５〜８であり、好ましくは少なくとも２０ｍＭの濃度の陽イオンを含む溶液ＩＩに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき該陽イオンは好ましくはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、(ii) ５０〜９９℃である温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する、(iii) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、(iv) ５０℃未満である温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整することを含み、好ましくはこれらの工程が所定の順序で行われる方法を提供する。
部分的に凝集したオリゴヌクレオチドを含みうる未処置のオリゴヌクレオチドの解離はアルカリ性ｐＨで起こる。解離工程は温度を上げることによって促されうる。
部分的に凝集したオリゴヌクレオチドを含みうる未処置のオリゴヌクレオチドの解離はアルカリ性ｐＨで起こる。解離工程は温度を上げることによって促されうる。
ゆえに、一実施態様では、溶液Ｉは、８〜１３、好ましくは１０〜１３、最も好ましくは１２のｐＨを含む。溶液Ｉが任意のバッファ又は薬剤を含んでもよく、又は、８と１３の間のｐＨを調整することができる当分野で公知のバッファ又は薬剤を含む。好適な実施態様では、溶液Ｉは、水酸化物、好ましくは水酸化金属、最も好ましくはアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物、好ましくはアルカリ金属の水酸化物を含む。好適な実施態様では、前記水酸化物は、水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム、最も好ましくは水酸化ナトリウムである。一実施態様では、前記溶液Ｉ中の前記水酸化ナトリウム、好ましくは前記水酸化物の濃度は、１０ｍＭ〜２００ｍＭ、より好ましくはおよそ２５ｍＭ、最も好ましくは２５ｍＭである。
オリゴヌクレオチドの分解を避けるために、温度Ｉは９０℃を超えないことが好ましく、温度Ｉが７０℃を超えない。一実施態様では、温度Ｉは室温、好ましくは１９〜２５℃である。他の実施態様では、温度Ｉは４〜７０℃、好ましくは２０〜７０℃、より好ましくは４５〜７０℃、好ましくはおよそ５０℃、そして最も好ましくは５０℃である。好適な実施態様では、前記温度Ｉでの前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、前記オリゴヌクレオチドが十分に分解されるまで行う。他の実施態様では、前記温度Ｉでの前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間が１１０％を超える、好ましくは１３０％を超える、最も好ましくは１３５％を超えるまで行う。更なる実施態様では、前記温度Ｉでの前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、３０〜１９０分間、好ましくは５０〜９０分間、最も好ましくは７０分間行う。
更なる好適な実施態様では、前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドの濃度は、５０μＭ〜２ｍＭ、好ましくは５０〜５００μＭ、より好ましくは２００〜３００μＭ、最も好ましくは２６０μＭである。
オリゴヌクレオチドの分解を避けるために、温度Ｉは９０℃を超えないことが好ましく、温度Ｉが７０℃を超えない。一実施態様では、温度Ｉは室温、好ましくは１９〜２５℃である。他の実施態様では、温度Ｉは４〜７０℃、好ましくは２０〜７０℃、より好ましくは４５〜７０℃、好ましくはおよそ５０℃、そして最も好ましくは５０℃である。好適な実施態様では、前記温度Ｉでの前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、前記オリゴヌクレオチドが十分に分解されるまで行う。他の実施態様では、前記温度Ｉでの前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間が１１０％を超える、好ましくは１３０％を超える、最も好ましくは１３５％を超えるまで行う。更なる実施態様では、前記温度Ｉでの前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、３０〜１９０分間、好ましくは５０〜９０分間、最も好ましくは７０分間行う。
更なる好適な実施態様では、前記溶液Ｉ中での前記オリゴヌクレオチドの濃度は、５０μＭ〜２ｍＭ、好ましくは５０〜５００μＭ、より好ましくは２００〜３００μＭ、最も好ましくは２６０μＭである。
オリゴヌクレオチドの解離は、溶液Ｉを中和するか又は酸性化し及び／又は温度を下げることによって止めることができる。ゆえに、前記方法は、前記溶液ＩのｐＨをｐＨ８以下、好ましくはｐＨ５〜８に調整する工程を更に含む。好適な実施態様では、前記のｐＨの調整は、前記ｐＨが６〜７となるまで、最も好ましくは前記ｐＨがおよそ６になるまで行う。更なる好適な実施態様では、前記溶液ＩのｐＨの調製は、溶液Ｉに酸を加えることによって行う。このために当分野で公知のいずれかの鉱酸又は有機酸を用いてもよい。好適な実施態様では、前記酸は、リン酸、塩酸、及び有機酸からなる群から選択され、前記有機酸が蟻酸、酢酸及びクエン酸から選択されるのが好ましい。好適な実施態様では、前記酸は鉱酸である。好ましくは、前記酸はリン酸又は塩酸、最も好ましくはリン酸である。
前記工程はさらに、前記溶液Ｉの温度を温度ＩＩに調整することを含み、前記温度ＩＩが０〜７０℃であることが好ましく、前記温度ＩＩが温度Ｉよりも低いことが好ましい。好適な実施態様では、前記温度ＩＩが０〜２５℃、好ましくは０〜１０℃、最も好ましくは０〜２℃である。
前記工程はさらに、前記溶液Ｉの温度を温度ＩＩに調整することを含み、前記温度ＩＩが０〜７０℃であることが好ましく、前記温度ＩＩが温度Ｉよりも低いことが好ましい。好適な実施態様では、前記温度ＩＩが０〜２５℃、好ましくは０〜１０℃、最も好ましくは０〜２℃である。
方法はさらに、前記オリゴヌクレオチドを凝集する工程を含む。オリゴヌクレオチドの凝集は、Ｇ-四重鎖ＤＮＡ構造を促すことができる陽イオン(Simonsson T., Biol. Chem. 382:621-628を参照)を含む溶液中でおよそ中性のｐＨで、そして５０℃を超える温度で前記オリゴヌクレオチドをインキュベートすることによって達成される。したがって、一実施態様では、前記陽イオンは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択される。好適な実施態様では、前記陽イオンはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択され、より好ましくは前記陽イオンはＮａ＋又はＫ＋であり、最も好ましくは前記陽イオンはＮａ＋である。非常に好適な実施態様では濃度である。
好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドを含む溶液ＩＩは、前記溶液Ｉに前記陽イオンを加えることによって得られ、該添加は溶液ＩのｐＨの調整後に行うことが好ましい。
更なる実施態様では、前記溶液ＩＩは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、及びＭｇ２＋からなる群から選択されるいずれかの陽イオンの混合である。更なる実施態様では、前記溶液ＩＩは、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるいずれかの陽イオンの混合である。非常に好適な実施態様では、前記混合物はＮａ＋及びＫ＋を含むか、又は好ましくはこれらからなる。
好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドを含む溶液ＩＩは、前記溶液Ｉに前記陽イオンを加えることによって得られ、該添加は溶液ＩのｐＨの調整後に行うことが好ましい。
更なる実施態様では、前記溶液ＩＩは、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、ＮＨ４ ＋、Ｃｓ＋、Ｌｉ＋、Ｓｒ２＋、Ｂａ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、及びＭｇ２＋からなる群から選択されるいずれかの陽イオンの混合である。更なる実施態様では、前記溶液ＩＩは、Ｎａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるいずれかの陽イオンの混合である。非常に好適な実施態様では、前記混合物はＮａ＋及びＫ＋を含むか、又は好ましくはこれらからなる。
好適な実施態様では、前記溶液ＩＩは、少なくとも２０ｍＭ、好ましくは少なくとも１００ｍＭ、より好ましくは、２００〜２７５ｍＭ及び最も好ましくは２５０ｍＭの前記陽イオン、又は陽イオンの前記混合物を含む。非常に好適な実施態様では、前記溶液ＩＩは、２５０ｍＭのＮａ＋及びＫ＋、最も好ましくは２５０ｍＭのＮａ＋を含む。なお更なる好適な実施態様では、前記溶液ＩＩは、２５０ｍＭの塩化ナトリウム又は塩化カリウム、最も好ましくは２５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。しかしながら、この目的のために当分野で公知のいずれかのナトリウム、カリウム、アンモニウム、リチウム、カルシウム又はマグネシウム塩が使われてもよい。
更なる実施態様では、前記溶液ＩＩ中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は、５０μＭ〜２ｍＭ、好ましくは１００〜３００μＭ、最も好ましくは１７５μＭである。
更なる実施態様では、前記方法はさらに、溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整することを含み、このとき前記温度ＩＩＩは５０〜９９℃、好ましくは８０〜９０℃、より好ましくはおよそ８５℃、最も好ましくは８５℃である。
更なる実施態様では、前記溶液ＩＩ中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は、５０μＭ〜２ｍＭ、好ましくは１００〜３００μＭ、最も好ましくは１７５μＭである。
更なる実施態様では、前記方法はさらに、溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整することを含み、このとき前記温度ＩＩＩは５０〜９９℃、好ましくは８０〜９０℃、より好ましくはおよそ８５℃、最も好ましくは８５℃である。
更なる実施態様では、前記方法は、溶液ＩＩ中の前記オリゴヌクレオチドを温度ＩＩＩにてインキュベートすることを含み、このとき前記オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％、好ましくは８０〜９５％、より好ましくは８０〜９０％、さらにより好ましくは８３〜９０％、さらにより好ましくは８５〜９０％、最も好ましくは８８％の相対的なピークのスタート時間を含むまで該インキュベートを行う。非常に好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドはＧ１０(配列番号：８)であり、前記オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％、好ましくは８０〜９５％、より好ましくは８０〜９０％、さらにより好ましくは８３〜９０％、さらにより好ましくは８５〜９０％、最も好ましくは８８％の相対的なピークのスタート時間を含むまで、前記インキュベートを行う。
所望の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドを得るために必要なインキュベート時間は、配列とオリゴヌクレオチドの純度に依存し、典型的かつ好ましくはおよそ５分からおよそ３０分までの範囲である。好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドはＧ１０(配列番号：８)であり、前記温度ＩＩＩでの溶液ＩＩ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは９〜２４分間行う。
凝集過程は溶液ＩＩを５０℃より下に冷却することによって停止させる。好適な実施態様では、前記過程は溶液ＩＩの温度を温度ＩＶに調整することを含み、該温度ＩＶは５０℃未満であり、該温度ＩＶは０〜２５℃、より好ましく、０〜１０℃、最も好ましくは０〜２℃であることが好ましい。
所望の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドを得るために必要なインキュベート時間は、配列とオリゴヌクレオチドの純度に依存し、典型的かつ好ましくはおよそ５分からおよそ３０分までの範囲である。好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドはＧ１０(配列番号：８)であり、前記温度ＩＩＩでの溶液ＩＩ中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは９〜２４分間行う。
凝集過程は溶液ＩＩを５０℃より下に冷却することによって停止させる。好適な実施態様では、前記過程は溶液ＩＩの温度を温度ＩＶに調整することを含み、該温度ＩＶは５０℃未満であり、該温度ＩＶは０〜２５℃、より好ましく、０〜１０℃、最も好ましくは０〜２℃であることが好ましい。
本発明の方法に適用する加熱及び／又は冷却の速度は、入手した凝集したオリゴヌクレオチドの収率及び粒子サイズの分布に影響を及ぼすことを発見した。特に、この工程のバッチ体積のスケールを上げる方法において、収率及び粒子サイズの分布は少なくとも３．６℃／分の温度勾配(すなわち加熱又は冷却速度)を用いてさらに改善されうることを発見した。当業者は、反応容器の反応体積、形状及び熱伝導率と選択する温度の違いに関する反応条件を正規化することによって定められた温度勾配が達成されうる。好適な実施態様では、前記の溶液Ｉの温度を温度Ｉに調整すること、前記の溶液Ｉの温度を温度ＩＩに調整すること、前記の溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整すること、及び／又は前記の溶液ＩＩの温度を温度ＩＶに調節することは、最低３．６℃／分の温度勾配によって実行される。更なる好適な実施態様では、前記の溶液ＩＩの温度を温度ＩＩＩに調整することは、最低３．６℃／分の温度勾配によって行い、該温度勾配はおよそ７℃／分であることが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記の溶液ＩＩの温度を温度ＩＶに調節することは、最低３．６℃／分の温度勾配によって行い、該温度勾配はおよそ７℃／分であることが好ましい。
集合体を形成することができるように、前記オリゴヌクレオチドは少なくとも１、好ましくは２のポリＧ伸展を含む。好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、その５'末端に少なくとも３、好ましくは少なくとも４のグアノシン自体を、そして、その３'末端に少なくとも３、好ましくは少なくとも４のグアノシン自体を含む。更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、その５'末端に少なくとも４のグアノシン自体を、そして、その３'末端に少なくとも４のグアノシン自体を含む。好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、その５'末端に少なくとも３で最大２０、好ましくは最大１５のグアノシン自体を、そして、その３'末端に少なくとも３で最大２０、好ましくは最大１５のグアノシン自体を含む。更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、その５'末端に少なくとも３、好ましくは少なくとも４、最大１１のグアノシン自体を、そして、その３'末端に少なくとも３、好ましくは少なくとも４、最大１０のグアノシン自体を含む。更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを含むメチル化されていないＣｐＧであり、該オリゴヌクレオチドを含むメチル化されていないＣｐＧは２つのポリＧ伸展を含むことが好ましく、このポリＧ伸展のそれぞれは少なくとも４のグアノシン自体からなることが好ましく、さらに該オリゴヌクレオチドを含むメチル化されていないＣｐＧはパリンドローム配列を含むことが好ましい、このパリンドローム配列は前記ポリＧ伸展の間に位置する。更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、その５'末端に少なくとも３、好ましくは少なくとも４のグアノシン自体を、そして、その３'末端に少なくとも３、好ましくは少なくとも４のグアノシン自体を含み、さらに該オリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、該パリンドローム配列はGACGATCGTC(配列番号：１)であることが好ましい。
更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドはパリンドローム配列を含み、該パリンドローム配列はGACGATCGTC(配列番号：１)であることが好ましく、該パリンドローム配列は少なくとも３、好ましくは少なくとも４、多くても１５のグアノシン自体がその５’末端で隣接しており、該パリンドローム配列は少なくとも３、好ましくは少なくとも４、多くても１５のグアノシン自体がその３’末端で隣接している。
更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、１０〜１０００のヌクレオチド、好ましくは１０〜２００のヌクレオチド、より好ましくは１０〜１００のヌクレオチド、さらにより好ましくは２０〜４０のヌクレオチド、最も好ましくは３０のヌクレオチドを含む。
非常に好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、(a) 「Ｇ４−４」GGGGGACGAT CGTCGGGG(配列番号：２)；(b) 「Ｇ５−５」GGGGGGACGA TCGTCGGGGG(配列番号：３)；(c) 「Ｇ６−６」GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(配列番号：４)；(d) 「Ｇ７−７」GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(配列番号：５)；(e) 「Ｇ８−８」GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(配列番号：６)；(f) 「Ｇ９−９」GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(配列番号：７)；(g) 「Ｇ１０」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(配列番号：８)；(h) 「Ｇ11」GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG(配列番号：９)からなる群から選択される核酸配列を含むか、又は好ましくはこれらからなり、該オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。さらにより好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号：８)を含むか、又は好ましくはこれからなり、このとき該オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。
更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、１０〜１０００のヌクレオチド、好ましくは１０〜２００のヌクレオチド、より好ましくは１０〜１００のヌクレオチド、さらにより好ましくは２０〜４０のヌクレオチド、最も好ましくは３０のヌクレオチドを含む。
非常に好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、(a) 「Ｇ４−４」GGGGGACGAT CGTCGGGG(配列番号：２)；(b) 「Ｇ５−５」GGGGGGACGA TCGTCGGGGG(配列番号：３)；(c) 「Ｇ６−６」GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(配列番号：４)；(d) 「Ｇ７−７」GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(配列番号：５)；(e) 「Ｇ８−８」GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(配列番号：６)；(f) 「Ｇ９−９」GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(配列番号：７)；(g) 「Ｇ１０」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(配列番号：８)；(h) 「Ｇ11」GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG(配列番号：９)からなる群から選択される核酸配列を含むか、又は好ましくはこれらからなり、該オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。さらにより好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号：８)を含むか、又は好ましくはこれからなり、このとき該オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。
さらに、本発明はオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物に関し、該ヌクレオチド組成物は、上記のいずれか一の方法、上記いずれか一の実施態様を行うこと、の単独ないしはいずれかの組み合わせによって得ることができる。特に、本発明はオリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物に関し、該ヌクレオチド組成物は上記の方法のいずれかによって入手可能であり、該オリゴヌクレオチドは５０〜１１０％、好ましくは８０〜９５％、より好ましくは８０〜９０％、さらにより好ましくは８３〜９０％、さらにより好ましくは８５〜９０％、最も好ましくは８８％の相対的なピークのスタート時間を含むことが好ましい。好適な実施態様では、前記ヌクレオチド組成物はオリゴヌクレオチドを含み、該オリゴヌクレオチドは、(a) 「Ｇ４-4」GGGGGACGAT CGTCGGGG(配列番号：２)；(b) 「Ｇ５−５」GGGGGGACGA TCGTCGGGGG(配列番号：３)；(c) 「Ｇ６−６」GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(配列番号：４)；(d) 「Ｇ７−７」GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(配列番号：５)；(e) 「Ｇ８−８」GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(配列番号：６)；(f) 「Ｇ9-９」GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(配列番号：７)；(g) 「Ｇ１０」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(配列番号：８)；(h) 「Ｇ11」GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG(配列番号：９)からなる群から選択される核酸配列を含むか、又は好ましくはこれからなり、該オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。さらにより好適な実施態様では、前記ヌクレオチド組成物はオリゴヌクレオチドを含み、このとき該オリゴヌクレオチドは核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号：８)を含むか、又は好ましくはこれからなり、このとき該オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記ヌクレオチド組成物はオリゴヌクレオチドを含み、このとき該オリゴヌクレオチドは核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号：８)からなり、このとき該オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になり、前記オリゴヌクレオチドは５０〜１１０％、好ましくは８０〜９５％、より好ましくは８０〜９０％、さらにより好ましくは８３〜９０％、さらにより好ましくは８５〜９０％、最も好ましくは８８％の相対的なピークのスタート時間を含む。
前述のように、本発明のヌクレオチド組成物に含まれる凝集したオリゴヌクレオチドはＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質が自己集合体化し、これによってＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子が形成されるのを促すので、本発明のヌクレオチド組成物は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法に有用であり、このとき該オリゴヌクレオチドは該ウイルス様粒子内にパッケージ化される。したがって、本発明は、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) 本発明のいずれかの方法によって入手可能なヌクレオチド組成物である、オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を準備する工程、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含む方法に関する。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドは本発明の目的のために最も有用であり、それに対して、より高い又はより低い相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドは低い収率となりうる。したがって、本発明はさらに、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、(i) 該オリゴヌクレオチドは少なくとも一つのポリＧ伸展を有することが好ましく、そして、(ii)該オリゴヌクレオチドは５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含む方法に関する。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
当業者は、標準的な方法を適用することによってＲＮＡバクテリオファージから前記コートタンパク質を精製することによってＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を生産して、精製することが可能である。しかしながら、好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、好ましくは大腸菌の該コートタンパク質の発現によって、組み換えて生産される。ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を得る方法は、実施例の項目において開示される。好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいは基本的にこれからなるか、あるいはこれからなり、該ＲＮＡバクテリオファージは、(a) バクテリオファージＱβ；(b) バクテリオファージＲ１７；(c) バクテリオファージｆｒ；(d) バクテリオファージＧＡ；(e) バクテリオファージＳＰ；(f) バクテリオファージＭＳ２；(g) バクテリオファージＭ１１；(h) バクテリオファージＭＸ1；(i) バクテリオファージＮＬ９５；(j)バクテリオファージｆ2；(k) バクテリオファージＰＰ７；及びバクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択されるのが好ましい。好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβである。ＲＮＡバクテリオファージ、特にバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を発現させ、精製するための工程及び方法は、国際公開２００６／１２５８２１Ａ２及び国際公開２００７／０３９５５２Ａ１において開示される。これらは出典明記によって本明細書中に援用される。例えば本明細書中の実施例にて説明したように、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質はウイルス様粒子の分解によって得られてもよい。
当業者は、標準的な方法を適用することによってＲＮＡバクテリオファージから前記コートタンパク質を精製することによってＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を生産して、精製することが可能である。しかしながら、好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、好ましくは大腸菌の該コートタンパク質の発現によって、組み換えて生産される。ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を得る方法は、実施例の項目において開示される。好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいは基本的にこれからなるか、あるいはこれからなり、該ＲＮＡバクテリオファージは、(a) バクテリオファージＱβ；(b) バクテリオファージＲ１７；(c) バクテリオファージｆｒ；(d) バクテリオファージＧＡ；(e) バクテリオファージＳＰ；(f) バクテリオファージＭＳ２；(g) バクテリオファージＭ１１；(h) バクテリオファージＭＸ1；(i) バクテリオファージＮＬ９５；(j)バクテリオファージｆ2；(k) バクテリオファージＰＰ７；及びバクテリオファージＡＰ２０５からなる群から選択されるのが好ましい。好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβである。ＲＮＡバクテリオファージ、特にバクテリオファージＱβのウイルス様粒子を発現させ、精製するための工程及び方法は、国際公開２００６／１２５８２１Ａ２及び国際公開２００７／０３９５５２Ａ１において開示される。これらは出典明記によって本明細書中に援用される。例えば本明細書中の実施例にて説明したように、ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質はウイルス様粒子の分解によって得られてもよい。
更なる好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＡＰ２０５である。また、アミノ酸５のプロリンがスレオニンに置換しているＡＰ２０５コートタンパク質を含む、ＡＰ２０５ ＶＬＰの集合体化しやすい変異形態が本発明の実施に使われてもよい。国際公開２００４／００７５３８は、特に実施例１及び実施例２において、ＡＰ２０５コートタンパク質を含むＶＬＰを得る方法、特にこれらの発現及び精製方法を記載する。国際公開２００４／００７５３８は出典明記によって本明細書中に援用される。
更なる好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージｆｒである。Pushko P et al. ((1993) Prot Engin 6:883-891)によって記載されるように、組み換えＶＬＰの形態のｆｒコートタンパク質が得られてもよい。更なる好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＧＡである。ＧＡ ＶＬＰは、ＧＡファージからｐＱｂ１８５への逆転写によって単離されるＧＡコートタンパク質をクローニングすることによって得られてもよい。これは国際公開２００４／００７５３８の実施例のために記述される。ｆｒ及びＧＡのＶＬＰの分解は、場合によって０．１Ｍの濃度の酢酸を添加した７Ｍ 尿素中でＶＬＰをインキュベートすることによって容易に行うことができる。さらに、有意な量のコートタンパク質が流れ出るが、核酸は保持されるｐＨか、又はコートタンパク質もカラムに吸着され、その後塩勾配によって溶出されるｐＨのいずれかのイオン交換クロマトグラフィによって、核酸はコートタンパク質から精製される。
更なる好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージｆｒである。Pushko P et al. ((1993) Prot Engin 6:883-891)によって記載されるように、組み換えＶＬＰの形態のｆｒコートタンパク質が得られてもよい。更なる好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＧＡである。ＧＡ ＶＬＰは、ＧＡファージからｐＱｂ１８５への逆転写によって単離されるＧＡコートタンパク質をクローニングすることによって得られてもよい。これは国際公開２００４／００７５３８の実施例のために記述される。ｆｒ及びＧＡのＶＬＰの分解は、場合によって０．１Ｍの濃度の酢酸を添加した７Ｍ 尿素中でＶＬＰをインキュベートすることによって容易に行うことができる。さらに、有意な量のコートタンパク質が流れ出るが、核酸は保持されるｐＨか、又はコートタンパク質もカラムに吸着され、その後塩勾配によって溶出されるｐＨのいずれかのイオン交換クロマトグラフィによって、核酸はコートタンパク質から精製される。
好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、(a) 配列番号：１０(Ｑβ ＣＰ)；(b) 配列番号：１０と配列番号：１１の混合物(Ｑβ Ａ1タンパク質)；(c) 配列番号：１２(Ｒ１７コートタンパク質)；(d) 配列番号：１３(ｆｒコートタンパク質)；(e) 配列番号：１４(ＧＡコートタンパク質)；(ｆ) 配列番号：１５(ＳＰコートタンパク質)；(g) 配列番号：１５と配列番号：１６の混合物；(h) 配列番号：１７(ＭＳ２コートタンパク質)；(ｉ) 配列番号：１８(Ｍ１１コートタンパク質)；(ｊ) 配列番号：１９(ＭＸ1コートタンパク質)；(k) 配列番号：２０(ｆ２コートタンパク質)；(ｌ) 配列番号：２１(ｆ２コートタンパク質)；(m) 配列番号：２２(ＰＰ７コートタンパク質)；及び(n) 配列番号：２３(ＡＰ２０５コートタンパク質)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはこれからなる。更なる好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、(a) 配列番号：１０；(b) 配列番号：１１と配列番号：１１の混合物；(c) 配列番号：１３；(d) 配列番号：１４；(e) 配列番号：２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはこれからなる。更なる非常に好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、(a) 配列番号：１０；及び(b) 配列番号：１０と配列番号：１１の混合物からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又は好ましくはこれからなる。
さらに、露出したリジン残基がアルギニンによって置換されているバクテリオファージＱβの変異コートタンパク質が、本発明のために使われてもよい。ゆえに、更なる好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、国際公開０２／０５６９０５(この実施例１８を参照)に開示される変異Ｑβコートタンパク質を含むか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。
さらに、露出したリジン残基がアルギニンによって置換されているバクテリオファージＱβの変異コートタンパク質が、本発明のために使われてもよい。ゆえに、更なる好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、国際公開０２／０５６９０５(この実施例１８を参照)に開示される変異Ｑβコートタンパク質を含むか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。
さらにまた、ＲＮＡバクテリオファージコートタンパク質は、細菌宿主での発現の際に自己集合体化することが示された(Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983)、Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986)、Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989)、Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995))。特にＧＡ(Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996)、Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271:759-773(1997))、及びｆｒ(Pushko P. et al., Prot. Eng. 6: 883-891 (1993)、Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290, (1994))の生物学的及び生化学的な性質が開示された。いくつかのＲＮＡバクテリオファージの結晶構造は決定されている(Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996))。
典型的かつ好ましくは、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本明細書に開示した方法は室温で実施される。好適な実施態様では、前記方法は、１５〜３０℃、好ましくは１９〜２５℃、最も好ましくは２２℃で行われる。更なる好適な実施態様では、前記の混合物の生成、前記の混合物からの薬剤の除去、及び／又は前記のコートタンパク質のウイルス様粒子への自己集合体化は、１５〜３０℃、好ましくは１９〜２５℃、最も好ましくは２２℃で行われる。 前記方法は混合物を生成することを含み、該混合物は、(i) 前記コートタンパク質；(ii) 前記コートタンパク質の自己集合を予防することが可能な薬剤；(iii) 前記オリゴヌクレオチドを含む。好適な実施態様では、前記混合物中の前記コートタンパク質の濃度は０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌであり、該濃度はブラッドフォードアッセイにおいて決定されることが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は、１２．５〜２５０μＭ、より好ましくは２５〜１００μＭ、最も好ましくは６２．５μＭである。
典型的かつ好ましくは、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本明細書に開示した方法は室温で実施される。好適な実施態様では、前記方法は、１５〜３０℃、好ましくは１９〜２５℃、最も好ましくは２２℃で行われる。更なる好適な実施態様では、前記の混合物の生成、前記の混合物からの薬剤の除去、及び／又は前記のコートタンパク質のウイルス様粒子への自己集合体化は、１５〜３０℃、好ましくは１９〜２５℃、最も好ましくは２２℃で行われる。 前記方法は混合物を生成することを含み、該混合物は、(i) 前記コートタンパク質；(ii) 前記コートタンパク質の自己集合を予防することが可能な薬剤；(iii) 前記オリゴヌクレオチドを含む。好適な実施態様では、前記混合物中の前記コートタンパク質の濃度は０．５〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜４ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２．５ｍｇ／ｍｌであり、該濃度はブラッドフォードアッセイにおいて決定されることが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は、１２．５〜２５０μＭ、より好ましくは２５〜１００μＭ、最も好ましくは６２．５μＭである。
パッケージ化工程の最適収率を得るために、前記オリゴヌクレオチド、及び前記混合物中の前記コートタンパク質のモル比は、０．５〜１．２、好ましくは０．６〜０．８、最も好ましくは０．７である。コートタンパク質当たりのオリゴヌクレオチドの使用が少なければ収率が低くなり、過剰なオリゴヌクレオチドを使うと費用が増し、純度の低い生成物となるであろう。非常に好適な実施態様では、前記混合物中の前記コートタンパク質の濃度は２．５ｍｇ／ｍｌであり、前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は６２．５μＭである。
一般に、ウイルス、特にＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質は、キャプシド構造、例えばウイルス様粒子に自己集合体化する強力な傾向がある。常にではなく、多くの場合、この傾向はＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸の存在下で亢進される。前記コートタンパク質の自己集合体化が起こる前に前記コートタンパク質と前記オリゴヌクレオチドを適度に混合するために、該混合物は該コートタンパク質の自己集合を防ぐことが可能な薬剤を含む。典型的かつ好ましくは、前記薬剤は変性化合物を含む。多数の変性化合物は生化学において公知であり、界面活性剤、尿素又はグアニジウムハイドロクロライドを含む。好適な界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などである。好適な実施態様では、前記変性化合物は尿素又はグアニジウムハイドロクロライドであり、前記混合物中の該変性化合物、好ましくは該尿素の濃度は０．２５〜７．２Ｍ、好ましくは１Ｍであることが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記変性化合物は尿素であり、前記混合物中の前記尿素の濃度は０．５〜２Ｍ、好ましくは０．７〜１．５Ｍ、より好ましくは０．８〜１．２Ｍ、最も好ましくは１Ｍである。
一般に、ウイルス、特にＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質は、キャプシド構造、例えばウイルス様粒子に自己集合体化する強力な傾向がある。常にではなく、多くの場合、この傾向はＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸の存在下で亢進される。前記コートタンパク質の自己集合体化が起こる前に前記コートタンパク質と前記オリゴヌクレオチドを適度に混合するために、該混合物は該コートタンパク質の自己集合を防ぐことが可能な薬剤を含む。典型的かつ好ましくは、前記薬剤は変性化合物を含む。多数の変性化合物は生化学において公知であり、界面活性剤、尿素又はグアニジウムハイドロクロライドを含む。好適な界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００などである。好適な実施態様では、前記変性化合物は尿素又はグアニジウムハイドロクロライドであり、前記混合物中の該変性化合物、好ましくは該尿素の濃度は０．２５〜７．２Ｍ、好ましくは１Ｍであることが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記変性化合物は尿素であり、前記混合物中の前記尿素の濃度は０．５〜２Ｍ、好ましくは０．７〜１．５Ｍ、より好ましくは０．８〜１．２Ｍ、最も好ましくは１Ｍである。
更なる好適な実施態様では、前記混合物のｐＨはおよそ中性であり、該ｐＨは６〜８、より好ましくは６．８〜７．５であることが好ましく、前記ｐＨは７．２であることが最も好ましい。非常に好適な実施態様では、前記混合物はリン酸バッファ、好ましくはリン酸ナトリウムバッファを含み、さらに、前記混合物中の該リン酸バッファの終濃度は２〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭ、最も好ましくはおよそ２０ｍＭであることが好ましい。
更なる実施態様では、前記混合物はさらに塩を含み、前記塩はハロゲン化物、好ましくはアルカリ金属の塩化物であることが好ましく、該塩は塩化カリウム又は塩化ナトリウム又はこれらの組合せであることがより好ましく、該塩は塩化ナトリウムであるであることが最も好ましい。好適な実施態様では、前記混合物中の、前記塩又は塩類の組み合わせの濃度、好ましくは前記塩化ナトリウムの濃度は、０〜１Ｍ、好ましくは０〜５５０ｍＭ、より好ましくは０〜３５０ｍＭ、さらにより好ましくは５０〜３５０ｍＭ、最も好ましくは２５０ｍＭである。
更なる実施態様では、前記混合物はさらに塩を含み、前記塩はハロゲン化物、好ましくはアルカリ金属の塩化物であることが好ましく、該塩は塩化カリウム又は塩化ナトリウム又はこれらの組合せであることがより好ましく、該塩は塩化ナトリウムであるであることが最も好ましい。好適な実施態様では、前記混合物中の、前記塩又は塩類の組み合わせの濃度、好ましくは前記塩化ナトリウムの濃度は、０〜１Ｍ、好ましくは０〜５５０ｍＭ、より好ましくは０〜３５０ｍＭ、さらにより好ましくは５０〜３５０ｍＭ、最も好ましくは２５０ｍＭである。
特定のＲＮＡバクテリオファージ、特に、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＡＰ２０５及びバクテリオファージｆｒのキャプシド及び／又はウイルス様粒子は、前記キャプシド又はウイルス様粒子を形成しているタンパク質サブユニット間の分子間ジスルフィド結合によって安定化される。前記混合物への還元剤の添加は、前記ジスルフィド架橋を還元状態に保ち、前記コートタンパク質の自己集合の防止を助ける。ゆえに、好適な実施態様では、前記薬剤は還元剤を更に含み、該還元剤は、当分野で公知のＤＴＴ(dithioerythol)、β-メルカプトエタノール、ＴＣＥＰ及び他の還元剤から選択されるのが好ましい。好適な実施態様では、前記還元剤はＤＴＴであり、前記混合物中の前記ＤＴＴの濃度は１〜２５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭであることが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＡＰ２０５又はバクテリオファージｆｒであり、前記薬剤は還元剤を更に含み、該還元剤はＤＴＴであることが好ましく、前記混合物中の該ＤＴＴの濃度は１〜２５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭであることがさらに好ましい。更なる好適な実施態様では、前記コートタンパク質は前記ウイルス様粒子の分子間ジスルフィド結合を形成することが可能なシステイン残基を含み、該薬剤は還元剤を更に含み、該還元剤はＤＴＴであることが好ましく、前記混合物中の該ＤＴＴの濃度は１〜２５ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭであることがさらに好ましい。
好適な実施態様では、前記の混合物を生成することは、(i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを前記混合物に加えることを含み、この添加を所定の順序で行うことが好ましく、該混合物が該オリゴヌクレオチドの添加の前に混合されることがさらに好ましい。
更なる好適な実施態様では、前記方法は、前記薬剤の除去の前に前記混合物をインキュベートする処置をさらに含み、該インキュベートはおよそ５０〜７０、好ましくはおよそ６０分間行うことが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートは、１５〜３０℃、より好ましくは１９〜２５℃、最も好ましくは２２℃で行う。さらに好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートは該混合物をかき回すことを含み、該撹拌はおよそ５０〜２００回転数／分、最も好ましくはおよそ１００回転数／分で行うことが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートはおよそ６０分間行い、前記混合物のインキュベートは該混合物を撹拌することを含み、該撹拌はおよそ１００回転数／分で行われることが好ましい。
一実施態様では、前記の混合物からの薬剤の除去は第一バッファとの第一バッファ交換によって行われ、該第一バッファ交換は透析によって、又は連続流動濾過、好ましくは連続流動濾過によって行われるのが好ましい。前記第一バッファ交換は、前記コートタンパク質と自己集合体化したＶＬＰの保持を可能にする分子量カットオフを含むメンブランによって行う。好適な実施態様では、前記第一バッファ交換はメンブランによって行い、前記メンブランは、１〜５０ｋＤ、好ましくは５〜３０ｋＤ、最も好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含む。非常に好適な実施態様では、前記第一バッファ交換は、１〜５０ｋＤ、好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、該第一バッファの体積は前記混合物の体積のおよそ６倍であることがさらに好ましい。非常に好適な実施態様では、前記メンブランは、３０ｋＤ分子量カットオフを含むＢｉｏｍａｘ-５(ＰＥＳ)である。非常に好適な実施態様では、前記第一バッファ交換は、１〜５０ｋＤ、好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、このとき透過流量はおよそ９６ｌ／(ｍ２×ｈ)に調整される。
更なる好適な実施態様では、前記方法は、前記薬剤の除去の前に前記混合物をインキュベートする処置をさらに含み、該インキュベートはおよそ５０〜７０、好ましくはおよそ６０分間行うことが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートは、１５〜３０℃、より好ましくは１９〜２５℃、最も好ましくは２２℃で行う。さらに好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートは該混合物をかき回すことを含み、該撹拌はおよそ５０〜２００回転数／分、最も好ましくはおよそ１００回転数／分で行うことが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートはおよそ６０分間行い、前記混合物のインキュベートは該混合物を撹拌することを含み、該撹拌はおよそ１００回転数／分で行われることが好ましい。
一実施態様では、前記の混合物からの薬剤の除去は第一バッファとの第一バッファ交換によって行われ、該第一バッファ交換は透析によって、又は連続流動濾過、好ましくは連続流動濾過によって行われるのが好ましい。前記第一バッファ交換は、前記コートタンパク質と自己集合体化したＶＬＰの保持を可能にする分子量カットオフを含むメンブランによって行う。好適な実施態様では、前記第一バッファ交換はメンブランによって行い、前記メンブランは、１〜５０ｋＤ、好ましくは５〜３０ｋＤ、最も好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含む。非常に好適な実施態様では、前記第一バッファ交換は、１〜５０ｋＤ、好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、該第一バッファの体積は前記混合物の体積のおよそ６倍であることがさらに好ましい。非常に好適な実施態様では、前記メンブランは、３０ｋＤ分子量カットオフを含むＢｉｏｍａｘ-５(ＰＥＳ)である。非常に好適な実施態様では、前記第一バッファ交換は、１〜５０ｋＤ、好ましくは３０ｋＤの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、このとき透過流量はおよそ９６ｌ／(ｍ２×ｈ)に調整される。
更なる好適な実施態様では、前記第一バッファは塩を含み、このとき該第一バッファの塩組成は該混合物の塩組成と同一である。好適な実施態様では、前記第一バッファ中の塩は、ハロゲン化物、好ましくはアルカリ金属の塩化物であり、該塩は塩化カリウム又は塩化ナトリウム又はこれらの組合せであることが好ましく、該塩は塩化ナトリウムであることが最も好ましい。好適な実施態様では、前記第一バッファ中の、前記塩又は塩類の組み合わせの濃度、好ましくは前記塩化ナトリウムの濃度は、０〜１Ｍ、好ましくは０〜５５０ｍＭ、より好ましくは０〜３５０ｍＭ、さらにより好ましくは５０〜３５０ｍＭ、最も好ましくは２５０ｍＭである。更なる好適な実施態様では、前記第一バッファのｐＨは６〜８、より好ましくは６．８〜７．５であり、最も好ましくは前記ｐＨは７．２である。更なる好適な実施態様では、前記第一バッファはリン酸バッファ、好ましくはリン酸ナトリウムバッファを含み、前記第一バッファ中の前記リン酸バッファの終濃度は２〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭ、最も好ましくはおよそ２０ｍＭであることがさらに好ましい。
自己集合において形成される前記ウイルス様粒子を安定化するために、前記ウイルス様粒子を、ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な酸化剤と接触させることが好ましい。ゆえに、好適な実施態様では、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) アスコルビン酸、(e) Ｃｕ２＋、及び(f) Ｆｅ３＋からなる群から選択されるのが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＡＰ２０５又はバクテリオファージｆｒであり、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) Ｃｕ２＋、及び(e) Ｆｅ３＋からなる群から選択されるのが好ましく、該酸化剤は過酸化水素であることが最も好ましく、該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭであることがさらに好ましい。好適な実施態様では、前記コートタンパク質は前記ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することが可能なシステイン残基を含み、前記コートタンパク質は、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＡＰ２０５又はバクテリオファージｆｒのコートタンパク質であることが好ましく、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) Ｃｕ２＋、及び(e) Ｆｅ３＋からなる群から選択されるのが好ましく、該酸化剤は過酸化水素であることが最も好ましく、該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭであることがさらに好ましい。
自己集合において形成される前記ウイルス様粒子を安定化するために、前記ウイルス様粒子を、ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な酸化剤と接触させることが好ましい。ゆえに、好適な実施態様では、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) アスコルビン酸、(e) Ｃｕ２＋、及び(f) Ｆｅ３＋からなる群から選択されるのが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記ＲＮＡバクテリオファージはバクテリオファージＱβ、バクテリオファージＡＰ２０５又はバクテリオファージｆｒであり、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) Ｃｕ２＋、及び(e) Ｆｅ３＋からなる群から選択されるのが好ましく、該酸化剤は過酸化水素であることが最も好ましく、該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭであることがさらに好ましい。好適な実施態様では、前記コートタンパク質は前記ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することが可能なシステイン残基を含み、前記コートタンパク質は、バクテリオファージＱβ、バクテリオファージＡＰ２０５又はバクテリオファージｆｒのコートタンパク質であることが好ましく、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) Ｃｕ２＋、及び(e) Ｆｅ３＋からなる群から選択されるのが好ましく、該酸化剤は過酸化水素であることが最も好ましく、該過酸化水素の濃度は０．２５〜５０ｍＭ、好ましくは２ｍＭであることがさらに好ましい。
更なる好適な実施態様では、前記方法はさらに前記ウイルス様粒子を精製する工程を含み、該精製は第二バッファとの第二バッファ交換を含むことが好ましく、該第二バッファは薬学的に許容されるバッファであることがさらに好ましい。好適な実施態様では、前記第二バッファ交換は第二バッファによって行われ、該第二バッファ交換は透析によって、又は連続流量濾過、好ましくは連続流量濾過によって行われることが好ましい。前記第二バッファ交換は、前記ウイルス様粒子の保持を可能にする分子量カットオフを含むメンブランによって行い、この分子量カットオフは前記コートタンパク質及び／又は前記オリゴヌクレオチドの透過を可能にすることが好ましい。ゆえに、好適な実施態様では、前記第二バッファ交換は、１００〜１０００ｋＤ、好ましくは３００ｋＤの分子量カットオフを含むメンブランに対して行われ、該第二バッファ交換は連続流量濾過によって行われることが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記メンブランは、３００ｋＤの分子量カットオフを含むＰＬＣＭＫ-３００である。更なる非常に好適な実施態様では、前記第二バッファ交換は、１００〜１０００ｋＤ、好ましくは３００ｋＤの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、このとき前記混合物の体積のおよそ１０倍が交換されるのが好ましく、透過流量はおよそ１００ｌ／(ｍ２×ｈ)に調整されることがさらに好ましい。
更なる実施態様では、前記方法は、前記ウイルス様粒子を濃縮することを含み、この濃縮は、前記組成物中のウイルス様粒子の終濃度を１〜５ｍｇタンパク質／ｍｌ、好ましくはおよそ２．５ｍｇタンパク質／ｍｌにするまで行われることが好ましく、該濃度はブラッドフォードタンパク質アッセイで測定されるのが好ましく、該ウイルス様粒子は該第二バッファに溶解されることがさらに好ましい。非常に好適な実施態様では、前記の濃縮はウイルス様粒子を保持することが可能なメンブランによって行われ、該メンブランの分子量カットオフは、１００〜１０００ｋＤ、好ましくはおよそ３００ｋＤであることが好ましく、このときこの濃縮が１００ｌ／(ｈ×ｍ２)未満、好ましくはおよそ３０ｌ／(ｈ×ｍ２)のメンブランに対する透過流量で行われることがさらに好ましい。濃縮工程の間に流量速度が低ければ生成物の沈殿が妨げられる。
更なる実施態様では、前記方法は、前記ウイルス様粒子を濃縮することを含み、この濃縮は、前記組成物中のウイルス様粒子の終濃度を１〜５ｍｇタンパク質／ｍｌ、好ましくはおよそ２．５ｍｇタンパク質／ｍｌにするまで行われることが好ましく、該濃度はブラッドフォードタンパク質アッセイで測定されるのが好ましく、該ウイルス様粒子は該第二バッファに溶解されることがさらに好ましい。非常に好適な実施態様では、前記の濃縮はウイルス様粒子を保持することが可能なメンブランによって行われ、該メンブランの分子量カットオフは、１００〜１０００ｋＤ、好ましくはおよそ３００ｋＤであることが好ましく、このときこの濃縮が１００ｌ／(ｈ×ｍ２)未満、好ましくはおよそ３０ｌ／(ｈ×ｍ２)のメンブランに対する透過流量で行われることがさらに好ましい。濃縮工程の間に流量速度が低ければ生成物の沈殿が妨げられる。
更なる好適な実施態様では、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を滅菌濾過する工程を含み、該ウイルス様粒子が前記第二バッファに含まれることが好ましく、該滅菌濾過は０．１〜０．４５μｍ、好ましくはおよそ０．２２μｍを含むメンブランフィルターによって行われることがさらに好ましい。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はタンパク質の産生を含み、このタンパク質産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はオリゴヌクレオチドの産生を含み、このオリゴヌクレオチド産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、前記のウイルス様粒子を含む組成物は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を含む。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はタンパク質の産生を含み、このタンパク質産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はオリゴヌクレオチドの産生を含み、このオリゴヌクレオチド産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、前記のウイルス様粒子を含む組成物は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の純度を含む。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はオリゴヌクレオチドの産生を含み、このオリゴヌクレオチド産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はタンパク質の産生とオリゴヌクレオチドの産生を含み、このタンパク質産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、前記のウイルス様粒子を含む組成物は、１００μｇコートタンパク質につきオリゴヌクレオチドを１５〜３０μｇ、好ましくは２０〜２５μｇ、最も好ましくはおよそ２０μｇ含み、該ウイルス様粒子はバクテリオファージＱβのウイルス様粒子であることが好ましく、該オリゴヌクレオチドはＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましく、このウイルス様粒子を含む組成物は少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の純度を含むことがさらに好ましく、該コートタンパク質の定量化はブラッドフォードタンパク質アッセイによって行われることがさらに好ましく、該オリゴヌクレオチドの定量化は基本的に、好ましくは厳密に実施例９に開示されるように行われるのがさらに好ましい。
更なる好適な実施態様では、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はタンパク質の産生とオリゴヌクレオチドの産生を含み、このタンパク質産生(収率)は少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％である。
更なる好適な実施態様では、前記のウイルス様粒子を含む組成物は、１００μｇコートタンパク質につきオリゴヌクレオチドを１５〜３０μｇ、好ましくは２０〜２５μｇ、最も好ましくはおよそ２０μｇ含み、該ウイルス様粒子はバクテリオファージＱβのウイルス様粒子であることが好ましく、該オリゴヌクレオチドはＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましく、このウイルス様粒子を含む組成物は少なくとも９８％、好ましくは少なくとも９９％の純度を含むことがさらに好ましく、該コートタンパク質の定量化はブラッドフォードタンパク質アッセイによって行われることがさらに好ましく、該オリゴヌクレオチドの定量化は基本的に、好ましくは厳密に実施例９に開示されるように行われるのがさらに好ましい。
本発明はさらに、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法における、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能なヌクレオチド組成物の使用に関し、この方法は、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) ヌクレオチド組成物を準備する工程、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含むことが好ましく、このとき前記のヌクレオチド組成物に含まれるオリゴヌクレオチドは５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むことが好ましく、前記ＲＮＡバクテリオファージがＱβであることがさらに好ましく、前記オリゴヌクレオチドがＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましい。
本発明はさらに、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法における、５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドの使用に関し、この方法は、(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、(c) (i) 前記コートタンパク質と、(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、(iii) 前記オリゴヌクレオチドとを含有してなる混合物を生成する工程、(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程を含むことが好ましく、このとき前記ＲＮＡバクテリオファージがＱβであることが好ましく、前記オリゴヌクレオチドがＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましい。
本発明はさらに、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能な組成物であって、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物に関し、このとき該ＲＮＡバクテリオファージがＱβであることが好ましく、該オリゴヌクレオチドがＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましく、該組成物の純度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であることがさらに好ましく、前記のウイルス様粒子を含む組成物は１００μｇコートタンパク質につきオリゴヌクレオチドを１５〜３０μｇ、好ましくは２０〜２５μｇ、最も好ましくはおよそ２０μｇ含むことがさらに好ましい。
本発明はさらに、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能な組成物であって、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物に関し、このとき該ＲＮＡバクテリオファージがＱβであることが好ましく、該オリゴヌクレオチドがＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましく、該組成物の純度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であることがさらに好ましく、前記オリゴヌクレオチドはＤＮアーゼ加水分解にアクセス可能でない。
本発明はさらに、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能な組成物であって、(i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物に関し、このとき該ＲＮＡバクテリオファージがＱβであることが好ましく、該オリゴヌクレオチドがＧ１０(配列番号：８)であることがさらに好ましく、該組成物の純度が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、最も好ましくは少なくとも９９％であることがさらに好ましく、前記オリゴヌクレオチドはＤＮアーゼ加水分解にアクセス可能でない。
実施例１ オリゴヌクレオチドＧ１０(配列番号：８)の解離と凝集
Ｇ１０の定量：Ｇ１０は、３４０ｎｍの吸収によって校正した２６０ｎｍのＵＶ吸収によって定量化し、このとき１Ａ２６０−３４０は１ｃｍ経路長で２７．８μｇの濃度に相当する。
解離(１０．０ｍｌスケール、２６０μＭ Ｇ１０、２５ｍＭ ＮａＯＨ、５０℃、７０分)：４５．９１ｍｇのＧ１０を１５ｍｌチューブに入れた。粉を１１．０ｍｌの純水に溶解した(ｃ＝３２５．３μＭ；吸光度測定によって決定した)。８．０ｍｌのオリゴヌクレオチド溶液を、１５ｍｌのチューブ(２６０μＭ Ｇ１０、２５ｍＭ ＮａＯＨ)中で２５０μｌ の１Ｍ ＮａＯＨと１．７５ｍｌの純水に混合した。混合物をウォーターバス中で５０℃、７０分間かけて解離させた。溶液を氷上で冷却した後に、ｐＨを０．５ＭのＨＣｌにてｐＨ５．３１に調整した。５４０μｌの０．５Ｍ ＨＣｌと５μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えた。
凝集(１０．０ｍｌスケール、１７５μＭ Ｇ１０、２５０ｍＭ Ｎａ＋、８５℃、９〜２４分)：７．１ｍｌの解離したＧ１０溶液、２．１３ｍｌの純水及び７７０μｌの３Ｍ ＮａＣｌを、１５ｍｌチューブ(１７５μＭ オリゴ、２５０ｍＭ Ｎａ＋)中で混合した。混合物をウォーターバス中で８５℃で９分間インキュベートした。溶液を氷／ウォーターバスにて冷却し、使用時まで氷上に保存した。凝集されたオリゴヌクレオチド溶液は、調製後で３時間以内に使われなければならない。
Ｇ１０の定量：Ｇ１０は、３４０ｎｍの吸収によって校正した２６０ｎｍのＵＶ吸収によって定量化し、このとき１Ａ２６０−３４０は１ｃｍ経路長で２７．８μｇの濃度に相当する。
解離(１０．０ｍｌスケール、２６０μＭ Ｇ１０、２５ｍＭ ＮａＯＨ、５０℃、７０分)：４５．９１ｍｇのＧ１０を１５ｍｌチューブに入れた。粉を１１．０ｍｌの純水に溶解した(ｃ＝３２５．３μＭ；吸光度測定によって決定した)。８．０ｍｌのオリゴヌクレオチド溶液を、１５ｍｌのチューブ(２６０μＭ Ｇ１０、２５ｍＭ ＮａＯＨ)中で２５０μｌ の１Ｍ ＮａＯＨと１．７５ｍｌの純水に混合した。混合物をウォーターバス中で５０℃、７０分間かけて解離させた。溶液を氷上で冷却した後に、ｐＨを０．５ＭのＨＣｌにてｐＨ５．３１に調整した。５４０μｌの０．５Ｍ ＨＣｌと５μｌの１Ｍ ＮａＯＨを加えた。
凝集(１０．０ｍｌスケール、１７５μＭ Ｇ１０、２５０ｍＭ Ｎａ＋、８５℃、９〜２４分)：７．１ｍｌの解離したＧ１０溶液、２．１３ｍｌの純水及び７７０μｌの３Ｍ ＮａＣｌを、１５ｍｌチューブ(１７５μＭ オリゴ、２５０ｍＭ Ｎａ＋)中で混合した。混合物をウォーターバス中で８５℃で９分間インキュベートした。溶液を氷／ウォーターバスにて冷却し、使用時まで氷上に保存した。凝集されたオリゴヌクレオチド溶液は、調製後で３時間以内に使われなければならない。
実施例２ オリゴヌクレオチドＧ４−４の解離と凝集
脱凝集：２６０μＭ オリゴヌクレオチドＧ４−４(配列番号：２)と２５ｍＭ ＮａＯＨを純水に含む溶液を調製した。溶液を７０分間５０℃に加熱し、その後氷上で冷却し、溶液のｐＨを０．５Ｍ ＨＣｌを用いて５と８の間のｐＨに調整した。
凝集：解離したＧ４−４を含む溶液を純水と３Ｍ ＮａＣｌにて、２３０μＭ Ｇ４−４及び２５０ｍＭ Ｎａ＋の終濃度に希釈した。混合物は、６．８℃／分の加熱勾配によって数分(２〜７０分)かけて８０℃に加熱した。インキュベートの後、混合物を６．８℃／分の温度勾配にて０〜２℃に冷却した。
サイズ排除ＨＰＬＣ(実施例４を参照)による生成物の分析によって、凝集したオリゴヌクレオチドが得られたことが明らかとなった。(相対的なピークのスタート時間：８８%)。
脱凝集：２６０μＭ オリゴヌクレオチドＧ４−４(配列番号：２)と２５ｍＭ ＮａＯＨを純水に含む溶液を調製した。溶液を７０分間５０℃に加熱し、その後氷上で冷却し、溶液のｐＨを０．５Ｍ ＨＣｌを用いて５と８の間のｐＨに調整した。
凝集：解離したＧ４−４を含む溶液を純水と３Ｍ ＮａＣｌにて、２３０μＭ Ｇ４−４及び２５０ｍＭ Ｎａ＋の終濃度に希釈した。混合物は、６．８℃／分の加熱勾配によって数分(２〜７０分)かけて８０℃に加熱した。インキュベートの後、混合物を６．８℃／分の温度勾配にて０〜２℃に冷却した。
サイズ排除ＨＰＬＣ(実施例４を参照)による生成物の分析によって、凝集したオリゴヌクレオチドが得られたことが明らかとなった。(相対的なピークのスタート時間：８８%)。
実施例３ オリゴヌクレオチドの解離と凝集
解離：２６０μＭ オリゴヌクレオチドＧ５−５(配列番号：３)、Ｇ６−６(配列番号：４)、Ｇ７−７(配列番号：５)、Ｇ８−８(配列番号：６)、Ｇ９−９(配列番号：７)及びＧ１１(配列番号：９)と、２５ｍＭ ＮａＯＨを純水にそれぞれ含む溶液を調製する。溶液を７０分間５０℃に加熱し、その後氷上で冷却し、溶液のｐＨを０．５Ｍ ＨＣｌを用いて５と８の間のｐＨに調整する。
凝集：解離したオリゴヌクレオチドを含む溶液を純水と３Ｍ ＮａＣｌにて、２３０μＭ オリゴヌクレオチド及び２５０ｍＭ Ｎａ＋の終濃度に希釈した。混合物は、６．８℃／分の加熱勾配によって数分(２〜７０分)かけて８０℃に加熱した。インキュベートの後、混合物を６．８℃／分の温度勾配にて０〜２℃に冷却した。
この凝集方法の生成物はサイズ排除ＨＰＬＣによって分析される(実施例４を参照)。
解離：２６０μＭ オリゴヌクレオチドＧ５−５(配列番号：３)、Ｇ６−６(配列番号：４)、Ｇ７−７(配列番号：５)、Ｇ８−８(配列番号：６)、Ｇ９−９(配列番号：７)及びＧ１１(配列番号：９)と、２５ｍＭ ＮａＯＨを純水にそれぞれ含む溶液を調製する。溶液を７０分間５０℃に加熱し、その後氷上で冷却し、溶液のｐＨを０．５Ｍ ＨＣｌを用いて５と８の間のｐＨに調整する。
凝集：解離したオリゴヌクレオチドを含む溶液を純水と３Ｍ ＮａＣｌにて、２３０μＭ オリゴヌクレオチド及び２５０ｍＭ Ｎａ＋の終濃度に希釈した。混合物は、６．８℃／分の加熱勾配によって数分(２〜７０分)かけて８０℃に加熱した。インキュベートの後、混合物を６．８℃／分の温度勾配にて０〜２℃に冷却した。
この凝集方法の生成物はサイズ排除ＨＰＬＣによって分析される(実施例４を参照)。
実施例４ サイズ排除ＨＰＬＣによるオリゴヌクレオチドＧ１０の凝集状態の分析
Ｇ１０の凝集状態は、以下の条件を用いた分析的サイズ排除ＨＰＬＣにて分析した。
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ５０００ ＰＷＸＬ ７．８ｍｍ×３０．０ｃｍ (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤： ＰＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２)
注射体積： ４０．０μｌ(およそ２０μＭ〜およそ５００μＭの濃度を含むことが好ましい)
流速： ０．８ｍｌ／分勾配：均一濃度
ランタイム： ２０分
波長： ２１５、２６０及び２８０ｎｍ、２６０ｎｍのデータ評価
カラムオーブン温度： ２５℃
自動回収装置： ８℃
標準物質としてバクテリオファージＱβのキャプシドを用いた。
Ｑβキャプシドと比較したときのＧ１０のピークのスタート時間Ｘ％(相対的なピークのスタート時間Ｑβ)は、以下の通りに算出した。Ｘ％＝オリゴヌクレオチドのピークのスタート時間[分]÷Ｑβキャプシド標準物質[分]の持続時間×１００％、このときオリゴヌクレオチドのピークのスタート時間はオリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になる時間として測定し、Ｑβキャプシド標準物質の持続時間は標準物質の最大のピークが生じる時間として測定した。オリゴヌクレオチドＧ１０と標準物質としてのバクテリオファージＱβのキャプシドの溶出プロフィルの例を図１に示す。図１において示されるクロマトグラムに基づいて、８８％の相対的なピークのスタート時間は、凝集したオリゴヌクレオチドについて算出した。
Ｇ１０の凝集状態は、以下の条件を用いた分析的サイズ排除ＨＰＬＣにて分析した。
カラム： ＴＳＫｇｅｌ ５０００ ＰＷＸＬ ７．８ｍｍ×３０．０ｃｍ (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤： ＰＢＳ(１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２)
注射体積： ４０．０μｌ(およそ２０μＭ〜およそ５００μＭの濃度を含むことが好ましい)
流速： ０．８ｍｌ／分勾配：均一濃度
ランタイム： ２０分
波長： ２１５、２６０及び２８０ｎｍ、２６０ｎｍのデータ評価
カラムオーブン温度： ２５℃
自動回収装置： ８℃
標準物質としてバクテリオファージＱβのキャプシドを用いた。
Ｑβキャプシドと比較したときのＧ１０のピークのスタート時間Ｘ％(相対的なピークのスタート時間Ｑβ)は、以下の通りに算出した。Ｘ％＝オリゴヌクレオチドのピークのスタート時間[分]÷Ｑβキャプシド標準物質[分]の持続時間×１００％、このときオリゴヌクレオチドのピークのスタート時間はオリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になる時間として測定し、Ｑβキャプシド標準物質の持続時間は標準物質の最大のピークが生じる時間として測定した。オリゴヌクレオチドＧ１０と標準物質としてのバクテリオファージＱβのキャプシドの溶出プロフィルの例を図１に示す。図１において示されるクロマトグラムに基づいて、８８％の相対的なピークのスタート時間は、凝集したオリゴヌクレオチドについて算出した。
実施例５ 無処置のＧ１０、解離したオリゴヌクレオチドＧ１０及び凝集したオリゴヌクレオチドＧ１０の相対的なピークのスタート時間の比較
基本的には実施例１に記載のように調製した解離したＧ１０と凝集したＧ１０の相対的なピークのスタート時間を測定し、商業的な供給元から得た無処置のＧ１０の相対的なピークのスタート時間と比較した。解離したＧ１０は、１３８％(１３６．９〜１４０．３％；ｎ＝５)の相対的なピークのスタート時間を示した。実施例１に記載の解離／凝集の処理を行わなかったＧ１０調製物は解離したＧ１０と同じ範囲の相対的なピークのスタート時間を示す。解離及び凝集の後、Ｇ１０のピークのスタート時間は８８％であることが明らかとなった。
基本的には実施例１に記載のように調製した解離したＧ１０と凝集したＧ１０の相対的なピークのスタート時間を測定し、商業的な供給元から得た無処置のＧ１０の相対的なピークのスタート時間と比較した。解離したＧ１０は、１３８％(１３６．９〜１４０．３％；ｎ＝５)の相対的なピークのスタート時間を示した。実施例１に記載の解離／凝集の処理を行わなかったＧ１０調製物は解離したＧ１０と同じ範囲の相対的なピークのスタート時間を示す。解離及び凝集の後、Ｇ１０のピークのスタート時間は８８％であることが明らかとなった。
実施例６ 解離工程の影響
無処理のオリゴヌクレオチドＧ１０と実施例１に記載のように解離させたオリゴヌクレオチドＧ１０を、基本的には実施例１に記載のように凝集させた。以下のような凝集条件を選択した。１７５μＭ Ｇ１０、２５０ｍＭ Ｎａ＋(３Ｍ ＮａＣｌの添加によって)、８５℃で１６分間のインキュベーション、その後氷上で冷却。両調製物はＱβキャプシド及び標準物質としての無処置のＧ１０を用いたサイズ排除ＨＰＬＣ(実施例４を参照)によって分析した。結果として生じるＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。
無処置のＧ１０は凝集したＧ１０を含んだ(図２Ａ及び２Ｂ、ボックス１を参照)。凝集の前に解離していなかった凝集したＧ１０は、Ｑβキャプシドと同等か、又はＱβキャプシドよりも高い見かけの分子量を示した(図２Ａ、ボックス２)。相対的なピークのスタート時間はおよそ７５％であった。凝集の前に解離していた凝集されたＧ１０は、Ｑβキャプシドよりも低い見かけの分子量を表した(図２Ｂ、ボックス２)。相対的なピークのスタート時間はおよそ８８％であった。
無処理のオリゴヌクレオチドＧ１０と実施例１に記載のように解離させたオリゴヌクレオチドＧ１０を、基本的には実施例１に記載のように凝集させた。以下のような凝集条件を選択した。１７５μＭ Ｇ１０、２５０ｍＭ Ｎａ＋(３Ｍ ＮａＣｌの添加によって)、８５℃で１６分間のインキュベーション、その後氷上で冷却。両調製物はＱβキャプシド及び標準物質としての無処置のＧ１０を用いたサイズ排除ＨＰＬＣ(実施例４を参照)によって分析した。結果として生じるＨＰＬＣクロマトグラムを図２に示す。
無処置のＧ１０は凝集したＧ１０を含んだ(図２Ａ及び２Ｂ、ボックス１を参照)。凝集の前に解離していなかった凝集したＧ１０は、Ｑβキャプシドと同等か、又はＱβキャプシドよりも高い見かけの分子量を示した(図２Ａ、ボックス２)。相対的なピークのスタート時間はおよそ７５％であった。凝集の前に解離していた凝集されたＧ１０は、Ｑβキャプシドよりも低い見かけの分子量を表した(図２Ｂ、ボックス２)。相対的なピークのスタート時間はおよそ８８％であった。
実施例７ 円二色性によるオリゴヌクレオチドＧ１０の凝集状態の分析
無処置のＧ１０、解離したＧ１０及び凝集したＧ１０(基本的に実施例１に記載のように調製した)、並びにＧ１０をパッケージ化したＱβキャプシド(実施例１０に記載のように得たＱβＧ１０)のＣＤスペクトルを、ＪＡＳＣＯ Ｊ-７１５分光光度計にて２００ｎｍと３００ｎｍの間で記録した。(図３)。凝集したＧ１０のスペクトルは、２６２ｎｍの最大及び２４０ｎｍのトラフ値にて強いポジティブバンド(高い楕円形)の特徴を示した。これらのシグナルは、鎖が平行配向しているＤＮＡ四重体の典型的なスペクトルに対応することが報告されている(Lu et al., Biochemistry 31, p.2455, 1992)。重要なことに、２５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のＣＤスペクトルの形状は、凝集したＧ１０がある場合に再集合体化するＶＬＰのスペクトルを変化させない。ゆえに、Ｇ１０は、パッケージの際に立体配置的変化を経ないようである。２６２ｎｍの振幅のわずかな増加は、Ｑβキャプシドに凝集したＧ１０を選択的にパッケージ化していることを反映している可能性がある。このパッケージ化によって、凝集していない分子の分画を含んでいる凝集したＧ１０と比較して、パッケージ化の後に四重体の割合が高くなる。これに対して、無処置のＧ１０のスペクトルは定められる最大がない低い楕円の特徴を示し、これは定められる二次及び三次の構造成分を欠いていることを示す。また、２９５ｎｍで最大、２６２ｎｍで最小となることは逆平行の四重体配座異性体の存在を表すものであるが、解離したＧ１０については低いＣＤシグナルも観察される(P. Balagurumoorthy et al., Nucleic Acids Research 20, p. 4061, 1992)。
無処置のＧ１０、解離したＧ１０及び凝集したＧ１０(基本的に実施例１に記載のように調製した)、並びにＧ１０をパッケージ化したＱβキャプシド(実施例１０に記載のように得たＱβＧ１０)のＣＤスペクトルを、ＪＡＳＣＯ Ｊ-７１５分光光度計にて２００ｎｍと３００ｎｍの間で記録した。(図３)。凝集したＧ１０のスペクトルは、２６２ｎｍの最大及び２４０ｎｍのトラフ値にて強いポジティブバンド(高い楕円形)の特徴を示した。これらのシグナルは、鎖が平行配向しているＤＮＡ四重体の典型的なスペクトルに対応することが報告されている(Lu et al., Biochemistry 31, p.2455, 1992)。重要なことに、２５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲のＣＤスペクトルの形状は、凝集したＧ１０がある場合に再集合体化するＶＬＰのスペクトルを変化させない。ゆえに、Ｇ１０は、パッケージの際に立体配置的変化を経ないようである。２６２ｎｍの振幅のわずかな増加は、Ｑβキャプシドに凝集したＧ１０を選択的にパッケージ化していることを反映している可能性がある。このパッケージ化によって、凝集していない分子の分画を含んでいる凝集したＧ１０と比較して、パッケージ化の後に四重体の割合が高くなる。これに対して、無処置のＧ１０のスペクトルは定められる最大がない低い楕円の特徴を示し、これは定められる二次及び三次の構造成分を欠いていることを示す。また、２９５ｎｍで最大、２６２ｎｍで最小となることは逆平行の四重体配座異性体の存在を表すものであるが、解離したＧ１０については低いＣＤシグナルも観察される(P. Balagurumoorthy et al., Nucleic Acids Research 20, p. 4061, 1992)。
実施例８ 分解／再集合体化によるＧ１０を有するＱβ ＶＬＰのパッケージ化
Ｑβ ＶＬＰの分解：ＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)中の４５ｍｇのＱβ ＶＬＰ(２．５ｍｇ／ｍｌ、ブラッドフォード分析によって決定)を、１０ｍＭのＤＴＴにて、撹拌しながらＲＴで１５分間還元した。その後、塩化マグネシウムを０．７Ｍの終濃度になるまで加え、撹拌しながらＲＴで１５分間インキュベートし、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡの沈殿と同時に起こるＶＬＰの崩壊を引き起こした。溶液を４０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心して(以降すべての工程において用いた固定角度のローターＡ-４-６２にて、Eppendorf 5810 R)、溶液から沈殿したＲＮＡを除去した。放出した二量体のＱβコートタンパク質を含む上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるＱβコートタンパク質の精製：二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残留する宿主細胞ＲＮＡを含む、分解反応物の上清を、ＳＰ−セファロースＦＦカラム(ｘｋ１６／２０、６ｍｌ、Amersham Bioscience)に流した。カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ ｐＨ７で平衡化して、試料を水で１：１５に希釈して伝導率を１０ｍＳ／ｃｍ未満に調節してコートタンパク質をカラムに適切に結合させた。結合したコートタンパク質は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ 塩化ナトリウムに勾配することによって溶出を行い、タンパク質はおよそ２５ｍｌの分画体積に回収した。すべての工程において５ｍｌ／分の流速にて室温でクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度をモニターした。第二の工程において、単離されたＱβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２にて平衡化したセファクリルＳ−１００ ＨＲカラム(ｘｋ２６／６０、３２０ｍｌ、Amersham Bioscience)に流した。２．５ｍｌ／分の流速にて室温でクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの分画を回収した。
Ｑβ ＶＬＰの分解：ＰＢＳ(２０ｍＭ リン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５)中の４５ｍｇのＱβ ＶＬＰ(２．５ｍｇ／ｍｌ、ブラッドフォード分析によって決定)を、１０ｍＭのＤＴＴにて、撹拌しながらＲＴで１５分間還元した。その後、塩化マグネシウムを０．７Ｍの終濃度になるまで加え、撹拌しながらＲＴで１５分間インキュベートし、カプセル化された宿主細胞ＲＮＡの沈殿と同時に起こるＶＬＰの崩壊を引き起こした。溶液を４０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心して(以降すべての工程において用いた固定角度のローターＡ-４-６２にて、Eppendorf 5810 R)、溶液から沈殿したＲＮＡを除去した。放出した二量体のＱβコートタンパク質を含む上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるＱβコートタンパク質の精製：二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残留する宿主細胞ＲＮＡを含む、分解反応物の上清を、ＳＰ−セファロースＦＦカラム(ｘｋ１６／２０、６ｍｌ、Amersham Bioscience)に流した。カラムを２０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファ ｐＨ７で平衡化して、試料を水で１：１５に希釈して伝導率を１０ｍＳ／ｃｍ未満に調節してコートタンパク質をカラムに適切に結合させた。結合したコートタンパク質は、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／５００ｍＭ 塩化ナトリウムに勾配することによって溶出を行い、タンパク質はおよそ２５ｍｌの分画体積に回収した。すべての工程において５ｍｌ／分の流速にて室温でクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度をモニターした。第二の工程において、単離されたＱβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)を、２０ｍＭ リン酸ナトリウム／２５０ｍＭ 塩化ナトリウム、ｐＨ７．２にて平衡化したセファクリルＳ−１００ ＨＲカラム(ｘｋ２６／６０、３２０ｍｌ、Amersham Bioscience)に流した。２．５ｍｌ／分の流速にて室温でクロマトグラフィを行い、２６０ｎｍと２８０ｎｍの吸光度をモニターした。５ｍｌの分画を回収した。
分析的サイズ排除クロマトグラフィによる精製されたＱβコートタンパク質の特徴づけ：精製されたＱβコートタンパク質の試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィ(図１Ｃ)によって分析し、i) 大腸菌溶解物から精製して、精製手順の原物質として用いたインタクトなＱβ ＶＬＰ(図４Ａ)、及びii) 分解反応の上清(図４Ｂ)に比較した。コートタンパク質からＲＮＡ分子が効率良く分離されたことは、図４ＣのいずれかのＲＮＡ様ピーク(Ａ２８０／Ａ２６０の典型的な比率＝０．５)の欠如と、固有のタンパク質様ピーク(Ａ２８０／Ａ２６０の典型的な比率＝１．７)の存在によって示される。
ダイアフィルトレーションによるＱβＧ１０の集合：精製されたコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中)を、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ及び凝集されたＧ１０オリゴヌクレオチド(基本的には実施例１に記載のように調製される)の貯蔵液と水に混合した。混合物の体積を５０ｍｌとし、構成成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、１．０Ｍの尿素、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ及び０．２４ｍｇ／ｍｌのＧ１０とした。その後、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)と、１０ｍｌ／分のクロス流速と２．５ｍｌ／分の透過流速を用いて、溶液を３００ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対して室温でダイアフィルトレーションを行った。Ｈ２Ｏ２を７ｍＭの終濃度になるまで加え、溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導した。その後、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)と、１０ｍｌ／分のクロス流速と２．５ｍｌ／分の透過流速を用いて、溶液を５００ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なＨ２Ｏ２とパッケージ化されなかったＧ１０オリゴヌクレオチドを集合体化したＱβＧ１０生成物から取り除いた。
ダイアフィルトレーションによるＱβＧ１０の集合：精製されたコートタンパク質(２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中)を、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ及び凝集されたＧ１０オリゴヌクレオチド(基本的には実施例１に記載のように調製される)の貯蔵液と水に混合した。混合物の体積を５０ｍｌとし、構成成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、１．０Ｍの尿素、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ及び０．２４ｍｇ／ｍｌのＧ１０とした。その後、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)と、１０ｍｌ／分のクロス流速と２．５ｍｌ／分の透過流速を用いて、溶液を３００ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対して室温でダイアフィルトレーションを行った。Ｈ２Ｏ２を７ｍＭの終濃度になるまで加え、溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導した。その後、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)と、１０ｍｌ／分のクロス流速と２．５ｍｌ／分の透過流速を用いて、溶液を５００ｍｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なＨ２Ｏ２とパッケージ化されなかったＧ１０オリゴヌクレオチドを集合体化したＱβＧ１０生成物から取り除いた。
実施例９ ＱβＧ１０パッケージ生成物の分析とパッケージ方法の収率の測定
分析的サイズ排除クロマトグラフィによるパッケージ化されたＱβＧ１０ ＶＬＰの特徴づけ：パッケージ化されたＱβＧ１０ ＶＬＰの試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィ(図５)にて分析して、大腸菌溶解物から精製したインタクトなＱβ ＶＬＰと比較した。前記分析的サイズ排除クロマトグラフィは、以下のパラメータを使用して実行した。
カラム： Ｂｉｏ-Ｓｉｌ ＳＥＣ ２５０、７．８×３００ｍｍ、Cat. No. 125-0062
溶出剤： ５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
勾配： 均一濃度(アイソクラチック)
カラム温度： ２５℃
自動回収装置： ８℃
流速： １．０ｍｌ／分
試料濃度： １．０ｍｇ／ｍｌ タンパク質
注射体積： ４０μｌ
評価波長： ２８０ｎｍ
帯域幅： ４ｎｍ
ランタイム： ２０分
試料調製：
試料は溶出剤を用いて１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、試料を短時間ボルテックスにかけ、４℃で１０分間、１６０００ｇで遠心分離した。
生成物中の正しく集合体化したＶＬＰの存在は、天然のＱβ ＶＬＰを表しているピークと同じ滞留時間にピークが移動していることによって確認した。ＱβＧ１０ ＶＬＰについて観察されたピーク(図５Ｄ)は、ＶＬＰの核酸含量によって左右される。これは、２６０ｎｍの吸収係数核酸がコートタンパク質の吸収係数の１００倍以上であるためである。精製されたＱβＧ１０ ＶＬＰの比率Ａ２６０／Ａ２８０は１．７０(１．６５〜１．７６；ｎ＝５)であることが明らかとなり、これはＧ１０(Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７４)の特徴であり、Ｑβ ＶＬＰのＡ２６０／Ａ２８０比率は１．８７(１．８５〜１．９０；ｎ＝１０)であることが明らかとなり、これはＲＮＡの特徴である。
分析的サイズ排除クロマトグラフィによるパッケージ化されたＱβＧ１０ ＶＬＰの特徴づけ：パッケージ化されたＱβＧ１０ ＶＬＰの試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィ(図５)にて分析して、大腸菌溶解物から精製したインタクトなＱβ ＶＬＰと比較した。前記分析的サイズ排除クロマトグラフィは、以下のパラメータを使用して実行した。
カラム： Ｂｉｏ-Ｓｉｌ ＳＥＣ ２５０、７．８×３００ｍｍ、Cat. No. 125-0062
溶出剤： ５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ
勾配： 均一濃度(アイソクラチック)
カラム温度： ２５℃
自動回収装置： ８℃
流速： １．０ｍｌ／分
試料濃度： １．０ｍｇ／ｍｌ タンパク質
注射体積： ４０μｌ
評価波長： ２８０ｎｍ
帯域幅： ４ｎｍ
ランタイム： ２０分
試料調製：
試料は溶出剤を用いて１．０ｍｇ／ｍｌに希釈し、試料を短時間ボルテックスにかけ、４℃で１０分間、１６０００ｇで遠心分離した。
生成物中の正しく集合体化したＶＬＰの存在は、天然のＱβ ＶＬＰを表しているピークと同じ滞留時間にピークが移動していることによって確認した。ＱβＧ１０ ＶＬＰについて観察されたピーク(図５Ｄ)は、ＶＬＰの核酸含量によって左右される。これは、２６０ｎｍの吸収係数核酸がコートタンパク質の吸収係数の１００倍以上であるためである。精製されたＱβＧ１０ ＶＬＰの比率Ａ２６０／Ａ２８０は１．７０(１．６５〜１．７６；ｎ＝５)であることが明らかとなり、これはＧ１０(Ａ２６０／Ａ２８０＝１．７４)の特徴であり、Ｑβ ＶＬＰのＡ２６０／Ａ２８０比率は１．８７(１．８５〜１．９０；ｎ＝１０)であることが明らかとなり、これはＲＮＡの特徴である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるパッケージ化されたＱβＧ１０ ＶＬＰの特徴付け：パッケージ化されたＱβ Ｇ１０の試料を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(図６)にて分析し、大腸菌溶解物から精製したインタクトなＱβ ＶＬＰと比較した。生成物中の正しく集合体化したＶＬＰの存在は、インタクトなＱβ ＶＬＰと類似する、ジスルフィド結合した五量体型と六量体型のコートタンパク質のバンドの形成によって確認した。このことは、インビトロで集合体化したＱβＧ１０ ＶＬＰのコートタンパク質ユニットが構造的に正しく配位していることを示唆する。
パッケージ化されたオリゴヌクレオチドＧ１０の定量：ＱβＧ１０ ＶＬＰ(ＰＢＳ中に０．２５ｍｇ／ｍｌ)の試料を１ｍＭ ＴＣＥＰ(トリス(２-クロロエチル)フォスフェート)(室温で１５分)にて処理して、ジスルフィド結合を還元した。この還元した試料にＮａＣｌを加え(１Ｍの終濃度)、混合物を６０℃で１５分間インキュベートして、タンパク質成分を沈殿させた。遠心分離の後、結果として生じた上清を９５℃で５分間インキュベートし、１分間氷上で冷却して、その後Ａ２６０値を測定した。上清中のオリゴヌクレオチドＧ１０の濃度は以下の式に従って算出した。
ｃ(Ｇ１０)(ｍｇ／ｍｌ)＝Ａ２６０×１．１２×９６００／３４４５８０：
１．１２＝試料中の塩含量についての補正係数
９６００＝オリゴヌクレオチドＧ１０の分子質量
３４４５８０＝オリゴヌクレオチドＧ１０の特定のモル吸収係数。
一般的に、パッケージ化されたオリゴヌクレオチドＧ１０の量は、Ｑβコートタンパク質１ｍｇにつき０．２ｍｇであった。
ＱβＧ１０ ＶＬＰのＧ１０含量とパッケージ化反応の収率算出：凝集されたＧ１０は、実施例８に記載のように、ＶＬＰの集合体化／再集合体化によってＱβ ＶＬＰにパッケージ化した。９５３ｍｇのＧ１０オリゴヌクレオチドを、４０００ｍｇの精製されたＱβ二量体との再集合体化に用いた。反応により、１００μｇのタンパク質につき２０μｇのＧ１０オリゴヌクレオチドを含むＱβＧ１０が得られた(ブラッドフォード分析又はＨＰＬＣで測定されるタンパク含有量)。タンパク質収率７５％の場合に、パッケージ化反応のＧ１０の収率は６３％であった。
パッケージ化されたオリゴヌクレオチドＧ１０の定量：ＱβＧ１０ ＶＬＰ(ＰＢＳ中に０．２５ｍｇ／ｍｌ)の試料を１ｍＭ ＴＣＥＰ(トリス(２-クロロエチル)フォスフェート)(室温で１５分)にて処理して、ジスルフィド結合を還元した。この還元した試料にＮａＣｌを加え(１Ｍの終濃度)、混合物を６０℃で１５分間インキュベートして、タンパク質成分を沈殿させた。遠心分離の後、結果として生じた上清を９５℃で５分間インキュベートし、１分間氷上で冷却して、その後Ａ２６０値を測定した。上清中のオリゴヌクレオチドＧ１０の濃度は以下の式に従って算出した。
ｃ(Ｇ１０)(ｍｇ／ｍｌ)＝Ａ２６０×１．１２×９６００／３４４５８０：
１．１２＝試料中の塩含量についての補正係数
９６００＝オリゴヌクレオチドＧ１０の分子質量
３４４５８０＝オリゴヌクレオチドＧ１０の特定のモル吸収係数。
一般的に、パッケージ化されたオリゴヌクレオチドＧ１０の量は、Ｑβコートタンパク質１ｍｇにつき０．２ｍｇであった。
ＱβＧ１０ ＶＬＰのＧ１０含量とパッケージ化反応の収率算出：凝集されたＧ１０は、実施例８に記載のように、ＶＬＰの集合体化／再集合体化によってＱβ ＶＬＰにパッケージ化した。９５３ｍｇのＧ１０オリゴヌクレオチドを、４０００ｍｇの精製されたＱβ二量体との再集合体化に用いた。反応により、１００μｇのタンパク質につき２０μｇのＧ１０オリゴヌクレオチドを含むＱβＧ１０が得られた(ブラッドフォード分析又はＨＰＬＣで測定されるタンパク含有量)。タンパク質収率７５％の場合に、パッケージ化反応のＧ１０の収率は６３％であった。
実施例１０ ダイアフィルトレーションによるＱβＧ１０の集合体化と収率の測定
精製されたＱβコートタンパク質は、基本的に実施例８に記載のように得た。２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中のコートタンパク質を、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ及び凝集したＧ１０オリゴヌクレオチド(基本的には実施例１に記載のように調製される；解離したＧ１０の相対的なピークのスタート時間は１３５％とし、凝集したＧ１０の相対的なピークのスタート時間は８８％とした)の貯蔵液と水に混合した。混合物の体積は１．６Ｌとし、構成成分の終濃度は２．５ ｍｇ／ｍｌ コートタンパク質、１．０Ｍ 尿素、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＤＴＴ及び０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ１０とした。その後、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2、０．１ｍ２フィルター領域、Millipore)と、３８４Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と９６Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を９．６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対して室温でダイアフィルトレーションを行った。Ｈ２Ｏ２を２ｍＭの終濃度になるまで加え、溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導した。その後、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2、０．１ｍ２フィルター領域、Millipore)と、３００Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と１００Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を１６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なＨ２Ｏ２とパッケージ化されなかったＧ１０オリゴヌクレオチドを集合体化したＱβＧ１０生成物から取り除いた。生成物は、接線の(tangential)流量濾過によって２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２２μｍフィルターにて濾過した。主な生産工程を表１にまとめる。
精製されたＱβコートタンパク質は、基本的に実施例８に記載のように得た。２０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ７．２、２５０ｍＭ ＮａＣｌ中のコートタンパク質を、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ及び凝集したＧ１０オリゴヌクレオチド(基本的には実施例１に記載のように調製される；解離したＧ１０の相対的なピークのスタート時間は１３５％とし、凝集したＧ１０の相対的なピークのスタート時間は８８％とした)の貯蔵液と水に混合した。混合物の体積は１．６Ｌとし、構成成分の終濃度は２．５ ｍｇ／ｍｌ コートタンパク質、１．０Ｍ 尿素、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＤＴＴ及び０．６ｍｇ／ｍｌ Ｇ１０とした。その後、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2、０．１ｍ２フィルター領域、Millipore)と、３８４Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と９６Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を９．６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対して室温でダイアフィルトレーションを行った。Ｈ２Ｏ２を２ｍＭの終濃度になるまで加え、溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導した。その後、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2、０．１ｍ２フィルター領域、Millipore)と、３００Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と１００Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を１６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なＨ２Ｏ２とパッケージ化されなかったＧ１０オリゴヌクレオチドを集合体化したＱβＧ１０生成物から取り除いた。生成物は、接線の(tangential)流量濾過によって２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２２μｍフィルターにて濾過した。主な生産工程を表１にまとめる。
表１：集合体化のための生産工程の概要とＱβＧ１０の精製。
サイズ排除クロマトグラフィによって分析した生成物の純度は９９．２８％であった、すなわちＱβＧ１０のピークは実施例４に記載のように行ったクロマトグラフィの全体のピーク領域の９９．２８％に達した。タンパク質収率とオリゴヌクレオチド収率は、実施例８に記載のように測定した。全方法全体のタンパク質収率は７５％であった。全方法全体のオリゴヌクレオチド収率は７５％であった。
実施例１１ 集合体化工程に影響するＧ１０の凝集状態
１３９％の相対的なピークのスタート時間を有するＧ１０を実施例８に記載のような集合体化工程に用いる場合には、極わずかな量のＧβＧ１０しか形成されず、ＶＬＰ生成物は単離されない。
１３９％の相対的なピークのスタート時間を有するＧ１０を実施例８に記載のような集合体化工程に用いる場合には、極わずかな量のＧβＧ１０しか形成されず、ＶＬＰ生成物は単離されない。
実施例１２ 分解／再集合体化によるＧ１０のＡＰ２０５及びＧＡ３５５のパッケージ化
分解：５０〜１００ｍｇのＡＰ２０５又はＧＡ３５５のＶＬＰ(ブラッドフォード分析によって測定される)を含むバッファＡ(５ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２)を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＡ(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)とともに３０℃で１６時間インキュベートした。ＡＰ２０５ ＶＬＰの場合、ＲＮアーゼＡとベンゾナーゼを加える前に２０ｍＭ ＤＴＴを加えて、３７℃で３０分間インキュベートすることによって内部ジスルフィド架橋の脱酸化を行った。１Ｍ ＮａＣｌを加えた後、７０℃で１５分間インキュベートすることによってウイルスコートタンパク質の沈殿を誘導した。２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心して、沈殿したコートタンパク質を堆積させた。ＲＮアーゼＡ、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を廃棄した。ペレットをバッファＢ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、６Ｍ 尿素)に再懸濁して、室温で１０分インキュベートした。
陽イオン交換クロマトグラフィによるコートタンパク質の精製：溶液を２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して清浄化した。ごくわずかなペレットを廃棄した。そして、分解したコートタンパク質を含有する上清を、バッファＢ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、６Ｍ 尿素)にて平衡化したＳＰセファロースＴＭ ＦＦカラム(１６／２０、Amersham Biosciences)にアプライした。流れ出たものは廃棄した。バッファＢ(１５ＣＶ)にて十分に洗浄した後、カラムを、３７．５ＣＶの勾配幅のバッファＢからバッファＣ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、１Ｍ 尿素)への直線的な濃度勾配によって調整した。負荷、洗浄及び溶出の間、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。バッファＤ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６.５、１Ｍ 尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ)にて一分画としてコートタンパク質を溶出し、ＬＤＳ−ＰＡＧＥの後にクーマシー染色をすることによって分析した。溶出したタンパク質分画を「分解したコートタンパク質」として保存した。タンパク質濃度はブラッドフォード分析にて測定した。
分解：５０〜１００ｍｇのＡＰ２０５又はＧＡ３５５のＶＬＰ(ブラッドフォード分析によって測定される)を含むバッファＡ(５ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２)を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＡ(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)とともに３０℃で１６時間インキュベートした。ＡＰ２０５ ＶＬＰの場合、ＲＮアーゼＡとベンゾナーゼを加える前に２０ｍＭ ＤＴＴを加えて、３７℃で３０分間インキュベートすることによって内部ジスルフィド架橋の脱酸化を行った。１Ｍ ＮａＣｌを加えた後、７０℃で１５分間インキュベートすることによってウイルスコートタンパク質の沈殿を誘導した。２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心して、沈殿したコートタンパク質を堆積させた。ＲＮアーゼＡ、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を廃棄した。ペレットをバッファＢ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、６Ｍ 尿素)に再懸濁して、室温で１０分インキュベートした。
陽イオン交換クロマトグラフィによるコートタンパク質の精製：溶液を２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して清浄化した。ごくわずかなペレットを廃棄した。そして、分解したコートタンパク質を含有する上清を、バッファＢ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、６Ｍ 尿素)にて平衡化したＳＰセファロースＴＭ ＦＦカラム(１６／２０、Amersham Biosciences)にアプライした。流れ出たものは廃棄した。バッファＢ(１５ＣＶ)にて十分に洗浄した後、カラムを、３７．５ＣＶの勾配幅のバッファＢからバッファＣ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、１Ｍ 尿素)への直線的な濃度勾配によって調整した。負荷、洗浄及び溶出の間、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターした。バッファＤ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６.５、１Ｍ 尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ)にて一分画としてコートタンパク質を溶出し、ＬＤＳ−ＰＡＧＥの後にクーマシー染色をすることによって分析した。溶出したタンパク質分画を「分解したコートタンパク質」として保存した。タンパク質濃度はブラッドフォード分析にて測定した。
再集合体化：精製したＡＰ２０５又はＧＡ３５５コートタンパク質を、Ｇ１０オリゴヌクレオチドに５倍過剰(ｗ／ｗ)で用いた。コートタンパク質を、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴを含む再集合体化バッファ中のＧ１０オリゴヌクレオチドと混合して、室温で１時間インキュベートした。インキュベートの後、再集合体化混合物を５リットルのＰＢＳに対して２４時間透析した。結果として生じる懸濁液を２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離した。ごくわずかなペレットを廃棄した。上清には再集合化してパッケージ化されたＶＬＰが含まれた。タンパク質濃度をブラッドフォード分析で測定し、再集合化してパッケージ化されたＶＬＰを遠心フィルター装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)にて濃縮した。
再集合化してパッケージ化されたＶＬＰの精製：２５ｍｇ以下の総タンパクをＰＢＳにて平衡化したセファロースＴＭ ＣＬ-４Ｂ(２６／６０、Amersham Biosciences)に流した。１．２５ｍｌ／分の流速の室温の平衡化バッファにてサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出の間、２５４ｎｍと２６０ｎｍの吸光度をモニターした。２つのピークを単離した。主要な高分子量のピークは、それよりも低い見かけの分子量の小さいピークに先行した。主要なピークは、ＳＥ−ＨＰＬＣで示すように、精製されたＶＬＰに一致する見かけの分子量を示した。基本的には国際公開０３／０２４４８１(ｐ．１３１ｆｆ)の実施例１６に示されるように、Ｇ１０オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＡＰ２０５又はＧＡ３５５のＶＬＰの分析を行った。
再集合化してパッケージ化されたＶＬＰの精製：２５ｍｇ以下の総タンパクをＰＢＳにて平衡化したセファロースＴＭ ＣＬ-４Ｂ(２６／６０、Amersham Biosciences)に流した。１．２５ｍｌ／分の流速の室温の平衡化バッファにてサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出の間、２５４ｎｍと２６０ｎｍの吸光度をモニターした。２つのピークを単離した。主要な高分子量のピークは、それよりも低い見かけの分子量の小さいピークに先行した。主要なピークは、ＳＥ−ＨＰＬＣで示すように、精製されたＶＬＰに一致する見かけの分子量を示した。基本的には国際公開０３／０２４４８１(ｐ．１３１ｆｆ)の実施例１６に示されるように、Ｇ１０オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＡＰ２０５又はＧＡ３５５のＶＬＰの分析を行った。
実施例１３ 分解／再集合体化によるＧ１０のＦＲ ＶＬＰのパッケージ化
分解：５０〜１００ｍｇのＦＲ ＶＬＰ(ブラッドフォード分析によって測定される)を含むバッファＡ(５ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２)を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＡ(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)とともに３０℃で１６時間インキュベートする。１Ｍ ＮａＣｌを加えた後、７０℃で１５分間インキュベートすることによってＦＲコートタンパク質の沈殿を誘導する。２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心して、沈殿したコートタンパク質を堆積させる。ＲＮアーゼＡ、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を廃棄する。ペレットをバッファＢ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、６Ｍ 尿素)に再懸濁して、室温で１０分インキュベートする。
陽イオン交換クロマトグラフィによるＦＲコートタンパク質の精製：溶液を２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して清浄化する。ごくわずかなペレットを廃棄し、分解したコートタンパク質を含有する上清を、バッファＢにて平衡化したＳＰセファロースＴＭ ＦＦカラム(１６／２０、Amersham Biosciences)にアプライする。流れ出たものは廃棄する。バッファＢ(１５ＣＶ)にて十分に洗浄した後、カラムを、３７．５ＣＶの勾配幅のバッファＢからバッファＣ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、１Ｍ 尿素)への直線的な濃度勾配によって調整する。負荷、洗浄及び溶出の間、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターする。バッファＤ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６.５、１Ｍ 尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ)にて一分画としてＦＲコートタンパク質を溶出し、ＬＤＳ−ＰＡＧＥの後にクーマシー染色をすることによって分析する。溶出したタンパク質分画を「分解したコートタンパク質」として４℃で保存する。タンパク質濃度はブラッドフォード分析にて測定する。
分解：５０〜１００ｍｇのＦＲ ＶＬＰ(ブラッドフォード分析によって測定される)を含むバッファＡ(５ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６．８、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２)を、それぞれ１ｍｇ／ｍｌ及び５Ｕ／ｍｌのＲＮアーゼＡ(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)とともに３０℃で１６時間インキュベートする。１Ｍ ＮａＣｌを加えた後、７０℃で１５分間インキュベートすることによってＦＲコートタンパク質の沈殿を誘導する。２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心して、沈殿したコートタンパク質を堆積させる。ＲＮアーゼＡ、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を廃棄する。ペレットをバッファＢ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、６Ｍ 尿素)に再懸濁して、室温で１０分インキュベートする。
陽イオン交換クロマトグラフィによるＦＲコートタンパク質の精製：溶液を２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離して清浄化する。ごくわずかなペレットを廃棄し、分解したコートタンパク質を含有する上清を、バッファＢにて平衡化したＳＰセファロースＴＭ ＦＦカラム(１６／２０、Amersham Biosciences)にアプライする。流れ出たものは廃棄する。バッファＢ(１５ＣＶ)にて十分に洗浄した後、カラムを、３７．５ＣＶの勾配幅のバッファＢからバッファＣ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ７．２、１Ｍ 尿素)への直線的な濃度勾配によって調整する。負荷、洗浄及び溶出の間、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍの吸光度をモニターする。バッファＤ(２０ｍＭ ＮａＰＯ４ ｐＨ６.５、１Ｍ 尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌ)にて一分画としてＦＲコートタンパク質を溶出し、ＬＤＳ−ＰＡＧＥの後にクーマシー染色をすることによって分析する。溶出したタンパク質分画を「分解したコートタンパク質」として４℃で保存する。タンパク質濃度はブラッドフォード分析にて測定する。
再集合体化：精製したＦＲコートタンパク質を、Ｇ１０オリゴヌクレオチドに５倍過剰(ｗ／ｗ)で用いる。ＦＲコートタンパク質を、１Ｍ 尿素及び２．５ｍＭ ＤＴＴを含む再集合体化バッファ中のＧ１０オリゴヌクレオチドと混合して、室温で１時間インキュベートする。インキュベートの後、再集合体化混合物を５リットルのＰＢＳに対して２４時間透析する。結果として生じる懸濁液を２７０００ｇにて４℃で１０分間遠心分離する。ごくわずかなペレットを廃棄する。上清には再集合化してパッケージ化されたＦＲ ＶＬＰが含まれる。タンパク質濃度をブラッドフォード分析で測定し、再集合化してパッケージ化されたＦＲ ＶＬＰを遠心フィルター装置(Amicon Ultra 15, 10K MWCO)にて濃縮する。
再集合化してパッケージ化されたＦＲ ＶＬＰの精製：２５ｍｇ以下の総タンパクをＰＢＳにて平衡化したセファロースＴＭ ＣＬ-４Ｂ(２６／６０、Amersham Biosciences)に流す。１．２５ｍｌ／分の流速の室温の平衡化バッファにてサイズ排除クロマトグラフィを行う。溶出の間、２５４ｎｍと２６０ｎｍの吸光度をモニターする。２つのピークを単離する。主要な高分子量のピークは、それよりも低い見かけの分子量の小さいピークに先行する。主要なピークは、ＳＥ−ＨＰＬＣで示すように、精製されたＦＲ ＶＬＰに一致する見かけの分子量を示した。基本的には国際公開０３／０２４４８１(ｐ. １３１ｆｆ)の実施例１６に示されるように、Ｇ１０オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＦＲ ＶＬＰの分析を行う。
再集合化してパッケージ化されたＦＲ ＶＬＰの精製：２５ｍｇ以下の総タンパクをＰＢＳにて平衡化したセファロースＴＭ ＣＬ-４Ｂ(２６／６０、Amersham Biosciences)に流す。１．２５ｍｌ／分の流速の室温の平衡化バッファにてサイズ排除クロマトグラフィを行う。溶出の間、２５４ｎｍと２６０ｎｍの吸光度をモニターする。２つのピークを単離する。主要な高分子量のピークは、それよりも低い見かけの分子量の小さいピークに先行する。主要なピークは、ＳＥ−ＨＰＬＣで示すように、精製されたＦＲ ＶＬＰに一致する見かけの分子量を示した。基本的には国際公開０３／０２４４８１(ｐ. １３１ｆｆ)の実施例１６に示されるように、Ｇ１０オリゴヌクレオチドをパッケージ化したＦＲ ＶＬＰの分析を行う。
実施例１４ ダイアフィルトレーションによるＱβＧ８の集合体化と収率の測定
精製したＱβコートタンパク質は基本的に実施例８に記載のように得る。コートタンパク質を含む２０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．２、２５０ｍＭ ＮａＣｌを、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ及び凝集されたＧ８オリゴヌクレオチドの貯蔵液と水に混合する(基本的には実施例３に記載のように調製される；解離したＧ８の相対的なピークのスタート時間は１１３％とし、凝集したＧ８の相対的なピークのスタート時間は８８％とする)。混合物の体積を１．６Ｌとし、構成成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、１．０Ｍの尿素、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ及び０．２４ｍｇ／ｍｌのＧ８とする。その後、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2, ０．１ｍ２フィルター領域, Millipore)と、３８４Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と９６Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を９．６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対して室温でダイアフィルトレーションを行う。Ｈ２Ｏ２を２ｍＭの終濃度になるまで加え、溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導する。その後、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2, ０．１ｍ２フィルター領域, Millipore)と、３００Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と１００Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を１６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なＨ２Ｏ２とパッケージ化されなかったＧ８オリゴヌクレオチドを集合体化したＱβＧ８生成物から取り除く。生成物は、接線の(tangential)流量濾過によって２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２２μｍフィルターにて濾過する。
精製したＱβコートタンパク質は基本的に実施例８に記載のように得る。コートタンパク質を含む２０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．２、２５０ｍＭ ＮａＣｌを、尿素、ＮａＣｌ、ＤＴＴ及び凝集されたＧ８オリゴヌクレオチドの貯蔵液と水に混合する(基本的には実施例３に記載のように調製される；解離したＧ８の相対的なピークのスタート時間は１１３％とし、凝集したＧ８の相対的なピークのスタート時間は８８％とする)。混合物の体積を１．６Ｌとし、構成成分の終濃度は１ｍｇ／ｍｌのコートタンパク質、１．０Ｍの尿素、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ及び０．２４ｍｇ／ｍｌのＧ８とする。その後、３０ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2, ０．１ｍ２フィルター領域, Millipore)と、３８４Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と９６Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を９．６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム ２５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対して室温でダイアフィルトレーションを行う。Ｈ２Ｏ２を２ｍＭの終濃度になるまで加え、溶液を室温で１時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導する。その後、３００ｋＤａのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2, ０．１ｍ２フィルター領域, Millipore)と、３００Ｌ／(ｈ×ｍ２)のクロス流速と１００Ｌ／(ｈ×ｍ２)の透過流速を用いて、溶液を１６Ｌの２０ｍＭ リン酸ナトリウム １５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なＨ２Ｏ２とパッケージ化されなかったＧ８オリゴヌクレオチドを集合体化したＱβＧ８生成物から取り除く。生成物は、接線の(tangential)流量濾過によって２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、０．２２μｍフィルターにて濾過する。
Claims (16)
- オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、
(a) 少なくとも一つのポリＧ伸展を含むオリゴヌクレオチドを溶液Ｉに準備する工程、このとき該溶液Ｉはアルカリ性ｐＨを有し、
(b) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、
(i) 温度Ｉに溶液Ｉの温度を調節する、 該温度Ｉは４〜７０℃であり、
(ii) 該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を１１０％より上になるまで、該温度Ｉにて該溶液Ｉ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iii) 温度ＩＩに該溶液Ｉの温度を調整する、該温度ＩＩは０〜７０℃であり、
(c) ｐＨ５〜８に該溶液ＩのｐＨを調整する工程、そして、
(d) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、
(i) ｐＨ５〜８であり、少なくとも２０ｍＭの陽イオンを含む溶液ＩＩに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき該陽イオンはＮａ＋、Ｋ＋、ＮＨ４ ＋、Ｌｉ＋、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋からなる群から選択されるものであり、
(ii) 温度ＩＩＩに溶液ＩＩの温度を調整する、 該温度ＩＩＩは５０〜９９℃であり、
(iii) 該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間になるまで、該温度ＩＩＩにて該溶液ＩＩ中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iv) 温度ＩＶに溶液ＩＩの温度を調整する、該温度ＩＶは５０℃未満である、
を含む方法であって、相対的なピークのスタート時間がバクテリオファージＱβのキャプシドと比較したサイズ排除ＨＰＬＣにより測定されるものである方法。 - 前記溶液Ｉの温度を温度ＩＩに調節する工程が、少なくとも３．６℃／分の温度勾配で行われ、及び／又は、該溶液ＩＩの温度を温度ＩＶに調節する工程が、少なくとも３．６℃／分の温度勾配で行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記溶液Ｉが、アルカリ金属の水酸化物を含む、請求項１又は２に記載の方法。
- 前記陽イオンがＮａ＋又はＫ ＋ である、請求項１から３のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液Ｉの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、５０μＭ〜２ｍＭである、請求項１から４のいずれか一に記載の方法。
- 温度ＩＩＩにて溶液ＩＩ中で前記オリゴヌクレオチドをインキュベートする工程が、前記オリゴヌクレオチドが８０〜９５％の相対的なピークのスタート時間になるまで行われる、請求項１から５のいずれか一に記載の方法であって、相対的なピークのスタート時間がバクテリオファージＱβのキャプシドと比較したサイズ排除ＨＰＬＣにより測定されるものである方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、その５'末端に少なくとも３、最大１５のグアノシン体と、その３'末端に少なくとも３、最大の１５グアノシン体を含む、請求項１から６のいずれか一に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、
(a) 「Ｇ４−４」GGGGGACGATCGTCGGGG (配列番号：２)、
(b) 「Ｇ５−５」GGGGGGACGATCGTCGGGGG (配列番号：３)、
(c) 「Ｇ６−６」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号：４)、
(d) 「Ｇ７−７」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (配列番号：５)、
(e) 「Ｇ８−８」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号：６)、
(f) 「Ｇ９−９」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (配列番号：７)、
(g) 「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号：８)、
(h) 「Ｇ１１」GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (配列番号：９)
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１から７のいずれか一に記載の方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「Ｇ１０」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号：８)を含む、請求項１から８のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチド組成物であって、該ヌクレオチド組成物が請求項１から９のいずれか一に記載の方法によって取得され、該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を有する、ヌクレオチド組成物であって、相対的なピークのスタート時間がバクテリオファージＱβのキャプシドと比較したサイズ排除ＨＰＬＣにより測定されるものである組成物。
- (i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、
(i) このとき、該オリゴヌクレオチドが少なくとも一つのポリＧ伸展を含み、そして、
(ii) このとき、該オリゴヌクレオチドが５０〜１１０％の相対的なピークのスタート時間を有するものであり、
(c) 混合物を生成する工程、このとき該混合物が以下を含有してなるものであり、
(i) 前記コートタンパク質、
(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤、
(iii) 前記オリゴヌクレオチド
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法であって、相対的なピークのスタート時間がバクテリオファージＱβのキャプシドと比較したサイズ排除ＨＰＬＣにより測定されるものである方法。 - (i) ＲＮＡバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該ＲＮＡバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) 請求項１０に記載のヌクレオチド組成物を準備する工程、
(c) 混合物を生成する工程、このとき該混合物が以下を含有してなるものであり、
(i) 前記コートタンパク質、
(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤、
(iii) 前記オリゴヌクレオチド
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。 - 前記コートタンパク質が、ＲＮＡバクテリオファージの組み換えタンパクを含み、前記ＲＮＡバクテリオファージが、
(a) バクテリオファージＱβ、
(b) バクテリオファージＲ１７，
(c) バクテリオファージｆｒ、
(d) バクテリオファージＧＡ、
(d) バクテリオファージＳＰ、
(e) バクテリオファージＭＳ２、
(f) バクテリオファージＭ１１、
(g) バクテリオファージＭＸ１、
(h) バクテリオファージＮＬ９５、
(i) バクテリオファージｆ２、
(j) バクテリオファージＰＰ７、及び
(k) バクテリオファージＡＰ２０５
からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の方法。 - 前記ＲＮＡバクテリオファージがＱβであり、前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドと前記コートタンパク質のモル比が、０．５〜１．２である、請求項１１又は１２に記載の方法。
- 前記コートタンパク質が、
(a) 配列番号：１０(ＱβＣＰ)；
(b) 配列番号：１０と配列番号：１１の混合物(Ｑβ Ａ１タンパク質)；
(c) 配列番号：１２(Ｒ１７コートタンパク質)；
(d) 配列番号：１３(ｆｒコートタンパク質)；
(e) 配列番号：１４(ＧＡコートタンパク質)；
(f) 配列番号：１５(ＳＰコートタンパク質)；
(g) 配列番号：１５と配列番号：１６の混合物；
(h) 配列番号：１７(ＭＳ２コートタンパク質)；
(i) 配列番号：１８(Ｍ１１コートタンパク質)；
(j) 配列番号：１９(ＭＸ１コートタンパク質)；
(k) 配列番号：２０(ＮＬ９５コートタンパク質)；
(l) 配列番号：２１(ｆ２コートタンパク質)；
(m) 配列番号：２２(ＰＰ７コートタンパク質)；及び、
(n) 配列番号：２３(ＡＰ２０５コートタンパク質)
からなる群から選択される配列を含む、請求項１１又は１２に記載の方法。 - タンパク質収率が少なくとも７５％であり、及び／又はオリゴヌクレオチド収率が少なくとも７５％である、請求項１１から１５のいずれか一に記載の方法。
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