JP2010501827A - Ｍｐｈｏｓｐｈ１とｐｒｃ１の結合を阻害する作用物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、MPHOSPH1とPRC1の結合を阻害または抑制する作用物質の同定方法を提供する。そのような作用物質は、MPHOPH1とPEC1を発現している細胞の増殖抑制、および癌、特に膀胱癌を予防または治療する薬剤としての機能が期待される。

Description

技術分野
本出願は、2006年8月25日に出願した米国仮特許出願第60/840,124号の恩典を主張し、これらの内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本発明は、M期ホスホプロテイン（MPHOSPH1）と細胞質分裂タンパク質調節因子1（PRC1）の結合を指標として用いたスクリーニング方法に関する。作用物質は癌、特に膀胱癌の治療または予防に適用でき、本方法によって同定することができる。

背景技術
膀胱癌はヒト集団において2番目に多く見られる泌尿生殖器腫瘍であり、全世界で毎年、およそ357,000人の新たな症例が発生している。（Parkin DM et al., CA Cancer J Clin 2005, 55: 74-108（非特許文献1））。患者の約1/3は診断時に浸潤性疾患または転移性疾患となっている可能性が高い(Parkin DM et al., CA Cancer J Clin 2005, 55: 74-108（非特許文献1）; Sternberg CN, Ann Oncol 1995, 6: 113-26（非特許文献2）; Ardavanis A et al., Br J Cancer 2005, 92: 645-50（非特許文献3）)。根治的膀胱切除術は、局所的であるが筋層浸潤性膀胱癌を有する患者を治療するための“最も標準的な治療法”と考えられているが、そのような患者の約50％は膀胱切除術後2年以内に転移を発症し、その後その疾患により死亡する（Sternberg CN, Ann Oncol 1995, 6: 113-26（非特許文献2））。

この20年間、CMV(シスプラチン、メトトレキセート、ビンブラスチン)やM-VAC（メトトレキセート、ビンブラスチン、ドクソルビシン、シスプラチン）などのシスプラチンベースのコンビネーション化学療法が進行膀胱癌患者へ第一に適用されてきた（Ardavanis A et al., Br J Cancer 2005, 92: 645-50（非特許文献3）; Lehmann J et al., World J Urol 2002, 20: 144-50（非特許文献4））。しかし、総合的な予後予測は未だ不十分なままである。さらに、M-VAC化学療法の副作用は極めて深刻である（Vaughn DJ, Semin Oncol 1999, 26(suppl 2): 117-22（非特許文献5））。そのため、膀胱癌に対する新規分子標的薬の開発が真剣に望まれている。

cDNAマイクロアレイは、同時に何千もの遺伝子の発現パターンを解析する効果的手段であることが証明されてきた。cDNAマイクロアレイによる癌細胞と正常細胞のゲノム全体の発現プロファイルの比較は、癌の診断と治療の開発のための候補標的分子の発見を可能にする有効な情報であることが実証されている（Debouck C et al., Na Genet 1999, 21: 48-50（非特許文献6））。最近の薬剤開発研究はイマチニブ、メシレート、トランスツマブに代表される、発癌に関連する重要分子を標的にすることに集中してきた。RNAiと癌発現プロファイリングの組み合わせは、治療のためのそのような薬剤標的の同定を可能にする見込みがある(Clarke PA et al., Eur J Cancer 2004, 40: 2560-91（非特許文献7）)。

ゲノム全体の発現解析によって、肝細胞癌（Hamamoto R et al., Nat Cell Biol2004, 6: 731-40（非特許文献8）; YagyuR et al., Int J Oncol2002, 20: 1173-8（非特許文献9））、滑膜肉腫（Nagayama S et al., Oncogene 2004, 23: 5551-7（非特許文献10）; Nagayama S et al., Oncogene 2005. 24: 6201-12（非特許文献11））、腎細胞癌（Togashi A et al., Cancer Res 2005, 65: 4817-26（非特許文献12））、乳癌（WO 2005/28676（特許文献1））の発達および/または進行に関連する多くの癌遺伝子が単離された。そのような分子は新しい治療方法開発の有効な候補分子であると考えられる。

しばしば重篤な副作用を生じるM-VACなどの細胞毒のため、十分に特徴付けられたメカニズムに基づく新規標的分子の慎重な選択は、副作用の危険性が最小限である効果的な抗癌剤開発には非常に有益である。目標のため、膀胱癌26例と正常ヒト組織29例の発現プロファイル解析を以前行い、次々に膀胱癌に特異的に高発現する多数の遺伝子を発見した(Takata R et al., Clin Cancer Res April 1, 2005, 11(7): 2625-36（非特許文献13）; Saito-Hisaminato A et al., DNA Res 2002, 9: 35-45（非特許文献14）)。MPHOSPH1(C2093参照)は膀胱癌で高発現している遺伝子の一つとして同定された。

さらに、MPHOSPH1はG2/M期において特異的にリン酸化されるタンパク質として以前に同定されており、さらにプラス端キネシン関連タンパク質として明らかにされた(Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52（非特許文献15）)。MPHOSPH1 cDNAはNH2型キネシン関連タンパクで特徴付けられる3つのドメイン、NH2キネシンモータードメイン、中央コイルドコイル・ストークドメイン、Cグロビュラーテールドメインから構成される、1780アミノ酸をコードしている。その上さらに、MPHOSPH1は細胞質分裂において重要な役割を持つプラス端分子モーターであること、HeLa細胞において後期から終期にかけての紡錘体のミッドゾーンに蓄積されることが証明されている。

PRC1はいくつかのキネシンファミリータンパクと相互作用することが報告された（Ban R et al., J Biol Chem 2004, 279: 16394-402（非特許文献16）; Kurasawa Y et al., EMBO J 2004, 23: 3237-48（非特許文献17）; Zhu C & Jiang W, Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 343-8（非特許文献18）; Gruneberg U et al., J Cell Biol 2006, 172: 363-72（非特許文献19））。Hela細胞における抗PRC1抗体によるPRC1抑制は二核細胞の増加を生じることが報告されている（Mollinari C et al., J Cell Biol 2002, 157: 1175-86（非特許文献20））。さらに、PRC1は幾つかの分子、例えば細胞分裂、特に細胞質分裂に関わるKIF4またはKIF14と相互作用しうることが報告された(EMBO J 2004, 23: 3237-48（非特許文献21）; Mollinari C et al., Mol Biol Cell 2005, 16: 1043-55（非特許文献22）)。さらに、PRC1は本発明者らによって同定されており、乳癌で高発現している（WO 2005/28676（特許文献1））。

WO 2005/28676

Parkin DM et al., CA Cancer J Clin 2005, 55: 74-108 Sternberg CN, Ann Oncol 1995, 6: 113-26 Ardavanis A et al., Br J Cancer 2005, 92: 645-50 Lehmann J et al., World J Urol 2002, 20: 144-50 Vaughn DJ, Semin Oncol 1999, 26(suppl 2): 117-22 Debouck C et al., Na Genet 1999, 21: 48-50 Clarke PA et al., Eur J Cancer 2004, 40: 2560-91 Hamamoto R et al., Nat Cell Biol2004, 6: 731-40 YagyuR et al., Int J Oncol2002, 20: 1173-8 Nagayama S et al., Oncogene 2004, 23: 5551-7 Nagayama S et al., Oncogene 2005. 24: 6201-12 Togashi A et al., Cancer Res 2005, 65: 4817-26 Takata R et al., Clin Cancer Res April 1, 2005, 11(7): 2625-36 Saito-Hisaminato A et al., DNA Res 2002, 9: 35-45 Abaza A et al., J Biol Chem 2003, 278: 27844-52 Ban R et al., J Biol Chem 2004, 279: 16394-402 Kurasawa Y et al., EMBO J 2004, 23: 3237-48 Zhu C & Jiang W, Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 343-8 Gruneberg U et al., J Cell Biol 2006, 172: 363-72 Mollinari C et al., J Cell Biol 2002, 157: 1175-86 EMBO J 2004, 23: 3237-48 Mollinari C et al.,Mol Biol Cell 2005, 16: 1043-55

発明の概要
本発明は、少なくとも一部分はインビボでのMPHOHPH1とPRC1の相互作用の発見に基づく。MPHOSPH1とPRC1の両タンパクは、膀胱癌細胞で過剰発現しており、MPHOSPH1発現は膀胱癌細胞と正常睾丸組織のみであることが観察されている。本明細書中に示されているように、これらのタンパクをコードする遺伝子のうち1つを阻害すると次々に細胞質分裂が抑制され、多核化を誘導し、最終的にその遺伝子を発現する細胞の増殖抑制を導く。

したがって、本発明はMPHOSPH1とPRC1の結合阻害剤のスクリーニング方法を提供する。さらに具体的には、a)作用物質存在下でMPHOSPH1とPRC1を接触、b)MPHOSPH1とPRC1の結合レベルを検出、c)作用物質非存在下で検出したMPHOSPH1とPRC1の結合レベルと比較、d)MPHOSPH1とPRC1の結合レベルを減少させる作用物質を選択する、という段階を含む方法である。この方法では、断片とは各断片がそのパートナーリガンドとの結合能力を維持している限りは全長MPHOSPH1または全長PRC1の代わりに使用することができる。本スクリーニングに使用される特に好ましいMPHOSPH1断片は、配列番号:2の1188から1718のアミノ酸残基を含む。

上記方法によって同定された作用物質は、そのタンパク質を発現する細胞の増殖を抑制するであろうことを考慮すると、そのように同定された作用物質は膀胱癌の治療または予防の候補物質として役立つ。そのため、本発明は膀胱癌治療または予防剤と同様に、膀胱癌細胞増殖抑制剤の同定方法もまた提供する。

膀胱癌と正常組織におけるMPHOSPH1の発現を示す。パネルAは10例の膀胱癌患者の癌細胞とヒト正常組織(マイクロダイセクションした正常膀胱移行細胞、心臓、肺、肝臓、腎臓)における半定量的RT-PCRによるMPHOSPH1の発現を示す。パネルBは膀胱癌細胞株（HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4）および正常ヒト臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脳、膵臓、睾丸、膀胱）におけるMPHOSPH1転写物のノーザンブロット解析の結果を示す。パネルCは種々のヒト組織におけるMPHOSPH1転写物のノーザンブロット解析結果を示す。パネルDは外科的切除した膀胱癌組織（表在膀胱癌2例と浸潤膀胱癌2例）と正常膀胱組織切片における、アフィニティー精製した抗MPHOSPH1ポリクローナル抗体を使用した免疫組織化学的染色によるMPHOSPH1タンパク質発現を示す。 細胞周期の進行における膀胱癌細胞の内因性MPHOSPH1タンパク質の細胞内局在を示す。UMUC細胞はアフィニティー精製したMPHOSPH1ポリクローナル抗体で免疫組織化学的染色を行った（緑）。DAPIは核染色を表す（青）。 膀胱癌細胞株、J82とUMUC3におけるMPHOSPH1-siRNAの増殖阻害効果を示す。パネルAはウエスタンブロット（上パネル）と半定量的RT-PCR（下パネル）によるMPHOSPH1発現を示す。パネルBはMPHOSPH1-siRNA、対照siRNA(EGFP)またはMPHOSPH1ミスマッチsiRNA発現プラスミドをトランスフェクトしたJ82細胞とUMUC3細胞における、コロニー形成アッセイの結果を示す。パネルCはMPHOSPH1-siRNAによる誘導に応答して、対照による誘導と比較するとJ82細胞およびUMUC3細胞のMTTアッセイによる生存可能性が上昇したことを示す。 NIH3T3細胞における外因性MPHOSPH1の増殖促進効果を示す。パネルAは外因性MPHOSPH1高レベル発現細胞もしくはモックべクターをトランスフェクトした細胞のウエスタンブロット解析の結果を示す。外因性の導入したMPHOSPH1発現は抗HA標識モノクローナル抗体で認識した。ローディングコントロールとしてベータ‐アクチンを使用した。パネルBはインビトロでのNIH3T3-MPHOSPH1細胞増殖を示す。MPHOPH1をトランスフェクトしたNIH3T3細胞（NIH3T3-MPHOPH1-#1、#2、#3）とモックをトランスフェクトした細胞(NIH3T3-モック-#1、#2、#3)の増殖はMTTアッセイで測定した。パネルCでは、NIH3T3-MPHOSPH1(NIH3T3-MPHOSPH1-#1)とモック（NIH3T3-モック#1）を24時間アフィジコリン処理で同調させた。細胞周期解除後、表示した時点で細胞試料を調製した。パネルDはNIH3T3-MPHOSPH1細胞で実施したインビボ腫瘍増殖アッセイの結果を示す。腫瘍の直径はカリパスで測定し、腫瘍体積は次の方法：0.5×(最大直径)×（最小直径）²で決定した。対応のないt検定は、インジェクション後21日のNIH3T3-MPHOSPH1とNIH3T3-モックの差異を評価した（P<0.001; 対応のないt検定）。 MPHOSPH1およびPRC1の相互作用を示す。パネルAは半定量的RT-PCRによる膀胱癌症例のMPHOSPH1およびPRC1の発現を示す。GAPDH発現は内部対照として使用した。パネルBはMPHOSPH1およびPRC1の共免疫沈降を示す。HA標識MPHOSPH1とmyc標識PRC1タンパクをトランスフェクトしたCOS7細胞の細胞抽出液を抗HAまたは抗mycで免疫沈降した。免疫沈降物はモノクローナル抗HA抗体または抗myc抗体でイムノブロットを行った。パネルCはUMUC3細胞における内因性MPHOSPH1および外因性PRC1の細胞内局在を示す。内因性MPHOSPH1タンパク（緑）は外因性PRC1タンパク（赤）と共局在していた。 PRC1と相互作用するMPHOSPH1の決定された領域を示す。パネルAは免疫沈降実験に使用したMPHOSPH1の断片および全長の模式図である。パネルBは一連のMPHOSPH1断片およびPRC1の共免疫沈降を示す。HA標識MPHOSPH1とmyc標識PRC1タンパク質をトランスフェクトしたCOS7細胞からの細胞抽出液は、抗HAまたは抗mycで免疫沈降した。免疫沈降物は図5の説明で記載したようにモノクローナル抗HA抗体または抗myc抗体でイムノブロットを行った。 膀胱癌の細胞増殖におけるMPHOSPH1およびPRC1の重要な役割を示す。パネルAは半定量的RT-PCR（上段左）、コロニー形成アッセイ（下段左）、MTTアッセイ（右）で解析した、J82細胞におけるsi-PRC1または対照siRNA(si-EGFP)の効果を示す。パネルBは半定量的RT-PCR（上段左）、コロニー形成アッセイ（下段左）、MTTアッセイ（右）で解析した、UMUC3細胞におけるsi-PRC1または対照siRNA(si-EGFP)の効果を示す。パネルCはsi-MPHOSPH1、si-PRC1、または対照としてsi-EGFPをトランスフェクトしたUMUC3細胞の形態を示す。si-MPHOSPH1、si-PRC1、または対照siRNAとしてのsi-EGFPをトランスフェクトしたUMUC細胞の形態は顕微鏡下で観察（上パネル）、または免疫細胞化学（下パネル）により評価した。siRNAをトランスフェクトしたUMUC細胞は核と細胞質を見分けるため、DAPIとファロイジンで染色した。

発明の詳細な説明
マイクロアレイ解析で検出された膀胱癌で上方制御された遺伝子の中で、本発明は検査した膀胱癌細胞の大多数で高度に過剰発現していた遺伝子、MPHOSPH1（M-phase phosphoprotein 1）(配列番号:1)(NM_016195)に注目した。ノーザンブロット解析は、MPHOSPH1発現が睾丸を除いたどの正常ヒト組織でもほとんど検出されないことを示した。さらに、抗MPHOSPH1ポリクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色実験は明らかに膀胱癌細胞におけるMPHOSPH1（配列番号:2）発現の上方制御を示し、それらはMPHOSPH1が癌-睾丸抗原であることを示唆している（Kanehira M et al., Cancer Res. 2007, 67(7): 3276-85）。同時に、これらの結果はMPHOSPH1遺伝子が膀胱癌の抗癌剤または癌ペプチドワクチンの開発の有望な標的であることを示唆している。

さらに、免疫細胞化学的染色実験は、MPHOSPH1が間期には膀胱癌細胞の核、後期には中央部に、終期には収縮環に局在することを示した。加えて、siRNAによる内因性MPHOSPH1のノックダウンは膀胱癌細胞の細胞質分裂の失敗を誘導し、結果として多核細胞が蓄積され、それに続く細胞死が誘導されることを実証した。そのため、膀胱癌細胞におけるMPHOSPH1の生物学的役割は、それに相互作用するタンパク質を同定することによって検討した。

MHPOSPH1はPRC1(配列番号:36でコードされる配列番号:37)(AF044588)(Protein regulator of Cytokinesis 1)、その発現もまた膀胱癌で上方制御される遺伝子、と相互作用することが見出された。膀胱癌細胞におけるその機能的類似性と共通の過剰発現によって、PRC1はMPHOSPH1と相互作用する候補物質として選択された。図5に示すように、MPHOSPH1およびPRC1(Protein regulator of cytokinesis 1)の膀胱癌細胞におけるインビボ相互作用と共局在は間期から後期にみられたが、終期細胞において、MPHOSPH1は中心体の中央に局在するPRC1を取り囲んでいた（図5C）。従って、紡錘体におけるMPHOSPH1およびPRC1の関連性および共局在は、MPHOSPH1が細胞分裂の間、紡錘体と平行してPRC1を移行させるモータータンパクであるという主張をさらに裏付ける。膀胱癌症例におけるそれらの共転写促進は、膀胱癌形成過程において、それらの相互作用が必須の役割を果たすことを示唆している（図5A）。

さらに、特異的siRNAを用いたMPHOSPH1またはPRC1どちらかの発現抑制は、多核細胞形成の誘導に加え、その後細胞死が生じる。MPHOSPH1またはPRC1が膀胱癌細胞の増殖または生存に役割があるかどうか評価するため、内因性MPHOSPH1またはPRC1のどちらかの発現をMPHOSPH1とPRC1発現が高レベルである膀胱癌細胞株、J82またはUMUC3において特異的siRNAでノックダウンした。各特異的siRNAは一致する遺伝子発現を顕著に抑制し、その結果これらの細胞を著しく増殖抑制した。これらは膀胱癌細胞の増殖にMPHOSPH1およびPRC1の両方が必須であることを示している。さらに、UMUC3細胞におけるMPHOSPH1またはPRC1発現のノックダウンは多核化細胞の顕著な増加を生じさせた。これらの結果は、抗PRC抗体のHeLa細胞へのマイクロインジェクションによるPRC1抑制が、倍核細胞の増加を生じさせ得るという文献を証明している(Mollinari C et al., J Cell Biol 2002, 157: 1175-86)。それらの相互作用の阻害は、膀胱癌細胞の細胞質分裂の失敗後、最終的に細胞死を誘導する可能性があるため、それらの相互作用を阻害する作用物質は、膀胱癌に対する薬剤開発の有望な標的として役立つ。

本発明者らによって得られたマイクロアレイデータは膀胱癌における限定的なMPHOSPH1過剰発現を明らかにした。しかし、MPHOSPH1と相互作用することが発見されたタンパクPRC1は、膀胱癌細胞だけでなく、幾つかの他の型のヒト腫瘍にも過剰発現していた（データ示さず）。PRC1が幾つかの分子、例えば有糸分裂事象、特に細胞質分裂と関連するKIF4またはKIF14(Kurasawa Y et al., EMBO J 2004, 23: 3237-48; Mollinari C et al., Mol Biol Cell 2005, 16: 1043-55)と相互作用するという報告のある一方、本発明者らによって得られた膀胱癌の発現プロファイルによるとKIF4もKIF14も膀胱癌で発現していない。細胞増殖のためのこの相互作用の役割および、他の結合パートナーの存在はまだ解明されていないままであるが、これらの結果は、中央部微小管束の安定化、およびMPHOSPH1とPRC1の相互作用による細胞分裂完了の容認による細胞質分裂の制御が、膀胱癌細胞に特異的事象であることを示唆する。

最終的に、MPHOSPH1/PRC1経路が膀胱癌細胞において発癌機能を有すること、膀胱癌に対する抗癌剤開発の有望な分子標的となり得ることが示唆された。MPHOSPH1とPRC1の結合抑制剤または阻害剤開発は膀胱癌治療の合理的戦略である可能性がある。MPHOSPH1およびPRC1の結合は更なる分析が必要であるが、本明細書中に提供された知見は膀胱癌発癌のより深い理解と膀胱癌新規治療法の開発の一助となる。

本明細書で用いられる「1つの(a、an)」、および「その(the)」という単語は、特記しない限り「少なくとも1つの」を意味する。

物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然供給源に含まれているかもしれない少なくとも一つの物質を実質的に含まないことを示す。従って、単離された、または精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）が由来する細胞または組織供給源からの炭化水素、脂質、もしくはその他の混入タンパク質のような細胞材料を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には、化学前駆物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドが、それが単離されたかまたは組換えにより作製された細胞の細胞成分から分離されているような、ポリペプチドの調製物が含まれる。従って、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドには、（乾重量で）約30％、20％、10％、または5％未満の異種タンパク質（本明細書中、「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組み換えにより作製される場合、これは、好ましくは、培養培地を実質的に含まず、かつ、タンパク質調製物の容量の約20％、10％、または5％未満の培養培地を含むポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、これは、好ましくは、化学前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まず、かつ、タンパク質調製物の容量の（乾重量で）約30％、20％、10％、5％未満のタンパク質の合成に関与した化学前駆物質またはその他の化学物質を含むポリペプチドの調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が、単離または精製されたポリペプチドを含有していることは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の、単一のバンドの出現によって示され得る。好ましい態様において、本発明の抗体は単離されているか、または精製されている。

cDNA分子のような「単離された」または「精製された」核酸分子は、他の細胞材料を、もしくは、組み換え技術によって作製された場合には培養培地を実質的に含まない可能性があり、または、化学合成された場合には、化学前駆物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離されているか、または精製されている。

「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。それらの用語は、天然のアミノ酸ポリマーのみならず、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体のような修飾された残基または天然には存在しない残基であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるものおよび細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびR基）を有するが、R基または骨格が改変された化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、一般的なアミノ酸と類似した機能を有する化学化合物(chemical compound)を指す。

アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨された、一般的に公知の三文字記号または一文字記号によって言及されうる。

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記されない限り交換可能に使用され、かつ、アミノ酸と同様に、一般的に認められている一文字コードによって言及される。アミノ酸と同様に、それらは天然の核酸ポリマーおよび天然には存在しない核酸ポリマーの両方を包含する。

ヒトMPHOSPH1の塩基配列は配列番号:1（GenBank Accession NM_016195）に示される。明細書中の「MPHOSPH1遺伝子」とは、ヒトではない霊長類、マウス、ラット、犬、猫、馬、牛を含む他の動物だけでなくヒトMPHOSPH1遺伝子も包含する。しかし、本発明はそれらに限られず、対立遺伝子の変異およびMPHOSPH1遺伝子と対応する他の動物の遺伝子を含む。

ヒトMPHOSPH1遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は配列番号:2（GenBank Accession NP_057279.2）に示される。明細書中のMPHOSPH1遺伝子によってコードされるポリペプチドは「MPHOSPH1」をと示し、時折「MPHOSPH1ポリペプチド」または「MPHOSPH1タンパク質」と示す。

ヒトPRC1遺伝子の塩基配列は、配列番号:36に示される。さらに、15、14、および14エクソンから成る3つの異なる転写変異体はそれぞれ公知である。変異体の塩基配列およびアミノ酸配列はGenBankで検索することができる（以下に示すように、GenBank Accession NoNM_003981、NM_199413、NM_199414の変異体の配列はそれぞれV1、V2およびV3、対応するアミノ酸配列はそれぞれGenBank Accession No. NM_003972.1、NP_955445.1、NM_955446.1である）。V1のエクソン13および14におけるオルタナティブ変異を除き、他の全てのエクソンは3つの変異体に共通していた。V2変異体はV1のエクソン14がなく、新規の初期停止コドンが最後のエクソン内に含まれている。V3変異体のエクソン14は完全に欠失しており、V3のエクソン13はV1の3´末端よりも77bp短く、最後のエクソン中に新規の初期停止コドンを含んでいた。変異体V1、V2およびV3はそれぞれ620、606および566アミノ酸のタンパク質をコードする。

明細書中の「PRC1遺伝子」という用語は、全てのヒトPRC1遺伝子変異体を包含し、ヒトでない霊長類、マウス、ラット、犬、猫、馬、牛を含む他の動物も同様、それに限られるものではなく、他の動物で見られるPRC1遺伝子と対応する遺伝子および突然変異体も含む。

ヒトPRC1遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は配列番号:37に示される。明細書中の、PRC1遺伝子によってコードされるポリペプチドとは「PRC1」を指し、時折「PRC1ポリペプチド」または「PRC1タンパク質」を指す。

本発明の一態様によると、機能的同等物とは、「MPHOSPH1ポリペプチド」および「PRC1ポリペプチド」とも見なされる。本明細書において、タンパク質の「機能的同等物」とは生物活性を有するポリペプチド、特に結合活性がそのタンパク質と同等なものをいう。すなわち、PRC1タンパク質に対するMPHOSPH1タンパク質の活性、またはMPHOSPH1タンパク質に対するPRC1タンパク質の活性を維持するいかなるポリペプチドも、本発明におけるポリペプチドの機能的同等物のように用いられうる。そのような機能的同等物は、天然の状態で生じたMPHOSPH1またはPRC1タンパク質のアミノ酸配列に、1つまたは多数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入したものを含む。

一般的に、タンパク質のアミノ酸の1つまたは複数の改変は、そのタンパク質の機能に影響を与えないことが知られている（Mark DF et al., Proc Natl Acad Sci USA 1984, 81: 5662-6; Zoller MJ&Smith M, Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500; Wang A et al., Sxience 1984, 224: 1431-3; Dalbadie-McFarland G et al., Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79: 6409-13）。実際、ある特定のアミノ酸配列の1つまたは複数のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および/または付加によって改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である変異タンパク質または改変タンパク質は、当初の生物活性を保持することが知られている(Mark et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6；Zoller and Smith, (1982) Nucleic Acids Res 10: 6487-500；Dalbadie-McFarland et al., (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13)。そのため、当業者は、一つのアミノ酸またはアミノ酸の一部を変える、アミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入または置換、または同じような機能を有するタンパク質となるタンパク質の改変のような、「保存的改変物」は本発明の文脈の中に含まれると認識するだろう。

タンパク質の活性が維持される限り、アミノ酸変異の数は特に制限されない。しかし、一般に変異の数はアミノ酸配列の5%またはそれ以下が好ましい。次に、好ましい態様において、そのような変異体において変異させるアミノ酸の数は一般に30アミノ酸またはそれ未満、好ましくは20アミノ酸またはそれ未満、より好ましくは10アミノ酸またはそれ未満、さらに好ましくは6アミノ酸またはそれ未満、よりより好ましくは3アミノ酸またはそれ未満である。

変異させるアミノ酸残基は、アミノ酸側鎖の特性が保存される別のアミノ酸に変異させることが好ましい(保存的アミノ酸置換として知られる過程)。アミノ酸側鎖の特性の例には、疎水性アミノ酸(アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、バリン)、親水性アミノ酸(アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、セリン、スレオニン)、および以下の官能基または特徴を共通して有する側鎖がある：脂肪族側鎖(グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン)；水酸基含有側鎖(セリン、スレオニン、チロシン)；硫黄原子含有側鎖(C、M)；カルボン酸およびアミド含有側鎖(アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン)；塩基含有側鎖(アルギニン、リジン、ヒスチジン)；ならびに芳香族含有側鎖（ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン)。さらに、保存的置換表が機能的に類似のアミノ酸を提供することは公知である。例えば、以下の8群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
1） アラニン（A）、グリシン（G）；
2） アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
3） アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4） アルギニン（R）、リジン（K）；
5） イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6） フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7） セリン（S）、スレオニン（T）；および
8） システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton, Proteins(1984)を参照されたい）。

そのような保存的改変ポリペプチドは、本発明のMPHOSPH1またはPRC1タンパク質に含まれる。しかし、本発明はこれに限定されるものではなく、MPHOSPH1およびPRC1タンパク質は基タンパク質の結合活性が維持される限り、非保存的改変を含む。さらに、改変タンパク質は多様な変異体、種間相同性、これらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。

1つまたは複数のアミノ酸残基の付加によって改変されたタンパク質の一例は、融合タンパク質である。融合タンパク質とはMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と他のペプチドまたはタンパク質の融合物であり、本発明でも用いられうる。融合タンパク質は、例えば、本発明のMPHOSPH1またはPRC1をコードするDNAを他のペプチドまたはタンパク質をコードするDNAとフレームが合致するように連結させ、この融合DNAを発現ベクターに挿入して、それを宿主において発現させることなどによる、当業者に周知の技法で作製することができる。結果として生じた融合タンパク質が、互いに結合するための元のタンパク質の活性を維持している限り、本発明のMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と融合したペプチド、またはタンパク質に関する制限はない。

MPHOSPH1またはPRCタンパク質と融合させるペプチドとして用いられ得る既知ペプチドには、例えば、FLAG(Hopp et al., (1988) Biotechnology 6: 1204-10)、6個のHis(ヒスチジン)残基を含む6×His、10×His、インフルエンザ凝集素(HA)、ヒトc-myc断片、VSP-GP断片、p18HIV断片、T7タグ、HSVタグ、Eタグ、SV40T抗原断片、lckタグ、α-チューブリン断片、Bタグ、プロテインC断片などが含まれる。本発明のタンパク質と融合させ得るタンパク質の例には、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)、インフルエンザ凝集素(HA)、免疫グロブリン定常領域、β-ガラクトシダーゼ、MBP(マルトース結合タンパク質)などがある。

融合タンパク質は、上記の融合ペプチドまたはタンパク質をコードする市販のDNAと、MPHOSPH1またはPRC1タンパク質をコードするDNAを融合させ、調製された融合DNAを発現させることによって調製することができる。

さらに、改変タンパク質は多様な変異体、種間相同性、これらのタンパク質の対立遺伝子によってコードされるタンパク質を含む。

または、当技術分野において公知である方法、例えばハイブリダイゼーション技法を用いて、機能的に同等なポリペプチドを単離することができる(Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press)。当業者は、ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質をコードするDNA配列(すなわち、配列番号:1または36)の全体または一部と高い相同性を有するDNAを容易に単離して、単離されたDNAからヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することができる。そのため、本発明のタンパク質には、ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質をコードするDNA配列の全体または一部とハイブリダイズするDNAによってコードされ、かつヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と機能的に同等であるタンパク質が含まれる。これらのタンパク質には、ヒトまたはマウス由来のタンパク質に対応する哺乳動物相同体(例えば、サル、ラット、ウサギ、およびウシ遺伝子によってコードされるタンパク質)が含まれる。ヒトMPHOSPH1タンパク質をコードするDNAと相同性の高いcDNAを動物から単離する際には、精巣由来の組織または膀胱癌組織を用いることが特に好ましい。一方、ヒトPRC1タンパク質をコードするDNAと相同性の高いcDNAを動物から単離する際には、精巣由来の組織または膀胱癌組織に加え、乳癌由来組織も用いることができる。

ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。「ストリンジェントな（ハイブリダイゼーション）条件」という語句は、核酸分子がその標的配列にはハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない、通常、核酸複合体混合物における条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、および異なる状況下で異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広い指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridaization with Nucleic probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)で見られる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびpHでの特定の配列に対する熱融解点（Tm）よりも約5-10℃低くなるように選択される。Tmは、（規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下で）平衡状態で標的配列に相補的なプローブの50％が標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Tmにおいて、平衡状態でプローブの50％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドのような不安定下剤の添加によって達成してもよい。選択的または特異的なハイブリダイゼーションに関して、陽性シグナルとは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの10倍である。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下であり得る：50％ホルムアミド、5×SSC、および1％ SDS中での42℃におけるインキュベーション、または5×SSC、1％ SDS中での65℃におけるインキュベーション、0.2×SSCおよび0.1％ SDS中での50℃における洗浄を伴う。

ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離するためのハイブリダイゼーションの条件は、当業者によって慣行的に選択され得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、「Rapid-hyb緩衝液」(Amersham LIFE SCIENCE)を用いて68℃でプレハイブリダイゼーションを30分間またはそれ以上行い、標識プローブを添加した上で、68℃で1時間またはそれ以上加温することにより行うことができる。それに続く洗浄段階は、例えば低ストリンジェント条件下で行い得る。低ストリンジェント条件は、例えば、42℃、2× SSC、0.1% SDS、または好ましくは50℃、2× SSC、0.1% SDSである。より好ましくは、高ストリンジェント条件を用いる。高ストリンジェント条件は、例えば、室温で2× SSC、0.01% SDS中での20分間の洗浄を3回行った後に、37℃で1× SSC、0.1% SDS中での20分間の洗浄を3回行い、50℃で1× SSC、0.1% SDS中での20分間の洗浄を2回行うことである。しかし、温度および塩濃度などのいくつかの要因はハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るため、当業者は必要なストリンジェンシーを得るためにこれらの要因を適切に選択することができる。

ハイブリダイゼーションの代わりに、遺伝子増幅法、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を利用して、タンパク質をコードするDNA(配列番号:1：MPHOSPH1、配列番号:36：PRC1)の配列情報に基づいて合成したプライマーを用いて、ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質（配列番号:2および37）と機能的に同等なポリペプチドをコードするDNAを単離することもできる。

上記のハイブリダイゼーション法または遺伝子増幅法により単離されたDNAによってコードされる、ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、ヒトMPHOSPH1またはPRC1タンパク質のアミノ酸配列と高い相同性（配列同一性ともいう）を有する。「高い相同性」（「高い同一性」ともいう）という用語は典型的に、2つの最適アラインメント（ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列のどちらか）の同一の程度をいう。典型的に、高い相同性または同一性は、40%またはそれ以上、好ましくは60%またはそれ以上、より好ましくは80%またはそれ以上、さらにより好ましくは85%、90%、95%、98%、99%またはそれ以上の相同性を指す。2つのポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列の間の相同性または同一性の程度は、「Wilbur and Lipman, (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 726-30」中のアルゴリズムを用いて決定することができる。

本発明において有用なタンパク質は、これを産生させるために用いる細胞もしくは宿主または利用する精製法に応じて、アミノ酸配列、分子量、等電点、糖鎖の有無、または形態に差異があってもよい。それでもなお、このようなタンパク質は、天然のタンパク質（（MPHOSPH1(配列番号:1)またはPRC1（配列番号:37））と同等な結合活性を有する限り、本発明において有用である。

本発明はまた、MPHOSPH1またはPRC1タンパク質の部分ペプチドの使用も包含する。部分ペプチドはMPHOSPH1またはPRC1タンパク質に特異的なアミノ酸配列を有し、約400以下のアミノ酸からなり、通常は約200以下、しばしば100以下、少なくとも7アミノ酸、好ましくは8アミノ酸またはそれ以上、より好ましくは9アミノ酸またはそれ以上からなる。本発明のスクリーニングに使用するのに適したMPHOSPH1の部分ペプチドは、少なくともMPHOSPH1タンパク質のPRC1結合部位を含んでおり、本発明のスクリーニングに使用するのに適したPRC1の部分ペプチドは、少なくともPRC1タンパク質のMPHOSPH1結合部位を含む。このような部分ペプチドは、MPHOSPH1またはPRC1タンパク質と「機能的に同等な」という語句も含む。

本発明者らは、配列番号:2の1188〜1465位および1662〜1718位のアミノ酸残基の、PRC1に対するMPHOSPH1の結合領域としての機能を明らかにした。そのため、本発明のスクリーニングに使用されるMPHOSPH1の部分ペプチドは少なくとも、配列番号:2の1188〜1465位または1662〜1718位のアミノ酸残基を含むべきである。さらに、本発明の好ましい態様によれば、本発明のスクリーニング方法に用いるMPHOSPH1タンパク質は少なくとも、配列番号:2の1188〜1465位または1662〜1718位のアミノ酸残基を含む。

さらに、本発明の明細書中において、「MPHOSPH1遺伝子」という語句はMPHOSPH1タンパク質またはMPHOSPH1タンパク質のあらゆる機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。同様に、「PRC1遺伝子」という語句はPRC1タンパク質またはPRC1タンパク質のあらゆる機能的同等物をコードするポリヌクレオチドを包含する。

本発明の明細書中において、本発明のスクリーニング方法によって同定された作用物質は、あらゆる化合物および複数の化合物を含んだ組成物であり得る。さらに、本発明のスクリーニング方法によって細胞またはタンパク質に暴露した被験作用物質は、一つの化合物または化合物の組み合わせも含み得る。化合物の組み合わせが本方法において使用される場合、その化合物は順次に、または同時に接触し得る。

あらゆる被験作用物質、例えば細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物の産物、海洋生物からの抽出物、植物抽出物、精製タンパク質または粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成微小分子化合物（アンチセンスRNA、siRNA、リボザイムなどの核酸抽出物を含む）、および天然化合物が本発明のスクリーニング方法に用いることができる。本発明の被験作用物質は、(1) 生物学的ライブラリー、(2) 空間的にアドレス指定が可能な並行した固相または液相ライブラリー、(3) デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法、(4) 「1ビーズ1化合物」ライブラリー法、および(5) アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を含む、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における任意の多くの方法で入手することもできる。アフィニティークロマトグラフィー選択を用いる生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の低分子ライブラリーに適用可能である(Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67)。分子ライブラリーを合成する方法の例は、当技術分野において見い出すことができる(DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13；Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6；Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85；Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5；Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059；Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061；Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51)。化合物のライブラリーは、溶液中に提示してもよく(Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照されたい)、またはビーズ(Lam (1991) Nature 354: 82-4)、チップ(Fodor (1993) Nature 364: 555-6)、細菌(米国特許第5,223,409号)、胞子(米国特許第5,571,698号；同第5,403,484号、および同第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9)、もしくはファージ(Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90；Delvin (1990) Science 249: 404-6；Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82；Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10；米国特許出願第2002103360号)上に提示してもよい。

本発明の任意のスクリーニング方法によって選択された化合物の構造の一部が、付加、欠失、および/または置換によって変換された化合物は、本発明のスクリーニング法によって得られる作用物質に含まれる。

さらに、選択された被験作用物質がタンパク質である場合には、そのタンパク質をコードするDNAを得るため、タンパク質の全アミノ酸配列を解析して、そのタンパク質をコードする核酸配列を推定することができるし、またはその配列に基づいたプローブとしてオリゴDNAを合成するため、得られたタンパク質の部分的アミノ酸配列を解析し、そのタンパク質をコードするDNAを取得するために、そのプローブとcDNAライブラリーをスクリーニングすることもできる。得られたDNAは癌の治療または予防のための候補物となる被験作用物質の調製においてその有用性が確認される。

本明細書に記載のスクリーニングにおいて有用な被験作用物質は、インビボでMPHOSPH1またはPRC1タンパク質、または本来のタンパク質の生物活性を喪失したそれらの部分ペプチドと特異的に結合する抗体であってもよい。例えば、抗体（例：モノクローナル抗体）はMPHOSPH1とPRC1タンパク質の結合を阻害する能力について試験することができる。

本明細書で用いられる「抗体」という用語は、抗体を合成するために用いた抗原、またはそれに近縁の抗原とのみ相互作用する(すなわち、結合する)、特異的構造を有する免疫グロブリン分子を指す。さらに、抗体は、MPHOSPH1またはPRC1遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する限り、抗体の断片または修飾抗体であってもよい。例えば、抗体断片は、Fab、F(ab')₂、Fv、またはHおよびL鎖由来のFv断片が適切なリンカーによって連結されている一本鎖Fv(scFv)であってもよい(Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83)。より具体的には、抗体断片は、抗体をパパインやペプシンなどの酵素で処理することにより作製することができる。または、抗体断片をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞で発現させることができる(例えばCo et al., (1994) J Immunol 152：2968-76.；Better and Horwitz, (1989) Methods Enzymol 178：476-96；Pluckthun and Skerra, (1989) Methods Enzymol. 178：497-515；Lamoyi, (1986) Methods Enzymol 121：652-63；Rousseaux et al., (1986) Methods Enzymol 121：663-9；Bird and Walker, (1991) Trends Biotechnol 9：132-7を参照されたい)。

抗体は、例えばポリエチレングリコール(PEG)のような様々な分子との結合によって修飾することができる。そのような修飾抗体も本発明において使用される。修飾抗体は、抗体を化学的に修飾することにより得られる。これらの修飾法は、当技術分野で慣例的である。 または、抗体は、非ヒト抗体に由来する可変領域とヒト抗体に由来する定常領域とのキメラ抗体、または非ヒト抗体に由来する相補性決定領域(CDR)、ヒト抗体に由来するフレームワーク領域(FR)および定常領域を含むヒト化抗体として得られてもよい。そのような抗体は、公知の技術によって調製することができる。ヒト化は、ヒト抗体の対応する配列の代わりに、齧歯類のCDRまたはCDR配列を用いることによって行われ得る(例えば、Verhoeyen et al., (1988) Science 239：1534-6を参照されたい)。したがって、このようなヒト化抗体は、実質的にヒト可変ドメインの全長より短い領域が、非ヒト種由来の対応する配列によって置き換えられたキメラ抗体である。

ヒトフレームワーク領域および定常領域に加えてヒト可変領域をも含む完全ヒト抗体を用いることもできる。このような抗体は、当技術分野で公知のさまざまな技術を用いて作製することができる。例えば、インビトロ法は、バクテリオファージ上に提示されたヒト抗体断片の組換えライブラリーの使用を含む(例えば、Hoogenboom & Winter, (1992) J. Mol. Biol. 227：381-8)。同様に、ヒト免疫グロブリン座位を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによってヒト抗体を作製することもできる。このアプローチは例えば、米国特許第6,150,584号、第5,545,807号；第5,545,806号；第5,569,825号；第5,625,126号；第5,633,425号；第5,661,016号に記載されている。

被験化合物ライブラリーの構築は当技術分野において周知であるが、被験化合物の同定と、本スクリーニング方法のためのこのような化合物ライブラリー構築とにおけるさらなるガイダンスを本明細書中にて、以下に提供する。

(i)分子モデリング
被験化合物ライブラリーの構築は、求められる特性を有することが知られている化合物の分子構造、ならびに/または阻害する標的分子、すなわちMPHOSPHO1およびPRC1の分子構造の知識によって促進される。さらなる評価に適した被験化合物の予備スクリーニングに対する1つのアプローチが、被験化合物とその標的との間の相互作用のコンピュータモデリングである。本発明において、MPHOSPH1および/またはPRC1の間の相互作用をモデリングすることにより、相互作用自体への詳細への洞察が提供され、また、可能性のある、相互作用の分子阻害剤を含む、相互作用を阻害するために可能な方法が示唆される。

コンピュータモデリングテクノロジーにより、選択した分子の3次元原子構造の視覚化と、その分子と相互作用するであろう新しい化合物の合理的設計とが可能である。3次元構築物は典型的には、選択した分子のX線結晶構造解析またはNMRイメージングのデータに依存する。分子動態は力場データを必要とする。コンピュータグラフィックシステムは、新しい化合物がどのように標的分子と関連するかを予測することができ、結合特異性を完全にするように化合物および標的分子の構造を実験操作することが可能である。片方または両方に小さな変化を起こしたときに分子‐化合物間相互作用がどうなるのかの予測には、通常ユーザーが使いやすい、分子設計プログラムとユーザーとの間のメニュー駆動型インターフェースと連係した、分子力学ソフトウェアおよび計算集約型コンピュータが必要である。

一般的に述べた上記の分子モデリングシステムの一例は、CHARMmおよびQUANTAプログラム（Polygen Corporation, Waltham, Mass）からなる。CHARMmはエネルギー最小化および分子動態機能を行う。QUANTAは分子構造の構築、グラフィックモデリング、および解析を行う。QUANTAによって、分子の互いの挙動の相互的な構築、修飾、視覚化、および解析が可能である。

特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングが多くの論文に概説されている。例えば、Rotivinen, et al., Acta Pharmaceutica Fennica 97, 159-166(1988); Ripka, New Scientist 54-57(Jun. 16, 1988); McKnlay and Rossmann, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29, 111-122(1989); Perry and Davies, Prog Clin Biol Res. 291: 189-93(1989); Lewis and Dean, Proc. R. Soc. Lond B Biol Sci. 236, 125-40 and 141-62(1989); および核酸成分に対するモデル受容体に関しては、Askew, et al., J. Am. Chem. Soc. 111, 1082-90(1989)。

化合物をスクリーニングし、画像として描写する他のコンピュータプログラムが、BioDesign, Inc., Pasadena, Calif., Allelix, Inc, Mississauga, Ontario, Canada、およびHypercube, Inc., Cambridge, Ontarioなどの会社から利用可能である。例えば、Des Jarlais et al.,(1988) J. Med. Chem. 31: 722-9; Meng et al.(1992) J. Computer Chem. 13: 505-24; Meng et al. (1993) Proteins 17: 266-78; Shoichet et al. (1993) Science 259: 1445-50を参照されたい。

MPHOSPH1とPRC1相互作用の推定阻害剤が同定されれば、以下に詳述するように、同定された推定阻害剤の化学構造に基づき、コンビナトリアル化学技術を使用して任意の数の変異体を構築することができる。こうして得られる推定阻害剤または「被験作用物質」のライブラリーを本発明の方法を用いてスクリーニングし、MPHOSPH1とPRC1の会合を阻害するライブラリーの被験作用物質を同定することができる。

(ii)コンビナトリアル化学合成
被験作用物質のコンビナトリアルライブラリーは、MPHOSPH1とPRC1の相互作用の公知の阻害剤に存在するコア構造の知識を含む合理的薬物設計プログラムの一部として産生しうる。このアプローチはライブラリーを妥当なサイズに維持することが可能であり、ハイスループットスクリーニングを促進する。または、単純な、特に短いポリマー分子ライブラリーは、ライブラリーを構成する分子ファミリーの全ての並び換えを単純に合成することによって構築しうる。この後者のアプローチの一例は、全てのペプチドが6アミノ酸長のライブラリーであろう。このようなペプチドライブラリーは全ての6アミノ酸配列の並び換えを含みうる。このタイプのライブラリーは直線的コンビナトリアル化学ライブラリーと呼ばれる。

コンビナトリアル化学ライブラリーの調製は当業者に周知であり、化学的または生物学的合成によって生成されうる。コンビナトリアル化学ライブラリーには、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、 Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-93(1991)およびHoughten et al., Nature 354: 84-6(1991)を参照されたい）が挙げられるが、これに限定されない。化学的多様性ライブラリーを生成するために他の化学も用いることができる。このような化学としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ペプチド（例えばPCT公報WO91/19735）、コードされるペプチド（例えばPCT公報WO93/20242）、ランダムバイオオリゴマー（例えばPCT公報WO92/00091）、ベンゾジアゼピン（例えば米国特許第5,288,514号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピン、およびジペプチドなどのディバーソマー（diversomer）（DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909-13(1993)）、ビニル性（vinylogous）ポリペプチド（Hagihara et al., J. Amer. Cirschmann et al., J. Amer. Chem. Xoc. 114: 9217-8(1992)）、グルコース骨格を有する非ペプチド性模倣体（Hirschmann et al., J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-8(1992)）、低分子化合物ライブラリーの類似の有機合成(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661(1994))、オリゴカルバメート（Cho et al., Science 261: 1303(1993)）、および/またはペプチジルホスホネート(Campbell et al., J. Org. Chem. 59: 658(1994))、核酸ライブラリー(Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology 1995 付録およびSambrook(上記記載)を参照されたい)、ペプチド核酸ライブラリー（例えば米国特許第5,539,083号を参照されたい）、抗体ライブラリー（例えばVaughan et al., NatureBioyrchnology, 14(3): 309-14(1996)およびPCT/US96/10287を参照されたい）、炭水化物ライブラリー（例えばLiang et al., Science, 274: 1520-2(1996)および米国特許第5,593,853号を参照されたい）、有機低分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec 1; 6(6): 624-31; イソプレノイド、米国特許第5,569,588号；チアゾリジノン（thiazolidinone）およびメタチアザノン（metathiazanone）、米国特許第5,549,974号；ピロリジン、米国特許第5,525,735号および第5,519,134号；モルホリノ化合物、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピン、米国特許第5,288,514号などを参照されたい）。

（iii）ファージディスプレイ
別のアプローチは、ライブラリーを構築するために組換えバクテリオファージを用いる。この「ファージ法」（Scott & Smith, Science 249: 386-90, 1990; Cwirla, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 6378-82, 1990; Devlin et al., Science, 249: 404-6, 1990）を用いて、非常に大きなライブラリーを構築することができる（例えば10⁶〜10⁸化学単位）。第二のアプローチは主に化学的方法を用いるものであり、Geysen法（Gesen et al., Molecular Immunology 23: 709-15, 1986; Geysen et al., J. Immunologic Method 102: 259-74, 1987）およびFodorらの方法（Scinence 251: 767-73, 1991）がその例である。Furka et al.,(14th International Congress of Biochemistry, Volume#5, Abstract FR: 013, 1988; Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37: 487-493, 1991)、Houghten(米国特許第4,631,211号)、およびRutter et al.(米国特許第5,010,175号)がアゴニストまたはアンタゴニストとして試験されうるペプチドの混合物を産生するための方法を記載している。

コンビナトリアルライブラリー調製用の装置が市販されている（例えば、357MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford MAを参照されたい）。また、多数のコンビナトリアルライブラリー自体が市販されている（例えばComGenex, Princeton, N.J., Tripos, Inc., St. Luis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなどを参照されたい）。

本発明はMPHOSPH1とPRC1の結合を阻害する作用物質のスクリーニング方法を提供する。MPHOSPH1とPRC1の結合を阻害する作用物質は、膀胱癌細胞の増殖を抑制し、膀胱癌の治療または予防に有効であると期待される。そのため、本発明は、膀胱癌細胞の増殖抑制化合物のスクリーニング方法、および膀胱癌の治療または予防のための作用物質のスクリーニング方法を提供する。

さらに具体的には、その方法は以下の段階を含む。
(a) 作用物質の存在下において、MPHOSPH1タンパク質をPRC1タンパク質と接触させる段階；
(b) MPHOSPH1とPRC1タンパク質との結合レベルを検出する段階；
(c) MPHOSPH1とPRC1タンパク質の結合レベルを作用物質非存在下で検出されるレベルと比較する段階；
(d) MPHOSPH1とPRC1タンパク質の結合レベルをMPHOSPH1とPRC1タンパク質の結合を阻害する作用物質として減少させる作用物質、すなわち膀胱癌の治療または予防のため膀胱癌細胞の増殖を抑制するために用いることができる作用物質を選択する段階。

本発明の明細書中において、二つのタンパク質の間の「結合阻害」とは、そのタンパク質間の結合を少なくとも減少させることを指す。そのため、いくつかの場合には、試料の結合ペアの割合が適切な対照（すなわち、被験作用物質で処理していない、または非癌試料由来、または癌試料由来）と比較して減少している。タンパク質結合量の減少は、対照試料の結合ペアよりも90％、80％、70％、60％、50％、40％、25％、10％、5％、1％またはそれ以下（すなわち0％）よりも少なくてよい。

明細書中において、MPHOSPH1およびPRC1タンパク質は前述したタンパク質の機能的同等物を含み得る。スクリーニングに用いられたMPHOSPH1またはPRC1タンパク質、またはそれらの機能的同等物は、当業者に公知の方法によって、組換えタンパク質または天然のタンパク質として調製され得る。それらのタンパク質は、ポリペプチド産生のために一般的に知られている任意の技術方法を採用して得ることができる（すなわち、Morrison J., J Bacterioligy 1977, 132: 349-51; Clark-Curtiss & Cyrtuss, Methods in Enzymology(eds. Wu et al.) 1983, 101: 347-62）。例えば、組換えタンパク質は、そのタンパク質をコードするDNA（例えば配列番号:1または36の塩基配列を有するDNA）を適切な発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞にベクターを導入し、抽出物を得て、この抽出物をクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過、または本発明のタンパク質に対する抗体を固定したカラムを利用するアフィニティークロマトグラフィーに供して、または前述のカラムを2つ以上組み合わせタンパク質を精製することによって、調製することができる。

また、本発明のタンパク質を宿主細胞(例えば、動物細胞および大腸菌(E. coli))において、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、または複数のヒスチジンが付加された組換えタンパク質として発現させる場合には、発現された組換えタンパク質は、グルタチオンカラムまたはニッケルカラムを用いて精製することができる。

融合タンパク質の精製後に、融合タンパク質を必要に応じてトロンビンまたは第Xa因子で切断することにより、目的のポリペプチド以外の領域を除くことも可能である。

天然タンパク質は、当業者に公知の方法によって、例えば前述したMPHOSPH1またはPRC1タンパク質に結合する抗体を結合させたアフィニティーカラムを、本発明のタンパク質を発現する組織または細胞の抽出物と接触させることによって、単離することができる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはMPHOSPH1またはPRC1タンパク質に結合する限り任意の修飾抗体であり得る。

MPHOSPH1またはPRC1タンパク質、またはそれらの機能的同等物はインビトロ翻訳システムを採用してインビトロで産生することもできる。

さらに、MPHOSPH1およびPRC1タンパク質の部分ペプチドも相互の結合活性を保持する限り、本発明において使用される。そのような部分ペプチドは遺伝子工学、ペプチド合成の公知の方法または適切なぺプチダーゼで天然のMPHOSPH1およびPRC1タンパク質を消化することによって生成され得る。ペプチド合成には、例えば固相合成または液相合成を使用することができる。合成に採択され得る、慣習的なペプチド合成方法は以下に含まれる。
1) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
2) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1975;
3) Peptide Synthesis(in Japanese), Maruzen Co., 1975;
4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis(in Japanese), Maruzen Co., 1985;
5) Development of Pharmaceuticals(second volume)(in Japanese), Vol. 14(peptide synthesis), Hirokawa, 1991;
6) WO99/67288; and
7) Barany G & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2. “Solid Phase Peptide Synthesis”, Academic Press, New York, 1980, 100-118。

ポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドまたはその断片が互いに結合する本来のタンパク質の能力を維持する限り、他の基質とさらにつながり得る。使用に適した基質は、ペプチド、脂質、糖、糖鎖、アセチル基、天然および合成ポリマー等を含む。これらの修飾は、ポリペプチドおよび断片に付加機能を与えたり、安定化させたりしうる。

被験作用物質と接触させるMPHOSPH1、PRC1ポリペプチド、またはそれらの機能的同等物は、例えば、精製ポリペプチド、可溶性タンパク質、または他のポリペプチドと融合した融合タンパク質であってもよい。

本発明のスクリーニング方法は、MPHOSPH1とその結合パートナーであるPRC1の会合を阻害する可能性の高い被験作用物質の効率的で迅速な同定を提供する。一般に、MPHOSPH1とPRC1の会合を妨害する被験作用物質の能力を決定する方法はいずれも本発明と共に使用するのに適する。例えば、ELISA形式の競合および非競合阻害アッセイを利用しうる。対照実験を行ってシステムの最大結合能を決定すべきである（例えば、結合させたMPHOSPH1をPRC1と接触させ、MPHOSPH1に結合するPRC1の量を決定する）。

本発明の結合を阻害する作用物質の同定方法のように、当業者によく知られている多くの方法が用いられうる。そのような同定はインビトロアッセイ系、例えば細胞系として実施しうる。より具体的には、まず、MPHOSPH1またはその結合パートナーであるPRC1のどちらかを支持体に結合し、もう片方のタンパク質がそこへ被験作用物質とともに接触する。次に、混合物をインキュベート、洗浄し、支持体に結合したもう片方のタンパク質を検出および/または測定する。

タンパク質の結合に用い得る支持体の例には、アガロース、セルロース、およびデキストランなどの不溶性多糖類、ならびにポリアクリルアミド、ポリスチレン、およびシリコンなどの合成樹脂が含まれる。上記の材料から調製された市販のビーズおよびプレート(例えば、マルチウェルプレート、バイオセンサーチップなど)を用い得ることが好ましい。ビーズを用いる場合には、それらをカラムに充填してもよい。あるいは、磁気ビーズの使用も公知であり、磁力を通したビーズに結合したタンパク質を簡単に単離することができる。

タンパク質の支持体への結合は、化学的結合および物理的吸着などの慣行的方法に従って行うことができる。または、タンパク質は、タンパク質を特異的に認識する抗体を介して支持体に結合させてもよい。さらに、支持体へのタンパク質の結合は、アビジン、ビオチン結合のような、分子相互作用によっても行うことができる。

タンパク質間の結合は、緩衝液がタンパク質間の結合を阻害しない限りは、例えばこれらに限定されないがリン酸緩衝液、トリス緩衝液などの緩衝液中で実現される。

本発明において、表面プラズモン共鳴現象を使用するバイオセンサーを、結合したタンパク質を検出または定量するための手段として用いることができる。このようなバイオセンサーを用いると、ごく微量のポリペプチドのみを用いて、標識を行わずに、タンパク質間の相互作用を表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することができる(例えば、BIAcore、Pharmacia)。このため、BIAcoreなどのバイオセンサーを用いて、MPHOSPH1とPRC1との結合を評価することが可能である。

または、MPHOSPH1またはPRC1のどちらかを標識し、結合したタンパク質の標識を用いて、結合したタンパク質を検出または測定することもできる。具体的には、タンパク質の一方をあらかじめ標識した後に、標識したタンパク質を被験作用物質の存在下でもう一方のタンパク質と接触させ、次いで洗浄後に結合したタンパク質を標識によって検出または測定する。

本方法におけるタンパク質の標識には、放射性同位体(例えば、³H、¹⁴C、³²P、³³P、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、β-グルコシダーゼ)、蛍光物質(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フルオレセイン、テキサスレッド、緑蛍光物質、ローダミン)、磁気ビーズ(例えばDYNABEADS^TM)、熱量測定標識（例えば金コロイド、カラーガラス、またはプラスチックビーズ（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）およびビオチン/アビジンなどの標識物質を用いることができる。それらの標識の使用を教示している特許には、米国特許第3,817,837号、3,859,754号、3,939,350号、3,996,345号、4,277,437号、4,275,149号、4,366,241号がある。しかし、本発明はこれらに限られず、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的手段によって検出可能な任意の標識を使用することができる。

タンパク質を放射性同位体で標識する場合には、検出または測定は液体シンチレーションによって行い得る。または、酵素で標識したタンパク質は、酵素の基質を添加して、呈色などの基質の酵素的変化を吸光光度計で検出することにより、検出または測定し得る。さらに、蛍光物質を標識として用いる場合には、蛍光光度計を用いて結合したタンパク質を検出または測定し得る。

さらに、本発明のスクリーニング方法における結合はMPHOSPH1またはPRC1に対する抗体を用いて検出または測定することもできる。例えば、支持体に固定されたMPHOSPH1と被験化合物およびPRC1を接触させた後、その混合物をインキュベートおよび洗浄し、PRC1に対する抗体を用いて検出または測定を行うことができる。また、PRC1を支持体に固定させ、MPHOSPH1に対する抗体を抗体として使用しうる。

本スクリーニングにおいて抗体を用いる場合には、抗体を上記の標識物質のいずれかで標識し、標識物質に基づいて検出または測定することが好ましい。また、MPHOSPH1またはPRC1に対する抗体を一次抗体として使用して、標識物質で標識した二次抗体によって検出してもよい。さらに、本発明のスクリーニングにおいてタンパク質に結合した抗体は、プロテインGまたはプロテインAカラムを用いて検出または測定することもできる。

または、本発明の同定方法の別の態様においては、細胞を利用するツーハイブリッドシステムを使用することができる(「MATCHMAKERツーハイブリッドシステム」、「哺乳動物MATCHMAKERツーハイブリッドアッセイキット」、「MATCHMAKERワンハイブリッドシステム」(Clontech)；「HybriZAPツーハイブリッドベクターシステム」(Stratagene)；参考文献「Dalton and Treisman, (1992) Cell 68: 597-612」、「Fields and Sternglanz, (1994) Trends Genet 10: 286-92」)。ツーハイブリッドシステムでは、例えばMPHOSPH1をSRF結合領域またはGAL4結合領域と融合させて、酵母細胞で発現させる。または、PRC1をSRF結合領域またはGAL4結合領域、およびMPHOSPH1をVP16またはGAL4転写活性化領域と融合させ、被験作用物質の存在下、酵母細胞で発現させることもできる。被験作用物質がMPHOSPH1およびPRC1の結合を阻害する場合、この2つの結合によってレポーター遺伝子が活性化され、検出可能な陽性クローンが作成される。レポーター遺伝子としては、HIS3遺伝子のほかに、例えばAde2遺伝子、lacZ遺伝子、CAT遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子などを用いることができる。

本明細書において、MPHOSPH1とPRC1の結合レベルはMPHOSPH1とPRC1の結合後に生じるどのような変化も測定し得る。具体的には、そのようなスクリーニングは、J82あるいはUMUC細胞のようなMPHOSPH1およびPRC1を発現する細胞と被験作用物質との接触によって実施し得る。例えば、細胞増殖の抑制は、MPHOSPH1およびPRC1の結合における被験作用物質の影響を確定するために、検出される。

1．競合アッセイ形式
本発明の被験作用物質をスクリーニングするために競合アッセイを用いうる。例として、競合ELISA形式は、固体支持体に結合されたMPHOSPH1（またはPRC1）が含みうる。この結合されたMPHOSPH1（またはPRC1）はPRC1（またはMPHOSPH1）および被験作用物質とインキュベートされる。被験作用物質および/またはPRC1（またはMPHOSPH1）がMPHOSPH1(PRC1)に結合させるのに十分な時間の後、基質を洗浄して非結合物質を除く。そしてMPHOSPH1に結合したPRC1の量を決定する。これは、当技術分野で公知の様々な方法のいずれか、例えば検出可能な標識でタグ化されたPRC1（またはMPHOSPH1）種を用いて、あるいは洗浄した基質を標識化抗PRC1（またはMPHOSPH1）抗体と接触させて遂行しうる。MPHOSPH1（またはPRC1）に結合したPRC1（またはMPHOSPH1）の量は、PRC1/MPHOSPH1の会合を妨害する被験作用物質の能力に反比例するであろう。抗体を含むがそれに限定されないタンパク質の標識は、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual(1988)に記載されている。

あるバリエーションでは、MPHOSPH1(またはPRC1)は親和性タグで標識される。標識されたMPHOSPHO1(またはPRC1)を次に、被験作用物質およびPRC1(またはMPHOSPH1)とインキュベートし、免疫沈降する。そして免疫沈降物を抗PRC1（またはMPHOSPH1）抗体を用いたウエスタンブロッティングに供する。前記の競合アッセイ形式のように、MPHOSPH1（またはPRC1）を会合することが見出されたMPHOSPH1（またはPRC1）の量は、MPHOSPH1/PRC1の会合を妨害する被験作用物質の能力と反比例する。

2．非競合アッセイ形式
非競合結合アッセイも、本明細書に記載されるもののような競合アッセイを用いたスクリーニングに容易に適用できない形式で構築された作用物質ライブラリーを試験するための初期スクリーニングとして有用でありうる。このようなライブラリーの一例は、ファージディスプレイライブラリーである（例えば、Barrett, et al., Anal Biochem 1992, 204: 357-64を参照されたい）。

ファージライブラリーは、数多くの異なる組換えペプチドの作業量（working quantity）を素早く産生しうる点において有用である。ファージライブラリーはそれ自体は本発明の競合アッセイには向いてはいないが、非競合形式で効率的にスクリーニングされ、どの組換えペプチド被験作用物質がMPHOSPH1またはPRC1に結合するかを決定することができる。次いで、結合すると同定された被験化合物を産生し、競合アッセイ形式を用いてスクリーニングすることができる。ファージおよび細胞ディスプレイライブラリーの産生およびスクリーニングは当技術分野において周知であり、例えば、Lander et al., WO 88/06630; Fuchs et al., Biotechnology 1991, 9: 1369-72; Goward et al., TIBS 1993, 18: 136-40; Charbit et al., EMBO J 1986, 5: 3029-37; Cull et al., PNAS USA 1992, 89: 1865-9; Cwirla et al., PNAS USA 1990, 87: 6378-82に考察されている。

典型的な非競合アッセイは、構成要素の1つ（MPHOSPH1またはPRC1）の添加なしで競合アッセイに関して記載されたものと同様の手順に従って行なわれる。しかしながら、非競合形式はMPHOSPH1またはPRC1に対する被験作用物質の結合を決定するので、被験化合物のMPHOSPH1およびPRC1の両方に対する結合能力は各候補ごとに決定する必要がある。したがって、例示の方法によって、固定化されたMPHOSPHO1への被験作用物質の結合は、結合していない被験作用物質を洗い流し、結合した被験作用物質を支持体から溶出させた後に、例えば、質量分析、タンパク質測定（BradfordもしくはLowryアッセイ法、または280nmの吸光度測定）によって溶出物を解析することにより決定しうる。または、溶出工程を省いて支持体表面での有機層の分光学的特性における変化をモニターするこのとによって被験作用物質の結合を決定してもよい。表面の分光学的特性をモニターするための方法としては以下のものが含まれるが、これらに限定されない：吸光度、反射率、透過率、複屈折、屈折率、回折、表面プラズモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法、格子共役導波管（greating coupled waveguide）技術、および多極共鳴分光法（これらは全て当業者に公知である）。溶出工程の必要性を省くために、標識された被験作用物質もアッセイに用いうる。この場合、非結合物質を洗い流した後に支持体に会合している標識の量が被験化合物の結合に直接比例する。

周知の多数のロボットシステムが液相化学用に開発されてきた。これらのシステムとしてTakara Chemical Industries, LTD. (Osaka, Japan)によって開発された自動合成装置のような自動ワークステーションが挙げられ、多くのロボットシステムがロボットアーム（Zymate II, Symark Corporation、Hopkinton、Mass: Orca, Hewlett Packard, Palo Alto, Calif)を利用しており、化学者によって行われるマニュアル合成操作を模倣する。上記装置はいずれも本発明と共に使用するのに適している。本明細書において述べられているように操作可能になるようなこれらの装置の装備品（もしあれば）や特性は、関連技術分野の当業者には明らかであろう。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーはそれ自体が市販されている。（例えばComGenec, Princeton, H.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, MO, ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなどを参照されたい。

本発明の一態様によると、本発明のスクリーニング方法の必須構成要素はMPHOSPH1とPRC1の結合を阻害する作用物質、膀胱癌細胞の増殖を抑制する作用物質、または膀胱癌治療または予防のための作用物質をスクリーニングするキットとして提供されることができる。キットは、例えばMPHOSPH1ポリペプチドまたは機能的に同等なポリペプチド、および/またはPRC1ポリペプチドまたは機能的に同等なポリペプチドを含む。さらに、キットは対照薬（正および/または負）、検出可能な標識、反応緩衝液、細胞培養培地、スクリーニングに必要な容器、方法を実施するための仕様書（例えば、書面、テープ、VCR、CD-ROM等）等を含むことができる。構成物質と試薬は別々の容器で梱包することができる。

本発明の方法によって単離された作用物質を、ヒトおよび他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーの膀胱癌治療または予防のための薬剤として投与することもできるし、薬学的（治療的または予防的）組成物の製造に使用することもできる。

本明細書の中で、「予防的な」という用語は、腫瘍形成を遅延または抑制する、または少なくとも1つの癌の臨床症状を遅延、抑制または軽減するために、作用物質を予防的に投与することを示す。腫瘍の評価は、標準的な臨床プロトコールを用いて行うことができる。予防的投与は疾病、あるいは疾患の予防、または進行の遅延といった、明らかな疾患の臨床症状の徴候の前に行うことができる。本発明の明細書において、「予防」とは疾病の死亡率または罹患率の負荷を減少するあらゆる活性を含む。予防は、1次的、2次的、3次的予防レベルで行うことができる。1次的予防が疾病の進行を回避する一方、2次的および3次的予防レベルは、機能回復および疾病関連合併症の減少によって、既に発生している疾病の負の影響を減少するのと同時に、疾病の進行および症状の発現を目的とした活性を含む。本発明は、癌、特に膀胱癌の重症度を軽減する目的で広範囲の予防療法を含む。

単離された作用物質を直接投与してもよく、または公知の薬剤調製法を用いて剤形に製剤化してもよい。適切な薬学的製剤には、経口、直腸内、鼻腔内、局所(口腔内および舌下を含む)、膣内、もしくは非経口(筋肉内、皮下、および静脈内を含む)投与に適した製剤、または吸入もしくは吹入による投与に適した製剤が含まれる。例えば、必要に応じて、化合物は、糖衣錠、カプセル剤、エリキシル剤、およびマイクロカプセルとして経口摂取されるか、または水もしくは任意の他の薬学的に許容される液体との滅菌溶液もしくは懸濁液の注射剤形で非経口摂取され得る。例えば、化合物は、薬学的に許容される担体または媒体、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定化剤、着香剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと共に、一般的に許容される投薬実施に必要な単位投与剤形で混合することができる。これらの調製物に含まれる活性成分の量によって、指示範囲内の適した用量を得ることができる。

錠剤およびカプセル剤に混合することができる添加剤の例には、結合剤、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、およびアラビアゴム；賦形剤、例えば結晶セルロース；膨張剤、例えばコーンスターチ、ゼラチン、およびアルギン酸；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；甘味剤、例えばショ糖、乳糖、またはサッカリン；ならびに着香剤、例えばペパーミント、アカモノ(Gaultheria adenothrix)油、およびチェリーが含まれる。単位投与剤形がカプセル剤である場合には、油などの液体担体を上記の成分にさらに含めることもできる。注射用滅菌組成物は、注射用蒸留水などの溶剤を用いて、通常の投薬実施に従って製剤化することができる。

生理食塩水、グルコース、ならびにD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムなどの補助剤を含む他の等張液を、注射用水溶液として用いることができる。これらは、アルコール、具体的にはエタノール、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどの多価アルコール、Polysorbate 80(商標)およびHCO-50などの非イオン性界面活性剤といった適切な可溶化剤と共に用いることができる。

ゴマ油または大豆油は、可溶化剤としての安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールと共に使用することができ、かつ緩衝液、例えばリン酸緩衝液および酢酸ナトリウム緩衝液；鎮痛剤、例えば塩酸プロカイン；安定化剤、例えばベンジルアルコール、フェノール；ならびに抗酸化剤と共に製剤化することのできる油性液体の例である。調製された注射剤は、適したアンプルに充填してもよい。

経口投与に適した薬学的製剤には、それぞれが活性成分の規定量を含むカプセル剤、カシェ剤、または錠剤が含まれる。適切な製剤にはまた、粉剤、顆粒剤、溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。活性成分は、担体を含まないで任意でボーラス、舐剤、またはペーストとしても投与される。経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、または湿潤剤のような通常の賦形剤を含んでもよい。錠剤は、任意で1つもしくは複数の製剤成分を用いて、圧縮または成形により作製することができる。縮錠は、粉剤または顆粒剤のような流動状の活性成分を、任意で結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、潤滑剤、表面活性剤、または分散剤と混合して、適した機械において圧縮することによって調製してもよい。成形錠剤は、不活性液体希釈剤によって湿らせた粉末化合物の混合物を適した機械において成形することによって作製してもよい。錠剤は、当技術分野で周知の方法にしたがってコーティングすることができる。経口液体調製物は、例えば、水性もしくは油性懸濁液、溶液、乳液、シロップ剤、もしくはエリキシル剤の形であってもよく、または使用前に水もしくは他の適した溶剤で構成するための乾燥製品として提供してもよい。そのような液体調製物は、懸濁剤、乳化剤、非水性溶剤(食用油が含まれてもよい)、または保存剤のような通常の添加剤を含んでもよい。錠剤は任意で、活性成分の徐放または制御放出を提供するように調製してもよい。

非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、制菌剤および対象とするレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を任意で含む水性および非水性滅菌注射剤、ならびに懸濁剤および濃化剤を含む水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数回用量で容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに入れてもよく、滅菌液体担体、例えば生理食塩液、注射用水を使用直前に加えるだけでよい凍結乾燥状態で保存してもよい。または、製剤を持続注入用とすることができる。即時調合注射溶液および懸濁液は、既に説明した種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。

直腸投与用の適切な製剤には、カカオバターまたはポリエチレングリコールのような標準的な担体を含む坐剤が含まれる。口内への、例えば口腔内または舌下への局所投与用の適切な製剤には、ショ糖およびアカシアまたはトラガカントのような着香基剤に活性成分を含むトローチ剤、ならびにゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシアのような基剤に活性成分を含む香錠が含まれる。鼻腔内投与の場合、本発明の化合物を液体スプレー、もしくは分散性の粉末として、または点鼻剤の形態で用いてもよい。点鼻剤は、一つまたは複数の分散剤、溶解剤、または懸濁剤を含む水性または非水性基剤によって製剤化してもよい。液体スプレーは加圧容器から簡単に送達できる。

吸入による投与の場合、吸入器、ネブライザー、加圧パックまたは他のエアロゾル噴霧を送達するための都合のよい手段によって化合物を都合よく送達することができる。加圧容器は、適切な噴霧剤(ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、炭酸ガス、または他の適切なガス)を含む場合がある。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、一定量を送達するバルブを提供することで決定することができる。

または、吸入もしくは吹入による投与の場合、化合物は、乾燥粉末組成物、例えば化合物と、乳糖またはデンプンのような適した粉末基剤との粉末混合物の形状をとってもよい。粉末組成物は、単位投与剤形、例えば、粉末が吸入器または吹入器を利用して投与され得るカプセル剤、カートリッジ、ゼラチンまたはブリスターパックの形としてもよい。

望ましい場合、活性成分が徐放性となるように適合した上記の製剤を使用することができる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、免疫抑制剤、および/または保存剤のような他の活性成分を含んでもよい。

好ましい単位投与製剤は、下記に引用するように、活性成分またはその適当な分画の有効量を含む。

当業者に周知の方法を用いて、本発明の方法で選別された作用物質を患者に、例えば動脈内、静脈内、または経皮注射として投与することができ、また鼻腔内、筋肉内、または経口投与として投与することもできる。投与の用量および方法は、患者の体重および年齢ならびに投与法に応じて変化するが、当業者はそれらを日常的に選択することができる。当該作用物質がDNAによってコードされ得る場合には、DNAを遺伝子治療用のベクターに挿入し、治療を行うためにベクターを投与することができる。投与の用量および方法は、患者の体重、年齢、および症状に応じて変化するが、当業者はこれらを適切にすることができる。

本発明の方法で選別された作用物質の用量は症状等に依存するものの、その組成物は成人で0.01から約250 mg/kg日で投与することができる。成人の用量範囲は一般に、約5 mg〜約17.5 g/日であり、好ましくは約5 mgから約10 g/日であり、最も好ましくは約100 mg〜約3 g/日である。個別の単位で提供される錠剤または他の単位投与剤型は、同一単位量を複数回投与した量で有効性を示すような単位量、例えば約5 mgから約500 mg、より典型的には約100 mgから約500 mgを含む量を都合に合わせて含ませてもよい。

標準的な成人(体重60 kg)に注射剤形で非経口投与する場合には、患者、標的器官、症状、および投与方法によって多少の差はあるものの、約0.01 mg〜約30 mg/日、好ましくは約0.1〜約20 mg/日、より好ましくは約0.1〜約10 mg/日の用量を静脈内注射することが都合がよい。同様に他の動物の場合においても、体重60 kgに換算した量を投与することが可能である。

作用物質は、好ましくは経口で、または注射（静脈注射または皮下注射）で投与され、正確な投与量は対象の年齢および性別、治療する正確な疾患、およびその重症度を含む、いくつかの因子に依存して主治医の責任の下で決定される。

本発明の方法により選別された作用物質は、さらに膀胱癌の治療または予防に使用することができる。投与は、MPHOSPH1タンパクとPRC1タンパクの結合に関連した疾患に罹患した、または疾患の危険性（または可能性）のある対象における疾患の予防または治療を可能にする。その方法には膀胱癌細胞におけるMPHOSPH1とPRC1の結合を減少するものが含まれる。本発明のスクリーニング方法によって得られた作用物質の投与によりその機能を阻害することができる。

特記しない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾した場合は、本明細書に含まれる定義が優先される。

以下、本発明の実施例をより詳細に記載する。しかし、以下の材料および方法、実施例は発明の局面を説明するのみであり、本発明の範囲を制限するものではない。従って、本明細書に記載する方法および材料と類似した、またはそれらと同等である方法および材料を本発明の実施または試行において使用することも可能である。

1．材料および方法
(1)膀胱癌細胞株および組織試料
ヒト膀胱癌細胞株、HT1197、UM-UC-3、J82、HT1376、SW780、RT4はAmerica Type Culture Collectionから購入した（ATCC; Rockville, MD）。全ての膀胱癌細胞株、COS7およびNIH3T3細胞は適切な培地；すなわちHT1197、UMUC3、J82、およびHT1376に関しては、0.1 mM必須アミノ酸(Roche)、1 mMピルビン酸ナトリウム(Roche)、を含むEMEM(Sigma、ミズーリ州、セントルイス)；SW780に関してはL-15；RT-4に関してはマッコイ5a(sigma)；COS7とNIH3T3に関してはダルベッコー修飾イーグル培地(Invitrogen、カルスバッド、カリフォルニア州)中で単層培養した。各培地には、10%ウシ胎児血清(Cansera)および1%抗菌/抗真菌溶液(Sigma)を添加した。SW 780細胞は、CO2を含まない加湿空気の雰囲気中において37℃で維持した。他の細胞株は、5% CO2を含む加湿空気の雰囲気中において37℃で維持した。

外科切除された浸潤性または表在性膀胱癌の組織試料および対応する臨床情報は、各患者が書面によるインフォームドコンセントを提出した後に取得した。

(2)半定量的RT-PCR解析
全RNAはRNeasyマイクロキット（Qiagen、バレンシア、カナダ）を用いて培養細胞と臨床組織から抽出した。抽出したRNAと正常ヒト組織ポリA+RNAはDNase I（ニッポンジーン、東京、日本）で処理し、そしてオリゴdTプライマーとSuperScript II逆転写酵素（Invitrogen、カルスバッド、カリフォルニア州）を用いて逆転写した。半定量的逆転写PCR（RT-PCR）実験は、次のMPHOSPH1特異的プライマーまたは内部標準としてのGAPDH特異的プライマーで実施した；すなわち、
MPHOSPH1
5'-CCGGGAAAGTAAACTGACTCAC-3' (配列番号:3)および
5'-TTCTAGCTCCTCAACCAAATCCT-3' (配列番号:4)；ならびに
GADH
5'-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3' (配列番号:5)および
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (配列番号:6)。
PCR反応は、産物強度が増幅の直線相の範囲内に入るように、サイクル数を最適化した。

(3)ノーザンブロット解析
6個の膀胱癌細胞株と8個の正常ヒト器官のmRNAから成るヒト多組織部ブロット（Takara Clontech、パロアルト、カリフォルニア州）および膀胱癌細胞ブロットは³²PラベルMPHOSPH1 cDNAでハイブリダイズした。プローブ、すなわちMPHOSPH1 cDNAは、プライマー5'-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3' (配列番号:7)と5'-TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3' (配列番号:8)を用いてRT-PCRにより調製した。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄は、供給業者の推奨に従って行った。ブロットのオートラジオグラフィーは、増感スクリーンを用いて-80℃で14日間行った。

(4)発現ベクターの構築
MPHOSPH1とPRC1のオープンリーディングフレーム配列はKOD-Plus DNAポリメラーゼ(東洋紡、大阪、日本)を使用して以下のプライマーでPCRすることにより増幅した：
MPHOSPH1
フォワード：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAATCTAATTTTAATCAAGAGG-3' (配列番号: 9)および
リバース： 5'-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3' (配列番号:10) (下線はNotI部位を示す)；ならびに
PRC1
フォワード：5’-CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3’ (配列番号:11) (下線部はEcoRI部位を示す)および
リバース：5’-TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3’ (配列番号:12) (下線部はXhoI部位を示す)。

MPHOSPH1とPRC1のPCR産物はHAタグpCAGGS発現ベクターのNotI部位、FLAGタグpCAGGS発現ベクターのEcoRIおよびXhoI部位にそれぞれ挿入した。これらの構築物はDNA配列決定により確認した。トランケートMPHOSPH1の鋳型のプライマー配列を以下に示す：
1182から1302
フォワード：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAAATCACACAGTTAACAAATAATTTGC-3’ (配列番号:13)および
リバース：5’-ATAAGAATGCGGCCGCACCTGAATGGTTCGCTGTTTCAT-3’ (配列番号:14)；ならびに
1295から1465
フォワード：5’-CCGGAATTCATGAAACAGCGAACCATTCAG-3’ (配列番号:15)
および
リバース：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGTCAGTATTTCCATTTCATTCTGTT-3’（配列番号:16）；ならびに
1456 から1662
フォワード：5’-CCGGAATTCATGAAGCAACAGAATGAAATGGAAATACT-3’ (配列番号:17) および
リバース：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCTGGACGTATGGCAACCTTTT-3’ (配列番号:18)；ならびに
1655 から 1725
フォワード：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAACAAAAGGTTGCCATACGTC-3’ (配列番号:19)および
リバース：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGCTTCTACATTTGAGAGCTTTGA-3’ (配列番号:20)；ならびに
1718から1780
フォワード：5’-CCGGAATTCATGTCAAAGCTCTCAAATGTAGAAGCA-3’ (配列番号:21)および
リバース：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3’ (配列番号:10)（下線部はNOTIまたはEcoRI制限酵素部位を示す）。

(5)抗MPHOSPH1特異的ポリクローナル抗体
C末端にHisタグエピトープとMPHOSPH1(1612から1780アミノ酸)またはPRC1（234から360アミノ酸）の一部を発現するように設計したプラスミドをpET21ベクターを用いて調製した（Novagen、ウィスコンシン州、マディソン）。組み換えペプチドは大腸菌BL21コドン‐プラス株（Stratagene、カリフォルニア州、ラジョラ）にそれぞれ発現させ、Ni-NTAレジンアガロース（Qiagen）とTALON(Takara Clontech)を用いて供給業者の手順に従って精製した。精製した組み換えタンパクはウサギに接種し、免疫血清を標準的手順に従ってアフィニティーカラムで精製した。アフィニティー精製した抗MPHOSPH1抗体と抗PRC1抗体はウエスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫細胞化学染色に下記に示すように使用した。これらの抗体はUMUC3膀胱癌細胞においてウエスタンブロット解析により内因性PHOSPH1を特異的に認識することが確認された。

(6)同期化およびフローサイトメトリー解析
トランスフェクション後24時間、アフィディコリン(2 μg/ml)でさらに16時間作用させて細胞をG1期で停止させた。細胞周期はPBS(-)で5回洗浄することにより解除した。細胞周期停止から解除した後、示した時点で細胞を回収した。FACS解析のため、同期化した接着細胞および脱離細胞のアリコート400 μlを混合し、4℃、70%エタノールで固定した。PBS(-)で洗浄した後、RNase I 1 mgを含むPBS 1 mlと共に細胞を37℃で30分間インキュベートした。細胞はヨウ化プロピジウム(PI) 50 mgを含むPBS 1 ml中で染色した。細胞周期の各画分の割合は、フローサイトメーター(FACScalibur；Becton Dickinson、カリフォルニア州、サンディエゴ)で少なくとも10000個の細胞から測定した。免疫細胞化学解析のため、同期化した細胞は示した時点で固定し、以下に示すように染色した。

(7)免疫細胞化学解析
UMUC3細胞はウェル当たり1×10⁵細胞で播種した。24時間後、細胞は4%パラホルムアルデヒドを含むPBSを用いて固定し、室温で2分間0.1% Triton X-100を含むPBSを用いて透過性を与えられた。続いて、細胞を4℃で12時間3% BSAのPBS溶液で被覆し、非特異的抗体結合部位を阻害した。次に、細胞を、ブロッキング溶液1/100希釈のアフィニティー精製した抗MPHOSPH1特異的ポリクローナル抗体と共にインキュベートした。PBSで洗浄した後、UMUC3細胞は、1/1000希釈のAlexa488結合抗マウス二次抗体(Molecular Probe)により染色した。核は4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸(DAPI)で対比染色した。顕微鏡(ライカ、日本、東京)下で蛍光像を取得した。

(8)免疫組織化学解析
パラフィン包埋された膀胱癌組織切片は外科的標本から得た。臨床におけるMPHOSPH1タンパク発現を調べるため、組織切片は高pHを有する抗原回復溶液(DAKO)中で108℃で15分間オートクレーブした後に、ENVISION+キット/HRP(DakoCytomation、デンマーク、グロストラップ)を用いて染色した。内因性のペルオキシダーゼおよびタンパク質をブロッキングした後、これらの切片を、1/80希釈の抗MPHOSPH1ポリクローナル抗体と共にインキュベートした。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ免疫グロブリン(Envisionキット、Dako Cytomation、カリフォルニア州、カーピンテリア)を用いて、免疫検出を行った。最終的に、反応物を3,3 V-ジアミノベンジン(Dako)で発色させ、細胞はヘマトキシリンで対比染色した。

(9) 低分子干渉RNAアッセイ
ベクターに基づくRNAiシステム、psiU6BX3.0を以前確立した。このシステムは哺乳類細胞で低分子干渉RNAを合成する設計をする（Shimokawa T et al., Cancer Res 2003, 63: 6116-20）。psiU6BXベクターに二本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることにより、siRNA発現プラスミドを調製した。siRNA発現ベクターはLipofectamine2000(Invitrogen)試薬またはFuGENE6(Roche) をそれぞれ供給業者の推奨に従って使用し、J82またはUMUC3細胞にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞は0.6から1.0 mg/ml ジェネティシン（G418）存在下で28日間または21日間培養し、それぞれコロニー数をギムザ染色で測定した。細胞生存度は処理後28日または14日のMTTアッセイで評価した。

MPHOSPH1タンパク発現の抑制を確認するため、アフィニティー精製した抗MPHOSPH1特異的ポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット解析、および標準的手順に従った半定量的RT-PCRを行った。さらに、sPRC1特異的siRNAのノックダウン効果を特異的プライマーを使用した半定量的RT-PCRで確認した。内部対照としてのGAPDHプライマーは前述と同じである。PRC1特異的プライマーは以下の通りである。
5'-GTTTGTCCCTTGGCTCTCATC-3' (配列番号:22)および
5'-AGTCCACACTGGTAAGCTTTTGA-3'(配列番号:23)。
RNAi用合成オリゴヌクレオチドの標的配列は以下の通りである。
対照としてのEGFPは5'-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3'(配列番号:24)
siRNA-MPHOSPH1 5'-GTGAAGAAGTGCGACCGAA-3'(配列番号:25)
siRNA-MPHOSPH1ミスマッチ 5'-TTGTAGAAGTGCGACCGAG-3'(配列番号:26)
siRNA-PRC1#1 5'-GGAAAGACTCATCAAAAGC-3'(配列番号:27)
siRNA-PRC1#2 5'-GCATATCCGTCTGTCAGAAT-3'(配列番号:31)および
siRNA-PRC1#2ミスマッチ 5'-TCATATCCCTCTGTAAGAT-3'(配列番号:35)。

(10)定常的にMPHOSPH1を発現するNIH3T3細胞の樹立
MPHOSPH1発現ベクターまたはモックベクターをFUGENE6を用いて上述のようにNIH3T3細胞へトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞は0.9 mg/mlのジェネティシン(G418)(Invitrogen)を含む培地中でインキュベートした。NIH3T3細胞のクローンは限界希釈法でサブクローニングした。HAタグMPHOSPH1発現は抗HAモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット解析によって評価した。最終的に幾つかのクローンがMPHOSPH1-NIH3T3として樹立および指定された。

インビトロでのMPHOSPH1増殖促進効果を調べるため、3つの独立したMPHOSPH1-NIH3T3細胞と3つの独立したモック-NIH3T3細胞5000個を播種し、5日間毎日MTTアッセイにより細胞数を測定した。

インビボ実験は機構ガイドラインに従って動物施設で行った。ヌードマウスの腫瘍成長におけるMPHOSPH1の効果をさらに調べるため、16匹のBALB/cA Jcl-nuマウス（雌、7週齢）にNIH3T3-MPHOSPH10#1、NIH3T3-MPHOSPH1#3、NIH3T3-モック#1またはNIH3T3-モック-#3(5×10⁶個)を皮下注射で注入した。腫瘍は、3週間の間、3日毎に測定し、その容積を以下の公式で評価した。0.5×(最大直径)×（最小直径）²

(11)免疫沈降法およびウエスタンブロッティング
細胞は溶解バッファー（50 mM Tis0HCL(pH8.0)、150 mM NaCl、0.5% NP-40、プロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII(Calbiochem、カリフォルニア州、サンディエゴ)）で溶解した。全タンパクをラット抗HA抗体（Roche）またはマウス抗c-myc抗体（Sigma）2μgとともに、4℃で2時間インキュベートした。免疫複合物はプロテインGセファロース（Zymed Laboratories、カリフォルニア州、南サンフランシスコ）とともに2時間インキュベートし、その後溶解バッファーで洗浄した。共沈降したタンパクはSDS-PAGEで分離した。

SDS-PAGEで分離したタンパク質はニトロセスロース膜へ転写し、その後マウス抗c-myc抗体（Sigma）またはラット抗HA抗体（Roche）と共にインキュベートした。次いで、HRP結合二次抗体と共にインキュベートした後、ECLキット(Amersham Biosciences)を用いてシグナルを可視化した。

(12)細胞増殖におけるMPHOSPH1とPRC1のノックダウン効果
UMUC3細胞にsi-EGFP(負対照)、si-MPHOSPH1、またはsi-PRC1(上述のsiRNAアッセイを参照)を発現するように設計されたプラスミドをFuGENE6(Roche)を用いてトランスフェクト後、4日間細胞形態を調べた。トランスフェクション後4日目、Alexa594ファロイジン（Molecular probes）とDAPIで細胞を免疫細胞化学的染色した。蛍光像は共焦点顕微鏡（ライカ、日本、東京）下で得た。MPHOSPH1発現におけるsiRNAの抑制効果を調べるため、ウエスタンブロット解析をアフィニティー精製した抗MPHOSPH1抗体を用いて標準的手順に従って行った。

2．結果
(1)膀胱癌における上方制御遺伝子としてのMPHOSPH1の同定
新規治療剤の標的として適用可能である分子を同定するため、浸潤性膀胱癌26症例の全ゲノム発現プロファイル解析を遺伝子27,648個またはESTを提示するcDNAマイクロアレイを用いてあらかじめ行った（Takata R et al., Clin Cancer Res April 1, 2005, 11(7): 2625-36）。

この解析によって、検討した膀胱癌細胞の大多数においてその発現が上方制御されていた遺伝子セットが同定された。これらのうち、MPHOSPH1（M期ホスホプロテイン1）遺伝子は半定量的RT-PCR解析による膀胱癌細胞株（データ示さず）と同様に臨床膀胱癌症例で上方制御が確認されるが（図1A）、その発現は睾丸を除いたどの正常器官でも検出されず、さらなる調査のため選択された。続いて、ノーザンブロット解析では約7kbのMPHOSPH1遺伝子転写物が、試験した6個の膀胱癌細胞株全てで上方制御されていたが、睾丸を除く正常器官では発現していなかった（図1B、1C）。

次に、MPHOSPH1に対するポリクローナル抗体が、膀胱癌組織におけるそのタンパク質発現を調査するため開発された（材料および方法を参照されたい）。

アフィニティー精製された抗MPHOSPH1ポリクローナル抗体による免疫組織化学解析は、臨床浸潤性膀胱癌組織切片の膀胱癌細胞において陽性染色を提示したが、正常膀胱組織では検出されなかった（図1D）。さらに、MPHOSPH1の上方制御された発現は初期段階の膀胱癌でも検出された（図1D）。MPHOSPH1の上昇は、その進行にMPHOSPH1の関与が示唆される浸潤性膀胱癌の発現プロファイル解析によって最初に同定されたが、膀胱癌の進行では同定されていなかった。

(2)膀胱癌細胞におけるMPHOSPH1の細胞局在
MPHOSPH1遺伝子をさらに明らかにするため、抗MPHOSPH1抗体を使用した免疫組織化学解析によって膀胱癌細胞株UMUC3の内因性MPHOSPH1細胞局在を調べた。内因性MPHOSPH1は間期では主に細胞の核に局在しているが、核膜消失後のM期細胞では細胞質全体で観察された。免疫細胞化学解析はMPHOSPH1の発現パターンが細胞終期に依存していることを示唆したので、細胞周期の異なるポイントにおけるMPHOSPH1の局在を調べるため、アフィジコリンを用いてUMUC3細胞を同調させた。図2に示したように、内因性MPHOSPH1は前期、中期、前後期の細胞質に局在していた。さらに、そのタンパク質は後後期には細胞の中央部に集積し、終期には最終的に収縮環に濃縮された。これらの知見は細胞質分裂におけるMPHOSPH1の重要な機能を示唆する。

(3)MPHOSPH1の発癌活性
MPHOSPH1の発癌機能を評価するため、MPHOSPH1高発現レベルが示されている膀胱癌細胞株J82およびUMUC3において、哺乳動物ベクターに基づくRNA干渉(RNAi)法により、MPHOSPH1内在発現をノックダウンした（材料および方法を参照されたい)。MPHOSPH1特異的siRNA(si-MPHOSPH1)がこの遺伝子発現を有意に抑制するか対照siRNA構築物（si-EGFP）と比較して、MPHOSPH1発現レベルを半定量的RT-PCRおよびウエスタンブロット解析により調べた（図3A）。siRNA構築物を用いたコロニー形成アッセイおよびMTTアッセイは、MPHOSPH1特異的なsiRNAの導入がJ82とUMUC3細胞の増殖を抑制することを示した（図3B 、3C）。さらに、si-MPHOSPH1の3塩基置換を含むsiRNA(si-MPHOSPH1ミスマッチ、材料および方法を参照されたい)を構築して実験を行い、同様にMPHOSPH1発現または膀胱癌細胞増殖抑制効果がないことが判明した（図3A）。

MPHOSPH1の増殖促進効果をさらに確認するため、外因性MPHOSPH1を安定発現させたNIH3T3派生細胞を樹立した（NIH3T3-MPHOSPH1-1、2および3細胞）。ウエスタンブロット解析では3つの派生クローンにおいて、高レベルの外因性MPHOSPH1タンパクを示した(図4A)。それに続くMTTアッセイは3つの派生細胞株NIH3T3-MPHOSPH1-1、2、3がモックプラスミドをトランスフェクトした細胞よりも非常に早く増殖し（NIH3T3 モック-1、2、3細胞）（図4B）、MPHOSPH1発現が細胞増殖を増幅させる可能性が高いことを示した。次に、外因性MPHOSPH1を発現させたNIH3T3派生細胞が細胞周期の進行を早めるかどうか調べるため、FACS解析を行った。図4Cに示したように、NIH3T3-MPHOSPH1細胞の細胞周期は全時点で、特にG2/M期細胞（6時間）において、NIH3T3-モック細胞よりも早かった（MPHOSPH1:モック=35.71%:22.10%）。結局、NIH3T3-モック細胞は12時間ではG0/G1期にほとんど戻っていたが、NIH3T3-MPHOSPH1細胞はG0/G1期を経過し、12時間ではS期に移行していた（図4C）。

インビボでのMPHOSPH1の機能を調べるため、NIH3T3-MPHOSPH1細胞またはNIH3T3-モック細胞を皮下注射によりBALB/cA Jcl-nuマウスへ移植した（♀、7週齢）。NIH3T3-MPHOSPH1細胞（#1または#2）を移植した12匹全ては、NIH3T3-モック細胞(#1または#2)を移植したものと比較してヌードマウスで有意に早く、大きな腫瘍を形成した（図4D）。これらの知見は、インビボおよびインビトロの両方で膀胱癌形成におけるMPHOSPH1の発癌機能を示す。

(4)MPHOSPH1とPRC1の相互作用
膀胱癌細胞においてMPHOSPH1の機能をさらに検討するため、MPHOSPH1と相互作用するタンパク質を調べた。探索の結果、MPHOSPH1と相互作用する候補物質としてprotein-regulating cytokinesis 1（PRC1）タンパクが同定された。このタンパクは後後期または終期の中心体または収縮環に局在し、中央部形成（midzone formation）および細胞質分裂において機能することが知られている。加えて、PRC1は幾つかのキネシンファミリータンパク質と相互作用することが報告されている（ban R et al., J Biol Chem 2004, 279: 16394-402; Kurasawa Y et al., EMBO J 2004, 23: 3237-48; Zhu C & Jiang W, Proc Natl Acad Sci USA 2005, 102: 343-8; Gruneberg U et al., J Cell Biol 2006, 172: 363-72）。

半定量的RT-PCRによる膀胱癌症例のPRC1発現パターンを解析は、PRC1とMPHOSPH1が膀胱癌症例でともに上方制御されていることを見出した（図5A）。
次に、COS7細胞へ同時導入させたHAタグMPHOSPH1とFLAGタグPRC1を用いて共免疫沈降法実験を行った。抗FLAG抗体または抗HA抗体を用いたところ、それぞれHAタグMPHOSPH1はFLAGタグPRC1と共沈降で同定され、同様にFLAGタグPRC1はHAタグMPHOSPH1と共沈降で同定され（図5B）、これらの2つのタンパクが相互作用することを示している。次に、細胞免疫化学解析は UMUC細胞の間期において、外因性PRC1は染色された線維アレイフィラメントに局在し、外因性MPHOSPH1は共局在することを示した（図5C）。

さらに、これらのタンパクはM期、特に後後期の間は共局在していることが観察され、紡錘体中央部に転移し、中央部で一組の狭い微小管束として共局在していた。しかし、興味深いことに2つのタンパク質は終期細胞では離れて局在していた。PRC1（赤）は前述したように中心体の中央に局在し、一方MPHOSPH1（緑）は微小管のプラス端近傍に存在していた。これらの知見は、膀胱細胞終期を除き、細胞周期の間、MPHOSPH1がPRC1と相互作用することを強く示唆している。

(5)MPHOSPH1とPRC1の相互作用の同定
PRC1と相互作用するMPHOSPH1領域を同定するため、一連のHAタグMPHOSPH1トランケート型とFLAGタグ全長PRC1を用いてCOS7細胞に同時導入して共免疫沈降実験を行った（図6A）。抗FLAGまたは抗HA抗体でのイムノブロット解析はMPHOSPH1の2つの構築物（1188-1456番と1662-1718番のアミノ酸）がPRC1に結合することを示し、MPHOSPH1のストーク領域とテール領域のC末端2つの結合領域を介してMPHOSPH1がPRC1と相互作用することを示唆している（図6B）。

(6)膀胱癌におけるPRC1特異的siRNAの増殖阻害効果
さらに膀胱癌形成過程におけるPRC1の生物学的役割を確認するため、PRC1を過剰発現する膀胱癌細胞株J82およびUMUC3の各構築物ノックダウン効果を調べるためのPRC1特異的siRNA発現ベクターを構築した。半定量的RT-PCRでは、si-PRC1#1とsi-PRC1-#2はPRC1発現を劇的にノックダウンしたが、si-PRC1#1の3塩基置換を含むsi-PRC1ミスマッチ構築物または負対照si-EGFPはまったく、あるいはほとんどノックダウン効果を示さなかった。si-PRC1#1またはsi-PRC1#2をJ82とUMUC3細胞に導入すると、コロニー数と細胞生存率が有意に減少したが、対照siRNAとsi-PRC1ミスマッチはコロニー形成と細胞生存率にはまったく、あるいはほとんど効果がなかった（図7A および7B）。これらの知見からPRC1が膀胱癌細胞の増殖において重要な機能を有することが示唆される。

さらに図7Cに示すように、癌細胞の細胞質分裂におけるMPHOSPH1およびPRC1のノックダウン効果を調べるための免疫細胞化学的解析を実施した。MPHOSPH1またはPRC1特異的siRNA発現ベクターをUMUC3細胞にトランスフェクトし、それぞれトランスフェクション後4日間細胞形態を観察した。興味深いことに、トランスフェクション後4日間で、2つのsiRNAどちらかをトランスフェクトした細胞で多核形成が観察された（図7C）。この知見はMPHOSPH1またはPRC1が存在しないために細胞質分裂の失敗を生じ、最終的に細胞死を誘導する多核細胞を次々に形成するという結果になることを示している。

産業上の利用可能性
本発明は、癌、特に膀胱癌の治療および予防剤の同定およびスクリーニング方法に関し、MPHOSPH1タンパクとPRC1の結合を阻害する化合物の検出に関るものである。本発明により、細胞質分裂の失敗と多核形成がMPHOSPH1およびPRC1のノックダウンで観察されることが示された。従って、本スクリーニング方法は膀胱癌の治療または予防の新規治療戦略の発展を約束する。

本明細書において報告したデータは膀胱癌の包括的な理解を深め、治療用薬剤および予防剤のための分子標的を同定するための手がかりを提供する。このような情報は腫瘍形成のより深い理解に寄与し、膀胱癌の治療および最終的な予防に向けた新規戦略を開発するための指標を提供する。

本明細書において引用した特許、特許出願、および出版物はすべて、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

さらに、本発明をその特定の態様に言及して詳細に説明してきたが、上記の説明は、例示的かつ説明的な性質のものであって、本発明およびその好ましい態様を例示することを意図していることが理解されるべきである。当業者は、日常的な実験を通して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そこで様々な変更および修正がなされ得ることを容易に理解すると考えられる。したがって、本発明は上記の説明によって規定されるのではなく、特許請求の範囲およびそれらの同等物によって規定されることが意図される。

Claims (6)

1. 下記段階を含む、MPHOSPH1とPRC1の結合を阻害する作用物質の同定方法：
   a)以下からなる群から選択される第1のポリペプチド：
   i）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   ii）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なPRC1結合活性を有するならば、1つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、置換、欠失または挿入される、ポリペプチド、
   iii）配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なPRC1結合活性を有するならば、配列番号:2と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
   iv）配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のPRC1結合活性を有するならば、配列番号:1の核酸配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
   を、以下からなる群から選択される第2のポリペプチド：
   i）配列番号:37のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   ii）配列番号:37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、1つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、置換、欠失または挿入される、ポリペプチド、
   iii）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、配列番号:37と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
   iv）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、配列番号:36の核酸配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
   と、作用物質の存在下で接触させる段階；
   b) 第1のポリペプチドと第2のポリペプチドの結合レベルを検出する段階；
   c) 作用物質の非存在下における第1と第2のポリペプチドの結合レベルを比較する段階；ならびに
   d）第1と第2のポリペプチドの結合レベルを減少させる作用物質を選択する段階。
2. 第1のポリペプチドが配列番号:2の1188から1718のアミノ酸配列を含む、請求項1の方法。
3. 下記段階を含む、膀胱癌細胞の増殖を抑制する作用物質の同定方法：
   a）以下からなる群から選択される第1のポリペプチド：
   i）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   ii）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なPRC1結合活性を有するならば、1つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、置換、欠失または挿入される、ポリペプチド、
   iii）配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なPRC1結合活性を有するならば、配列番号:2と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
   iv）配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のPRC1結合活性を有するならば、配列番号:1の核酸配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
   を、以下からなる群から選択される第2のポリペプチド：
   i）配列番号:37のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   ii）配列番号:37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、1つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、置換、欠失または挿入される、ポリペプチド、
   iii）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、配列番号:37と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
   iv）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOISPH1結合活性を有するならば、配列番号:36の核酸配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
   と、作用物質の存在下で接触させる段階；
   b）第1と第2のポリペプチドの結合レベルを検出する段階；
   c）作用物質非存在下における第1と第2のポリペプチドの結合レベルを比較する段階；ならびに
   d) 第1と第2のポリペプチドの結合レベルを減少させる作用物質を膀胱癌細胞の増殖を抑制する作用物質として選択する段階。
4. 第1のポリペプチドが配列番号:2の1188から1718のアミノ酸配列を含む、請求項3の方法。
5. 下記段階を含む、膀胱癌の治療または予防用作用物質の同定方法：
   a）以下からなる群から選択される第1のポリペプチド：
   i）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   ii）配列番号:2のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なPRC1結合活性を有するならば、1つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、置換、欠失または挿入される、ポリペプチド、
   iii）配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等なPRC1結合活性を有するならば、配列番号:2と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
   iv）配列番号:2のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のPRC1結合活性を有するならば、配列番号:1の核酸配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
   を、以下からなる群から選択される第2のポリペプチド：
   i）配列番号:37のアミノ酸配列を含むポリペプチド、
   ii）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、配列番号:37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、1つまたはそれ以上のアミノ酸が付加、置換、欠失または挿入される、ポリペプチド、
   iii）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、配列番号:37と少なくとも約80％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド、および
   iv）配列番号:37のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同等のMPHOSPH1結合活性を有するならば、配列番号:36の核酸配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド
   と、作用物質の存在下で接触させる段階；
   b）第1と第2のポリペプチドの結合レベルを検出する段階；
   c）その作用物質の非存在下における第1と第2のポリペプチドの結合レベルを比較する段階；ならびに
   d) 第1と第2のポリペプチドの結合レベルを減少させる作用物質を膀胱癌の予防または治療のための作用物質として選択する段階。
6. 第1のポリペプチドが配列番号:2の1188から1718のアミノ酸残基を含む、請求項5の方法。

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