发明详述
除非另外明确说明,下面描述的定义和实施方案适用于本发明的任一方面和实施方案,特别是本发明的方法、组合物、核苷酸组合物和用途。除非另外定义,此处使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
“寡核苷酸”:此处使用的术语寡核苷酸是指单链脱氧核糖核苷酸。优选的寡核苷酸包含至少一个如下定义的poly G区段。更优选的寡核苷酸包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个所述的poly G区段。非常优选的寡核苷酸包含恰好两个poly G区段,其中优选地所述两个poly G区段中的一个位于所述寡核苷酸的5’末端或者3’末端。甚至更优选的寡核苷酸包含恰好两个poly G区段,其中所述两个poly G区段中的一个位于所述寡核苷酸的5’末端而所述两个poly G区段中的一个位于所述寡核苷酸的3’末端。典型且优选地,此处使用的寡核苷酸由6-1000个、优选10-1000个、更优选10-200个、再更优选10-100个、再更优选20-40个、最优选30个核苷酸组成。进一步优选的寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸组成。再更优选的寡核苷酸由24-32个核苷酸、更优选大约30个核苷酸组成。
术语寡核苷酸也指至少包含一个修饰的核苷酸的分子,其中优选地所述修饰的核苷酸选自(a)核苷酸类似物或(b)包含骨架修饰的核苷酸。在一个实施方案中,寡核苷酸包含至少一个选自下组的修饰的核苷酸:(a)肽核酸,(b)肌苷,(c)三苯甲基化(tritylated)碱基,(d)硫代磷酸酯,(e)烷基硫代磷酸酯,(f)5-硝基吲哚脱氧呋喃核糖基,(g)5-甲基脱氧胞嘧啶,和(h)5,6-二氢-5,6-二羟基脱氧胸苷。在进一步的实施方案中,寡核苷酸包含或者由硫代磷酸化的核苷酸组成。硫代磷酸化的核苷酸受到保护而不在细胞或生物体中降解,因此是优选的核苷酸修饰。进一步优选的是一般在自然中发现的化学、酶或代谢修饰形式的多核苷酸。但是,优选的寡核苷酸只由未修饰的核苷酸即腺苷、胸苷、鸟苷和/或胞苷组成。进一步优选的寡核苷酸只由磷酸二酯键结合的核苷酸组成。
非常优选的寡核苷酸是含有非甲基化的CpG的寡核苷酸,其包含至少1个,优选1、2、3或4个CpG基序。更优选的寡核苷酸包含回文序列,其中优选地所述回文序列包含至少1个,优选1、2、3或4个CpG基序。更优选的寡核苷酸包含回文序列,其中优选地所述回文序列包含或者优选地由序列GACGATCGTC(SEQ ID NO:1)组成。更优选的寡核苷酸包含回文序列,其中所述回文序列在其5’端的侧翼为poly G区段,并且所述回文序列在其3’端的侧翼为poly G区段,其中优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO:1)。非常优选的寡核苷酸包含回文序列,其中所述回文序列在其5’末端的侧翼为至少3-10个,优选4-10个鸟苷个体,并且所述回文序列在其3’末端的侧翼为至少3-10个,优选4-10个鸟苷个体,其中优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO:1)。
“poly G区段”:术语poly G区段涉及寡核苷酸区段,其中所述区段由至少3个连续鸟苷残基组成。优选的poly G区段由3-25个、优选4-20个、更优选4-15个、最优选4-10个连续鸟苷个体组成。进一步优选的poly G区段由3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续鸟苷个体组成。
“CpG基序”:此处使用的术语“CpG基序”是指短DNA序列,优选单链DNA序列,其包含胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)二核苷酸,其中C是非甲基化的,并且优选地所述CG二核苷酸是磷酸二酯键结合的。优选地,CpG基序在所述CG二核苷酸的5’和/或3’侧包含至少1个,优选1、2或3个额外的核苷酸,其中进一步优选地所述额外的核苷酸不包含CG二核苷酸。
“相对峰开始时间”:术语“相对峰开始时间”是一个指示寡核苷酸的聚集状态的参数。寡核苷酸的相对峰开始时间通过分析型大小排阻HPLC确定,其中优选地所述HPLC基本上、优选地完全使用下列参数进行:
柱:TSKgel 5000 PWXL 7.8mm* 30.0cm(Lot:5PWX06GNMH3304,Art:08023,Tosoh Bioscience)
洗脱液:PBS(20mM磷酸钠缓冲液中的150mM NaCl,pH7.2)
注入体积: 40.0μl(优选地含有约20μM-约500μM的浓度)
流速: 0.8ml/min
梯度: 等度
运行时间: 20min
波长: 215、260和280nm,在260nm评价数据
柱加热器温度: 25℃
自动进样器温度:8℃;
并且其中使用所述RNA噬菌体的衣壳作为标准物。所述寡核苷酸相对于所述RNA噬菌体的衣壳的相对峰开始时间X%如下计算:X%=寡核苷酸的峰开始时间[min]除以标准物的保留时间[min]x100%,其中寡核苷酸的峰开始时间被确定为可以检测到寡核苷酸的洗脱时的时间,并且标准物的保留时间被确定为所述标准物出现最大峰值的时间。因此,在其中所述RNA噬菌体例如是噬菌体AP205的实施方案中,在所述HPLC中使用AP205的衣壳作为标准物,所述寡核苷酸的相对峰开始时间相对于所述AP205标准物进行计算。重要的是,在不涉及RNA噬菌体的实施方案中,相对峰开始时间总是使用噬菌体Qβ的衣壳作为标准物进行确定。此外,如果所述HPLC中适当标准物的选择具有任何不确定性,使用噬菌体Qβ的衣壳作为标准物,相对于所述噬菌体Qβ的衣壳确定相对峰开始时间。因此,在一个非常优选的实施方案中,通过所述HPLC确定所述相对峰开始时间,其中优选地所述标准物是噬菌体Qβ的衣壳,并且进一步优选地所述相对峰开始时间相对于所述噬菌体Qβ的衣壳进行确定。
“包装的”:此处使用的术语“包装的”是指寡核苷酸相对于病毒样颗粒的状态。术语“包装到VLP内的寡核苷酸”或“包装有寡核苷酸的VLP”的使用是等同的。此处使用的术语“包装的”是指非共价结合,优选地是指离子相互作用、疏水相互作用或氢键。非常优选地,此处使用的术语“包装的”是指所述寡核苷酸包封或部分包封于VLP内。例如,寡核苷酸,优选具有50-110%的相对峰开始时间的寡核苷酸,可以被VLP包封,而不需存在实际的共价或非共价的结合,或者存在非共价结合。典型且优选地,包装有寡核苷酸的VLP保护所述寡核苷酸免于降解,优选地免于DNAse水解。因此,在优选的含义中,术语“包装的”表示包装状态的寡核苷酸不会被DNAse水解。更优选地,术语“包装的”表示寡核苷酸不会被DNAse水解,其中进一步优选地,该DNAse是DNAseI或Benzonase。再更优选地,术语“包装的”表示寡核苷酸不会被Benzonase水解。
寡核苷酸对于DNAse(例如DNaseI或Benzonase)的可及性优选地如WO2003/024481 A2的实施例11-17(参见其中第111页)所述测定。在优选的含义中,当用Benzonase(190U Benzonase/mg外壳蛋白,在含有2mM MgCl2的pH7.2的缓冲液中,20-25℃,18h)处理后从VLP中可以回收至少90%、优选至少95%、最优选至少98%的寡核苷酸时(例如,在溴化乙锭染色的凝胶中),所述VLP被认为包装有所述寡核苷酸。技术人员显然知道这样的试验需要适当的对照,并且可能需要适应VLP和寡核苷酸的具体组合。在更优选的含义中,当用Benzonase(190U Benzonase/mg外壳蛋白,在含有2mM MgCl2的pH7.2的缓冲液中,20-25℃,18h)处理后从RNA噬菌体的VLP中可以回收至少90%、优选至少95%、最优选至少98%的寡核苷酸时,所述寡核苷酸被认为包装在所述RNA噬菌体的VLP内。在非常优选的含义中,当用Benzonase(190U Benzonase/mg外壳蛋白,在含有2mMMgCl2的pH7.2的缓冲液中,20-25℃,18h)处理后从RNA噬菌体的VLP中可以回收至少90%、优选至少95%、最优选至少98%的寡核苷酸G10(SEQ ID NO:8)时,所述G10被认为包装在所述RNA噬菌体的VLP内。在更特定的含义中,当用Benzonase(190U Benzonase/mg外壳蛋白,在含有2mM MgCl2的pH7.2的缓冲液中,20-25℃,18h)处理后从RNA噬菌体Qβ、AP205、GA或fr的VLP中可以回收至少90%、优选至少95%、最优选至少98%的寡核苷酸G10(SEQ ID NO:8)时,所述G10被认为包装在所述RNA噬菌体的VLP内。在非常特定的含义中,当用Benzonase(190U Benzonase/mg外壳蛋白,在含有2mM MgCl2的pH7.2的缓冲液中,20-25℃,18h)处理后从RNA噬菌体Qβ的VLP中可以回收至少90%、优选至少95%、最优选至少98%的含非甲基化CpG的寡核苷酸时,寡核苷酸G10(SEQ ID NO:8)被认为包装在所述RNA噬菌体Qβ的VLP内。
“外壳蛋白”:此处使用的术语“外壳蛋白”是指能够合并到噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配体内的RNA噬菌体的蛋白质。因此,术语外壳蛋白是指形成RNA噬菌体的衣壳或RNA噬菌体的VLP的蛋白质。典型且优选地,RNA噬菌体的外壳蛋白具有二聚体结构。
此处使用的“(重组)外壳蛋白的片段”,特别是重组外壳蛋白的片段,被定义为一种多肽,其长度分别是野生型外壳蛋白或野生型重组蛋白长度的至少70%,优选至少80%,更优选至少90%,甚至更优选至少95%,并且优选地保持形成VLP的能力。优选地,该片段通过至少一个内部缺失、至少一个截短或者至少一个它们的组合而获得。术语“重组外壳蛋白的片段”或“外壳蛋白的片段”进一步包括如下的多肽,它分别与野生型外壳蛋白有至少80%、优选90%、甚至更优选95%的氨基酸序列同一性,并且优选地能够装配为病毒样颗粒。术语“突变外壳蛋白”是指分别具有来源于野生型重组蛋白或外壳蛋白的氨基酸序列的多肽,其中氨基酸序列与野生型序列至少80%、优选地至少85%、90%、95%、97%或99%相同,并且优选地保持装配为VLP的能力。
此处使用的“病毒样颗粒(VLP)”是指非复制性的或非传染性的,优选非复制性且非传染性的病毒颗粒,或者指非复制性或非传染性的,优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒的结构,优选病毒的衣壳。此处使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。此处使用的术语“非传染性”是指不能进入宿主细胞。优选地,本发明的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的,因为它缺乏全部或部分病毒基因组或基因组功能。在一个实施方案中,病毒样颗粒是一种病毒颗粒,其中病毒基因组已经被物理或化学灭活,通过解装配和重装配或者通过将纯化的蛋白质装配为VLP而除去。典型且更优选地,病毒样颗粒缺乏病毒基因组的全部或部分的复制性和传染性成分。本发明的病毒样颗粒可以含有与它们的基因不同的核酸。本发明病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳,如相应病毒、噬菌体(优选RNA噬菌体)的病毒衣壳。术语“衣壳”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般有60、120、180、240、300、360和360个以上的病毒蛋白质亚单位。典型且优选地,这些亚单位的相互作用导致形成具有固有的重复组织的病毒衣壳,其中所述结构一般且优选地是球形。例如,RNA噬菌体的衣壳具有二十面体对称的球形。
“RNA噬菌体的病毒样颗粒”:此处使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含或者优选地基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段组成的病毒样颗粒。另外,类似于RNA噬菌体的结构的RNA噬菌体的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的,并且至少缺乏编码RNA噬菌体的复制机构的一个或多个基因,一般也缺乏编码一种或多种负责病毒附着于或进入宿主的蛋白质的一个或多个基因。优选的来源于RNA噬菌体的VLP显示出二十面体对称,并且由180个亚单位组成。在本发明的上下文中,术语RNA噬菌体的病毒样颗粒优选地涉及通过RNA噬菌体的重组外壳蛋白的自装配获得的大分子结构,或其片段或突变体,其中优选地所述自装配在寡核苷酸的存在下发生。
“能够阻止外壳蛋白自装配的试剂”:能够阻止外壳蛋白自装配的试剂是阻止在所述混合物中自发形成病毒样颗粒的试剂。技术人员能够通过实验确定所述试剂的化学性质和合适的浓度,例如,通过如实施例9所公开的大小排阻层析法分析所述混合物。能够阻止外壳蛋白自装配的试剂,当在室温下、优选地在22℃下温育所述混合物至少1小时后,通过如实施例9所公开的大小排阻层析法没有检测到病毒样颗粒。但是,能够阻止外壳蛋白自装配的试剂不会不可逆地修饰所述外壳蛋白,从所述混合物中除去所述试剂将会导致病毒样颗粒的自发形成。优选的能够阻止外壳蛋白自装配的试剂包括去污剂、盐酸胍和尿素,最优选的是尿素。优选的去污剂是十二烷基硫酸钠、吐温20、TritonX100等。一般且优选地,能够阻止外壳蛋白自装配的试剂还包括使通过所述外壳蛋白的半胱氨酸残基形成的分子间二硫键保持还原状态的还原剂。
“蛋白质收率”:本发明方法的蛋白质收率被确定为相对于所述混合物中所含的外壳蛋白量,所述方法的最后一步后作为病毒样颗粒回收的外壳蛋白的量,其中优选地所述外壳蛋白的量通过Bradford蛋白质分析来确定。一般且优选地,所述混合物中所含的外壳蛋白的至少70%、优选地至少75%在所述方法的最后一步后作为病毒样颗粒被回收,其中优选地所述最后一步是所述无菌过滤。
“寡核苷酸收率”:本发明方法的寡核苷酸收率被确定为相对于所述混合物中所含的所述寡核苷酸的量,所述方法的最后一步后可以从所述病毒样颗粒中回收的寡核苷酸的量,其中优选地从所述病毒样颗粒中回收的所述寡核苷酸的量基本或者优选地完全按照实施例9中所公开的确定。一般且优选地,在所述方法的最后一步后,从所述病毒样颗粒中回收所述混合物中所含的寡核苷酸的至少70%、优选地至少75%,其中优选地所述最后一步是所述无菌过滤。
“纯度”:本发明组合物的纯度通过分析型大小排阻HPLC测定,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中所述HPLC在基本上、优选地完全如实施例4所述的条件下进行。所述组合物的纯度被确定为所述组合物中所含的所述病毒样颗粒的峰面积相对于同一层析图的总峰面积的百分比。一般且优选地,本发明组合物的纯度为至少98%,优选地至少99%。
“一个”、“一种”:当术语“一个”、“一种”在本文中使用时,除非另外指出,它们的意思是“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”。
“大约”:在本申请的含义中,表述“大约”具有+/-10%的含义。例如,大约100是指90-110。
本发明提供生产包含聚集的寡核苷酸的核苷酸组合物的方法。更详细地,本发明提供一种生产包含寡核苷酸的核苷酸组合物的方法,其中优选地所述寡核苷酸具有50-110%的相对峰开始时间,所述方法包括以下步骤:(a)在溶液II中提供寡核苷酸,其中所述寡核苷酸优选地在其5’末端具有至少3个鸟苷个体并且在其3’末端具有至少3个鸟苷个体;并且其中所述溶液II的pH为5-8;并且其中所述溶液II包含阳离子,其中优选地所述溶液II中所述阳离子的浓度为至少20mM,其中所述阳离子优选地选自Na+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+和Mg2+;(b)调节溶液II的温度至温度III,其中所述温度III为50-99℃;和(c)在温度III下在溶液II中温育所述寡核苷酸,其中进行所述温育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相对峰开始时间;和(d)调节溶液II的温度至温度IV,其中所述温度IV低于50℃;其中所述步骤优选地按照给定的顺序进行。下面描述的所有实施方案都以任意组合适用于该方法。
如上所述,已发现使所述寡核苷酸在所述聚集步骤之前经历解聚步骤是有利的,其中优选地所述寡核苷酸完全解聚。寡核苷酸的完全解聚是指在优选地基本如实施例4所述进行的大小排阻HPLC中寡核苷酸的表观分子量对应于可能来源于所述寡核苷酸序列的分子量。因此,本发明进一步提供一种生产包含寡核苷酸的核苷酸组合物的方法,其中优选地所述寡核苷酸具有50-110%的相对峰开始时间,所述方法包括以下步骤:(a)在溶液I中提供寡核苷酸,其中所述寡核苷酸具有至少一个poly G区段;并且其中所述溶液I具有碱性pH;(b)解聚所述寡核苷酸,其中所述解聚包括以下步骤:(i)调节溶液I的温度至温度I,其中所述温度I为4-70℃;(ii)在所述温度I下在所述溶液I中温育所述寡核苷酸,其中进行所述温育直到所述寡核苷酸具有高于110%的相对峰开始时间;和(iii)调节所述溶液I的温度至温度II,其中所述温度II为0-70℃;(c)调节所述溶液I的pH至pH5-8;和(d)聚集所述寡核苷酸,其中所述聚集包括以下步骤:(i)在溶液II中提供所述寡核苷酸,其中所述溶液II为pH5-8并且含有阳离子,其中优选地所述溶液II中所述阳离子的浓度为至少20mM,并且优选地所述阳离子选自Na+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+和Mg2+;(ii)调节溶液II的温度至温度III,其中所述温度III为50-99℃;(iii)在温度III下在溶液II中温育所述寡核苷酸,其中进行所述温育直到所述寡核苷酸具有50-110%的相对峰开始时间;和(iv)调节溶液II的温度至温度IV,其中所述温度IV低于50℃;其中所述步骤优选地按照给定的顺序进行。
可能包含部分聚集的寡核苷酸的未处理的寡核苷酸在碱性pH下发生解聚。升高的温度可以促进解聚过程。
因此,在一个实施方案中,溶液I的pH为8-13,优选10-13,最优选12。溶液I可以包含任何缓冲液或者试剂,可以包含允许调节pH为8-13的任何本领域中已知的缓冲液或试剂。在一个优选的实施方案中,溶液I包含氢氧化物,优选金属氢氧化物,最优选碱金属或碱土金属的氢氧化物,优选碱金属的氢氧化物。在一个优选的实施方案中,所述氢氧化物是氢氧化钾或氢氧化钠,最优选氢氧化钠。在一个实施方案中,所述溶液I中所述氢氧化物、优选所述氢氧化钠的浓度为10mM-200mM,更优选约25mM,最优选25mM。
为了避免寡核苷酸的降解,温度I优选地不超过90℃,温度I不超过70℃。在一个实施方案中,温度I为室温,优选19-25℃。在另一个实施方案中,温度I为4-70℃,优选20-70℃,更优选45-70℃,优选约50℃,最优选50℃。在一个优选的实施方案中,在所述温度I下在所述溶液I中对所述寡核苷酸进行所述温育,直到所述寡核苷酸完全解聚。在另外一个实施方案中,在所述温度I下在所述溶液I中对所述寡核苷酸进行所述温育,直到所述寡核苷酸的相对峰开始时间高于110%,优选高于130%,最优选地高于135%。在进一步的实施方案中,在所述温度I下在所述溶液I中对所述寡核苷酸的所述温育进行30-190min,优选50-90min,最优选70min。
在一个进一步优选的实施方案中,所述溶液I中所述寡核苷酸的浓度为50μM-2mM,优选50-500μM,更优选200-300μM,最优选260μM。
寡核苷酸的解聚可以通过中和或酸化溶液I和/或降低温度来终止。因此,所述方法进一步包括调节所述溶液I的pH至pH8或更低,优选至pH5-8的步骤。在一个优选的实施方案中,进行所述pH的调节直到所述pH为6-7,最优选地直到所述pH约为6。在进一步的实施方案中,所述所述溶液I的pH的调节通过向所述溶液I中加入酸进行。本领域周知的任何无机酸或有机酸可以用于该目的。在一个优选的实施方案中,所述酸选自磷酸、盐酸和有机酸,其中所述有机酸优选地选自甲酸、乙酸和柠檬酸。在一个优选的实施方案中,所述酸是无机酸。优选地,所述酸是磷酸或盐酸,最优选磷酸。
所述方法进一步包括调节所述溶液I的温度至温度II,其中优选地所述温度II为0-70℃,并且其中优选地所述温度II低于温度I。在一个优选的实施方案中,所述温度II为0-25℃,优选0-10℃,最优选0-2℃。
该方法进一步包括聚集所述寡核苷酸的步骤。寡核苷酸的聚集是通过在大约中性pH和高于50℃的温度下在含有能够支持G-四元DNA结构形成的阳离子的溶液中温育所述寡核苷酸而实现的(参见,Simonsson T.,Biol.Chem.382:621-628)。因此,在一个实施方案中,所述阳离子选自Na+、K+、Rb+、NH4 +、Cs+、Li+、Sr2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+和Mg2+。在一个优选的实施方案中,所述阳离子选自Na+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+和Mg2+,更优选地,所述阳离子是Na+或K+,最优选地,所述阳离子是Na+。在一个非常优选的实施方案中,浓度
在一个优选的实施方案中,包含所述寡核苷酸的溶液II是通过向所述溶液I中添加所述阳离子而获得的,其中优选地所述添加在所述溶液I的pH调节之后进行。
在进一步的实施方案中,所述溶液II是选自Na+、K+、Rb+、NH4 +、Cs+、Li+、Sr2+、Ba2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Ni2+和Mg2+的任意阳离子的混合物。在进一步的实施方案中,所述溶液II是选自Na+、K+、NH4 +、Li+、Ca2+和Mg2+的任意阳离子的混合物。在一个非常优选的实施方案中,所述混合物包含或者优选地由Na+和K+组成。
在一个优选的实施方案中,所述溶液II包含至少20mM,优选至少100mM,更优选200-275mM,最优选250mM的所述阳离子或者所述阳离子混合物。在一个非常优选的实施方案中,所述溶液II包含250mM的Na+和K+,最优选250mM的Na+。在再进一步优选的实施方案中,所述溶液II包含250mM的氯化钠或氯化钾,最优选250mM的氯化钠。但是,任何本领域周知的钠、钾、铵、锂、钙或镁盐都可以用于该目的。
在进一步的实施方案中,所述溶液II中所述寡核苷酸的浓度为50μM-2mM,优选100-300μM,最优选175μM。
在进一步的实施方案中,所述方法进一步包括调节溶液II的温度至温度III,其中所述温度III为50-99℃,优选80-90℃,更优选约85℃,最优选85℃。
在进一步的实施方案中,所述方法包括在温度III下在溶液II中温育所述寡核苷酸,其中进行所述温育直到所述寡核苷酸具有50-110%、优选80-95%、更优选80-90%、再更优选83-90%、再更优选85-90%、最优选88%的相对峰开始时间。在一个非常优选的实施方案中,所述寡核苷酸为G10(SEQ ID NO:8),并且进行所述温育直到所述寡核苷酸具有50-110%、优选80-95%、更优选80-90%、再更优选83-90%、再更优选85-90%、最优选88%的相对峰开始时间。
获得具有所需相对峰开始时间的寡核苷酸所需的温育时间取决于寡核苷酸的序列和纯度,其范围一般且优选地是从大约5分钟至大约30分钟。在一个优选的实施方案中,所述寡核苷酸是G10(SEQ IDNO:8),所述寡核苷酸在所述温度III下在所述溶液II中的所述温育进行9-24分钟。
聚集过程通过使溶液II冷却到50℃以下来终止。在一个优选的实施方案中,所述方法包括调节溶液II的温度至温度IV,其中所述温度IV低于50℃,并且优选地所述温度IV为0-25℃,更优选0-10℃,最优选0-2℃。
已发现在本发明方法中使用的加热和/或冷却速率对获得的聚集寡核苷酸的收率和颗粒大小分布具有影响。特别是,在将该方法放大到较高的批量体积的过程中发现,使用至少3.6℃/min的变温速度(即加热或冷却速率)可以进一步提高收率和颗粒大小分布。技术人员通过将关于反应容器的反应体积、几何形状和导热性的过程条件和所选的温差标准化,可以实现确定的温度变化。在优选的实施方案中,所述调节溶液I的温度至温度I,所述调节所述溶液I的温度至温度II,所述调节溶液II的温度至温度III,和/或所述调节溶液II的温度至温度IV,使用至少3.6℃/min的变温速度进行。在一个进一步优选的实施方案中,所述调节溶液II的温度至温度III,采用至少3.6℃/min的变温速度进行,其中优选地所述变温速度为大约7℃/min。在一个进一步优选的实施方案中,所述调节溶液II的温度至温度IV采用至少3.6℃/min的变温速度进行,其中优选地所述变温速度为大约7℃/min。
为了能够形成聚集物,所述寡核苷酸包含至少一个、优选两个poly G区段。在一个优选的实施方案中,所述寡核苷酸在其5’末端包含至少3个、优选至少4个鸟苷个体,在其3’末端包含至少3个、优选至少4个鸟苷个体。在一个进一步优选的实施方案中,所述寡核苷酸在其5’末端包含至少4个鸟苷个体并且在其3’末端包含至少4个鸟苷个体。在一个优选的实施方案中,所述寡核苷酸在其5’末端包含至少3个、最多20个、优选地最多15个鸟苷个体,在其3’末端包含至少3个、最多20个、优选地最多15个鸟苷个体。在一个进一步优选的实施方案中,所述寡核苷酸在其5’末端包含至少3个、优选至少4个,最多11个鸟苷个体,在其3’末端包含至少3个、优选至少4个、最多10个鸟苷个体。在一个进一步优选的实施方案中,所述寡核苷酸是含有非甲基化的CpG的寡核苷酸,优选地其中所述含有非甲基化的CpG的寡核苷酸包含两个poly G区段,其中优选地每个所述poly G区段由至少4个鸟苷个体组成,并且其中进一步优选地所述含有非甲基化的CpG的寡核苷酸包含回文序列,其中所述回文序列位于所述poly G区段之间。在一个进一步优选的实施方案中,所述寡核苷酸在其5’末端包含至少3个,优选至少4个鸟苷个体,并且在其3’末端包含至少3个,优选至少4个鸟苷个体,其中所述寡核苷酸进一步包含回文序列,其中优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQID NO:1)。
在一个进一步优选的实施方案中,所述寡核苷酸包含回文序列,其中优选地所述回文序列是GACGATCGTC(SEQ ID NO:1),并且其中所述回文序列在其5’端的侧翼为至少3个,优选至少4个,最多15个鸟苷个体,并且其中所述回文序列在其3’端的侧翼为至少3个,优选至少4个,最多15个鸟苷个体。
在一个进一步优选的实施方案中,所述寡核苷酸包含10-1000个核苷酸,优选10-200个核苷酸,更优选10-100个核苷酸,再更优选20-40个核苷酸,最优选30个核苷酸。
在一个非常优选的实施方案中,所述寡核苷酸包含或者优选地由选自下组的核酸序列组成:(a)“G4-4”GGGGGACGAT CGTCGGGG(SEQ ID NO:2);(b)“G5-5”GGGGGGACGA TCGTCGGGGG(SEQ IDNO:3);(c)“G6-6”GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ IDNO:4);(d)“G7-7”GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(SEQ IDNO:5);(e)“G8-8”GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(SEQID NO:6);(f)“G9-9”GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(SEQ ID NO:7);(g)“G10”GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8);(h)“G11”GGGGGGGGGGGGACGATCGT CGGGGGGGGG GG(SEQ ID NO:9),其中优选地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯键合的核苷酸组成。在一个更优选的实施方案中,所述寡核苷酸包含或者优选地由核酸序列“G10”GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8)组成,其中优选地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯键合的核苷酸组成。
本发明进一步涉及包含寡核苷酸的核苷酸组合物,其中所述核苷酸组合物通过上述任意一种方法、通过单独或者任意组合地实施上述任一种实施方案可以获得。特别是,本发明涉及一种包含寡核苷酸的核苷酸组合物,其中所述核苷酸组合物通过上述任意一种方法可以获得,其中优选地所述寡核苷酸具有50-110%,优选80-95%,更优选80-90%,更优选83-90%,再更优选85-90%,最优选88%的相对峰开始时间。在一个优选的实施方案中,所述核苷酸组合物包含寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含或者优选地由选自下组的核酸序列组成:(a)“G4-4”GGGGGACGAT CGTCGGGG(SEQ ID NO:2);(b)“G5-5”GGGGGGACGA TCGTCGGGGG(SEQ ID NO:3);(c)“G6-6”GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG(SEQ ID NO:4);(d)“G7-7”GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG(SEQ ID NO:5);(e)“G8-8”GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG(SEQ IDNO:6);(f)“G9-9”GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG(SEQ ID NO:7);(g)“G10”GGGGGGGGGG GACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8);(h)“G11”GGGGGGGGGGGGACGATCGT CGGGGGGGGG GG(SEQ ID NO:9),其中优选地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯键合的核苷酸组成。在一个更优选的实施方案中中,所述核苷酸组合物包含寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含或者优选地由核酸序列“G10”GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8)组成,其中优选地所述寡核苷酸完全由磷酸二酯键合的核苷酸组成。在一个非常优选的实施方案中,所述核苷酸组合物包含寡核苷酸,其中所述寡核苷酸由核酸序列“G10”GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG(SEQ ID NO:8)组成,其中所述寡核苷酸完全由磷酸二酯键合的核苷酸组成,并且其中所述寡核苷酸具有50-110%,优选80-95%,更优选80-90%,更优选83-90%,再更优选85-90%,最优选88%的相对峰开始时间。
如前所述,本发明的核苷酸组合物可用于生产组合物的方法中,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,因为本发明的核苷酸组合物中所含的聚集的寡核苷酸有利于RNA噬菌体外壳蛋白的自装配,因而有利于RNA噬菌体的病毒样颗粒的形成,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒中。因此本发明进一步涉及一种生产组合物的方法,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,所述方法包括以下步骤:(a)提供所述RNA噬菌体的外壳蛋白;(b)提供包含寡核苷酸的核苷酸组合物,其中所述核苷酸组合物是通过本发明的任意一种方法可以获得的核苷酸组合物;(c)产生混合物,其中所述混合物包含:(i)所述外壳蛋白;(ii)能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂;(iii)所述寡核苷酸;(d)从所述混合物中除去所述试剂;和(e)让所述外壳蛋白自装配为病毒样颗粒。所述方法可以包括任意组合的此处所述的任一种特征和实施方案。
相对峰开始时间为50-110%的寡核苷酸对于本发明的目的是最有用的,而具有较高或较低相对峰开始时间的寡核苷酸可能导致低收率。因此,本发明进一步提供一种生产组合物的方法,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,所述方法包括以下步骤:(a)提供所述RNA噬菌体的外壳蛋白;(b)提供寡核苷酸,(i)其中所述寡核苷酸优选地包含至少一个poly G区段;和(ii)其中所述寡核苷酸具有50-110%的相对峰开始时间;(c)产生混合物,其中所述混合物包含:(i)所述外壳蛋白;(ii)能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂;(iii)所述寡核苷酸;(d)从所述混合物中除去所述试剂;和(e)让所述外壳蛋白自装配为病毒样颗粒.所述方法可以包括任意组合的此处所述的任一种特征和实施方案。
技术人员通过采用标准方法从RNA噬菌体中纯化所述外壳蛋白能够产生和纯化RNA噬菌体的外壳蛋白。然而,在一个优选的实施方案中,所述外壳蛋白是重组产生的,优选的是通过在大肠杆菌中表达所述外壳蛋白而产生的。获得RNA噬菌体的外壳蛋白的方法在实施例部分中公开。在一个优选的实施方案中,所述外壳蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成,其中优选地所述RNA噬菌体选自:(a)噬菌体Qβ;(b)噬菌体R17;(c)噬菌体fr;(d)噬菌体GA;(e)噬菌体SP;(f)噬菌体MS2;(g)噬菌体M11;(h)噬菌体MX1;(i)噬菌体NL95;(j)噬菌体f2;(k)噬菌体PP7;和噬菌体AP205。在一个优选的实施方案中,所述RNA噬菌体是噬菌体Qβ。用于表达和纯化RNA噬菌体(特别是噬菌体Qβ)的病毒样颗粒的过程和方法在WO2006/125821A2和WO2007/039552A1中公开,它们在此引入作为参考。RNA噬菌体的外壳蛋白可以通过病毒样颗粒的解装配获得,例如,如本文实施例所述。
在一个进一步优选的实施方案中,所述RNA噬菌体是噬菌体AP205。AP205VLP的可装配突变形式,包括第5位氨基酸的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白,也可以在本发明的实施中应用。WO 2004/007538,特别是实施例1和实施例2中,描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP,由此,特别是描述了它们的表达和纯化。WO 2004/007538在此引入作为参考。
在一个进一步优选的实施方案中,所述RNA噬菌体是噬菌体fr。重组VLP形式的fr外壳蛋白可以如Pushko P等人((1993)Prot Engin6:883-891)所述获得。在一个进一步优选的实施方案中,所述RNA噬菌体是噬菌体GA。GA VLP可以通过将经逆转录从GA噬菌体中分离的GA外壳蛋白cDNA克隆到pQb185内而获得,这在例如WO2004/007538中描述。Fr和GA VLP的解装配可以容易地如下进行:在任选地添加有浓度为0.1M的乙酸的7M尿素中温育VLP。通过离子交换层析,在允许明显量的外壳蛋白流过而核酸保留的pH下,或者在外壳蛋白也被吸附到柱上并随后被盐梯度洗脱的pH下,从外壳蛋白中进一步纯化核酸。
在一个优选的实施方案中,所述外壳蛋白包含或者优选地由选自下组的氨基酸序列组成:(a)SEQ ID NO:10(QβCP);(b)SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11(QβA1蛋白)的混合物;(c)SEQ ID NO:12(R17外壳蛋白);(d)SEQ ID NO:13(fr外壳蛋白);(e)SEQ ID NO:14(GA外壳蛋白);(f)SEQ ID NO:15(SP外壳蛋白);(g)SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的混合物;(h)SEQ ID NO:17(MS2外壳蛋白);(i)SEQ ID NO:18(M11外壳蛋白);(j)SEQ ID NO:19(MX1外壳蛋白);(k)SEQ ID NO:20(NL95外壳蛋白);(1)SEQ ID NO:21(f2外壳蛋白);(m)SEQ ID NO:22(PP7外壳蛋白);和(n)SEQ ID NO:23(AP205外壳蛋白)。在一个进一步优选的实施方案中,所述外壳蛋白包含或者优选地由选自下组的氨基酸序列组成:(a)SEQ ID NO:10;(b)SEQID NO:10和SEQ ID NO:11的混合物;(c)SEQ ID NO:13;(d)SEQ IDNO:14;(e)SEQ ID NO:23。在一个进一步优选的实施方案,所述外壳蛋白包含或者优选地由选自下组的氨基酸序列组成:(a)SEQ IDNO:10;和(b)SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的混合物。
此外,本发明可以使用其中暴露的赖氨酸残基被替换为精氨酸的噬菌体Qβ的突变外壳蛋白。这样,在一个进一步优选的实施方案中,所述外壳蛋白包含、基本由或者由WO02/056905(参见其中的实施例18)公开的突变Qβ外壳蛋白组成。
进一步地,也已证明RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein,RA.等人,Gene 23:245-254(1983),Kozlovskaya,TM.等人,Dokl.Akad.Nauk SSSR 287:452-455(1986),Adhin,MR.等人,Virology 170:238-242(1989),Priano,C.等人,J.Mol.Biol.249:283-297(1995))。特别是已经公开了GA(Ni,CZ.,等人,Protein Sci.5:2485-2493(1996),Tars,K等人,J.Mol.Biol.271:759-773(1997))和fr(Pushko P.等人,Prot.Eng.6:883-891(1993),Liljas,L等人J Mol.Biol.244:279-290,(1994))的生物学和生物化学性质。已经确定了几种RNA噬菌体的晶体结构(Golmohammadi,R.等人,Structure 4:543-554(1996))。
典型且优选地,此处公开的生产组合物的方法在室温下进行,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内。在一个优选实施方案中,所述方法在15-30℃,优选地在19-25℃,最优选地在22℃下进行。在一个进一步优选的实施方案中,所述混合物的所述产生、所述从所述混合物中除去所述试剂和/或所述让所述外壳蛋白自装配为病毒样颗粒在15-30℃,优选地在19-25℃,最优选地在22℃下进行。
所述方法包括产生混合物,其中所述混合物包含:(i)所述外壳蛋白;(ii)能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂;(iii)所述寡核苷酸。在一个优选的实施方案中,所述混合物中所述外壳蛋白的浓度为0.5-10mg/ml,优选1-4mg/ml,最优选2.5mg/ml,其中优选地所述浓度通过Bradford分析测定。在一个进一步优选的实施方案中,所述混合物中所述寡核苷酸的浓度为12.5-250μM,更优选25-100μM,最优选62.5μM。
为了获得包装过程的最佳收率,所述混合物中所述寡核苷酸和所述外壳蛋白的摩尔比为0.5-1.2,优选0.6-0.8,最优选0.7。每个外壳蛋白使用较少的寡核苷酸将导致低收率,而使用过量的寡核苷酸则会提高成本,并且可能产生低纯度的产物。在一个非常优选的实施方案中,所述混合物中所述外壳蛋白的浓度为2.5mg/ml,所述混合物中所述寡核苷酸的浓度为62.5μM。
病毒外壳蛋白,特别是RNA噬菌体的外壳蛋白,通常具有自装配为衣壳结构例如病毒样颗粒的强烈倾向。尽管不是在每种情况下都是这样,但是在许多情况下在存在核酸如RNA或DNA的情况下这种倾向将会提高。为了在所述外壳蛋白发生自装配之前获得所述外壳蛋白和所述寡核苷酸的最佳混合,所述混合物包含能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂。典型且优选地,所述试剂包括变性化合物。生物化学领域知道大量的变性化合物,包括去污剂、尿素或盐酸胍。优选的去污剂是十二烷基硫酸钠、吐温20、TritonX 100等。在一个优选的实施方案中,所述变性化合物是尿素或盐酸胍,其中优选地所述混合物中所述变性化合物(优选地所述尿素)的浓度为0.25-7.2M,优选1M。在一个非常优选的实施方案中,所述变性化合物是尿素,所述混合物中所述尿素的浓度为0.5-2M,优选0.7-1.5M,更优选0.8-1.2M,最优选1M。
在一个进一步优选的实施方案中,所述混合物的pH大约为中性,优选地所述pH为6-8,更优选6.8-7.5,最优选地所述pH为7.2。在一个非常优选的实施方案中,所述混合物包含磷酸盐缓冲液,优选磷酸钠缓冲液,其中进一步优选地所述混合物中所述磷酸盐缓冲液的终浓度为2-100mM,更优选10-50mM,最优选大约20mM。
在进一步的实施方案中,所述混合物进一步包含盐,其中优选地所述盐是卤化物,优选碱土金属的氯化物,更优选地所述盐是氯化钾或氯化钠或它们的组合,最优选地,所述盐是氯化钠。在一个优选的实施方案中,所述混合物中所述盐或所述盐的组合的浓度,优选地所述氯化钠的浓度,为0-1M,优选0-550mM,更优选0-350mM,再更优选50-350mM,最优选250mM。
某些RNA噬菌体,特别是噬菌体Qβ、噬菌体AP205和噬菌体fr的衣壳和/或病毒样颗粒,通过形成所述衣壳或病毒样颗粒的蛋白质亚单位之间的分子间二硫键而被稳定化。向所述混合物中添加还原剂使所述二硫键保持还原状态,从而支持了阻止所述外壳蛋白的自装配。在一个优选的实施方案中,所述试剂因而进一步包括还原剂,其中所述还原剂优选地选自DTT(二硫赤藓糖醇)、β-巯基乙醇、TCEP和其它本领域周知的还原剂。在一个优选的实施方案中,所述还原剂是DTT,其中优选地所述混合物中所述DTT的浓度为1-25mM,优选2.5mM。在一个非常优选的实施方案中,所述RNA噬菌体是噬菌体Qβ、噬菌体AP205或噬菌体fr,并且所述试剂进一步包括还原剂,其中优选地所述还原剂是DTT,并且进一步优选地所述混合物中所述DTT的浓度为1-25mM,优选2.5mM。在一个进一步优选的实施方案中,所述外壳蛋白包含能够在所述病毒样颗粒中形成分子间二硫键的半胱氨酸残基,并且所述试剂进一步包括还原剂,其中优选地所述还原剂是DTT,并且进一步优选地所述混合物中所述DTT的浓度为1-25mM,优选2.5mM。
在一个优选的实施方案中,所述产生所述混合物包括向所述混合物中添加(i)所述外壳蛋白;(ii)所述能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂;和(iii)所述寡核苷酸,其中优选地所述添加按照给定顺序进行,并且进一步优选地所述混合物在添加所述寡核苷酸之前混合。
在一个进一步优选的实施方案中,所述方法进一步包括在所述除去所述试剂之前温育所述混合物的步骤,其中优选地所述温育进行大约50-70分钟,优选大约60分钟。在一个进一步优选的实施方案中,所述混合物的温育在15-30℃下进行,更优选地在19-25℃下进行,最优选地在22℃下进行。在一个进一步优选的实施方案中,所述混合物的所述温育包括搅拌所述混合物,其中优选地所述搅拌以大约50-200rpm进行,最优选地以大约100rpm进行。在一个非常优选的实施方案中,所述混合物的所述温育进行大约60分钟,并且所述混合物的所述温育包括搅拌所述混合物,其中优选地所述搅拌以大约100rpm进行。
在一个实施方案中,所述从所述混合物中除去所述试剂是通过使用第一缓冲液的第一缓冲液交换进行的,其中优选地所述第一缓冲液交换通过透析或者通过连续流过滤进行,优选地通过连续流过滤进行。所述第一缓冲液交换通过具有允许保留所述外壳蛋白和自装配的VLP的分子量截止值的膜进行。在一个优选的实施方案中,所述第一缓冲液交换通过膜进行,其中所述膜的分子量截止值为1-50kD、优选5-30kD,最优选30kD。在一个非常优选的实施方案中,所述第一缓冲液交换通过分子量截止值为1-50kD、优选30kD的膜通过连续流过滤进行,其中进一步优选地所述第一缓冲液的体积是所述混合物体积的大约6倍。在一个非常优选的实施方案中,所述膜是分子量截止值为30kD的Biomax-5(PES)。在一个非常优选的实施方案中,所述第一缓冲液交换是通过分子量截止值为1-50kD、优选30kD的膜通过连续流过滤进行的,其中将渗透流速调节为大约96l/(m2*h)。
在一个进一步优选的实施方案中,所述第一缓冲液包含盐,其中优选地所述第一缓冲液的盐组成与所述混合物的盐组成相同。在一个优选的实施方案中,所述第一缓冲液中的所述盐是卤化物,优选碱土金属的氯化物,更优选地所述盐是氯化钾或氯化钠或它们的组合,最优选地,所述盐是氯化钠。在一个优选的实施方案中,所述第一缓冲液中所述盐或所述盐组合的浓度,优选地所述氯化钠的浓度,为0-1M,优选0-550mM,更优选0-350mM,再更优选50-350mM,最优选250mM。在一个进一步优选的实施方案中,所述第一缓冲液的pH为6-8,更优选6.8-7.5,最优选地所述pH为7.2。在一个进一步优选的实施方案,所述第一缓冲液包含磷酸盐缓冲液,优选磷酸钠缓冲液,其中进一步优选地所述第一缓冲液中所述磷酸盐缓冲液的终浓度为2-100mM,更优选10-50mM,最优选大约20mM。
为了稳定在自装配反应中形成的所述病毒样颗粒,所述病毒样颗粒优选地与能够在所述病毒样颗粒中形成分子间二硫键的氧化剂接触。因此,在一个优选的实施方案中,所述方法进一步包括使所述病毒样颗粒接触氧化剂的步骤,其中优选地所述氧化剂选自(a)过氧化氢,其中优选地所述过氧化氢的浓度为0.25-50mM,优选2mM;(b)氧;(c)谷胱甘肽;(d)抗坏血酸盐;(e)Cu2+;和(f)Fe3+。在一个非常优选的实施方案中,所述RNA噬菌体为噬菌体Qβ、噬菌体AP205或噬菌体fr,并且所述方法进一步包括使所述病毒样颗粒接触氧化剂的步骤,其中优选地所述氧化剂选自(a)过氧化氢,其中优选地所述过氧化氢的浓度为0.25-50mM,优选2mM;(b)氧;(c)谷胱甘肽;(d)Cu2+;和(e)Fe3+,并且最优选地所述氧化剂为过氧化氢,其中进一步优选地所述过氧化氢的浓度为0.25-50mM,优选2mM。在一个优选的实施方案中,所述外壳蛋白包含能够在所述病毒样颗粒中形成分子间二硫键的半胱氨酸残基,其中优选地所述外壳蛋白是噬菌体Qβ、噬菌体AP205或噬菌体fr的外壳蛋白,并且所述方法进一步包括使所述病毒样颗粒接触氧化剂的步骤,其中优选地所述氧化剂选自(a)过氧化氢,其中优选地所述过氧化氢的浓度为0.25-50mM,优选2mM;(b)氧;(c)谷胱甘肽;(d)Cu2+;和(e)Fe3+,并且其中最优选地所述氧化剂为过氧化氢,其中进一步优选地所述过氧化氢的浓度为0.25-50mM,优选2mM。
在一个进一步优选的实施方案中,所述方法进一步包括纯化所述病毒样颗粒的步骤,其中优选地所述纯化包括使用第二缓冲液的第二缓冲液交换,其中进一步优选地所述第二缓冲液是药学可接受的缓冲液。在一个优选的实施方案中,所述第二缓冲液交换使用第二缓冲液进行,其中优选地所述第二缓冲液交换通过透析或者通过连续流过滤进行,优选地通过连续流过滤进行。所述第二缓冲液交换通过其分子量截止值允许保留所述病毒样颗粒、优选地允许所述外壳蛋白和/或所述寡核苷酸透过的膜进行。因此,在一个优选的实施方案中,所述第二缓冲液交换通过分子量截止值为100-1000kD、优选300kD的膜进行,其中优选地所第二缓冲液交换通过连续流过滤进行。在一个非常优选的实施方案中,所述膜是分子量截止值为300kD的PLCMK-300。在一个进一步优选的实施方案,所述第二缓冲液交换通过分子量截止值为100-1000kD、优选300kD的膜通过连续流过滤进行,其中优选地交换所述混合物体积的大约10倍,并且进一步优选地将渗透流速调节为大约100l/(m2*h)。
在一个进一步的实施方案中,所述方法包括浓缩所述病毒样颗粒,其中优选地进行所述浓缩,直到所述组合物中所述病毒样颗粒的终浓度为1-5mg蛋白质/ml,优选大约2.5mg蛋白质/ml,其中优选地所述浓度通过Bradford蛋白质分析测定,并且进一步优选地所述病毒样颗粒溶解在所述第二缓冲液中。在一个非常优选的实施方案中,通过能够保留所述病毒样颗粒的膜进行所述浓缩,其中优选地所述膜的分子量截止值为100-1000kD,优选大约300kD,并且进一步优选地以低于100l/(h*m2)、优选地大约30l/(h*m2)的通过所述膜的渗透流速进行所述浓缩。浓缩步骤中的低流速阻止了产物的沉淀。
在一个进一步优选的实施方案中,所述方法进一步包括无菌过滤所述病毒样颗粒的步骤,其中优选地所述病毒样颗粒包含在所述第二缓冲液中,其中进一步优选地所述无菌过滤通过0.1-0.45μm、优选大约0.22μm的膜过滤器进行。
在一个进一步优选的实施方案中,本发明的生产组合物的方法具有蛋白质收率,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中所述蛋白质收率为至少50%,优选至少60%,更优选至少70%,再更优选至少75%,最优选至少80%。
在一个进一步优选的实施方案中,本发明的生产组合物的方法具有寡核苷酸收率,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中所述寡核苷酸收率为至少50%,优选至少60%,更优选至少70%,再更优选至少75%,最优选至少80%。
在一个进一步优选的实施方案中,包含所述病毒样颗粒的所述组合物具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%、再更优选至少98%、最优选至少99%的纯度。
在一个进一步优选的实施方案中,本发明的生产组合物的方法具有寡核苷酸收率,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中所述寡核苷酸收率为至少50%,优选至少60%,更优选至少70%,再更优选至少75%,最优选至少80%。
在一个进一步优选的实施方案中,本发明的生产组合物的方法具有蛋白质收率和寡核苷酸收率,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中所述蛋白质收率为至少50%,优选至少60%,更优选至少70%,再更优选至少75%,最优选至少80%。
在一个进一步优选的实施方案中,包含所述病毒样颗粒的所述组合物中每100μg外壳蛋白包含15-30μg,优选20-25μg,最优选大约20μg所述寡核苷酸,其中优选地所述病毒样颗粒是噬菌体Qβ的病毒样颗粒,并且进一步优选地所述寡核苷酸是G10(SEQ IDNO:8),其中再进一步优选地包含所述病毒样颗粒的所述组合物具有至少98%、优选至少99%的纯度,其中再进一步优选地,所述外壳蛋白的定量通过Bradford蛋白质分析进行,并且再进一步优选地,所述寡核苷酸的定量基本上、优选地完全如实施例9所述进行。
本发明进一步涉及通过本发明的任一种方法可以获得的核苷酸组合物在生产组合物的方法中的应用,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中优选地所述方法包括以下步骤:(a)提供所述RNA噬菌体的外壳蛋白;(b)提供所述核苷酸组合物;(c)产生混合物,其中所述混合物包含:(i)所述外壳蛋白;(ii)能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂;(iii)所述寡核苷酸;(d)从所述混合物中除去所述试剂;和(e)让所述外壳蛋白自装配为病毒样颗粒;其中优选地所述核苷酸组合物中包含的所述寡核苷酸具有50-110%的相对峰开始时间,其中进一步优选地所述RNA噬菌体是Qβ,再进一步优选地所述寡核苷酸是G10(SEQ ID NO:8)。
本发明进一步涉及具有50-110%的相对峰开始时间的寡核苷酸在生产组合物的方法中的应用,该组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中优选地所述方法包括以下步骤:(a)提供所述RNA噬菌体的外壳蛋白;(b)提供所述寡核苷酸;(c)产生混合物,其中所述混合物包含:(i)所述外壳蛋白;(ii)能够阻止所述外壳蛋白自装配的试剂;(iii)所述寡核苷酸;(d)从所述混合物中除去所述试剂;和(e)让所述外壳蛋白自装配为病毒样颗粒;其中优选地所述RNA噬菌体是Qβ,并且进一步优选地所述寡核苷酸是G10(SEQ ID NO:8)。
本发明进一步涉及通过本发明的任一种方法可以获得的组合物,所述组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中优选地所述RNA噬菌体是Qβ,并且进一步优选地所述寡核苷酸是G10(SEQ ID NO:8),再进一步优选地所述组合物的纯度为至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,再更优选至少98%,最优选至少99%,并且再进一步优选地,包含所述病毒样颗粒的所述组合物中每100μg外壳蛋白包含15-30μg、优选20-25μg、最优选大约20μg的所述寡核苷酸。
本发明进一步涉及通过本发明的任一种方法可以获得的组合物,所述组合物包含(i)病毒样颗粒,其中所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒,和(ii)寡核苷酸,其中所述寡核苷酸被包装到所述病毒样颗粒内,其中优选地所述RNA噬菌体是Qβ,并且进一步优选地所述寡核苷酸是G10(SEQ ID NO:8),其中更进一步优选地所述组合物的纯度为至少80%,优选至少90%,更优选至少95%,再更优选至少98%,最优选至少99%,其中所述寡核苷酸不被DNAse水解。
实施例
实施例1
寡核苷酸G10(SEQ ID NO:8)的解聚和聚集
G10的定量:根据用340nm处的吸收校正的260nm处的紫外吸收对G10进行定量,其中在1cm光程长度时,1A260-340对应于27.8μg/ml的浓度。
解聚(10.0ml规模,260μM G10,25mM NaOH,50℃,70min):称重45.91mg G10加入15ml试管中。将粉末溶解在11.0ml纯化水中(c=325.3μM;通过光谱法测量)。将8.0ml寡核苷酸溶液与250μl1MNaOH和1.75ml纯化水在15ml试管中混合(260μM G10,25mMNaOH)。混合物在50℃水浴中解聚70分钟。在冰上冷却该溶液后,用0.5M HCl调节pH至pH5.31;加入540μl 0.5M HCl和5μl 1MNaOH。
聚集(10.0ml规模,175μM G10,250mM Na + ,85℃,9-24min):将7.1ml解聚的G10溶液、2.13ml纯化水和770μl 3M NaCl在15ml试管中混合(175μM寡核苷酸,250mM Na+)。混合物在85℃水浴中温育9分钟。该溶液在冰/水浴中冷却,并贮存在冰上直到使用。聚集的寡核苷酸溶液应当在制备后3小时内使用。
实施例2
寡核苷酸G4-4的解聚和聚集
解聚:制备260μM寡核苷酸G4-4(SEQ ID NO:2)和25mMNaOH在纯化水中的溶液。将溶液加热到50℃保持70分钟,然后在冰上冷却,用0.5M HCl调节溶液的pH至pH5-8。
聚集:包含解聚的G4-4的溶液用纯化水和3M NaCl稀释至终浓度为230μM G4-4和250mM Na+。采用6.8℃/min的加热升温速度将混合物加热到80℃数分钟(2-70min)。温育后,采用6.8℃/min的降温速度将该混合物冷却至0-2℃。
通过大小排阻HPLC分析产物(参见实施例4)显示获得聚集的寡核苷酸。(相对峰开始时间:88%)。
实施例3
寡核苷酸的解聚和聚集
解聚:分别制备260μM寡核苷酸G5-5(SEQ ID NO:3)、G6-6(SEQ ID NO:4)、G7-7(SEQ ID NO:5)、G8-8(SEQ ID NO:6)、G9-9(SEQ ID NO:7)和G11(SEQ ID NO:9)和25mM NaOH在纯化水中的溶液。将溶液加热到50℃70min,然后在冰上冷却,使用0.5M HCl将溶液的pH调节至pH5-8。
聚集:包含解聚的寡核苷酸的溶液用纯化水和3M NaCl稀释至终浓度为230μM寡核苷酸和250mM Na+。采用6.8℃/min的加热升温速度将混合物加热到80℃数分钟(2-70min)。温育后,采用6.8℃/min的降温速度将该混合物冷却至0-2℃。
通过大小排阻HPLC分析聚集过程的产物(参见实施例4)。
实施例4
通过大小排阻HPLC分析寡核苷酸G10的聚集状态
G10的聚集状态通过分析型大小排阻HPLC进行分析,使用下列条件:
柱: TSKgel 5000 PWXL 7.8mm* 30.0cm(Lot:5PWX06GNMH3304,Art:08023,Tosoh Bioscience)
洗脱液: PBS(20mM磷酸钠缓冲液中的150mM NaCl,pH7.2)
注入体积: 40.0μl(优选地包含大约20μM-大约500μM的浓度)
流速: 0.8ml/min
梯度: 等度
运行时间: 20min
波长: 215、260和280nm,在260nm评价数据
柱加热器温度: 25℃
自动进样器温度:8℃
使用噬菌体Qβ的衣壳作为标准物。
G10相对于Qβ衣壳的峰开始时间X%(相对峰开始时间Qβ)如下计算:X%=寡核苷酸的峰开始时间[min]除以Qβ衣壳标准物的保留时间[min]x100%,其中寡核苷酸的峰开始时间确定为可以检测到寡核苷酸的洗脱时的时间,并且Qβ衣壳标准物的保留时间确定为所述标准物出现最大峰值的时间。寡核苷酸G10和作为标准物的噬菌体Qβ衣壳的洗脱曲线的一个实例如图1所示。基于图1所示的层析图,聚集的寡核苷酸计算得到88%的相对峰开始时间。
实施例5
未处理的、解聚的和聚集的寡核苷酸G10的相对峰开始时间的比较
确定基本如实施例1所述制备的解聚的和聚集的G10的相对峰开始时间,并且与从供应商处获得的未处理的G10的相对峰开始时间进行比较。解聚的G10显示138%的相对峰开始时间(136.9-140.3%;n=5)。未经历实施例1所述的解聚/聚集处理的G10制品显示与解聚的G10相同范围内的相对峰开始时间。在解聚和聚集后,发现G10的峰开始时间为88%。
实施例6
解聚步骤的影响
未处理的寡核苷酸G10和如实施例1所述解聚的寡核苷酸G10基本如实施例1所述进行聚集处理,其中选择如下的聚集条件:175μM G10,250mM Na+(通过加入3M NaCl),于85℃温育16分钟,然后在冰上冷却。两种制品都使用Qβ衣壳和未处理的G10作为标准物通过大小排阻HPLC进行分析(参见实施例4)。得到的HPLC层析图如图2所示。
未处理的G10含有聚集的G10(参见图2A和2B,盒1)。在聚集之前没有解聚的聚集的G10显示与Qβ衣壳相当或更高的表观分子量(图2A,盒2)。相对峰开始时间约为75%。在聚集之前解聚的聚集的G10显示比Qβ衣壳更低的表观分子量(图2B,盒2)。相对峰开始时间约为88%。
实施例7
通过圆二色性分析寡核苷酸G10的聚集状态
利用JASCO J-715分光光度计在200nm和300nm之间记录未处理的、解聚的和聚集的G10(基本如实施例1所述制备)以及包装有G10的Qβ衣壳(如实施例10所述获得的QbG10)的CD谱(图3)。聚集的G10的光谱的特征是强阳性带(高椭圆形),在262nm处具有最大值,在240nm处为波谷。这些信号据报道对应于具有平行方向的链的DNA四链体的典型光谱(Lu等人,Biochemistry 31,p.2455,1992)。重要的是,在聚集的G10的存在下重装配的VLP谱中,CD谱在250nm-300nm区域中的形状没有变化。因此,G10似乎在包装时没有经历构象变化。在262nm处振幅的轻微增加可能反映了聚集的G10选择性包装到Qβ衣壳内,与仍然含有一部分非聚集分子的聚集的G10相比,在包装后产生较高比例的四链体。相反,未处理的G10的光谱的特征在于低椭圆性,而没有确定的表示缺乏确定的二级和三级结构元件的最大值。对于解聚的G10也观察到低CD信号,尽管在295nm处出现最大值和在262nm处出现最小值可能反映了某些反平行四链构象异构体的存在(P.Balagurumoorthy等人,Nucleic AcidsResearch 20,p.4061,1992)。
实施例8
通过解装配/重装配包装Qβ VLP和G10
Qβ VLP的解装配:PBS(20mM磷酸盐,150mM NaCl,pH7.5)中的45mg Qβ VLP(2.5mg/ml,通过Bradford分析测定)用10mM DTT在室温和搅拌条件下还原15分钟。然后,加入氯化镁至0.7M的终浓度,并且在室温和搅拌条件下继续温育15分钟,导致包封的宿主细胞RNA沉淀和伴随的VLP分解。将溶液在4℃下以4000rpm离心10分钟(Eppendorf 5810 R,固定角转头A-4-62,在下面的所有步骤中使用),以从溶液中除去沉淀的RNA。含有释放的二聚体Qβ外壳蛋白的上清液用于层析纯化步骤。
通过阳离子交换层析法和大小排阻层析法纯化Qβ外壳蛋白:将含有二聚体外壳蛋白、宿主细胞蛋白质和残余宿主细胞RNA的解装配反应的上清液加到SP-Sepharose FF柱(xk16/20,6ml,AmershamBioscience)上。该柱用pH7的20mM磷酸钠缓冲液平衡,用水1:15稀释样品以调节电导率低于10mS/cm,以实现外壳蛋白与柱的适当的结合。结合的外壳蛋白的洗脱通过直到20mM磷酸钠/500mM氯化钠的分步梯度完成,并且以大约25ml的级分体积收集蛋白质。在室温下进行层析,在所有步骤中流速均为5ml/min,并于260nm和280nm监测吸光度。第二步,将分离的Qβ外壳蛋白(从阳离子交换柱上洗脱的级分)加到用pH7.2的20mM磷酸钠/250mM氯化钠平衡的Sephacryl S-100HR柱(xk26/60,320ml,Amersham Bioscience)上。在室温下以2.5ml/min的流速进行层析,并于260nm和280nm监测吸光度。收集5ml的级分。
通过分析型大小排阻层析法表征纯化的Qβ外壳蛋白:纯化的Qβ外壳蛋白的样品通过分析型大小排阻层析法进行分析(图1C),并且比较-i)完整的QβVLP(图4A),它从大肠杆菌裂解液中纯化并且用作纯化步骤的原材料,和ii)解装配反应的上清液(图4B)。图4C中不存在任何RNA样峰(A280/A260的典型比值=0.5)而存在唯一的蛋白质样峰(A280/A260的典型比值=1.7)指示RNA分子与外壳蛋白的有效分离。
通过渗滤装配QβG10:纯化的外壳蛋白(在20mM磷酸钠pH7.2,250mM NaCl中)与水和尿素、NaCl、DTT和聚集的G10寡核苷酸(基本如实施例1所述制备)的储备液混合。混合物的体积为50ml,成分的终浓度为1mg/ml外壳蛋白、1.0M尿素、250mM NaCl、2.5mM DTT和0.24mg/ml G10。然后使用30kDa截止值的柱(Pellicon XL,Millipore)和10ml/min的横向流速和2.5ml/min的渗透流速,在室温下相对于300ml 20mM磷酸钠250mM NaCl pH7.2渗滤该溶液。加入H2O2至7mM的终浓度,并在室温下温育该溶液1小时,以诱导二硫键的形成。然后使用300kDa截止值的柱(Pellicon XL,Millipore)和10ml/min的横向流速和2.5ml/min的渗透流速,将该溶液相对于500ml20mM磷酸钠150mM NaCl pH7.2渗滤,以从装配的QβG10产物中除去过量的H2O2和未包装的G10寡核苷酸。
实施例9
QβG10包装产物的分析和包装方法收率的测定
通过分析型大小排阻层析法表征包装的QβG10 VLP:包装的QβG10 VLP的样品通过分析型大小排阻层析法进行分析(图5)并且与从大肠杆菌裂解液中纯化的完整Qβ VLP进行比较。所述分析型大小排阻层析法使用如下的参数进行:
柱: Bio-Sil SEC 250,7.8x300mm,目录号125-0062
洗脱液: 50mM磷酸钠pH6.5,150mM NaCl
梯度: 等度
柱温度: 25℃
自动进样器温度: 8℃
流速: 1.0ml/min
样品浓度: 1.0mg/ml蛋白质
注入体积: 40μl
评价波长: 280nm
带宽: 4nm
运行时间: 20min
样品制备:
用洗脱液将样品稀释为1.0mg/ml,立即振荡样品并于4℃以16000g离心10分钟。
与代表天然QβVLP的峰以相同保留时间迁移的峰证实了产物中存在正确装配的VLP。观察到的QβG10 VLP的峰(图5D)是由VLP的核酸成分主要贡献的,因为核酸在260nm处的吸光系数比外壳蛋白的吸光系数高100倍以上。发现纯化的QβG10 VLP的A260/A280比值为1.70(1.65-1.76;n=5),这是G10的特征(A260/A280=1.74),其中发现Qβ VLP的A260/A280比值为1.87(1.85-1.90;n=10),这是RNA的特征。
通过SDS-PAGE分析表征包装的QβG10 VLP:包装的Qβ G10样品通过非还原性SDS-PAGE进行分析(图6),并且与从大肠杆菌裂解物中纯化的完整QβVLP进行比较。外壳蛋白的二硫键连接的五聚体和六聚体形式的条带的形成证实了产物中存在正确装配的VLP,其类似于完整Qβ VLP,表明体外装配的QβG10 VLP中外壳蛋白单元具有正确的结构排列。
包装的寡核苷酸G10的定量:为了还原二硫键,将QβG10 VLP样品(0.25mg/ml,在PBS中)用0.1mM TCEP(三(2-氯乙基)磷酸酯)处理(室温15分钟)。向还原的样品中加入NaCl(1M终浓度),混合物在60℃下温育15分钟,以便沉淀蛋白质成分。离心后,将得到的上清液于95℃温育5分钟,在冰上冷却1分钟,然后测量A260值。上清液中寡核苷酸G10的浓度按照下式计算:
c(G10)(mg/ml)=A260 x 1.12 x 9600/344580,其中:
1.12=样品中盐含量的校正系数
9600=寡核苷酸G10的分子量
344580=寡核苷酸G10的比摩尔吸光系数。
包装的寡核苷酸G10的量一般为0.2mg/mg Qβ外壳蛋白。
QβG10 VLP的G10含量和包装反应的收率计算:如实施例8所述通过VLP的装配/重装配将聚集的G10包装到Qβ VLP内。加入953mg G10寡核苷酸用于与4000mg纯化的Qβ二聚体重装配。该反应产生每100μg蛋白质包含20μg G10寡核苷酸的QβG10(蛋白质含量通过Bradford分析或HPLC测定)。包装反应的G10收率为63%,蛋白质收率为75%。
实施例10
通过渗滤装配QβG10和收率的测定
纯化的Qβ外壳蛋白基本如实施例8所述获得。20mM磷酸钠pH7.2,250mM NaCl中的外壳蛋白与水和尿素、NaCl、DTT和聚集的G10寡核苷酸(基本如实施例1所述制备;解聚的G10的相对峰开始时间为135%,聚集的G10的相对峰开始时间为88%)的储备液混合。混合物的体积为1.6L,成分的终浓度为2.5mg/ml外壳蛋白、1.0M尿素、250mM NaCl、2.5mM DTT和0.6mg/ml G10。然后使用30kDa截止值的柱(Pellicon Mini2,0.1m2过滤面积,Millipore)和384L/(h*m2)的横向流速和96L/(h*m2)的渗透流速,在室温下相对于9.6L20mM磷酸钠250mM NaCl pH7.2渗滤该溶液。加入H2O2至2mM的终浓度,并在室温下温育该溶液1小时,以诱导二硫键的形成。然后使用300kDa截止值的柱(Pellicon Mini 2,0.1m2过滤面积,Millipore)和300l/(h*m2)的横向流速和100l/(h*m2)的渗透流速,将溶液相对于16L20mM磷酸钠150mM NaCl pH7.2渗滤,以从装配的QβG10产物中除去过量的H2O2和未包装的G10寡核苷酸。通过切向流过滤将产物浓缩为2.5mg/ml并且通过0.22μm滤器过滤。主要的过程步骤总结在表1中。
表1:QβG10的装配和纯化的过程步骤总结
过程步骤 | 参数 | 过程步骤输出 |
G10的解聚 | G10浓度:260μMNaOH浓度:25mM温度:50℃加热时间:70分钟规模:1.1g G10,V=440ml(10ml等份) | G10的相对峰开始时间:138% |
解聚的G10溶液的中和 | 使用的酸:0.5M H3PO4 | pH7.2 |
G10溶解的再聚集 | G10浓度:175μMNa+浓度:250mM温度:85℃加热时间:10分钟规模:1.1g G10,V=654ml(10ml等份) | G10的相对峰开始时间:88% |
原材料的融化 | 温度:22℃ | Qβ二聚体溶液 |
重装配混合物的制备 | 二聚体浓度:2.5mg/ml尿素浓度:1MDTT浓度:2.5mMG10浓度:62.5μM混合时间:60±10分钟温度:22±3℃规模:4g Qβ二聚体;V=1.61 | 用于渗滤1的溶液 |
连续渗滤1 | 膜:30kDa MWCO面积:0.1m2渗滤体积:6(收集的9.6L渗透液)缓冲液:NaP250pH7.2目标持续时间:60分钟温度:22℃通量:96l/(h*m2)V=1.61 | 由于除去了尿素和DTT,Qβ二聚体在G10核心材料周围形成VLP。 |
用过氧化氢氧化 | H2O2浓度:2mM温度:22℃反应时间:60±10分钟V=1.6l | 形成二硫键因而使VLP稳定化 |
连续渗滤2 | 膜:300kDa MWCO面积:0.1m2渗滤体积:10(16L)缓冲液:药学可接受的缓冲液温度:22±3℃通量:100l/(h*m2)V=1.6l | 除去残余的过氧化氢和残余的、未包装的G10 |
QbG10的浓缩 | 膜:300kDa MWCO面积:0.1m2温度:22±3℃ | 浓度=2.5mg/ml |
| 渗透流速:<100l/(h*m2)V=1.2l | |
QbG10的过滤 | 0.22μm PES膜过滤器 | 生物负担减少 |
产物的纯度通过大小排阻层析法进行分析,发现为99.28%,即,如实施例4所述进行的层析中,QbG10峰占整个峰面积的99.28%。蛋白质收率和寡核苷酸收率如实施例8所述测定。整个过程中的蛋白质收率为75%。整个过程中的寡核苷酸收率为75%。
实施例11
G10的聚集状态对装配过程的影响
当在如实施例8所述的装配过程中使用相对峰开始时间为139%的G10时,只形成了极少量的GbG10,无法分离到VLP产物。
实施例12
AP205和GA355VLP与G10通过解装配/重装配的包装
解装配:缓冲液A(5mM NaPO4 pH6.8,100mM NaCl,2mMMgCl2)中的50-100mg AP205或GA355 VLP(通过Bradford分析测定)与分别为1mg/ml和5U/ml的RNAse A(Sigma)和Benzonase(Novagen)于30℃温育16小时。对于AP205V LP,在加入RNAse A和Benzonase之前,通过加入20mM DTT然后在37℃温育30分钟,进行内部二硫键的还原。在加入1M NaCl后,通过于70℃温育15分钟诱导病毒外壳蛋白的沉淀。沉淀的外壳蛋白通过于4℃以27,000g离心10分钟沉积。弃去含有RNAse A、Benzonase和降解的核酸的上清液。将沉淀物重悬浮在缓冲液B(20mM NaPO4 pH7.2,6M尿素)中并且于室温温育10分钟。
通过阳离子交换层析纯化外壳蛋白:通过于4℃以27,000g离心10分钟澄清溶液。弃去极少量的沉淀物,将含有解装配的外壳蛋白的上清液加到用缓冲液B(20mM NaPO4 pH7.2,6M尿素)平衡的SPSepharose TM FF柱(16/20,Amersham Biosciences)上。弃去流过液。用缓冲液B(15CV)充分冲洗后,用从缓冲液B到缓冲液C(20mMNaPO4 pH7.2,1M尿素)的线性梯度调整柱子,梯度长度为37.5CV。在加样、冲洗和洗脱过程中,监测254nm和280nm的吸光度。外壳蛋白作为一个级分被缓冲液D(20mM NaPO4 pH6.5,1M尿素,300mM NaCl)洗脱下来,通过LDS-PAGE和随后的考马斯染色分析。将洗脱下来的蛋白质级分作为“解装配的外壳蛋白”保存在4℃。蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
重装配:纯化的AP205或GA355外壳蛋白以相对于G10寡核苷酸5倍过量的量(w/w)使用。外壳蛋白与G10寡核苷酸在含有1M尿素和2.5mM DTT的重装配缓冲液中混合,并在室温下温育1小时。温育后,重装配混合物相对于5升PBS透析24小时。得到的悬浮液在4℃下以27,000g离心10分钟。弃去极少量的沉淀物。上清液含有重装配的和包装的VLP。蛋白质浓度通过Bradford分析测定,重装配的和包装的VLP用离心过滤装置(Amicon Ultra15,10K MWCO)浓缩。
重装配的和包装的VLP的纯化:将最多25mg总蛋白质加样到用PBS平衡的SepharoseTM CL-4B(26/60,Amersham Biosciences)上。在室温下用平衡缓冲液以1.25ml/min的流速进行大小排阻层析。在洗脱过程中监测254nm和260nm处的吸光度。分离到两个峰。高分子量主峰位于低表观分子量小峰之前。主峰显示的表观分子量与如SE-HPLC显示的纯化的VLP一致。包装有G10寡核苷酸的AP205或GA355 VLP的分析基本如WO 03/024481的实施例16(p.131ff)所述进行。
实施例13
FR VLP和G10通过解装配/重装配的包装
解装配:缓冲液A(5mM NaPO4pH6.8,100mM NaCl,2mMMgCl2)中的50-100mg FR VLP(通过Bradford分析测定)与分别为1mg/ml和5U/ml的RNAse A(Sigma)和Benzonase(Novagen)于30℃温育16小时。加入1M NaCl后,通过于70℃温育15分钟诱导FR外壳蛋白的沉淀。沉淀的外壳蛋白通过于4℃以27,000g离心10分钟沉积。弃去含有RNAse A、Benzonase和降解的核酸的上清液。将沉淀物重悬浮在缓冲液B(20mM NaPO4 pH7.2,6M尿素)中并且于室温温育10分钟。
通过阳离子交换层析纯化FR外壳蛋白:通过于4℃以27,000g离心10分钟澄清溶液。弃去极少量的沉淀物,将含有解装配的外壳蛋白的上清液加到用缓冲液B平衡的SP Sepharose TM FF柱(16/20,Amersham Biosciences)上。弃去流过液。用缓冲液B(15CV)充分冲洗后,用从缓冲液B到缓冲液C(20mM NaPO4 pH7.2,1M尿素)的线性梯度调整柱子,梯度长度为37.5CV。在加样、冲洗和洗脱过程中,监测254nm和280nm的吸光度。FR外壳蛋白作为一个级分被缓冲液D(20mM NaPO4 pH6.5,1M尿素,300mM NaCl)洗脱下来,通过LDS-PAGE和随后的考马斯染色进行分析。将洗脱下来的蛋白质级分作为“解装配的外壳蛋白”保存在4℃。蛋白质浓度通过Bradford分析测定。
重装配:纯化的FR外壳蛋白以相对于G10寡核苷酸5倍过量的量(w/w)使用。FR外壳蛋白与G10寡核苷酸在含有1M尿素和2.5mMDTT的重装配缓冲液中混合,并在室温下温育1小时。温育后,重装配混合物相对于5升PBS透析24小时。将得到的悬浮液在4℃下以27,000g离心10分钟。弃去极少量的沉淀物。上清液含有重装配的和包装的FR VLP。蛋白质浓度通过Bradford分析测定,重装配的和包装的FR VLP用离心过滤装置(Amicon Ultra 15,10K MWCO)浓缩。
重装配的和包装的FR VLP的纯化:将最多25mg总蛋白质加样到用PBS平衡的SepharoseTM CL-4B(26/60,Amersham Biosciences)上。在室温下用平衡缓冲液以1.25ml/min的流速进行大小排阻层析。在洗脱过程中监测254nm和260nm处的吸光度。分离到两个峰。高分子量主峰位于低表观分子量小峰之前。主峰显示的表观分子量与如SE-HPLC显示的纯化的FR VLP一致。包装有G10寡核苷酸的FR VLP的分析基本如WO 03/024481的实施例16(p.131ff)所述进行。
实施例14
通过渗滤装配Qβ G8和收率的测定
纯化的Qβ外壳蛋白基本如实施例8所述获得。20mM磷酸钠pH7.2,250mM NaCl中的外壳蛋白与水和尿素、NaCl、DTT和聚集的G8寡核苷酸(基本如实施例3所述制备;解聚的G8的相对峰开始时间为113%,聚集的G8的相对峰开始时间为88%)的储备液混合。混合物的体积为1.6L,成分的终浓度为1mg/ml外壳蛋白、1.0M尿素、250mM NaCl、2.5mM DTT和0.24mg/ml G8。然后使用30kDa截止值的柱(Pellicon Mini2,0.1m2过滤面积,Millipore)和384L/(h*m2)的横向流速和96L/(h*m2)的渗透流速,在室温下相对于9.6L 20mM磷酸钠250mM NaCl pH7.2渗滤该溶液。加入H2O2至2mM的终浓度,并在室温下温育该溶液1小时,以诱导二硫键的形成。然后使用300kDa截止值的柱(Pellicon Mini 2,0.1m2过滤面积,Millipore)和300l/(h*m2)的横向流速和100l/(h*m2)的渗透流速,将溶液相对于16L20mM磷酸钠150mM NaCl pH7.2渗滤,以便从装配的QβG8产物中除去过量的H2O2和未包装的G8寡核苷酸。通过切向流过滤将产物浓缩为2.5mg/ml并且通过0.22μm滤器过滤。