BRPI0713651A2

BRPI0713651A2 - processos para acondicionamento de oligonucleotìdeos em partìculas do tipo vìrus de bacteriófagos de rna

Info

Publication number: BRPI0713651A2
Application number: BRPI0713651-0A
Authority: BR
Inventors: Matthias Kinzler; Karl Proba
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 2006-06-12
Filing date: 2007-06-12
Publication date: 2012-10-23
Also published as: DK2032592T3; JP2014097057A; KR101552227B1; BRPI0713651B1; MX2008015529A; CA2655108C; SG172696A1; ES2738986T3; AU2007260236B2; ZA200810109B; RU2476595C2; SI2032592T1; CA2655108A1; US20100273237A1; EP2032592B1; CN101466720A; KR20090016634A; PL2032592T3; WO2007144150A1; JP5437797B2

Abstract

PROCESSOS PARA ACINDICIONAMENTO DE OLIGONUCLEOTìDEOS EM PARTìCULAS DO TIPO VìRUS DE BACTERIóFAGOS DE RNA. A presente invenção refere-se a processos a produção de composições compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus. A invenção adicionalmente provê processos para a produção de composições de nucleotídeo comrpeendendo oligonucleotídeos adequados para serem usados nos processos mencionados antes. A invenção adicionalmente provê composições de nucleotídeo obteníveis pelos processos da invenção e usos dos mesmos. A invenção adicionalmente provê composições compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, em que as ditas composições são obteníveis pleos processos da invenção e em que as ditas composições de preferência compreende uma pureza de pelo menos 98%, mais de preferência de pleo menos 99%.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOS PARA ACONDICIONAMENTO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS EM PARTÍCU- LAS DO TIPO VÍRUS DE BACTERIÓFAGOS DE RNA".

Campo da Invenção

A presente invenção prove processos para a produção de com- posições compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partí- cula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus. A invenção adicionalmente provê processos para a produção de composições de nucleotídeo compreendendo oligonucleotí- deos adequados para serem usados nos processos mencionados antes. A invenção adicionalmente provê composições de nucleotídeo obteníveis pelos processos da invenção e seus usos. A invenção adicional provê composi- ções compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, em que as ditas composições são obteníveis pelos processos da invenção e em que as ditas composições de preferência com- preendem uma pureza de pelo menos 98%, mais de preferência de pelo menos 99%.

Técnica Relacionada

Partículas do tipo vírus de bacteriófagos de RNA acondicionadas com oligonucleotídeos são potentes estimuladores do sistema imune (W02003/024481A2) e são amplamente usadas nos tratamentos de vacina- ção modernos. Processos para a produção de composições compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus foram descritas, por exemplo, no WO 2003/024481A2, WO .2004/000351A1, WO 2004/084940A1 e WO 2004/007538A2. Processos que são baseados na desmontagem da partícula do tipo vírus recombinante, a purificação da proteína de revestimento e o reagrupamento da dita proteína de revestimento na presença de ácido nucléico são mais comumente usa- dos. Processos escaláveis e eficientes para a produção de partículas do tipo vírus recombinantes de bacteriófagos de RNA são descritos no WO 2005/117963A1. Processos para a produção em grande escala de endotoxi- na livre, partículas do tipo vírus intactas são descritos na WO 2007/039552A1. Processos para a preparação de proteína de revestimento a partir de partículas do tipo vírus recombinantemente produzidas ("desmon- tagem") são descritos, inter alia, no WO 2003/024481A2, e na seção de e- xemplos do presente pedido. Os processos para a montagem da proteína de revestimento na presença de ácido nucléico ("reagrupamento") descritos na técnica anterior não são otimizados com relação à eficácia, escabilidade e pureza do produto montado. Em particular, a técnica anterior não ensina que a eficácia do processo de "reagrupamento", pode ser dramaticamente aper- feiçoada pelo uso de oligonucleotídeo agregado compreendendo um certo tamanho de partícula (aqui caracterizado pelo tempo de começo de pico re- lativo, vide abaixo). Essa aplicação provê um processo de "reagrupamento" com eficácia dramaticamente aumentda que leva a um acondicionamento de produto de pureza muito alta. Tipicamente e de preferência o processo de "reagrupamento" descrito aqui compreende um rendimento de proteína e um rendimento de oligonucleotídeo de pelo menos cerca de 75% e resulta em um produto (composição compreendendo uma partícula do tipo vírus acon- dicionada com oligonucleotídeo) que tipicamente e de preferência é pelo menos 99% de pureza. Sumário da Invenção

A invenção refere-se a um processo para a produção de uma composição de nucleotídeo compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bac- teriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus. Durante o dito processo a dita partícula do tipo vírus é formada pela própria montagem de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA na presença de um oligonucleotí- deo. Surpreendentemente verificou-se que a eficácia de processo pode ser significativamente aperfeiçoada quando a automontagem da proteína de re- vestimento for realizada na presença de oligonucleotídeo agregado. Em ge- ral, oligonucleotídeos compreendendo pelo menos uma extensão de poly G são capazes de agregação. O estado de agregação de um oligonucleotídeo pode ser caracterizado pelo tempo de início de pico relativo em HPLC de exclusão de tamanho usando-se o capsídeo do dito bacteriófago de RNA como padrão. Oligonucleotídeo compreendendo um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, de preferência de 80 a 95%, demonstrou ser ótimo. Isso corresponde a agregados de oligonucleotídeo compreendendo um peso molecular aparente que está na faixa do um peso molecular aparente do capsídeo do dito bacteriófago de RNA ou levemente abaixo. Verificou-se que oligonucleotídeo compreendendo o tempo de início de pico relativo desejado pode ser obtido por submissão do dito oligonucleotídeo a um processo de agregação.

Assim, um primeiro aspecto da invenção é um processo para a produção de uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonu- cleotídeo, em que de preferência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, o dito processo compreen- dendo as etapas de: (a) provisão de um oligonucleotídeo em uma solução II, em que o dito oligonucleotídeo é pelo menos uma extensão de poly G; e em que a dita solução Il compreende um pH de 5 a 8; e em que a dita solução Il compreende um cátion, em que de preferência a concentração do dito cátion na dita solução Il é pelo menos 20 mM, em que o dito cátion é de preferência selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+; (b) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura Ill em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C; e (c) incubação do dito oligonucleotídeo na solução Il a temperatura III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; e (d) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C; em que as ditas etapas são de preferência realizadas na dada ordem.

A automontagem da dita proteína de revestimento e mais efici- ente quando a preparação de oligonucleotídeo compreender agregados compreendendo o ótimo tamanho de partícula e uma estreita distribuição de tamanho. Além disso, surpreendentemente verificou-se que o estado de a- gregação do oligonucleotídeo pode ser controlado mais eficazmente e que preparações de oligonucleotídeo com uma distribuição de tamanho mais es- treita são obtidas, quando o oligonucleotídeo é submetido a uma etapa de desagregação antes da etapa de agregação. O dito processo pode compre- ender qualquer uma das características e concretizações descritas aqui em qualquer combinação. Assim, um segundo aspecto da invenção é um processo para a

produção de uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonu- cleotídeo, em que de preferência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, o dito processo compreen- dendo as etapas de: (a) provisão de um oligonucleotídeo na solução I, em que o dito oligonucleotídeo pelo menos uma extensão de poly G; e em que a dita solução I compreende um pH alcalino; (b) desagregação do dito oligo- nucleotídeo, em que a dita desagregação compreende as etapas de: (i) ajus- te da temperatura da solução I para a temperatura I, em que a dita tempera- tura I é de 4 a 70°C; (ii) incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I, em que a dita incubação é realizada até que o dito oli- gonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo acima de 110%; e (iii) ajuste da temperatura da dita solução I para a temperatura II, em que a dita temperatura Il é de 0 a 70°C; (c) ajuste do pH da dita solução I para pH de 5 a 8; e (d) agregação do dito oligonucleotídeo, em que a dita agregação compreende as etapas de: (i) provisão do dito oligonucleotídeo na solução II, em que a dita solução Il compreende pH de 5 a 8 e um cátion, em que de preferência a concentração do dito cátion na dita solução Il é pelo menos 20 mM, e em que de preferência o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+; (ii) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura III, em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C; (iii) incubação do dito oligonucleotídeo na solução Il a temperatura III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compre- enda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; e (iv) ajuste da tem- peratura da solução Il para a temperatura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C; em que as ditas etapas são de preferência realizadas na dada ordem. O dito processo pode compreender qualquer uma das ca- racterísticas e concretizações descritas aqui em qualquer combinação.

Um terceiro aspecto da invenção é uma composição de nucleo- tídeo compreendendo um oligonucleotídeo, em que a dita composição de nucleotídeo é obtenível por qualquer um dos processos descritos acima, em que de preferência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%. A dita composição de nucleotídeo pode com- preender qualquer uma das características e concretizações descritas aqui em qualquer combinação.

Um quarto aspecto da invenção é um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicio- nado na dita partícula do tipo vírus, o dito processo compreendendo as eta- pas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão de uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonucleotídeo, em que a dita composição de nucleotídeo é uma composi- ção de nucleotídeo obtenível por qualquer um dos processos do primeiro e do segundo aspectos da invenção; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partí- cula do tipo vírus. O dito processo pode compreender qualquer uma das ca- racterísticas e concretizações descritas aqui em qualquer combinação.

Um quinto aspecto da invenção é um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicio- nado na dita partícula do tipo vírus, o dito processo compreendendo as eta- pas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão de um oligonucleotídeo, (i) em que o dito oligonucleotídeo é pelo menos uma extensão de poly G; e (ii) em que o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita prote- ína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus. O dito processo pode compre- ender qualquer uma das características e concretizações descritas aqui em qualquer combinação.

Um sexto aspecto da invenção é um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicio- nado na dita partícula do tipo vírus, o dito processo compreendendo as eta- pas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão de um oligonucleotídeo, em que de preferência o dito oli- gonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, a dita provisão de compreendendo as etapas de: (i) provisão de um oligonucleotídeo na solução II, em que a dita solução Il compreende um pH de 5 a 8 e um cátion, em que de preferência a concentração do dito cátion na dita solução Il é pelo menos 20 mM, e em que de preferência o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4"1", Li+, Ca2+, e Mg2+; (ii) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura Ill em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C; e (iii) incubação do dito oligonucleotídeo na solução Il a temperatura III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; e (iv) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C; em que as etapas de (i) a (iv) são de preferência realizadas na dada ordem; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimen- to; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus. O dito processo pode compreender qualquer uma das características e concretizações descritas aqui em qualquer combi- nação.

Um sétimo aspecto da invenção é um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA1 e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicio- nado na dita partícula do tipo vírus, o dito processo compreendendo as eta- pas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão de um oligonucleotídeo, em que de preferência o dito oli- gonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a .110%, a dita provisão compreendendo as etapas de: (i) provisão de um oli- gonucleotídeo na solução I, em que o dito oligonucleotídeo é pelo menos uma extensão de poly G; e em que a dita solução I compreende um pH alca- lino; (ii) desagregação do dito oligonucleotídeo, em que a dita desagregação compreende as etapas de: (1) ajuste da temperatura da solução I para a temperatura I, em que a dita temperatura I é de 4 a 70°C; (2) incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo acima de 110%; e (3) ajuste da temperatura da dita solução I para a temperatura II, em que a dita temperatura Il é de 0 a 70°C; (iii) ajuste do pH da dita solução I para pH de 5 a 8; e (iv) agregação do dito oligonucleotídeo, em que a dita agregação compreende as etapas de: (1) provisão do dito oligonucleotídeo na solução II, em que a dita solução Il compreende pH de 5 a 8 e um cátion, em que de preferência a concentração do dito cátion na dita solução Il é pelo menos 20 mM, e em que de preferên- cia o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+; (2) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura III, em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C; (3) incubação do dito oligonu- cleotídeo na solução Il a temperatura III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico rela- tivo de 50 a 110%; e (4) ajuste da temperatura da solução Il para a tempera- tura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C; em que as etapas de (i) a (iv) são de preferência realizadas na dada ordem; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de reves- timento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se au- tomonte em uma partícula do tipo vírus. O dito processo pode compreender qualquer uma das características e concretizações descritas aqui em qual- quer combinação.

Um oitavo aspecto da invenção é o uso de uma composição de nucleotídeo obtenível por qualquer um dos processos da invenção, em um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus. Um nono aspecto da invenção é a composição obtenível por

qualquer um dos processos da invenção, a dita composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus, em que de preferência o dito bacteriófago de RNA é Qbeta, e em que mais de preferência o dito oligonucleotídeo é G8-8 (SEQ ID NO: 6) ou G10 (SEQ ID NO: 8), de preferência G10 (SEQ ID NO: 8), e em que ainda mais de preferência a pureza da dita composição seja pelo menos pelo menos 98%, com mais preferência pelo menos 99%, e mais de preferência pelo menos 99,2%.

Breve Descrição dos Desenhos

figura 1: cromatograma de HPLC de exclusão de tamanho do padrão de capsídeo de Qbeta (topo) e G10 agregado (fundo). HPLC foi rea- lizada como descrita no exemplo 4. O tempo de retenção do padrão foi de .8,532 min, o tempo de início de pico de G10 agregado foi de 7,510 min. As- sim, o tempo de início de pico relativo do G10 agregado foi de 88% (7,510 min/8,532 min * 100).

figura 2: cromatograma de HPLC de exclusão de tamanho de G10 não-tratado, G10 agregado por oligonucleotídeo e padrão de capsídeo de Qbeta. HPLC foi realizada como descrita no exemplo 4 (A) G10 agregado que nao foi submetido a um tratamento de desagregação antes da agrega- ção mostrada um peso molecular aparente equivalente ou mais alto do que capsídeo de Qbeta (A, caixa 2). O tempo de início de pico relativo era cerca de 75%. (B) G10 agregado que antes da agregação foi submetido a um tra- tamento de desagregação como descrito no exemplo 1 e exibia um peso molecular aparente mais baixo do que capsídeo de Qbeta (B, caixa 2). O tempo de início de pico relativo era cerca de 88%.

figura 3: espectros de CD de oligonucleotídeo G10 não tratadao e agregado e VLP reagrupada acondicionado com G10. Espectros foram registrados usando-se concentrações de oligonucleotídeo de 22,5 μΜ e sub- seqüentemente foram normalizados. Para a normalização, elipticidades são calculadas de acordo com Theta = 100 χ sinal de CD [mdeg] / L [cm] χ c [mM],

figura 4: caracterização de proteína de revestimento de Qbeta purificada por cromatografia de exclusão de tamanho analítico. (A) amostra de VLP de Qbeta purificada. O pico observado (razão de A260/A280 = 2) é dominado pelo núcleo de RNA da VLP, uma vez que o coeficiente de absor- ção de RNA a 260 nm seja cerca de 100 vezes mais alto do que o coeficien- te de absorção da proteína de revestimento. (B) amostra do sobrenadante da reação de desmontagem. A proteína de revestimento liberada é indicada pela presença do pico de tipo proteína a cerca de 12 min. Além disso várias espécies de moléculas de RNA não precipitadas estão presentes na faixa de .6,8 a 11 min. (C) amostra de proteína de revestimento Qbeta purificada. A análise foi realizada em PBS na coluna TSK G5000PWxl (Tosoh Bioscien- ce).

figura 5: cromatografia de exclusão de tamanho analítico de (A) VLP de Qbeta nativa, (D) VLP de G10 de Qbeta e o acondicionamento de componentes (B) G10 de oligonucleotídeo e (C) proteína de revestimento de Qbeta. O pico observado para VLP de G10 de Qbeta(D) (razão A260/A280 = 1,74) é dominado pelo núcleo de G10 do VLP1 uma vez que o coeficiente de absorção de G10 a 260 nm seja cerca de 130 vezes mais alto do que o coe- ficiente de absorção da proteína de revestimento. A análise foi realizada em PBS na coluna TSK G5000PWxl (Tosoh Bioscience).

figura 6: Análise de SDS-PAGE de não-redução de VLP de Qbe- ta nativa e Qbeta G10 montado in vitro. A posição da proteína de revesti- mento pentâmeros e hexâmeros é indicada ((a) marcador de peso molecu- lar, (b) VLP de Qbeta, (c) G10 Qbeta). Descrição Detalhada da Invenção

As definições e concretizações descritas a seguir são, a não ser que de outra maneira explicitamente afirmada, aplicáveis a qualquer um dos aspectos, e concretizações, em particular processos, composições, compo- sições de nucleotídeo e usos da invenção. A não ser que de outra maneira definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm os mesmos significados que comumente entendidos por aquele de habilidade normal na técnica à qual essa invenção pertence.

Oligonucleotídeo": o termo oligonucleotídeo como usado aqui refere-se a um desoxirribonucleotídeo de filamento único. Um oligonucleotí- deo preferido compreende pelo menos uma extensão de poly G como defini- do abaixo. Oligonucleotídeos mais preferidos compreendem 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 das ditas extensões de poly G. Oligonucleotídeos muito preferi- dos compreendem exatamente duas extensões de poly G, em que de prefe- rência uma das ditas duas extensões de poly G está localizada na extremi- dade 5' ou na extremidade 3' do dito oligonucleotídeo. Oligonucleotídeos ainda mais preferidos compreendem exatamente duas extensões de poly G, em que uma das ditas duas extensões de poly G está localizada na extremi- dade 5' do dito oligonucleotídeo e uma das ditas duas extensões de poly G está localizada na extremidade 3' do dito oligonucleotídeo. Tipicamente e de preferência, um oligonucleotídeo como usado aqui consiste em 6 a 1000, de preferência de 10 a 1000, mais de preferência de 10 a 200, ainda mais de preferência de 10 a 100, ainda mais de preferência de 20 a 40, e com mais preferência de 30 nucleotídeos. Outros oligonucleotídeos preferidos consis- tem em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 nucleotídeos. Oligonucleotídeos ainda mais preferidos consistem em 24 a 32 nucleotídeos, mais de preferência de cerca de 30 nucleotídeos.

O termo oligonucleotídeo também refere-se a moléculas com- preendendo pelo menos um nucleotídeo modificado, em que de preferência o dito nucleotídeo modificado é selecionado de (a) um análogo de nucleotí- deo ou (b) um nucleotídeo compreendendo uma modificação de cadeia prin- cipal. Em uma concretização o oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo modificado selecionado do grupo que consiste em (a) ácido nu- cléico de peptídeo, (b) inosina, (c) bases tritiladas, (d) fosforotioatos, (e) al- quilfosforotioatos, (f) 5-nitroindol desoxirribofuranosila, (g) 5- metildesoxicitosina, e (h) 5,6-diidro-5,6-diidroxidesoxitimidina. Em uma outra concretização o oligonucleotídeo compreende ou alternativamente consiste em nucleotídeos fosfotioatados. Nucleotídeos fosfotioatados são protegidos contra degradação de uma célula ou um organismo e são, portanto, modifi- cações de nucleotídeo preferidas. Adicionalmente preferidas são formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas de poly- nucleotídeos como tipicamente encontradas na natureza. No entanto, oligo- nucleotídeos preferidos exclusivamente consistem em nucleotídeos não- modificados, isto é, de adenosina, timidina, guanosina, e/ou citidina. Oligo- nucleotídeos ainda mais preferidos exclusivamente consiste em nucleotídeos ligados a fosfodiéster.

Oligonucleotídeos muito preferidos são oligonucleotídeos con- tendo CpG não-metilados compreendendo pelo menos um, de preferência um, dois, três ou quatro pedaços de CpG. Oligonucleotídeos ainda mais pre- feridos compreendem uma seqüência palindrômica, em que de preferência a dita seqüência palindrômica compreende pelo menos, de preferência um, dois, três ou quatro pedaços de CpG. Oligonucleotídeos ainda mais preferi- dos compreendem uma seqüência palindrômica, em que de preferência a dita seqüência palindrômica compreende, ou de preferência consiste na se- qüência GACGATCGTC (SEQ ID NO: 1). Oligonucleotídeos ainda mais pre- feridos compreendem uma seqüência palindrômica, em que a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 5' por uma extensão de poly G e em que a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade .3' por uma extensão de poly G, em que de preferência a dita seqüência pa- lindrômica é GACGATCGTC (SEQ ID NO: 1). Oligonucleotídeos muito prefe- ridos compreendem uma seqüência palindrômica, em que a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 5' por pelo menos de 3 a 10, de preferência por de 4 a 10 entidades de guanosina e em que a dita se- qüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 3' pelo menos de 3 a 10, de preferência por 4 a 10, entidades de guanosina, em que de prefe- rência a dita seqüência palindrômica é GACGATCGTC (SEQ ID NO: 1).

"Consistência de poly G": o termo extensão de poly G refere-se a um segmento de um oligonucleotídeo, em que o dito segmento consiste em pelo menos 3 resíduos de guanosina consecutivos. Consistências de poly G preferidos consistem em 3 a 25, de preferência de 4 a 20, mais de preferência de 4 a 15 e com mais preferência de 4 a 10 entidades de guano- sina consecutivas. Outras extensão de poly G preferidas consistem em 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17,18,19, ou 20 entidades de gua- nosina consecutivas.

"Pedaço de CpG: como usado aqui, o termo "pedaço de CpG refere-se a seqüência de DNA curta, de preferência uma seqüência de DNA de filamento único, compreendendo uma citosina (C) - guanosina (G) dinu- cleotídeo, em que C não é metilada e em que de preferência o dito dinucleo- tídeo de CG é um fosfodiéster ligado. De preferência, um pedaço de CpG compreende pelo menos um, de preferência um, dois ou três, nucleotídeos .5' e/ou 3' adicionais do dito dinucleotídeo de CG, em que mais de preferên- cia os ditos nucleotídeos adicionais não compreendem um dinucleotídeo de CG.

"Tempo de início de pico relativo": o termo "tempo de início de pico relativo" é um parâmetro que é indicativo do estado de agregação de um oligonucleotídeo. O tempo de início de pico relativo de um oligonucleotí- deo é determinado por HPLC de exclusão de tamanho analítico, em que de preferência a dita HPLC é realizada essencialmente com, de preferência e- xatamente com os seguintes parâmetros: coluna: TSKgeI 5000 PWXL 7,8 mm * 30,0 cm (Lote:5PWX06GNMH3304, Técnica: 08023, Tosoh Bioscience) eluentee: PBS (NaCI a 150 mM em tampão de fosfato de sódio a 20 mM, pH7.2)

Volume de injeção: 40,0 μΙ (de preferência compreendendo uma concentra- ção de cerca de 20 μΜ a cerca de 500 μΜ) Taxa de fluxo: 0,8 ml/min Gradiente: Isocrático Tempo da experiência: 20 min

Comprimento de onda: 215, 260 e 280 nm, avaliação de dados a 260 nm Temp. do forno da coluna: 25°C Temp. do auto-amostrador: 8°C;

e em que o capsídeo do dito bacteriófago de RNA é usado como um padrão. O tempo de início de pico relativo X% do dito oligonucleotídeo em relação ao capsídeo do dito bacteriófago de RNA é calculado como se segue: X% = tempo de início de pico [min] do oligonucleotídeo dividido pelo tempo de re- tenção do padrão [min] χ 100%, em que o tempo de início de pico do oligo- nucleotídeo é determinado como o tempo quando a eluição do oligonucleotí- deo se torna detectável, e em que o tempo de retenção do padrão é deter- minado como o tempo da ocorrência do pico máximo do dito padrão. Assim, em uma concretização em que o dito bacteriófago de RNA é, por exemplo, bacteriófago AP205, capsídeo de AP205 é usado como padrão na dita HPLC e o tempo de início de pico relativo do dito oligonucleotídeo é calculado em relação ao dito padrão de AP205. De modo importante, em concretizações que não referem-se a um bacteriófago de RNA, o tempo de início de pico relativo é sempre determinado pelo uso do capsídeo de bacteriófago Qbeta como padrão. Além disso, no caso de qualquer variabilidade com relação à escolha do padrão apropriado na dita HPLC, capsídeo de bacteriófago Qbe- ta é usado como padrão e o tempo de início de pico relativo é determinado em relação ao dito capsídeo de bacteriófago Qbeta. Assim, em uma concre- tização muito preferida o dito tempo de início de pico relativo é determinado pela dita HPLC, em que de preferência o dito padrão é capsídeo de bacterió- fago Qbeta, e em que mais de preferência o dito tempo de início de pico re- lativo é determinado em relação ao dito capsídeo de bacteriófago Qbeta.

"Acondicionado": o termo "acondicionado" como usado aqui refe- re-se ao estado de um oligonucleotídeo, em relação à partícula do tipo vírus. O uso dos termos "oligonucleotídeo acondicionado em VLP" ou "VLP acon- dicionadas com oligonucleotídeo" é equivalente. O termo "acondicionado" como usado aqui refere-se a uma ligação não-covalente, de preferência a interações iônicas, a interações hidrofóbicas ou a ligações de hidrogênio. Muito de preferência, o termo "acondicionado" como usado aqui refere-se ao encerramento ou encerramento parcial, do dito oligonucleotídeo dentro da VLP. Por exemplo, o oligonucleotídeo, de preferência o oligonucleotídeo compreendendo um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, pode ser encerrado pela VLP sem a existência de uma ligação real, nem covalente- mente nem não-covalentemente ou com uma ligação não-covalente. Tipica- mente e de preferência, uma VLP acondicionado com oligonucleotídeo pro- tege o dito oligonucleotídeo contra degradação, de preferência contra hidró- Iise de DNAse. Portanto, no significado preferido, o termo "acondicionado" indica que o oligonucleotídeo em um estado acondicionado não é acessível à hidrólise de DNAse. Mais de preferência, o termo "acondicionado" indica que o oligonucleotídeo não é acessível hidrólise de DNAse, em que mais de preferência o DNAse é DNAseI ou benzonase. Ainda mais de preferência, o termo "acondicionado" indica que o oligonucleotídeo não é acessível à hidró- lise de benzonase.

A acessibilidade do oligonucleotídeo para DNAse (por exemplo, DNaseI ou Benzonase) é de preferência analisada como descrita nos exem- pios de 11 a 17 da WO 2003/024481A2 (vide p. 111 ali). Em um significado preferido, uma VLP é considerado como sendo acondicionado com um oli- gonucleotídeo, quando depois do tratamento com benzonase (190 U de Benzonase /mg de proteína de revestimento em um tampão compreendendo MgCI2 a 2 mM, pH 7,2, 20-25 0C, 18 h) pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, mais de preferência pelo menos 98% do dito oligonucleotídeo podem ser recuprados a partir da dita VLP (por exemplo, em um gel man- chado com brometo de etídio). É evidente para o técnico que tais ensaios exijam controles apropriados e possam necessitar serem adaptados à com- binação específica de VLP e oligonucleotídeo. Em um significado mais prefe- rido, um oligonucleotídeo é considerado como sendo acondicionado em uma VLP de um bacteriófago de RNA1 quando depois do tratamento com benzo- nase (190 U de benzonase/mg de proteína de revestimento em um tampão compreendendo MgC12 a 2 mM, pH 7,2, 20-25°C, 18 h) pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, mais de preferência pelo menos 98% do dito oligonucleotídeo pode ser recuperado a partir da dita VLP de um bacte- riófago de RNA. Em um significado muito preferido, oligonucleotídeo G10 (SEQ ID NO: 8) é considerado como sendo acondicionado em uma VLP de um bacteriófago de RNA, quando depois do tratamento com benzonase (190 U de benzonase/mg de proteína de revestimento em um tampão compreen- dendo MgCI2 a 2 mM, pH 7,2, 20-25 0C, 18 h) pelo menos 90%, de prefe- rência pelo menos 95%, mais de preferência pelo menos 98% do dito G10 pode ser recuperado a partir da dita VLP. No significado mais específico, o oligonucleotídeo G10 (SEQ ID NO: 8) é considerado como sendo acondicio- nado em uma VLP de um bacteriófago de RNA Qbeta, AP205, GA ou fr, quando depois do tratamento com benzonase (190 U de Benzonase/mg de proteína de revestimento em um tampão compreendendo MgCI2 a 2 mM, pH .7,2, 20-25°C, 18 h) pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, mais de preferência pelo menos 98% do dito G10 pode ser recuperado a partir da dita VLP de um bacteriófago de RNA. Em um significado muito específico, oligonucleotídeo G10 (SEQ ID NO: 8) é considerado como sendo acondicio- nado em uma VLP de um bacteriófago de RNA Qbeta, quando depois do tratamento com benzonase (190 U de benzonase/mg de proteína de reves- timento em um tampão compreendendo MgC12 a 2 mM, pH 7,2, 20-25°C, 18 h) pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, mais de preferência pelo menos 98% do dito oligonucleotídeo contendo CpG não-metilado pode ser recuperado a partir da dita VLP de bacteriófago de RNA Qbeta.

"Proteína de revestimento": Como usado aqui, o termo "proteína de revestimento" refere-se à(s) proteína(s) de um bacteriófago de RNA ca- paz de ser incorporada dentro da montagem de capsídeo do bacteriófago ou o bacteriófago de RNA. Assim, o termo proteína de revestimento refere-se à formação de proteína do capsídeo de um bacteriófago de RNA ou uma VLP de um bacteriófago de RNA. Tipicamente e de preferência, proteína de re- vestimento de bacteriófagos de RNA tem uma estrutura dimérica.

"Fragmento de uma proteína de revestimento (recombinante)", em particular fragmento de uma proteína de revestimento recombinante, como usado aqui, é definido como um polipeptídeo, que é de pelo menos .70%, de preferência pelo menos 80%, mais de preferência pelo menos 90%, ainda mais de preferência pelo menos 95% do comprimento da proteína de revestimento de tipo selvagem, ou da proteína recombinante de tipo selva- gem, respectivamente e que de preferência retém a capacidade de formar VLP. De preferência o fragmento é obtido por pelo menos uma deleção in- terna, pelo menos uma truncação ou pelo menos uma combinação sua. O termo "fragmento de uma proteína de revestimento recombinante" ou "frag- mento da proteína de revestimento" adicionalmente incluirá polipeptídeo, que tem pelo menos 80%, de preferência 90%, ainda mais de preferência . 95% de identidade de seqüência de aminoácidos com a proteína de revesti- mento de tipo selvagem, respectivamente, e que é de preferência capaz de montar para formar uma partícula do tipo vírus. O termo "proteína de reves- timento mutante" refere-se a um polipeptídeo tendo uma seqüência de ami- noácidos derivada da proteína recombinante de tipo selvagem, ou proteína de revestimento, respectivamente, em que a seqüência de aminoácidos é pelo menos 80%, de preferência pelo menos 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% idêntica à seqüência de tipo selvagem e de preferência retém a capacidade de montar para formar uma VLP.

"Partícula do tipo vírus (VLP)", como usado aqui, refere-se a uma partícula de vírus não-replicativa ou não-infecciosa, de preferência uma partícula de vírus não-replicativa e não-infecciosa, ou refere-se a uma mon- tagem de estrutura não-replicativa ou não-infecciosa, de preferência uma montagem de estrutura não-replicativa e não-infecciosa, de preferência um capsídeo de um vírus. O termo "não-replicativa", como usado aqui, refere-se a ser incapaz de replicar o genoma compreendido pelo VLP. O termo "não- infeccioso", como usado aqui, refere-se a ser incapaz de entrar na célula hospedeira. De preferência uma partícula do tipo vírus de acordo coma in- venção não é replicativa e/ou não-infecciosa uma vez que ela carece da to- talidade ou parte da função de genoma ou genoma viral. Em uma concreti- zação, uma partícula do tipo vírus é uma partícula de vírus, em que o geno- ma viral foi fisicamente ou qumicamente inativado, removido por desmonta- gem e reagrupamento, ou por montagem de proteína purificadas para formar uma VLP. Tipicamente e mais de preferência uma partícula do tipo vírus ca- rece da totalidade ou parte dos componentes replicativos e infecciosos do genoma viral. Uma partícula do tipo vírus de acordo coma invenção pode conter ácido nucléico distinto de seu genoma. Uma concretização típica e preferida de uma partícula do tipo vírus de acordo com a presente invenção é um capsídio viral tal como o capsídeo viral do vírus correspondente, bacte- riófago, de preferência bacteriófago de RNA. O termo "capsídeo", refere-se a uma montagem macromolecular constituída de subunidade de proteína viral. Tipicamente, há 60, 120, 180, 240, 300, 360 e mais do que 360 subunidades de proteína viral. Tipicamente e de preferência, as interações dessas subu- nidades levam à formação de capsídeo viral com uma orgânicação repetitiva inerente, em que a dita estrutura tipicamente e de preferência é esférica. Por exemplo, os capsídeos de bacteriófagos de RNA têm uma forma esférica de simetria icosaedral.

"Partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA": como usa- do aqui, o termo "partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA" refere- se a uma partícula do tipo vírus compreendendo, ou de preferência que con- siste essencialmente em ou que consiste em proteínas de revestimento, seus mutantes ou fragmentos, de um bacteriófago de RNA. Além disso, par- tícula do tipo vírus de uma remontagem de bacteriófago de RNA da estrutura de um bacteriófago de RNA, sendo não replicativo e/ou não-infeccioso, e que carece pelo menos do gene ou genes que codifica(m) para a maquinária de replicação do bacteriófago de RNA, e tipicamente também que carece(m) o gene ou genes que codifica(m) a proteína ou proteínas responsáveis por ligação viral ou entra(m) no hospedeiro. VLPs preferidas derivadas de bacte- riófagos de RNA exibem simetria icosaedral consistem em 180 subunidades. No contexto da invenção o termo partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA de preferência refere-se a uma estrutura macromolecular obtida por uma automontagem de proteína de revestimento recombinante de um bacte- riófago de RNA, ou seus fragmentes ou mutantes, em que de preferência a dita automontagem ocorre na presença de um oligonucleotídeo.

"Agente capaz de prevenir a automontagem de proteína de re-

vestimento": um agente capaz de prevenir a automontagem de proteína de revestimento é um agente que previne a formação espontânea de partículas do tipo vírus na dita mistura. O técnico é capaz de determinar a natureza química e a concentração apropriada do dito agente experimentalmente, por 20 exemplo, por análise da dita mistura por cromatografia de exclusão de tama- nho como descrita no exemplo 9. Um agente é capaz de prevenir a auto- montagem de proteína de revestimento, quando depois da incubação da dita mistura por pelo menos 1 h à temperatura ambiente, de preferência a 22°C, nenhuma partícula do tipo vírus é detectável pela cromatografia de exclusão 25 de tamanho descrita no exemplo 9. No entanto, o agente que é capaz de prevenir a automontagem de proteína de revestimento, não irreversivelmente modificar a dita proteína de revestimento e remoção do dito agente a partir da dita mistura resultará na formação espontânea de partículas de tipo de vírus. Agentes preferidos capazes de prevenir a automontagem de proteína 30 de revestimento compreendem detergentes, cloridrato de guanidínio e uréia, mais de preferência uréia. Detergentes preferidos são dodecilsulfato de só- dio, Tween 20, Triton X 100 e similares. Tipicamente e de preferência agen- tes capazes de prevenir a automontagem de proteína de revestimento adi- cionalmente compreendem um agente de redução que mantém ligações de dissulfeto intermoleculares formadas por resíduos de cisteína da dita proteí- na de revestimento em um estado reduzido.

"Rendimento de proteína": o rendimento de proteína de um pro- cesso da invenção é determinado quando a quantidade de proteína de re- vestimento recuperada como partícula do tipo vírus depois da última etapa do dito processo em relação à quantidade de proteína de revestimento con- tida na dita mistura, em que de preferência a quantidade da dita proteína de revestimento é determinada por ensaio de proteína Bradford. Tipicamente e de preferência pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75% da proteína de revestimento contida na dita mistura é recuperada como partícula do tipo vírus depois da etapa final do dito processo, em que de preferência a dita etapa final é a dita filtração estéril.

"Rendimento de oligonucleotídeo": o rendimento de oligonucleo- tídeo de um processo da invenção é determinado quando a quantidade de oligonucleotídeo que pode ser recuperada a partir da dita partícula do tipo vírus depois da última etapa do dito processo em relação à quantidade do dito oligonucleotídeo contido na dita mistura, em que de preferência a quan- tidade do dito oligonucleotídeo recuperada a partir da dita partícula do tipo vírus é determinada essencialmente ou de preferência exatamente como descrito no exemplo 9. Tipicamente e de preferência pelo menos 70%, de preferência pelo menos 75% do oligonucleotídeo contido na dita mistura é recuperado a partir da dita partícula do tipo vírus depois da etapa final do dito processo, em que de preferência a dita etapa final é a dita filtração esté- ril.

"Pureza": a pureza da composição da invenção compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus, é determinado pelo HPLC de exclusão de tamanho analítica, em que a dita HPLC é realizada sob condições essencialmente, de preferência exata- mente como revelada no exemplo 4. A pureza da dita composição é deter- minada como a percentagem da área de pico da dita partícula do tipo vírus contida na dita composição em relação à área de pico total do mesmo cro- matograma. Tipicamente e de preferência a pureza da composição da in- venção é pelo menos 98%, de preferência pelo menos 99%.

"uma", "um/uma": quando os termos "um," "uma," uns ou umas são usados nessa descrição, eles signifiam "um" ou "mais", a não ser que de outra maneira indicado.

"Cerca de": dentro do significado do presente pedido a expres- são cerca de terá o significado de +/- 10%. Por exemplo, cerca de 100 signi- ficará de 90 a 110.

A invenção provê processos para a produção de uma composi- ção de nucleotídeo compreendendo um oligonucleotídeo agregado. Em mais detalhes, a invenção provê um processo para a produção de uma composi- ção de nucleotídeo compreendendo um oligonucleotídeo, em que de prefe- rência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relati- vo de 50 a 11 0%, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão de um oligonucleotídeo em uma solução H, em que o dito oligonucleotídeo de preferência compreende em sua extremidade 5' pelo menos 3 entidades de guanosina e em sua extremidade 3' pelo menos 3 entidades de guanosi- na; e em que a dita solução Il compreende um pH de 5 a 8; e em que a dita solução Il compreende um cátion, em que de preferência a concentração do dito cátion na dita solução Il é pelo menos de 20 mM, em que o dito cátion é de preferência selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+; (b) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura Ill em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C; e (c) incubação do dito oligo- nucleotídeo na solução Il a temperatura III, em que a dita incubação é reali- zada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; e (d) ajuste da temperatura da solução Il para a tem- peratura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C; em que as ditas etapas são de preferência realizadas na dada ordem. Todas as concre- tizações descritas a seguir são aplicáveis a esse processo em qualquer combinação.

Como mencionado acima, verificou-se que é vantajoso submeter

0 dito oligonucleotídeo a uma etapa de desagregação antes da dita etapa de agregação, em que de preferência o dito oligonucleotídeo é totalmente de- sagregado. Desagregação completa do oligonucleotídeo significa que o peso molecular aparente do oligonucleotídeo em HPLC de exclusão de tamanho, de preferência realizado essencialmente como descrito no exemplo 4, cor- responde ao peso molecular que pode ser derivado da seqüência do dito oligonucleotídeo. Assim, a invenção adicionalmente provê um processo para a produção de uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonu- cleotídeo, em que de preferência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, o dito processo compreen- dendo as etapas de: (a) provisão de um oligonucleotídeo na solução I, em que o dito oligonucleotídeo pelo menos uma extensão de poly G; e em que a dita solução I compreende um pH alcalino; (b) desagregação do dito oligo- nucleotídeo, em que a dita desagregação compreende as etapas de: (i) ajus- te da temperatura da solução I para a temperatura I, em que a dita tempera- tura I é de 4 a 70°C; (ii) incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I, em que a dita incubação é realizada até que o dito oli- gonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo acima de .110%; e (iii) ajuste da temperatura da dita solução I para a temperatura II, em que a dita temperatura Il é de 0 a 70 0C; (c) ajuste do pH da dita solução .1 a pH de 5 a 8; e (d) agregação do dito oligonucleotídeo, em que a dita a - gregação compreende as etapas de: (i) provisão do dito oligonucleotídeo na solução II, em que a dita solução Il compreende um pH de 5 a 8 e um cátion, em que de preferência a concentração do dito cátion na dita solução Il é pelo menos de 20 mM, e em que de preferência o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+; (ii) ajuste da tempe- ratura da solução Il para a temperatura III, em que a dita temperatura Ill é de . 50 a 99°C; (iii) incubação do dito oligonucleotídeo na solução Il a temperatu- ra III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; e (iv) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV, em que a dita tempera- tura IV está abaixo de 50°C; em que as ditas etapas são de preferência rea- lizadas na dada ordem.

A desagregação do oligonucleotídeo não-tratado que pode com- preender oligonucleotídeo parcialmente agregado ocorre ao pH alcalino. O processo de desagregação pode ser facilitado por temperatura elevada.

Assim, em uma concretização a solução I compreende um pH de 8 a 13, de preferência de 10 a 13, mais de preferência 12. A solução I pode compreender qualquer tampão ou o agente pode compreender qualquer tampão ou o agente conhecido na técnica permite que se ajuste o pH entre 8 e 13. Em uma concretização preferida a solução I compreende hidróxido, de preferência um hidróxido de metal, mais de preferência um hidróxido de um metal alcalino ou um metal alcalino-terroso, de preferência um hidróxido de um metal alcalino. Em uma concretização preferida o dito hidróxido é hidró- xido de potássio ou hidróxido de sódio, mais de preferência hidróxido de só- dio. Em uma concretização a concentração do dito hidróxido, de preferência do dito hidróxido de sódio, na dita solução I é de 10 mM a 200 mM, mais de preferência cerca de 25 mM, com mais preferência de 25 mM.

Para evitar a degradação do oligonucleotídeo, a temperatura I de preferência não excede 90°C, a temperatura I não excede 70°C. Em uma concretização temperatura I é a temperatura ambiente, de preferência de 19 a 25°C. Em uma outra concretização temperatura I é de 4 a 70 0C, de prefe- rência de 20 a 70°C, mais de preferência de 45 a 70°C, de preferência cerca de 50°C, e com mais preferência 50°C. Em uma concretização preferida a dita incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I é realizada até que o dito oligonucleotídeo seja totalmente desagregado. Em uma outra concretização a dita incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I é realizada até que o tempo de início de pico relativo do dito oligonucleotídeo esteja acima de 110%, de preferência acima de 130% e mais de preferência acima de 135%. Em uma outra con- cretização a dita incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I é realizada por 30 a 190 min, de preferência por 50 a 90 min, mais de preferência por 70 min.

Em uma outra concretização preferida a concentração do dito oligonucleotídeo na dita solução I é de 50 μΜ a 2 mM, de preferência de 50 a 500 μΜ, mais de preferência de 200 a 300 μΜ, e mais de preferência 260 μΜ.

A desagregação do oligonucleotídeo pode ser terminada por neutralização ou acidificação da solução I e/ou redução da temperatura. As- sim, o dito processo adicionalmente compreende a etapa de ajuste do pH da dita solução I para o pH 8 ou abaixo, de preferência para o pH de 5 a 8. Em uma concretização preferida o dito ajuste do pH é realizado até que o dito pH seja de 6 a 7, mais de preferência até que o dito pH seja cerca de 6. Em uma outra concretização o dito ajuste do pH da dita solução I é realizado pela adição de ácido à dita solução I. Qualquer mineral ou ácido orgânico conhecido na técnica pode ser usado para essa finalidade. Em uma concre- tização preferida o dito ácido é selecionado do grupo que consiste em ácido fosfórico; ácido clorídrico; e ácidos orgânicos, em que os ditos ácidos orgâ- nicos são de preferência selecionados de ácido fórmico, ácido acético, e áci- do cítrico. Em uma concretização preferida o dito ácido é um ácido mineral. De preferência, o dito ácido é ácido fosfórico ou ácido clorídrico, mais de preferência ácido fosfórico.

O dito processo adicionalmente compreende ajuste da tempera- tura da dita solução I para a temperatura II, em que de preferência a dita temperatura Il é de 0 a 70°C e em que de preferência a dita temperatura Il está abaixo da temperatura I. Em uma concretização preferida a dita tempe- ratura Il é de 0 a 25 0C, de preferência de 0 a 10°C, e mais de preferência de 0 a 2°C.

O processo adicionalmente compreende a etapa de agregação do dito oligonucleotídeo. A agregação do oligonucleotídeo é alcançada por incubação do dito oligonucleotídeo a cerca de pH neutro em uma solução compreendendo cátions capazes de suportar a formação de estruturas de DNA G-quadruplex (cf. Simonsson T., Biol. Chem. 382:621-628) e a uma temperatura acima de 50°C. Assim, em uma concretização o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, Rb+, NH4+, Cs+, Li+, Sr2+, Ba2+, Ca2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, e Mg2+. Em uma concretização preferida o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+, mais de preferência o dito cátion é Na+ ou K+, mais de preferência o dito cátion é Na+. Em uma concretização muito preferida a concentração.

Em uma concretização preferida a solução Il compreendendo o dito oligonucleotídeo é obtido pela adição do dito cátion à dita solução I, em que de preferência a dita adição é realizada depois do dito ajuste do pH da solução I.

Em uma outra concretização a dita solução Il é uma mistura de qualquer cátion selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, Rb+, NH4+, Cs+, Li+, Sr2+, Ba2+, Ca2+, Mn2+, Co2+, Ni2+, e Mg2+. Em uma outra concretiza- ção a dita solução Il é uma mistura de qualquer cátion selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+. Em uma concretização muito preferida a dita mistura compreende ou de preferência consiste em Na+ e K+.

Em uma concretização preferida a dita solução Il compreende pelo menos 20 mM, de preferência pelo menos 100 mM, mais de preferência de 200 a 275 mM, e mais de preferência 250 mM do dito cátion ou da dita mistura de cátions. Em uma concretização muito preferida a dita solução II compreende 250 mM de Na+ e K+, mais de preferência 250 mM de Na+. Em concretização ainda mais preferida a dita solução Il compreende 250 mM de cloreto de sódio ou de cloreto de potássio, mais de preferência 250 mM de cloreto de sódio. No entanto, qualquer sal de sódio, potássio, amônio, lítio, cálcio ou magnésio conhecido na técnica pode ser usado para essa finalida- de.

Em uma outra concretização a concentração do dito oligonucleo- tídeo na dita solução Il é de 50 μΜ a 2 mM, de preferência de 100 a 300 μΜ mais de preferência 175 μΜ.

Em uma outra concretização o dito processo adicionalmente compreende ajuste da temperatura da solução II para a temperatura III, em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C, de preferência de 80 a 90°C, mais de preferência cerca de 85°C, e mais de preferência de 85°C.

Em uma outra concretização o dito processo compreende incu- bação do dito oligonucleotídeo na solução Il à temperatura III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, de preferência de 80 a 95%, mais de preferência de 80 a 90%, ainda mais de preferência de 83 a 90%, ainda mais de preferência de 85 a 90%, e com mais preferência de 88%. Em uma con- cretização muito preferida o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8) e a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, de preferência de 80 a 95%, mais de preferência de 80 a 90%, ainda mais de preferência de 83 a 90%, ainda mais de preferência de 85 a 90%, e com mais preferência de 88%.

O tempo de incubação exigido para se obter oligonucleotídeo compreendendo o tempo de início de pico relativo desejado depende da se- qüência e da pureza do oligonucleotídeo e varia tipicamente e de preferência de cerca de 5 min a cerca de 30 min. Em uma concretização preferida o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8) e a dita incubação de do dito oligo- nucleotídeo na dita solução Il na dita temperatura Ill é realizada por 9 a 24 min.

O processo de agregação é terminado por resfriamento da solu-

ção Il abaixo de 50°C. Em uma concretização preferida o dito processo compreende ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C, e em que de preferência a dita temperatura IV é de 0 a 25°C, mais de preferência de 0 a 10°C, e mais de preferência de 0 a 2°C.

Verificou-se que as taxas de aquecimento e/ou resfriamento a- plicadas no processo da invenção têm impacto no rendimento de distribuição de tamanho de partícula do oligonucleotídeo agregado obtido. Em particular, foi encontrado no curso de escalamento positivo do processo para volumes de batelada mais altos, que a distribuição de tamanho e rendimento de partí- cula pode ser adicionalmente aperfeiçoada pelo uso de rampas de tempera- tura (isto é, taxas de aquecimento ou de resfriamento) de pelo menos 3,6°C/min. O técnico pode alcançar a rampa de temperatura por padroniza- ção das condições de processo com relação ao volume de reação, geome- tria e condutividade térmica do recipiente de reação e a diferença de tempe- ratura escolhida. Em uma concretização preferida, o dito ajuste da tempera- tura da solução I para a temperatura I, o dito ajuste da temperatura da dita solução I para a temperatura II, o dito ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura III, e/ou o dito ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV são realizados com uma rampa de temperatura de pelo me- nos 3,6°C/min. Em uma outra concretização preferida, o dito ajuste da tem- peratura da solução Il para a temperatura III, é realizado com uma rampa de temperatura de menos 3,6°C/min, em que de preferência a dita rampa de temperatura é cerca de 7°C/min. Em uma outra concretização preferida, o dito ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV é realizado com uma rampa de temperatura de menos 3,6°C/min, em que de preferência a dita rampa de temperatura é cerca de 7°C/min.

A fim de ser capaz de formar agregados, o dito oligonucleotídeo compreende pelo menos uma, de preferência duas extensões de poly G. Em uma concretização preferida o dito oligonucleotídeo compreende em sua extremidade 5' pelo menos 3, de preferência pelo menos 4 entidades de guanosina e em sua extremidade 3' pelo menos 3, de preferência pelo me- nos 4 entidades de guanosina. Em uma outra concretização preferida o dito oligonucleotídeo compreende em sua extremidade 5' pelo menos 4 entida- des de guanosina e em sua extremidade 3' pelo menos 4 entidades de gua- nosina. Em uma concretização preferida o dito oligonucleotídeo compreende em sua extremidade 5' pelo menos 3 e no máximo 20, de preferência no máximo 15 entidades de guanosina e em sua extremidade 3' pelo menos 3 e no máximo 20, de preferência no máximo 15 entidades de guanosina. Em uma outra concretização preferida o dito oligonucleotídeo compreende em sua extremidade 5' pelo menos 3, de preferência pelo menos 4, e no máximo 11 entidades de guanosina e em sua extremidade 3' pelo menos 3, de prefe- rência pelo menos 4 e no máximo 10 entidades de guanosina. Em uma outra concretização preferida o dito oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo con- tendo CpG não-metilado, de preferência em que o dito oligonucleotídeo con- tendo CpG não-metilado compreende duas extensões de poly G, em que de preferência cada uma das ditas extensões de poly G consiste em pelo me- nos 4 entidades de guanosina, e em que mais de preferência o dito oligonu- cleotídeo contendo CpG não-metilado compreende uma seqüência palin- drômica, em que a dita seqüência palindrômica está localizada entre as ditas extensões de poly G. Em uma outra concretização preferida o dito oligonu- cleotídeo compreende em sua extremidade 5' pelo menos 3, de preferência pelo menos 4 entidades de guanosina e em sua extremidade 3' pelo menos 3, de preferência pelo menos 4 entidades de guanosina, em que o dito oligo- nucleotídeo adicionalmente compreende uma seqüência palindrômica, em que de preferência a dita seqüência palindrômica é GACGATCGTC (SEQ ID NO: 1).

Em uma outra concretização preferida o dito oligonucleotídeo compreende uma seqüência palindrômica, em que de preferência a dita se- qüência palindrômica é GACGATCGTC (SEQ ID NO: 1), e em que a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 5' por pelo menos 3, de preferência pelo menos 4, e no máximo 15 entidades de guanosina e em que a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 3' por pelo menos 3, de preferência pelo menos 4, e no máximo 15 entidades de guanosina.

Em uma outra concretização preferida o dito oligonucleotídeo compreende de 10 a 1000 nucleotídeos, de preferência de 10 a 200 nucleo- tídeos, mais de preferência de 10 a 100 nucleotídeos, ainda mais de prefe- rência de 20 a 40 nucleotídeos, com mais preferência 30 nucleotídeos.

Em uma concretização muito preferida o dito oligonucleotídeo compreende ou de preferência consiste em uma seqüência de ácidos nucléi- cos selecionada do grupo que consiste em: (a) "G4-4"GGGGGACGAT CGTCGG GG (SEQ ID NO: 2); (b)"G5-5" GGGGGGACGA TCGTCGGGGG (SEQ )D N0: 3); (c) "G6-6nG<jGGGGGACG ATCGTCGGGG GG (SEQ ID NO: 4); (d)"G7-7" GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG (SEQ ID NO: .5); (e)"G8-8" GGGOGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG (SEQ ID NO- 6)· (f)"G9-9" GGGGGGGGGG ACGATCGTCG

GGGGGGGG (seq id no: 7); (g) "G10" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ

ID NO1 8)· (h) "Gl I" GGGGGGGGGG GGACGATCGT GGGGGGGGGG GG (SEQ iD N0: 9)) em que de preferência o dito oligonucleotídeo totalmente consiste em nucleotídeos ligados a fosfodiéster. Em uma concretização ainda mais preferida o dito oligonucleotídeo compre- ende ou de preferência consiste na seqüência de ácidos nucléicos "G10" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO- 8)

em que de preferência o dito oligonucleotídeo totalmente consiste em nucle- otídeos ligados a fosfodiéster.

A invenção adicionalmente refere-se a uma composição de nu- cleotídeo compreendendo um oligonucleotídeo, em que a dita composição de nucleotídeo é obtenível por qualquer um dos processos descritos acima, implementação de qualquer uma das concretizações descritas acima, sozi- nho ou em qualquer combinação. Em particular, a invenção refere-se a uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonucleotídeo, em que a dita composição de nucleotídeo é obtenível por qualquer um dos processos descritos acima, em que de preferência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, de preferência de 80 a95%, mais de preferência de 80 a 90%, ainda mais de preferência de 83 a90%, ainda mais de preferência de 85 a 90%, e com mais preferência de88%. Em uma concretização preferida, a dita composição de nucleotídeo compreende um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo compreen- de ou de preferência consiste na seqüência de ácidos nucléicos selecionada

do grupo que consiste em: (a)

(a) "G4-4"GGGGGACGAT CGTCGGGG (SEQ ID N0:2); (b)"G5-5" GGGGGGACGA TCGTCGGGGG (SEQ ID NO:3); (c)"G6-6"GGGGGGGACG ATCGTCGGGG GG (SEQ ID N0:4); (d)"G7-7" GGGGGGGGAC GATCGTCGGG GGGG (SEQ ID N0:5); (e)"G8-8" GGGGGGGGGA CGATCGTCGG GGGGGG (SEQ ID N0:6); (f)"G9-9" GGGGGGGGGG ACGATCGTCG GGGGGGGG (SEQ ID NO:7); (g) "G10" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8); (h) "G11" GGGGGGGGGG GGACGATCGT CGGGGGGGGG GG (SEQ ID NO:9),

em que de preferência o dito oligonucleotídeo totalmente consiste em nucle- otídeos ligados a fosfodiéster. Em uma concretização ainda mais preferida a dita composição de nucleotídeo compreende um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo compreende ou de preferência consiste na seqüência de ácidos nucléicos "G10" GGGGGGGGGGGAC- GATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 8), em que de preferência o dito oligonucleotídeo totalmente consiste em nucleotídeos ligados a fosfodiéster. Em concretização muito preferida a dita composição de nucleotídeo compre- ende um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo consiste na se- qüência de ácidos nucléicos "G10" GGGGGGGGGGGAC- GATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 8), em que o dito oligonucleotídeo totalmente consiste em nucleotídeos ligados a fosfodiéster, e em que o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a .110%, de preferência de 80 a 95%, mais de preferência de 80 a 90%, ainda mais de preferência de 83 a 90%, ainda mais de preferência de 85 a 90%, e com mais preferência de 88%.

Como mencionado antes, as composições de nucleotídeo da invenção são úteis em um processo para a produção da composição com- preendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oli- gonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partí- cula do tipo vírus, uma vez que o oligonucleotídeo agregado quando contido nas composições de nucleotídeo da invenção facilite a automontagem da proteína de revestimento de bacteriófagos de RNA e, assim, a formação de partícula do tipo vírus de bacteriófagos de RNA, em que o dito oligonucleotí- deo seja condicionado nas ditas partículas do tipo vírus. A invenção portanto adicionalmente refere-se a um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA1 e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provi- são de uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonucleotí- deo, em que a dita composição de nucleotídeo é uma composição de nucle- otídeo obtenível por qualquer um dos processos da invenção; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de reves- timento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se au- tomonte em uma partícula do tipo vírus. O dito processo pode compreender qualquer uma das características e concretizações descritas aqui em qual- quer combinação.

Oligonucleotídeo compreendendo um tempo de início de pico relativo de 50 a 110% é mais útil para a finalidade da invenção, enquanto que o oligonucleotídeo compreendendo um tempo de início de pico relativo mais alto ou mais baixo pode resultar em baixo rendimento. Assim, a inven- ção adicionalmente provê um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provi- são de um oligonucleotídeo, (i) em que o dito oligonucleotídeo de preferência compreende pelo menos uma extensão de poly G; e (ii) em que o dito oligo- nucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus. O dito processo pode compreender qualquer uma das características e concretizações des- critas aqui em qualquer combinação.

O técnico é capaz de produzir e de purificar a proteína de reves- timento de bacteriófagos de RNA por purificação da dita proteína de revesti- mento de bacteriófagos de RNA por aplicação de métodos padrão. No en- tanto, em uma concretização preferida a dita proteína de revestimento é re- combinantemente produzida, de preferência por expressão da dita proteína de revestimento em E. coli. Métodos para a obtenção de proteína de reves- timento de bacteriófagos de RNA são descritos na seção dos exemplos. Em uma concretização preferida a dita proteína de revestimento compreende, ou alternativamente essencialmente consiste em, ou alternativamente consiste em proteínas recombinantes, ou seus fragmentos, de um bacteriófago de RNA, em que de preferência o dito bacteriófago de RNA é selecionado do grupo que consiste em: (a) bacteriófago Qbeta; (b) bacteriófago RI7; (c) bac- teriófago fr; (d) bacteriófago GA; (e) bacteriófago SP; (f) bacteriófago MS2; (g) bacteriófago Mi I; (h) bacteriófago MXI; (i) bacteriófago NL95; (j) bacterió- fago f2; (k) bacteriófago PP7; e bacteriófago AP205. Em uma concretização preferida o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago Qbeta. Processos e mé- todos para a expressão e purificação de partículas do tipo vírus de bacterió- fagos de RNA, em particular de bacteriófago Qbeta são descritos nos WO 2006/125821A2 e WO 2007/039552A1, que são incorporados aqui a título de referência. Proteína de revestimento de bacteriófago de RNA pode ser obti- da por desmontagem de partículas do tipo vírus, por exemplo, como descrita nos exemplos aqui.

Em uma outra concretização preferida o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago AP205. Formas mutantes de montagem-competente de VLPs de AP205, incluindo proteína de revestimento de AP205 com a substi- tuição de prolina a aminoácido 5 até treonina, pode também ser usado na prática da invenção. O WO 2004/007538 descreve, em particular nos exem- plos 1 e 2, como se obter VLP compreendendo proteínas de revestimento AP205, e aqui em particular sua expressão e purificação. O WO 2004/007538 é incorporado aqui a título de referência.

Em uma outra concretização preferida o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago fr. Proteína de revestimento de Fr na forma de VLP re- combinante pode ser obtida como descrita por Pushko P et al. ((1993) Prot Engin 6:883-891). Em uma outra concretização preferida o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago GA. VLP de GUM pode ser obtido por clonagem de cDNA de proteína de revestimento de GA isolado por transcrição reversa de fago de GA em pQbl85, que é descrito, por exemplo, no WO 2004/007538. Desmontagem de VLPs de Fr e GUM podem ser prontamente feita por incu- bação das VLPs em uréia a 7 M, opcionalmente suplementadas com ácido acético a uma concentração de 0,1 Μ. O ácido nucléico é adicionalmente purificado da proteína de revestimento por cromatografia de troca de cátion, ou a um pH onde uma quantidade significativa da proteína de revestimento flui enquanto o ácido nucléico é retido, ou a um pH onde a proteína de reves- timento é também adsorvida na coluna e subseqüentemente eluída com um gradiente de sal.

Em uma concretização preferida, a dita proteína de revestimento compreende ou de preferência consiste em uma seqüência de aminoácidos selecionado do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 10 (Qbeta CP); (b) uma mistura de SEO ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 (proteína de Qbeta Al); (c) SEQ ID NO: 12 (proteína de revestimento de R17); (d) SEQ ID NO: 13 (pro- teína de revestimento de fr); (e) SEQ ID NO: 14 (proteína de revestimento de GA); (f) SEQ ID NO: 15 (proteína de revestimento de SP); (g) uma mistura de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16; (h) SEQ ID NO: 17 (proteína de reves- timento de MS2); (i) SEQ ID NO: 18 (proteína de revestimento de M11); (j) SEQ ID NO: 19 (proteína de revestimento de MXI); (k) SEQ ID NO: 20 (pro- teína de revestimento de NL95); (1) SEQ ID NO: 21 (proteína de revestimen- to de f2); (m) SEQ ID NO: 22 (proteína de revestimento de PP7); e (n) SEQ ID NO: 23 (proteína de revestimento de AP205). Em uma outra concretiza- ção preferida, a proteína de revestimento auxiliar compreende ou de prefe- rência consiste em uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 10; (b) uma mistura de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 11; (c) SEQ ID NO: 13; (d) SEQ ID NO: 14; (e) SEQ ID NO: 23. Em uma outra concretização muito preferida a dita proteína de revestimento de auxílio de proteína de revestimento compreende ou de preferência con- siste em uma seqüência de aminoácidos selecionado do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: 10; e (b) uma mistura de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.

Além disso, proteína de revestimento mutante de bacteriófago Qbeta em que resíduos de Iisina expostos são substitídos por argininas po- dem ser usados para a presente invenção. Assim, em uma outra concretiza- ção preferida a dita proteína de revestimento compreende, consiste essenci- almente em ou alternativamente consiste em proteína em revestimento mu- tante de Qbetas como descrita no WO 02/056905 (vide exemplo 18 aqui).

Outras proteínas de revestimento de bacteriófago de RNA tam- bém demonstraram se auto-montar na expressão em um hospedeiro bacte- riano (Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). Em particular as propriedades biológicas e bioquímicas de GA (Ni, CZ., et al., Proteína Sei. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271 :759- 773(1997)) e de fr (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290, (1994)) foram descritos. A estrutura de cristal de vários bacteriófagos de RNA foi determinada (Golmohammadi, R. et al., S- trueture 4:543-554 (1996)).

Tipicamente e de preferência, os processos descritos aqui para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bac- teriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, são realizados à temperatura ambiente. Em uma concretização preferida os ditos processos são realiza- dos a 15 a 30°C, de preferência a 19 até 25°C, mais de preferência a 22°C. Em uma outra concretização preferida a dita geração da dita mistura, a dita remoção do dito agente a partir da dita mistura, e/ou a dita permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus é realizada a 15 até 30°C, de preferência a 19 até 25°C, mais de preferência a .22°C.

O dito processo compreende geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo. Em uma concretização preferida a concentração da dita proteína de revestimento na dita mistura é de 0,5 a 10 mg/ml, de preferência de 1 a 4 mg/ml, e mais de preferência de 2,5 mg/ml, em que de preferência a dita concentração é determinada em um ensaio de Bradford. Em uma outra concretização preferida a concentração do dito oligonucleotídeo na dita mis- tura é de 12,5 a 250 μΜ, mais de preferência de 25 a 100 μΜ, e mais de pre- ferência 62,5 μΜ.

A fim de se obter ótimo rendimento do processo de acondicio- namento, a razão molar do dito oligonucleotídeo e da dita proteína de reves- timento na dita mistura é de 0,5 a 1,2, de preferência de 0,6 a 0,8 e mais de preferência 0,7. O uso de menos oligonucleotídeo por proteína de revesti- mento levará ao baixo rendimento enquanto o uso excessivo de oligonucleo- tídeo aumenta custos e pode resultar em um produto com baixa pureza. Em uma concretização muito preferida a concentração da dita proteína de reves- timento na dita mistura é de 2,5 mg/ml, e a concentração do dito oligonucleo- tídeo na dita mistura é de 62,5 μΜ.

Proteínas de revestimento de vírus e em particular de bacterió- fagos de RNA em geral têm uma forte tendência de automontar para formar uma estrutura de capsídeo, por exemplo, para formar uma partícula do tipo vírus. Embora não em cada caso, essa tendência é em muitos casos aumen- tada na presença de ácidos nucléicos tal como RNA ou DNA. A fim de se obter ótima misturação da dita proteína de revestimento e do dito oligonucle- otídeo antes da automontagem da dita proteína de revestimento ocorra, a dita mistura compreende um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento. Tipicamente e de preferência o dito agente compreende um composto de desnaturação. Numerosos compostos de des- naturação são conhecidos na bioquímica e incluem detergentes, uréia ou cloridrato de guanidínio. Detergentes preferidos são dodecilsulfato de sódio, Tween 20, Triton X100 e similares. Em uma concretização preferida o dito composto de desnaturação é uréia ou cloridrato de guanidínio, em que de preferência a concentração do dito composto de desnaturação, de preferên- cia da dita uréia, na dita mistura é de 0,25 a 7,2 M, de preferência a 1 M. Em uma concretização muito preferida o dito composto de desnaturação é uréia, e a concentração da dita uréia na dita mistura é de 0,5 a 2 M, de preferência de 0,7 a 1,5 M, mais de preferência de 0,8 a 1,2 M, e mais de preferência a 1 M.

Em uma outra concretização preferida o pH da dita mistura é neutro, de preferência o dito pH é de 6 a 8, mais de preferência de 6,8 a 7,5, e mais de preferência o dito pH é 7,2. Em uma concretização muito preferida a dita mistura compreende um tampão de fosfato, de preferência um tampão de fosfato de sódio, em que mais de preferência a concentração final do dito tampão de fosfato na dita mistura é de 2 a 100 mM, mais de preferência de 10 a 50 mM e com mais preferência cerca de 20 mM.

Em uma outra concretização a dita mistura adicionalmente com- preende sal, em que de preferência o dito sal é um halogeneto, de preferên- cia um cloreto de um metal alcalino, mais de preferência o dito sal é cloreto de potássio ou cloreto de sódio ou uma sua combinação, e mais de prefe- rência o dito sal é cloreto de sódio. Em uma concretização preferida a con- centração do dito sal ou da dita combinação de sais, de preferência a con- centração do dito cloreto de sódio, na dita mistura é de 0 a 1 M, de preferên- cia de 0 a 550 mM, mais de preferência de 0 a 350 mM, ainda mais de prefe- rência de 50 a 350 mM, e com mais preferência 250 mM.

O capsídeo e/ou as partículas do tipo vírus de certos bacteriófa- gos de RNA, em particular de bacteriófago Qbeta1 bacteriófago AP205, e bacteriófago fr, são estabilizados por ligações de dissulfeto intermoleculares entre as subunidades de proteína que formam o(a) dito(a) capsídeo ou partí- cula do tipo vírus. A adição de um agente de redução à dita mistura mantém as ditas pontes de dissulfeto em um estado reduzido e, assim, suporta a prevenção da automontagem da dita proteína de revestimento. Em uma concretização preferida o dito agente portanto adicionalmente compreende um agente de redução, em que o dito agente de redução é de preferência selecionado de DTT (ditioeritol), beta-mecaptoetanol, TCEP et al. agentes de redução em geral conhecido na técnica. Em uma concretização preferida o dito agente de redução é DTT, em que de preferência a concentração do dito DTT na dita mistura é de 1 a 25 mM, de preferência 2,5 mM. Em uma con- cretização muito preferida, o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago Οβ, bacteriófago AP205, ou bacteriófago fr, e o dito agente adicionalmente com- preende um agente de redução, em que de preferência o dito agente de re- dução é DTT, e em que mais de preferência a concentração do dito DTT na dita mistura é de 1 a 25 mM, de preferência 2,5 mM. Em uma outra concreti- zação preferida, a dita proteína de revestimento compreende resíduos de cisteína capazes de formar ligações de dissulfeto intermoleculares na dita partícula do tipo vírus, e o dito agente adicionalmente compreende um agen- te de redução, em que de preferência o dito agente de redução é DTT, e em que mais de preferência a concentração do dito DTT na dita mistura é de 1 a 25 mM, de preferência 2,5 mM.

Em uma concretização preferida, a dita geração da dita mistura compreende adição (i) da dita proteína de revestimento; (ii) do dito agente capaz de prevenir a automontagem da dita proteína de revestimento; e (iii) do dito oligonucleotídeo à dita mistura, em que de preferência a dita adição é realizada na dada ordem, e em que mais de preferência a dita mistura é mis- turada antes da dita adição do dito oligonucleotídeo.

Em uma outra concretização preferida, o dito processo adicio- nalmente compreende a etapa de incubação da dita mistura antes da dita remoção do dito agente, em que de preferência a dita incubação é realizada por cerca de 50 a 70, de preferência cerca de 60 min. Em uma outra concre- tização preferida, incubação da dita mistura é realizada a 15 até 30°C, mais de preferência a 19 até 25°C, e mais de preferência a 22°C. Em uma outra concretização preferida, a dita incubação da dita mistura compreende agita- ção da dita mistura, em que de preferência a dita agitação é realizada a cer- ca de 50 a 200 rpm, mais de preferência a cerca de 100 rpm. Em uma con- cretização muito preferida, a dita incubação da dita mistura é realizada por cerca de 60 min, e a dita incubação da dita mistura compreende agitação da dita mistura, em que de preferência a dita agitação é realizada a cerca de 100 rpm.

Em uma concretização, a dita remoção do dito agente a partir da dita mistura é realizada por uma primeira troca de tampão com um primeiro tampão, em que de preferência a dita primeira troca de tampão é realizada por diálise ou por filtração de fluxo contínuo, de preferência por filtração de fluxo contínuo. A dita primeira troca de tampão é realizada através de uma membrana compreendendo um corte de peso molecular que premite a re- tenção da dita proteína de revestimento e da própria VLP montada. Em uma concretização preferida, a dita primeira troca de tampão é realizada através de uma membrana, em que a dita membrana compreende um corte de peso molecular de 1 a 50 kD, de preferência de 5 a 30 kD, mais de preferência de 30 kD. Em uma concretização muito preferida, a dita primeira troca de tam- pão é realizada por filtração de fluxo contínuo através de uma membrana compreendendo um corte de peso molecular de 1 a 50 kD, de preferência de 30 kD, em que mais de preferência o volume do dito primeiro tampão é cerca de 6 vezes o volume da dita mistura. Em uma concretização muito preferida, a dita membrana é Biomax-5 (PES) compreendendo corte de peso molecular de 30 kD. Em uma concretização muito preferida a dita primeira troca de tampão é realizada por filtração de fluxo contínuo através de uma membrana compreendendo um corte de peso molecular de 1 a 50 kD, de preferência de 30 kD, em que o fluxo permeato é ajustado para cerca de 96 l/(m2*h).

Em uma outra concretização preferida, o dito primeiro tampão compreende um sal, em que de preferência a composição de sal do dito pri- meiro tampão é idêntica à composição de sal da dita mistura. Em uma con- cretização preferida, o dito sal no dito primeiro tampão é um halogeneto, de preferência um cloreto de um metal alcalino, mais de preferência o dito sal é cloreto de potássio ou cloreto de sódio ou uma sua combinação, e mais de preferência o dito sal é cloreto de sódio. Em uma concretização preferida, a concentração do dito sal ou da dita combinação de sais, de preferência a concentração do dito cloreto de sódio, no dito primeiro tampão é de 0 a 1 M, de preferência de 0 a 550 mM, mais de preferência de 0 a 350 mM, ainda mais de preferência de 50 a 350 mM, e com mais preferência 250 mM. Em uma outra concretização preferida, o pH do dito primeiro tampão é de 6 a 8, mais de preferência de 6,8 a 7,5, e com mais preferência o dito pH é 7,2. Em uma outra concretização preferida, o dito primeiro tampão compreende um tampão de fosfato, de preferência um tampão de fosfato de sódio, em que mais de preferência a concentração final do dito tampão de fosfato no dito primeiro tampão é de 2 a 100 mM, mais de preferência de 10 a 50 mM e com mais preferência cerca de 20 mM.

A fim de estabilizar a dita partícula do tipo vírus formada em uma reação de automontagem, a dita partícula do tipo vírus é de preferência pos- ta em contato com um agente de oxidação capaz de formar ligações de dis- sulfeto intermoleculares na dita partícula do tipo vírus. Assim, em uma con- cretização preferida o dito processo adicionalmente compreende a etapa de contato da dita partícula do tipo vírus com um agente de oxidação, em que de preferência o dito agente de oxidação é selecionado do grupo que consis- te em (a) peróxido de hidrogênio, em que de preferência a concentração do dito peróxido de hidrogênio é de 0,25-50 mM, de preferência 2 mM; (b) oxi- gênio; (c) glutationa; (d) ascorbato; (e) Cu2+; e (f) Fe3+. Em uma concretiza- ção muito preferida, o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago Qbeta, bacte- riófago AP205, ou bacteriófago fr, e o dito processo adicionalmente compre- ende a etapa de contato da dita partícula do tipo vírus com um agente de oxidação, em que de preferência o dito agente de oxidação é selecionado do grupo que consiste em (a) peróxido de hidrogênio, em que de preferência a concentração do dito peróxido de hidrogênio é de 0,25-50 mM, de preferên- cia 2 mM; (b) oxigênio; (c) glutationa; (d) Cu2+; e (e) Fe3+, e em que mais de preferência o dito agente de oxidação é peróxido de hidrogênio, em que mais de preferência a concentração do dito peróxido de hidrogênio é de 0,25-50 mM, de preferência 2 mM. Em uma concretização preferida, a dita proteína de revestimento compreende resíduos de cisteína capazes de for- mar ligações de dissulfeto intermoleculares na dita partícula do tipo vírus, em que de preferência a dita proteína de revestimento é proteína de revestimen- to de bacteriófago Οβ, bacteriófago AP205 ou bacteriófago fr, e o dito pro- cesso adicionalmente compreende a etapa de contato da dita partícula do tipo vírus com um agente de oxidação, em que de preferência o dito agente de oxidação é selecionado do grupo que consiste em (a) peróxido de hidro- gênio, em que de preferência a concentração do dito peróxido de hidrogênio é de 0,25-50 mM, de preferência 2 mM; (b) oxigênio; (c) glutationa; (d) Cu2+; e (e) Fe3+, e em que mais de preferência o dito agente de oxidação é peróxi- do de hidrogênio, em que mais de preferência a concentração do dito peró- xido de hidrogênio é de 0,25-50 mM, de preferência 2 mM.

Em uma outra concretização preferida, o dito processo adicio- nalmente compreende a etapa de purificação da dita partícula do tipo vírus, em que de preferência a dita purifcação compreende uma segunda troca de tampão com um segundo tampão, em que mais de preferência o dito segun- do tampão é um tampão farmaceuticamente aceitável. Em uma concretiza- ção preferida, a dita segunda troca de tampão é realizada com um segundo tampão, em que de preferência a dita segunda troca de tampão é realizada por diálise ou por filtração de fluxo contínuo, de preferência por filtração de fluxo contínuo. A dita segunda troca de tampão é realizada através de uma membrana compreendendo um corte de peso molecular que permite a re- tenção da dita partícula do tipo vírus, e que de preferência permite a perme- ação da dita proteína de revestimento e/ou do dito oligonucleotídeo. Assim, em uma concretização preferida, a dita segunda troca de tampão é realizada através de uma membrana compreendendo um corte de peso molecular de 100 a 1000 kD, de preferência de 300 kD, em que de preferência a dita se- gunda troca de tampão é realizada por filtração de fluxo contínuo. Em uma concretização muito preferida, a dita membrana é PLCMK-300 compreen- dendo corte de peso molecular de 300 kD. Em uma outra concretização mui- to preferida, a dita segunda troca de tampão é realizada por filtração de fluxo contínuo através de uma membrana compreendendo um corte de peso mo- lecular de 100 a 1000 kD, de preferência de 300 kD, em que de preferência cerca de 10 vezes o volume da dita mistura é trocado, e em que mais de preferência o fluxo permeato é ajustado para cerca de 100 l/(m2*h).

Em uma outra concretização, o dito processo compreende a concentração da dita partícula do tipo vírus, em que de preferência a dita concentração é realizada para dar uma concentração final da dita partícula do tipo vírus na dita composição de 1 a 5 mg de proteína/ml, de preferência de cerca de 2,5 mg de proteína/ml, em que de preferência a dita concentra- ção é determinada por ensaio de proteína de Bradford, e em que mais de preferência a dita partícula do tipo vírus é dissolvida no dito segundo tam- pão. Em uma concretização muito preferida, a dita concentração é realizada através de uma membrana capaz de reter a dita partícula do tipo vírus, em que de preferência o corte de peso molecular da dita membrana é de 100 a 1000 kD, de preferência cerca de 300 kD, e em que mais de preferência, a dita concentração é realizada com um fluxo permeato através da dita mem- brana de menos do que 100 l/(h*m2), de preferência cerca de 30 l/(h*m2). Baixas taxas de fluxo durante a etapa de concentração previnem a precipita- ção do produto.

Em uma outra concretização preferida, o dito processo adicio- nalmente compreende a etapa de filtração estéril da dita partícula do tipo vírus, em que de preferência a dita partícula do tipo vírus está contida no dito segundo tampão, em que mais de preferência a dita filtração estéril é reali- zada através de um filtro de membrana compreendendo de 0,1 a 0,45 μιη, de preferência cerca de 0,22 μηι.

Em uma outra concretização preferida, os processos de acordo com a invenção para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, com- preendem um rendimento de proteína, em que o dito rendimento de proteína é pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais de preferência pelo menos 70%, ainda mais de preferência pelo menos 75%, e com mais preferência pelo menos 80%. Em uma outra concretização preferida, os processos de acordo com a invenção para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, com- preendem um rendimento de oligonucleotídeo, em que o dito rendimento de oligonucleotídeo é pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais de preferência pelo menos 70%, ainda mais de preferência pelo menos 75%, e com mais preferência pelo menos 80%. Em uma outra concretização preferida, a dita composição com-

preendendo a dita partícula do tipo vírus compreende uma pureza de pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais de preferência pelo me- nos 95%, ainda mais de preferência pelo menos 98%, e com mais preferên- cia pelo menos 99%. Em uma outra concretização preferida, os processos de acordo

com a invenção para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, com- preendem um rendimento de oligonucleotídeo, em que o dito rendimento de oligonucleotídeo é pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais de preferência pelo menos 70%, ainda mais de preferência pelo menos 75%, e com mais preferência pelo menos 80%.

Em uma outra concretização preferida, os processos de acordo com a invenção para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, com- preendem um rendimento de proteína e um rendimento de oligonucleotídeo, em que o dito rendimento de proteína é pelo menos 50%, de preferência pe- lo menos 60%, mais de preferência pelo menos 70%, ainda mais de prefe- rência pelo menos 75%, e com mais preferência pelo menos 80%. Em uma outra concretização preferida, a dita composição com- preendendo a dita partícula do tipo vírus compreende de 15 a 30 μς, de pre- ferência de 20 a 25 μρ, e mais de preferência cerca de 20 μς do dito oligo- nucleotídeo por 100 μς de proteína de revestimento, em que de preferência a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de bacteriófago Οβ, e em que mais de preferência o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8), em que ainda mais de preferência a dita composição compreendendo a dita partícula do tipo vírus compreende uma pureza de pelo menos 98%, de pre- ferência de pelo menos 99%, em que ainda mais de preferência a quantifica- ção da dita proteína de revestimento é realizada por ensaio de proteína de Bradford, e em que ainda mais de preferência a quantificação do dito oligo- nucleotídeo é realizado essencialmente, de preferência exatamente como descrito no exemplo 9.

A invenção adicionalmente refere-se ao uso de uma composição de nucleotídeo obtenível por qualquer um dos processos da invenção, em um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partí- cula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, em que de preferência o dito processo compreende as etapas de (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão da dita composição de nucleotídeo; (c) geração de uma mistura, em que a dita mis- tura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonu- cleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permis- são que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus; em que de preferência o dito oligonucleotídeo contido na dita composição de nucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, em que mais de preferência o dito bacteriófago de RNA é Οβ, e em que ainda mais de preferência o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8).

A invenção adicionalmente refere-se ao uso de um oligonucleo- tídeo compreendendo um tempo de início de pico relativo de 50 a 110% em um processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partí- cula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus, em que de preferência o dito processo compreende as etapas de (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão do dito oligonucleotídeo, (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura com- preende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus; em que de preferência o dito bacteriófago de RNA é Οβ, e em que mais de preferência o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8).

A invenção adicionalmente refere-se à composição obtenível por qualquer um dos processos da invenção, a dita composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus, em que de preferência o dito bacteriófago de RNA é Οβ, e em que mais de preferência o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8), e em que ain- da mais de preferência a pureza da dita composição é pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais de preferência pelo menos 95%, ainda mais de preferência pelo menos 98% e mais de preferência pelo menos 99%, e em que ainda mais de preferência a dita composição compreenden- do a dita partícula do tipo vírus compreende de 15 a 30 μg, de preferência de 20 a 25 μg, e mais de preferência cerca de 20 μg do dito oligonucleotídeo por 100 μg de proteína de revestimento.

A invenção adicionalmente refere-se à composição obtenível por qualquer um dos processos da invenção, a dita composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus, em que de preferência o dito bacteriófago de RNA é Οβ, e em que mais de preferência o dito oligonucleotídeo é G10 (SEQ ID NO: 8), em que ainda mais de preferência a pureza da dita composição é pelo menos 80%, de pre- ferência pelo menos 90%, mais de preferência pelo menos 95%, ainda mais de preferência pelo menos 98% e com mais preferência pelo menos 99%, em que o dito oligonucleotídeo não é acessível à hidrólise de DNAse.

Exemplos

Exemplo 1

Desagregação e Agregação de oligonucleotídeo G10 (SEQ ID NO: 8)

Quantificação de G10: G10 foi quantificado por absorção de UV a 260 nm corrigido pela absorção a 340 nm, em que 1 A260-340 corresponde a uma concentração de 27,8 μg/ml de comprimento de trajetória de 1 cm.

Desagregação (escala de 10,0 ml. 260 uM de G10. NaOH a 25 mM, 50°C. 70 min): 45,91 mg de G10 foram introduzidos sob pesagem para dentro de um tubo de 15 ml. O pó foi dissolvido em 11,0 ml de água purifica- da (c= 325,3 μΜ; determinado por espectrometria). 8,0 ml do solução de oli- gonucleotídeo foram misturados com 250 μΙ de NaOH a 1 M e 1,75 ml de água purificada em um tubo de 15 ml (260 μΜ de G10, NaOH a 25 mM). A mistura foi desagregada por 70 minutos a 50°C em um banho-maria. Depois do resfriamento da solução no gelo, o pH foi ajustado com HCI a 0,5 M para pH 5,31; 540 μΙ de HCI a 0,5 M e 5 μΙ de NaOH a 1 M foram adicionados.

Agregação (escala de 10.0 ml. 175 uM de G10. Na+a 250 mM. 85°C. 9-24 min): 7,1 ml de solução de G10 desagregada, 2,13 ml de água purificada e 770 μΙ de NaCI a 3 M foram misturados em um tubo de 15 ml (175 μΜ oligo, Na+a 250 mM). A msitura foi incubada por 9 minutos a 85°C em um banho-maria. A solução foi resfriada em um banho com gelo/banho- maria e foi armazenada no gelo até o uso. Soluções de oligonucleotídeo a- gregadas seriam usadas no período de 3 horas depois da preparação.

Exemplo 2

Desagregação e Agregação de Oligonucleotídeos G4-4

Desagregação: a solução de 260 μΜ de oligonucleotídeo G4-4 (SEQ ID NO: 2) e NaOH a 25 mM em água purificada foi preparada. A solu- ção foi aquecida até 50 0C por 70 min e foi então resfriada no gelo, o pH da solução foi ajustado para um pH entre 5 e 8 usando-se HCI a 0,5 M.

Agregação: a solução compreendendo o G4-4 desagregado foi diluída com água purificada e NaCI a 3 M para dar uma concentração final de 230 μΜ de G4-4 e Na+a 250 mM. A mistura foi aquecida até 80 0C usan- do-se uma rampa de aquecimento de 6,8°C/min por vários minutos (de 2 a 70 min). Depois da incubação, a mistura foi resfriada até 0-2°C com uma rampa de temperatura de 6,8°C/min.

Análise do produto por HPLC de exclusão de tamanho (vide E- xemplo 4) revelou que oligonucleotídeo agregado foi obtido, (tempo de início de pico relativo: 88%).

Exemplo 3

Desagregação e Agregação de Olioonucleotídeos

Desagregação: a solução de 260 μΜ de oligonucleotídeo G5-5 (SEQ ID NO: 3), G6-6 (SEQ ID NO: 4), G7-7 (SEQ ID NO: 5), G8-8 (SEQ ID NO: 6), G9-9 (SEQ ID NO: 7) e G11 (SEQ ID NO: 9), respectivamente, e NaOH a 25 mM em água purificada é preparada. A solução é aquecida até 50°C por 70 min e é então resfriada no gelo, o pH da solução é ajustado pa- ra o pH entre 5 e 8 usando-se HCI a 0,5 M.

Agregação: a solução compreendendo o oligonucleotídeo desa- gregado é diluída com água purificada e NaCI a 3 M para dar uma concen- tração final de 230 μΜ de oligonucleotídeo e Na+ a 250 mM. A mistura foi aquecida até 80°C usando-se uma rampa de aquecimento de 6,8°C/min por vários minutos (de 2 a 70 min). Depois da incubação, a mistura foi resfriada até 0-2°C com uma rampa de temperatura de 6,8°C/min.

O produto do processo de agregação é analisado por HPLC de exclusão de tamanho (vide Exemplo 4).

Exemplo 4

Análise do Estado de Agregação de oligonucleotídeo G10 por HPLC de Ex- clusão de Tamanho

O estado de agregação de G10 foi analisado por HPLC de ex- clusão de tamanho analítico usando-se as seguintes condições:

Coluna: TSK gel 5000 PWXL 7,8 mm*30,0 cm (Lote: 5PWX06GNMH3304,

Técnica: 08023, Tosoh Bioscience)

Eluente: PBS (NaCI a 150 mM em tampão de fosafto de sódio a 20 mM, pH 7,2)

Comprimento de onda: 215, 260 e 280 nm, avaliação de dados a 260 nm Temp. do forno da coluna: 25°C Temp. do auto-amostrador: 8°C Capsídeo de bacteriófago Οβ foi usado como padrão.

O tempo de início de pico X% de G10 em relação a capsídeo de

Qβ (tempo de início de pico relativo Οβ) foi calculado como se segue: X% = tempo de início de pico [min] do oligonucleotídeo dividido pelo tempo de re- tenção do Padrão de capsídeo de Qpa[min] χ 100%, em que o tempo de iní- cio de pico do oligonucleotídeo foi determinado como o tempo quando a elu- ição do oligonucleotídeo se tornou detectável, e em que o tempo de retenção do padrão de capsídeo de Οβ foi determinado como o tempo da ocorrência do pico máximo do padrão. Um exemplo de um perfil de eluição de oligonu- cleotídeo G10 e capsídeo de bacteriófago Οβ como padrão é mostrado na figura 1. Com base nos cromatogramas mostrados na figura 1 um tempo de início de pico relativo de 88% calculado para o oligonucleotídeo agregado. Exemplo 5

Comparação dos tempos de início de pico relativo de oligonucleotídeo G10 não-tratado, desagregado e agregado

O tempo de início de pico relativo de G10 desagregado e agre- gado preparado essencialmente como descrito no exemplo 1 foi determinado e foi comparado com o tempo de início de pico relativo de G10 não-tratado como obtido a partir de um fornecedor comercial. G10 desagregado mostrou um tempo de início de pico relativo de 138% (de 136,9 - 140,3%; η = 5). Preparações de G10 que não sofreram um tratamento de desagrega- ção/agregação descrito no exemplo 1 mostram um tempo de início de pico relativo na mesma faixa que G10 desagregado. Depois da desagregação e da agregação, tempo de início de pico de G10 demonstrou ser 88%. Exemplo 6

O Impacto da Etapa de Desagregação

Oligonucleotídeo G10 não-tratado e oligonucleotídeo G10 desa- gregado como descritos no exemplo 1 foram submetidos a agregação es- sencialmente como descrito no exemplo 1, em que as seguintes condições de agregação foram escolhidas: G10 a 175 μΜ, Na+ a 250 mM (por adição de NaCI a 3 M), incubação a 85°C por 16 minutos, então resfriamento no gelo. Ambas as preparações foram analisadas por HPLC de exclusão de tamanho (vide exemplo 4) usando-se capsídeo de Οβ e G10 não-tratado como padrão. Os cromatogramas de HPLC resultantes são mostrados na figura 2.

G10 não-tratado continha G10 agregado (vide a figura 2A e 2 B, caixa 1). G10 agregado que não foi desagregado antes da agregação mos- trava um peso molecular aparente equivalente ou mais alto do que capsídeo de Οβ (figura 2A, caixa 2). O tempo de início de pico relativo era cerca de 75%. G10 agregado que foi desagregado antes da agregação exibia um pe- so molecular aparente mais baixo do que capsídeo de Οβ (figura 2B, caixa 2). O tempo de início de pico relativo era cerca de 88%. Exemplo 7

Análise do Estado de Agregação de Oligonucleotídeo G10 por Dicroismo Circular

Espectros de CD de G10 não-tratado, desagregado e agregado (preparado essencialmente como descrito no exemplo 1) bem como de cap- sídeo de Οβ acondicionados com G10 (QbG 10 obtido como descrito no e- xemplo 10) foram registrados entre 200 nm e 300 nm em um espectrofotô- metro JASCO J-715. (figura 3). O espectro de G10 agregado é caracterizado por uma banda positiva forte (altamente elíptica) com um máximo a 262 nm e uma tina a 240 nm. Esses sinais são relatados para corresponder ao es- pectro típico de DNA tetraplexos com uma orientação paralela de filamentos (Lu et al., Biochemistry 31, p.2455, 1992). De modo importante, a forma do espectro de CD na região de 250 nm - 300 nm não muda nos espectros de VLPs montados na presença de G10 agregado. Assim, G10 não pareceu sofrer uma mudança conformacional no acondicionamento. O aumento leve da amplitude a 262 nm possivelmente reflete o acondicionamento seletivo de G10 agregado em capsídeos de Οβ que resulta em uma proporção mais alta de tetraplexos depois do acondicionamento em comparação com G10 agre- gado que ainda contém uma fração de moléculas não agregadas. Em con- traste com isso, o espectro de G10 não-tratado é caracterizado por baixa elipticidades sem máxima definida indicando uma falta de elementos de es- trutura secundária e terciária definidos. Baixos sinais de CD são também observados para G10 desagregado apesar da ocorrência de um máximo a295 nm e um mínimo a 262 nm pudesse refletir a presença de alguns con- formadores tetraplexo antiparalelo (P. Balagurumoorthy et al., Nucleic Acids Research 20, p. 4061, 1992). Exemplo 8

Acondicionamento de VLPs de QB com G10 por Desmonta- qem/Reaqrupamento

Desmontaqem de VLPs de Οβ: 45 mg de VLP de Οβ (2,5 mg/ml, como determinado por análise de Bradford) em PBS (fosfato a 20 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,5) foram reduzidos com DTT a 10 mM por 15 min a tempe- ratura ambiente sob condições de agitação. Então, cloreto de magnésio foi adicionado à concentração final a 0,7 M e a incubação foi continuada por 15 min em temperatura ambiente sob condições de agitação, levando à precipi- tação do RNA de célula hospedeira encapsulado e desintegração concomi- tante das VLPs. A solução foi centrifugada 10 min a 4000 rpm a 4°C (Ep- pendorf 5810 R, em rotor de ângulo fixo A-4-62 usado em todas as seguintes etapas) a fim de remover o RNA precipitado a partir da solução. O sobrena- dante, contendo a proteína de revestimento de Οβ dimérica liberada, foi u- sado para as etapas de purificação cromatográficas. Purificação de proteína de revestimento de Qp por cromatoqrafia de troca de cátion e cromatoqrafia de exclusão de tamanho: o sobrenadante da reação de desmontagem, contendo proteína de revestimento dimérica, proteínas de célula hospedeira e RNA de célula hospedeira residual, foi car- regado sobre uma coluna de SP-Sepharose FF (xkl6/20, 6 ml, Amersham Bioscience). A coluna foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio a 20 mM pH 7 e a amostra foi diluída 1:15 em água para ajustar uma condutivida- de abaixo de 10 mS/cm a fim de alcançar ligação adequada da proteína de revestimento à coluna. A eluição da proteína de revestimento ligada foi reali- zada por um gradiente de etapa a fosfato de sódio a 20 mM/cloridrato de sódio a 500 mM e a proteína foi coletada em um volume de fração de cerca de 25 ml. A cromatografia foi realizada à temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 5 ml/min durante todas as etapas e a absorbância foi moni- torada a 260 nm e 280 nm. Em uma segunda etapa, a proteína de revesti- mento de Οβ isolada (a fração eluída oriunda da coluna de troca de cátions) foi carregada sobre uma coluna de Sephacryl S-100 HR (xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience) equilibrada com fosfato de sódio a 20 mM/cloreto de sódio a 250 mM; pH 7,2. A cromatografia foi realizada à temperatura ambi- ente com uma taxa de fluxo de 2,5 ml/min e a absorbância foi monitorada a 260 nm e 280 nm. Frações de 5 ml foram coletadas.

Caracterização de proteína de revestimento de Οβ purificada por cromatografia de exclusão de tamanho analítico: a amostra de proteína de revestimento de Οβ purificada foi analisada por cromatografia de exclusão de tamanho analítico (figura 1C) e em comparação com i) VLP de Οβ intacta (figura 4A), que tinha sido purificada de Iisado de E.coli e que foi usada co- mo material de fonte para um procedimento de purificação, e ii) com o so- brenadante da reação de desmontagem (figura 4B). Separação eficiente de moléculas de RNA da proteína de revestimento é indicada pela ausência de qualquer pico de tipo de RNA (razão típica de A280/A260 = 0,5) na figura 4C e a presença de um único pico de tipo proteína (razão típica de A280/A260 = 1,7).

Montagem de ΟβΘΙΟ por diafiltração: proteína de revestimento purificada (em fosfato de sódio a 20 mM pH 7,2, NaCI a 250 mM) foi mistu- rada com água e soluções de estoque de uréia, NaCI, DTT e oligonucleotí- deo de G10 agregado (preparado essencialmente como descrita no exemplo1). O volume da mistura foi 50 ml e as concentrações finais dos componen- tes foram de 1 mg/ml de proteína de revestimento, uréia a 1,0 M, NaCI a 250 mM, DTT a 2,5 mM e 0,24 mg/ml de G10. A solução foi então diafiltrada à temperatura ambiente contra 300 ml de fosfato de sódio a 20 mM NaCI a250 mM pH 7,2, usando-se um cartucho de corte de 30 kDa (Pellicon XL, Millipore) e uma taxa de fluxo cruzada de 10 ml/min e uma taxa de fluxo de permeato de 2,5 ml/min. H2O2 foi adicionado à concentração final a 7 mM e a solução foi incubada por 1 h à temperatura ambiente a fim de induzir a formação de ligações de dissulfeto. A solução foi então diafiltrada contra 500 ml de fosfato de sódio a 20 mM NaCI a 150 mM pH 7,2, usando-se um car- tucho de corte de 300 kDa (Pellicon XL, Millipore) e uma taxa de fluxo cruza- da de 10 ml/min e uma taxa de fluxo de permeato de 2,5 ml/min, a fim de remover o excesso de H2O2 e oligonucleotídeos de G10 não acondicionados a partir do produto de ΟβΘΙΟ montado. Exemplo 9

Análise de produto de acondicionamento de Q3G10 e Determinação de Rendimento do Processo de Acondicionamento

Caracterização de VLP de QBG10 acondicionada por cromato- grafia de exclusão de tamanho analítico: a amostra de VLP de Οβ de G10 acondicionada foi analisada por cromatografia de exclusão de tamanho ana- lítico (figura 5) e em comparação com VLP de Οβ intacta, que tinha sido puri- ficada de Iisado de E. coli lysate. A dita cromatografia de exclusão de tama- nho analítico foi realizada usando-se os seguintes parâmetros: Coluna: Bio-Sil SEC 250, 7,8 χ 300 mm, Cat. N9 125-0062 Eluente: fosfato de sódio a 50 mM pH 6,5, NaCI a 150 mM Gradiente: Isocrático Temperatura de Coluna: 25°C

Temperatura de auto-amostrador: 8°C Taxa de fluxo: 1,0 ml/min Concentração de amostra: 1,0 mg/ml de proteína Volume de injeção: 40 μΙ Avaliação de comprimento de onda: 280 nm Amplitude de banda: 4 nm Tempo da experiência: 20 min

Preparação de amostra: a amostra foi diluída a 1,0 mg/ml usan- do-se eluente, a amostra foi turbilhonada logo e foi centrifugada a 16.000 g por 10 minutos a 4°C.

A presença da VLP corretamente montada no produto foi confir- mada por um pico que migra no tempo de retenção idêntico que o pico que representa VLP de Οβ nativa. O pico observado para VLP de Οβ G10 (figura5D) é dominado pelo teor de ácido nucléico da VLP, uma vez que o coefici- ente de absorção de ácidos nucléicos a 260 nm é mais do que 100 vezes mais alto do que o coeficiente de absorção da proteína de revestimento. A razão de A260/A280 de VLP de Οβ G10 purificada demonstrou ser 1,70 (1,65 - 1,76; η = 5), que é característica para G10 (A260/A280 = 1,74), em que a razão de A260/A280 de VLP de Οβ demonstrou ser 1,87 (1,85 - 1,90; η = 10) que é característica para RNA.

Caracterização de QBG10 VLP acondicionada por análise de SDS-PAGE: a amostra de Οβ G10 acondicionada foi analisada por não- redução de SDS-PAGE (figura 6) e em comparação com VLP de Οβ intacta, que foi purificada de Iisado de E. coli. A presença de VLP corretamente mon- tada no produto foi confirmada pela formação de bandas de formas hexamé- ricas e pentaméricas ligadas a dissulfeto da proteína de revestimento, simila- res àquelas de VLPs de Οβ intactas, indicando a disposição estrutural corre- ta das unidades de proteína de revestimento nas VLP de ΟββΙΟ montada in vitro.

Quantificação de oliaonucleotídeo G10 acondicionado: amostras de VLP de G10 de Qbeta (0,25 mg/ml em PBS) foram tratadas por TCEP a0,1 mM (Tris(2-cloroetil)fosfato) (15 min à temperatura ambiente) a fim de reduzir as ligações de dissulfeto. NaCI foi adicionado às amostras reduzidas (concentração final a 1 M) e as misturas foram incubadas por 15 min a 60°C a fim de precipitar o componente de proteína. Depois da centrifugação, os sobrendantes resultantes foram incubados por 5 min a 95°C, foram resfria- dos no gelo por 1 min e então o valor de A260 foi medido. A concentração de oligonucleotídeo G10 no sobrenadantes foi calculado de acordo com a fórmula:

c(G10) (mg/ml) = A260X 1,12x9600/344580, onde: 1,12 = fator de correção para o teor de sal na amostra 9600 = massa molecular de oligonucleotídeo G10 344580 = coeficiente de absorção específico de oligonucleotídeo G10.

Tipicamente, a quantidade de acondicionado oligonucleotídeo

G10 era de 0,2 mg por mg de proteína de revestimento de Οβ.

O teor de G10 de VLP de QBGIOe cálculo de rendimento para o acondicionamento da reação: G10 agregado foi acondicionado para formar VLP de Οβ por montagem/reagrupamento da VLP como descrita no exemplo 8, 953 mg de oligonucleotídeo G10 foram introduzidos para o reagrupamento com 4000 mg de dímero de Οβ purificado. A reação forneceu ΟβΰΙΟ com- preendendo 20 μg de oligonucleotídeo G10 por 100 μg de proteína (teor de proteína determinado por análise de Bradford ou HPLC). O rendimento de G10 da reação de acondicionamento era de 63% a um rendimento de prote- ína de 75%.

Exemplo 10

Montagem de QBG10 por Diafiltração e Determinação de Rendimento

Proteína de revestimento purificada de Οβ foi obtida essencial- mente como descrita no exemplo 8. Proteína de revestimento no fosfato de sódio a 20 mM pH 7,2, NaCI a 250 mM foi misturada com água e soluções de estoque de uréia, NaCI1 DTT e oligonucleotídeo de G10 agregado (prepa- rado essencialmente como descrita no exemplo 1; tempo de início de pico relativo de G10 desagregado foi de 135%, tempo de início de pico relativo de G10 agregado foi de 88%). O volume da mistura foi de 1,6 L e as concentra- ções finais dos componentes eram de 2,5 mg/ml de proteína de revestimen- to, uréia a 1,0 M, NaCI a 250 mM, DTT a 2,5 mM e 0,6 mg/ml de G10. A so- lução foi então diafiltrada à temperatura ambiente contra 9,6 L de fosfato de sódio a 20 mM NaCI a 250 mM pH 7,2, usando-se um cartucho de corte de 30 kDa (Pellicon Mini2, área de filtragem de 0,1 m2, Millipore) e uma taxa de fluxo cruzada de 384 L/(h*m2) e uma taxa de fluxo de permeato de 96 L/(h*m2). H2O2 foi adicionado à concentração final a 2 mM e a solução foi incubada por 1 h à temperatura ambiente a fim de induzir a formação de li- gações de dissulfeto. A solução foi então diafiltrada contra 16 L de fosfato de sódio a 20 mM NaCI a 150 mM pH 7,2, usando-se um cartucho de corte de 300 kDa (Pellicon Mini 2, área de filtragem de 0,1 m2, Millipore) e uma taxa de fluxo cruzada de 300 l/(h*m2) e uma taxa de fluxo de permeato de 100 l/(h*m2), a fim de remover excesso de H2O2 e oligonucleotídeos de G10 não acondicionados a partir do produto de QbetaGIO montado. O produto foi concentrado para dar 2,5 mg/ml por filtração de fluxo tangencial e foi filtrado através de um filtro de 0,22 μηι. As etapas de processo principais são suma- rizadas na tabela 1.

Tabela 1: Sumário das etapas de processo para a montagem e purificação de QBG10.

<table>table see original document page 54</column></row><table> Continuação...

Etapa de processo Parâmetros Saída da etapa de processo Reagregação da solução de G10 G10 concentração: 175 μΜ Concentração de Na+: 250 mM Temperatura: 85°C Tempo de aquecimen- IOminutos to: Escala: 1,1 g de G10, V = 654 ml (em alíquotas de 10 ml) Tempo de iní- cio de pico relativo de G10: 88% Descongelamento do material de partida Temperatura: 22°C Solução de dimétro de Οβ Preparação da mistura de rea- grupamento Concentração de díme- 2,5 mg/ml ro: Concentração de uréia: 1 M Concentração de DTT 2,5 mM G10 concentração: 62,5 μΜ Tempo de misturação: 60 ± 10 mi- nutos Temperatura: 22 ± 3°C Escala: 4 g de dímero de Οβ, V = 1,6 I Solução para a diafiltração 1 diafiltração contí- nua 1 Membrana: 30 kDa MW- CO Área: 0,1 m2 Volumes de diafiltra- 6 9,6 L de ção: permeato coletado) Tampão NaP250 pH 7,2 Duração de alvo: 60 minutos Temperatura: 22°C Fluxo: 96 l/(h*m2) V= 1,6 I O dímero de Οβ forma VLPs em volta do material de núcleo de G10 devido a rea- ção de uréia e DTT Continuação...

<table>table see original document page 56</column></row><table>

A pureza do produto foi analisada por cromatografia de exclusão de tamanho demonstrou ser 99,28%, isto é, o pico de QbGIO equivaleu a 99,28% da área de pico total de um teste cromatográfico como descrita no exemplo 4. Rendimento de proteína e rendimento de oligonucleotídeo foram determinados como descritos no exemplo 8. O rendimento de proteína atra- vés do processo total foi de 75%. O rendimento de oligonucleotídeo através do processo total foi de 75%. Exemplo 11

Impacto do Estado de Agregação de G10 em um processo de montagem

Quando G10 com um tempo de início de pico relativo de 139% foi usado em um proceso de montagem como descrito no exemplo 8, apenas quantidades desprezíveis de GbGIO foram formadas e nenhum produto de VLP poderia ser isolado. Exemplo 12

Acondicionamento de VLPs de AP205 e de GA355 com G10 por Desmonta- gem/Reagrupamento Desmontaoem: 50-100 mg de VLPs de AP205 ou GA355 (como

determinado por análise de Bradford) em tampão A (NaPO4 a 5 mM pH 6,8, NaCI a 100 mM, MgCI2 a 2 mM) foram incubados a 30°C por 16 horas com RNAse A (Sigma) e Benzonase (Novagen) a 1 mg/ml e 5 U/ml, respectiva- mente. No caso de desoxidação de VLP de AP205 das pontes de dissulfeto internas, foi realizada anteriormente a adição de RNAse A e Benzonase por adição de DTT a 2 mM seguido por uma incubação de 30 min a 37 0C. De- pois da adição de precipitação de NaCI a 1 M das proteínas de revestimento virais foi induzida por incubação de 15 min a 70°C. Proteínas de revestimen- to precipitadas foram sedimentadas por centrifugação por 10 min, 27.000 g a4°C. O sobrenadante contendo RNAse A, Benzonase e ácidos nucléicos de- gradados foi descarregado. Péletes foram ressuspensos em tampão B (Na- P04 a 20 mM pH 7,2, uréia a 6 M) e foram incubadas por 10 min a tempera- tura ambiente.

Purificação de Proteínas de revestimento por cromatografia de troca de Cátion: as soluções foram clarificadas por centrifugação por 10 min,27.000 a 4°C. Um pélete desprezível foi descarregado. E o sobrenadante contendo as proteínas de revestimento desmontadas foi aplicado em uma coluna de SP SepharoseTM FF (16/20, Amersham Biosciences) equilibrada com tampão B (NaPO4 a 20 mM pH 7,2, uréia a 6 Μ). O material escoável foi descarregado. Depois de uma lavagem extensa com tampão B (15 CV) a coluna foi ajustada com um gradiente linear oriundo do tampão B para tam- pão C (NaPO4 a 20 mM pH 7,2, uréia a 1 M) com um comprimento de gradi- ente de 37,5 CV. Durante o carregamento, lavagem e eluição, a absorbância a 254 nm e 280 nm foi monitorada. Proteínas de revestimento foram eluídas como uma fração com tampão D (NaPO4 a 20 mM pH 6,5, uréia a 1 M, NaCI a 300 mM) e foram analisadas por LDS-PAGE seguido por manchamento com Coomassie. Frações de proteína eluídas foram armazenadas a 4°C como "proteína de revestimento desmonstada". Concentrações de proteína foram determinadas por análise de Bradford.

Reagrupamento: proteína de revestimento AP205 ou GA355 pu- rificada foi usada em excesso de cinco vezes (p/p) para oligonucleotídeo G10. As proteínas de revestimento foram misturadas com o oligonucleotídeo G10 em um tampão de reagrupamento contendo uréia a 1 M e DTT a 2,5 mM e foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Depois da incubação, a mistura de reagrupamento foi dialisada por 24 horas contra 5 litros de PBS. A suspensão resultante foi centrifugada por 10 min, 27.000 g a4°C. Um sedimento desprezível foi descarregado. O sobrenadante continha as VLPs reagrupadas e acondicionadas. Concentração de proteína foi de- terminada por análise de Bradford e as VLPs reagrupadas e acondicionadas foram concentradas com dispositivos de filtragem de centrífuga (Amicon Ul- tra 15, 10K MWCO).

Purificação de VLPs reagrupadas e acondicionadas: até 25 mg

de proteína total foram carregados sobre uma SepharoseTM CL-4B (26/60, Amersham Biosciences) eguilibrada com PBS. Cromatografia de exclusão de tamanho foi realizada com tampão de equilibração a temperatura ambien- te com uma taxa de fluxo de 1,25 ml/min. Durante a eluição absorbância a254 nm e 260 nm foi monitorada. Os picos foram isolados. Um principal pico de alto peso molecular precedeu um pico pequeno de um peso molecular aparente mais baixo. O pico principal revelou a um peso molecular aparente consistente com VLPs purificadas como mostrado por SE-HPLC. Análise de VLPs de AP205 ou GA355 acondicionadas com oligonucleotídeo G10 é rea- Iizada essencialmente como mostrada no exemplo 16 do WO 03/024481 (p.131 ff). Exemplo 13

Acondicionamento de VLPs de FR com G10 por Desmonta- gem/Reagrupamento

Desmontagem: 50-100 mg de VLPs de FR (como determinado por análise de Bradford) em tampão A (NaPO4 a 5 mM pH 6,8, NaCI a 100 mM, MgCI2 a 2 mM) são incubados a 30°C por 16 horas com RNAse A (Sig- ma) e Benzonase (Novagen) a 1 mg/ml e 5 U/ml, respectivamente. Depois adição de precipitação de NaCI a 1 M das proteínas de revestimento de FR é induzida por uma incubação de 15 min a 70°C. Proteínas de revestimento precipitadas são sedimentadas por centrifugação por 10 min, 27.000 g a 4°C. O sobrenadante contendo RNAse A. Benzonase e ácidos nucléicos de- gradados são descarregados. O pélete é ressuspenso em tampão B (NaPO4 a 20 mM pH 7,2, uréia a 6 M) e é incubada por 10 min à temperatura ambi- ente.

Purificação de proteínas de revestimento de Fr por cromatografia de troca de cátion: a solução é clarificada por centrifugação por 10 min, 27.000 g a 4°C. Uma pélete desprezível é descarregado e o sobrenadante contendo as proteínas de revestimento desmontadas é aplicado em uma coluna de SP SepharoseTM FF (16/20, Amersham Biosciences) eguilibrada com tampão Β. O material escoável é descarregado. Depois uma lavagem extensa com tampão B (15 CV) a coluna é ajustada com um gradiente linear oriundo do tampão B para tampão C (NaPO4 a 20 mM pH 7,2, uréia a 1 M) com um comprimento de gradiente de 37,5 CV. Durante o carregamento, lavagem e eluição a absorbância a 254 nm e 280 nm é monitorada. Proteí- nas de revestimento FR são eluídas como uma fração com tampão D (Na- PO4 a 20 mM pH 6,5, uréia a 1 M, NaCI a 300 mM) e são analisadas por LDS-PAGE seguido por manchamento de Coomassi. As frações de proteína eluídas são armazenadas a 4°C como "proteína de revestimento desmonta- da". Concentração de proteína é determinada por análise de Bradford.

Reaorupamento: proteína de revestimento FR purificada é usada em excesso de cinco vezes (p/p) para oligonucleotídeo G10. As proteínas de revestimento FR são misturadas com o oligonucleotídeo G10 em um reagru- pamento de tampão contendo uréia a 1 M e DTT a 2,5 mM e são incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Depois da incubação, a mistura de reagrupamento é dialisada por 24 horas contra 5 litros de PBS. A suspensão resultante é centrifugada por 10 min, 27.000 g a 4°C. Um sedimento despre- zível é descarregado. O sobrenadante contém as VLPs de FR reagrupadas e acondicionadas. Concentração de proteína é determinada por análise de Bradford e as VLPs de FR reagrupadas e acondicionadas são concentradas com dispositivos de filtragem de centrífuga (Amicon Ultra 15, 10K MWCO).

Purificação de VLPs de FR reagrupadas e acondicionadas: até 25 mg de proteína total são carregados sobre uma SepharoseTM CL-4B (26/60, Amersham Biosciences) equilibrada com PBS. Cromatografia de ex- clusão de tamanho é realizada com tampão de equilibração a temperatura ambiente com uma taxa de fluxo de 1,25 ml/min. Durante a eluição absor- bância a 254 nm e 260 nm é monitorada. Dois picos são isolados. Um pico principal de alto peso molecular precede um pico pequeno de um peso mo- lecular aparente mais baixo. O pico principal revela um peso molecular apa- rente consistente com VLPs de FR purificadas como mostradas por SE- HPLC. Análise de VLPs de FR acondicionadas com oligonucleotídeo G10 é realizada essencialmente como mostrada no exemplo 16 de WO 03/024481 (p. 131 ff). Exemplo 14

Montagem de ΟβΘ8 por diafiltração e Determinação de Rendimento

Proteína de revestimento purificada de Οβ é obtida essencial- mente como descrita no exemplo 8. Proteína de revestimento em fosfato de sódio a 20 mM pH 7,2, NaCI a 250 mM é misturada com água e soluções de estoque de uréia, NaCI, DTT e G8 oligonucleotídeo agregado (preparado essencialmente como descrita no exemplo 3; tempo de início de pico relativo de G8 desagregado é 113%, tempo de início de pico relativo de G8 agrega- do é 88%). O volume da mistura é 1,6 L e as concentrações finais dos com- ponentes são 1 mg/ml de proteína de revestimento, uréia a 1,0 M, NaCI a 250 mM, DTT a 2,5 mM e 0,24 mg/ml de G8. A solução é então diafiltrada à temperatura ambiente contra 9,6 L de fosfato de sódio a 20 mM NaCI a 250 mM pH 7,2, usando-se um cartucho de corte de 30 kDa (Pellicon Mini2, área de filtragem de 0,1 m2, Millipore) e uma taxa de fluxo cruzada de 384 L7(h*m2) e uma taxa de fluxo de permeato de 96 L/(h*m2). H2O2 é adicionado a uma concentração final a 2 mM e a solução é incubada por 1 h à tempera- tura ambiente a fim de induzir a formação de ligações de dissulfeto. A solu- ção é então diafiltrada contra 16 L de fosfato de sódio a 20 mM NaCI a 150 mM pH 7,2, usando-se um cartucho de corte de 300 kDa (Pellicon Mini 2, área de filtragem de 0,1 m2, Millipore) e uma taxa de fluxo cruzada de 300 l/(h*m2) e uma taxa de fluxo de permeato de 100 l/(h*m2), a fim de remover o excesso de H2O2 e oligonucleotídeos G8 não acondicionados a partir do produto de ΟβΘ8 montado. O produto é concentrado para dar 2,5 mg/ml por filtração de fluxo tangencial e é filtrado através de um filtro de 0,22 μιτι. Listagem de Seqüências

<110> Cytos Biotechnology AG Kinzler, Matthias Proba, Karl

<120> "PROCESSOS PARA ACONDICION AMENTO DE OLIGONUCLEOTÍDEOS EM PARTÍCULAS DO TIPO VÍRUS DE BACTERIÓFAGOS DE RNA"

<130> PIO7OPCOO

<150> US 60/812,592

<151> 2006-06-12

<150> PCT/EP2006/069734

<151> 2006-12-14

<160> 23

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 10

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamente sintetizado

<400> 1

gacgatcgtc 10

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <22 0>

<223> Quimicamente sintetizado

<400> 2

gggggacgat cgtcgggg 18

<210> 3

<2ll> 20

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamentesintetizado

<400> 3

ggggggacga tcgtcggggg 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Quimieamente sintetizado <400> 4

gggggggacg atcgtcgggg gg

22

<210> 5

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<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamente sintetizado

<400> 5

ggggggggac gatcgtcggg gggg 24

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<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamentesintetizado

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<2ll> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamentesintetizado

<400> 7

gggggggggg acgatcgtcg gggggggg 28

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamente sintetizado

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Quimicamente sintetizado

<400> 6

ggggggggga cgatcgtcgg gggggg

26

<400> 8

gggggggggg gacgatcgtc gggggggggg

30

<400> 9

gggggggggg ggacgatcgt cggggggggg gg

32 <formula>formula see original document page 64</formula> Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95

Phe 1Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140

Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro 145 150 155 160

Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu 165 170 175

Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala 180 185 190

Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp VaI Ala Leu Lys Asp Leu Leu 195 200 205

Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 210 215 220

Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240

Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu 245 250 255

Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu 260 265 270

Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His 275 280 285

Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300

Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile 305 310 315 320

Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala 325

<210> 12

<211> 129

<212> PRT

<213> bacteriophaçe R17

<400> 12

Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15

Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30

Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45

Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val 50 55 60

Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cya Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110

Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125

Tyr

<210> 13 <211> 130 <212> PRT

<213> bacteriophage fr <400> 13

Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15

Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30 Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser 35 40 45

Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu 50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 BO

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe 85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr 100 105 110

Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125

Ile Tyr 130

<210> 14 <211> 130 <212> PRT

<213> bacteriophage GA <400> 14

Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15

Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30

Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr 35 40 45

Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val 50 55 60

Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn GIy Val Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 BO

Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95

Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110 Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe IlS 120 125

Tyr Ala

130

<210> 15 <211> 132 <212> PRT <213> bacteriophage SP <400> 15

Met Ala Lys Leu Asn Gln 1 5

10 15

Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys 50 55 60

Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe 85 90 95

Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 16 <211> 329 <212> PRT

<213> bacteriophage SP <400> 16

Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp 15 10 15

Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly vai 20 25 30 Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val 35 40 45

Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val 50 55 60

Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp 65 70 75 80

Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr 85 90 95

Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala 100 105 110

Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Aap Ala Ile Asp Asn Leu Asn 115 120 125

Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp 130 135 140

Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro 145 150 155 160

Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly 165 170 175

Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg 180 185 190

Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205

Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 210 215 220

Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp 225 230 235 240

Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly 245 250 255

Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu 260 265 270

Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Aep Leu Ser Glu Val Thr Ala 275 280 285 Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300

Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro 305 310 315 320

Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser 325

<21Q> Π <211> 130 <212> PRT

<213> bacteriophage MS2 <400> 17

Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15

Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu 20 25 30

Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cye Ser

35 40 45

Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu 50 55 60

Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val 65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe 85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu 100 105 110

Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125

Ile Tyr 130

<210> 18

<211> 133

<212> PRT

<213> bacteriophage Mll

<400> 18 Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly 15 10 15

Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Het Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn

115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 19 <211> 133 <212 > PRT

<213> bacteriophage MXl <400> 19

Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly lie Gly Lys Asn Gly 15 10 15

Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser 85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Het Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 20 <211> 330 <212> PRT

<213> bacteriophage NL95 <400> 20

Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly lie Gly Lys Ala Gly 1 5 10 15

Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Val Gln lie Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe 85 90 95

Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly 130 135 140

Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro 145 150 155 160

Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly 165 170 175 Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys 180 185 190

Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205

Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp 210 215 220

Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp 225 230 235 240

Ala Ser Val Het Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp 245 250 255

Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr 260 265 210

Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala 275 280 285

Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300

Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro 305 310 315 320

Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu 325 330

<210> 21 <211> 129 <212> PRT <213> bacteriophage f2 <400> 21 Ala Ser Asn Phe Thr Gln

10 15

Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp 20 25 30

Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val 35 40 45

Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val 50 55 60 Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala 65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110

Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Aan Ser Gly Ile 115 120 125

Tyr

<210> 22

<2ll> 128

<212> PRT

<213> baeteriophage PP7

<400> 22

Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu 1 5 10 15

Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val 20 25 30

Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn 35 40 45

Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp 50 55 60

Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg 65 70 75 80

Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr 85 90 95

Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala 100 105 110

Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg 115 120 125

<210> 23

<211> 131

<212> PRT

<213> baeteriophage AP205 <400> 23

Met Aia Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile 1 5 10 15

Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu 20 25 30

Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser 35 40 45

Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly 50 55 60

Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg 65 70 75 80

Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu 85 90 95

Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn 100 105 110

Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp 115 120 125

Thr Thr Ala 130

Claims

1. Processo para a produção de uma composição de nucleotídeo compreendendo um oligonucleotídeo, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão de um oligonucleotídeo na solução I, em que o dito oligonucleotídeo pelo menos uma extensão de poly G; e em que a dita solu- ção I compreende um pH alcalino; (b) desagregação do dito oligonucleotídeo, em que a dita desa- gregação compreende as etapas de: (i) ajuste da temperatura da solução I para a temperatura I, em que a dita temperatura I é de 4 a 70°C; (ii) incubação do dito oligonucleotídeo na dita solução I na dita temperatura I, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucle- otídeo compreenda um tempo de início de pico relativo acima de 110%; e (iii) ajuste da temperatura da dita solução I para a temperatura II, em que a dita temperatura Il é de 0 a 70°C. (c) ajuste do pH da dita solução I para pH de 5 a 8; e (d) agregação do dito oligonucleotídeo, em que a dita agregação compreende as etapas de: (i) provisão do dito oligonucleotídeo na solução II, em que a dita solução Il compreende pH de 5 a 8 e pelo menos 20 mM de um cátion, em que o dito cátion é selecionado do grupo que consiste em Na+, K+, NH4+, Li+, Ca2+, e Mg2+; (ii) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura III, em que a dita temperatura Ill é de 50 a 99°C; (iii) incubação do dito oligonucleotídeo na solução Il a temperatu- ra III, em que a dita incubação é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; e (iv) ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV, em que a dita temperatura IV está abaixo de 50°C.

2. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita temperatura I é de 45 a 70°C, de preferência cerca de 50°C, e mais de preferência 50°C.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita temperatura Il está abaixo de temperatura I, e em que de preferência temperatura Il é de 0 a 25°C, mais de preferência de Oa 2°C.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita temperatura Ill é de 80 a 90°C, de preferência cerca de 85°C, mais de preferência 85°C.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito ajuste da temperatura da dita solução I para a temperatura Il é realizado com uma rampa de temperatura de pelo menos -3,6°C/min.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita temperatura IV é de 0 a 25°C, de preferência de -0 a 2°C.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, ajuste da temperatura da solução Il para a temperatura IV é realizado com uma rampa de temperatura de menos 3,6°C/min.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita solução I compreende um pH de 8 a 13, de pre- ferência de 12.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita solução I compreende um hidróxido de um metal alcalino, de preferência hidróxido de potássio ou hidróxido de sódio, mais de preferência hidróxido de sódio, em que a concentração do dito hidróxido é de -10 mM a 200 mM, de preferência cerca de 25 mM, mais de preferência 25 mM.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito ajuste do pH da dita solução I é realizado pela adição de ácido à dita solução I, em que de preferência o dito ácido é o áci- do fosfórico.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito ajuste do pH da dita solução I é realizado até que o dito pH seja de 6 a 7.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito cátion é Na+ ou K+, em que de preferência o dito cátion é Na+.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita solução Il compreende de 200 a 275 mM do dito cátion, de preferência 250 mM.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a concentração do dito oligonucleotídeo na dita solu- ção I é de 50 μΜ a 2 mM, mais de preferência 260 μΜ.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a concentração do dito oligonucleotídeo na dita solu- ção Il é de 50 μΜ a 2 mM, de preferência de 100 a 300 μΜ mais de prefe- rência175μM.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a dita incubação do dito oligonucleotídeo na solução Il a temperatura Ill é realizada até que o dito oligonucleotídeo compreenda um tempo de início de pico relativo de 80 a 95%, de preferência de 80 a 90%, ainda mais de preferência de 83 a 90%, ainda mais de preferência de 85 a 90%, e com mais preferência de 88%.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito oligonucleotídeo compreende em sua extremi- dade 5' pelo menos 3 e no máximo 15 entidades de guanosina e em sua ex- tremidade 3' pelo menos 3 e no máximo 15 entidades de guanosina.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito oligonucleotídeo compreende uma seqüência palindrômica, em que de preferência a dita seqüência palindrômica é GAC- GATCGTC (SEQ ID NO: 1), e em que mais de preferência a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 5' por pelo menos 3 e no máximo 15 entidades de guanosina e em que a dita seqüência palindrômica é flanqueada em sua extremidade 3' por pelo menos 3 e no máximo 15 enti- dades de guanosina.

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito oligonucleotídeo compreende de 10 a 1000 nu- cleotídeos, de preferência de 10 a 200 nucleotídeos, mais de preferência de 10 a 100 nucleotídeos, ainda mais de preferência de 20 a 40 nucleotídeos, com mais preferência de 30 nucleotídeos.

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito oligonucleotídeo compreende uma seqüência de ácidos nucléicos selecionada do grupo que consiste em: (a) "G4-4" GGGGGACGATCGTCGGGG (SEQ ID NO: 2); (b) "G5-5" GGGGGGACGATCGTCGGGGG (SEQ ID NO: 3); (c) "G6-6" GGGGGGGACGATCGTCGGGGGG (SEQ ID NO: 4); (d) "G7-7" GGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGG (SEQ ID NO: 5); (e) "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (SEQ ID NO: 6); (f) "G9-9" GGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 7); (g) "G10" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8); (h) "G11" GGGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 9).

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o dito oligonucleotídeo tem a seqüência de ácidos nu- cléicos "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (SEQ ID NO: 6).

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 21, em que o dito oligonucleotídeo tem a seqüência de ácidos nucléi- cos "G10" GGGGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8).

23. Composição de nucleotídeo compreendendo um oligonucleo- tídeo, em que a dita composição de nucleotídeo é obtenível pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 27, em que de preferência o dito oligonucleotídeo compreende um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%, de preferência de 80 a 95%, mais de preferência de 80 a 90%, ainda mais de preferência de 83 a 90%, ainda mais de preferência de 85 a 90%, e com mais preferência de 88%.

24. Composição de nucleotídeo de acordo com a reivindicação -23, em que o dito oligonucleotídeo tem a seqüência de ácidos nucléicos "G8- -8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (SEQ ID NO: 6) ou "G10" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 8), em que de preferência o dito oligonucleotídeo tem a seqüência de ácidos nucléi- cos "G10" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ ID NO:8).

25. Processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão de um oligonucleotídeo, (i) em que o dito oligonucleotídeo pelo menos uma extensão de poly G; e (ii) em que o dito oligonucleotídeo compreendem um tempo de início de pico relativo de 50 a 110%; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus.

26. Processo para a produção da composição compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo ví- rus, o dito processo compreendendo as etapas de: (a) provisão de proteína de revestimento do dito bacteriófago de RNA; (b) provisão da composição de nucleotídeo de qualquer uma das reivindicações de 23 ou 24; (c) geração de uma mistura, em que a dita mistura compreende: (i) a dita proteína de revestimento; (ii) um agente capaz de prever a automontagem da dita proteína de revestimento; (iii) o dito oligonucleotídeo; (d) remoção do dito agente a partir da dita mistura; e (e) permissão que a dita proteína de revestimento se automonte em uma partícula do tipo vírus.

27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 ou 26, em que a dita proteína de revestimento compreende, ou alter- nativamente essencialmente consiste em, alternativamente consiste em pro- teínas recombinantes, ou seus fragmentos, de um bacteriófago de RNA.

28. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 27, em que o dito bacteriófago de RNA é selecionado do grupo que consiste em: (a) bacteriófago Qbeta; (b) bacteriófago R17; (c) bacteriófago fr; (d) bacteriófago GA; (d) bacteriófago SP; (e) bacteriófago MS2; (f) bacteriófago M11; (g) bacteriófago MX1; (h) bacteriófago NL95; (i) bacteriófago f2; (j) bacteriófago PP7; e (k) bacteriófago AP205.

29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28, em que o dito bacteriófago de RNA é Qp.

30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28, em que o dito bacteriófago de RNA é AP205.

31. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28, em que o dito bacteriófago de RNA é fr.

32. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28, em que o dito bacteriófago de RNA é GA.

33. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 28, em que a dita proteína de revestimento compreende ou de prefe- rência consiste na seqüência selecionada do grupo que consiste em: (a) SEQ ID NO: IO(QpCP); (b) uma mistura de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11 (proteína de Οβ A1); (c) SEQ ID NO: 12 (proteína de revestimento de R17); (d) SEQ ID NO: 13 (proteína de revestimento de fr); (e) SEQ ID NO: 14 (proteína de revestimento de GA); (f) SEQ ID NO: 15 (proteína de revestimento de SP); (g) uma mistura de SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16; (h) SEQ ID NO: 17 (proteína de revestimento de MS2); (i) SEQ ID NO: 18 (proteína de revestimento de M11); (j) SEQ ID NO: 19 (proteína de revestimento de MX1); (k) SEQ ID NO: 20 (proteína de revestimento de NL95); (I) SEQ ID NO: 21 (proteína de revestimento de f2); (m) SEQ ID NO: 22 (proteína de revestimento de PP7); e (n) SEQ ID NO: 23 (proteína de revestimento de AP205).

34. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 33, em que a concentração da dita proteína de revestimento na dita mistura é de 1 a 4 mg/ml, de preferência 2,5 mg/ml.

35. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 34, em que a concentração do dito oligonucleotídeo na dita mistura é de 25 a 100 μΜ, de preferência 62,5 μΜ.

36. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 35, em que a razão molar do dito oligonucleotídeo e a dita proteína de revestimento na dita mistura é de 0,5 a 1,2, de preferência 0,7.

37. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 31 a 36, em que o dito agente compreende um composto de desnatura- ção selecionda de uréia e cloridrato de guanidínio, em que de preferência o dito composto de desnaturação é uréia e em que mais de preferência a con- centração da dita uréia na dita mistura é de 0,25 a 7,2 M, de preferência 1 M.

38. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 37, em que o dito agente adicionalmente compreende um agente de redução.

39. Processo de qualquer uma das reivindicações de 25 a 31 e 33 a 38, em que a dita proteína de revestimento compreende resíduos de cisteína capaz de formar ligações de dissulfeto intermoleculares na dita par- tícula do tipo vírus, e em que o dito agente adicionalmente compreende um agente de redução.

40. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 38 ou 39, em que o dito agente de redução é DTT, em que de preferência a concentração do dito DTT na dita mistura é de 1 a 25 mM, de preferência 2,5 mM.

41. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 40, em que a dita remoção do dito agente a partir da dita mistura é realizada por uma primeira troca de tampão com um primeiro tampão, em que o dito primeiro tampão compreende cloreto de sódio, em que de prefe- rência a concentração do dito cloreto de sódio no dito primeiro tampão é de 0 a 1 M, de preferência de 0 a 550 mM, mais de preferência de 0 a 350 mM, ainda mais de preferência de 50 a 350 mM, e com mais preferência 250 mM.

42. Processo de acordo com reivindicação 41, em que a dita primeira troca de tampão é realizada através de uma membrana, em que a dita membrana compreende um corte de peso molecular de 1 a 50 kD, de preferência de 5 a 30 kD, com mais preferência de 30 kD.

43. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 42, em que o dito processo adicionalmente compreende a etapa de contato da dita partícula do tipo vírus com um agente de oxidação, em que de preferência o dito agente de oxidação é selecionado do grupo que consis- te em: (a) peróxido de hidrogênio, em que de preferência a concentra- ção do dito peróxido de hidrogênio é de 0,25-50 mM, de preferência 2 mM; (b) oxigênio; (c) glutationa; (d) Cu2+; e (e) Fe3+.

44. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 43, em que o dito processo adicionalmente compreende a etapa de purificação da dita partícula do tipo vírus, e em que de preferência a dita pu- rifcação compreende uma segunda troca de tampão com um segundo tam- pão, em que o dito segundo tampão é um tampão farmaceuticamente acei- tável.

45. Processo de acordo com a reivindicação 44, em que a dita segunda troca de tampão é realizada usando-se a membrana, em que a dita membrana compreende um corte de peso molecular de 100 a 1000 kD, de preferência de 300 kD.

46. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 25 a 45, em que o rendimento de proteína é pelo menos 75% e/ou em que o rendimento de oligonucleotídeo é pelo menos 75%.

47. Uso de uma composição de nucleotídeo obtenível por qual- quer um dos processos como definidos nas reivindicações 1 a 24 em um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 26 a 45.

48. Uso de um oligonucleotídeo compreendendo (i) pelo menos uma extensão de poly G; e (ii) um tempo de início de pico relativo de 50 a -110% em um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 25 a 45.

49. Composição obtenível por um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 25 a 45, a dita composição de preferên- cia compreendendo (i) uma partícula do tipo vírus, em que a dita partícula do tipo vírus é uma partícula do tipo vírus de um bacteriófago de RNA, e (ii) um oligonucleotídeo, em que o dito oligonucleotídeo é acondicionado na dita partícula do tipo vírus.

50. Composição de acordo com a reivindicação 49, em que o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago Οβ, bacteriófago AP205, bacteriófa- go fr ou bacteriófago GA, em que de preferência o dito bacteriófago de RNA é bacteriófago Οβ.

51. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 49 ou 50, em que o dito oligonucleotídeo tem a seqüência de ácidos nucléicos "G8-8" GGGGGGGGGACGATCGTCGGGGGGGG (SEQ ID NO: 6) ou "G10" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 8), em que de preferência o dito oligonucleotídeo tem a seqüência de ácidos nucléicos "G10" GGGGGGGGGG GACGATCGTC GGGGGGGGGG (SEQ ID NO: 8).

52. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 49 a 51, em que a pureza da dita composição é pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais de preferência pelo menos 95%, ainda mais de preferência pelo menos 98%, e com mais preferência pelo menos 99%.

53. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica- ções de 49 a 51, em que o dito oligonucleotídeo não é acessível hidrólise de D NAse.