KR20090016634A - 올리고뉴클레오티드를 ｒｎａ 박테리오파지의 바이러스-유사 입자로 패키징하는 방법 - Google Patents

올리고뉴클레오티드를 ｒｎａ 박테리오파지의 바이러스-유사 입자로 패키징하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090016634A
KR20090016634A KR1020097000353A KR20097000353A KR20090016634A KR 20090016634 A KR20090016634 A KR 20090016634A KR 1020097000353 A KR1020097000353 A KR 1020097000353A KR 20097000353 A KR20097000353 A KR 20097000353A KR 20090016634 A KR20090016634 A KR 20090016634A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
seq
coat protein
bacteriophage
temperature
Prior art date
Application number
KR1020097000353A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101552227B1 (ko
Inventor
마티아스 킨즐러
칼 프로바
Original Assignee
사이토스 바이오테크놀로지 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2006/069734 external-priority patent/WO2007068747A1/en
Application filed by 사이토스 바이오테크놀로지 아게 filed Critical 사이토스 바이오테크놀로지 아게
Publication of KR20090016634A publication Critical patent/KR20090016634A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101552227B1 publication Critical patent/KR101552227B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/00034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18123—Virus like particles [VLP]

Abstract

본 발명은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 언급된 방법에 사용하기에 적합한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 뉴클레오티드 조성물 및 이의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 여기에서 상기 조성물은 본 발명의 방법에 수득될 수 있으며, 상기 조성물은 적어도 98%, 가장 바람직하게 적어도 99%의 순도를 포함한다.

Description

올리고뉴클레오티드를 ＲＮＡ 박테리오파지의 바이러스-유사 입자로 패키징하는 방법{PROCESSES FOR PACKAGING OLIGONUCLEOTIDES INTO VIRUS-LIKE PARTICLES OF RNA BACTERIOPHAGES}
본 발명은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된(packaged) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 언급된 방법에 사용하기에 적합한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 본 발명의 방법으로 수득될 수 있는 뉴클레오티드 조성물 및 이의 용도를 추가로 제공한다. 본 발명은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 추가로 제공하며, 여기에서 상기 조성물은 본 발명의 방법으로 수득될 수 있으며, 상기 조성물은 바람직하게 적어도 98%, 가장 바람직하게 적어도 99%의 순도를 포함한다.
올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자는 면역계의 강력한 자극제이며(WO2003/024481A2), 현대 백신 치료에 널리 사용된다. (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 예를 들어, 제 WO2003/024481A2호, 제 WO2004/000351A1호, 제 WO2004/084940A1호 및 제 WO2004/007538A2호에 기술되었다. 재조합 바이러스-유사 입자의 디스어셈블리(disassembly), 코트 단백질의 정제, 핵산의 존재 하에서 상기 코트 단백질의 리어셈블리(reassembly)에 기초한 방법이 가장 통상적으로 사용된다. RNA 박테리오파지의 재조합 바이러스-유사 입자의 효율적이고 대량화 가능한(scalable)생산 방법이 제 WO2005/117963A1호에 개시되었다. 엔도톡신이 없는 온전한 바이러스-유사 입자를 대량 정제하기 위한 방법은 제 WO2007/039552A1호에 개시되었다. 재조합적으로 생산된 바이러스 유사 입자로부터 코트 단백질을 제조하는 방법("디스어셈블리")은 특히 제 WO2003/024481A2호 및 본 출원의 실시예 섹션에서 개시되었다. 종래에 기술된 핵산의 존재 하에서 코트 단백질을 어셈블리하는 방법("리어셈블리")은 어셈블리된 산물의 효능, 확장성 및 순도에 대하여 최적이 아니다. 특히, 종래 기술은 "리어셈블리" 방법의 효능이 특정 입자 크기를 포함하는 응집된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상당히 개선될 수 있음을 개시하지 않았다(본원에서 상대 피크 시작 시간으로 특성화, 하기 참조). 본 출원은 매우 높은 순도의 패키징 산물을 유발하는 상당히 증진된 효능을 지닌 "리어셈블리" 방법을 제공한다. 전형적이며 바람직하게, 본원에 개시된 "리어셈블리" 방법은 적어도 약 75%의 단백질 수율 및 올리고뉴클레오티드 수율을 포함하고, 전형적이며 바람직하게 적어도 99% 순도인 산물(올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물)을 생성한다.
발명의 요약
본 발명은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법 도중에, 상기 바이러스-유사 입자가 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질의 자기(self)-어셈블리에 의하여 형성된다. 코트 단백질의 자기 어셈블리가 응집된 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 수행되는 경우 방법의 효능이 상당히 개선될 수 있는 것을 놀랍게도 발견하였다. 일반적으로, 적어도 하나의 폴리 G 스트레치(stretch)를 포함하는 올리고뉴클레오티드는 응집이 가능하다. 올리고뉴클레오티드의 응집 상태는 표준으로서 상기 RNA 박테리오파지의 캡시드를 사용하여 크기 배제 HPLC에서의 상대 피크 시작 시간에 의해 특성화될 수 있다. 50 내지 110%, 바람직하게 80 내지 95%의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 최적인 것으로 관찰되었다. 이는 상기 RNA 박테리오파지의 캡시드의 겉보기 분자량의 범위이거나 이보다 약간 적은 겉보기 분자량을 포함하는 올리고뉴클레오티드 응집체에 상응한다. 바람직한 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드를 응집 과정에 적용하여 수득될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일면은 바람직하게 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법이며, 이 방법은: (a) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하는 올리고뉴클레오 티드를 용액 II 중에 제공하는 단계(여기에서 상기 용액 II는 5 내지 8의 pH를 포함하며; 양이온을 포함하고, 바람직하게 상기 용액 II 중에 상기 양이온의 농도는 적어도 20 mM이고, 여기에서 양이온은 바람직하게 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 + 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택됨); (b) 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 III은 50 내지 99℃임); (c) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 용액 II 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 인큐베이션하는 단계; 및 (d) 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 IV는 50℃ 미만임)를 포함하며; 여기에서 상기 단계들은 바람직하게 주어진 순서로 수행된다.
상기 코트 단백질의 자기 어셈블리는 올리고뉴클레오티드 제제가 최적의 입자 크기 및 좁은 크기 분포를 포함하는 응집체를 포함하는 경우 가장 효율적이다. 더욱 놀랍게도, 올리고뉴클레오티드가 응집 단계 전에 분해 단계에 주어지는 경우,올리고뉴클레오티드의 응집체 상태가 더욱 효율적으로 조절될 수 있고, 이 올리고뉴클레오티드 제제가 더 좁은 크기 분포를 갖는 것이 관찰되었다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 하나를 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 두번째 면은 바람직하게 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법이며, 상기 방법은: (a) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 알칼리성 pH를 갖는 용액 I 중에 제공하는 단계; (b) (i) 용액 I의 온도를 온도 I로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 I은 4 내지 70℃임), (ii) 상기 올리고뉴클레오티드가 110 % 초과의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 온도 I에서 상기 용액 I 중에 인큐베이션하는 단계, (iii) 상기 용액 I의 온도를 온도 II(여기에서 상기 온도 II는 0 내지 70 ℃임)로 조정하는 단계를 포함하여, 상기 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계; (c) 상기 용액 I의 pH를 pH 5 내지 8로 조정하는 단계; 및 (d) (i) 상기 올리고뉴클레오티드를 용액 II 중에 제공하는 단계(여기에서 상기 용액 II는 pH 5 내지 8 및 양이온을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 용액 II 중에 상기 양이온의 농도가 적어도 20 mM이며, 여기에서 바람직하게 상기 양이온은 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 + 및 Mg2+로 구성된 군에서 선택됨); (ii) 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 III은 50 내지 99℃임); (iii) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 IV는 50 ℃ 미만임);를 포함하여, 상기 올리고뉴클레오티드를 응집하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 단계들은 바람직하게 주어진 순서로 수행된다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 세번째 면은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물이며, 여기에서 상기 뉴클레오티드 조성물은 상기 기술된 방법 중 임의의 것에 의 해 수득할 수 있으며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함한다. 상기 뉴클레오티드 조성물은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 네번째 면은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며, 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제공하는 단계(여기에서, 상기 뉴클레오티드 조성물은 본 발명의 첫번째 및 두번째 면의 방법 중 임의의 것에 의해 수득될 수 있는 뉴클레오티드 조성물임); (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기 어셈블되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다섯번째 면은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며, 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) (i) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하며; (ii) 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기-어셈블되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 여섯번째 면은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며, 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) (i) 올리고뉴클레오티드를 용액 II 중에 제공하는 단계(여기에서 상기 용액 II는 pH 5 내지 8 및 양이온을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 용액 II 중에 양이온의 농도가 적어도 20 mM이며, 여기에서 바람직하게 상기 양이온은 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 + 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택됨); (ii) 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 III은 50 내지 99℃임); 및 (iii) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 IV는 50 ℃ 미만임)를 포함하며, 바람직하게 단계 (i) 내지 (iv)를 주어진 순서로 수행하여, 바람직하게 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기-어셈블되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일곱번째 면은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법이며, 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) (i) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 알칼리성 pH를 갖는 용액 I 중에 제공하는 단계; (ii) (1) 용액 I의 온도를 온도 I로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 I은 4 내지 70 ℃임); (2) 상기 올리고뉴클레오티드가 110% 초과의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 온도 I에서 상기 용액 I 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (3) 상기 용액 I의 온도를 온도 II로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 II는 0 내지 70℃임)를 포함하여 상기 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계; (iii) 상기 용액 I의 pH를 pH 5 내지 8로 조정하는 단계; 및 (iv) (1) 상기 올리고뉴클레오티드를 용액 II 중에 제공하는 단계(여기에서 상기 용액 II는 pH 5 내지 8 및 양이온을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 용액 II 중에 양이온의 농도가 적어도 20 mM이며, 여기에서 바람직하게 상기 양이온은 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 + 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택됨); (2) 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계(여기에서 상기 온 도 III은 50 내지 99℃임); (3) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (4) 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 IV는 50 ℃ 미만임)를 포함하여, 상기 올리고뉴클레오티드를 응집하는 단계를 포함하며, 단계 (i) 내지 (iv)를 바람직하게 주어진 순서로 수행하여, 바람직하게 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기 어셈블되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
본 발명의 여덟번째 면은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법에서, 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의하여 수득될 수 있는 뉴클레오티드 조성물의 용도이다.
본 발명의 아홉번째 면은 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의하여 수득될 수 있는 조성물이며, 상기 조성물은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 바람직하게 상기 RNA 박테리오파지는 Qβ이고, 여기에서, 더욱 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 G8-8 (서열 번호 6) 또는 G1O (서열 번호 8), 바람직하게는 G1O (서열 번호 8)이며, 여기에서 더더욱 바람직하게 상기 조성물의 순도는 적어도 98%, 더욱 바람직하게 적어도 99% 및 가장 바람직하게 적어도 99.2%이다.
도 1: Qβ 캡시드 표준 (상부) 및 응집된 G10 (하부)의 크기 배제 HPLC 크로마토그램 . HPLC를 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. 표준의 체류 시간은 8.532 분이었으며, 응집된 G10의 피크 시작 시간은 7.510 분이었다. 이에 따라, 응집된 G10의 상대 피크 시작 시간은 88 %이었다 (7.510 분 / 8.532 분 * 100).
도 2: 미처리된 G10 , 응집된 올리고뉴클레오티드 G10 및 Qβ 캡시드 표준의 크기 배제 HPLC 크로마토그램 . HPLC를 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행하였다. (A) 응집 전에 분리 처리를 하지 않은 응집된 G10은 Qβ 캡시드와 동등하거나 이보다 더 높은 겉보기 분자량을 나타내었다(A, 박스 2). 상대 피크 시작 시간은 약 75%이었다. (B) 실시예 1에 기술된 바와 같이 응집 전에 분리 처리를 한 응집된 G10은 Qβ 캡시드보다 더 낮은 겉보기 분자량을 가졌다(B, 박스 2). 상대 피크 시작 시간은 약 88%였다.
도 3: 미처리, 분리 및 응집된 G10 올리고뉴클레오티드 및 G10 과 함께 패킹된( packed ) 리어셈블 VLP 의 CD 스펙트럼. 22.5 μM의 올리고뉴클레오티드 농도를 사용하여 스펙트럼을 기록하고, 이후에 표준화하였다. 표준화를 위하여, Θ = 100 X CD 신호 [mdeg] / L [cm] X c [mM]에 따라, 타원율(ellipticity)을 계산하였다.
도 4: 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제된 Qβ 코트 단백질의 특성. (A) 정제된 Qβ VLP의 샘플. 260 nm에서 RNA의 흡광 계수가 코트 단백질의 흡광 계수보다 약 100 배 더 높기 때문에, 관찰된 피크 (A260/A280 비 = 2)는 VLP의 RNA 코어에 의해 조절된다. (B) 디어셈블리 반응의 상층액의 샘플. 방출된 코트 단백질은 약 12분에 단백질-유사 피크의 존재에 의하여 표시된다. 또한, 비-침전 RNA 분자의 일부 종이 6.8 내지 11 분의 범위에 존재한다. (C) 정제된 Qβ 코트 단백질의 샘플. 컬럼 TSK G5000PWx1 (Tosoh Bioscience)에서, PBS 중에 분석을 수행하였다.
도 5: (A) 본래 Qβ VLP , (D) Qβ G1O VLP 및 패키징 성분 (B) 올리고 뉴클레오티드 G1O 및 (C) Qβ 코트 단백질의 분석적 크기 배제 크로마토그래피. 260 nm에서 G10의 흡광 계수가 코트 단백질의 흡광 계수보다 약 130 배 더 높기 때문에, QβG1O VLP (D) (A260/A280 비 = 1.74)에 대하여 관찰된 피크는 VLP의 G10 코어에 의하여 조절된다. 컬럼 TSK G5000PWx1 (Tosoh Bioscience)에서, PBS 중에 분석을 수행하였다.
도 6: 본래 Qβ VLP 및 시험관 내 어셈블된 Qβ G1O 의 비-환원성 SDS - PAGE 분 석. 코트 단백질 펜타머 및 헥사머의 위치를 나타내었다 ((a) 분자량 마커, (b) Qβ VLP, (c) Qβ G10).
명백하게 달리 명시되지 않는다면, 다음에 기술된 정의 및 구체예는 본 발명의 일면 및 구체예, 특히 방법, 조성물, 뉴클레오티드 조성물 및 용도 중 임의의 것에 적용가능하다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 분야의 숙련자에게 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다.
"올리고뉴클레오티드": 본원에 사용되는 용어 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥의 데옥시리보뉴클레오티드를 말한다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 하기에서 정의되는 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함한다. 더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 상기 폴리 G 스트레치를 포함한다. 매우 바람직한 올리고뉴클레오티드는 정확히 두개의 폴리 G 스트레치를 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 두개의 폴리 G 스트레치 중 하나가 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단에 위치한다. 더더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 정확히 두개의 폴리 G 스트레치를 포함하며, 여기에서 상기 두개의 폴리 G 스트레치 중 하나가 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 위치하며, 상기 두개의 폴리 G 스트레치 중 하나는 상기 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 위치한다. 전형적이며 바람직하게, 본원에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 6 내지 1000개, 바람직하게 10 내지 1000개, 더욱 바람직하게 10 내지 200개, 더더욱 바람직하게 10 내지 100개, 보다 바람직하게 20 내지 40개 및 가장 바람직하게는 30 개 뉴클레오티드로 구성된다. 더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오티드로 구성된다. 더더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 24 내지 32개 뉴클레오티드로 구성되며, 더욱 바람직하게 약 30개 뉴클레오티드로 구성된다.
용어 올리고뉴클레오티드는 또한 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 분자를 말하며, 여기에서, 바람직하게 상기 변형된 뉴클레오티드는 (a) 뉴클레오티드 유사체, 또는 (b) 백본(backbone) 변형을 포함하는 뉴클레오티드에서 선택된다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 (a) 펩티드 핵산, (b) 이노신, (c) 트리틸화(tritylated) 염기, (d) 포스포로티오에이트, (e) 알킬포스포로티오에이트, (f) 5-니트로인돌 데속시리보푸라노실, (g) 5-메틸데속시시토신 및 (h) 5,6-디하이드로-5,6-디하이드록시데속시티미딘으로 구성된 군에서 선택되는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 포스포티오에이트화 뉴클레오티드를 포함하거나, 대안적으로 이로 구성된다. 포스포티오에이트화 뉴클레오티드는 세포 또는 기관에서 분해에 대하여 보호되며, 이에 따라 바람직한 뉴클레오티드 변형이다. 더욱 바람직한 것은 자연 상에서 전형적으로 발견되는 폴리뉴클레오티드의 화학적, 효소적, 또는 대사적으로 변형된 형태이다. 그러나 바람직한 올리고뉴클레오티드는 비변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신, 티미딘, 구아노신 및/또는 시티딘만으로 구성된다. 더더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드만으로 구성된다.
매우 바람직한 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개, 바람직하게, 1, 2, 3, 또는 4개의 CpG 모티브를 포함하는 비메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이다. 더더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 적어도 1개, 바람직하게 1, 2, 3, 또는 4개의 CpG 모티브를 포함하는 팔린드롬(palindromic) 서열을 포함한다. 더더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 서열 GACGATCGTC (서열 번호 1)을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 팔린드롬 서열을 포함한다. 더더욱 바람직한 올리고뉴클레오티드는 그 5' 말단에서 폴리 G 스트레치에 의하여 프랭킹되고(flanked), 그 3' 말단에서 폴리 G 스트레치에 의하여 프랭킹되는 팔린드롬 서열을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 팔린드롬 서열은 GACGATCGTC (서열 번호 1)이다. 매우 바람직한 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에서 적어도 3 내지 10, 바람직하게 4 내지 10개 구아노신 엔티티(entity)에 의해 프랭킹되며, 그의 3' 말단에서 적어도 3 내지 10, 바람직하게 4 내지 10개 구아노신 엔티티에 의해 프랭킹되는 팔린드롬 서열을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 팔린드롬 서열은 GACGATCGTC (서열 번호 1)이다.
" 폴리 G 스트레치 ": 용어 폴리 G 스트레치는 적어도 3개의 연속 구아노신 잔기로 구성된 올리고뉴클레오티드의 분절에 관한 것이다. 바람직하게 폴리 G 스트레치는 3 내지 25개, 바람직하게 4 내지 20개, 더욱 바람직하게 4 내지 15개 및 가장 바람직하게 4 내지 10개의 연속 구아노신 엔티티로 구성된다. 더욱 바람직한 폴리 G 스트레치는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 연속 구아노신 엔티티로 구성된다.
"CpG 모티브": 본원에 사용된 용어 "CpG 모티브"는 시토신 (C) - 구아노신 (G) 디뉴클레오티드를 포함하는 짧은 DNA 서열, 바람직하게 단일 가닥 DNA 서열을 말하며, 여기에서 C는 비메틸화되고, 여기에서 바람직하게 상기 CG 디뉴클레오티드는 포스포디에스테르 결합된다. 바람직하게, CpG 모티브는 상기 CG 디뉴클레오티드의 5' 및/또는 3'에 적어도 1개, 바람직하게, 1, 2, 또는 3개의 부가의 뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 부가의 뉴클레오티드는 CG 디뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
"상대 피크 시작 시간 ": 용어 "상대 피크 시작 시간"은 올리고뉴클레오티드의 응집 상태를 나타내는 파라미터이다. 올리고뉴클레오티드의 상대 피크 시작 시간은 바람직하게 본질적으로 다음의 파라미터를 사용하여, 바람직하게 정확히 다음의 파라미터를 사용하여 수행되는 분석적 크기 배제 HPLC로 결정된다:
컬럼: TSKgel 5000 PWXL 7.8 mm * 30.0 cm (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
용리액: PBS (20 mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.2 중 150 mM NaCl)
주입 부피: 40.0 ㎕ (바람직하게 약 20 μM 내지 약 500 μM의 농도를 포함)
유속: 0.8 ㎖/분
구배: 등용매용리(isocratic)
구동 시간: 20 분
파장: 215, 260 및 280 nm, 260 nm에서 데이터 평가
컬럼 오븐 온도: 25 ℃
오토샘플러(Autosampler) 온도: 8 ℃; 및
여기에서 상기 RNA 박테리오파지의 캡시드가 표준으로 사용되었다. 상기 올리고뉴클레오티드 대 상기 RNA 박테리오파지의 캡시드의 상대 피크 시작 시간 X% 를 다음과 같이 계산하였다: X % = 올리고뉴클레오티드의 피크 시작 시간 [분]/표준의 체류 시간 [분] x 100 %, 여기에서, 올리고뉴클레오티드의 피크 시작 시간은 올리고뉴클레오티드의 용리가 검출가능하게 되는 시간으로 결정되며, 여기에서 표준의 체류 시간은 상기 표준의 최대 피크의 발생 시간으로 결정된다. 따라서, 상기 RNA 박테리오 파지가 예를 들어, 박테리오파지 AP205인 일 구체예에서, AP205의 캡시드가 상기 HPLC에서 표준으로 사용되며, 상기 올리고뉴클레오티드의 상대 피크 시작 시간은 상기 AP205 표준에 대하여 계산된다. 중요하게, RNA 박테리오파지를 언급하지 않는 구체예에서, 상대 피크 시작 시간은 항상 표준으로서 박테리오파지 Qβ의 캡시드를 사용하여 결정된다. 또한, 상기 HPLC에서 적절한 표준의 선택에 관하여 어떤 불확실함이 있는 경우, 박테리오파지 Qβ의 캡시드가 표준으로 사용되며, 상대 피크 시작 시간은 상기 박테리오파지 Qβ의 캡시드에 대하여 결정된다. 따라서, 매우 바람직한 구체예에서, 상기 상대 피크 시작 시간은 상기 HPLC에 의해 결정되며, 여기에서 바람직하게 상기 표준은 박테리오파지 Qβ의 캡시드이며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 상대 피크 시작 시간은 박테리오파지 Qβ의 캡시드에 대하여 결정된다.
"패키징": 본원에 사용된 용어 "패키징"은 바이러스-유사 입자와 관련된 올리고뉴클레오티드의 상태를 말한다. 용어 "VLP로 패키징된 올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 VLP"의 이용은 동등하다. 본원에 사용된 용어 "패키징"은 비-공유 결합, 바람직하게 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 또는 수소 결합을 말한다. 매우 바람직하게, 본원에 사용된 용어 "패키징"은 VLP 내로 상기 올리고뉴클레오티드가 둘러싸여지거나, 또는 부분적으로 둘러싸여지는 것을 말한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드, 바람직하게 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 실제적인 공유 또는 비공유 결합의 존재 없이, 또는 비공유 결합으로, VLP에 의해 둘러싸여질 수 있다. 전형적이며 바람직하게, 올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 VLP는 상기 올리고뉴클레오티드를 분해, 바람직하게 DNAse 가수 분해로부터 보호한다. 따라서, 바람직한 의미로, 용어 "패키징"은 패키징 상태에 있는 올리고뉴클레오티드가 DNAse 가수 분해에 영향받지 않는 것을 나타낸다. 더욱 바람직하게, 용어 "패키징"은 올리고뉴클레오티드가 DNAse 가수 분해에 영향받지 않는 것을 나타내며, 여기에서 더욱 바람직하게 DNAse는 DNAseI 또는 Benzonase이다. 더더욱 바람직하게, 용어 "패키징"은 올리고뉴클레오티드가 Benzonase 가수 분해에 영향받지 않는 것을 나타낸다.
DNAse (예를 들어, DNaseI 또는 Benzonase)에 대한 올리고뉴클레오티드의 접근성은 바람직하게 제 WO2003/024481A2호의 실시예 11-17 (p.111)에 기술된 바와 같이 분석된다. 바람직한 의미로, VLP는 Benzonase (2 mM MgCl2, pH 7.2를 포함하는 완충액 중 190 U Benzonase / mg 코트 단백질, 20-25 ℃, 18 시간)로 처리된 후에, 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 가장 바람직하게 적어도 98 %의 상기 올리고뉴클레오티드가 (예를 들어, 에티듐브로마이드 염색된 겔에서) 상기 VLP로부터 회수될 수 있는 경우, 올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 것으로 간주된다. 이러한 분석법에 적절한 대조군이 필요하며, VLP 및 올리고뉴클레오티드의 특정 조합에 채용되는데 필요할 수 있는 것이 당업자에게 명백한 것이다. 더욱 바람직한 의미로, 올리고뉴클레오티드는 Benzonase (2 mM MgCl2, pH 7.2를 포함하는 완충액 중 190 U Benzonase / mg 코트 단백질, 20-25 ℃, 18 시간)로 처리된 후에, 적어도90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 가장 바람직하게 적어도 98 %의 상기 올리고뉴클레오티드가 RNA 박테리오파지의 상기 VLP로부터 회수될 수 있는 경우, RNA 박테리오파지의 VLP로 패키징된 것으로 간주된다. 매우 바람직한 의미로, 올리고뉴클레오티드 G10(서열 번호 8)은 Benzonase (2 mM MgCl2, pH 7.2를 포함하는 완충액 중 190 U Benzonase / mg 코트 단백질, 20-25 ℃, 18 시간)로 처리된 후에, 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 가장 바람직하게 적어도 98 %의 상기 G10이 상기 VLP로부터 회수될 수 있는 경우, RNA 박테리오파지의 VLP로 패키징된 것으로 간주된다. 더욱 특별한 의미로, 올리고뉴클레오티드 G10(서열 번호 8)은 Benzonase (2 mM MgCl2, pH 7.2를 포함하는 완충액 중 190 U Benzonase / mg 코트 단백질, 20-25 ℃, 18 시간)로 처리된 후에, 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 가장 바람직하게 적어도 98 %의 상기 G10이 RNA 박테리오파지의 상기 VLP로부터 회수될 수 있는 경우, RNA 박테리오파지 Qβ, AP205, GA 또는 fr의 VLP로 패키징된 것으로 간주된다. 매우 특별한 의미에서, 올리고뉴클레오티드 G10(서열 번호 8)은 Benzonase (2 mM MgCl2, pH 7.2를 포함하는 완충액 중 190 U Benzonase / mg 코트 단백질, 20-25 ℃, 18 시간)로 처리된 후에, 적어도 90 %, 바람직하게 적어도 95 %, 가장 바람직하게 적어도 98 %의 상기 비메틸화 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 상기 RNA 박테리오파지 Qβ의 VLP로부터 회수될 수 있는 경우, RNA 박테리오파지 Qβ의 VLP로 패키징된 것으로 간주된다.
"코트 단백질": 본원에서, 용어 "코트 단백질"은 박테리오파지 또는 RNA 박테리오파지의 캡시드 어셈블리 내에 도입될 수 있는 RNA 박테리오파지의 단백질(들)을 말한다. 따라서, 용어 코트 단밸질은 RNA 박테리오파지의 캡시드 또는 RNA 박테리오파지의 VLP를 형성하는 단백질을 말한다. 전형적이며 바람직하게, RNA 박테리오파지의 코트 단백질은 다이머 구조를 갖는다.
본원에서 사용되는 "(재조합) 코트 단백질의 단편", 특히 재조합 코트 단백질의 단편은 바람직하게 VLP를 형성하는 능력을 보유하며, 각각 야생형 코트 단백질, 또는 야생형 재조합 단백질의 적어도 90%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%, 더더욱 바람직하게 95% 길이의 폴리펩티드로 정의된다. 바람직하게 단편은 적어도 하나의 내부 결실, 적어도 하나의 절단, 또는 이들의 적어도 하나의 조합으로 수득된다. 용어 "재조합 코트 단백질의 단편" 또는 "코트 단백질의 단편"은 바이러스-유사 입자로 어셈블리할 수 있고, 각각 야생형 코트 단백질과 적어도 80%, 바람직하게 90%, 더욱 바람직하게 95% 아미노산 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함할 것이다. 용어 "돌연변이 코트 단백질"은 각각 야생형 재조합 단백질 또는 코트 단백질에서 유래된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 말하며, 여기에서 상기 아미노산 서열은 바람직하게 VLP로 어셈블리할 능력을 보유하며, 야생형 서열과 적어도 80%, 바람직하게 적어도 85%, 90%, 95%, 97%, 또는 99%의 상동성이 있다.
본원에 사용된 "바이러스-유사 입자 ( VLP )"는 비-복제성 또는 비감염성, 바람직하게 비-복제성 및 비-감염성 바이러스 입자를 말하거나, 바이러스 입자, 바람직하게 바이러스의 캡시드를 닮은 비-복제성 또는 비-감염성, 바람직하게 비-복제성 및 비-감염성 구조를 말한다. 본원에 사용되는 용어 "비-복제성"은 VLP에 포함되는 게놈이 복제될 수 없음을 말한다. 본원에 사용되는 용어 "비-감염성"은 숙주 세포에 들어갈 수 없는 것을 말한다. 바람직하게 본 발명과 관련된 바이러스-유사 입자는 바이러스 게놈 또는 게놈 기능의 모두 또는 일부가 결여되기 때문에, 비-복제성 및/또는 비-감염성이다. 일 구체예에서, 바이러스-유사 입자는 VLP로의 정제된 단백질의 어셈블리에 의하여, 또는 디스어셈블리 및 리어셈블리에 의하여 바이러스 게놈이 물리적 또는 화학적으로 불활성화, 제거되는 바이러스 입자이다. 전형적이며, 더욱 바람직하게, 바이러스-유사 입자는 바이러스 게놈의 복제성 및 감염성 성분의 모두 또는 일부가 결여된다. 본 발명과 관련된 바이러스-유사 입자는 그들의 게놈과 상이한 핵산을 함유할 수 있다. 본 발명과 관련된 바이러스-유사 입자의 전형적이며 바람직한 구체예는 바이러스 캡시드, 이를 테면 상응하는 바이러스, 박테리오파지, 바람직하게 RNA 박테리오파지의 바이러스 캡시드이다. 용어 "캡시드"는 바이러스 단백질 서브유닛으로 구성된 거대 분자 어셈블리를 말한다. 전형적으로, 60, 120, 180, 240, 300, 360 및 360 초과의 바이러스 단백질 서브유닛이 존재한다. 전형적이며 바람직하게, 이들 서브유닛의 상호작용은 고유의 반복적 구성을 지닌 바이러스 캡시드의 형성을 유발하며, 여기에서 상기 구조는 전형적이며 바람직하게 구형이다. 예를 들어, RNA 박테리오파지의 캡시드는 20면체 대칭의 구형 형태를 갖는다.
" RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자": 본원에 사용되는 용어 "RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자"는 RNA 박테리오파지의 코트 단백질, 이의 돌연변이 또는 단편을 포함하거나, 바람직하게 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 바이러스-유사 입자를 말한다. 또한, RNA 박테리오파지의 구조를 닮은 RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자는 비복제성 및/또는 비감염성이며, 적어도 RNA 박테리오파지의 복제 기작을 코딩하는 유전자(들)이 결여되어 있고, 전형적으로 숙주에 들어가거나 바이러스 부착에 필요한 단백질(들)을 코딩하는 유전자(들)이 결여되어 있다. RNA 박테리오파지에서 유래된 바람직한 VLP는 20면체 대칭을 가지며, 180개 서브유닛으로 구성된다. 본 발명의 문맥 내에서, 용어 RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자는 바람직하게 RNA 박테리오파지의 재조합 코트 단백질, 또는 이의 단편 또는 돌연변이의 자기-어셈블리에 의해 수득되는 거대분자 구조에 관련되며, 여기에서 바람직하게 상기 자기-어셈블리는 올리고뉴클레오티드의 존재 하에서 발생한다.
"코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제": 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제는 상기 혼합물 중에서 바이러스-유사 입자의 자발적 형성을 방지하는 제제이다. 당업자는 실험적으로, 예를 들어 실시예 9에 개시된 크기 배제 크로마토그래피로 상기 혼합물을 분석하여, 상기 제제의 화학적 성질 및 적절한 농도를 결정할 수 있다. 상기 제제는 상기 혼합물을 적어도 1 시간 동안 실온, 바람직하게 22 ℃에서 인큐베이션한 후, 실시예 9에 개시된 크기 배제 크로마토그래피로 바이러스-유사 입자를 검출할 수 없는 경우, 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있다. 그러나 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제는 상기 코트 단백질을 비가역적으로 변형시키지 않으며, 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하면 바이러스 유사 입자가 자발적으로 형성될 것이다. 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 바람직한 제제는 세정제, 구아니디늄하이드로클로라이드 및 우레아, 가장 바람직하게 우레아를 포함한다. 바람직한 세정제는 소듐도데실설페이트, Tween 20, TritonX 100 등이다. 전형적이며 바람직하게 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제는 환원된 상태의 상기 코트 단백질의 시스테인 잔기에 의해 형성된 분자간 이황화 결합이 유지되도록 하는 환원제를 추가로 포함한다.
"단백질 수율": 본 발명의 방법의 단백질 수율은 상기 혼합물 중에 함유된 코트 단백질의 양에 대한, 상기 방법의 마지막 단계 후 바이러스-유사 입자로서 회수된 코트 단백질로서 결정되며, 여기에서 바람직하게 상기 코트 단백질의 양은 브래드포드(Bradford) 단백질 분석으로 결정된다. 전형적이며 바람직하게, 상기 혼합물 중에 함유된 적어도 70%, 바람직하게 적어도 75%의 코트 단백질은 상기 방법의 마지막 단계 후에 바이러스-유사 입자로서 회수되며, 여기에서 바람직하게 상기 마지막 단계는 상기 멸균 여과이다.
"올리고뉴클레오티드 수율": 본 발명의 방법의 올리고뉴클레오티드 수율은 상기 혼합물 중에 함유된 상기 올리고뉴클레오티드의 양에 대한, 상기 방법의 마지막 단계 후 상기 바이러스-유사 입자로부터 회수될 수 있는 올리고뉴클레오티드의 양으로 결정되며, 여기에서 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자에서 회수되는 상기 올리고뉴클레오티드의 양은 필수적으로 또는 바람직하게 정확히 실시예 9에 개시된 바와 같이 결정된다. 전형적이며 바람직하게, 상기 혼합물 중에 함유된 적어도 70%, 바람직하게 적어도 75%의 올리고뉴클레오티드가 상기 방법의 마지막 단계 후에 상기 바이러스-유사 입자로부터 회수되며, 여기에서 바람직하게 상기 마지막 단계는 상기 멸균 여과이다.
"순도": (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 본 발명의 조성물의 순도는 분석적 크기 배제 HPLC로 결정되며, 상기 HPLC는 필수적으로, 바람직하게 정확히 실시예 4에 개시된 바와 같은 조건 하에서 수행된다. 상기 조성물의 순도는 동일한 크로마토그램의 총 피크 면적에 대한, 상기 조성물에 포함된 상기 바이러스-유사 입자의 피크 영역의 백분율로 결정된다. 전형적이며 바람직하게, 본 발명의 조성물의 순도는 적어도 98%, 바람직하게 적어도 99%이다.
단수의 용어: 본 명세서에서 용어가 단수로 사용되는 경우, 이는 달리 언급하지 않는 한 "적어도 하나의" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
"약": 본 출원의 의미 내에서, 표현 약은 +/- 10 %의 의미를 가질 것이다. 예를 들어, 약 100은 90 내지 110을 의미할 것이다.
본 발명은 응집된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 더욱 자세하게, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함하고, 상기 방법은 (a) 용액 II 중에 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계(여기에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 그의 5' 말단에 적어도 3개의 구아노신 엔티티 및 그의 3' 말단에 적어도 3개의 구아노신 엔티티를 포함하고; 여기에서 상기 용액 II는 pH 5 내지 8을 포함하며; 상기 용액 II는 양이온을 포함하고, 바람직하게 상기 용액 II 중에 양이온의 농도는 적어도 20 mM이고, 여기에서 상기 양이온은 바람직하게 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 +, 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택됨); (b) 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 III은 50 내지 99℃임); (c) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (d) 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계를 포함하며(상기 온도 IV는 50℃ 미만임), 상기 단계들은 바람직하게 주어진 순서로 수행된다. 다음에 개시된 모든 구체예는 임의의 조합으로 본 방법에 적용가능하다.
상기 언급된 바와 같이, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 응집 단계 전에 분리 단계에 적용하는 것이 바람직한 것으로 관찰되었으며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 완전히 분리된다. 올리고뉴클레오티드의 완전한 분리는 바람직하게 본질적으로 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행되는 크기 배제 HPLC에서 올리고뉴클레오티드의 겉보기 분자량이 상기 올리고뉴클레오티드의 서열에서 유래될 수 있는 분자량에 상응하는 것을 의미한다. 따라서, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함하고, 상기 방법은 (a) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 알칼리성 pH를 갖는 용액 I 중에 제공하는 단계; (b) (i) 용액 I의 온도를 온도 I로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 I은 4 내지 70℃임); (ii) 상기 올리고뉴클레오티드가 110 % 초과의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 I에서 상기 용액 I 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (iii) 상기 용액 I의 온도를 온도 II로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 II는 0 내지 70 ℃임)를 포함하여, 상기 올리고뉴클레오티드를 분리하는 단계; (c) 상기 용액 I의 pH를 pH 5 내지 8로 조정하는 단계; 및 (d) (i) 상기 올리고뉴클레오티드를 용액 II 중에 제공하는 단계(여기에서 상기 용액 II는 pH 5 내지 8 및 양이온을 포함하고; 여기에서 바람직하게 상기 용액 II 중에 상기 양이온의 농도가 적어도 20 mM이며, 여기에서 바람직하게 상기 양이온은 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 + 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택됨); (ii) 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계(상기 온도 III은 50 내지 99℃임); (iii) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계; 및 (iv) 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계(여기에서 상기 온도 IV는 50 ℃ 미만임)를 포함하여 상기 올리고뉴클레오티드를 응집하는 단계를 포함하며, 여기에서 상기 단계들은 바람직하게 주어진 순서로 수행된다.
부분적으로 응집된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있는 미처리된 올리고뉴클레오티드의 분리는 알칼리성 pH에서 발생한다. 분리 방법은 승온에 의하여 촉진될 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 용액 I은 pH 8 내지 13, 바람직하게 10 내지 13, 가장 바람직하게 12를 포함한다. 용액 I은 pH가 8 내지 13로 조정되도록 하는 본 분야에 공지인 임의의 완충액 또는 제제를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 용액 I은 수산화물, 바람직하게 수산화 금속, 가장 바람직하게 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 수산화물, 바람직하게 알칼리 금속의 수산화물을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 수산화물은 수산화 칼륨, 또는 수산화 나트륨, 가장 바람직하게 수산화 나트륨이다. 일 구체예에서, 상기 용액 I 중의 상기 수산화물, 바람직하게 상기 수산화 나트륨의 농도는 10 mM 내지 200 mM, 더욱 바람직하게 약 25 mM, 가장 바람직하게 25 mM이다.
올리고뉴클레오티드의 분해를 막기 위하여, 온도 I이 바람직하게 90℃를 넘지 않으며, 온도 I은 70℃를 넘지 않는다. 일 구체예에서, 온도 I은 실온, 바람직하게 19 내지 25℃이다. 또다른 구체예에서, 온도 I은 4 내지 70℃, 바람직하게 20 내지 70℃, 더욱 바람직하게 45 내지 70℃, 바람직하게 약 50℃ 및 가장 바람직하게 50℃이다. 바람직한 구체예에서, 상기 온도 I에서 상기 용액 I 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 인큐베이션하는 것은 상기 올리고뉴클레오티드가 완전히 분리될 때까지 수행된다. 또다른 구체예에서, 상기 온도 I에서 상기 용액 I 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 인큐베이션하는 것은 상기 올리고뉴클레오티드의 상대 피크 시작 시간이 110 % 초과, 바람직하게 130 % 초과 및 가장 바람직하게 135 %를 초과할 때까지 수행된다. 추가의 구체예에서, 상기 온도 I에서 상기 용액 I 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 인큐베이션하는 것은 30 내지 190 분, 바람직하게 50 내지 90 분, 가장 바람직하게 70 분 동안 수행된다.
추가의 바람직한 구체예에서, 상기 용액 I 중의 상기 올리고뉴클레오티드의 농도는 50 μM 내지 2 mM, 바람직하게 50 내지 500 μM, 더욱 바람직하게 200 내지 300 μM 및 가장 바람직하게 260 μM이다.
올리고뉴클레오티드의 분리는 용액 I을 중화 또는 산성화시키고/거나 온도를 낮춰 종료시킬 수 있다. 따라서, 상기 방법은 상기 용액 I의 pH를 pH 8 이하, 바람직하게 pH 5 내지 8로 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 pH 조정은 상기 pH가 6 내지 7이 될 때까지, 가장 바람직하게 상기 pH가 6일 때까지 수행된다. 추가의 구체예에서, 상기 용액 I의 pH 조정은 상기 용액 I에 산을 첨가하여 수행된다. 본 분야에 알려진 임의의 광산 또는 유기산이 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 산은 인산; 염산; 및 유기산으로 구성된 군에서 선택되며, 여기에서 상기 유기산은 바람직하게, 포름산, 아세트산 및 시트르산에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 산은 광산이다. 바람직하게, 상기 산은 인산, 또는 염산, 가장 바람직하게는 인산이다.
상기 방법은 상기 용액 I의 온도를 온도 II로 조정하는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 상기 온도 II는 0 내지 70 ℃이고, 여기에서 바람직하게 상기 온도 II는 온도 I 미만이다. 바람직한 구체예에서, 상기 온도 II는 0 내지 25 ℃, 바람직하게 0 내지 10 ℃ 및 가장 바람직하게 0 내지 2 ℃이다.
상기 방법은 상기 올리고뉴클레오티드를 응집하는 단계를 추가로 포함한다. 올리고뉴클레오티드의 응집은 상기 올리고뉴클레오티드를 50 ℃ 초과의 온도에서, G-4중 DNA 구조 (참조 Simonsson T., Biol. Chem. 382:621-628)의 형성을 유지할 수 있는 양이온을 포함하는 용액 중에 대략 중성의 pH에서 인큐베이션하여 성취된다. 이에 따라, 일 구체예에서 상기 양이온은 Na+, K+, Rb+, NH4 +, Cs+, Li+, Sr2+, Ba2 +, Ca2 +, Mn2 +, Co2 +, Ni2 + 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 양이온은 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2 +, 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택되며, 더욱 바람직하게 상기 양이온은 Na+, 또는 K+이고, 가장 바람직하게 상기 양이온은 Na+이다.
바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액 II는 상기 용액 I에 상기 양이온을 첨가하여 수득될 수 있고, 여기에서 바람직하게 상기 첨가는 상기 용액 I의 pH 조정 후에 수행된다.
상기 용액 II의 추가의 구체예에서, 임의의 양이온의 혼합물은 Na+, K+, Rb+, NH4 +, Cs+, Li+, Sr2 +, Ba2 +, Ca2 +, Mn2 +, Co2 +, Ni2 + 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택된다. 상기 용액 II의 추가의 구체예에서, 임의의 양이온의 혼합물은 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2+ 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물은 Na+ 및 K+를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
바람직한 구체예에서, 상기 용액 II는 적어도 20 mM, 바람직하게 적어도 100 mM, 더욱 바람직하게 200 내지 275 mM 및 가장 바람직하게 250 mM의 상기 양이온 또는 상기 양이온들의 혼합물을 포함한다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 용액 II는 250 mM의 Na+ 및 K+, 가장 바람직하게 250 mM의 Na+를 포함한다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 상기 용액 II는 250 mM의 염화 나트륨 또는 염화 칼륨, 가장 바람직하게 250 mM의 염화 나트륨을 포함한다. 그러나, 본 분야에 알려진 임의의 나트륨, 칼륨, 암모늄, 리튬, 칼슘, 또는 마그네슘 염이 이러한 목적을 위하여 사용될 수 있다.
추가의 구체예에서, 상기 용액 II 중의 상기 올리고뉴클레오티드의 농도는 50 μM 내지 2 mM, 바람직하게 100 내지 300 μM, 가장 바람직하게 175 μM이다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 상기 온도 III은 50 내지 99 ℃, 바람직하게 80 내지 90 ℃, 더욱 바람직하게 약 85 ℃ 및 가장 바람직하게 85 ℃이다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 온도 III에서 용액 II 중에 상기 올리고뉴클레오티드를 인큐베이션하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 인큐베이션은 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %, 바람직하게 80 내지 95 %, 더욱 바람직하게 80 내지 90 %, 더더욱 바람직하게 83 내지 90 %, 보다 바람직하게 85 내지 90 % 및 가장 바람직하게 88 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지 수행된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 G1O (서열 번호 8)이며, 상기 인큐베이션은 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %, 바람직하게 80 내지 95 %, 더욱 바람직하게 80 내지 90 %, 더더욱 바람직하게 83 내지 90 %, 보다 바람직하게 85 내지 90 % 및 가장 바람직하게 88 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지 수행된다.
원하는 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 수득하기 위하여 요구되는 인큐베이션 시간은 올리고뉴클레오티드의 서열 및 순도에 따라 달라지며, 전형적이며 바람직하게 약 5 분 내지 약 30 분의 범위이다. 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드가 G1O (서열 번호 8)이며, 상기 온도 III에서 상기 용액 II 중의 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 인큐베이션은 9 내지 24 분 동안 수행된다.
상기 응집 과정은 용액 II를 50 ℃ 미만으로 냉각시켜 종료된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 것을 포함하며, 여기에서 상기 온도 IV는 50 ℃미만이고, 여기에서 바람직하게 상기 온도 IV는 0 내지 25 ℃, 더욱 바람직하게 0 내지 10 ℃ 및 가장 바람직하게 0 내지 2 ℃이다.
본 발명의 방법에서 적용되는 가열 및/또는 냉각 속도가 수득되는 응집된 올리고뉴클레오티드의 수율 및 입자 크기 분포에 영향을 갖는 것이 관찰되었다. 특히, 더 높은 뱃취 부피로 공정을 스케일링 업(scaling up)하는 단계에서, 적어도 3.6 ℃/분의 온도 램프(temperature ramp)(예를 들어, 가열 또는 냉각 속도)를 사용하여, 수율 및 입자 크기 분포가 추가로 개선될 수 있는 것이 관찰되었다. 숙련자는 반응 용기의 반응 부피, 기하학 및 열 전도성 및 선택된 온도 차이에 대한 공정 조건을 표준화하여 정의된 온도 램프를 성취할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 용액 I의 온도를 온도 I로 조정하는 단계, 상기 용액 I의 온도를 온도 II로 조정하는 단계, 상기 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계 및/또는 상기 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계가 적어도 3.6 ℃/분의 온도 램프로 수행된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 용액 II의 온도를 온도 III으로 조정하는 단계가 적어도 3.6 ℃/분의 온도 램프로 수행되며, 여기에서 바람직하게 상기 온도 램프는 약 7 ℃/분이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계는 적어도 3.6 ℃/분의 온도 램프로 수행되며, 여기에서 바람직하게 상기 온도 램프는 약 7 ℃/분이다.
응집체를 형성할 수 있게 하기 위하여, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나, 바람직하게 두개의 폴리 G 스트레치를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에서 적어도 3개, 바람직하게 적어도 4개의 구아노신 엔티티를 포함하며, 그의 3' 말단에 적어도 3개, 바람직하게 적어도 4개의 구아노신 엔티티를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 적어도 4개의 구아노신 엔티티를 포함하며, 그의 3' 말단에 적어도 4개의 구아노신 엔티티를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 3개 이상 20개 이하, 바람직하게 15개 이하의 구아노신 엔티티를 포함하며, 그의 3' 말단에 3개 이상 20개 이하, 바람직하게 15개 이하의 구아노신 엔티티를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 3개 이상, 바람직하게 4개 이상 및 11개 이하의 구아노신 엔티티를 포함하며, 그의 3' 말단에 3개 이상, 바람직하게 4개 이상 및 10개 이하의 구아노신 엔티티를 포함한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 비메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드이며, 바람직하게 여기에서 상기 비메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 두개의 폴리 G 스트레치를 포함하고, 여기에서 바람직하게 각각의 폴리 G 스트레치는 적어도 4개의 구아노신 엔티티로 구성되며, 더욱 바람직하게 상기 비메틸화 CpG 함유 올리고뉴클레오티드는 팔린드롬 서열을 포함하며, 여기에서 상기 팔린드롬 서열은 상기 폴리 G 스트레치 사이에 위치한다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에 3개 이상, 바람직하게 4개 이상의 구아노신 엔티티를 포함하며, 그의 3' 말단에 3개 이상, 바람직하게 4개 이상의 구아노신 엔티티를 포함하고, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 팔린드롬 서열을 추가로 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 팔린드롬 서열은 GACGATCGTC (서열 번호 1)이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 팔린드롬 서열을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 팔린드롬 서열은 GACGATCGTC (서열 번호 1)이고, 여기에서 상기 팔린드롬 서열은 그의 5' 말단에서 3개 이상, 바람직하게 4개 이상 및 15개 이하의 구아노신 엔티티에 의하여 프랭킹되며, 여기에서 상기 팔린드롬 서열은 그의 3' 말단에서 3개 이상, 바람직하게 4개 이상 및 15개 이하의 구아노신 엔티티에 의하여 프랭킹된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 10 내지 1000개의 뉴클레오티드, 바람직하게 10 내지 200개의 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게, 10 내지 100개의 뉴클레오티드, 더더욱 바람직하게 20 내지 40개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 30개의 뉴클레오티드를 포함한다.
매우 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 (a) "G4-4" GGGGGACGAT CGTCGGGG (서열 번호 2); (b) "G5-5" GGGGGGACGA TCGTCGGGGG (서열 번호 3); (c) "G6-6" GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG (서열 번호 4); (d) "G7-7" GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG (서열 번호 5); (e) "G8-8" GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG (서열 번호 6); (f) "G9-9" GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG (서열 번호 7); (g) "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8); (h) "G11" GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG (서열 번호 9)로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 전부 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드로 구성된다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8)를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 전부 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드로 구성된다.
본 발명은 또한 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 뉴클레오티드 조성물은 상기 기술된 구체예 중 임의의 것을 단독으로, 또는 임의로 조합하여 실행하여, 상기 기술된 방법 중 임의의 것에 의하여 수득될 수 있다. 특히, 본 발명은 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물에 관한 것이며, 여기에서 상기 뉴클레오티드 조성물은 상기 기술된 방법들 중 임의의 것에 의하여 수득될 수 있으며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 50 내지 110 %, 바람직하게 80 내지 95 %, 더욱 바람직하게 80 내지 90 %, 더더욱 바람직하게 83 내지 90 %, 보다 바람직하게 85 내지 90 %, 및 가장 바람직하게 88 %의 상대 피크 시작 시간을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 조성물은 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 (a) "G4-4" GGGGGACGAT CGTCGGGG (서열 번호 2); (b) "G5-5" GGGGGGACGA TCGTCGGGGG (서열 번호 3); (c) "G6-6" GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG (서열 번호 4); (d) "G7-7" GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG (서열 번호 5); (e) "G8-8" GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG (서열 번호 6); (f) "G9-9" GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG (서열 번호 7); (g) "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8); (h) "G11" GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG (서열 번호 9)로 구성된 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 전부 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드로 구성된다. 더더욱 바람직한 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 조성물은 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 핵산 서열 "G1O" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (서열 번호 8)를 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되며, 여기에서 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 전부 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드로 구성된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 뉴클레오티드 조성물은 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 핵산 서열 "G1O" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (서열 번호 8)으로 구성되고, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 전부 포스포디에스테르 결합 뉴클레오티드로 구성되며, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 50 내지 110 %, 바람직하게 80 내지95 %, 더욱 바람직하게 80 내지 90 %, 더더욱 바람직하게 83 내지 90 %, 보다 바람직하게 85 내지 90 %, 및 가장 바람직하게 88 %의 상대 피크 시작 시간을 포함한다.
이전에 언급된 바와 같이, 본 발명의 뉴클레오티드 조성물은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물의 제조 방법에서 유용하며, 이는 본 발명의 뉴클레오티드 조성물에 함유되는 응집된 올리고뉴클레오티드가 RNA 박테리오파지의 코트 단백질의 자기 어셈블리를 촉진하며, 이에 따라, RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자의 형성이 촉진되기 때문이고, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된다. 이에 따라, 본 발명은 또한, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물을 제공하는 단계(여기에서, 상기 뉴클레오티드 조성물은 본 발명의 방법들 중 임의의 것에 의해 수득될 수 있음); (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기 어셈블되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 목적을 위해 가장 유용한 반면, 더 높거나 더 낮은 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 낮은 수율을 유발할 수 있다. 이에 따라, 본 발명은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 추가로 제공하며, 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) (i) 바람직하게, 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하며; (ii) 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기-어셈블되도록 하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 본원에 기술된 특성 및 구체예 중 임의의 것을 임의의 조합으로 포함할 수 있다.
당업자는 표준 방법을 적용하여 RNA 박테리오파지로부터 상기 코트 단백질을 정제하여 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 생산하고 정제할 수 있다. 그러나 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 바람직하게, E. coli에서 상기 코트 단백질을 발현하여 재조합적으로 생산될 수 있다. RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 수득하는 방법을 실시예 섹션에 개시하였다. 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 RNA 박테리오파지의 재조합 단백질, 또는 이의 단편을 포함하거나, 대안적으로 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 대안적으로 이로 구성되며, 여기에서 바람직하게 상기 RNA 박테리오파지는 (a) 박테리오파지 Qβ; (b) 박테리오파지 R17; (c) 박테리오파지 fr; (d) 박테리오파지 GA; (e) 박테리오파지 SP; (f) 박테리오파지 MS2; (g) 박테리오파지 M1l; (h) 박테리오파지 MX1; (i) 박테리오파지 NL95; (j) 박테리오파지 f2; (k) 박테리오파지 PP7; 및 박테리오파지 AP205로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 RNA 박테리오파지는 박테리오파지 Qβ이다. RNA 박테리오파지, 특히 박테리오파지 Qβ의 바이러스-유사 입자를 발현하고 정제하는 공정 및 방법은 제 WO2006/125821A2호 및 제 WO2007/039552A1호에 기술되어 있으며, 이는 본원에 참고의 방법으로 삽입된다. RNA 박테리오파지의 코트 단백질은 예를 들어, 본원의 실시예에 기술된 바와 같이 바이러스-유사 입자의 디스어셈블리에 의하여 수득될 수 있다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 RNA 박테리오파지는 박테리오파지 AP205이다. 아미노산 5에서 프롤린이 트레오닌으로 치환된 AP205 코트 단백질을 포함한 AP205 VLP의 어셈블리-유능(competent) 돌연변이 형태도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 제 WO 2004/007538호, 특히 실시예 1 및 실시예 2에는 AP205 코트 단백질을 포함하는 VLP를 수득하는 방법, 특히 이에 의한 그들의 발현 및 정제 방법이 기술되었다. 제 WO 2004/007538호는 본원에 참고의 방법으로 삽입된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 RNA 박테리오파지는 박테리오파지 fr이다. 재조합 VLP의 형태인 fr 코트 단백질은 Pushko P 등 ((1993) Prot Engin 6:883-891)에 의하여 기술된 바와 같이 수득될 수 있다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 RNA 박테리오파지는 박테리오파지 GA이다. GA VLP는 GA 파지로부터의 역 전사에 의하여 분리된 GA 코트 단백질 cDNA를 pQb185로 클로닝하여 수득될 수 있으며, 이는 예를 들어, 제 WO2004/007538호에 기술되었다. fr 및 GA VLP의 디스어셈블리는 임의로 0.1M 농도의 아세트산으로 보충된 7M 우레아 중에 VLP를 인큐베이션하여 즉시 수행될 수 있다. 핵산이 체류되는 동안 상당한 양의 코트 단백질이 통해 흐르는 pH, 또는 코트 단백질도 컬럼에 흡수되며 결과적으로 염 구배로 용리되는 pH에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 핵산이 코트 단백질로부터 추가로 정제된다.
바람직한 일 구체예에서, 상기 코트 단백질은 (a) 서열 번호 10 (Qβ CP); (b) 서열 번호 10 및 서열 번호 11 (Qβ A1 단백질)의 혼합물; (c) 서열 번호 12 (R17 코트 단백질); (d) 서열 번호 13 (fr 코트 단백질); (e) 서열 번호 14 (GA 코트 단백질); (f) 서열 번호 15 (SP 코트 단백질); (g) 서열 번호 15 및 서열 번호 16의 혼합물; (h) 서열 번호 17 (MS2 코트 단백질); (i) 서열 번호 18 (M11 코트 단백질); (j) 서열 번호 19 (MX1 코트 단백질); (k) 서열 번호 20 (NL95 코트 단백질); (1) 서열 번호 21 (f2 코트 단백질); (m) 서열 번호 22 (PP7 코트 단백질); 및 (n) 서열 번호 23 (AP205 코트 단백질)로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나 바람직하게 이로 구성된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 (a) 서열 번호 10; (b) 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 혼합물; (c) 서열 번호 13; (d) 서열 번호 14; (e) 서열 번호 23으로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다. 추가의 매우 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 (a) 서열 번호 10; 및 (b) 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 혼합물로 구성된 군에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성된다.
또한, 노출된 라이신 잔기가 아르기닌으로 대체된 박테리오파지 Qβ의 돌연변이 코트 단백질이 본 발명을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 제 WO02/056905호(참조, 여기의 실시예 18)에 개시된 돌연변이 Qβ 코트 단백질을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 대안적으로 이로 구성된다.
추가의 RNA 박테리오파지 코트 단백질이 박테리아 숙주에서의 발현에 따라 자기-어셈블리하는 것으로 나타났다 (Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. MoI. Biol. 249:283-297 (1995)). 특히 GA (Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271 :759-773(1997)) 및 fr (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L et al. J MoI. Biol. 244:279-290, (1994))의 생물학적 및 생화학적 특성이 개시되었다. 일부 RNA 박테리오파지의 결정 구조가 결정되었다 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)).
전형적이며 바람직하게, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위하여 본원에 개시된 방법은 실온에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 15 내지 30 ℃, 바람직하게 19 내지 25 ℃, 가장 바람직하게 22 ℃에서 수행된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물을 생성하는 단계, 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계 및/또는 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기 어셈블리하도록 하는 단계는 15 내지 30 ℃, 바람직하게 19 내지 25 ℃, 가장 바람직하게 22 ℃에서 수행된다.
상기 방법은 (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물 중에 상기 코트 단백질의 농도는 0.5 내지 10 mg/㎖, 바람직하게 1 내지 4 mg/㎖, 및 가장 바람직하게 2.5 mg/㎖이며, 여기에서 바람직하게 상기 농도는 브래드포드 분석으로 결정된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물 중 상기 올리고뉴클레오티드의 농도는 12.5 내지 250 μM, 더욱 바람직하게 25 내지 100 μM, 및 가장 바람직하게 62.5 μM이다.
패키징 방법의 최적의 수율을 수득하기 위하여, 상기 혼합물 중에 상기 올리고뉴클레오티드 대 상기 코트 단백질의 몰비는 0.5 내지 1.2, 바람직하게 0.6 내지 0.8 및 가장 바람직하게 0.7이다. 코트 단백질에 대하여 적은 올리고뉴클레오티드를 사용하면, 수율이 낮아지는 반면, 지나치게 과도한 올리고뉴클레오티드를 사용하면 비용이 증가하고, 생산물이 낮은 순도를 갖을 수 있다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물 중에 상기 코트 단백질의 농도는 2.5 mg/㎖이고, 상기 혼합물 중에 상기 올리고뉴클레오티드의 농도는 62.5 μM이다.
바이러스 및 특히 RNA 박테리오파지의 코트 단백질은 일반적으로 캡시드 구조, 예를 들어 바이러스 유사 입자로 자기 어셈블리하려는 강한 경향을 갖는다. 각 경우에서는 아니지만, 많은 경우에서 이러한 경향은 RNA 또는 DNA와 같은 핵산의 존재 하에서 증가한다. 상기 코트 단백질의 자기 어셈블리가 발생하기 전에, 상기 코트 단백질 및 상기 올리고뉴클레오티드의 최적의 혼합물을 수득하기 위하여, 상기 혼합물은 상기 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제를 포함한다. 전형적이며 바람직하게, 상기 제제는 변성 화합물(denaturing compound)을 포함한다. 수많은 변성 화합물이 생화학에서 알려져 있으며, 세제, 우레아 또는 구아니디늄하이드로클로라이드를 포함한다. 바람직한 세제는 소듐도데실설페이트, Tween 20, TritonX 100 등이다. 바람직한 구체예에서, 상기 변성 화합물은 우레아 또는 구아니디늄하이드로클로라이드이며, 여기에서 바람직하게 상기 혼합물 중에 상기 변성 화합물, 바람직하게 상기 우레아의 농도는 0.25 내지 7.2 M, 바람직하게 1 M이다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 변성 화합물이 우레아이며, 상기 혼합물 중에 상기 우레아의 농도는 0.5 내지 2 M, 바람직하게 0.7 내지 1.5 M, 더욱 바람직하게 0.8 내지 1.2 M, 및 가장 바람직하게 1 M이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물의 pH는 대략 중성이며, 바람직하게 상기 pH는 6 내지 8, 더욱 바람직하게 6.8 내지 7.5, 및 가장 바람직하게 상기 pH는 7.2이다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물은 인산 완충액, 바람직하게 인산 나트륨 완충액을 포함하며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 혼합물 중에 상기 인산 완충액의 최종 농도는 2 내지 100 mM, 더욱 바람직하게 10 내지 50 mM 및 가장 바람직하게 약 20 mM이다.
추가의 구체예에서, 상기 혼합물은 염을 추가로 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 염은 할로게나이드, 바람직하게 알칼리 금속의 클로라이드이며, 더욱 바람직하게 상기 염은 염화 칼륨 또는 염화 나트륨 또는 이의 조합이고, 가장 바람직하게, 상기 염은 염화 나트륨이다. 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물 중에 상기 염 또는 상기 염의 조합의 농도, 바람직하게 상기 염화 나트륨의 농도는 0 내지 1 M, 바람직하게 0 내지 550 mM, 더욱 바람직하게 0 to 350 mM, 더더욱 바람직하게 50 내지 350 mM, 및 가장 바람직하게 250 mM이다.
특정 RNA 박테리오파지, 특히 박테리오파지 Qβ, 박테리오파지 AP205 및 박테리오파지 fr의 캡시드 및/또는 바이러스-유사 입자는 상기 캡시드 또는 바이러스-유사 입자를 형성하는 단백질 서브유닛 사이의 분자간 이황화 결합에 의하여 안정화된다. 상기 혼합물에 환원제를 첨가하면, 이황화 결합이 환원된 상태로 유지되고, 이에 따라, 상기 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방한다. 이에 따라, 바람직한 구체예에서, 상기 제제는 환원제를 추가로 포함하며, 여기에서 상기 환원제는 바람직하게 DTT (디티오에리톨), β-머캅토에탄올, TCEP 및 본 분야에 일반적으로 알려진 다른 환원제로부터 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 환원제는 DTT이며, 여기에서 바람직하게 상기 혼합물 중에 상기 DTT의 농도는 1 내지 25 mM, 바람직하게 2.5 mM이다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 RNA 박테리오파지는 박테리오파지 Qβ, 박테리오파지 AP205, 또는 박테리오파지 fr이며, 상기 제제는 환원제를 추가로 포함하고, 여기에서 바람직하게 상기 환원제는 DTT이며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 혼합물 중에 상기 DTT의 농도는 1 내지 25 mM, 바람직하게 2.5 mM이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 상기 바이러스-유사 입자에서 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하며, 상기 제제는 환원제는 추가로 포함하고, 여기에서 바람직하게 상기 환원제는 DTT이고, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 혼합물 중에 상기 DTT의 농도는 1 내지 25 mM, 바람직하게 2.5 mM이다.
바람직한 구체예에서, 상기 혼합물을 생성하는 단계는 상기 혼합물에, (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기 어셈블리를 예방할 수 있는 제제; 및 (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 첨가는 주어진 순서로 수행되며, 더욱 바람직하게 상기 혼합물은 상기 올리고뉴클레오티드의 첨가 전에 혼합된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 제제를 제거하는 단계 전에 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 인큐베이션은 약 50 내지 70, 바람직하게 약 60분 동안 수행된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물의 인큐베이션은 15 내지 30 ℃, 더욱 바람직하게 19 내지 25 ℃ 및 가장 바람직하게 22 ℃에서 수행된다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 상기 혼합물을 교반하는 것을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 교반은 약 50 내지 200 rpm, 가장 바람직하게 약 100 rpm에서 수행된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 약 60 분 동안 수행되며, 상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계는 상기 혼합물을 교반하는 것을 포함하고, 여기에서 바람직하게 상기 교반은 약 100 rpm에서 수행된다.
일 구체예에서, 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계는 제1 완충액을 사용하는 제1 완충액 교환에 의하여 수행되며, 여기에서 바람직하게 상기 제1 완충액 교환은 투석 또는 연속 흐름 여과, 바람직하게 연속 흐름 여과에 의하여 수행된다. 상기 제1 완충액 교환은 상기 코트 단백질 및 자기 어셈블 VLP의 보류를 허용하는 분자량 컷 오프(cut off)를 포함하는 막을 가로질러 수행된다. 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액 교환이 막을 가로질러 수행되며, 여기에서 상기 막은 1 내지 50 kD, 바람직하게 5 내지 30 kD, 가장 바람직하게 30 kD의 분자량 컷 오프를 포함한다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액 교환은 1 내지 50 kD, 바람직하게 30 kD의 분자량 컷 오프를 포함하는 막을 가로지른 연속 흐름 여과에 의하여 수행되며, 여기에서 더욱 바람직하게, 상기 제1 완충액의 부피는 상기 혼합물 부피의 약 6배이다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 막은 30 kD 분자량 컷 오프를 포함하는 Biomax-5 (PES)이다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액 교환은 1 내지 50 kD, 바람직하게 30 kD의 분자량 컷 오프를 포함하는 막을 가로지르는 연속 흐름 여과로 수행되며, 여기에서 투과 흐름은 약 96 l/(m2*h)로 조정된다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액은 염을 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 제1 완충액의 염 조성물은 상기 혼합물의 염 조성물과 동일하다. 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액 중의 상기 염은 할로게나이드, 바람직하게 알칼리 금속의 클로라이드이며, 더욱 바람직하게 상기 염은 염화 칼륨 또는 염화 나트륨 또는 이의 조합이며, 가장 바람직하게 상기 염은 염화 나트륨이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액 중에 상기 염 또는 상기 염의 조합의 농도, 바람직하게 상기 염화 나트륨의 농도는 0 내지 1 M, 바람직하게 0 내지 550 mM, 더욱 바람직하게 0 내지 350 mM, 더더욱 바람직하게 50 내지 350 mM 및 가장 바람직하게 250 mM이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액의 pH는 6 내지 8, 더욱 바람직하게 6.8 내지 7.5 및 가장 바람직하게 상기 pH는 7.2이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 상기 제1 완충액은 인산 완충액, 바람직하게 인산 나트륨 완충액을 포함하며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 제1 완충액 중에 상기 인산 완충액의 최종 농도는 2 내지 100 mM, 더욱 바람직하게 10 내지 50 mM 및 가장 바람직하게 약 20 mM이다.
자기 어셈블리 반응에서 형성되는 상기 바이러스-유사 입자를 안정화하기 위하여, 상기 바이러스-유사 입자는 바람직하게, 상기 바이러스-유사 입자에서 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 산화제와 접촉된다. 이에 따라, 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 바이러스-유사 입자를 산화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 바람직하게 상기 산화제는 (a) 과산화 수소 (여기에서 바람직하게 상기 과산화수소의 농도는 0.25-50 mM, 바람직하게 2 mM임); (b) 산소; (c) 글루타티온; (d) 아스코르베이트; (e) Cu2 +; 및 (f) Fe3 +로 구성된 군에서 선택된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 RNA 박테리오파지는 박테리오파지 Qβ, 박테리오파지 AP205, 또는 박테리오파지 fr이며, 상기 방법은 상기 바이러스-유사 입자와 산화제를 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고, 여기에서 바람직하게 상기 산화제는 (a) 과산화 수소 (여기에서 바람직하게 상기 과산화수소의 농도는 0.25-50 mM, 바람직하게 2 mM임); (b) 산소; (c) 글루타티온; (d) Cu2 +; 및 (e) Fe3 +로 구성된 군에서 선택되며, 여기에서 가장 바람직하게, 상기 산화제는 과산화수소이며, 더욱 바람직하게, 상기 과산화수소의 농도는 0.25-50 mM, 바람직하게 2 mM이다. 바람직한 구체예에서, 상기 코트 단백질은 상기 바이러스-유사 입자에서 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 코트 단백질은 박테리오파지 Qβ, 박테리오파지 AP205, 또는 박테리오파지 fr의 코트 단백질이고, 상기 방법은 상기 바이러스-유사 입자를 산화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 산화제는 (a) 과산화 수소 (여기에서 바람직하게 상기 과산화수소의 농도는 0.25-50 mM, 바람직하게 2 mM임); (b) 산소; (c) 글루타티온; (d) Cu2 +; 및 (e) Fe3 +로 구성된 군에서 선택되며, 가장 바람직하게 상기 산화제는 과산화수소이고, 더욱 바람직하게 상기 과산화수소의 농도는 0.25-50 mM, 바람직하게 2 mM이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 바이러스-유사 입자를 정제하는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 정제는 제2 완충액을 사용하는 제2 완충액 교환에 의하여 수행되며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 제2 완충액은 약제학적으로 허용되는 완충액이다. 바람직한 구체예에서, 상기 제2 완충액 교환은 제2 완충액을 사용하여 수행되며, 여기에서 바람직하게 상기 제2 완충액 교환은 투석 또는 연속 흐름 여과, 바람직하게 연속 흐름 여과에 의하여 수행된다. 상기 제2 완충액 교환은 상기 바이러스-유사 입자의 보류를 허용하는 분자량 컷 오프를 포함하는 막을 가로질러 수행되며, 바람직하게 상기 코트 단백질 및/또는 상기 올리고뉴클레오티드의 투과를 허용한다. 따라서, 바람직한 구체예에서, 상기 제2 완충액 교환은 100 내지 1000 kD, 바람직하게 300 kD의 분자량 컷 오프를 포함하는 막을 가로질러 수행되고, 여기에서 바람직하게 상기 제2 완충액 교환은 연속 흐름 여과에 의하여 수행된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 막은 300 kD 분자량 컷 오프를 포함하는 PLCMK-300이다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 제2 완충액 교환은 100 내지 1000 kD, 바람직하게 300 kD의 분자량 컷 오프를 포함하는 막을 가로지르는 연속 흐름 여과로 수행되며, 여기에서 바람직하게, 상기 혼합물 부피의 약 10 배가 교환되며, 여기에서 더욱 바람직하게 투과 흐름은 약 100 l/(m2*h)로 조정된다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 상기 바이러스-유사 입자를 농축하는 단계를 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 농축은 상기 조성물 중에 상기 바이러스 유사 입자가 1 내지 5 mg 단백질/㎖, 바람직하게 약 2.5 mg 단백질/㎖의 최종 농도가 될 때까지 수행되며, 여기에서 바람직하게 상기 농도는 브래드포드 단백질 분석으로 결정되며, 더욱 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자는 상기 제2 완충액 중에 용해된다. 매우 바람직한 구체예에서, 상기 농축은 상기 바이러스-유사 입자를 보유할 수 있는 막을 가로질러 수행되며, 여기에서 바람직하게 상기 막의 분자량 컷 오프는 100 내지 1000 kD, 바람직하게 약 300 kD이며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 농축은 100 l/(h*m2) 미만, 바람직하게 약 30 l/(h*m2)의 상기 막을 가로지른 투과 흐름으로 수행된다. 농축 단계 동안의 낮은 흐름 속도는 산물의 침전을 예방한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 상기 바이러스-유사 입자를 멸균 여과하는 단계를 추가로 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자가 상기 제2 완충액 중에 포함되며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 멸균 여과는 0.1 내지 0.45 ㎛, 바람직하게 약 0.22 ㎛를 포함하는 막 필터를 가로질러 수행된다.
더욱 바람직한 구체예에서, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 적어도 50 %, 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70 %, 더더욱 바람직하게 적어도 75 % 및 가장 바람직하게 적어도 80 %의 단백질 수율을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 적어도 50 %, 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70 %, 더더욱 바람직하게 적어도 75 % 및 가장 바람직하게 적어도 80 %의 올리고뉴클레오티드 수율을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 상기 조성물은 적어도 80 %, 바람직하게 적어도 90 %, 더욱 바람직하게 적어도 95 %, 더더욱 바람직하게 적어도 98 % 및 가장 바람직하게 적어도 99 %의 순도를 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 적어도 50 %, 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70 %, 더더욱 바람직하게 적어도 75 % 및 가장 바람직하게 적어도 80 %의 올리고뉴클레오티드 수율을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 본 발명에 따른 방법은 적어도 50 %, 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70 %, 더더욱 바람직하게 적어도 75 % 및 가장 바람직하게 적어도 80 %의 단백질 수율 및 올리고뉴클레오티드 수율을 포함한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 상기 조성물은 100 ㎍ 코트 단백질 당 15 내지 30 ㎍, 바람직하게 20 내지 25 ㎍ 및 가장 바람직하게 약 20 ㎍의 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 여기에서 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자는 박테리오파지 Qβ의 바이러스 유사 입자이고, 더욱 바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드는 G1O (서열 번호 8)이고, 여기에서 더더욱 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 상기 조성물은 적어도 98 %, 바람직하게 적어도 99 %의 순도를 포함하며, 여기에서, 더더욱 바람직하게 상기 코트 단백질의 정량은 브래드포드 단백질 분석으로 수행되며, 보다 바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드의 정량은 본질적으로, 바람직하게 정확히 실시예 9에 개시된 바와 같이 수행된다.
본 발명은 또한, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법에서, 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의하여 수득될 수 있는 뉴클레오티드 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기에서 바람직하게 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) 상기 뉴클레오티드 조성물을 제공하는 단계; (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기 어셈블되도록 하는 단계를 포함하며; 여기에서 바람직하게 상기 뉴클레오티드 조성물 중에 포함된 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 RNA 박테리오파지는 Qβ이고, 여기에서 더더욱 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 G1O (서열 번호 8)이다.
본 발명은 또한, (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법에서, 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용도에 관한 것이며, 여기에서 바람직하게 상기 방법은 (a) 상기 RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계; (b) 상기 뉴클레오티드를 제공하는 단계; (c) (i) 상기 코트 단백질; (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제; (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계; (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및 (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기 어셈블되도록 하는 단계를 포함하며; 여기에서 바람직하게 상기 RNA 박테리오파지는 Qβ이며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 G1O (서열 번호 8)이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의하여 수득될 수 있는 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 바람직하게 상기 RNA 박테리오파지는 Qβ이며, 더욱 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 G1O (서열 번호 8)이고, 더더욱 바람직하게 상기 조성물의 순도는 적어도 80 %, 바람직하게 적어도 90 %, 더욱 바람직하게 적어도 95 %, 더더욱 바람직하게 적어도 98 % 및 가장 바람직하게 적어도 99 %이며, 여기에서 더욱 바람직하게 상기 바이러스-유사 입자를 포함하는 조성물은 100 ㎍ 코트 단백질 당 상기 올리고뉴클레오티드를 15 내지 30 ㎍, 바람직하게 20 내지 25 ㎍, 및 가장 바람직하게 약 20 ㎍ 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법 중 임의의 것에 의해 수득될 수 있는 조성물에 관한 것이며, 상기 조성물은 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기에서 바람직하게 상기 RNA 박테리오파지는 Qβ이며, 더욱 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 G1O (서열 번호 8)이고, 더더욱 바람직하게 상기 조성물의 순도는 적어도 80 %, 바람직하게 적어도 90 %, 더욱 바람직하게 적어도 95 %, 더더욱 바람직하게 적어도 98 % 및 가장 바람직하게 적어도 99 %이며, 여기에서 상기 올리고뉴클레오티드는 DNAse 가수 분해에 영향받지 않는다.
실시예 1
올리고뉴클레오티드 G10 (서열 번호 8) 의 분리 및 응집
G10 의 정량:
G10은 340 nm에서의 흡광도에 의해 보정된 260 nm에서의 UV 흡광도에 의하여 정량하였으며, 여기에서 1 A260-340은 1 cm 패쓰 길이에서 27.8 ㎍/㎖의 농도에 상응한다.
분리(10.0 ㎖ 스케일, 260 μM G1O , 25 mM NaOH , 50℃, 70분):
45.91 mg G1O을 15 ㎖ 튜브에 무게를 재 넣었다. 분말을 11.0 ㎖ 정제수(c= 325.3 μM; 분광분석법으로 결정) 중에 용해하였다. 8.0 ㎖의 올리고뉴클레오티드 용액을 15 ㎖ 튜브 중에 250 ㎕ 1 M NaOH 및 1.75 ㎖ 정제수와 혼합하였다 (260 μM G1O, 25 mM NaOH). 혼합물을 수조 중에 50℃에서 70 분 동안 분리하였다. 용액을 얼음에서 냉각시킨 다음, 0.5 M HCl을 사용하여 pH를 pH 5.31으로 조정하고; 540 ㎕ 0.5 M HCl 및 5 ㎕ 1 M NaOH를 첨가하였다.
응집 (10.0 ㎖ 스케일, 175 μM G1O , 250 mM Na + , 85 ℃, 9-24 분):
7.1 ㎖ 분리된 G1O 용액, 2.13 ㎖ 정제수 및 770 ㎕ 3 M NaCl을 15 ㎖ 튜브 중에서 혼합하였다(175 μM 올리고, 250 mM Na+). 혼합물을 수조에서 85 ℃로 9 분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 얼음/수조에서 냉각시키고, 사용할 때까지 얼음에 보관하였다. 응집된 올리고뉴클레오티드 용액은 제조 후 3 시간 내에 사용되어야 한다.
실시예 2
올리고뉴클레오티드 G4 -4의 분리 및 응집
분리:
정제 수 중 260μM 올리고뉴클레오티드 G4-4 (서열 번호 2) 및 25 mM NaOH의 용액을 제조하였다. 용액을 70 분 동안 50 ℃로 가열한 다음, 얼음에서 냉각시키고, 0.5 M HCl을 사용하여 용액의 pH를 5 내지 8의 pH로 조정하였다.
응집:
분리된 G4-4를 포함하는 용액을 230 μM G4-4 및 250 mM Na+의 최종 농도까지 정제수 및 3 M NaCl로 희석하였다. 수 분 (2 내지 70 분) 동안 6.8 ℃/분의 가열 램프를 사용하여 혼합물을 80 ℃로 가열하였다. 인큐베이션 후, 6.8 ℃/분의 가열 램프로 혼합물을 0-2 ℃로 냉각시켰다.
크기 배제 HPLC (실시예 4 참조)에 의한 산물의 분석으로, 응집된 올리고뉴클레오티드가 수득되는 것으로 나타났다 (상대 피크 시작 시간: 88 %).
실시예 3
올리고뉴클레오티드 분리 및 응집
분리:
정제 수 중에 각각 올리고뉴클레오티드 G5-5 (서열 번호 3), G6-6 (서열 번호 4), G7-7 (서열 번호 5), G8-8 (서열 번호 6), G9-9 (서열 번호 7) 및 G11 (서열 번호 9) 260μM 및 25 mM NaOH를 제조하였다. 용액을 70 분 동안 50 ℃로 가열한 다음, 얼음에서 냉각시키고, 0.5 M HCl를 사용하여 용액의 pH를 5 내지 8의 pH로 조정하였다.
응집:
분리된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 용액을 230 μM 올리고뉴클레오티드 및 250 mM Na+의 최종 농도까지 정제수 및 3 M NaCl로 희석하였다. 수 분 (2 내지 70 분) 동안 6.8 ℃/분의 가열 램프를 사용하여 혼합물을 80 ℃로 가열하였다. 인큐베이션 후, 6.8 ℃/분의 가열 램프를 사용하여 혼합물을 0-2 ℃로 냉각시켰다.
응집 방법의 산물을 크기 배제 HPLC로 분석하였다 (실시예 4 참조).
실시예 4
크기 배제 HPLC 에 의한 올리고뉴클레오티드 G10 의 응집 상태 분석
G10의 응집 상태를 다음 조건을 사용하여 분석적 크기 배제 HPLC로 분석하였다:
컬럼: TSKgel 5000 PWXL 7.8 mm * 30.0 cm (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
용리액: PBS (20 mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.2 중 150 mM NaCl)
주입 부피: 40.0 ㎕ (바람직하게 약 20 μM 내지 약 500 μM의 농도 포함)
흐름 속도: 0.8 ㎖/분
구배: 등용매용리
수행 시간: 20 분
파장: 215, 260 및 280 nm, 260 nm에서 데이터 평가
컬럼 오븐 온도: 25 ℃
오토샘플러 온도: 8 ℃
박테리오파지 Qβ의 캡시드를 표준으로 사용하였다.
Qβ 캡시드(상대 피크 시작 시간 Qβ)에 대한 G10의 피크 시작 시간 X %를 다음과 같이 계산하였다: X % = 올리고뉴클레오티드의 피크 시작 시간 [분]/Qβ 캡시드 표준의 체류 시간 [분] x 100 %, 여기에서, 올리고뉴클레오티드의 피크 시작 시간을 올리고뉴클레오티드의 용리가 검출가능하게 되는 시간으로 결정하였고, Qβ 캡시드 표준의 체류 시간은 표준의 최대 피크의 발생 시간으로 결정하였다. 올리고뉴클레오티드 G10 및 표준으로서 박테리오파지 Qβ의 캡시드의 용리 프로필의 예를 도 1에 도시하였다. 도 1에 도시된 크로마토그램에 기초하여, 88%의 상대 피크 시작 시간을 응집된 올리고뉴클레오티드에 대하여 계산하였다.
실시예 5
미처리, 분리 및 응집된 올리고뉴클레오티드 G10 의 상대 피크 시작 시간의 비교
본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된 분리 및 응집된 G10의 상대 피크 시작 시간을 결정하고, 상업적 공급자로부터 수득되는 미처리된 G10의 상대 피크 시작 시간과 비교하였다. 분리된 G10은 138 % (136.9 - 140.3 %; n = 5)의 상대 피크 시작 시간을 나타내었다. 실시예 1에 기술된 분리/응집 처리를 수행하지 않은 G10 제제는 분리된 G10과 동일한 범위의 상대 피크 시작 시간을 나타내었 다. 분리 및 응집 후, G10의 피크 시작 시간은 88 %인 것으로 관찰되었다.
실시예 6
분리 단계의 효과
실시예 1에 기술된 바와 같이 미처리된 올리고뉴클레오티드 G10 및 분리된 올리고뉴클레오티드 G10을 본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 응집시켰으며, 여기에서 다음 응집 조건을 선택하였다: 175 μM G1O, 250 mM Na+(3 M NaCl의 첨가에 의하여), 16분 동안 85 ℃에서 인큐베이션 한 다음, 얼음에서 냉각. 두 제제를 Qβ 캡시드 및 표준으로서 미처리된 G10을 사용하여 크기 배제 HPLC (실시예 4 참조)로 분석하였다. 얻은 HPLC 크로마토그램을 도 2에 도시하였다.
미처리된 G10은 응집된 G10을 포함하였다 (도 2A 및 2B, 박스 1 참조). 응집 전에 분리되지 않은 응집된 G10은 Qβ 캡시드와 동등하거나 더 높은 겉보기 분자량을 나타내었다 (도 2A, 박스 2). 상대 피크 시작 시간은 약 75 %였다. 응집 전에 분리된 응집된 G10은 Qβ 캡시드보다 더 낮은 겉보기 분자량을 보유하였다 (도 2B, 박스 2). 상대 피크 시작 시간은 약 88 %였다.
실시예 7
원편광 이색성(Circular Dichroism)에 의한 올리고뉴클레오티드 G10 의 응집 상태 분석
미처리, 분리 및 응집된 G10(본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조) 및 G10과 함께 패키징된 Qβ 캡시드(실시예 10에 기술되는 바와 같이 수득되는 Qb G1O)의 CD 스펙트럼을 JASCO J-715 분광 광도계 200 nm 내지 300 nm에서 기록하였다 (도 3). 응집된 G10의 스펙트럼은 262 nm에서 최대치 및 240 nm에서 골을 갖는 강한 양성 밴드 (고 타원율 (high elliptic))를 특징으로 하였다. 이들 신호를 평행의 오리엔테이션 가닥들을 지닌 DNA 테트라플렉스(tetraplex)의 전형적인 스펙트럼에 상응하여 기록하였다 (Lu et al., Biochemistry 31, p.2455, 1992). 중요하게, 250 nm - 300 nm의 영역에서 CD 스펙트럼의 형상은 응집된 G10의 존재 하에서 리어셈블된 VLP의 스펙트럼을 변화시키지 않았다. 따라서, G10은 패키징에 따라 형태적 변화를 수행하는 것으로 보이지 않는다. 262 nm에서 진폭의 약간의 증가는 아마도 Qβ 캡시드로의 응집된 G10의 선택적 패키징을 반영하는 것이며, 패키징 후 비-응집된 분자의 분획을 여전히 함유하는 응집된 G10과 비교하여 더 높은 비율의 테트라플렉스를 유발한다. 반대로, 미처리된 G10의 스펙트럼은 정의된 최대치가 없는 낮은 타원율을 특징으로 하며, 이는 정의된 2차 및 3차 구조 요소의 결여를 나타낸다. 295 nm에서 최대치 및 262 nm에서 최소치의 출현이 일부 병렬의 테트라플렉스 컨포머가 존재할 수 있음을 반영할지라도, 분리된 G10에 대한 낮은 CD 신호가 또한 관찰되었다(P. Balagurumoorthy et al., Nucleic Acids Research 20, p. 4061, 1992).
실시예 8
디스어셈블리 / 리어셈블리에 의한 G1O 과 함께 Qβ VLP 의 패키징
Qβ VLP 의 디스어셈블리:
PBS (20 mM 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.5) 중 45 mg Qβ VLP (2.5 mg/㎖, 브래드포드 분석으로 결정)를 교반 조건 하에서 실온에서 15 분 동안 10 mM DTT를 사용하여 환원시켰다. 그 다음, 염화 마그네슘을 0.7 M 최종 농도로 첨가하고, 교반 조건 하에서 실온에서 15 분 동안 인큐베이션을 계속하여, 캡슐화된 숙주 세포 RNA의 침전 및 동시에 발생하는 VLP의 분해를 유발하였다. 용액을 4 ℃, 4000 rpm에서 10 분 동안 원심분리(Eppendorf 5810 R, 다음 모든 단계에서 사용되는 고정된 앵글 로터 A-4-62)하여, 용액으로부터 침전된 RNA를 분리하였다. 방출된, 다이머 Qβ 코트 단백질을 포함하는 상층액을 크로마토그래피 정제 단계에서 사용하였다.
양이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피에 의한 Qβ 코트 단백질의 정제:
다이머 코트 단백질, 숙주 세포 단백질 및 잔류 숙주 세포 RNA를 포함하는 디스어셈블리 반응의 상층액을 SP-세파로스 FF 컬럼 (xk16/20, 6 ㎖, Amersham Bioscience)에 로딩하였다. 컬럼을 20 mM 인산 나트륨 완충액 pH 7로 평형화하고, 컬럼에 대한 코트 단백질의 적절한 결합을 위하여, 샘플을 수 중에 1:15로 희석하여, 10 mS/cm 미만의 전도성으로 조정하였다. 결합 코트 단백질의 용리를 20 mM 인산 나트륨 / 500 mM 염화 나트륨으로의 단계 구배로 수행하고, 단백질을 약 25 ㎖의 분획 부피 중에 수집하였다. 모든 단계 중에 5 ㎖/분의 유속으로 실온에서 크로마토그래피를 수행하고, 흡광도를 260 nm 및 280 nm에서 모니터하였다. 두번째 단계에서, 분리된 Qβ 코트 단백질(양이온 교환 컬럼으로부터 용리된 분획)을 20 mM 인산 나트륨 / 250 mM 염화 나트륨; pH 7.2으로 평형화한 Sephacryl S-100 HR 컬럼 (xk26/60, 320 ㎖, Amersham Bioscience)에 로딩하였다. 2.5 ㎖/분의 유속으로 실온에서 크로마토그래피를 수행하고, 흡광도를 260 nm 및 280 nm에서 모니터하였다. 5 ㎖의 분획을 수집하였다.
분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의한 정제된 Qβ 코트 단백질의 특성:
정제된 Qβ 코트 단백질의 샘플을 분석적 크기 배제 크로마토그래피(도 1C)로 분석하고, i) E.coli 용해물로부터 정제되고 정제 과정을 위한 소스 물질로 사용되는 온전한 Qβ VLP (도 4A) 및 ii) 디스어셈블리 반응의 상층액 (도 4B)와 비교하였다. 코트 단백질로부터의 RNA 분자의 효율적인 분리는 도 4C에서 임의의 RNA-유사 피크(A280/A260의 전형적인 비 = 0.5)의 부재 및 독특한 단백질-유사 피크(A280/A260의 전형적인 비 = 1.7)의 존재에 의하여 나타났다.
정용 여과( diafiltration )에 의한 Qβ G10 의 어셈블리:
정제된 코트 단백질 (20 mM 인산 나트륨 pH 7.2 중 250 mM NaCl)을 물 및 우레아, NaCl, DTT 및 응집된 G1O 올리고뉴클레오티드 (본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조)의 스톡 용액과 혼합하였다. 혼합물의 부피는 50 ㎖이었고, 성분의 최종 농도는 1 mg/㎖ 코트 단백질, 1.0 M 우레아, 250 mM NaCl, 2.5 mM DTT 및 0.24 mg/㎖ G1O이었다. 그 다음, 용액을 실온에서 30 kDa 컷 오프 카트리지 (Pellicon XL, Millipore), 10 ㎖/분의 교차 흐름 속도 및 2.5 ㎖/분의 침투 흐름 속도를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨 250 mM NaCl pH 7.2, 300 ㎖에 대하여 정용 여과하였다. H2O2를 7 mM 최종 농도로 첨가하고, 용액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 이황화 결합의 형성을 유도하였다. 그 다음 용액을 300 kDa 컷 오프 카트리지 (Pellicon XL, Millipore), 10 ㎖/분의 교차 흐름 속도 및 2.5 ㎖/분의 침투 흐름 속도를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨 150 mM NaCl pH 7.2, 500 ㎖에 대하여 정용 여과하여, 어셈블된 QβG10 산물로부터 과량의 H2O2 및 비-패키징 G10 올리고뉴클레오티드를 제거하였다.
실시예 9
패키징 방법의 수율 결정 및 Qβ G10 패키징 산물의 분석
분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의한 패키징 Qβ G10 VLP 의 특성:
패키징 QβG10 VLP의 샘플을 분석적 크기 배제 크로마토그래피 (도 5)로 분석하고, E. coli 용해물로부터 정제된 온전한 Qβ VLP와 비교하였다. 다음 변수를 사용하여 상기 분석적 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다:
컬럼: Bio-Sil SEC 250, 7.8 x 300 mm, Cat. No. 125-0062
용리액: 50 mM 인산 나트륨 pH 6.5, 150 mM NaCl
구배: 등용매용리
컬럼 온도: 25 ℃
오토샘플러 온도: 8 ℃
유속: 1.0 ㎖/분
샘플 농도: 1.0 ㎎/㎖ 단백질
주입 부피: 40 ㎕
평가 파장: 280 nm
밴드폭: 4 nm
수행 시간: 20 분
샘플 제조:
용리액을 사용하여 1.0 ㎎/㎖로 샘플을 희석하고, 샘플을 짧게 보텍싱하고(vortexing), 4 ℃, 16,000g에서 10 분 동안 원심분리하였다.
산물 중에 바르게 어셈블된 VLP의 존재는 본래 Qβ VLP를 나타내는 피크와 동일한 체류 시간에서 피크 이동으로 확인된다. QβG10 VLP에 대하여 관찰된 피크 (도 5D)는 VLP의 핵산 함량에 의하여 지배되며, 이는 260 nm에서 핵산의 흡광 계수가 코트 단백질의 흡광 계수보다 100 배 이상 더 높기 때문이다. 정제된 QβG10 VLP의 A260/A280 비가 1.70 (1.65 - 1.76; n = 5)인 것으로 나타났으며, 이는 G10 (A260/A280 = 1.74)에 대한 특징이고, 여기에서 QβVLP의 A260/A280 비는 1.87 (1.85 - 1.90; n = 10)인 것으로 나타났고, 이는 RNA에 대한 특징이다.
SDS - PAGE 분석에 의한 패키징된 Qβ G10 VLP 의 특성:
패키징된 Qβ G10의 샘플을 비-환원성 SDS-PAGE로 분석하고(도 6), E. coli 용해물로부터 정제된 온전한 Qβ VLP와 비교하였다. 산물 중에 바르게 어셈블된 VLP의 존재는 온전한 Qβ VLP와 유사한 코트 단백질의 이황화-결합된 펜타머 및 헥 사머 형태의 밴드 형성으로 확인하였으며, 이는 시험관 내에서 어셈블된 QβG10 VLP에서 코트 단백질 단위체의 바른 구조적 배열을 나타낸다.
패키징된 올리고뉴클레오티드 G10 의 정량화:
QβG1O VLP (PBS 중 0.25 mg/㎖)의 샘플을 0.1 mM TCEP (트리스(2-클로로에틸)포스페이트) (실온에서 15분)로 처리하여, 이황화 결합을 환원시켰다. NaCl을 환원된 샘플에 첨가하고 (1M 최종 농도), 혼합물을 60 ℃에서 15 분 동안 인큐베이션하여 단백질 성분을 침전시켰다. 원심분리 후, 생성된 상층액을 95 ℃에서 5 분 동안 인큐베이션하고, 얼음에서 1 분 동안 냉각시킨 다음, A260 값을 측정하였다. 상층액 중에 올리고뉴클레오티드 G10의 농도를 다음 식에 따라 계산하였다:
c(G1O) (mg/㎖) = A260 x 1.12 x 9600 / 344580,
상기 식에서:
1.12 = 샘플 중 염 함량에 대한 보정 상수
9600 = 올리고뉴클레오티드 G10의 분자 질량
344580 = 올리고뉴클레오티드 G10의 특정 몰 흡광 계수
전형적으로, 패키징된 올리고뉴클레오티드 G10의 양은 Qβ 코트 단백질 mg 당 0.2 mg이었다.
패키징 반응을 위한 수율 계산 및 Qβ G10 VLP 의 G10 함량:
실시예 8에 기술된 바와 같은 VLP의 어셈블리/리어셈블리로 응집된 G10을 Qβ VLP로 패키징하였다. 953 mg의 G1O 올리고뉴클레오티드를 4000 mg의 정제된 Q β 다이머와의 리어셈블리를 위하여 도입하였다. 상기 반응으로, 100 ㎍ 단백질 (브래드포드 분석 또는 HPLC로 결정된 단백질 함량) 당 20 ㎍ G10 올리고뉴클레오티드를 포함하는 Qβ G10을 얻었다. 패키징 반응의 G10 수율은 75 %의 단백질 수율에서 63%였다.
실시예 10
정용 여과에 의한 Qβ G10 의 어셈블리 및 수율의 결정
본질적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이 정제된 Qβ 코트 단백질을 수득하였다. 20 mM 인산 나트륨 pH 7.2, 250 mM NaCl 중의 코트 단백질을 물 및 우레아, NaCl, DTT 및 응집된 G10 올리고뉴클레오티드 (본질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조; 분리된 G10의 상대 피크 시작 시간은 135%이고, 응집된 G10의 상대 피크 시작 시간은 88%임)의 스톡 용액과 혼합하였다. 혼합물의 부피는 1.6 L였고, 성분의 최종 농도는 2.5 mg/㎖ 코트 단백질, 1.0 M 우레아, 25O mM NaCl, 2.5 mM DTT 및 0.6 mg/㎖ G1O였다. 그 다음, 용액을 실온에서 30 kDa 컷 오프 카트리지 (Pellicon Mini2, 0.1 m2 필터 면적, Millipore) 및 384 ℓ/(h*m2)의 교차 흐름 속도 및 96 ℓ/(h*m2)의 침투 흐름 속도를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨 250 mM NaCl pH 7.2, 9.6 ℓ에 대하여 정용 여과하였다. H2O2를 2 mM 최종 농도로 첨가하고, 용액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 이황화 결합의 형성을 유도하였다. 그 다음 용액을 300 kDa 컷 오프 카트리지 (Pellicon Mini2, 0.1 m2 필터 면적, Millipore) 및 300 ℓ/(h*m2)의 교차 흐름 속도 및 100 ℓ/(h*m2)의 침투 흐름 속도를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨 150 mM NaCl pH 7.2, 16 ℓ에 대하여 정용 여과하여, 응집된 Qβ G10 산물로부터 과량의 H2O2 및 비-패키징 G10 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 산물을 접촉류 여과(tangential flow filtration)하여 2.5 mg/㎖로 농축시키고, 0.22 ㎛를 통하여 여과하였다. 주요 공정 단계를 표 1에 요약하였다.
표 1: QβG10의 정제 및 어셈블리를 위한 공정 단계의 요약
공정 단계 변수 공정 단계의 생산
G10의 분리 G10 농도: 260 μM NaOH 농도: 25 mM 온도: 50 ℃ 가열 시간: 70 분 스케일: 1.1 g G10, V=440 ㎖(10 ㎖ 분취액 중) G10의 상대 피크 시작 시간: 138 %
분리된 G10 용액의 중화 사용된 산: 0.5 M H3PO4 pH 7.2
G10 용액의 재응집 G10 농도: 175 μM Na+ 농도: 250 mM 온도: 85 ℃ 가열 시간: 10 분 스케일: 1.1 g G10, V=654 ㎖(10 ㎖ 분취액 중) G10의 상대 피크 시작 시간: 88 %
시작 물질의 융해 온도: 22 ℃ Q베타 다이머 용액
리어셈블리 혼합물의 제조 다이머 농도: 2.5 mg/㎖ 우레아 농도: 1 M DTT 농도: 2.5 mM G10 농도: 62.5 μM 혼합 시간: 60 ± 10 분 온도: 22 ± 3 ℃ 스케일: 4 g Qβ 다이머; V=1.6 ℓ 정용 여과 1을 위한 용액
연속 정용 여과 1 막: 30 kDa MWCO 면적: 0.1 ㎡ 정용 여과 부피: 6(9.6 ℓ침투 수집) 완충액: NaP250 pH 7.2 표적 기간: 60 분 온도: 22 ℃ 플럭스: 96 ℓ(h*㎡) V=1.6 ℓ 우레아 및 DTT의 제거로 유발된 G10 코어 물질 주위의 Q베타 다이머 형태 VLP
과산화 수소로 산화 H2O2 농도: 2 mM 온도: 22 ℃ 반응 시간: 60 ± 10 분 V=1.6 ℓ 이황화 결합의 형성 및 이에 따른 VLP의 안정화
연속 정용 여과 2 막: 300 kDa MWCO 면적: 0.1 ㎡ 정용 여과 부피: 10(16 ℓ) 완충액: 약제학적으로 허용되 는 완충액 온도: 22 ± 3 ℃ 플럭스: 100 ℓ(h*㎡) V=1.6 ℓ 잔류 과산화 수소 및 잔류 비패키징 G10의 제거
Qβ G10의 농도 막: 300 kDa MWCO 면적: 0.1 ㎡ 온도: 22 ± 3 ℃ 침투 흐름: <100 ℓ(h*㎡) V=1.2 ℓ 농도 = 2.5 mg/㎖
Qβ G10의 여과 0.22 ㎛ PES 막 필터 미생물 함량 (Bioburde n) 감소
산물의 순도를 크기 배제 크로마토그래피로 분석하여, 99.28 %인 것으로 나타났으며, 예를 들어, QbG10 피크는 실시예 4에 기술된 바와 같은 크로마토그래피 수행 중 전체 피크 면적의 99.28 %에 달한다. 단백질 수율 및 올리고뉴클레오티드 수율을 실시예 8에 기술된 바와 같이 결정하였다. 전체 공정에서 단백질 수율은 75 %였다. 전체 공정에서 올리고뉴클레오티드 수율은 75 %였다.
실시예 11
어셈블리 공정에서 G10 의 응집 상태의 효과
139 %의 상대 피크 시작 시간을 갖는 G10이 실시예 8에 기술된 바와 같은 어셈블리 공정에 사용되는 경우, 무시해도 좋은 양의 GbG10만이 형성되며, VLP 산물이 분리될 수 없었다.
실시예 12
디스어셈블리 / 리어셈블리에 의한 G10 과 함께 AP205 및 GA355 VLP의 패키징
디스어셈블리 :
완충액 A (5 mM NaPO4 pH 6.8, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2) 중의 50-100 mg의 AP205 또는 GA355 VLP (브래드포드 분석으로 결정)를 30 ℃에서 각각 1 mg/㎖ 및 5 U/㎖의 RNAse A (Sigma) 및 Benzonase (Novagen)와 함께 16 시간 동안 인큐베이션하였다. AP205 VLP의 경우에, RNAse A 및 Benzonase 첨가 이전에 20 mM DTT의 첨 가 후, 37 ℃에서 30 분 인큐베이션하여, 내부 이황화 결합의 탈산화(deoxidation)를 수행하였다. 1 M NaCl의 첨가 후, 70 ℃에서 15 분 인큐베이션하여 바이러스 코트 단백질의 침전을 유도하였다. 침전된 코트 단백질을 4 ℃, 27,00Og에서 10분 동안 원심 분리하여 침전시켰다. RNAse A, Benzonase 및 분해된 핵산을 함유하는 상층액을 버렸다. 펠렛을 완충액 B (20 mM NaPO4 pH 7.2, 6 M 우레아) 중에 재현탁시키고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.
양이온 교환 크로마토그래피에 의한 코트 단백질의 정제:
용액을 10 분 동안 4 ℃, 27,00Og에서 원심분리하여 깨끗하게 하였다. 무시해도 되는 펠렛을 버렸다. 그리고 디스어셈블 코트 단백질을 함유하는 상층액을 완충액 B (20 mM NaPO4 pH 7.2, 6 M 우레아)로 평형화된 SP SepharoseTM FF 컬럼 (16/20, Amersham Biosciences)에 적용하였다. 통해 흘러나온 것을 버렸다. 완충액 B (15 CV)로 광대하게 세척한 후, 컬럼을 37.5 CV의 구배 길이를 가지고, 완충액 B에서 완충액 C (20 mM NaPO4 pH 7.2, 1 M 우레아)로 선형 구배로 조정하였다. 로딩, 세척 및 용리하는 동안 254 nm 및 280 nm에서 흡광도를 모니터하였다. 완충액 D (20 mM NaPO4 pH 6.5, 1 M 우레아, 300 mM NaCl)를 사용하여 하나의 분획으로 코트 단백질을 용리하고, LDS-PAGE로 분석한 후, 쿠마시 염색하였다. 용리된 단백질 분획을 "디스어셈블 코트 단백질"로서 4 ℃에 보관하였다. 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 결정하였다.
리어셈블리 :
정제된 AP205 또는 GA355 코트 단백질을 G10 올리고뉴클레오티드에 대하여 5배 과량으로 사용하였다. 코트 단백질을 1 M 우레아 및 2.5 mM DTT를 함유하는 리어셈블리 완충액 중에서 G10 올리고뉴클레오티드와 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 리어셈블리 혼합물을 5 리터 PBS에 대하여 24 시간 동안 투석하였다. 생성된 현탁액을 4 ℃, 27,00Og에서 10 분 동안 원심분리하였다. 무시할 수 있는 침전물을 버렸다. 상층액에 리어셈블 및 패키징된 VLP가 포함되어 있었다. 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 결정하고, 리어셈블 및 패키징된 VLP를 원심분리 필터 장치 (Amicon Ultra 15, 1OK MWCO)로 농축하였다.
리어셈블 및 패키징된 VLP 의 정제:
최대 25 mg의 총 단백질을 PBS로 평형화된 SepharoseTM CL-4B (26/60, Amersham Biosciences)에 로딩하였다. 1.25 ㎖/분의 유속으로 실온에서 평형화 완충액으로 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 용리하는 동안, 254 nm 및 260 nm에서의 흡광도를 모니터하였다. 두개의 피크를 분리하였다. 주요한 고분자량 피크는 더 낮은 겉보기 분자량의 작은 피크보다 상위에 존재한다. 주요한 피크는 SE-HPLC에 나타낸 바와 같이 정제된 VLP와 일관된 겉보기 분자량을 나타내었다. G10 올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 AP205 또는 GA355 VLP의 분석을 본질적으로 제 WO03/024481호의 실시예 16(p. 131 ff)에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
실시예 13
디스어셈블리 / 리어셈블리에 의하여 G10 과 함께 Fr VLP 의 패키징
디스어셈블리:
완충액 A (5 mM NaPO4 pH 6.8, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2) 중 50-100 mg의 FR VLP (브래드포드 분석으로 결정)를 각각 1 mg/㎖ 및 5 U/㎖의 RNAse A (Sigma) 및 Benzonase (Novagen)와 함께 30 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다. 1 M NaCl을 첨가한 후, 70 ℃에서 15분 인큐베이션하여 FR 코트 단백질의 침전을 유도하였다. 침전된 코트 단백질을 4 ℃, 27,00Og에서 10 분 동안 원심분리하여 침전시켰다. RNAse A, Benzonase 및 분해된 핵산을 함유하는 상층액을 버렸다. 펠렛을 완충액 B (20 mM NaPO4 pH 7.2, 6 M 우레아) 중에 재현탁하고, 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.
양이온 교환 크로마토그래피에 의한 FR 코트 단백질의 정제:
용액을 10 분 동안 4 ℃, 27,00Og에서 원심분리하여 깨끗하게 하였다. 무시해도 되는 펠렛을 버리고, 디스어셈블 코트 단백질을 함유하는 상층액을 완충액 B로 평형화된 SP SepharoseTM FF 컬럼 (16/20, Amersham Biosciences)에 적용하였다. 흘러나온 것을 버렸다. 완충액 B (15 CV)로 광대하게 세척한 후, 컬럼을 37.5 CV의 구배 길이를 가지고, 완충액 B에서 완충액 C (20 mM NaPO4 pH 7.2, 1 M 우레아)로 선형 구배로 조정하였다. 로딩, 세척 및 용리하는 동안 254 nm 및 280 nm에서 흡광도를 모니터하였다. 완충액 D (20 mM NaPO4 pH 6.5, 1 M 우레아, 300 mM NaCl)를 사용하여 하나의 분획으로 FR 코트 단백질을 용리하고, LDS-PAGE로 분석한 후, 쿠마시 염색하였다. 용리된 단백질 분획을 "디스어셈블 코트 단백질"로 서 4 ℃에 보관하였다. 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 결정하였다.
리어셈블리 :
정제된 FR 코트 단백질을 G10 올리고뉴클레오티드에 대하여 5배 과량(w/w)으로 사용하였다. FR 코트 단백질을 1 M 우레아 및 2.5 mM DTT를 함유하는 리어셈블리 완충액 중에서 G10 올리고뉴클레오티드와 혼합하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 리어셈블리 혼합물을 5 리터 PBS에 대하여 24 시간 동안 투석하였다. 생성된 현탁액을 4 ℃, 27,00Og에서 10 분 동안 원심분리하였다. 무시할 수 있는 침전물을 버렸다. 상층액에 리어셈블 및 패키징된 FR VLP가 포함되어 있었다. 단백질 농도를 브래드포드 분석으로 결정하고, 리어셈블 및 패키징된 FR VLP를 원심분리 필터 장치 (Amicon Ultra 15, 1OK MWCO)로 농축하였다.
리어셈블 및 패키징된 FR VLP 의 정제:
최대 25 mg의 총 단백질을 PBS로 평형화된 SepharoseTM CL-4B (26/60, Amersham Biosciences)에 로딩하였다. 1.25 ㎖/분의 유속으로 실온에서 평형화 완충액으로 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 용리하는 동안, 254 nm 및 260 nm에서의 흡광도를 모니터하였다. 두개의 피크를 분리하였다. 주요한 고분자량 피크는 더 낮은 겉보기 분자량의 작은 피크보다 상위에 존재한다. 주요한 피크는 SE-HPLC에 나타낸 바와 같이 정제된 FR VLP와 일관된 겉보기 분자량을 나타내었다. G10 올리고뉴클레오티드와 함께 패키징된 FR VLP의 분석을 본질적으로 제 WO03/024481호의 실시예 16(p. 131 ff)에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
실시예 14
정용 여과에 의한 Qβ G8 의 어셈블리 및 수율의 결정
정제된 Qβ 코트 단백질을 본질적으로 실시예 8에 기술된 바와 같이 수득하였다. 20 mM 인산 나트륨 pH 7.2, 250 mM NaCl 중의 코트 단백질을 물 및 우레아, NaCl, DTT 및 응집된 G8 올리고뉴클레오티드 (본질적으로 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조; 분리된 G8의 상대 피크 시작 시간은 113%이고, 응집된 G8의 상대 피크 시작 시간은 88%임)의 스톡 용액과 혼합하였다. 혼합물의 부피는 1.6 L였고, 성분의 최종 농도는 1 mg/㎖ 코트 단백질, 1.0 M 우레아, 25O mM NaCl, 2.5 mM DTT 및 0.24 mg/㎖ G8였다. 그 다음, 용액을 실온에서 30 kDa 컷 오프 카트리지 (Pellicon Mini2, 0.1 m2 필터 면적, Millipore) 및 384 ℓ/(h*m2)의 교차 흐름 속도 및 96 ℓ/(h*m2)의 침투 흐름 속도를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨 250 mM NaCl pH 7.2, 9.6 ℓ에 대하여 정용 여과하였다. H2O2를 2 mM 최종 농도로 첨가하고, 용액을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 이황화 결합의 형성을 유도하였다. 그 다음 용액을 300 kDa 컷 오프 카트리지 (Pellicon Mini2, 0.1 m2 필터 면적, Millipore) 및 300 ℓ/(h*m2)의 교차 흐름 속도 및 100 ℓ/(h*m2)의 침투 흐름 속도를 사용하여, 20 mM 인산 나트륨 150 mM NaCl pH 7.2, 16 ℓ에 대하여 정용 여과하여, 어셈블된 QβG8 산물로부터 과량의 H2O2 및 비-패키징 G8 올리고뉴클레오티드를 제거하였다. 산물을 접촉류 여과하여 2.5 mg/㎖로 농축시키고, 0.22 ㎛ 필터를 통 하여 여과하였다.
SEQUENCE LISTING <110> Cytos Biotechnology AG Kinzler, Matthias Proba, Karl <120> PROCESSES FOR PACKAGING OLIGONUCLEOTIDES INTO VIRUS-LIKE PARTICLES OF RNA BACTERIOPHAGES <130> P1070PC00 <150> US 60/812,592 <151> 2006-06-12 <150> PCT/EP2006/069734 <151> 2006-12-14 <160> 23 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 1 gacgatcgtc 10 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 2 gggggacgat cgtcgggg 18 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 3 ggggggacga tcgtcggggg 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 4 gggggggacg atcgtcgggg gg 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 5 ggggggggac gatcgtcggg gggg 24 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 6 ggggggggga cgatcgtcgg gggggg 26 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 7 gggggggggg acgatcgtcg gggggggg 28 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 8 gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg 30 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> chemically synthesized <400> 9 gggggggggg ggacgatcgt cggggggggg gg 32 <210> 10 <211> 132 <212> PRT <213> bacteriophage Qb <400> 10 Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val 50 55 60 Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 11 <211> 329 <212> PRT <213> bacteriophage Qb <400> 11 Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly 1 5 10 15 Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser 65 70 75 80 Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95 Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln 115 120 125 Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140 Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro 145 150 155 160 Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu 165 170 175 Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala 180 185 190 Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 210 215 220 Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu 245 250 255 Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu 260 265 270 Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His 275 280 285 Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300 Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile 305 310 315 320 Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala 325 <210> 12 <211> 129 <212> PRT <213> bacteriophage R17 <400> 12 Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125 Tyr <210> 13 <211> 130 <212> PRT <213> bacteriophage fr <400> 13 Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr 100 105 110 Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130 <210> 14 <211> 130 <212> PRT <213> bacteriophage GA <400> 14 Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45 Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val 50 55 60 Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe 115 120 125 Tyr Ala 130 <210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> bacteriophage SP <400> 15 Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys 50 55 60 Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 16 <211> 329 <212> PRT <213> bacteriophage SP <400> 16 Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp 1 5 10 15 Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45 Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val 50 55 60 Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp 65 70 75 80 Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr 85 90 95 Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala 100 105 110 Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn 115 120 125 Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp 130 135 140 Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro 145 150 155 160 Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly 165 170 175 Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg 180 185 190 Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205 Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 210 215 220 Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp 225 230 235 240 Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly 245 250 255 Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu 260 265 270 Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala 275 280 285 Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro 305 310 315 320 Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser 325 <210> 17 <211> 130 <212> PRT <213> bacteriophage MS2 <400> 17 Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15 Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45 Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu 50 55 60 Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80 Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe 85 90 95 Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125 Ile Tyr 130 <210> 18 <211> 133 <212> PRT <213> bacteriophage M11 <400> 18 Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly 1 5 10 15 Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80 Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95 Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu 100 105 110 Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn 115 120 125 Leu Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 19 <211> 133 <212> PRT <213> bacteriophage MX1 <400> 19 Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly 1 5 10 15 Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80 Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95 Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu 100 105 110 Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn 115 120 125 Leu Asn Pro Ala Tyr 130 <210> 20 <211> 330 <212> PRT <213> bacteriophage NL95 <400> 20 Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly 1 5 10 15 Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30 Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45 Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60 Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys 65 70 75 80 Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe 85 90 95 Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 100 105 110 Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu 115 120 125 Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly 130 135 140 Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly 165 170 175 Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys 180 185 190 Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205 Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp 210 215 220 Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp 225 230 235 240 Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp 245 250 255 Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr 260 265 270 Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala 275 280 285 Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300 Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro 305 310 315 320 Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu 325 330 <210> 21 <211> 129 <212> PRT <213> bacteriophage f2 <400> 21 Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15 Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30 Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45 Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80 Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95 Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110 Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125 Tyr <210> 22 <211> 128 <212> PRT <213> bacteriophage PP7 <400> 22 Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu 1 5 10 15 Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val 20 25 30 Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn 35 40 45 Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp 50 55 60 Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg 65 70 75 80 Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr 85 90 95 Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala 100 105 110 Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg 115 120 125 <210> 23 <211> 131 <212> PRT <213> bacteriophage AP205 <400> 23 Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile 1 5 10 15 Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser 35 40 45 Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly 50 55 60 Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg 65 70 75 80 Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu 85 90 95 Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn 100 105 110 Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp 115 120 125 Thr Thr Ala 130

Claims (53)

  1. (a) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 알칼리성 pH를 갖는 용액 I 중에 제공하는 단계;
    (b) (i) 용액 I의 온도를 4 내지 70℃의 온도 I로 조정하는 단계;
    (ii) 상기 올리고뉴클레오티드가 110 % 초과의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 상기 온도 I에서 상기 용액 I 중에 인큐베이션하는 단계;
    (iii) 상기 용액 I의 온도를 0 내지 70 ℃의 온도 II로 조정하는 단계를 포함하여, 상기 올리고뉴클레오티드를 분해하는 단계;
    (c) 상기 용액 I의 pH를 pH 5 내지 8로 조정하는 단계; 및
    (d) (i) 상기 올리고뉴클레오티드를, pH 5 내지 8이고 Na+, K+, NH4 +, Li+, Ca2+ 및 Mg2 +로 구성된 군에서 선택되는 적어도 20 mM의 양이온을 포함하는 용액 II 중에 제공하는 단계;
    (ii) 용액 II의 온도를 50 내지 99℃의 온도 III으로 조정하는 단계;
    (iii) 상기 올리고뉴클레오티드가 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지, 상기 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계; 및
    (iv) 용액 II의 온도를 50 ℃ 미만의 온도 IV로 조정하는 단계를 포함하여, 상기 올리고뉴클레오티드를 응집하는 단계를 포함하는,
    올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 온도 I이 45 내지 70 ℃, 바람직하게 약 50 ℃ 및 가장 바람직하게 50 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 온도 II가 온도 I 미만이며, 바람직하게 온도 II가 0 내지 25 ℃, 가장 바람직하게 0 내지 2 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 III이 80 내지 90 ℃, 바람직하게 약 85 ℃, 가장 바람직하게 85 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 I의 온도를 온도 II로 조정하는 단계가 적어도 3.6 ℃/분의 온도 램프(ramp)로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 온도 IV가 0 내지 25 ℃, 바람직하게 0 내지 2 ℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 II의 온도를 온도 IV로 조정하는 단계가 적어도 3.6 ℃/분의 온도 램프로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 I이 pH 8 내지 13, 바람직하게 12를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 I이 10 mM 내지 200 mM, 바람직하게 약 25 M, 가장 바람직하게 25 mM의 농도로, 알칼리 금속의 수산화물, 바람직하게 수산화 칼륨 또는 수산화 나트륨, 가장 바람직하게 수산화 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 I의 pH를 조정하는 단계가 용액 I에 산, 바람직하게 인산 첨가로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 I의 pH를 조정하는 단계가 pH가 6 내지 7이 될 때까지 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온이 Na+ 또는 K+, 바람직하게 Na+인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 II가 200 내지 275 mM, 바람직하게 250 mM의 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 I 중에 올리고뉴클레오티드의 농도가 50 μM 내지 2 mM, 가장 바람직하게 260 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 용액 II 중의 올리고뉴클레오티드의 농도가 50 μM 내지 2 mM, 바람직하게 100 내지 300 μM, 가장 바람직하게 175 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드를 온도 III에서 용액 II 중에 인큐베이션하는 단계가 상기 올리고뉴클레오티드가 80 내지 95 %, 바람직하게 80 내지 90 %, 더더욱 바람직하게 83 내지 90 %, 보다 바람직하게 85 내지 90 %, 및 가장 바람직하게 88 %의 상대 피크 시작 시간을 포함할 때까지 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 그의 5' 말단에 3개 이상 및 15개 이하의 구아노신 엔티티(entity) 및 그의 3' 말단에 3 개 이상 및 15개 이하의 구아노신 엔티티를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 팔린드롬(palindromic) 서열을 포함하고, 이는 바람직하게 GACGATCGTC (서열 번호 1)이고, 더욱 바람직하게 그의 5' 말단에서 3개 이상 및 15개 이하의 구아노신 엔티티에 의해 프랭킹되며(franked), 그의 3' 말단에서 3개 이상 및 15개 이하의 구아노신 엔티티에 의해 프랭킹되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 10 내지 1000개 뉴클레오티드, 바람직하게 10 내지 200개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게 10 내지 100개 뉴클레오티드, 더더욱 바람직하게 20 내지 40개 뉴클레오티드, 가장 바람직하게 30개 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 다음으로 구성된 군에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) "G4-4" GGGGGACGATCGTCGGGG (서열 번호 2);
    (b) "G5-5" GGGGGGACGATCGTCGGGGG (서열 번호 3);
    (c) "G6-6" GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (서열 번호 4);
    (d) "G7-7" GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (서열 번호 5);
    (e) "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (서열 번호 6);
    (f) "G9-9" GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (서열 번호 7);
    (g) "G1O" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (서열 번호 8);
    (h) "G11" GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (서열 번호 9).
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 핵산 서열 "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (서열 번호 6)을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 핵산 서열 "GlO" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (서열 번호 8)을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의하여 수득될 수 있으며, 바람직하게 50 내지 110 %, 바람직하게 80 내지 95 %, 더욱 바람직하게 80 내지 90 %, 더더욱 바람직하게 83 내지 90 %, 보다 바람직하게 85 내지 90 % 및 가장 바람직하게 88 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 조성물.
  24. 제 23항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 핵산 서열 "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (서열 번호 6), 또는 "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8), 바람직하게 핵산 서열 "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  25. (a) RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계;
    (b) (i) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치를 포함하며,
    (ii) 50 내지 110%의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계;
    (c) (i) 상기 코트 단백질,
    (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제,
    (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계;
    (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및
    (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기-어셈블되도록 하는 단계를 포함하여,
    (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
  26. (a) RNA 박테리오파지의 코트 단백질을 제공하는 단계;
    (b) 제 23항 또는 제 24항의 뉴클레오티드 조성물을 제공하는 단계;
    (c) (i) 상기 코트 단백질,
    (ii) 상기 코트 단백질의 자기-어셈블리를 예방할 수 있는 제제,
    (iii) 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물을 생성하는 단계;
    (d) 상기 혼합물로부터 상기 제제를 제거하는 단계; 및
    (e) 상기 코트 단백질이 바이러스-유사 입자로 자기-어셈블되도록 하는 단계를 포함하여,
    (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
  27. 제 25항 또는 제 26항에 있어서, 코트 단백질이 RNA 박테리오파지의 재조합 단백질, 또는 이의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 박테리오파지가 다음으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 박테리오파지 Qβ;
    (b) 박테리오파지 R17;
    (c) 박테리오파지 fr;
    (d) 박테리오파지 GA;
    (e) 박테리오파지 SP;
    (f) 박테리오파지 MS2;
    (g) 박테리오파지 M11;
    (h) 박테리오파지 MX1;
    (i) 박테리오파지 NL95;
    (j) 박테리오파지 f2;
    (k) 박테리오파지 PP7; 및
    (l) 박테리오파지 AP205.
  29. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 박테리오파지가 Qβ인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 박테리오파지가 AP205인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 박테리오파지가 fr인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 박테리오파지가 GA인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 25항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 코트 단백질이 다음으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하거나, 바람직하게 이로 구성되는 것을 특징으 로 하는 방법:
    (a) 서열 번호 10 (Qβ CP);
    (b) 서열 번호 10 및 서열 번호 11 (Qβ A1 단백질)의 혼합물;
    (c) 서열 번호 12 (R17 코트 단백질);
    (d) 서열 번호 13 (fr 코트 단백질);
    (e) 서열 번호 14 (GA 코트 단백질);
    (f) 서열 번호 15 (SP 코트 단백질);
    (g) 서열 번호 15 및 서열 번호 16의 혼합물;
    (h) 서열 번호 17 (MS2 코트 단백질);
    (i) 서열 번호 18 (M11 코트 단백질);
    (j) 서열 번호 19 (MX1 코트 단백질);
    (k) 서열 번호 20 (NL95 코트 단백질);
    (l) 서열 번호 21 (f2 코트 단백질);
    (m) 서열 번호 22 (PP7 코트 단백질); 및
    (n) 서열 번호 23 (AP205 코트 단백질).
  34. 제 25항 내지 제 33항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중에 코트 단백질의 농도가 1 내지 4 mg/㎖, 바람직하게 2.5 mg/㎖인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 25항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중에 올리고뉴클레오 티드의 농도가 25 내지 100 μM, 바람직하게 62.5 μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 25항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중에 올리고뉴클레오티드 및 코트 단백질의 몰비가 0.5 내지 1.2, 바람직하게 0.7인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 31항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 우레아 및 구아니디늄하이드로클로라이드에서 선택되며, 바람직하게 상기 변성 화합물은 우레아이며, 더욱 바람직하게 혼합물 중에 상기 우레아의 농도가 0.25 내지 7.2 M, 바람직하게 1 M인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 25항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 환원제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 25항 내지 제 31항 및 제 33항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 코트 단백질이 바이러스-유사 입자에서 분자간 이황화 결합을 형성할 수 있는 시스테인 잔기를 포함하고, 제제가 환원제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38항 또는 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 환원제가 DTT이며, 바람직하게 혼합물 중에 상기 DTT의 농도가 1 내지 25 mM, 바람직하게 2.5 mM인 것을 특징 으로 하는 방법.
  41. 제 25항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물로부터 제제를 제거하는 단계가 염화 나트륨을 포함하는 제1 완충액을 사용하는 제1 완충액 교환에 의하여 수행되며, 바람직하게 상기 제1 완충액 중에 상기 염화 나트륨의 농도는 0 내지 1 M, 바람직하게 0 내지 550 mM, 더욱 바람직하게 0 내지 350 mM, 더더욱 바람직하게 50 내지 350 mM 및 가장 바람직하게 250 mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 제1 완충액 교환은 분자량 컷 오프(cut off)가 1 내지 50 kD, 바람직하게 5 내지 30 kD, 가장 바람직하게 30 kD를 포함하는 막을 가로질러 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 25항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스-유사 입자를 산화제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 산화제는 바람직하게 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (a) 바람직하게 0.25 내지 50 mM, 바람직하게 2 mM 농도의 과산화 수소;
    (b) 산소;
    (c) 글루타티온;
    (d) Cu2 +; 및
    (e) Fe3 +.
  44. 제 25항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스-유사 입자를 정제하는 단계를 추가로 포함하며, 바람직하게 정제는 약제학적으로 허용되는 완충액인 제2 완충액을 사용하는 제2 완충액 교환을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 제2 완충액 교환이 분자량 컷 오프가 100 내지 1000 kD, 바람직하게 300 kD을 포함하는 막을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 25항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 수율이 적어도 75%이고/거나 올리고뉴클레오티드 수율이 적어도 75%인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 26항 내지 제 45항 중 어느 한 항의 방법에서 제 1항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득될 수 있는 뉴클레오티드 조성물의 용도.
  48. 제 25항 내지 제 45항 중 어느 한 항에 따른 방법에서 (i) 적어도 하나의 폴리 G 스트레치; 및 (ii) 50 내지 110 %의 상대 피크 시작 시간을 포함하는 올리고뉴클레오티드의 용도.
  49. 바람직하게 (i) RNA 박테리오파지의 바이러스-유사 입자 및 (ii) 상기 바이러스-유사 입자로 패키징된 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 제 25항 내지 제 45항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 수득할 수 있는 조성물.
  50. 제 49항에 있어서, RNA 박테리오파지가 박테리오파지 Qβ, 박테리오파지 AP205, 박테리오파지 fr, 또는 박테리오파지 GA, 바람직하게 박테리오파지 Qβ인 것을 특징으로 하는 조성물.
  51. 제 49항 또는 제 50항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 핵산 서열 "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (서열 번호 6) 또는 "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8), 바람직하게, 핵산 서열 "G1O" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (서열 번호 8)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  52. 제 49항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물의 순도가 적어도 80%, 바람직하게 적어도 90 %, 더욱 바람직하게 적어도 95 %, 더더욱 바람직하게 적어도 98 %, 및 가장 바람직하게 적어도 99 %인 것을 특징으로 하는 조성물.
  53. 제 49항 내지 제 51항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드가 DNAse 가수분해에 영향받지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020097000353A 2006-06-12 2007-06-12 올리고뉴클레오티드를 ｒｎａ 박테리오파지의 바이러스-유사 입자로 패키징하는 방법 KR101552227B1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US81259206P 2006-06-12 2006-06-12
US60/812,592 2006-06-12
WOPCT/EP06/69734 2006-12-14
PCT/EP2006/069734 WO2007068747A1 (en) 2005-12-14 2006-12-14 Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090016634A true KR20090016634A (ko) 2009-02-16
KR101552227B1 KR101552227B1 (ko) 2015-09-10

Family

ID=40243628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097000353A KR101552227B1 (ko) 2006-06-12 2007-06-12 올리고뉴클레오티드를 ｒｎａ 박테리오파지의 바이러스-유사 입자로 패키징하는 방법

Country Status (20)

Country Link
US (4) US8541559B2 (ko)
EP (2) EP2530086B1 (ko)
JP (2) JP5437797B2 (ko)
KR (1) KR101552227B1 (ko)
CN (1) CN101466720B (ko)
AU (1) AU2007260236B2 (ko)
BR (1) BRPI0713651B1 (ko)
CA (1) CA2655108C (ko)
DK (1) DK2032592T3 (ko)
ES (2) ES2738986T3 (ko)
IL (1) IL195526A (ko)
MX (1) MX2008015529A (ko)
NZ (1) NZ573622A (ko)
PL (1) PL2032592T3 (ko)
PT (1) PT2032592E (ko)
RU (1) RU2476595C2 (ko)
SG (1) SG172696A1 (ko)
SI (1) SI2032592T1 (ko)
WO (1) WO2007144150A1 (ko)
ZA (1) ZA200810109B (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070059207A (ko) 2004-10-05 2007-06-11 사이토스 바이오테크놀로지 아게 Ｖｌｐ-항원 컨쥬게이트 및 백신으로서 그의 용도
PL2032592T3 (pl) 2006-06-12 2013-11-29 Kuros Biosciences Ag Sposoby pakowania oligonukleotydów do cząstek wirusopodobnych z bakteriofagów RNA
WO2008071774A1 (en) * 2006-12-14 2008-06-19 Cytos Biotechnology Ag Purification process for coat protein of rna bacteriophages
US8088392B2 (en) * 2007-06-18 2012-01-03 Yunxu Cao Capsid proteins and uses therefore
US20110020388A1 (en) 2009-05-27 2011-01-27 Selecta Biosciences, Inc. Targeted synthetic nanocarriers with ph sensitive release of immunomodulatory agents
EA023397B1 (ru) 2010-05-26 2016-05-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Комбинированные вакцины с синтетическими наноносителями
EA027410B1 (ru) 2011-04-29 2017-07-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Наноносители, вызывающие иммунную толерантность, для снижения ответной реакции цитотоксических t-лимфоцитов
WO2013019658A2 (en) 2011-07-29 2013-02-07 Selecta Biosciences, Inc. Synthetic nanocarriers comprising polymers comprising multiple immunomodulatory agents
WO2015024992A2 (en) * 2013-08-22 2015-02-26 Cytos Biotechnology Ag Treatment of asthma
NZ734144A (en) 2014-12-31 2023-06-30 Checkmate Pharmaceuticals Inc Combination tumor immunotherapy
US11000472B2 (en) 2015-04-06 2021-05-11 Lg Household & Health Care Ltd. Soluble microneedle for delivering poorly-soluble drug
WO2017173334A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Fc receptor-mediated drug delivery
WO2017179025A1 (en) 2016-04-15 2017-10-19 Alk-Abelló A/S Epitope polypeptides of ragweed pollen allergens
BR112019009469A2 (pt) * 2016-11-09 2019-07-30 Pulmotect Inc métodos e composições para a modulação imunológica adaptativa
SG11202009647VA (en) * 2018-04-09 2020-10-29 Checkmate Pharmaceuticals Packaging oligonucleotides into virus-like particles
AU2022208435A1 (en) 2021-01-18 2023-08-10 Conserv Bioscience Limited Coronavirus immunogenic compositions, methods and uses thereof

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2034118A1 (en) 1970-07-09 1972-01-13 Seinfeld, Hugo, Brendel, Walter, Prof Dr . 8000 München Xenogenic nucleic acids for enhancing antigenicity - of peptides and proteins
US5374426A (en) 1986-09-03 1994-12-20 University Of Saskatchewan Rotavirus nucleocapsid protein VP6 in vaccine compositions
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8913737D0 (en) 1989-06-15 1989-08-02 Univ Birmingham A novel anti-allergy treatment
US5039813A (en) 1990-06-29 1991-08-13 Polaroid Corporation 2-(4-alkenylphenyl)-5-oxazolones and polymers thereof
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
WO1992011291A1 (en) 1990-12-20 1992-07-09 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Vaccines based on hepatitis b surface antigen
GB9101550D0 (en) 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
GB9114003D0 (en) 1991-06-28 1991-08-14 Mastico Robert A Chimaeric protein
GB9213601D0 (en) 1992-06-26 1992-08-12 Mastico Robert A Protein based delivery system
CA2140542A1 (en) 1992-07-27 1994-02-03 Abeysingle Padmapriya Oligonucleotide alkylphosphonothioates
FR2695563B1 (fr) 1992-09-11 1994-12-02 Pasteur Institut Microparticules portant des antigènes et leur utilisation pour l'induction de réponses humorales ou cellulaires.
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US6727230B1 (en) 1994-03-25 2004-04-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
EP0772619B2 (en) 1994-07-15 2010-12-08 The University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US7935675B1 (en) 1994-07-15 2011-05-03 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US5935821A (en) 1995-01-17 1999-08-10 Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Polynucleotides related to monoclonal antibody 1A7 and use for the treatment of melanoma and small cell carcinoma
WO1996030523A2 (en) 1995-03-31 1996-10-03 Hans Wolf Antigen presentation system based on retrovirus-like particles
US5994315A (en) 1995-06-07 1999-11-30 East Carolina University Low adenosine agent, composition, kit and method for treatment of airway disease
HU220105B (hu) 1996-01-23 2001-10-28 Icn Pharmaceuticals, Inc. Ribavirin alkalmazása TH1- és TH2- válaszreakció befolyásolására szolgáló készítmények előállítására
CZ235798A3 (cs) 1996-01-24 1999-03-17 Aliatros Medical, A. S. Prostředek pro léčení rakoviny a způsob jeho výroby
JP4359654B2 (ja) 1996-01-30 2009-11-04 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ カリフォルニア 抗原特異的免疫応答を生起させる遺伝子発現ベクターおよびその使用方法
GB9621091D0 (en) 1996-10-09 1996-11-27 Fondation Pour Le Perfectionem Attenuated microorganisms strains and their uses
ATE292980T1 (de) 1996-10-11 2005-04-15 Univ California Immunostimulierende oligonucleotidekonjugate
EP0855184A1 (en) 1997-01-23 1998-07-29 Grayson B. Dr. Lipford Pharmaceutical composition comprising a polynucleotide and an antigen especially for vaccination
GB9702021D0 (en) 1997-01-31 1997-03-19 Imperial College Medicaments
JP2001513776A (ja) 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU7350798A (en) 1997-04-29 1998-11-24 Universiteit Utrecht Corona virus-like particles as tools for vaccination and therapy
CA2288129A1 (en) 1997-05-01 1998-11-12 Chiron Corporation Use of virus-like particles as adjuvants
AU7690898A (en) 1997-05-20 1998-12-11 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
CA2291483C (en) 1997-06-06 2012-09-18 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory oligonucleotides, compositions thereof and methods of use thereof
EP1012173B1 (en) 1997-06-23 2007-10-31 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated decapeptides which bind to hla molecules, and the use thereof
DE19731784A1 (de) 1997-07-24 1999-02-04 Bayer Ag Substituierte N-Aryl-N-thioxocarbonyl-sulfonamide
US6169175B1 (en) 1997-08-06 2001-01-02 Centers For Disease Control And Prevention Preparation and use of recombinant influenza A virus M2 construct vaccines
DK1009413T3 (da) 1997-09-05 2007-06-11 Univ California Anvendelse af immunstimulerende oligonukleotider til forebyggelse eller behandling af astma
US6171591B1 (en) 1997-12-08 2001-01-09 Pentamer Pharmaceuticals, Inc. Recombinant nodavirus compositions and methods
JP2002510644A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション 免疫治療用オリゴヌクレオチドおよびサイトカインを用いる免疫系刺激のための方法および産物
US5990085A (en) 1998-05-04 1999-11-23 Michigan State University Inhibin-HBc fusion protein
IL139646A0 (en) 1998-05-14 2002-02-10 Coley Pharm Group Inc Methods for regulating hematopoiesis using cpg-oligonucleotides
DK1091928T3 (da) 1998-06-30 2007-07-23 Om Pharma Nye acylerede pseudodipeptider, fremgangsmåde til disses fremstilling og sammensætninger, som indeholder dem
WO2000006588A1 (en) 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
US5962636A (en) 1998-08-12 1999-10-05 Amgen Canada Inc. Peptides capable of modulating inflammatory heart disease
EP1108017A2 (en) 1998-09-03 2001-06-20 Coley Pharmaceutical GmbH G-motif oligonucleotides and uses thereof
AU770802B2 (en) 1998-10-21 2004-03-04 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Virus-like particles for the induction of autoantibodies
RU2245163C2 (ru) 1998-11-30 2005-01-27 Сайтос Байотекнолэджи АГ Композиция (варианты), способ получения не природной упорядоченной и содержащей повторы антигенной матрицы, способ терапевтического лечения и способ иммунизации
CA2357004A1 (en) 1998-12-23 2000-06-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research Expression of immunogenic hepatitis b surface antigens in transgenic plants
CA2358385C (en) 1998-12-31 2013-08-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
WO2000046365A1 (en) 1999-02-02 2000-08-10 Biocache Pharmaceuticals, Inc. Advanced antigen presentation platform
HUP0105490A3 (en) 1999-02-25 2002-05-28 Peptide Therapeutics Ltd Cambr Epitopes or mimotopes derived from the c-epsilon-3 or c-epsilon-4 domains of ige, antagonists thereof, and their therapeutic uses
CA2689696C (en) 1999-02-26 2013-08-06 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
WO2000054803A2 (en) 1999-03-16 2000-09-21 Panacea Pharmaceuticals, Llc Immunostimulatory nucleic acids and antigens
US6977245B2 (en) 1999-04-12 2005-12-20 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Oligodeoxynucleotide and its use to induce an immune response
CZ303515B6 (cs) 1999-04-19 2012-11-07 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Adjuvantní prostredek
WO2001000232A2 (en) 1999-06-29 2001-01-04 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Use of cpg as an adjuvant for hiv vaccine
CA2380947C (en) 1999-08-19 2011-11-01 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
AU6801800A (en) 1999-08-30 2001-03-26 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nona and decapeptides which bind to hla molecules, and the use thereof
JP2001151698A (ja) 1999-09-10 2001-06-05 Nichiko Pharmaceutical Co Ltd インフルエンザワクチン
TR200503031T2 (tr) 1999-09-25 2005-09-21 University Of Iowa Research Foundation İmmünostimülatör nükleik asitler
US6949520B1 (en) 1999-09-27 2005-09-27 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
EP1220684B2 (en) 1999-09-27 2010-07-14 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Methods related to immunostimulatory nucleic acid-induced interferon
DE60043708D1 (de) 1999-10-13 2010-03-04 Novartis Vaccines & Diagnostic Verfahren zur erhaltung zellimmuneantworten gegen proteinen
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
EP1233783B9 (en) 1999-11-24 2006-03-15 Chiron Corporation Hbv/hcv virus-like particle
US20010044416A1 (en) 2000-01-20 2001-11-22 Mccluskie Michael J. Immunostimulatory nucleic acids for inducing a Th2 immune response
AT409085B (de) 2000-01-28 2002-05-27 Cistem Biotechnologies Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung zur immunmodulation und herstellung von vakzinen
EP1975182A1 (en) 2000-02-01 2008-10-01 PanGenetics B.V. CD40-binding APC-activating molecules
US7585847B2 (en) 2000-02-03 2009-09-08 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Immunostimulatory nucleic acids for the treatment of asthma and allergy
US6756044B1 (en) 2000-02-09 2004-06-29 Genvec, Inc. Antigenic complexes and methods
US6423539B2 (en) 2000-02-24 2002-07-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Adjuvant treatment by in vivo activation of dendritic cells
EP1278542A2 (en) 2000-05-05 2003-01-29 Cytos Biotechnology AG Molecular antigen arrays and vaccines
AUPQ912000A0 (en) 2000-07-31 2000-08-24 Crown In The Right Of The Queensland Department Of Health, The Improved virus like particles
US20030055014A1 (en) 2000-12-14 2003-03-20 Bratzler Robert L. Inhibition of angiogenesis by nucleic acids
US7094409B2 (en) 2001-01-19 2006-08-22 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of allergic eosinophilic diseases
US7128911B2 (en) 2001-01-19 2006-10-31 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays for treatment of bone disease
US7264810B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Cytos Biotechnology Ag Molecular antigen array
US20030050268A1 (en) 2001-03-29 2003-03-13 Krieg Arthur M. Immunostimulatory nucleic acid for treatment of non-allergic inflammatory diseases
WO2003040308A2 (en) 2001-07-27 2003-05-15 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Use of sterically stabilized cationic liposomes to efficiently deliver cpg oligonucleotides in vivo
AU2002339224B2 (en) * 2001-09-14 2008-10-09 Kuros Us Llc Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use
US20030091593A1 (en) 2001-09-14 2003-05-15 Cytos Biotechnology Ag In vivo activation of antigen presenting cells for enhancement of immune responses induced by virus like particles
ES2321491T3 (es) 2001-10-05 2009-06-08 Cytos Biotechnology Ag Conjugados que llevan peptido angiotensina y uso de los mismos.
US7115266B2 (en) 2001-10-05 2006-10-03 Cytos Biotechnology Ag Angiotensin peptide-carrier conjugates and uses thereof
DK1455593T3 (da) 2001-10-06 2013-08-26 Merial Ltd Fremgangsmåder og sammensætninger til fremme af vækst og medfødt immunitet hos unge dyr
BR0213950A (pt) 2001-11-07 2004-08-24 Cytos Biotechnology Ag Arranjos de antìgenos para o tratamento de doenças eosinofólicas alérgicas
CA2465981A1 (en) 2001-11-07 2003-05-15 Cytos Biotechnology Ag Antigen arrays comprising rankl for treatment of bone disease
TW200303759A (en) 2001-11-27 2003-09-16 Schering Corp Methods for treating cancer
US20030219459A1 (en) 2002-01-18 2003-11-27 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
WO2003059386A2 (en) 2002-01-18 2003-07-24 Cytos Biotechnology Ag Prion protein carrier-conjugates
AU2003242742B2 (en) * 2002-06-20 2009-04-30 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles for use as adjuvants: method of preparation and use
RU2324704C2 (ru) 2002-07-17 2008-05-20 Цитос Байотекнолоджи Аг Молекулярные массивы антигенов
WO2004009124A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Cytos Biotechnology Ag Ghrelin-carrier conjugates
WO2004071493A1 (en) 2003-02-17 2004-08-26 Peter Burkhard Peptidic nanoparticles as drug delivery and antigen display systems
EP1605973B1 (en) * 2003-03-26 2012-09-26 Cytos Biotechnology AG Packaging of immunostimulatory oligonucleotides into virus-like particles: methods of preparation and uses
US7537767B2 (en) * 2003-03-26 2009-05-26 Cytis Biotechnology Ag Melan-A- carrier conjugates
US20060210588A1 (en) * 2003-03-26 2006-09-21 Cytos Biotechnology Ag Hiv-peptide-carrier-conjugates
WO2005004907A1 (en) * 2003-07-10 2005-01-20 Cytos Biotechnology Ag Packaged virus-like particles
EP1646427A1 (en) 2003-07-22 2006-04-19 Cytos Biotechnology AG Cpg-packaged liposomes
CN101454451A (zh) 2003-10-30 2009-06-10 科勒制药有限公司 具有增强免疫刺激能力的c类寡核苷酸类似物
CN102895663A (zh) 2004-04-14 2013-01-30 健泰科生物技术公司 含有用于调节血管发育的egfl7拮抗剂的组合物及方法
CN1960752A (zh) 2004-06-02 2007-05-09 赛托斯生物技术公司 非人类tnf－肽的载体偶联物的医药用途
DE102004041340A1 (de) 2004-08-20 2006-02-23 Deutsche Gelatine-Fabriken Stoess Ag Nanopartikel und Verfahren zu deren Herstellung
JP2008513035A (ja) * 2004-09-21 2008-05-01 サイトス バイオテクノロジー アーゲー Ａｐ２０５のコートタンパク質と抗原性ポリペプチドとの融合タンパク質を含んでなるウイルス粒子
ES2424229T3 (es) 2005-03-18 2013-09-30 Cytos Biotechnology Ag Proteínas de fusión de alérgenos de gato y utilización de las mismas
CA2608579C (en) 2005-05-26 2019-09-10 Cytos Biotechnology Ag Scalable fermentation process
CN101267834B (zh) 2005-09-28 2013-06-05 赛托斯生物技术公司 白介素-1偶联物及其用途
US20070184068A1 (en) 2005-12-14 2007-08-09 Cytos Biotechnology Ag Immunostimulatory nucleic acid packaged particles for the treatment of hypersensitivity
PL2032592T3 (pl) 2006-06-12 2013-11-29 Kuros Biosciences Ag Sposoby pakowania oligonukleotydów do cząstek wirusopodobnych z bakteriofagów RNA
JP5396809B2 (ja) 2008-10-17 2014-01-22 ソニー株式会社 固体撮像装置、カメラ、および、固体撮像装置の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
DK2032592T3 (da) 2013-09-02
JP2014097057A (ja) 2014-05-29
KR101552227B1 (ko) 2015-09-10
BRPI0713651B1 (pt) 2020-02-18
MX2008015529A (es) 2009-01-13
CA2655108C (en) 2019-05-07
SG172696A1 (en) 2011-07-28
ES2738986T3 (es) 2020-01-28
AU2007260236B2 (en) 2013-05-16
ZA200810109B (en) 2010-02-24
RU2476595C2 (ru) 2013-02-27
SI2032592T1 (sl) 2013-10-30
CA2655108A1 (en) 2007-12-21
US20100273237A1 (en) 2010-10-28
EP2032592B1 (en) 2013-07-31
CN101466720A (zh) 2009-06-24
BRPI0713651A2 (pt) 2012-10-23
PL2032592T3 (pl) 2013-11-29
WO2007144150A1 (en) 2007-12-21
JP5437797B2 (ja) 2014-03-12
US8541559B2 (en) 2013-09-24
US20180171358A1 (en) 2018-06-21
IL195526A (en) 2015-06-30
JP2009539907A (ja) 2009-11-19
EP2032592A1 (en) 2009-03-11
US9902972B2 (en) 2018-02-27
US20140186405A1 (en) 2014-07-03
IL195526A0 (en) 2009-09-01
RU2008151507A (ru) 2010-07-20
US20150004688A1 (en) 2015-01-01
EP2530086B1 (en) 2019-03-20
ES2427994T3 (es) 2013-11-05
US9404126B2 (en) 2016-08-02
AU2007260236A1 (en) 2007-12-21
CN101466720B (zh) 2013-01-02
PT2032592E (pt) 2013-08-28
EP2530086A1 (en) 2012-12-05
NZ573622A (en) 2011-12-22
US10358656B2 (en) 2019-07-23
JP6057882B2 (ja) 2017-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10358656B2 (en) Oligonucleotides packaged into virus-like particles of RNA bacteriophages
JP2004180689A (ja) 動物起源のアデノウイルスベクターおよび遺伝子治療におけるそれらの使用
JP2024012286A (ja) ウイルス様粒子中へのオリゴヌクレオチドのパッケージ化
WO2008071774A1 (en) Purification process for coat protein of rna bacteriophages
AU2013204383B2 (en) Processes for packaging oligonucleotides into virus-like particles of RNA bacteriophages
RU2816533C2 (ru) Упаковка олигонуклеотидов в вирусоподобные частицы
WO2022234051A1 (en) Split prime editing enzyme
Pahari et al. Mutagenesis study to ameliorate the bacterial expression of phosphoprotein P of vesicular stomatitis virus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant