JP2008532477A - 膀胱癌を診断する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、膀胱癌を検出および診断する方法、ならびに膀胱癌および膀胱癌転移を治療および予防する方法に関する。本発明はまた、膀胱癌に関連する遺伝子およびポリペプチドに関する。
膀胱癌はヒト集団において2番目に多く見られる泌尿生殖器腫瘍であり、全世界で毎年、およそ261,000件の新たな症例が発生している。その約1/3は、診断時に浸潤性疾患または転移性疾患となっている可能性が高い(Parkin DM, et al., (1999) CA Cancer J Clin; 49:33-64(非特許文献1))。根治的膀胱切除術は、局所的であるが筋層浸潤性膀胱癌を有する患者を治療するための「最も標準的な治療法」であるとみなされているが、そのような患者の約50%は膀胱切除術後2年以内に転移を発症し、その後その疾患により死亡する(Sternberg CN., (1995) Ann Oncol; 6:113-26(非特許文献2))。
したがって、本明細書で報告する研究の中で、本発明者らは、解析用の純粋な癌細胞集団を得ることを目的とした腫瘍のレーザーマイクロビームマイクロダイセクション(LMM)と組み合わせて、転写要素27,648個からなるcDNAマイクロアレイにより、浸潤性膀胱癌症例33例から得られたゲノム全体の情報を用いて、新規分子標的を同定した。これらの結果から、このような情報が最終的に我々の目標である「個別化治療」につながり得ることが示唆される。
本明細書で用いる「1つの(a、an)」、および「その(the)」という語は、特記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。
本発明により、類似の配列を有するcDNAが同定され、これはB5860Nの変異体をコードするものである。長い方の変異体のcDNAは5318ヌクレオチドからなり、2436ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含む(SEQ ID NO:3)。既知のB5860Nのオープンリーディングフレームは1584ヌクレオチドからなり、527アミノ酸-タンパク質をコードする(Genebank登録番号NM_017779)。したがって、5318ヌクレオチドからなる長い方の変異体は本発明にとって新規である。さらに、527アミノ酸-タンパク質をコードするB5860N cDNAの既知配列は、3338ヌクレオチドからなる。しかし本発明では、4466ヌクレオチドからなるB5860Nの全長cDNAが単離された。この短い方の変異体のヌクレオチド配列は、既知ヌクレオチド配列と比較して3'-UTRの新規配列を含むが、それらによってコードされるアミノ酸配列はいずれも同一であった。本明細書では、既知の527アミノ酸-タンパク質をコードする短い方の変異体、および新規の811アミノ酸-タンパク質をコードする長い方の変異体の転写産物を、それぞれB5860NV2およびB5860NV1と記載する。B5860NV1およびB5860NV2のヌクレオチド配列、ならびにそれらによってコードされるアミノ酸配列を、以下のSEQ ID NOに記載する。
ヌクレオチド配列 アミノ酸配列
B5860NV1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:4
B5860NV2 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:6
本発明により、類似の配列を有するcDNAが同定され、これはC6055の変異体をコードするものである。NCBIのデータベースによれば、C6055は24エキソンからなり、MGC34032と称され、染色体1p31.3に位置する。C6055はデータベース上のMGC34032の最後のエキソン(エキソン24)内に含まれないため、本発明者らは、膀胱癌細胞株、SW780を鋳型として用いて、ESTウォーキング、ならびに5'RACEおよび3'RACE実験としてRT-PCRを行い、C6055の全cDNA配列を得た(材料および方法を参照されたい)。その結果、本発明者らは、2つの新規転写産物、C6055V1およびC6055V2を見出した。最終的に、この遺伝子は、それぞれMGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2に対応する、24、25、22、および22エキソンからなる4つの異なるスプライシング変異体を有する(図3c)。MGC34032のエキソン1、2、3、4、および24において選択的スプライシングが存在し、その他の残りのエキソンは4つの転写産物に共通していた。C6055V1およびC6055V2転写産物にはMGC34032のエキソン1、2、および3はなく、最後のエキソン内に同じ終止コドンを生じる。特に、C6055V1およびC6055V2転写産物のORFはそれぞれのエキソン4において開始し、C6055V1およびC6055V2転写産物は同じORFを有することが示される。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物の全長cDNA配列は、それぞれ2302、3947、3851、および3819ヌクレオチドからなる。MGC34032、Genbank登録番号AK128063、C6055V1、およびC6055V2転写産物は最終的に、それぞれ719、587、675、および675アミノ酸をコードする。C6055V1およびC6055V2のヌクレオチド配列、ならびにそれらによってコードされるアミノ酸配列を、以下のSEQ ID NOに記載する。
ヌクレオチド配列 アミノ酸配列
C6055V1 SEQ ID NO:129 SEQ ID NO:130
C6055V2 SEQ ID NO:131 SEQ ID NO:132
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドが導入されたベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明のベクターは、宿主細胞中に本発明のポリヌクレオチド、特にDNAを保存するため、本発明のポリペプチドを発現させるため、または遺伝子治療のために本発明のポリヌクレオチドを投与するために有用である。
さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを産生する方法を提供する。ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターを保有する宿主細胞を培養することによって調製し得る。必要に応じて、細胞内で遺伝子を安定に発現させると同時に遺伝子のコピー数を増幅するための方法を使用することができる。例えば、核酸合成経路が欠失したCHO細胞に、相補的なDHFR遺伝子を含むベクター(例えば、pCHO I)を導入し、次にこのベクターをメトトレキセート(MTX)により増幅することができる。さらに、遺伝子の一過性発現の場合には、SV40の複製起点を含むベクター(pcDなど)で、染色体上にSV40 T抗原発現遺伝子を含むCOS細胞を形質転換する方法が用いられ得る。
本発明の文脈において、BLCは、被験細胞集団(すなわち、患者由来の生体試料)からの1つまたは複数のBLC核酸の発現レベルを測定することにより診断される。好ましくは、被験細胞集団は、上皮細胞、例えば膀胱組織から得られた細胞を含む。遺伝子発現は、血液または他の体液(尿など)から測定することもできる。タンパク質レベルを測定するために、他の生体試料を使用することも可能である。例えば、診断しようとする対象由来の血液または血清中のタンパク質レベルを、免疫測定法または他の従来の生物学的アッセイ法により測定することができる。
BLC関連遺伝子の発現またはその遺伝子産物の活性を阻害する物質は、BLCに関連した上方制御遺伝子を発現する被験細胞集団を被験物質と接触させ、次いでBLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性を決定することにより同定することができる。物質の存在下におけるBLC関連遺伝子の発現レベルまたはその遺伝子産物の活性レベルが、被験物質の非存在下における発現または活性レベルと比較して低下していることにより、その物質がBLCに関連した上方制御遺伝子の阻害剤であり、BLCの阻害に有用であることが示される。
本明細書において同定されたBLC関連遺伝子の差次的発現により、BLCの治療過程をモニターすることも可能になる。本方法において、BLCに対する治療を受ける対象から被験細胞集団が提供される。必要に応じて、例えば、治療前、治療中、および/または治療後といった様々な時点で被験細胞集団を対象から入手する。次いで、当該細胞集団における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現を決定し、BLC状態が判明している細胞を含む参照細胞集団と比較する。本発明の文脈において、参照細胞は、関心対象の治療に曝露されてはならない。
個体の遺伝子構成の差によって、個体が様々な薬物を代謝する相対的能力に差が生じ得る。対象において代謝されて抗BLC剤として作用する物質は、対象の細胞において、癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンから非癌性状態に特徴的な遺伝子発現パターンへの変化を誘導することによって顕在化し得る。したがって、物質が対象においてBLCの適切な阻害剤であるかどうかを決定するために、本明細書に開示する差次的に発現されるBLC関連遺伝子によって、治療効果があるかまたは予防効果があると推定されるBLC阻害剤を、選択された対象由来の被験細胞集団において調べることができる。
本明細書に開示した差次的に発現されるBLC関連遺伝子を、BLCを治療するための候補治療剤を同定するために用いることもできる。本発明の方法は、候補治療剤をスクリーニングして、候補治療剤が、BLC状態に特徴的な表4〜5に列挙された1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現プロファイルを、非BLC状態に特徴的な遺伝子発現パターンへと変換させ得るかどうかを判定する段階を含む。
a) 被験化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;および
c) ポリペプチドに結合する被験化合物を選択する段階。
a) 候補化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;および
b) 表4に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させるか、または表5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。
a) 被験化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b) 段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
c) 被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、表4に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、表5に列挙された遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を増強する化合物を選択する段階。
a) 候補化合物を、表4または5に列挙された遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
b) レポーター遺伝子の発現または活性を測定する段階;ならびに
c) 被験化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して、マーカー遺伝子が表4に列挙された遺伝子からなる群より選択される上方制御されるマーカー遺伝子である場合に、レポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性を低下させるか、またはマーカー遺伝子が表5に列挙された遺伝子からなる群より選択される下方制御されるマーカー遺伝子である場合に、レポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性を増強する候補化合物を選択する段階。
(1) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはこのような配列と少なくとも約80%の相同性を有する配列を含むポリペプチド;ならびに
(3) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。
(a) 被験化合物をポリペプチドまたはその同等物と接触させる段階;
(b) 段階(a)のポリペプチドまたはその同等物の生物活性を検出する段階;および
(c) ポリペプチドまたはその同等物の生物活性を、被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して抑制する化合物を選択する段階。
a) 被験化合物を、C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の1つまたは複数を発現する細胞と接触させる段階;および
b) C2093、B5860N、またはC6055遺伝子の1つまたは複数の発現レベルを、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して低下させる化合物を選択する段階。
a) 被験化合物を、C2093、B5860N、またはC6055である1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
b) レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;および
c) レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を、被験化合物の非存在下で検出される発現レベルまたは活性と比較して低下させる化合物を選択する段階。
本発明はまた、被験細胞集団における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の発現を、全病期にわたる患者から得られた参照細胞集団における同じBLC関連遺伝子の発現と比較する段階を含む、BLCを有する対象の予後を評価する方法を提供する。被験細胞集団および参照細胞集団における1つまたは複数のBLC関連遺伝子の遺伝子発現を比較することにより、または対象から得られた被験細胞集団の経時的な遺伝子発現のパターンを比較することにより、対象の予後を評価することができる
本発明はまた、BLC検出試薬、例えば、BLC核酸の一部に相補的なオリゴヌクレオチド配列のような、1つまたは複数のBLC核酸に特異的に結合するかもしくはこれを同定する核酸、またはBLC核酸によってコードされる1つまたは複数のタンパク質に結合する抗体を含む。検出試薬は、キットの形態で共に包装され得る。例えば、検出試薬、例えば核酸または抗体(固相マトリクスに結合してあるか、またはそれらをマトリクスに結合させるための試薬とは個別に包装される)、対照試薬(陽性および/または陰性)、および/または検出可能な標識は、個別の容器に包装され得る。アッセイを行うための説明書(例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROMなど)もまた、キットに含まれ得る。キットのアッセイ形式は、当技術分野においていずれも公知であるノーザンハイブリダイゼーションまたはサンドイッチELISAであり得る。
本発明はまた、1つまたは複数の核酸を含む核酸基質アレイを含む。アレイ上の核酸は、表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される1つまたは複数の核酸配列に特異的に対応する。表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子によって示される核酸の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、40、または50個もしくはそれ以上の発現レベルは、アレイに結合する核酸を検出することによって同定され得る。
本発明はさらに、表4に列挙された上方制御されるBLC関連遺伝子の1つまたは複数の発現(またはその遺伝子産物の活性)を低下させるか、または表5に列挙された下方制御されるBLC関連遺伝子の1つまたは複数の発現(またはその遺伝子産物の活性)を上昇させることにより、対象におけるBLCの症状を治療または軽減する方法を提供する。適切な治療用化合物を、BLCに罹患しているかまたはBLCを発症するリスク(またはそれに対する感受性)を有する対象に対して、予防的または治療的に投与することができる。このような対象は、標準的な臨床的方法を用いて、または表4〜5に列挙されたBLC関連遺伝子の1つもしくは複数の異常な発現レベルもしくはその遺伝子産物の異常な活性を検出することにより、同定することができる。本発明の文脈において、適切な治療剤には、例えば細胞周期制御および細胞増殖の阻害剤が含まれる。
上記のように、表4に列挙されたBLC関連遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアンチセンス核酸を用いて、遺伝子の発現レベルを低下させることができる。膀胱癌において上方制御される、表4に列挙されたBLC関連遺伝子に対応するアンチセンス核酸は、膀胱癌の治療に有用である。具体的には、本発明のアンチセンス核酸は、表4に列挙されたBLC関連遺伝子またはそれらに対応するmRNAと結合することによって作用し得、それによって遺伝子の転写もしくは翻訳を阻害し、mRNAの分解を促進し、および/または表4に列挙されたBLC関連遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を阻害し、それによってタンパク質の機能を阻害する。
CCC、CCACC、またはCCACACC:Jacque, J. M, et al.,(2002) Nature, 418:435-8。
UUCG:Lee, N.S., et al.,(2002) Nature Biotechnology 20:500-5。Fruscoloni, P., et al.,(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4):1639-44。
UUCAAGAGA:Dykxhoorn, D. M., et al.,(2002) Nature Reviews Molecular Cell Biology 4:457-67。
1.対象となる転写物のAUG開始コドンから始めて、AAジヌクレオチド配列を求めて下流にスキャンする。潜在的なsiRNA標的部位として、個々のAAおよび3'側に隣接する19ヌクレオチドの出現を記録する。Tuschl, et al.(1999)Genes Dev 13(24):3191-7においては、5'および3'非翻訳領域(UTR)および開始コドン近傍(75塩基以内)の領域が、調節タンパク質結合部位により富んでいる可能性があることから、これらに対してsiRNAを設計しないことを推奨している。UTR-結合タンパク質および/または翻訳開始複合体は、siRNAエンドヌクレアーゼ複合体の結合を妨害し得る。
2.潜在的な標的部位をヒトゲノムデータベースと比較し、他のコード配列に対して有意な相同性をもついかなる標的配列も検討対象から除く。相同性検索は、NCBIのサーバー上(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)にあるBLASTを用いて実施することができる。
3.合成に適した標的配列を選択する。アンビオンでは、好ましくは、評価すべき遺伝子の長さに沿っていくつかの標的配列を選択することができる。
または、BLCにおいて過剰発現される遺伝子の1つまたは複数の遺伝子産物の機能は、遺伝子産物に結合するか、または別の方法で遺伝子産物の機能を阻害する化合物を投与することによって阻害することができる。例えば、化合物は、1つまたは複数の過剰発現される遺伝子産物に結合する抗体である。
本発明はまた、表4に列挙されたBLC関連遺伝子(すなわち上方制御遺伝子)からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法に関する。ポリペプチドの投与により、対象において抗腫瘍免疫が誘導される。抗腫瘍免疫を誘導するため、表4に列挙されたBLC関連遺伝子からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、そのようなポリペプチドの免疫学的活性断片、またはそのようなポリペプチドもしくはその断片をコードするポリヌクレオチドを、それを必要とする対象に投与する。ポリペプチドまたはその免疫学的活性断片は、BLCに対するワクチンとして有用である。場合によっては、タンパク質またはその断片は、T細胞受容体(TCR)に結合させた形態、またはマクロファージ、樹状細胞(DC)、もしくはB細胞などの抗原提示細胞(APC)により提示させた形態で投与してもよい。DCは抗原提示能が強いため、APCの中でもDCを用いることが最も好ましい。
-腫瘍に対する細胞傷害性リンパ球の誘導、
-腫瘍を認識する抗体の誘導、および
-抗腫瘍サイトカイン産生の誘導。
本発明は、本発明のスクリーニング法によって選択された任意の化合物を含む、膀胱癌を治療または予防するための組成物を提供する。
[A]は、C2093、B5860N、またはC6055のmRNAまたはcDNAに特異的にハイブリダイズする配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
[B]は、約3〜約23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
[A']は、[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である。
C2093-siRNAに関して(GTGAAGAAGTGCGACCGAA/SEQ ID NO:21の標的配列に関して)
5'-gugaagaagugcgaccgaa-[B]-uucggucgcacuucuucac-3'(SEQ ID NO:24)、
B5860N-siRNAに関して(CCAAAGTTCCGTAGTCTAA/SEQ ID NO:25の標的配列に関して)
5'-ccaaaguuccguagucuaa-[B]-uuagacuacggaacuuugg-3'(SEQ ID NO:28)および
C6055-siRNAに関して(GTTGCAGTTACAGATGAAG/SEQ ID NO:144の標的配列に関して)
5'-gttgcagttacagatgaag-[B]-cttcatctgtaactgcaac-3'(SEQ ID NO:147)。
材料および方法
患者、細胞株、組織試料、およびネオアジュバント化学療法
ヒト膀胱癌細胞株HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、およびRT4はATCCから入手した。全ての細胞は適切な培地;すなわち、HT1197、UMUC3、J82、およびHT1376に関しては、0.1 mM必須アミノ酸(Roche)、1 mMピルビン酸ナトリウム(Roche)、0.01 mg/mlインスリン(Sigma)を含むEMEM(Sigma、ミズーリ州、セントルイス);HBL100、COS7に関してはダルベッコー修飾イーグル培地(Invitrogen、カリフォルニア州、カールズバッド);RT-4に関してはマッコイ5a(sigma);SW 780に関してはL-15中で培養した。各培地には、10%ウシ胎児血清(Cansera)および1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)を添加した。SW 780細胞は、CO2を含まない加湿空気の雰囲気中において37℃で維持した。他の細胞株は、5% CO2を含む加湿空気の雰囲気中において37℃で維持した。
以前に記載されている通りに、マイクロダイセクションした癌細胞の各集団から全RNAを抽出した(Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res; 61:3544-9)。RNAの質を保証するため、各症例の残存組織から抽出した全RNAを変性アガロースゲルで電気泳動し、リボソームRNAバンドの存在により質を確認した。全RNAの抽出およびT7に基づくRNA増幅は、RNeasy Microキット(QIAGEN、米国、カリフォルニア州、バレンシア)を使用したこと以外は以前に記載されている通りに実施した(Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61:2129-37)。2ラウンドのRNA増幅後に、各試料に関して30〜100μgの増幅RNA(aRNA)が得られた。対照として、正常ヒト膀胱ポリ(A)+ RNA(BD Bioscience、カリフォルニア州、パロアルト)を同様に増幅した。鋳型として全RNAを使用するかまたはaRNAを使用するかにかかわらず、マイクロアレイによるデータがRT-PCRによる結果と一致することを、本発明者らは半定量的RT-PCR実験により先に確認しているため(Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res; 61:3544-9)、この方法によって増幅されたRNAは、元のRNA供給源における比率を正確に反映している。
スライドグラス上にスポットするcDNAを得るため、以前に記載されている通りに各遺伝子についてRT-PCRを行った(Kitahara O, et al., (2001) Cancer Res; 61:3544-9)。高密度Microarray Spotter Lucidea(GE Healthcare、Amersham Biosciences、英国 バッキンガムシャー)を用いて、PCR産物を7型スライドガラス(GE Healthcare、Amersham Biosciences)上にスポットした;遺伝子9,216個を1枚のスライド上に二つ組でスポットした。異なる3組のスライド(全体で遺伝子スポット27,648個)を調製して、そのそれぞれに同じハウスキーピング遺伝子52個および陰性対照遺伝子2個を同様にスポットした。cDNAプローブは、以前に記載されている方法でaRNAから調製した(Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61:2129-37)。ハイブリダイゼーション実験のため、各癌組織および対照に由来する増幅RNA(aRNA)9.0μgを、それぞれCy5-dCTPおよびCy3-dCTP(GE Healthcare、Amersham Biosciences)の存在下で逆転写した。ハイブリダイゼーション、洗浄、およびシグナルの検出は、以前に記載されている通りに実施した(Okabe H, et al., (2001) Cancer Res; 61:2129-37)。
スポット27,648個からCy3およびCy5のシグナル強度を定量し、ArrayVisionソフトウェア(Imaging Research, Inc.、カナダ、オンタリオ州、セントキャサリンズ)を用いて、バックグラウンドを置換してシグナルを解析した。次に、各標的スポットのCy5(腫瘍)およびCy3(対照)の蛍光強度を、ハウスキーピング遺伝子52個の平均Cy5/Cy3比が1となるように調整した。低いシグナル強度に由来するデータは信頼性が低いことから、以前に記載されている通りに各スライドにおいてカットオフ値を決定し(Ono K, et al., (2000) Cancer Res; 60:5007-11)、Cy3およびCy5色素がいずれもカットオフより低いシグナル強度を生じる場合には、さらなる解析から遺伝子を除外した(Saito-Hisaminato A, et al., (2002) DNA Res; 9:35-45)。他の遺伝子に関しては、Cy3またはCy5シグナル強度の一方がカットオフ値よりも低い場合、Cy5/Cy3比が極端に高いかまたは低い測定値を提供して、偽予測遺伝子が選択されることになるため、各試料の生データを用いて相対的発現比としてCy5/Cy3を計算する以前の方法を修正した。そのようなバイアスを低減するため、Cy3またはCy5シグナル強度の一方がカットオフ値よりも低い場合には、各カットオフ値の半分に加えて各試料のCy5およびCy3シグナル強度を用いて、Cy5/Cy3比を計算した。
以下の基準に従って、膀胱癌に共通して上方制御または下方制御される遺伝子を同定および解析した。まず、50%を超える症例についてその相対的発現比を計算することができ、かつ50%を超える症例においてその発現が上方制御または下方制御される遺伝子を選択した。さらに、35〜50%の症例について相対的発現比を計算することができる場合には、80%の症例で上方制御または下方制御される遺伝子も評価した。各遺伝子の相対的発現比(Cy5/Cy3強度比)を、以下のような4つのカテゴリーの1つに分類した:(1) 上方制御される(発現比は5.0より大きい);(2) 下方制御される(発現比は0.2未満);(3) 発現に変化なし(発現比は0.2〜5.0);および(4) 発現されない(またはわずかに発現されるが、検出のカットオフレベル未満である)。これらのカテゴリーを用いて、発現比の変化が試料間で共通していると同時に、特定のサブグループに特異的である一組の遺伝子を検出した。膀胱癌細胞において一般に上方制御または下方制御される候補遺伝子を検出するため、遺伝子27,648個の全体的な発現パターンをスクリーニングして、5.0よりも大きいかまたは0.2より小さい発現比を有する遺伝子を選択した。腫瘍細胞で上方制御されると考えられる全部で394個の遺伝子のうち、情報のある膀胱癌症例の50%を超える症例において発現比が5.0を超え、正常ヒト組織の発現プロファイルを介して心臓、肺、肝臓、および腎臓を含む正常器官において低い発現を示すという理由で、施設内同定番号C2093、B5860N、およびC6055を有する遺伝子に注目した。
上方制御された遺伝子44個を選択して、半定量的RT-PCR実験を適用することによりそれらの発現レベルを調べた。各試料からのaRNAのアリコート3μgを、ランダムプライマー(Roche)およびSuperscript II(Invitrogen)を用いて逆転写し、一本鎖cDNAを得た。各cDNA混合物を希釈し、次いで標的DNAまたはGAPDH特異的反応用に調製した同じプライマーセットを用いてPCR増幅した。図1aのRT-PCRに使用したプライマー配列を表2に記載する。図1bおよび1cのRT-PCRに使用したPCRプライマー配列は以下の通りである:
C2093用の
5'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3' (SEQ ID NO:9)および
5'-TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3' (SEQ ID NO:10)、
B5860N V1およびV2の共通配列用の
5'-GCTACAAGTAAAGAGGGGATGG-3' (SEQ ID NO:11)および
5'-GGACAGAAAGGTAAGTCAGTGGG-3' (SEQ ID NO:12)。
GAPDHの発現を内部対照とした。PCR反応は、産物強度が増幅の直線相の範囲内に入るように、サイクル数を最適化した(表2)。
ノーザンブロットを、それぞれRT-PCRにより調製したA0576N、C2093、C5509、B5860N、F1653、B9838、およびC6055の[α32P]-dCTP標識増幅産物とハイブリダイズさせた(表3)。C6055の特異的プローブは、以下のようなプライマーセットを用いてPCRにより調製した:
C6055のマイクロアレイプローブ用の
5'-CCCCAGTTGAGAGTTTGCTC-3' (SEQ ID NO:137)および
5'-CTGTCATGTGCTCATGTGAGTTT-3' (SEQ ID NO:53)、
C6055の4つの転写産物間の共通領域用の
5'-TGACATCGGGATTCAGACTAA-3' (SEQ ID NO:138)および
5'-AAAGATGCTGGTCCTTGTGC-3' (SEQ ID NO:139)。
製造業者の説明書に従ってTRIzol試薬(Invitrogen)を使用し、すべての膀胱癌細胞株および凍結外科標本から全RNAを抽出した。DNase I(ニッポンジーン、日本、大阪)で処理した後、製造業者の説明書に従ってMicro-FastTrack(Invitrogen)を用いてmRNAを単離した。各mRNAとともに正常成人ヒト心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、膵臓、精巣、および膀胱から単離されたポリA(+) RNA(Clontech、カリフォルニア州、パロアルト)のアリコート1μgを1%変性アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に転写した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は、供給業者の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは、増感スクリーンを用いて-80℃で14日間行った。
B5860NおよびC6055の5'末端および3'末端の配列を、SMART(商標) RACE cDNA増幅キット(Clontech)を用いて、cDNA末端の5'迅速増幅(5'RACE)およびcDNA末端の3'迅速増幅(3'RACE)を行うことにより決定した。増幅用に膀胱癌細胞株、SW780細胞からcDNA鋳型を合成し、5'RACE用のB5860N特異的リバースプライマー
5'-CATTTTCTGATCCCCACCTCCCTTTG-3' (SEQ ID NO:14)
、C6055特異的リバースプライマー
C6055_GSP1; 5'-GATCCAAATGCTAGGGATCCTGTGTG-3' (SEQ ID NO:140)および
C6055_NGSP1; 5'-CCTGTGTGATATCGTATGGCTCGTCCA-3' (SEQ ID NO:141)、
ならびに3'RACE用のB5860N特異的フォワードプライマー
5'-AGAGGGGATGGGGAAGGTGTTGC-3' (SEQ ID NO:15)、
ならびにキット中に供給されるAP1プライマーを用いてPCRを行った。
C2093、B5860N、およびC6055 cDNAの全コード配列を、KOD-Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡、日本、大阪)を使用して以下のプライマーでPCRすることにより増幅した:
C2093-フォワード、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAATCTAATTTTAATCAAGAGG-3' (SEQ ID NO:16)(下線はNotI部位を示す)および
C2093-リバース、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3' (SEQ ID NO:17)(下線はNotI部位を示す)、
B5860NV1-フォワード、
5'-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAGAGTCAGGGTGTGC-3’(SEQ ID NO:18)(下線はNotI部位を示す)および
B5860NV1-リバース、
5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3' (SEQ ID NO:19)(下線はXhoI部位を示す)、
B5860NV2-フォワード、
5'-GGAATTCATGGAGAGTCAGGGTGTG-3' (SEQ ID NO:20)(下線はEcoRI部位を示す)および
B5860NV2-リバース、
5'-CCGCTCGAGTCTTAGACTACGGAACTTTGGT-3' (SEQ ID NO:19)(下線はXhoI部位を示す)、
C6055-フォワード、
5'-AGAATTCATGATCTTCCTACTGTGTATTATTGGC-3' (SEQ ID NO:142)(下線はEcoRI部位を示す)および
C6055-リバース、
5'-TATCTCGAGCTGCTTCCTAGTTTGTGGATTTTC-3' (SEQ ID NO:143)(下線はXhoI部位を示す)。PCR産物を、pCAGGSnHA発現ベクターのそれぞれEcoRIおよびXhoI、ならびにNotI部位に挿入した。これらの構築物は、DNAの配列決定により確認した。
FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造業者の説明書に従って使用して、COS7細胞にそれぞれ1μgのpCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA、またはpCAGGS-C6055-HAを一過的にトランスフェクトした。細胞溶解液を10% SDSポリアクリルアミドゲル(pCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HAトランスフェクト細胞に関して)または7.5% SDSポリアクリルアミドゲル(pCAGGS-C6055-HAトランスフェクト細胞に関して)で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、次いで1/1000希釈の一次抗体としてのマウス抗HA抗体(Roche)と共にインキュベートした。二次抗体としてのヒツジ抗マウスIgG-HRP(Amersham Biosciences)と共にインキュベートした後、ECLキット(Amersham Biosciences)を用いてシグナルを可視化した。
外因性C2093、B5860NV1およびB5860NV2、またはC6055の細胞内局在を調べるため、COS7細胞を全3つの構築物のためにウェル当たり1×105細胞で播種した。24時間後、FuGENE 6トランスフェクション試薬(Roche)を製造業者の説明書に従って用いて、COS7細胞にそれぞれ1μgのpCAGGS-C2093-HA、pCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HA、またはpCAGGS-C6055-HAを一過的にトランスフェクトした。次いで、細胞は15分間4%パラホルムアルデヒドを含むPBSを用いて固定され、4℃で2.5分間0.1% Triton X-100を含むPBSを用いて透過性を与えられた。続いて、細胞を4℃で12時間3% BSAのPBS溶液で被覆し、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングした。次に、トランスフェクトして構築した各COS7細胞を、1/1000希釈のマウス抗HA抗体(Roche)と共にインキュベートした。PBSで洗浄した後、いずれのトランスフェクト細胞も、1/3000希釈のAlexa488結合抗マウス二次抗体(Molecular Probe)により染色した。4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で核を対比染色した。TCS SP2 AOBS顕微鏡(ライカ、日本、東京)下で蛍光像を取得した。
FuGENE 6(Roche)を供給業者の手順に従って用いて、HeLa細胞(1×106細胞)に8μgのpCAGGS-C2093-HA、またはpCAGGS-B5860NV1-HA、pCAGGS-B5860NV2-HAをトランスフェクトする。トランスフェクションの24時間後、アフィディコリン(1 ng/ml)をさらに16時間作用させて、細胞をG1期で停止させる。新鮮な培地で3回洗浄することにより細胞周期を解除し、示した時点で細胞を回収する。細胞を分裂期で停止させるには、細胞をノコダゾール(250 ng/ml)と共に16時間インキュベートしてから、これを回収する。
以前の報告(WO2004/076623)に従ってpsiU6BX siRNA発現ベクターを用いて、ベクターに基づくRNAiシステムを確立した。psiU6BXベクターのBbsI部位に二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、C2093(psiU6BX-C2093)、B5860N(psiU6BX-B5860N)、C6055(psiU6BX-C6055)に対するsiRNA発現ベクター、および対照プラスミド、psiU6BX-EGFP、psiU6BX-SCRを調製した。二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列を以下に示す。
標的配列、GTGAAGAAGTGCGACCGAA (SEQ ID NO:21)に対するC2093si#3
センス(SEQ ID NO:22):
5'-CACCGTGAAGAAGTGCGACCGAATTCAAGAGATTCGGTCGCACTTCTTCAC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:23):
5'-AAAAGTGAAGAAGTGCGACCGAATCTCTTGAATTCGGTCGCACTTCTTCAC-3'
標的配列、CCAAAGTTCCGTAGTCTAA (SEQ ID NO:25)に対するB5860Nsi#3
センス(SEQ ID NO:26):
5'-CACCCCAAAGTTCCGTAGTCTAATTCAAGAGATTAGACTACGGAACTTTGG-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:27):
5'-AAAACCAAAGTTCCGTAGTCTAATCTCTTGAATTAGACTACGGAACTTTGG-3'
標的配列、GTTGCAGTTACAGATGAAG (SEQ ID NO:144)に対するC6055si-08
センス(SEQ ID NO:145):
5'-CACCGTTGCAGTTACAGATGAAGTTCAAGAGACTTCATCTGTAACTGCAAC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:146):
5'-AAAAGTTGCAGTTACAGATGAAGTCTCTTGAACTTCATCTGTAACTGCAAC-3'
標的配列、GAAGCAGCACGACTTCTTC (SEQ ID NO:29)に対するsiRNA対照(SiEGFP)
センス(SEQ ID NO:30):
5'-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:31):
5'-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3'
標的配列、GCGCGCTTTGTAGGATTCG(SEQ ID NO:33)に対するsiRNA対照(SiSCR)
センス(SEQ ID NO:34):
5'-CACCGCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC-3'
アンチセンス(SEQ ID NO:35):
5'-AAAAGCGCGCTTTGTAGGATTCGTCTCTTGAACGAATCCTACAAAGCGCGC-3'
C2093 si#3:GTGAAGAAGTGCGACCGAATTCAAGAGATTCGGTCGCACTTCTTCAC (SEQ ID NO:24)、
B5860N si#3:CCAAAGTTCCGTAGTCTAATTCAAGAGATTAGACTACGGAACTTTGG (SEQ ID NO:28)、
C6055 si-08 GTTGCAGTTACAGATGAAGTTCAAGAGACTTCATCTGTAACTGCAAC (SEQ ID NO:147)、
EGFP対照:GAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC (SEQ ID NO:32)、および
SCR対照:GCGCGCTTTGTAGGATTCGTTCAAGAGACGAATCCTACAAAGCGCGC (SEQ ID NO:36)。
ヒト膀胱癌細胞株、C2093およびB5860Nに関するUMUC3およびJ82、またはC6055に関するSW780を10cmディッシュにプレーティングし(1×106細胞/ディッシュ)、C2093およびB5860Nに関してはFuGENE6(Roche)およびLipofectamine2000(Invitrogen)試薬、またはC6055に関してはNucleofector(Amaxa)試薬をそれぞれ供給業者の推奨に従って使用して、陰性対照としてのpsiU6BX-EGFPおよびpsiU6BX-SCR、psiU6BX-C2093、psiU6BX-B5860N、またはpsiU6BX-C6055をトランスフェクトした。各構築物のトランスフェクションの6日後に全RNAを細胞から抽出し、次いで上記のC2093、B5860N、およびC6055の共通領域の特異的プライマーを用いる半定量的RT-PCRにより、siRNAのノックダウン効果を確認した。内部対照としてのGAPDHおよびACTBのプライマーは以下の通りである:
GAPDH
5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3' (SEQ ID NO:7)および
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO:8)、
ACTB
5'-CATCCACGAAACTACCTTCAACT-3’(SEQ ID NO:148)
5'-TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG-3’(SEQ ID NO:149)。
FuGENE6(Roche)を用いてUMUC3細胞に陰性対照としてのsi-EGFPおよびsi-C2093をトランスフェクトした後、培養して、トランスフェクションの7日後にそれらの細胞形態を顕微鏡で観察した。C2093タンパク質発現の抑制をさらに確認するため、標準的な手順に従って抗C2093抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。
COOH末端においてHisタグを含むC2093(1612〜1780 a.a.)(SEQ ID NO:150)、およびB5860NV2(337〜527 a.a.)またはB5860NV1(621-811 a.a.)(SEQ ID NO:151)の部分断片を発現するプラスミドを、それぞれpET21ベクターを用いて調製した。組換えタンパク質を大腸菌、BL21コドン-プラス株(Stratagene、カリフォルニア州、ラホーヤ)で発現させ、Ni-NTA樹脂およびTALONを用いて供給業者の手順に従って精製した。これらのタンパク質をウサギに接種した。標準的手順に従って、免疫血清をアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製した抗C2093抗体および抗B5860N抗体を、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、および免疫染色に使用した。
内因性C2093またはB5860Nの細胞内局在を調べるため、C2093またはB5860Nを内因的に発現するUMUC3細胞をそれぞれウェル当たり1×105細胞で播種した。24時間後、細胞は15分間4%パラホルムアルデヒドを含むPBSを用いて固定され、4℃で2分間0.1% Triton X-100を含むPBSを用いて透過性を与えられた。続いて、細胞を4℃で12時間3% BSAのPBS溶液で被覆し、非特異的ハイブリダイゼーションをブロッキングした。次に、UMUC3細胞を、1/100希釈のアフィニティー精製した抗C2093抗体または抗B5860N抗体と共にインキュベートした。4',6'-ジアミジン-2'-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で核を対比染色した。PBSで洗浄した後、UMUC3細胞を1/1000希釈のAlexa488結合抗ウサギ二次抗体(Moleculrar Probe)により染色した。共焦点顕微鏡(ライカ、日本、東京)下で蛍光像を取得した。
パラフィン包埋された正常成人ヒト組織(BioChain、カリフォルニア州、ヘイワード)および外科的膀胱癌標本のスライドを、それぞれ切片を脱パラフィン処理し、抗C2093抗体を用いて高pHを有する抗原回復溶液(DAKO)中で電子レンジにより80℃で5分間加熱するか、または切片を脱パラフィン処理し、抗B5860N抗体を用いて高pHを有する抗原回復溶液(DAKO)中で108℃で15分間オートクレーブした後に、ENVISION+キット/HRP(DakoCytomation、デンマーク、グロストラップ)を用いて染色した。内因性のペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロッキングした後、これらの切片を、1/20希釈のアフィニティー精製した抗C2093抗体または抗B5860N抗体と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン(Envisionキット、Dako Cytomation、カリフォルニア州、カーピンテリア)を用いて、免疫検出を行った。最終的に、反応物を3,3 V-ジアミノベンジン(Dako)で発色させ、細胞はヘマトキシリンで対比染色した。
膀胱癌の正確な発現プロファイルを得るため、LMMを用いて膀胱癌細胞のみを収集した。この手順によって選択された癌細胞の比率は、顕微鏡による可視化で判定してほぼ100%であると推定された(データは示していない)。
膀胱癌患者33名からの癌細胞の遺伝子発現プロファイルを、ヒト遺伝子27,648個を提示するcDNAマイクロアレイを用いて解析したところ、膀胱癌細胞において一般に上方制御される遺伝子394個が同定された。これらのうち、施設内コードC2093(M期リンタンパク質1(MPHOSPH1)(Genebank登録NM_016195(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2をコードする))を示す)、B5860N(DEPドメイン含有1(DEPDC1)(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4をコードする)を示す)、およびC6055(MGC34032仮想タンパク質、(Genebank登録NM_152697 SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134をコードする)を示す)を有する遺伝子に注目した。C2093、B5860N、およびC6055遺伝子の発現は、発現データを得ることができた膀胱癌症例それぞれ25例のうち24例、20例のうち17例、および32例のうち21例で上昇していた。上方制御されたこれらの遺伝子の発現を確認するため、半定量的RT-PCR解析を行い、膀胱癌試料と正常膀胱癌細胞を含む正常ヒト組織との間で発現レベルを比較した。まず、C2093が、正常膀胱細胞、ならびに肺、心臓、肝臓、および腎臓を含む正常ヒト組織と比較して、臨床膀胱癌試料21例中17例において発現上昇を示したことが見出された(図1aおよびb)。さらに、この遺伝子は、6つの膀胱癌細胞株のいずれにおいても同様に過剰発現されていた(図1b)。次いで、B5860Nが、正常ヒト組織、特に正常膀胱mRNAと比較して、臨床膀胱癌試料21例中20例において発現上昇を示し(図1aおよびc)、試験した6つの膀胱癌細胞株のいずれにおいても過剰発現されていた(図1c)ことが見出された。
当初、データベースにおいてC2093が全長ではなかったため、C2093、B5860N、およびC6055の全cDNA配列を得ることを目的として、膀胱癌細胞株、SW780を鋳型として使用し、ESTウォーキング、ならびに5'RACEおよび3'RACE実験としてRT-PCRを行った(材料および方法を参照されたい)。C2093は31エキソンからなり、M期リンタンパク質1(MPHOSPH1)を示し、染色体10q23.31に位置する。C2093の全長mRNA配列は6319ヌクレオチドを含んでおり、1780アミノ酸をコードする。この転写産物のORFは、それぞれのエキソン1において開始する。
C2093、B5860N、およびC6055の特性をさらに調べるため、これらの遺伝子産物の細胞内局在をCOS7細胞において調べた。最初に、C2093タンパク質を発現するプラスミド(pCAGGS-C2093-HA)をCOS7細胞に一過的にトランスフェクトしたところ、210 KDa-C2093タンパク質が、ウェスタンブロット解析により予想される大きさで認められた(図4a)。免疫細胞化学染色により、外因性C2093はCOS7細胞において主に核器官に局在することが明らかになったが、いくつかの細胞では染色体の周囲に蓄積するのが観察された(図4b)。そのため、アフィディコリンを用いて細胞を同期化し、細胞周期の進行におけるC2093タンパク質の局在について調べた。顕著なことには、このタンパク質はG1/G0期およびS期には核に位置し、特にG2/M期には染色体の周囲に蓄積していた(図4c)。
C2093、B5860N、およびC6055の増殖促進の機能を評価するため、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)法により、C2093、B5860N、およびC6055を過剰発現することが示されている膀胱癌細胞株、J82、UMUC3、およびSW780で内因性のC2093、B5860N、およびC6055の発現をノックダウンした(材料および方法を参照されたい)。C2093、B5860N、およびC6055の発現レベルを、半定量的RT-PCR実験により調べた。図5〜7に示したように、C2093、B5860N、およびC6055特異的siRNAは、対照siRNA構築物(psiU6BX-EGFPおよびSCR)と比較して、それぞれの遺伝子の発現を有意に抑制した(図5a、5d、6a、7a)。C2093、B5860N、およびC6055特異的siRNAによる細胞増殖阻害を確かめるため、コロニー形成アッセイおよびMTTアッセイをそれぞれ実施した。C2093-si3構築物を導入するとJ82およびUMUC3細胞の増殖が抑制され(図5 b、c、e、f)、B5860N-si3構築物によりJ82細胞の増殖が抑制され(図6b、c)、およびC6055-si-08構築物によりSW780細胞の増殖が抑制され(図7b、c)、上記の発現低下の結果と一致した。結果はそれぞれ、3回の独立した実験により検証した。これらの知見から、C2093、B5860N、およびC6055が膀胱癌の細胞増殖において重要な機能を有することが示唆される。
外科切除した浸潤性膀胱癌組織および正常膀胱組織の切片、ならびに種々の正常組織(腎臓、心臓、肺、および肝臓)それぞれにおいて、C2093またはB5860Nの免疫組織化学的解析を行った。膀胱癌組織でのみ、両タンパク質に対する強い染色が認められ(図9a、b)、正常膀胱組織ではC2093の染色は検出されなかった(図9a)。
本報告では、ゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイを用いた膀胱癌の正確な発現プロファイルを介して、正常ヒト組織と比較して膀胱癌細胞において有意に過剰発現される新規遺伝子、C2093、B5860N、およびC6055が同定された。
レーザーキャプチャーダイセクションとゲノム全域にわたるcDNAマイクロアレイの組み合わせによって得られた、本明細書に記載の膀胱癌の遺伝子発現解析により、癌の予防および治療の標的として特異的遺伝子が同定された。差次的に発現されるこれら遺伝子の一部の発現に基づいて、本発明は、膀胱癌を同定および検出するための分子診断マーカーを提供する。
Claims (73)
- 患者由来の生体試料における膀胱癌関連遺伝子の発現レベルを決定する段階を含む、対象における膀胱癌または膀胱癌を発症する素因を診断する方法であって、該試料の発現レベルが該遺伝子の正常対照レベルと比較して上昇または低下していることにより、該対象が膀胱癌に罹患しているかまたは膀胱癌を発症するリスクがあることが示される方法。
- 膀胱癌関連遺伝子がBLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択され、さらに試料の発現レベルが正常対照レベルと比較して上昇していることにより、対象が膀胱癌に罹患しているかまたは膀胱癌を発症するリスクがあることが示される、請求項1記載の方法。
- 試料の発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10%高い、請求項2記載の方法。
- 膀胱癌関連遺伝子がBLC番号395〜1666の遺伝子からなる群より選択され、さらに試料の発現レベルが正常対照レベルと比較して低下していることにより、対象が膀胱癌に罹患しているかまたは膀胱癌を発症するリスクがあることが示される、請求項1記載の方法。
- 試料の発現レベルが正常対照レベルより少なくとも10%低い、請求項4記載の方法。
- 複数の膀胱癌関連遺伝子の発現レベルを決定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
- 遺伝子発現レベルが、以下からなる群より選択される方法によって決定される、請求項1記載の方法:
(a) 膀胱癌関連遺伝子のmRNAを検出する段階、
(b) 膀胱癌関連遺伝子によってコードされるタンパク質を検出する段階、および
(c) 膀胱癌関連遺伝子によってコードされるタンパク質の生物活性を検出する段階。 - 検出がDNAアレイ上で行われる、請求項7記載の方法。
- 患者由来の生体試料が上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 患者由来の生体試料が膀胱癌細胞を含む、請求項1記載の方法。
- 患者由来の生体試料が膀胱癌細胞由来の上皮細胞を含む、請求項1記載の方法。
- BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択される2つまたはそれ以上の膀胱癌関連遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、膀胱癌参照発現プロファイル。
- BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される2つまたはそれ以上の膀胱癌関連遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、膀胱癌参照発現プロファイル。
- BLC番号395〜1666の遺伝子からなる群より選択される2つまたはそれ以上の膀胱癌関連遺伝子の遺伝子発現パターンを含む、膀胱癌参照発現プロファイル。
- 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a) 被験化合物を、BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;および
c) ポリペプチドに結合する被験化合物を選択する段階。 - 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a) 候補化合物を、BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子を発現する細胞と接触させる段階;および
b) 被験化合物の非存在下で検出されるポリペプチドの発現レベルと比較して、BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを低下させるか、またはBLC番号395〜1666の遺伝子からなる群より選択される1つもしくは複数のマーカー遺伝子の発現レベルを上昇させる候補化合物を選択する段階。 - 細胞が膀胱癌細胞を含む、請求項16記載の方法。
- 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a) 被験化合物を、BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと接触させる段階;
b) 段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;および
c) 被験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して、BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を抑制するか、または被験化合物の非存在下で検出される該ポリペプチドの生物活性と比較して、BLC番号395〜1666の遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの生物活性を増強する被験化合物を選択する段階。 - 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
a) 候補化合物を、BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
b) 該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;および
c) 被験化合物の非存在下で検出される該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と比較して、該マーカー遺伝子がBLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される上方制御されるマーカー遺伝子である場合に、該レポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性を低下させるか、または該マーカー遺伝子がBLC番号395〜1666の遺伝子からなる群より選択される下方制御されるマーカー遺伝子である場合に、該レポーター遺伝子の発現レベルもしくは活性を増強する候補化合物を選択する段階。 - (a) BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択される2つもしくはそれ以上の核酸配列、または(b) それらによってコードされるポリペプチドに結合する検出試薬を含むキット。
- BLC番号1〜1666の遺伝子からなる群より選択される1つまたは複数の核酸配列に結合する2つまたはそれ以上の核酸を含むアレイ。
- アンチセンス組成物を対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法であって、該アンチセンス組成物が、BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択されるコード配列に相補的なヌクレオチド配列を含む方法。
- siRNA組成物を対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法であって、該siRNA組成物が、BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される核酸配列の発現を低下させる方法。
- BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択されるいずれか1つの遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその免疫学的活性断片の薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法。
- (a) BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される核酸によってコードされるポリペプチド、
(b) 該ポリペプチドの免疫学的活性断片、または
(c) ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を含むワクチンを対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法。 - 抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、抗原提示細胞をポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを含むベクターと接触させる段階を含む方法であり、ポリペプチドがBLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される遺伝子によってコードされるか、またはその断片をコードする免疫原性ポリペプチドである方法。
- 抗原提示細胞を対象に投与する段階をさらに含む、請求項26記載の抗腫瘍免疫を誘導する方法。
- 対象における膀胱癌を治療または予防する方法であって、請求項15〜19のいずれか一項記載の方法によって得られる化合物を投与する段階を含む方法。
- (a) BLC番号395〜1666の遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチド、または(b) それによってコードされるポリペプチドを含む物質の薬学的有効量を対象に投与する段階を含む、対象における膀胱癌を治療または予防する方法。
- 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択されるポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたはsiRNAの薬学的有効量を含む組成物。
- 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、BLC番号1〜394の遺伝子からなる群より選択される遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体またはその断片の薬学的有効量を含む組成物。
- 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、有効成分としての、請求項15〜19のいずれか一項記載の方法によって選択される化合物の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 以下からなる群より選択される、実質的に純粋なポリペプチド:
(a) SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b) SEQ ID NO:4のアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:4と少なくとも約80%の相同性を有する配列を含むポリペプチド;
(c) SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列内の1つまたは複数のアミノ酸が欠失、付加、挿入、および/または他のアミノ酸による置換によって修飾され、かつ変異の数が典型的に全アミノ酸の35%以下であるポリペプチドであり、SEQ ID NO:4のいずれか1つのアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド;および
(d) SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:4のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。 - 請求項33記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項34記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項34記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターを保有する宿主細胞。
- 請求項33記載のポリペプチドを産生する方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 請求項33記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドを含むベクターを保有する宿主細胞を培養する段階;
(b) 宿主細胞にポリペプチドを発現させる段階;および
(c) 発現されたポリペプチドを回収する段階。 - 請求項33記載のポリペプチドに結合する抗体であって、SEQ ID NO:4の304〜588のアミノ酸配列を含む抗原決定基に結合する抗体。
- SEQ ID NO:3のポリヌクレオチドまたはその相補鎖と相補的であり、かつ少なくとも15ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであって、SEQ ID NO:3の988〜1842位を含むヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
- SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAであって、アンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの標的配列が、SEQ ID NO:3の988〜1842位から選択されるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNA。
- 膀胱癌を診断する方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 生体試料における、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする遺伝子の発現レベルを検出する段階;および
(b) 発現レベルの上昇を膀胱癌と関連づける段階。 - 発現レベルが以下からなる群より選択される方法のいずれか1つによって検出される、請求項41記載の方法:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするmRNAを検出する段階;
(b) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を検出する段階;および
(c) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質の生物活性を検出する段階。 - 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 被験化合物を、以下からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階:
(1) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該配列と少なくとも約80%の相同性を有する配列を含むポリペプチド;および
(3) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド;
(b) ポリペプチドと被験化合物との結合活性を検出する段階;ならびに
(c) ポリペプチドに結合する化合物を選択する段階。 - 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 被験化合物を、以下からなる群より選択されるポリペプチドと接触させる段階:
(1) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列、または該配列と少なくとも約80%の相同性を有する配列を含むポリペプチド;および
(3) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド;
(b) 段階(a)のポリペプチドの生物活性を検出する段階;ならびに
(c) 被験化合物の非存在下で検出される生物活性と比較して、ポリペプチドの生物活性を抑制する化合物を選択する段階。 - 生物活性が細胞増殖活性である、請求項44記載の方法。
- 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 被験化合物を、SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する細胞と接触させる段階;および
(b) 被験化合物の非存在下で検出される発現レベルと比較して、SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチドの発現レベルを低下させる化合物を選択する段階。 - 細胞が膀胱癌細胞である、請求項46記載の方法。
- 膀胱癌を治療または予防するための化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含む方法:
(a) 被験化合物を、SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135のヌクレオチド配列のいずれか1つを含む1つまたは複数のマーカー遺伝子の転写制御領域およびその転写制御領域の調節下で発現されるレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と接触させる段階;
(b) 該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を測定する段階;および
(c) 被験化合物の非存在下で検出される該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性と比較して、該レポーター遺伝子の発現レベルまたは活性を低下させる化合物を選択する段階。 - 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、当該組成物は活性成分としてのポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの薬学的有効量および薬学的に許容される担体を含むものであり、ポリヌクレオチドが以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードする組成物:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(c) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。 - 低分子干渉RNAが標的配列としてSEQ ID NO:21、25、または144のヌクレオチド配列を含む、請求項49記載の組成物。
- siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、
式中、[A]はSEQ ID NO:21、25、または144のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
[B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
[A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、
請求項50記載の組成物。 - 組成物がトランスフェクション促進剤を含む、請求項49記載の組成物。
- 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、以下からなる群より選択されるポリペプチドに対する活性成分としての抗体の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む組成物:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(c) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。 - 膀胱癌を治療または予防するための組成物であって、請求項43〜48のいずれか一項記載の方法によって選択される活性成分としての化合物の薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む組成物。
- 膀胱癌を治療または予防する方法であって、以下からなる群より選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスポリヌクレオチドまたは低分子干渉RNAの薬学的有効量を投与する段階を含む方法:
(1) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(2) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(3) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。 - siRNAが標的配列としてSEQ ID NO:21、25、または144のヌクレオチド配列を含む、請求項55記載の方法。
- siRNAが一般式5'-[A]-[B]-[A']-3'を有し、
式中、[A]はSEQ ID NO:21、25、または144のヌクレオチド配列に対応するリボヌクレオチド配列であり、
[B]は3〜23ヌクレオチドからなるリボヌクレオチド配列であり、かつ
[A']は[A]の相補配列からなるリボヌクレオチド配列である、
請求項56記載の方法。 - 組成物がトランスフェクション促進剤を含む、請求項57記載の方法。
- 膀胱癌を治療または予防する方法であって、以下からなる群より選択されるポリペプチドに対する抗体の薬学的有効量を投与する段階を含む方法:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;および
(c) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド。 - 膀胱癌を治療または予防する方法であって、請求項43〜48のいずれか一項記載の方法によって選択された化合物の薬学的有効量を投与する段階を含む方法。
- 膀胱癌を治療または予防する方法であって、(a)〜(c)からなる群より選択されるポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの薬学的有効量を投与する段階を含む方法:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその断片;
(b) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド、またはその断片。 - 抗腫瘍免疫を誘導する方法であって、(a)〜(c)からなる群より選択されるポリペプチドを抗原提示細胞と接触させるか、またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドを含むベクターを抗原提示細胞に導入する段階を含む方法:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその断片;
(b) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド、またはその断片。 - 抗原提示細胞を対象に投与する段階をさらに含む、請求項62記載の抗腫瘍免疫を誘導する方法。
- 膀胱癌を治療または予防するための薬学的組成物であって、活性成分としての、(a)〜(c)の群より選択されるポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの薬学的有効量、および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物:
(a) SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはその断片;
(b) 1つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加され、かつSEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有する、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(c) SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドであって、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等な生物活性を有するポリペプチド、またはその断片。 - ポリヌクレオチドが発現ベクターに組み込まれている、請求項64記載の薬学的組成物。
- 膀胱癌を診断するための診断薬であって、試薬が、SEQ ID NO:2、4、6、130、132、134、および136からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、または該ポリペプチドに結合する抗体を含む診断薬。
- センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であって、センス鎖がSEQ ID NO:21、25、または144に対応するリボヌクレオチド配列を含み、かつアンチセンス鎖が該センス鎖と相補的なリボヌクレオチド配列を含み、該センス鎖と該アンチセンス鎖が相互にハイブリダイズして二本鎖分子を形成し、SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる遺伝子の少なくともいずれか1つを発現する細胞に導入した場合に、該遺伝子の発現を阻害する二本鎖分子。
- センス鎖が、SEQ ID NO:1、3、5、129、131、133、および135からなる群より選択されるヌクレオチド配列のいずれか1つに由来する約19〜約25個の連続したヌクレオチドを含む、請求項67記載の二本鎖分子。
- センス鎖がSEQ ID NO:21、25、または144に対応するリボヌクレオチド配列からなる、請求項67記載の二本鎖分子。
- 単一のリボヌクレオチド転写産物がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、請求項67記載の二本鎖分子であって、該センス鎖と該アンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む二本鎖分子。
- 請求項67記載の二本鎖分子をコードするベクター。
- 二次構造を有する転写産物をコードする請求項71記載のベクターであって、転写産物がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むベクター。
- 転写産物が、センス鎖とアンチセンス鎖を連結する一本鎖リボヌクレオチド配列をさらに含む、請求項71記載のベクター。
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