JP2014097057A - Rnaバクテリオファージのウイルス様粒子にオリゴヌクレオチドをパッケージ化するための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(i)RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii)該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法。さらに、前記の方法において用いられるのに適したオリゴヌクレオチドを含有してなるヌクレオチド組成物を作製するための方法。前記方法によって入手可能なヌクレオチド組成物とその使用。前記(i)のRNAバクテリオファージのウイルス様粒子と、前記(ii)の、該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなり、前記方法によって入手可能であり、好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の純度を含む組成物。
【選択図】なし
Description
オリゴヌクレオチド調製物が最適の粒子サイズと狭いサイズの分布を有する集合体を含む場合に、前記コートタンパク質の自己集合体化は最も効率が良い。さらに驚くべきことに、オリゴヌクレオチドを凝集(aggregate)工程の前に解離(disaggregate)工程を行うと、オリゴヌクレオチドの集合状態がより効率良く制御されうること、サイズ分布がより狭いオリゴヌクレオチド調製物が得られることを発見した。前記方法は、本明細書中に記載した実施態様といずれか一の特徴とをいずれかの組み合わせで含んでよい。
「CpGモチーフ」:本明細書中で用いる「CpGモチーフ」なる用語は、短いDNA配列、好ましくは一本鎖のDNA配列であって、シトシン(C)−グアノシン(G)ジヌクレオチドを含むものを指し、このときCはメチル化されておらず、該CGジヌクレオチドがホスホジエステル結合であることが好ましい。好ましくは、CpGモチーフは少なくとも1、好ましくは1、2又は3の、付加的なヌクレオチド5'及び/又は3'の該CGジヌクレオチドを含み、このとき該付加的なヌクレオチドはCGジヌクレオチドを含まないことがさらに好ましい。
「相対的なピークのスタート時間」:「相対的なピークのスタート時間」なる用語はオリゴヌクレオチドの集合状態を表すパラメーターである。オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間は分析的サイズ排除HPLCによって測定され、このとき基本的に、好ましくは厳密に以下のパラメーターによって該HPLCを実施する。
カラム: TSKgel 5000 PWXL 7.8mm×30.0cm (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤: PBS(150mM NaClを含む20mM リン酸ナトリウムバッファ、pH7.2)
注射体積: 40.0μl(およそ20μM〜およそ500μMの濃度を含むのが好ましい)
流速: 0.8ml/分
勾配: アイソクラチック
ランタイム: 20分
波長: 215、260及び280nm、260nmでのデータ評価
カラムオーブン温度: 25℃
自動回収装置の温度: 8℃、
そして、前記RNAバクテリオファージのキャプシドを標準物質として用いる。前記RNAバクテリオファージのキャプシドと比較したときの前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間X%は以下の通りに算出される。X%=オリゴヌクレオチドのピークのスタート時間[分]÷標準物質[分]の持続時間×100%、このときオリゴヌクレオチドのピークのスタート時間はオリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になる時間として測定し、標準物質の持続時間は該標準物質の最大のピークが生じる時間として測定した。したがって、前記RNAバクテリオファージが例えばバクテリオファージAP205である実施態様では、AP205のキャプシドを前記HPLCの標準物質として用い、前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間は該AP205標準物質と比較して算出される。重要なことには、RNAバクテリオファージでない実施態様では、相対的なピークのスタート時間は、バクテリオファージQβのキャプシドを標準物質として用いて常に決定される。さらに、前記HPLCの適切な標準物質の選択に関していくらか不確定である場合には、バクテリオファージQβのキャプシドが標準物質として用いられ、相対的なピークのスタート時間は該バクテリオファージQβのキャプシドと比較して決定される。ゆえに、非常に好適な実施態様では、前記相対的なピークのスタート時間は前記HPLCによって測定され、このとき該標準物質はバクテリオファージQβのキャプシドであることが好ましく、該相対的なピークのスタート時間は該バクテリオファージQβのキャプシドと比較して決定されることがさらに好ましい。
「オリゴヌクレオチド収率」:本発明の方法のオリゴヌクレオチド収率は、前記混合物に含まれるオリゴヌクレオチドの量と比較したときの、該方法の最終工程後にウイルス様粒子から回収されうるオリゴヌクレオチドの量として決定され、このとき好ましくは、ウイルス様粒子から回収されるオリゴヌクレオチドの量は基本的に又は好ましくは厳密に実施例9に開示したように決定される。典型的にかつ好ましくは、前記混合物に含有されるオリゴヌクレオチドの少なくとも70%、好ましくは少なくとも75%は、前記方法の最終工程の後にウイルス様粒子から回収されるものであり、該最終工程は前記滅菌濾過であることが好ましい。
「one」、「a/an」:「one」、「a」又は「an」なる用語を本開示中で使用するとき、それらは、特に示さない限りは、「少なくとも一」、又は「一又は複数」を意味する。
「およそ」:本出願の意味の範囲内でおよそなる表現は±10%の意味を有するであろう。例えば、およそ100は90〜110を意味する。
部分的に凝集したオリゴヌクレオチドを含みうる未処置のオリゴヌクレオチドの解離はアルカリ性pHで起こる。解離工程は温度を上げることによって促されうる。
オリゴヌクレオチドの分解を避けるために、温度Iは90℃を超えないことが好ましく、温度Iが70℃を超えない。一実施態様では、温度Iは室温、好ましくは19〜25℃である。他の実施態様では、温度Iは4〜70℃、好ましくは20〜70℃、より好ましくは45〜70℃、好ましくはおよそ50℃、そして最も好ましくは50℃である。好適な実施態様では、前記温度Iでの前記溶液I中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、前記オリゴヌクレオチドが十分に分解されるまで行う。他の実施態様では、前記温度Iでの前記溶液I中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、前記オリゴヌクレオチドの相対的なピークのスタート時間が110%を超える、好ましくは130%を超える、最も好ましくは135%を超えるまで行う。更なる実施態様では、前記温度Iでの前記溶液I中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは、30〜190分間、好ましくは50〜90分間、最も好ましくは70分間行う。
更なる好適な実施態様では、前記溶液I中での前記オリゴヌクレオチドの濃度は、50μM〜2mM、好ましくは50〜500μM、より好ましくは200〜300μM、最も好ましくは260μMである。
前記工程はさらに、前記溶液Iの温度を温度IIに調整することを含み、前記温度IIが0〜70℃であることが好ましく、前記温度IIが温度Iよりも低いことが好ましい。好適な実施態様では、前記温度IIが0〜25℃、好ましくは0〜10℃、最も好ましくは0〜2℃である。
好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドを含む溶液IIは、前記溶液Iに前記陽イオンを加えることによって得られ、該添加は溶液IのpHの調整後に行うことが好ましい。
更なる実施態様では、前記溶液IIは、Na+、K+、Rb+、NH4 +、Cs+、Li+、Sr2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+、及びMg2+からなる群から選択されるいずれかの陽イオンの混合である。更なる実施態様では、前記溶液IIは、Na+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+及びMg2+からなる群から選択されるいずれかの陽イオンの混合である。非常に好適な実施態様では、前記混合物はNa+及びK+を含むか、又は好ましくはこれらからなる。
更なる実施態様では、前記溶液II中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は、50μM〜2mM、好ましくは100〜300μM、最も好ましくは175μMである。
更なる実施態様では、前記方法はさらに、溶液IIの温度を温度IIIに調整することを含み、このとき前記温度IIIは50〜99℃、好ましくは80〜90℃、より好ましくはおよそ85℃、最も好ましくは85℃である。
所望の相対的なピークのスタート時間を含むオリゴヌクレオチドを得るために必要なインキュベート時間は、配列とオリゴヌクレオチドの純度に依存し、典型的かつ好ましくはおよそ5分からおよそ30分までの範囲である。好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドはG10(配列番号:8)であり、前記温度IIIでの溶液II中での前記オリゴヌクレオチドのインキュベートは9〜24分間行う。
凝集過程は溶液IIを50℃より下に冷却することによって停止させる。好適な実施態様では、前記過程は溶液IIの温度を温度IVに調整することを含み、該温度IVは50℃未満であり、該温度IVは0〜25℃、より好ましく、0〜10℃、最も好ましくは0〜2℃であることが好ましい。
更なる好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、10〜1000のヌクレオチド、好ましくは10〜200のヌクレオチド、より好ましくは10〜100のヌクレオチド、さらにより好ましくは20〜40のヌクレオチド、最も好ましくは30のヌクレオチドを含む。
非常に好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは、(a) 「G4−4」GGGGGACGAT CGTCGGGG(配列番号:2);(b) 「G5−5」GGGGGGACGA TCGTCGGGGG(配列番号:3);(c) 「G6−6」GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(配列番号:4);(d) 「G7−7」GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(配列番号:5);(e) 「G8−8」GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(配列番号:6);(f) 「G9−9」GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(配列番号:7);(g) 「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG(配列番号:8);(h) 「G11」GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG(配列番号:9)からなる群から選択される核酸配列を含むか、又は好ましくはこれらからなり、該オリゴヌクレオチドはホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。さらにより好適な実施態様では、前記オリゴヌクレオチドは核酸配列「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(配列番号:8)を含むか、又は好ましくはこれからなり、このとき該オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合したヌクレオチドから完全になることが好ましい。
当業者は、標準的な方法を適用することによってRNAバクテリオファージから前記コートタンパク質を精製することによってRNAバクテリオファージのコートタンパク質を生産して、精製することが可能である。しかしながら、好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、好ましくは大腸菌の該コートタンパク質の発現によって、組み換えて生産される。RNAバクテリオファージのコートタンパク質を得る方法は、実施例の項目において開示される。好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、RNAバクテリオファージの組み換えタンパク質又はその断片を含むか、あるいは基本的にこれからなるか、あるいはこれからなり、該RNAバクテリオファージは、(a) バクテリオファージQβ;(b) バクテリオファージR17;(c) バクテリオファージfr;(d) バクテリオファージGA;(e) バクテリオファージSP;(f) バクテリオファージMS2;(g) バクテリオファージM11;(h) バクテリオファージMX1;(i) バクテリオファージNL95;(j)バクテリオファージf2;(k) バクテリオファージPP7;及びバクテリオファージAP205からなる群から選択されるのが好ましい。好適な実施態様では、前記RNAバクテリオファージはバクテリオファージQβである。RNAバクテリオファージ、特にバクテリオファージQβのウイルス様粒子を発現させ、精製するための工程及び方法は、国際公開2006/125821A2及び国際公開2007/039552A1において開示される。これらは出典明記によって本明細書中に援用される。例えば本明細書中の実施例にて説明したように、RNAバクテリオファージのコートタンパク質はウイルス様粒子の分解によって得られてもよい。
更なる好適な実施態様では、前記RNAバクテリオファージはバクテリオファージfrである。Pushko P et al. ((1993) Prot Engin 6:883-891)によって記載されるように、組み換えVLPの形態のfrコートタンパク質が得られてもよい。更なる好適な実施態様では、前記RNAバクテリオファージはバクテリオファージGAである。GA VLPは、GAファージからpQb185への逆転写によって単離されるGAコートタンパク質をクローニングすることによって得られてもよい。これは国際公開2004/007538の実施例のために記述される。fr及びGAのVLPの分解は、場合によって0.1Mの濃度の酢酸を添加した7M 尿素中でVLPをインキュベートすることによって容易に行うことができる。さらに、有意な量のコートタンパク質が流れ出るが、核酸は保持されるpHか、又はコートタンパク質もカラムに吸着され、その後塩勾配によって溶出されるpHのいずれかのイオン交換クロマトグラフィによって、核酸はコートタンパク質から精製される。
さらに、露出したリジン残基がアルギニンによって置換されているバクテリオファージQβの変異コートタンパク質が、本発明のために使われてもよい。ゆえに、更なる好適な実施態様では、前記コートタンパク質は、国際公開02/056905(この実施例18を参照)に開示される変異Qβコートタンパク質を含むか、基本的にこれからなるか、あるいはこれからなる。
典型的かつ好ましくは、(i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本明細書に開示した方法は室温で実施される。好適な実施態様では、前記方法は、15〜30℃、好ましくは19〜25℃、最も好ましくは22℃で行われる。更なる好適な実施態様では、前記の混合物の生成、前記の混合物からの薬剤の除去、及び/又は前記のコートタンパク質のウイルス様粒子への自己集合体化は、15〜30℃、好ましくは19〜25℃、最も好ましくは22℃で行われる。 前記方法は混合物を生成することを含み、該混合物は、(i) 前記コートタンパク質;(ii) 前記コートタンパク質の自己集合を予防することが可能な薬剤;(iii) 前記オリゴヌクレオチドを含む。好適な実施態様では、前記混合物中の前記コートタンパク質の濃度は0.5〜10mg/ml、好ましくは1〜4mg/ml、最も好ましくは2.5mg/mlであり、該濃度はブラッドフォードアッセイにおいて決定されることが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの濃度は、12.5〜250μM、より好ましくは25〜100μM、最も好ましくは62.5μMである。
一般に、ウイルス、特にRNAバクテリオファージのコートタンパク質は、キャプシド構造、例えばウイルス様粒子に自己集合体化する強力な傾向がある。常にではなく、多くの場合、この傾向はRNA又はDNAなどの核酸の存在下で亢進される。前記コートタンパク質の自己集合体化が起こる前に前記コートタンパク質と前記オリゴヌクレオチドを適度に混合するために、該混合物は該コートタンパク質の自己集合を防ぐことが可能な薬剤を含む。典型的かつ好ましくは、前記薬剤は変性化合物を含む。多数の変性化合物は生化学において公知であり、界面活性剤、尿素又はグアニジウムハイドロクロライドを含む。好適な界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム、Tween20、TritonX100などである。好適な実施態様では、前記変性化合物は尿素又はグアニジウムハイドロクロライドであり、前記混合物中の該変性化合物、好ましくは該尿素の濃度は0.25〜7.2M、好ましくは1Mであることが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記変性化合物は尿素であり、前記混合物中の前記尿素の濃度は0.5〜2M、好ましくは0.7〜1.5M、より好ましくは0.8〜1.2M、最も好ましくは1Mである。
更なる実施態様では、前記混合物はさらに塩を含み、前記塩はハロゲン化物、好ましくはアルカリ金属の塩化物であることが好ましく、該塩は塩化カリウム又は塩化ナトリウム又はこれらの組合せであることがより好ましく、該塩は塩化ナトリウムであるであることが最も好ましい。好適な実施態様では、前記混合物中の、前記塩又は塩類の組み合わせの濃度、好ましくは前記塩化ナトリウムの濃度は、0〜1M、好ましくは0〜550mM、より好ましくは0〜350mM、さらにより好ましくは50〜350mM、最も好ましくは250mMである。
更なる好適な実施態様では、前記方法は、前記薬剤の除去の前に前記混合物をインキュベートする処置をさらに含み、該インキュベートはおよそ50〜70、好ましくはおよそ60分間行うことが好ましい。更なる好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートは、15〜30℃、より好ましくは19〜25℃、最も好ましくは22℃で行う。さらに好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートは該混合物をかき回すことを含み、該撹拌はおよそ50〜200回転数/分、最も好ましくはおよそ100回転数/分で行うことが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記混合物のインキュベートはおよそ60分間行い、前記混合物のインキュベートは該混合物を撹拌することを含み、該撹拌はおよそ100回転数/分で行われることが好ましい。
一実施態様では、前記の混合物からの薬剤の除去は第一バッファとの第一バッファ交換によって行われ、該第一バッファ交換は透析によって、又は連続流動濾過、好ましくは連続流動濾過によって行われるのが好ましい。前記第一バッファ交換は、前記コートタンパク質と自己集合体化したVLPの保持を可能にする分子量カットオフを含むメンブランによって行う。好適な実施態様では、前記第一バッファ交換はメンブランによって行い、前記メンブランは、1〜50kD、好ましくは5〜30kD、最も好ましくは30kDの分子量カットオフを含む。非常に好適な実施態様では、前記第一バッファ交換は、1〜50kD、好ましくは30kDの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、該第一バッファの体積は前記混合物の体積のおよそ6倍であることがさらに好ましい。非常に好適な実施態様では、前記メンブランは、30kD分子量カットオフを含むBiomax-5(PES)である。非常に好適な実施態様では、前記第一バッファ交換は、1〜50kD、好ましくは30kDの分子量カットオフを含むメンブランに対する連続流動濾過によって行われ、このとき透過流量はおよそ96l/(m2×h)に調整される。
自己集合において形成される前記ウイルス様粒子を安定化するために、前記ウイルス様粒子を、ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することが可能な酸化剤と接触させることが好ましい。ゆえに、好適な実施態様では、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は0.25〜50mM、好ましくは2mMである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) アスコルビン酸、(e) Cu2+、及び(f) Fe3+からなる群から選択されるのが好ましい。非常に好適な実施態様では、前記RNAバクテリオファージはバクテリオファージQβ、バクテリオファージAP205又はバクテリオファージfrであり、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は0.25〜50mM、好ましくは2mMである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) Cu2+、及び(e) Fe3+からなる群から選択されるのが好ましく、該酸化剤は過酸化水素であることが最も好ましく、該過酸化水素の濃度は0.25〜50mM、好ましくは2mMであることがさらに好ましい。好適な実施態様では、前記コートタンパク質は前記ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することが可能なシステイン残基を含み、前記コートタンパク質は、バクテリオファージQβ、バクテリオファージAP205又はバクテリオファージfrのコートタンパク質であることが好ましく、前記方法はさらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、該酸化剤は、(a) 過酸化水素(好ましくは該過酸化水素の濃度は0.25〜50mM、好ましくは2mMである)、(b) 酸素、(c) グルタチオン、(d) Cu2+、及び(e) Fe3+からなる群から選択されるのが好ましく、該酸化剤は過酸化水素であることが最も好ましく、該過酸化水素の濃度は0.25〜50mM、好ましくは2mMであることがさらに好ましい。
更なる実施態様では、前記方法は、前記ウイルス様粒子を濃縮することを含み、この濃縮は、前記組成物中のウイルス様粒子の終濃度を1〜5mgタンパク質/ml、好ましくはおよそ2.5mgタンパク質/mlにするまで行われることが好ましく、該濃度はブラッドフォードタンパク質アッセイで測定されるのが好ましく、該ウイルス様粒子は該第二バッファに溶解されることがさらに好ましい。非常に好適な実施態様では、前記の濃縮はウイルス様粒子を保持することが可能なメンブランによって行われ、該メンブランの分子量カットオフは、100〜1000kD、好ましくはおよそ300kDであることが好ましく、このときこの濃縮が100l/(h×m2)未満、好ましくはおよそ30l/(h×m2)のメンブランに対する透過流量で行われることがさらに好ましい。濃縮工程の間に流量速度が低ければ生成物の沈殿が妨げられる。
更なる好適な実施態様では、(i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はタンパク質の産生を含み、このタンパク質産生(収率)は少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも80%である。
更なる好適な実施態様では、(i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はオリゴヌクレオチドの産生を含み、このオリゴヌクレオチド産生(収率)は少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも80%である。
更なる好適な実施態様では、前記のウイルス様粒子を含む組成物は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%の純度を含む。
更なる好適な実施態様では、(i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための本発明に係る方法はタンパク質の産生とオリゴヌクレオチドの産生を含み、このタンパク質産生(収率)は少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、さらにより好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも80%である。
更なる好適な実施態様では、前記のウイルス様粒子を含む組成物は、100μgコートタンパク質につきオリゴヌクレオチドを15〜30μg、好ましくは20〜25μg、最も好ましくはおよそ20μg含み、該ウイルス様粒子はバクテリオファージQβのウイルス様粒子であることが好ましく、該オリゴヌクレオチドはG10(配列番号:8)であることがさらに好ましく、このウイルス様粒子を含む組成物は少なくとも98%、好ましくは少なくとも99%の純度を含むことがさらに好ましく、該コートタンパク質の定量化はブラッドフォードタンパク質アッセイによって行われることがさらに好ましく、該オリゴヌクレオチドの定量化は基本的に、好ましくは厳密に実施例9に開示されるように行われるのがさらに好ましい。
本発明はさらに、本発明のいずれか一に記載の方法によって入手可能な組成物であって、(i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物に関し、このとき該RNAバクテリオファージがQβであることが好ましく、該オリゴヌクレオチドがG10(配列番号:8)であることがさらに好ましく、該組成物の純度が少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%であることがさらに好ましく、前記オリゴヌクレオチドはDNアーゼ加水分解にアクセス可能でない。
G10の定量:G10は、340nmの吸収によって校正した260nmのUV吸収によって定量化し、このとき1A260−340は1cm経路長で27.8μgの濃度に相当する。
解離(10.0mlスケール、260μM G10、25mM NaOH、50℃、70分):45.91mgのG10を15mlチューブに入れた。粉を11.0mlの純水に溶解した(c=325.3μM;吸光度測定によって決定した)。8.0mlのオリゴヌクレオチド溶液を、15mlのチューブ(260μM G10、25mM NaOH)中で250μl の1M NaOHと1.75mlの純水に混合した。混合物をウォーターバス中で50℃、70分間かけて解離させた。溶液を氷上で冷却した後に、pHを0.5MのHClにてpH5.31に調整した。540μlの0.5M HClと5μlの1M NaOHを加えた。
凝集(10.0mlスケール、175μM G10、250mM Na+、85℃、9〜24分):7.1mlの解離したG10溶液、2.13mlの純水及び770μlの3M NaClを、15mlチューブ(175μM オリゴ、250mM Na+)中で混合した。混合物をウォーターバス中で85℃で9分間インキュベートした。溶液を氷/ウォーターバスにて冷却し、使用時まで氷上に保存した。凝集されたオリゴヌクレオチド溶液は、調製後で3時間以内に使われなければならない。
脱凝集:260μM オリゴヌクレオチドG4−4(配列番号:2)と25mM NaOHを純水に含む溶液を調製した。溶液を70分間50℃に加熱し、その後氷上で冷却し、溶液のpHを0.5M HClを用いて5と8の間のpHに調整した。
凝集:解離したG4−4を含む溶液を純水と3M NaClにて、230μM G4−4及び250mM Na+の終濃度に希釈した。混合物は、6.8℃/分の加熱勾配によって数分(2〜70分)かけて80℃に加熱した。インキュベートの後、混合物を6.8℃/分の温度勾配にて0〜2℃に冷却した。
サイズ排除HPLC(実施例4を参照)による生成物の分析によって、凝集したオリゴヌクレオチドが得られたことが明らかとなった。(相対的なピークのスタート時間:88%)。
解離:260μM オリゴヌクレオチドG5−5(配列番号:3)、G6−6(配列番号:4)、G7−7(配列番号:5)、G8−8(配列番号:6)、G9−9(配列番号:7)及びG11(配列番号:9)と、25mM NaOHを純水にそれぞれ含む溶液を調製する。溶液を70分間50℃に加熱し、その後氷上で冷却し、溶液のpHを0.5M HClを用いて5と8の間のpHに調整する。
凝集:解離したオリゴヌクレオチドを含む溶液を純水と3M NaClにて、230μM オリゴヌクレオチド及び250mM Na+の終濃度に希釈した。混合物は、6.8℃/分の加熱勾配によって数分(2〜70分)かけて80℃に加熱した。インキュベートの後、混合物を6.8℃/分の温度勾配にて0〜2℃に冷却した。
この凝集方法の生成物はサイズ排除HPLCによって分析される(実施例4を参照)。
G10の凝集状態は、以下の条件を用いた分析的サイズ排除HPLCにて分析した。
カラム: TSKgel 5000 PWXL 7.8mm×30.0cm (Lot: 5PWX06GNMH3304, Art: 08023, Tosoh Bioscience)
溶出剤: PBS(150mM NaClを含む20mM リン酸ナトリウムバッファ、pH7.2)
注射体積: 40.0μl(およそ20μM〜およそ500μMの濃度を含むことが好ましい)
流速: 0.8ml/分勾配:均一濃度
ランタイム: 20分
波長: 215、260及び280nm、260nmのデータ評価
カラムオーブン温度: 25℃
自動回収装置: 8℃
標準物質としてバクテリオファージQβのキャプシドを用いた。
Qβキャプシドと比較したときのG10のピークのスタート時間X%(相対的なピークのスタート時間Qβ)は、以下の通りに算出した。X%=オリゴヌクレオチドのピークのスタート時間[分]÷Qβキャプシド標準物質[分]の持続時間×100%、このときオリゴヌクレオチドのピークのスタート時間はオリゴヌクレオチドの溶出が検出可能になる時間として測定し、Qβキャプシド標準物質の持続時間は標準物質の最大のピークが生じる時間として測定した。オリゴヌクレオチドG10と標準物質としてのバクテリオファージQβのキャプシドの溶出プロフィルの例を図1に示す。図1において示されるクロマトグラムに基づいて、88%の相対的なピークのスタート時間は、凝集したオリゴヌクレオチドについて算出した。
基本的には実施例1に記載のように調製した解離したG10と凝集したG10の相対的なピークのスタート時間を測定し、商業的な供給元から得た無処置のG10の相対的なピークのスタート時間と比較した。解離したG10は、138%(136.9〜140.3%;n=5)の相対的なピークのスタート時間を示した。実施例1に記載の解離/凝集の処理を行わなかったG10調製物は解離したG10と同じ範囲の相対的なピークのスタート時間を示す。解離及び凝集の後、G10のピークのスタート時間は88%であることが明らかとなった。
無処理のオリゴヌクレオチドG10と実施例1に記載のように解離させたオリゴヌクレオチドG10を、基本的には実施例1に記載のように凝集させた。以下のような凝集条件を選択した。175μM G10、250mM Na+(3M NaClの添加によって)、85℃で16分間のインキュベーション、その後氷上で冷却。両調製物はQβキャプシド及び標準物質としての無処置のG10を用いたサイズ排除HPLC(実施例4を参照)によって分析した。結果として生じるHPLCクロマトグラムを図2に示す。
無処置のG10は凝集したG10を含んだ(図2A及び2B、ボックス1を参照)。凝集の前に解離していなかった凝集したG10は、Qβキャプシドと同等か、又はQβキャプシドよりも高い見かけの分子量を示した(図2A、ボックス2)。相対的なピークのスタート時間はおよそ75%であった。凝集の前に解離していた凝集されたG10は、Qβキャプシドよりも低い見かけの分子量を表した(図2B、ボックス2)。相対的なピークのスタート時間はおよそ88%であった。
無処置のG10、解離したG10及び凝集したG10(基本的に実施例1に記載のように調製した)、並びにG10をパッケージ化したQβキャプシド(実施例10に記載のように得たQβG10)のCDスペクトルを、JASCO J-715分光光度計にて200nmと300nmの間で記録した。(図3)。凝集したG10のスペクトルは、262nmの最大及び240nmのトラフ値にて強いポジティブバンド(高い楕円形)の特徴を示した。これらのシグナルは、鎖が平行配向しているDNA四重体の典型的なスペクトルに対応することが報告されている(Lu et al., Biochemistry 31, p.2455, 1992)。重要なことに、250nm〜300nmの範囲のCDスペクトルの形状は、凝集したG10がある場合に再集合体化するVLPのスペクトルを変化させない。ゆえに、G10は、パッケージの際に立体配置的変化を経ないようである。262nmの振幅のわずかな増加は、Qβキャプシドに凝集したG10を選択的にパッケージ化していることを反映している可能性がある。このパッケージ化によって、凝集していない分子の分画を含んでいる凝集したG10と比較して、パッケージ化の後に四重体の割合が高くなる。これに対して、無処置のG10のスペクトルは定められる最大がない低い楕円の特徴を示し、これは定められる二次及び三次の構造成分を欠いていることを示す。また、295nmで最大、262nmで最小となることは逆平行の四重体配座異性体の存在を表すものであるが、解離したG10については低いCDシグナルも観察される(P. Balagurumoorthy et al., Nucleic Acids Research 20, p. 4061, 1992)。
Qβ VLPの分解:PBS(20mM リン酸、150mM NaCl、pH7.5)中の45mgのQβ VLP(2.5mg/ml、ブラッドフォード分析によって決定)を、10mMのDTTにて、撹拌しながらRTで15分間還元した。その後、塩化マグネシウムを0.7Mの終濃度になるまで加え、撹拌しながらRTで15分間インキュベートし、カプセル化された宿主細胞RNAの沈殿と同時に起こるVLPの崩壊を引き起こした。溶液を4000rpmにて4℃で10分間遠心して(以降すべての工程において用いた固定角度のローターA-4-62にて、Eppendorf 5810 R)、溶液から沈殿したRNAを除去した。放出した二量体のQβコートタンパク質を含む上清をクロマトグラフィの精製工程に用いた。
陽イオン交換クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィによるQβコートタンパク質の精製:二量体コートタンパク質、宿主細胞タンパク質及び残留する宿主細胞RNAを含む、分解反応物の上清を、SP−セファロースFFカラム(xk16/20、6ml、Amersham Bioscience)に流した。カラムを20mM リン酸ナトリウムバッファ pH7で平衡化して、試料を水で1:15に希釈して伝導率を10mS/cm未満に調節してコートタンパク質をカラムに適切に結合させた。結合したコートタンパク質は、20mM リン酸ナトリウム/500mM 塩化ナトリウムに勾配することによって溶出を行い、タンパク質はおよそ25mlの分画体積に回収した。すべての工程において5ml/分の流速にて室温でクロマトグラフィを行い、260nmと280nmの吸光度をモニターした。第二の工程において、単離されたQβコートタンパク質(陽イオン交換カラムから溶出された分画)を、20mM リン酸ナトリウム/250mM 塩化ナトリウム、pH7.2にて平衡化したセファクリルS−100 HRカラム(xk26/60、320ml、Amersham Bioscience)に流した。2.5ml/分の流速にて室温でクロマトグラフィを行い、260nmと280nmの吸光度をモニターした。5mlの分画を回収した。
ダイアフィルトレーションによるQβG10の集合:精製されたコートタンパク質(20mM リン酸ナトリウム pH7.2、250mM NaCl中)を、尿素、NaCl、DTT及び凝集されたG10オリゴヌクレオチド(基本的には実施例1に記載のように調製される)の貯蔵液と水に混合した。混合物の体積を50mlとし、構成成分の終濃度は1mg/mlのコートタンパク質、1.0Mの尿素、250mMのNaCl、2.5mMのDTT及び0.24mg/mlのG10とした。その後、30kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)と、10ml/分のクロス流速と2.5ml/分の透過流速を用いて、溶液を300mlの20mM リン酸ナトリウム 250mM NaCl pH7.2に対して室温でダイアフィルトレーションを行った。H2O2を7mMの終濃度になるまで加え、溶液を室温で1時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導した。その後、300kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon XL, Millipore)と、10ml/分のクロス流速と2.5ml/分の透過流速を用いて、溶液を500mlの20mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl pH7.2に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なH2O2とパッケージ化されなかったG10オリゴヌクレオチドを集合体化したQβG10生成物から取り除いた。
分析的サイズ排除クロマトグラフィによるパッケージ化されたQβG10 VLPの特徴づけ:パッケージ化されたQβG10 VLPの試料を分析的サイズ排除クロマトグラフィ(図5)にて分析して、大腸菌溶解物から精製したインタクトなQβ VLPと比較した。前記分析的サイズ排除クロマトグラフィは、以下のパラメータを使用して実行した。
カラム: Bio-Sil SEC 250、7.8×300mm、Cat. No. 125-0062
溶出剤: 50mM リン酸ナトリウム pH6.5、150mM NaCl
勾配: 均一濃度(アイソクラチック)
カラム温度: 25℃
自動回収装置: 8℃
流速: 1.0ml/分
試料濃度: 1.0mg/ml タンパク質
注射体積: 40μl
評価波長: 280nm
帯域幅: 4nm
ランタイム: 20分
試料調製:
試料は溶出剤を用いて1.0mg/mlに希釈し、試料を短時間ボルテックスにかけ、4℃で10分間、16000gで遠心分離した。
生成物中の正しく集合体化したVLPの存在は、天然のQβ VLPを表しているピークと同じ滞留時間にピークが移動していることによって確認した。QβG10 VLPについて観察されたピーク(図5D)は、VLPの核酸含量によって左右される。これは、260nmの吸収係数核酸がコートタンパク質の吸収係数の100倍以上であるためである。精製されたQβG10 VLPの比率A260/A280は1.70(1.65〜1.76;n=5)であることが明らかとなり、これはG10(A260/A280=1.74)の特徴であり、Qβ VLPのA260/A280比率は1.87(1.85〜1.90;n=10)であることが明らかとなり、これはRNAの特徴である。
パッケージ化されたオリゴヌクレオチドG10の定量:QβG10 VLP(PBS中に0.25mg/ml)の試料を1mM TCEP(トリス(2-クロロエチル)フォスフェート)(室温で15分)にて処理して、ジスルフィド結合を還元した。この還元した試料にNaClを加え(1Mの終濃度)、混合物を60℃で15分間インキュベートして、タンパク質成分を沈殿させた。遠心分離の後、結果として生じた上清を95℃で5分間インキュベートし、1分間氷上で冷却して、その後A260値を測定した。上清中のオリゴヌクレオチドG10の濃度は以下の式に従って算出した。
c(G10)(mg/ml)=A260×1.12×9600/344580:
1.12=試料中の塩含量についての補正係数
9600=オリゴヌクレオチドG10の分子質量
344580=オリゴヌクレオチドG10の特定のモル吸収係数。
一般的に、パッケージ化されたオリゴヌクレオチドG10の量は、Qβコートタンパク質1mgにつき0.2mgであった。
QβG10 VLPのG10含量とパッケージ化反応の収率算出:凝集されたG10は、実施例8に記載のように、VLPの集合体化/再集合体化によってQβ VLPにパッケージ化した。953mgのG10オリゴヌクレオチドを、4000mgの精製されたQβ二量体との再集合体化に用いた。反応により、100μgのタンパク質につき20μgのG10オリゴヌクレオチドを含むQβG10が得られた(ブラッドフォード分析又はHPLCで測定されるタンパク含有量)。タンパク質収率75%の場合に、パッケージ化反応のG10の収率は63%であった。
精製されたQβコートタンパク質は、基本的に実施例8に記載のように得た。20mM リン酸ナトリウム pH7.2、250mM NaCl中のコートタンパク質を、尿素、NaCl、DTT及び凝集したG10オリゴヌクレオチド(基本的には実施例1に記載のように調製される;解離したG10の相対的なピークのスタート時間は135%とし、凝集したG10の相対的なピークのスタート時間は88%とした)の貯蔵液と水に混合した。混合物の体積は1.6Lとし、構成成分の終濃度は2.5 mg/ml コートタンパク質、1.0M 尿素、250mM NaCl、2.5mM DTT及び0.6mg/ml G10とした。その後、30kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2、0.1m2フィルター領域、Millipore)と、384L/(h×m2)のクロス流速と96L/(h×m2)の透過流速を用いて、溶液を9.6Lの20mM リン酸ナトリウム 250mM NaCl pH7.2に対して室温でダイアフィルトレーションを行った。H2O2を2mMの終濃度になるまで加え、溶液を室温で1時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導した。その後、300kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2、0.1m2フィルター領域、Millipore)と、300L/(h×m2)のクロス流速と100L/(h×m2)の透過流速を用いて、溶液を16Lの20mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl pH7.2に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なH2O2とパッケージ化されなかったG10オリゴヌクレオチドを集合体化したQβG10生成物から取り除いた。生成物は、接線の(tangential)流量濾過によって2.5mg/mlまで濃縮し、0.22μmフィルターにて濾過した。主な生産工程を表1にまとめる。
サイズ排除クロマトグラフィによって分析した生成物の純度は99.28%であった、すなわちQβG10のピークは実施例4に記載のように行ったクロマトグラフィの全体のピーク領域の99.28%に達した。タンパク質収率とオリゴヌクレオチド収率は、実施例8に記載のように測定した。全方法全体のタンパク質収率は75%であった。全方法全体のオリゴヌクレオチド収率は75%であった。
139%の相対的なピークのスタート時間を有するG10を実施例8に記載のような集合体化工程に用いる場合には、極わずかな量のGβG10しか形成されず、VLP生成物は単離されない。
分解:50〜100mgのAP205又はGA355のVLP(ブラッドフォード分析によって測定される)を含むバッファA(5mM NaPO4 pH6.8、100mM NaCl、2mM MgCl2)を、それぞれ1mg/ml及び5U/mlのRNアーゼA(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)とともに30℃で16時間インキュベートした。AP205 VLPの場合、RNアーゼAとベンゾナーゼを加える前に20mM DTTを加えて、37℃で30分間インキュベートすることによって内部ジスルフィド架橋の脱酸化を行った。1M NaClを加えた後、70℃で15分間インキュベートすることによってウイルスコートタンパク質の沈殿を誘導した。27000gにて4℃で10分間遠心して、沈殿したコートタンパク質を堆積させた。RNアーゼA、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を廃棄した。ペレットをバッファB(20mM NaPO4 pH7.2、6M 尿素)に再懸濁して、室温で10分インキュベートした。
陽イオン交換クロマトグラフィによるコートタンパク質の精製:溶液を27000gにて4℃で10分間遠心分離して清浄化した。ごくわずかなペレットを廃棄した。そして、分解したコートタンパク質を含有する上清を、バッファB(20mM NaPO4 pH7.2、6M 尿素)にて平衡化したSPセファロースTM FFカラム(16/20、Amersham Biosciences)にアプライした。流れ出たものは廃棄した。バッファB(15CV)にて十分に洗浄した後、カラムを、37.5CVの勾配幅のバッファBからバッファC(20mM NaPO4 pH7.2、1M 尿素)への直線的な濃度勾配によって調整した。負荷、洗浄及び溶出の間、254nm及び280nmの吸光度をモニターした。バッファD(20mM NaPO4 pH6.5、1M 尿素、300mM NaCl)にて一分画としてコートタンパク質を溶出し、LDS−PAGEの後にクーマシー染色をすることによって分析した。溶出したタンパク質分画を「分解したコートタンパク質」として保存した。タンパク質濃度はブラッドフォード分析にて測定した。
再集合化してパッケージ化されたVLPの精製:25mg以下の総タンパクをPBSにて平衡化したセファロースTM CL-4B(26/60、Amersham Biosciences)に流した。1.25ml/分の流速の室温の平衡化バッファにてサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出の間、254nmと260nmの吸光度をモニターした。2つのピークを単離した。主要な高分子量のピークは、それよりも低い見かけの分子量の小さいピークに先行した。主要なピークは、SE−HPLCで示すように、精製されたVLPに一致する見かけの分子量を示した。基本的には国際公開03/024481(p.131ff)の実施例16に示されるように、G10オリゴヌクレオチドをパッケージ化したAP205又はGA355のVLPの分析を行った。
分解:50〜100mgのFR VLP(ブラッドフォード分析によって測定される)を含むバッファA(5mM NaPO4 pH6.8、100mM NaCl、2mM MgCl2)を、それぞれ1mg/ml及び5U/mlのRNアーゼA(Sigma)及びベンゾナーゼ(Novagen)とともに30℃で16時間インキュベートする。1M NaClを加えた後、70℃で15分間インキュベートすることによってFRコートタンパク質の沈殿を誘導する。27000gにて4℃で10分間遠心して、沈殿したコートタンパク質を堆積させる。RNアーゼA、ベンゾナーゼ及び分解した核酸を含む上清を廃棄する。ペレットをバッファB(20mM NaPO4 pH7.2、6M 尿素)に再懸濁して、室温で10分インキュベートする。
陽イオン交換クロマトグラフィによるFRコートタンパク質の精製:溶液を27000gにて4℃で10分間遠心分離して清浄化する。ごくわずかなペレットを廃棄し、分解したコートタンパク質を含有する上清を、バッファBにて平衡化したSPセファロースTM FFカラム(16/20、Amersham Biosciences)にアプライする。流れ出たものは廃棄する。バッファB(15CV)にて十分に洗浄した後、カラムを、37.5CVの勾配幅のバッファBからバッファC(20mM NaPO4 pH7.2、1M 尿素)への直線的な濃度勾配によって調整する。負荷、洗浄及び溶出の間、254nm及び280nmの吸光度をモニターする。バッファD(20mM NaPO4 pH6.5、1M 尿素、300mM NaCl)にて一分画としてFRコートタンパク質を溶出し、LDS−PAGEの後にクーマシー染色をすることによって分析する。溶出したタンパク質分画を「分解したコートタンパク質」として4℃で保存する。タンパク質濃度はブラッドフォード分析にて測定する。
再集合化してパッケージ化されたFR VLPの精製:25mg以下の総タンパクをPBSにて平衡化したセファロースTM CL-4B(26/60、Amersham Biosciences)に流す。1.25ml/分の流速の室温の平衡化バッファにてサイズ排除クロマトグラフィを行う。溶出の間、254nmと260nmの吸光度をモニターする。2つのピークを単離する。主要な高分子量のピークは、それよりも低い見かけの分子量の小さいピークに先行する。主要なピークは、SE−HPLCで示すように、精製されたFR VLPに一致する見かけの分子量を示した。基本的には国際公開03/024481(p. 131ff)の実施例16に示されるように、G10オリゴヌクレオチドをパッケージ化したFR VLPの分析を行う。
精製したQβコートタンパク質は基本的に実施例8に記載のように得る。コートタンパク質を含む20mM リン酸ナトリウムpH7.2、250mM NaClを、尿素、NaCl、DTT及び凝集されたG8オリゴヌクレオチドの貯蔵液と水に混合する(基本的には実施例3に記載のように調製される;解離したG8の相対的なピークのスタート時間は113%とし、凝集したG8の相対的なピークのスタート時間は88%とする)。混合物の体積を1.6Lとし、構成成分の終濃度は1mg/mlのコートタンパク質、1.0Mの尿素、250mMのNaCl、2.5mMのDTT及び0.24mg/mlのG8とする。その後、30kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2, 0.1m2フィルター領域, Millipore)と、384L/(h×m2)のクロス流速と96L/(h×m2)の透過流速を用いて、溶液を9.6Lの20mM リン酸ナトリウム 250mM NaCl pH7.2に対して室温でダイアフィルトレーションを行う。H2O2を2mMの終濃度になるまで加え、溶液を室温で1時間インキュベートしてジスルフィド結合の形成を誘導する。その後、300kDaのカットオフカートリッジ(Pellicon Mini2, 0.1m2フィルター領域, Millipore)と、300L/(h×m2)のクロス流速と100L/(h×m2)の透過流速を用いて、溶液を16Lの20mM リン酸ナトリウム 150mM NaCl pH7.2に対してダイアフィルトレーションを行い、過剰なH2O2とパッケージ化されなかったG8オリゴヌクレオチドを集合体化したQβG8生成物から取り除く。生成物は、接線の(tangential)流量濾過によって2.5mg/mlまで濃縮し、0.22μmフィルターにて濾過する。
Claims (53)
- オリゴヌクレオチドを含むヌクレオチド組成物を作製する方法であって、
(a) 少なくとも一つのポリGが伸展しているオリゴヌクレオチドを溶液Iに準備する工程、このとき該溶液Iはアルカリ性pHを含み、
(b) 以下の工程を含む解離によって、該オリゴヌクレオチドを解離する工程、
(i) 4〜70℃である温度Iに溶液Iの温度を調節する、
(ii) 該オリゴヌクレオチドが相対的なピークのスタート時間を110%より上に含むまで、該温度Iにて該溶液I中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iii) 0〜70℃である温度IIに該溶液Iの温度を調整する、
(c) pH5〜8に該溶液IのpHを調整する工程、そして、
(d) 以下の工程を含む凝集によって、該オリゴヌクレオチドを凝集する工程、
(i) pH5〜8であり、少なくとも20mMの陽イオンを含む溶液IIに該オリゴヌクレオチドを準備する、このとき該陽イオンはNa+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+及びMg2+からなる群から選択されるものであり、
(ii) 50〜99℃である温度IIIに溶液IIの温度を調整する、
(iii) 該オリゴヌクレオチドが50〜110%の相対的なピークのスタート時間を含むまで、該温度IIIにて該溶液II中で該オリゴヌクレオチドをインキュベートする、そして、
(iv) 50℃未満である温度IVに溶液IIの温度を調整する
ことを含む方法。 - 前記温度Iが45〜70℃、好ましくはおよそ50℃、そして、最も好ましくは50℃である、請求項1に記載の方法。
- 前記温度IIが温度I未満であり、好ましくは温度IIが0〜25℃、最も好ましくは0〜2℃である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記温度IIIが80〜90℃、好ましくはおよそ85℃、最も好ましくは85℃である、請求項1から3のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液Iの温度を温度IIに調節する工程が、少なくとも3.6℃/分の温度勾配で行われる、請求項1から4のいずれか一に記載の方法。
- 前記温度IVが0〜25℃、好ましくは0〜2℃である、請求項1から5のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液IIの温度を温度IVに調節する工程が、少なくとも3.6℃/分の温度勾配で行われる、請求項1から6のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液Iが8〜13のpH、好ましくは12のpHを含む、請求項1から7のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液Iが、アルカリ金属の水酸化物、好ましくは水酸化カリウム又は水酸化ナトリウム、最も好ましくは水酸化ナトリウムを含み、このとき、前記水酸化物の濃度が、10mM〜200mM、好ましくはおよそ25mM、最も好ましくは25mMである、請求項1から8のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液IのpHを調節する工程が前記溶液Iに酸を添加することによって行われ、このとき好ましくは該酸がリン酸である、請求項1から9のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液IのpHを調節する工程が前記pHが6〜7になるまで行われる、請求項1から10のいずれか一に記載の方法。
- 前記陽イオンがNa+又はK+であり、このとき好ましくは前記陽イオンがNa+である、請求項1から11のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液IIが200〜275mM、好ましくは250mMの前記陽イオンを含む、請求項1から12のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液Iの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、50μM〜2mM、最も好ましくは260μMである、請求項1から13のいずれか一に記載の方法。
- 前記溶液IIの前記オリゴヌクレオチドの濃度が、50μM〜2mM、好ましくは100〜300μM、最も好ましくは175μMである、請求項1から14のいずれか一に記載の方法。
- 温度IIIにて溶液II中で前記オリゴヌクレオチドをインキュベートする工程が、前記オリゴヌクレオチドが80〜95%、好ましくは80〜90%、より好ましくは83〜90%、より好ましくは85〜90%、そして、最も好ましくは88%の相対的なピークのスタート時間を含むまで行われる、請求項1から15のいずれか一に記載の方法。
- その5'末端に少なくとも3、最大15のグアノシン体とその3'末端に少なくとも3、最大の15グアノシン体を含む、請求項1から16のいずれか一に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドがパリンドローム配列を含み、好ましくは該パリンドローム配列がGACGATCGTC(配列番号:1)であり、そして、さらに好ましくは該パリンドローム配列が5'末端で少なくとも3、多くても15のグアノシン体によって隣接し、そして、該パリンドローム配列が3'末端で少なくとも3、多くても15のグアノシン体によって隣接する、請求項1から17のいずれか一に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、10〜1000のヌクレオチド、好ましくは10〜200のヌクレオチド、より好ましくは、10〜100のヌクレオチド、より好ましくは20〜40のヌクレオチド、最も好ましくは30のヌクレオチドを含む、請求項1から18のいずれか一に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが、
(a) 「G4−4」GGGGGACGATCGTCGGGG (配列番号:2)、
(b) 「G5−5」GGGGGGACGATCGTCGGGGG (配列番号:3)、
(c) 「G6−6」GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (配列番号:4)、
(d) 「G7−7」GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (配列番号:5)、
(e) 「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号:6)、
(f) 「G9−9」GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (配列番号:7)、
(g) 「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号:8)、
(h) 「G11」GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (配列番号:9)
からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1から19のいずれか一に記載の方法。 - 前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号:6)を有する、請求項1から20のいずれか一に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「G10」GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (配列番号:8)を有する、請求項1から21のいずれか一に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドを含有するヌクレオチド組成物であって、該ヌクレオチド組成物が請求項1から27のいずれか一に記載の方法によって入手可能であり、好ましくは該オリゴヌクレオチドが50〜110%、好ましくは80〜95%、より好ましくは80〜90%、より好ましくは83〜90%、より好ましくは85〜90%、そして最も好ましくは88%の相対的なピークのスタート時間を含む、ヌクレオチド組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号:6)又は「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号:8)を有し、好ましくは前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号:8)を有する、請求項23に記載のヌクレオチド組成物。
- (i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該RNAバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) オリゴヌクレオチドを準備する工程、
(i) このとき、該オリゴヌクレオチドにおいて少なくとも一つのポリGが伸展しており、そして、
(ii) このとき、該オリゴヌクレオチドが50〜110%の相対的なピークのスタート時間を含むものであり、
(c)
(i) 前記コートタンパク質と、
(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、
(iii) 前記オリゴヌクレオチドと
を含有してなる混合物を生成する工程、
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。 - (i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを含有してなる組成物を作製するための方法であって、
(a) 該RNAバクテリオファージのコートタンパク質を準備する工程、
(b) 請求項23又は24に記載のヌクレオチド組成物を準備する工程、
(c)
(i) 前記コートタンパク質と、
(ii) 前記コートタンパク質の自己集合化を防ぐことが可能な薬剤と、
(iii) 前記オリゴヌクレオチドと、
を含有してなる混合物を生成する工程、
(d) 前記混合物から前記薬剤を除去する工程、そして、
(e) 前記コートタンパク質をウイルス様粒子に自己集合化させる工程
を含む方法。 - 前記コートタンパク質が、RNAバクテリオファージの組み換えタンパクないしはその断片を含むか、あるいは本質的にそれから成るか、あるいはそれからなる、請求項25又は26に記載の方法。
- 前記RNAバクテリオファージが、
(a) バクテリオファージQβ、
(b) バクテリオファージR17,
(c) バクテリオファージfr、
(d) バクテリオファージGA、
(d) バクテリオファージSP、
(e) バクテリオファージMS2、
(f) バクテリオファージM11、
(g) バクテリオファージMX1、
(h) バクテリオファージNL95、
(i) バクテリオファージf2、
(j) バクテリオファージPP7、及び
(k) バクテリオファージAP205
からなる群から選択される、請求項25から27のいずれか一に記載の方法。 - 前記RNAバクテリオファージがQβである、請求項25から28のいずれか一に記載の方法。
- 前記RNAバクテリオファージがAP205である、請求項25から28のいずれか一に記載の方法。
- 前記RNAバクテリオファージがfrである、請求項25から28のいずれか一に記載の方法。
- 前記RNAバクテリオファージがGAである、請求項25から28のいずれか一に記載の方法。
- 前記コートタンパク質が、
(a) 配列番号:10(QβCP);
(b) 配列番号:10と配列番号:11の混合物(Qβ A1タンパク質);
(c) 配列番号:12(R17コートタンパク質);
(d) 配列番号:13(frコートタンパク質);
(e) 配列番号:14(GAコートタンパク質);
(f) 配列番号:15(SPコートタンパク質);
(g) 配列番号:15と配列番号:16の混合物;
(h) 配列番号:17(MS2コートタンパク質);
(i) 配列番号:18(M11コートタンパク質);
(j) 配列番号:19(MX1コートタンパク質);
(k) 配列番号:20(NL95コートタンパク質);
(l) 配列番号:21(f2コートタンパク質);
(m) 配列番号:22(PP7コートタンパク質);及び、
(n) 配列番号:23(AP205コートタンパク質)
からなる群から選択される配列を含むか、又は好ましくはこれからなる、請求項25から28のいずれか一に記載の方法。 - 前記混合物中の前記コートタンパク質の濃度が1〜4mg/ml、好ましくは2.5mg/mlである、請求項25から33のいずれか一に記載の方法。
- 前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドの濃度が25〜100μM、好ましくは62.5μMである、請求項25から34のいずれか一に記載の方法。
- 前記混合物中の前記オリゴヌクレオチドと前記コートタンパク質のモル比が、0.5〜1.2、好ましくは0.7である、請求項25から35のいずれか一に記載の方法。
- 前記薬剤が、尿素及びグアニジウムハイドロクロライドから選択される変性化化合物を含み、好ましくは該変性化化合物が尿素であり、さらに好ましくは前記混合物中の該尿素の濃度が0.25〜7.2M、好ましくは1Mである、請求項31から36のいずれか一に記載の方法。
- 前記薬剤が還元剤を更に含む、請求項25から37のいずれか一に記載の方法。
- 前記コートタンパク質が、前記ウイルス様粒子内で分子間ジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含み、前記薬剤が還元剤を更に含む、請求項25から31及び33から38のいずれか一に記載の方法。
- 前記還元剤がDTTであり、好ましくは前記混合物中の該DTTの濃度が1〜25mM、好ましくは2.5mMである、請求項38又は39に記載の方法。
- 前記混合物から前記薬剤を除去する工程が、第一のバッファによる第一バッファ交換によって行われ、このとき該第一バッファは塩化ナトリウムを含み、好ましくは該第一バッファ中の該塩化ナトリウムの濃度が0〜1M、好ましくは0〜550mM、より好ましくは0〜350mM、より好ましくは50〜350mM、及び最も好ましくは250mMである、請求項25から40のいずれか一に記載の方法。
- 前記第一バッファ交換がメンブランにより行われ、該メンブランが1〜55kD、好ましくは5〜30kD、最も好ましくは30kDの分子量カットオフを含む、請求項41に記載の方法。
- さらに、前記ウイルス様粒子を酸化剤と接触させる工程を含み、好ましくは該酸化剤が、
(a) 過酸化水素、このとき好ましくは該過酸化水素が0.25〜50mM、好ましくは2mMである、
(b) 酸素、
(c) グルタチオン、
(d) Cu2+、及び
(e) Fe3+
からなる群から選択される、請求項25から42のいずれか一に記載の方法。 - さらに、前記ウイルス様粒子を精製する工程を含み、好ましくは該精製が第二バッファによる第二バッファ交換を含み、該第二バッファが薬学的に許容されるバッファである、請求項25から43のいずれか一に記載の方法。
- 前記第二バッファ交換がメンブランを用いて行われ、該メンブランが100〜1000kD、好ましくは300kDの分子量カットオフを含む、請求項44に記載の方法。
- タンパク質収率が少なくとも75%であり、及び/又はオリゴヌクレオチド収率が少なくとも75%である、請求項25から45のいずれか一に記載の方法。
- 請求項26から45のいずれか一に記載の方法における、請求項1から24のいずれか一に記載の方法によって入手可能なヌクレオチド組成物の使用。
- 請求項25から45のいずれか一に記載の方法における、i) 少なくとも一つのポリG伸展と、(ii)50〜110%の相対的なピークのスタート時間とを含むオリゴヌクレオチドの使用。
- (i) RNAバクテリオファージのウイルス様粒子である、ウイルス様粒子と、(ii) 該ウイルス様粒子内にパッケージ化されるオリゴヌクレオチドとを好ましくは含有してなる、請求項25から45のいずれか一に記載の方法によって入手可能な組成物。
- 前記RNAバクテリオファージが、バクテリオファージQβ、バクテリオファージAP205、バクテリオファージfr又はバクテリオファージGAであり、好ましくは前記RNAバクテリオファージがバクテリオファージQβである、請求項49に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドが、核酸配列「G8−8」GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (配列番号:6)又は「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号:8)を有し、好ましくは前記オリゴヌクレオチドが核酸配列「G10」GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (配列番号:8)を有する、請求項49又は50に記載の組成物。
- 前記組成物の純度が少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%、最も好ましくは少なくとも99%である、請求項49から51のいずれか一に記載の組成物。
- 前記オリゴヌクレオチドがDNアーゼ加水分解にアクセスできない、請求項49から51のいずれか一に記載の組成物。
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