CN101558307A - 抑制mphosph1与prc1之间的结合的作用剂的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于鉴定阻碍或抑制MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂的方法。这样的作用剂预期可作为抑制表达MPHOPH1和PEC1的细胞的增殖、以及预防或治疗癌症特别是膀胱癌的药物发挥作用。

Description

抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂的筛选方法

本申请要求2006年8月25日提交的美国临时专利申请第60/840,124号的权益，其全部内容以提述方式并入本说明书。

发明领域

本发明涉及采用M期磷蛋白(MPHOSPH1)和细胞质分裂蛋白蛋白调控因子1(PRC1)的结合为指标的筛选方法。可以根据本方法进行鉴定适用于癌症，特别是膀胱癌的治疗或预防的作用剂。

背景技术

膀胱癌是人群中第二常见的泌尿生殖器肿瘤，全世界每年约有357,000例的新发病例(Parkin DM et al.，CA Cancer J Clin 2005，55：74-108)。这其中约有1/3的患者很可能在诊断时已成为浸润性疾病或转移性疾病(Parkin DMet al.，CA Cancer J Clin 2005，55：74-108；Sternberg CN，Ann Oncol 1995，6：113-26；Ardavanis A et al.，Br J Cancer 2005，92：645-50)。虽然对于那些仅发生肌肉浸润性膀胱癌的患者的治疗而言根治性膀胱切除术被视为“黄金标准”，然而这些患者中约有50％在接受膀胱切除术后2年出现转移，并随后死于该疾病(Sternberg CN，Ann Oncol 1995，6：113-26)。

近二十年间，CMV(顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、长春碱(vinblastine)或M-VAC(甲氨蝶呤、长春碱、多柔比星、顺铂)等基于顺铂的组合化学疗法成为晚期膀胱癌患者的首选(Ardavanis A et al.，Br J Cancer2005，92：645-50；Lehmann J et al.，World J Urol 2002，20：144-50)。然而，总体预后仍然很差。而且，M-VAC化学疗法的副作用极大(Vaughn DJ，SeminOncol 1999，26(suppl 2)：117-22)。因此，人们热切希望开发新的针对膀胱癌的分子靶向药物。

cDNA微阵列已被证明是能够同时分析数千基因的表达图式的有效手段。基于cDNA微阵列的癌细胞与正常细胞的全基因组表达模式的比较可提供有用的信息来帮助发现用于癌症诊断和治疗开发的候选靶标分子(Debouck C et al.，Na Genet 1999，21：48-50)。最近的药物开发研究着重以与癌症发生相关的重要分子为靶标，以伊马替尼(imatinib)、去铁胺(mesylate)和曲妥单抗(trastuzumab)为代表。通过将RNAi与癌表达模式分析相结合，可望鉴定这样的治疗药物靶标(Clarke PA et al.，Eur J Cancer 2004，40：2560-91)。

通过全基因组表达分析，分离了与肝细胞癌(Hamamoto R et al.，Nat CellBiol2004，6：731-40；YagyuR et al.，Int J Oncol2002，20：1173-8)、滑膜肉瘤(Nagayama S et al.，Oncogene 2004，23：5551-7；Nagayama S et al.，Oncogene2005.24：6201-12)、肾细胞癌(Togashi A et al.，Cancer Res 2005，65：4817-26)和乳腺癌(WO 2005/28676)的发生和/或进展相关的多个癌基因。这样的分子被认为是用于开发新治疗方法的良好候选分子。

M-VAC等细胞毒剂屡屡产生严重的不良反应，因此，基于已经充分阐明的机理来慎重地选择新的靶标分子，对于开发将副作用的危险性控制在最小限度的有效抗癌剂而言是非常有益的。在此目标的基础上，曾经进行了26例膀胱癌与29例正常人组织的表达模式分析，发现了在膀胱癌中特异性过表达的多个基因(Takata R et al.，Clin Cancer Res April 1，2005，11(7)：2625-36；Saito-Hisaminato A et al.，DNA Res 2002，9：35-45)。MPHOSPH1(参照C2093)被鉴定为膀胱癌中过表达的基因之一。

而且，MPHOSPH1先前被鉴定为在G2/M过渡期被特异性磷酸化的蛋白质，而且被定性为正末端指向驱动蛋白相关蛋白(plus-end-directed kinesinrelated protein)(Abaza A et al.，J Biol Chem 2003，278：27844-52)。MPHOSPH1cDNA编码1780个氨基酸的蛋白质，该1780个氨基酸包括3个NH2型驱动蛋白相关蛋白的特征结构域即NH2驱动蛋白马达域、中央卷曲螺旋-茎柄域和C-球形尾域。而且，先前已经证明MPHOSPH1是在胞质分裂中起重要作用的正末端指向分子马达，在HeLa细胞中MPHOSPH1从后期到末期在纺锤体的中间区蓄积(Abaza A et al.，J Biol Chem 2003，278：27844-52；Kamimoto T et al.，J Biol Chem 2001，276：37520-8)。

有报道称：PRC1与数个驱动蛋白家族蛋白相互作用(Ban R et al.，J BiolChem 2004，279：16394-402；Kurasawa Y et al.，EMBO J 2004，23：3237-48；Zhu C&Jiang W，Proc Natl Acad Sci USA 2005，102：343-8；Gruneberg U et al.，J Cell Biol 2006，172：363-72)。有报道称：Hela细胞中抗PRC1抗体对PRC1的抑制引起双核细胞的增加(Mollinari C et al.，J Cell Biol 2002，157：1175-86)。而且，有报道称：PRC1可以与数种与细胞分裂事件特别是胞质分裂相关的分子(例如KIF4或KIF14)相互作用(EMBO J 2004，23：3237-48；Mollinari C et al.，Mol Biol Cell 2005，16：1043-55)。而且，PRC1已经由本发明人等鉴定在乳腺癌中过表达(WO 2005/28676)。

发明内容

本发明基于，至少部分基于体内的MPHOHPH1与PRC1间的相互作用的发现。MPHOSPH1和PRC1这两种蛋白均在膀胱癌细胞中过表达，而MPHOSPH1的表达仅见于膀胱癌细胞和正常睾丸组织。如本说明书中揭示的，如果抑制编码这些蛋白的基因中的一个，细胞质分裂就会受到抑制，诱导多核化，从而最终导致表达该基因的细胞的增殖抑制。

因此，本发明提供一种筛选抑制MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂的方法。更具体地，该方法包括下述步骤：a)在作用剂存在下使MPHOSPH1与PRC1接触、b)检测MPHOSPH1与PRC1的结合水平、c)与不存在作用剂的条件下检测出的MPHOSPH1与PRC1的结合水平相比较；d)选择降低MPHOSPH1与PRC1的结合水平的作用剂。在本方法的语境中，也可以用片段来代替完整MPHOSPH1或完整PRC1使用，只要各片段能够保持与其配偶配体的结合能力。本筛选中特别优选使用的MPHOSPH1片段包括这样的片段，它们包含SEQ ID NO：2的第1188～1718位的氨基酸残基。

考虑到经上述方法鉴定的作用剂很可能抑制表达所述蛋白质的细胞的增殖，这样鉴定出的作用剂可作为膀胱癌的治疗或预防的候选物质。因此，本发明还提供鉴定抑制膀胱癌细胞增殖的作用剂的方法，以及用于膀胱癌治疗或预防的作用剂。

附图说明

图1显示了膀胱癌与正常组织中的MPHOSPH1的表达。图面A显示了在来自10例膀胱癌患者的肿瘤细胞和人正常组织(显微切除的正常膀胱移行细胞、心脏、肺、肝脏、肾脏)中通过半定量RT-PCR测定的MPHOSPH1的表达。以GAPDH的表达作为定量对照。图面B显示了膀胱癌细胞系(HT1197、UMUC3、J82、HT1376、SW780、RT4)和正常人脏器(心脏、肺、肝脏、肾脏、脑、胰脏、睾丸、膀胱)中的MPHOSPH1转录物的Northern印迹分析结果。图面C显示了各种人组织中的MPHOSPH1转录物的Northern印迹分析结果。图面D显示了手术切除的膀胱癌组织(浅表性膀胱癌2例和浸润性膀胱癌2例)和正常膀胱组织切片中使用亲和纯化抗MPHOSPH1多克隆抗体免疫组织化学染色测定的MPHOSPH1蛋白质表达。

图2显示了细胞周期进行中膀胱癌细胞内源性MPHOSPH1蛋白质的亚细胞定位。对于UMUC细胞，使用亲和纯化的MPHOSPH1多克隆抗体进行了免疫组织化学染色(绿)。DAPI显示了核染色(蓝)。

图3显示了MPHOSPH1-siRNA对膀胱癌细胞系J82和UMUC3的增殖抑制效果。图面A显示通过western印迹(上图面)和半定量RT-PCR(下图面)测定的MPHOSPH1表达。图面B显示了用表达MPHOSPH1-siRNA、对照siRNA (EGFP)或MPHOSPH1错配siRNA的质粒转染的J82细胞和UMUC3细胞的集落形成测定结果。图面C显示，与对照的导入相比较，J82细胞和UMUC3细胞应答于MPHOSPH1-siRNA的通过MTT测定的存活力提高。

图4显示NIH3T3细胞中外源性MPHOSPH1的生长促进效果。图面A显示用外源性MPHOSPH1高水平表达细胞或者模拟载体转染的细胞的western印迹分析结果。用抗HA标签单克隆抗体验证了外源性导入的MPHOSPH1表达。使用了β-肌动蛋白作为上样对照。图面B显示体外的NIH3T3-MPHOSPH1细胞生长。采用MTT测定法测量了用MPHOPH1转染的NIH3T3细胞(NIH3T3-MPHOPH1-#1、#2、#3)和用模拟转染的细胞(NIH3T3-模拟-#1、#2、#3)的生长。在图面C中，采用阿非迪霉素(aphidicoline)处理24小时使NIH3T3-MPHOSPH1(NIH3T3-MPHOSPH1-#1)和模拟(NIH3T3-模拟#1)同步。停滞解除(release)后，在显示的时间点制备了细胞样品。图面D显示了对NIH3T3-MPHOSPH1细胞实施的体内肿瘤生长测定的结果。肿瘤的直径用测径器测定，肿瘤体积通过下式来确定：0.5×(长径(largerdiameter))×(短径(smaller diameter))²。采用非成对t检验来评价注射后第21日的NIH3T3-MPHOSPH1与NIH3T3-模拟的差异(p＜0.001；非成对t检验)。

图5显示MPHOSPH1和PRC1的相互作用。图面A显示通过半定量RT-PCR测定的膀胱癌病例的MPHOSPH1和PRC1的表达。使用GAPDH表达作为定量对照。图面B显示了MPHOSPH1和PRC1的共免疫沉淀。对于用HA标签MPHOSPH1和myc标签PRC1蛋白转染的COS7细胞的细胞裂解物，使用抗HA或抗myc进行了免疫沉淀。对于免疫沉淀物，使用单克隆抗HA抗体或抗myc抗体进行了免疫印迹。图面C显示了UMUC3细胞中内源性MPHOSPH1和外源性PRC1的亚细胞定位。内源性MPHOSPH1蛋白(绿)与外源性PRC1蛋白(红)共定位。

图6显示MPHOSPH1中被确定与PRC1相互作用的区域。图面A为免疫沉淀实验中使用的MPHOSPH1的片段和全长的模式图。图面B显示一系列MPHOSPH1片段和PRC1的共免疫沉淀。对于用HA标签MPHOSPH1和myc标签PRC1蛋白转染的COS7细胞的细胞裂解物，使用抗HA或抗myc进行了免疫沉淀。对于免疫沉淀物，如图5的图例说明那样，使用单克隆抗HA抗体或抗myc抗体进行了免疫印迹。

图7显示了膀胱癌细胞增殖中MPHOSPH1和PRC1的重要作用。图面A显示了通过半定量RT-PCR(左上)、集落形成测定(左下)、MTT测定(右)分析出的si-PRC1或对照siRNA(si-EGFP)对J82细胞的效应。图面B显示了通过半定量RT-PCR(左上)、集落形成测定(左下)、MTT测定(右)分析出的si-PRC1或对照siRNA(si-EGFP)对UMUC3细胞的效应。图面C显示了用si-MPHOSPH1、si-PRC1、或作为对照的si-EGFP转染的UMUC3细胞的形态。对于用si-MPHOSPH1、si-PRC1、或作为对照siRNA的si-EGFP转染的UMUC细胞的形态，通过显微镜下观察(上图)、或免疫细胞化学(下图)进行了评价。为了区分核与细胞质，使用DAPI和鬼笔环肽对用siRNA处理的UMUC细胞进行了染色。

发明的具体实施方式

在微阵列分析检测出的在膀胱癌中上调的基因中，本发明注意到了在绝大多数受检查的膀胱癌细胞中高度过表达的基因——MPHOSPH1(M-phase phosphoprotein 1，M期磷酸蛋白1)(SEQ ID NO：1)(NM_016195)。Northern印迹分析显示，在除睾丸外的任何受检的正常人组织中均几乎检测不到MPHOSPH1的表达。而且，使用抗MPHOSPH1多克隆抗体的免疫组织化学染色实验明显表明膀胱癌细胞中MPHOSPH1(SEQ ID NO：2)表达的上调。这提示MPHOSPH1是癌症-睾丸抗原(Kanehira M et al.，Cancer Res.2007，67(7)：3276-85)。综合起来，这些结果还提示，MPHOSPH1基因可能是膀胱癌抗癌剂或癌肽疫苗开发的有价值的靶标。

而且，免疫细胞化学染色实验显示：MPHOSPH1在间期定位于膀胱癌细胞中的细胞核、在后期定位于中间区，在末期则定位于收缩环。而且，已经证实利用siRNA敲低内源性MPHOSPH1，可诱导膀胱癌细胞的细胞质分裂失败，结果使得多核细胞蓄积，并导致其后的细胞死亡。因此，通过鉴定与MPHOSPH1相互作用的蛋白质，对膀胱癌细胞中MPHOSPH1的生物学作用进行了研究。

发现了MHPOSPH1与PRC1(SEQ ID NO：36所编码的SEQ ID NO：37)(AF044588)(Protein regulator of Cytokinesis 1，胞质分裂蛋白调控因子1，)相互作用，PRC1基因的表达也在膀胱癌中上调。由于它们功能相似且在膀胱癌细胞中共同过表达，选择PRC1作为与MPHOSPH1相互作用的候选物质。如图5所示，在膀胱癌细胞中，从间期至后期的期间，显示了MPHOSPH1和PRC1(胞质分裂蛋白调控因子1)的体内相互作用和共定位，但在末期细胞中，MPHOSPH1包围着定位在中间体中央的PRC1(图5C)。因此，纺锤体中MPHOSPH1和PRC1的相关性和共定位进一步支持了下述主张：MPHOSPH1是马达蛋白分子，其在细胞分裂期间沿着纺锤体移动PRC1。它们在膀胱癌病例中的共反式激活(co-transactivation)提示(图5A)它们的相互作用在膀胱癌发生过程中发挥着关键作用。

而且，使用特异性siRNA抑制MPHOSPH1或PRC1中任一个的表达可诱导多核细胞形成，其后发生细胞死亡。为了评价MPHOSPH1或PRC1对于膀胱癌细胞的生长或存活是否有作用，在显示高水平表达MPHOSPH1和PRC1的膀胱癌细胞系——J82或UMUC3中用特异性siRNA敲低了内源性MPHOSPH1或PRC1中任一个的表达。各特异性siRNA显著抑制相应基因的表达，其结果是对这些细胞产生显著的生长抑制，这表明MPHOSPH1和PRC1这两者对于膀胱癌细胞的增殖都是必需的。而且，在UMUC3细胞中敲低MPHOSPH1或PRC1表达引起多核细胞的显著增加。这些结果支持了文献中向HeLa细胞显微注射抗PRC1抗体引起的PRC1抑制可能造成双核细胞的增加的提议(Mollinari C et al.，J Cell Biol 2002，157：1175-86)。由于它们之间相互作用的抑制可能最终诱导膀胱癌细胞细胞质分裂失败后细胞死亡，因此，抑制它们的相互作用的作用剂作为针对膀胱癌的药物开发的靶标可能是有价值的

本发明人等提供的微阵列数据阐明了膀胱癌中的限定性MPHOSPH1过表达。但是，被发现与MPHOSPH1相互作用的蛋白PRC1，不仅在膀胱癌细胞中、而且在其它数种类型的人肿瘤中也过表达(数据未给出)。已报导PRC1与数种有丝分裂事件特别是细胞质分裂相关分子例如KIF4或KIF14相互作用(Kurasawa Y et al.，EMBO J 2004，23：3237-48；Mollinari C et al.，Mol Biol Cell 2005，16：1043-55)，但根据本发明人等获得的膀胱癌表达模式，KIF4和KIF14均不在膀胱癌中表达。这些结果提示，通过MPHOSPH1与PRC1相互作用稳定化中间区微管束并容许细胞分裂完成而进行的细胞分裂调节，是膀胱癌细胞中的特异性事件，虽然该相互作用对于细胞增殖的贡献以及其它结合配偶体的存在尚待阐明。

最后，本文的发现提示，MPHOSPH1/PRC1途径可能在膀胱癌细胞中具有致癌功能，并且可能成为膀胱癌抗癌剂开发的有潜力的分子靶标。抑制或阻遏MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂的开发可能是膀胱癌治疗的合理战略。虽然对MPHOSPH1与PRC1的结合还有必要进行进一步分析，但本说明书中提供的认识有助于更深入理解膀胱癌癌症的发生以及开发膀胱癌的新治疗方法。

除非另有说明，本说明书中使用的词语“一个”或“一种”或“该”是指至少一个或至少一种。

对于物质(例如多肽、抗体、多核苷酸等)使用的术语“分离的”或“纯化的”是指该物质基本上不含可能本包含在其天然供给源中的至少一种物质。因此，“分离的”或“纯化的”抗体是基本上不含细胞物质(例如糖类、脂质或来源于该蛋白(抗体)所由来的细胞或组织源的其它污染蛋白)的抗体，和/或在其为化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的抗体。术语“基本上不含细胞物质”包括多肽的制备物，其中该多肽与细胞(该多肽分离自该细胞或者在该细胞中重组表达)的细胞组分分开。因此，基本上不含细胞物质的多肽包括这样的多肽制备物，其中多肽制备物含异源蛋白(本说明书中也称为“污染蛋白”)少于约30％、20％、10％或5％(以干重计)。当多肽为重组产生时，还优选其基本上不含培养基，包括培养基少于蛋白质制备物体积的约20％、10％或5％的多肽制备物。当多肽是由化学合成产生时，优选基本上不含化学前体或其他化学物质，包括这样的多肽制备物，其中蛋白合成中涉及的化学前体或其他化学物质少于蛋白质制备物体积的约30％、20％、10％或5％(以干重计)。例如，对蛋白制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶考马斯亮蓝等染色后，出现单一条带，可以证明该蛋白制备物含有分离的或纯化的多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是分离的或纯化的。

“分离的”或“纯化的”核酸分子，例如cDNA分子，当由重组技术产生时，可基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当其由化学合成时，其可基本上不含化学前体或其它化学物质。在优选的实施方案中，编码本发明的抗体或其片段的核酸分子是分离的或纯化的。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白(质)”在本说明书中可互换使用，是指氨基酸残基的多聚体。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰残基或非天然存在的氨基酸残基(例如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸多聚体，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。

术语“氨基酸”指的是天然存在及合成的氨基酸，以及功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及在细胞内翻译后被修饰的氨基酸，(例如羟脯氨酸(hydroxyproline)、γ-羧基谷氨酸(γ-carboxyglutamate)和O-磷酸丝氨酸(O-phosphoserine))。短语“氨基酸类似物”指的是具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(例如与氢、羧基、氨基和R基结合的α碳)但具有修饰的R基或修饰的肽骨架的化合物(例如高丝氨酸(homoserine)、正亮氨酸(norleucine)、甲硫氨酸亚砜(methionine sulfoxide)、甲硫氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium))。短语“氨基酸模拟物”指的是具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构、但功能类似于天然存在的氨基酸的化合物。

在本说明书中氨基酸可用其通常公知的3个字母符号表示，或用IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission(国际理论和应用化学联合会-国际生物化学联合会生物化学命名委员会)推荐的单字母符号表示。

除非另外特别说明，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在可互换使用，而且，类似于氨基酸，也可以用其通常公认的单字母代码表示。与氨基酸的情况类似，这其中包括天然的核酸聚合物以及非天然存在的核酸聚合物这两者。

人MPHOSPH1的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1(GenBank登录号NM_016195)。在本说明书中，短语“MPHOSPH1基因”包括人以及其他动物的MPHOSPH1基因，所述其他动物包括非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。但是，本发明不限于上述，还包括相应于MPHOSPH1基因的等位突变体及在其他动物中发现的基因。

人MPHOSPH 1基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2(GenBank登录号NP_057279.2)。说明书中的由MPHOSPH 1基因编码的多肽称为“MPHOSPH 1”，有时也称“MPHOSPH 1多肽”或“MPHOSPH 1蛋白”。

人PRC1基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO：36。而且，已知其具有分别包括15、14和14个外显子的3个不同的转录变体。变体的核苷酸序列和氨基酸序列可以在GenBank上检索(下文中，将GenBank登录号NM_003981、NM_199413、NM_199414的变体的序列分别称为V1、V2和V3，对应的氨基酸序列可分别以GenBank登录号NM_003972.1、NP_955445.1、NM_955446.1查得)。除去V1的外显子13和14中的可变变异(alternative variation)，其它全部外显子在3个变体中是共通的。V2变体没有V1的外显子14，并在最后一个外显子内包含一个新的提前终止密码子(early stop codon)。V3变体的外显子14完全缺失，V3的外显子13比V1的3′末端短77bp，并在最后一个外显子中包含一个新的提前终止密码子。变体V1、V2和V3分别编码620、606和566个氨基酸的蛋白质。

在本说明书中，短语“PRC1基因”包括人以及其他动物的PRC1基因，所述其他动物包括但不限于非人灵长类、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛，还包括相应于PRC1基因的等位突变体及在其他动物中发现的基因。

人PRC1基因编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO：37，在本说明书中，将PRC1基因编码的多肽称为“PRC1”，有时称为“PRC1多肽”或“PRC1蛋白”。

根据本发明的一个方面，功能等价物也被认为是“MPHOSPH1多肽”或“PRC1多肽”。在本说明书中，蛋白质的“功能等价物”是具有与蛋白质等价的生物活性，特别是结合活性的多肽。即，任何保留MPHOSPH1蛋白针对PRC1蛋白的活性、或者PRC1蛋白针对MPHOSPH1蛋白的活性的多肽都可以用作本发明中所述的功能等价物。所述功能等价物包括那些在MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白天然存在的氨基酸序列中取代、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸而得到的多肽。

通常已知蛋白质中1个或多个氨基酸的修饰不会对该蛋白质的功能造成影响(Mark DF et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1984，81：5662-6；Zoller MJ&Smith M，Nucleic Acids Res 1982，10：6487-500；Wang A et al.，Science 1984，224：1431-3；Dalbadie-McFarland G et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1982，79：6409-13)。而实际上，已知经突变的蛋白或修饰的蛋白，具有通过在特定氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而被修饰的氨基酸序列的蛋白，保留原来的生物活性(Mark et al.，Proc Natl Acad SciUSA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acids Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。因此，本领域技术人员将承认本发明的上下文中涵盖氨基酸序列的改变单个氨基酸或一小部分氨基酸的个别添加、缺失、插入或取代，或者被认为是“保守修饰”的修饰，即氨基酸的改变导致产生具有类似功能的蛋白质的修饰。

对于氨基酸突变的数目没有特殊限制，只要能够保持蛋白质的活性即可。但是，通常改变数目优选为氨基酸序列的5％或以下。因此，在优选的实施方式中，这样的突变体中发生突变的氨基酸的数目通常为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选6个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少。

优选将待突变的氨基酸残基突变为保留氨基酸侧链性质的其他氨基酸(该过程即公知的保守氨基酸取代)。氨基酸侧链性质的例子包括疏水氨基酸(丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)、亲水氨基酸(精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸(cystein)、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸)以及具有以下共有官能团或特性的侧链：脂肪族侧链(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸)；含羟基侧链(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)；含硫原子侧链(C、M)；含羧酸和酰胺侧链(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺)；含碱(base)侧链(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)和含芳香族侧链(组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)。给出功能上类似的氨基酸的保守取代表是本领域公知的。例如，以下8组分别包含彼此互为保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；及

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton、Proteins(1984))。

本发明的MPHOSPH1或PRC1蛋白中包括这样的保守修饰的多肽。但本发明并不限于此，MPHOSPH1和PRC1蛋白还包括非保守性修饰，只要它们保留原蛋白的结合活性。而且，修饰的蛋白不排除多态性变体(polymorphic variants)、种间同源物、以及由这些蛋白的等位基因编码的蛋白。

通过添加一个或多个氨基酸残基而修饰的蛋白的例子是融合蛋白。融合蛋白是MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白与其他肽或蛋白质的融合物，也可以用于本发明。融合蛋白可通过本领域技术人员公知的技术来制备，例如通过将编码本发明的MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的DNA与编码其他肽或蛋白的DNA连接，使得读码框一致，然后将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达所述融合DNA。对于与本发明的MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白融合的肽或蛋白没有限制，只要作为结果产生的融合蛋白保持用于相互结合的原蛋白的活性即可。

可以用作与MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白融合的肽的已知肽包括例如FLAG(Hopp等人，Biotechnology 6：1204-10(1988))、含有6个His(组氨酸)残基的6×His、10×His、流感病毒凝集素(HA)、人c-myc片段、VSP-GP片段、p18HIV片段、T7-标签、HSV-标签、E-标签、SV40T抗原片段、lck标签、α-微管蛋白片段、B-标签、蛋白C片段等。可以与本发明的蛋白融合的蛋白的例子包括GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、流感病毒凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定区、β-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖-结合蛋白)等。

通过将编码上述融合肽或蛋白的可商购的DNA与编码MPHOSPH1或PRC1蛋白的DNA融合，并表达所制备的融合DNA，即可制备出融合蛋白。

而且，修饰的蛋白不排除多态性变体、种间同源物、以及由这些蛋白的等位基因编码的蛋白。

此外，本领域公知的分离功能上等价的蛋白的可选方法为例如使用杂交技术的方法(Sambrook等人，Molecular Cloning 2nd ed.9.47-9.58，ColdSpring Harbor Lab.Press(1989))。本领域技术人员能够容易地分离出与编码人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的MPHOSPH1或PRC1 DNA序列(即SEQID NO：1或36)的全部或部分具有高度同源性的DNA，并且由该分离的DNA分离与人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白。因此，本发明使用的蛋白包括由与编码人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的DNA序列的全部或部分在严格条件下杂交的DNA编码的、且在功能上等价于人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的蛋白。这些蛋白包括对应于人源或小鼠源蛋白的哺乳动物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的蛋白)。在从动物中分离与编码人MPHOSPH1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，特别优选使用来自睾丸或膀胱癌的组织。另一方面，在从动物中分离与编码人PRC1蛋白的DNA高度同源的cDNA时，除来自睾丸或膀胱癌的组织外，还可以使用来自乳腺癌的组织。

本领域技术人员可以按常规选择用于分离编码与人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白的DNA的杂交条件。短语“严格(杂交)条件”指的是这样的条件，在此条件下核酸分子会与其靶标序列杂交，通常在核酸的复杂混合物中，但不与其他序列发生可检测的杂交。严格条件是依赖序列的，在不同环境下会不同。比较长的序列在较高的温度特异性杂交。对核酸杂交的全面指导可在Tijssen，Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中找到。通常，对于确定的离子强度pH下的特定序列而言，严格条件选择为比其热解链温度(T_m)低约5-10℃。T_m是这样的温度，在该温度下，达到平衡时，同靶点互补的探针中有50％与靶标序列杂交(由于靶标序列过量存在，在T_m，50％的探针被占据)(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)。还可以通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)达到严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号为背景的至少两倍，优选为背景杂交的10倍。示例性的严格杂交条件可以如下述地获得：在50％甲酰胺、5×SSC、1％SDS中于42℃温育，或者在5×SSC、1％SDS中于65℃温育，在0.2×SSC、0.1％SDS中于50℃洗涤。

在本发明的语境中，本领域技术人员可以按常规选择用于分离编码与人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白的DNA的合适杂交条件。例如杂交可通过如下方式进行：使用“Rapid-hyb缓冲液”(Amersham LIFESCIENCE)于68℃进行预杂交30分钟或更长时间，加入标记的探针，并在68℃保温1小时或更长时间。其后的洗涤步骤例如可以在低度严格条件下进行。示例的低度严格条件为包括，例如，42℃、2×SSC、0.1％SDS，或优选50℃、2×SSC、0.1％SDS。更优选使用高严格条件。示例的高严格条件可包括，例如，室温下用2×SSC、0.01％SDS洗涤3次，每次20分钟，然后于37℃用1×SSC、0.1％SDS洗涤3次，每次20分钟，再于50℃用1×SSC、0.1％SDS洗涤2次，每次20分钟。然而，几种因素，如温度和盐浓度会影响杂交的严格度，本领域技术人员可适当选择这些因素以获得所需的严格度。

可以采用基因扩增法，例如聚合酶链反应(PCR)法代替杂交来分离编码与人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白的DNA，所述基因扩增法使用基于编码人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白(SEQ ID NO：2或37)的DNA的序列信息(SEQ ID NO：1，MPHOSPH1；SEQ ID NO：36，PRC1)合成的引物。

由通过上述杂交技术或基因扩增技术分离的DNA编码的、与人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白功能上等价的蛋白一般与所述人MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的氨基酸序列具有高度同源性(又称序列同一性)。“高度同源性”(或称“高度同一性”)典型地指2个最适比对的序列(多肽或多核苷酸序列中)之间的同一性程度。典型地，高度同源性或同一性是指同源性为40％或更高，优选为60％或更高，更优选为80％或更高，更优选为85％、90％、95％、98％、99％或更高。2个多肽序列或多核苷酸序列之间的同源性或同一性程度可例如依照″Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)″中的算法确定。

可用于本发明语境中的蛋白可能在氨基酸序列、分子量、等电点、存在或不存在糖链、或形式等方面有差异，这取决于用于产生所述蛋白的细胞或宿主或者采用的纯化方法。无论如何，只要该蛋白保留等价于相应的天然蛋白(MPHOSPH1(SEQ ID NO：1)；或PRC1(SEQ ID NO：37))所具有的结合活性，就可以用于本发明。

本发明还包括应用MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白的部分肽。部分肽具有MPHOSPH1或PRC1的蛋白的特有的氨基酸序列，并由少于约400个、通常少于约200个、经常少于约100个，且至少约7个，优选由约8个或更多，更优选由约9个或更多氨基酸组成。适用于本发明的筛选的MPHOSPH1部分肽至少包含MPHOSPH1蛋白的PRC1结合位点；适用于本发明的筛选的PRC1部分肽至少包含PRC1蛋白的MPHOSPH1结合位点。短语MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白“功能等价物”也包括这样的部分肽。

本发明人等揭示了SEQ ID NO：2的第1188～1465位和第1662～1718位氨基酸残基作为MPHOSPH1的PRC1结合区的功能。因此，要在本发明的筛选中使用的MPHOSPH1部分肽至少应包含SEQ ID NO：2的第1188～1465位或第1662～1718位氨基酸残基。而且，根据本发明的优选实施方式，用于所述筛选方法的MPHOSPH1蛋白至少包含SEQ ID NO：2的第1188～1718位氨基酸残基。

而且，在本发明的语境中，短语“MPHOSPH1基因”包括编码MPHOSPH1蛋白或MPHOSPH1蛋白的任何功能等价物的多核苷酸。相似地，短语“PRC1基因”包括编码PRC1蛋白或PRC1蛋白的任何功能等价物的多核苷酸。

在本发明的语境中，要用本发明的筛选方法鉴定的作用剂可以是任何化合物和包含多种化合物的组合物。而且，根据本发明的筛选方法暴露于细胞或蛋白质的受试作用剂可以是单一化合物或者化合物的组合。当本发明中使用化合物的组合时，这些化合物可以依次或同时接触。

在本发明的筛选方法中可以使用任何受试作用剂，例如细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物的产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的微分子化合物(包括核酸构建物、如反义RNA、siRNA、核酶等)以及天然化合物。本发明的受试作用剂还可以使用本领域已知的多种组合文库方法中的任一种获得，所述方法包括：(1)生物学文库，(2)空间可寻址平行固相或溶液相文库(spatially addressableparallel solid phase or solution phase libraries)，(3)需要去卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物(one bead one compound)”文库法，和(5)使用亲和层析选择的合成文库法。使用亲和层析选择的生物学文库法仅限于肽文库，而其它四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物小分子文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。合成分子文库的方法的例子可见于本技术领域(DeWitt等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-13；Erb等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91：11422-6；Zuckermann等人J.Med.Chem.37：2678-85，1994；Cho等人(1993)Science 261：1303-5；Carell等人(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell等人，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994，33：2061；Gallop等人，J.Med.Chem.1994，37：1233-51)。化合物文库可存在于溶液中(参见Houghten，Bio/Techniques 1992，13：412-21)或珠子(Lam，Nature 1991，354：82-4)、芯片(Fodor，Nature 1993，364：555-6)、细菌(美国专利5,223,409)，孢子(美国专利5,571,698；5,403,484和5,223,409)、质粒(Cull等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1992，89：1865-9)或噬菌体(Scott and Smith Science 1990，249：386-90；Delvin Science 1990，249：404-6；Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87：6378-82；Felici J.Mol.Biol.1990，222：301-10；美国专利申请2002103360)上。

此外，通过本发明的筛选方法获得的作用剂还包括对利用本发明的任何筛选方法筛选的化合物中的部分结构进行添加、缺失和/或取代而转变而成的化合物。

而且，当被筛选的受试作用剂是蛋白时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以测定该蛋白的全氨基酸序列来推定编码该蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列、基于该序列制备寡聚DNA作为探针，使用该探针对cDNA文库进行筛选，从而得到编码该蛋白的DNA。所得DNA确认了在制备作为治疗或预防癌症的候选物的受试作用剂中的有用性。

在本说明书描述的筛选方法中有用的受试作用剂可以是下述抗体，所述抗体与MPHOSPH1蛋白或PRC1蛋白特异性结合，或者所述蛋白的丧失了原蛋白体内生物活性的部分肽特异性结合。例如，可以试验抗体(例如多克隆抗体)抑制MPHOSPH1蛋白与PRC1蛋白的结合的能力。

本说明书中使用的术语“抗体”是指具有特定结构的免疫球蛋白分子，其仅与用于合成该抗体的抗原或该抗原的近缘抗原相互作用(即结合)。而且，抗体可以是抗体片段或修饰的抗体，只要其结合MPHOSPH1或PRC1基因编码的蛋白。例如，所述抗体片段可以是Fab、F(ab’)₂、Fv或将来自H链和L链的Fv片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv)(Huston等人，Proc Natl Acad Sci USA 1988，85：5879-83)。更具体地，可以用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体以产生抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入合适的表达载体，并在适合的宿主细胞中表达(参见例如Co等人，J Immunol 1994，152：2968-76；Better and Horwitz，Methods Enzymol1989，178：476-96；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 1989，178：497-515；Lamoyi，Methods Enzymol 1986，121：652-63；Rousseaux等人，MethodsEnzymol 1986，121：663-9；Bird and Walker，Trends Biotechnol 1991，9：132-7)。

抗体可以通过与各种分子如聚乙二醇(PEG)缀合来进行修饰。这样的修饰抗体也可以用于本发明的语境中。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。或者，本发明的抗体可以是嵌合抗体或人源化抗体的形式，所述嵌合抗体具有源自非人抗体的可变区与源自人抗体的恒定区，所述人源化抗体具有源自非人抗体的互补决定区(CDR)以及源自人抗体的框架区(FR)和恒定区。所述抗体可利用已知技术制备。人源化可以通过下述方法进行：用啮齿类的CDR序列取代人抗体的对应序列(Verhoeyen等人，Science 1988，239：1534-6)。由此，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中实质上短于人可变域全长的区域被非人物种来源的对应序列所取代。

除人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如，Hoogenboom&Winter，(1992)J.Mol.Biol.227：381-8)。类似地，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物，例如内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全致失活的小鼠，来制备人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos.6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016。

虽然受试作用剂文库的构建是本技术领域公知的，下文中还是提供了有关受试作用剂鉴定以及用于本筛选方法的这些作用剂的文库构建的进一步指导。

(i)分子建模

对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对待抑制靶分子即MPHOSPH1和PRC1的分子结构的知识，方便了受试作用剂文库的构建。预筛选适于进一步评估的受试作用剂的方法之一，是对受试作用剂与其靶标的相互作用进行计算机建模。在本发明中，MPHOSPH1与PRC1相互作用的建模提供了对相互作用本身细节的认识，并提示了干扰该相互作用的可能策略，包括潜在的相互作用分子抑制剂。

计算机建模技术为所选分子的三维原子结构的可视化以及与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于从所选分子的x-射线晶体分析或NMR成像而来的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以优化结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者中产生细小改变时分子-化合物相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常关联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。

上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation，Waltham，Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。QUANTA可帮助进行分子相互行为的分析、可视化、修饰和相互作用性构建。

大量文献综述了与特定蛋白质相互作用的药物的计算机建模，例如Rotivinen，et al.Acta Pharmaceutica Fennica 97，159-166(1988)；Ripka，NewScientist 54-57(Jun.16、1988)；McKinlay and Rossmann，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29，111-122(1989)；Perry and Davies，Prog Clin BiolRes.291：189-93(1989)；Lewis and Dean，Proc.R.Soc.LondBBiol Sci.236，125-40和141-62(1989)；以及关于核酸组分的模型受体，有Askew，et al.，J.Am.Chem.Soc.111，1082-90(1989)。

其他筛选和图形描述化学物质的计算机程序可以例如BioDesign Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix Inc.，Mississauga，Ontario，Canada和Hypercube Inc.，Cambridge，Ontario等公司获得。见例如DesJarlais et al.(1988)J.Med.Chem.31：722-9；Meng et al.(1992)J.Computer Chem.13：505-24；Meng et al.(1993)Proteins 17：266-78；Shoichet et al.(1993)Science 259：1445-50。

一旦鉴定了MPHOSPH1/PRC1相互作用的假定抑制剂，就可以根据已鉴定的假定抑制剂的化学结构使用组合化学技术构建任何数目的变体，如下文所述。对于最终的假定抑制剂或“受试作用剂”文库可使用本发明的方法进行筛选，以鉴定该文库中破坏MPHOSPH1/PRC1结合的受试作用剂。

(ii)组合化学合成

受试作用剂的组合文库可作为合理药物设计程序的一部分而产生，该程序涉及了对于在已知MPHOSPH1/PRC1相互作用抑制剂中存在的核心结构的知识。这种方法使文库保持合理的大小，便于高通量筛选。或者可通过简单合成组成该库的分子家族的全部排列构建简单的，特别是短的聚合物分子文库。后一种方法的实例是由所有长度为6个氨基酸的肽组成的文库。这种肽文库可包括每一个6氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。

组合化学文库的制备是本领域技术人员所公知的，并可通过化学或生物合成产生。组合化学库包括，但不限于肽文库(见例如美国专利5,010,175，Furka，Int.J.Pept.Prot.Res.37：487-93(1991)和Houghten et al.，Nature354：84-6(1991))。也可以采用其他用于产生化学多样性库的化学。这类化学包括，但不仅限于：肽(例如PCT公开第WO 91/19735号)，被编码的肽(例如WO 93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)，苯并二氮卓(benzodiazepine)(例如美国专利第5,288,514号)，diversomers如乙内酰脲类(hydantoins)，苯并二氮卓类(benzodiazepines)和二肽(dipeptides)(DeWitt etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909-13(1993))，插烯(vinylogous)多肽(Hagihara et al，J.Amer.Chem.Soc.114：6568-70(1992))，具有葡萄糖骨架的非肽性肽模拟物(Hirschmann et al.，J.Amer. Chem.Soc.114：9217-8(1992))，小化合物文库的类似有机合成(Chen et al.，J.Amer.Chem.Soc.116：2661(1994))，寡聚氨基甲酸酯(oligocarbamates)(Cho et al.，Science 261：1303(1993))，和/或肽基膦酸盐或酯(peptidylphosphonate)(Campbellet al.，J.Org.Chem.59：658(1994))，核酸文库(见Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology 1995supplement；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5,539,083)，抗体文库(见例如Vaughan et al.，NatureBiotechnology，14(3)：309-14(1996)和PCT/US96/10287)，糖文库(见例如Lianget al. Science，274：1520-2(1996)和美国专利5,593,853)，小有机分子库(见例如，苯并二氮卓，Gordon EM.Curr Opin Biotechnol.1995Dec 1；6(6)：624-31.；类异戊二烯，美国专利5,569,588；噻嗪烷酮类(thiazanones)和间噻嗪烷酮类(metathiazanones)，美国专利5,549,974；吡咯烷类，美国专利5,525,735和5,519,134；吗啉代化合物，美国专利5,506,337；苯并二氮卓、5,288,514等)。

(iii)噬菌体展示

另一种方法使用重组噬菌体产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott andSmith，Science 1990249：386-90；Cwirla，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.1990，87：6378-82；Devlin et al.，Science，1990，249：404-6)可以构建非常大的文库(例如10⁶-10⁸个化学实体)。另一种方法主要使用化学方法，其实例是Geysen法(Geysen et al.，Molecular Immunology 1986，23：709-15；Geysen et al.J.Immunologic Method 1987，102：259-74)和Fodor等人的方法(Science 1991251：767-73)。Furka等(第14届国际生物化学会议，第5卷，摘要FR：013、1988；Furka，Int.J.Peptide Protein Res.199137：487-493)，Houghten(美国专利No.4,631,211)和Rutter等(美国专利No.5,010,175)描述了产生能够作为激动剂或拮抗剂加以测试的肽混合物的方法。

制备组合文库的设备可以商业获得(见例如357MPS、390MPS、Advanced Chem Tech，Louisville KY，Symphony，Rainin，Woburn，MA，433A Applied Biosystems，Foster City，CA，9050Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，大量组合文库本身也可商业获得(见例如ComGenex，Princeton，N.J.，Tripos，Inc.，St.Louis，MO，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，MartekBiosciences，Columbia，MD，等)。

本发明提供抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂的筛选方法。抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂可望抑制膀胱癌细胞的增殖，从而可用于膀胱癌的治疗或预防。因此，本发明还提供抑制膀胱癌细胞增殖的化合物的筛选方法和用于膀胱癌的治疗或预防的作用剂的筛选方法。

更具体地，该方法包括以下步骤。

(a)在作用剂的存在下使MPHOSPH1蛋白质与PRC1蛋白质接触；

(b)检测MPHOSPH1与PRC1蛋白质间的结合水平；

(c)将MPHOSPH1与PRC1蛋白质间的结合水平与不存在所述作用剂的条件下检测到的水平相比较；

(d)选择降低MPHOSPH1和PRC1蛋白质的结合水平的作用剂作为抑制MPHOSPH1和PRC1蛋白质的结合的作用剂，即可用于抑制膀胱癌细胞增殖和治疗或预防膀胱癌的作用剂。

在本发明的说明书中，对两个蛋白质之间的“结合(的)抑制”是指至少降低所述蛋白质间的结合。因此，在有些情况下，样品的结合对的比例与合适的对照(即未经受试作用剂处理的、或来源于非癌样品的、或来源于癌样品的)相比较减少。与对照样品中的结合对相比，发生结合的蛋白质的量的减少可以为90％、80％、70％、60％、50％、40％、25％、10％、5％、1％或其以下(即0％)。

在本说明书中，MPHOSPH1蛋白质和PRC1蛋白质包括前述蛋白质的功能等价物。用于筛选的MPHOSPH1或PRC1蛋白质或者它们的功能等价物可以按照本领域技术人员公知的方法以重组蛋白或天然蛋白的形式来制备。这些蛋白可以采用任何公知的用于产生多肽的基因工程方法来获得(例如，Morrison J.，J Bacteriology 1977，132：349-51；Clark-Curtiss&Curtiss，Methods in Enzymology(Wu等人编)1983，101：347-62)。例如，可通过下述方法制备重组蛋白：将编码该蛋白的DNA(例如具有SEQ ID NO：1或36的核苷酸序列的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，获得提取物，然后对提取物进行层析以纯化多肽，所述层析例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤或利用固定了针对本发明蛋白的抗体的层析柱的亲和层析，或上述多于一种柱子的组合。

此外，当在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中将可用于本发明语境中的蛋白表达成与谷胱甘肽S-转移酶蛋白的融合蛋白或添加多个组氨酸的重组蛋白时，可以使用谷胱甘肽柱或镍柱来纯化所表达的重组蛋白。

纯化融合蛋白之后，通过用凝血酶(thrombin)或因子Xa切割融合蛋白来除去目的多肽之外的区域也是可能的。

可以采用本领域技术人员公知的方法分离出天然蛋白，例如使结合有可与前述的MPHOSPH1或PRC1蛋白结合的抗体的亲和柱与表达所述蛋白的组织或细胞的提取物接触。所述抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体，也可以是任何修饰抗体，只要其与MPHOSPH1或PRC1蛋白结合。

MPHOSPH1或PRC1蛋白或者它们的功能等价物也可以采用体外翻译系统在体外产生。

而且，MPHOSPH1蛋白和PRC1蛋白的部分肽也可以用于本发明，只要它们保持相互结合的活性。通过基因工程、已知的肽合成法或用适当的肽酶消化天然的MPHOSPH1蛋白和PRC1蛋白，均可以产生所述部分肽。例如，肽合成可以采取固相合成或液相合成。可用于合成的常规肽合成法包括：

1)Peptide Synthesis，Interscience，New York，1966；

2)The Proteins，Vol.2，Academic Press，New York，1976；

3)Peptide Synthesis(日语)，Maruzen Co.，1975；

4)Basics and Experiment of Peptide Synthesis(日语)，Maruzen Co.，1985；

5)Development of Pharmaceuticals(第二卷)(日语)，Vol.14(peptidesynthesis)，Hirokawa，1991；

6)WO99/67288；和

7)Barany G.&Merrifield R.B.，Peptides Vol.2，“Solid Phase PeptideSynthesis”，Academic Press，New York，1980，100-118。

可进一步将多肽或其片段与其他物质连接，只要多肽和片段保留其本身相互结合的能力。可用的物质包括：肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合成的多聚物等。可以进行这些种类的修饰来赋予额外的功能或稳定多肽和片段。

要与受试作用剂接触的MPHOSPH1及PRC1多肽或它们的功能等价物可以是例如纯化多肽、可溶性蛋白、或者与其它多肽相融合的融合蛋白。

本发明的筛选方法可高效而快速地鉴定针对具有较高的干扰MPHOSPH1与其结合配偶体PRC1之间结合的可能性的受试作用剂。一般地，任何确定受试作用剂干扰MPHOSPH1与PRC1的结合的能力的方法均适用于本发明。例如，可以采用ELISA样式的竞争性和非竞争性抑制测定。应当进行对照实验以确定系统的最大结合能力(例如，使已结合的MPHOSPH1与PRC 1接触，并确定结合于MPHOSPH1的PRC1的量)。

作为鉴定抑制本发明的结合的作用剂的方法，可以采用本领域技术人员公知的多种方法。这样的鉴定可以作为体外测定系统，如在细胞系统中进行。更具体地，首先使MPHOSPH1蛋白或其结合配偶体PRC1结合在支持物上，然后将另一种蛋白同受试作用剂一起添加。然后，对该混合物进行温育并清洗，再对结合在支持物上的另一种蛋白进行检测和/或测定。

可用于结合蛋白的支持物(support)的实例包括例如不溶性多糖，如琼脂糖、纤维素和葡聚糖；及合成树脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；可优选使用由上述材料制备的商业上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物传感器芯片等)。使用珠子时，可以将它们填入柱子。或者，磁珠的使用也是本技术领域公知的，该方法可以借助磁力容易地将结合在珠子上的蛋白分离出来。

蛋白质与支持物的结合可根据常规方法进行，这些方法例如化学结合或物理吸附。或者，蛋白质可通过特异性识别它的抗体而与支持物结合。此外，还可以利用相互作用性的多种分子，如抗生物素蛋白和生物素的组合来进行多肽与支持物的结合。

蛋白间的结合可以在缓冲液中进行，缓冲液的例子包括但不限于磷酸缓冲液和Tris缓冲液，只要缓冲液不抑制蛋白间的结合即可。

在本发明中，可以将利用表面等离子体共振现象(surface plasmonresonance phenomenon)的生物传感器(biosensor)用作对结合的蛋白质进行检测或定量的手段。当使用这类生物传感器时，只使用极少量的多肽且不需标记，即可实时观察表现为表面等离子体共振信号的蛋白质之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，可以使用生物传感器诸如BIAcore来评价MPHOSPH1和PRC1之间的结合。

或者，还可以对MPHOSPH1或PRC1中的任一种进行标记，利用结合的蛋白的标记来检测或测定结合的蛋白。具体地，预先对蛋白中的一种进行标记，然后在受试作用剂的存在下使标记的蛋白与另一种蛋白接触，并且在进行了洗涤后根据标记来检测或测定结合的蛋白。

本发明方法中用于标记蛋白质的标记物质可以使用放射性同位素(例如³H、¹⁴C、³²P、³³P、³⁵S、¹²⁵I、¹³¹I)、酶(例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶)、荧光物质(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、德克萨斯红、绿色荧光蛋白和罗丹明)、磁珠(例如DYNABEADS^TM)、量热标记物(如胶体金或者有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等)制的珠子)、以及生物素/抗生物素蛋白。教导这样的标记的使用的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,275,149；和4,366,241。但是，本发明并不限于此，任何可采用分光学、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检出的标记均可以使用。

当使用放射性同位素标记蛋白时，可以通过液体闪烁来进行检测或测定。或者，对于酶标记的蛋白可以这样检测或测定：添加酶的底物，使用吸光光度计(absorptiometer)来检测底物的酶促变化如显色等。而且，当使用荧光物质作为标记物时，可以使用荧光光度计来检测或测定结合的蛋白。

而且，本发明筛选方法中的结合，可以使用针对MPHOSPH1或PRC1的抗体来进行检测或测定。例如，在使固定在支持物上的MPHOSPH1与受试化合物和PRC1接触后，对该混合物进行温育并清洗，然后可以使用针对PRC1的抗体进行检测或测定。或者，可以将PRC1固定在支持物上，并可使用针对MPHOSPH1的抗体作为抗体。

当在本发明的筛选中使用抗体时，优选将抗体用上述标记物质中的任一种进行标记，并基于标记物质进行检测或测定。或者，可以使用针对MPHOSPH1或PRC1的抗体作为第一抗体，通过用标记物质标记的第二抗体对该第一抗体进行检测。而且，本发明的筛选中，与蛋白质结合的抗体可以使用蛋白G或蛋白A柱来进行检测或测定。

或者，在本发明的鉴定方法的另一实施方案中，可以使用利用细胞的双杂交系统(two-hybrid system)(“MATCHMAKER双杂交系统”、“哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参照“Dalton andTreisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。在双杂交系统中，例如，将MPHOSPH1与SRF-结合区或GAL4-结合区融合，并在酵母细胞中表达。将PRC1与VP16或GAL4转录活化区域(transcriptional activation region)融合。或者，可将PRC1SRF-结合区或GAL4-结合区融合，而将MPHOSPH1与VP16或GAL4转录活化区融合。当受试作用剂不抑制MPHOSPH1与PRC1的结合时，这两者的结合激活报道基因，使得阳性克隆能够被检出。就报道基因而言，除HIS3基因外，还可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

在本说明书中，MPHOSPH1与PRC1之间的结合水平也可以作为MPHOSPH1与PRC1结合后发生的任何变化来加以测定。具体地，这样的筛选可以通过使受试作用剂与表达MPHOSPH1与PRC1的细胞(诸如J82或UNUC细胞)接触来进行。例如，可以检测细胞增殖的抑制来确定受试作用剂在MPHOSPH1与PRC1的结合中的影响。

1.竞争性测定样式

竞争性测定可用于筛选本发明的受试作用剂。作为实例，竞争性ELISA样式可以包括与固体支持物结合的MPHOSPH1(或PRC1)。可将结合的MPHOSPH1(或PRC1)与PRC1(或MPHOSPH1)及受试作用剂共温育。经过足够的时间以容许受试作用剂和/或PRC1(或MPHOSPH1)结合MPHOSPH1(或PRC1)后，可清洗底物以除去未结合材料。然后确定与MPHOSPH1结合的PRC1的量。这可以用本领域已知的多种方法中的任何一种来实现，例如使用带有可检测标记物作为标签的PRC1(或MPHOSPH1)种类，或者使经过清洗的底物与标记的抗PRC1(或MPHOSPH1)抗体接触。与MPHOSPH1(或PRC1)结合的PRC1(或MPHOSPH1)的量将与受试作用剂干扰MPHOSPH1对PRC1的结合的能力成反比。关于蛋白质——包括但不仅限于抗体——的标记，如下面的文献所记载：Harlow&Lane，Antibodies，A Laboratory Manual(1988)。

在一种变化形式中，用亲和标签标记MPHOSPH1(或PRC1)。然后，将标记的MPHOSPH1(或PRC1)与受试作用剂和PRC1(或MPHOSPH1)一起温育，然后进行免疫沉淀。然后用抗PRC1(或MPHOSPH1)抗体对免疫沉淀物进行Western印迹。与前面的竞争性测定样式一样，被发现与MPHOSPH1(或PRC1)结合的PRC1(或MPHOSPH1)的量与受试作用剂干扰PRC1与MPHOSPH1结合的能力成反比。

2.非竞争测定形式

对于构建样式不适于直接利用竞争性测定加以筛选的受试作用剂文库(如本文所述的那些)而言，非竞争性结合测定作为初始筛选可能也是有用的。上述文库的实例是噬菌体展示文库(见例如Barret，et al.(1992)Anal.Biochem 204，357-364)。

噬菌体文库有用之处在于能够快速产生可工作量的很多种不同重组肽。噬菌体文库不适于本发明的竞争性测定，但是可以以非竞争样式高效地进行筛选，确定何种重组肽受试作用剂结合MPHOSPH1或PRC1。然后可以制备已鉴定为结合性的受试作用剂，并用竞争性测定样式加以筛选。噬菌体和细胞展示文库的产生和筛选在本领域是公知的，在例如如下文献中有讨论：Ladner et al.，WO 88/06630；Fuchs et al.(1991)Biotechnology9：1369-72；Goward et al.(1993)TIBS 18：136-40；Charbit et al.(1986)EMBO J5，3029-37；Cull et al.(1992)PNAS USA 89：1865-9；Cwirla，et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，6378-82。

示例性的非竞争性测定遵循与上述竞争性测定相似的程序，只是不添加其中一种组分(MPHOSPH1或PRC1)。然而，由于非竞争样式确定的是受试作用剂对MPHOSPH1或PRC1的结合，需要对于每个候选物确定受试作用剂结合MPHOSPH1和PRC1二者的能力。因此，例如，可通过下列步骤确定受试作用剂与固定化的MPHOSPH1的结合：清洗掉未结合的受试作用剂；从支持物洗脱结合的受试作用剂，随后通过例如质谱，蛋白测定(Bradford或Lowry测定，或280nm吸光度测定)对洗脱物进行分析。或者可以省略洗脱步骤，通过监测支持物表面上有机层光谱学性质的变化确定受试作用剂的结合。监测表面光谱学性质的方法包括，但不限于吸光度、反射率、透光度、双折射、折光率、衍射、表面等离子体共振、椭圆偏振测量、共振镜(resonant mirror)技术、光栅耦合波导技术和多极共振光谱，所有这些对于本领域技术人员而言是已知的。在测定中还可使用标记的受试作用剂，从而省去洗脱步骤。在这种情况下，洗去未结合材料后与支持物结合的标记的量与受试作用剂的结合成正比。

已经开发了大量公知的机器人系统，用于溶液相化学。这些系统包括自动工作站，如Takeda Chemical Industries公司(Osaka，Japan)开发的自动合成装置，以及许多利用机器手的机器人系统(Zymate II、Zymark公司、Hopkinton，Mass.；Orca，Hewlett Packard，Palo Alto，Calif.)，它们模拟化学技术人员的手工合成操作。上面的任何一种设备均适合于利用本发明。为使其能够如本文所述地工作而对这些设备所作的修改(如果有的话)的性质和实施，对于相关领域的技术人员而言是显而易见的。此外，大量的组合文库本身可以商业获得(见例如ComGenex，Princeton、N.J.，Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，MO、ChemStar，Ltd，Moscow，RU，3D Pharmaceuticals，Exton，PA，Martek Biosciences，Columbia，MD，等)。

根据本发明的一个方面，本筛选方法所必需的组分可以作为试剂盒来提供，用于筛选抑制MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂、抑制膀胱癌细胞增殖的作用剂、或者用于膀胱癌的治疗或预防的作用剂。本发明的试剂盒可以包含，例如，MPHOSPH1多肽或其功能等价物和/或PRC1多肽或其功能等价物。而且，本试剂盒还可以包含对照试剂(阳性和/或阴性)、可检测标记物、细胞培养基或缓冲液、筛选所必需的容器、用于实施本方法的说明书(例如书面文件、磁带、VCR、CD-ROM、其它)等等。组分和试剂可以分别包装在不同的容器中。

通过本发明的任何方法分离得到的作用剂，可以作为药物施用，或者可以用于制备药物(治疗性或预防性)组合物，用于人及其它哺乳动物如小鼠、大鼠、豚鼠(guinea-pig)、兔、猫、狗、绵羊、猪、牛、猴、狒狒(baboon)和黑猩猩(chimpanzee))来治疗或预防膀胱癌。

本说明书中，术语“预防”是指为了延缓或抑制肿瘤的形成、或者延缓、抑制或减轻癌症的至少一种临床症状，而预防性地施用作用剂。对受试者中肿瘤状态的评价可以采用标准临床规程来进行。预防性施用可以在显现明显的疾病的临床症状之前进行，以预防疾病或疾患和/或延迟它的进展。在本发明的语境中，“预防”包括减少疾病的死亡率或罹患率负担的一切活动。预防可以在初级、次级或三级预防水平上进行。初级预防避免疾病的发生(development)，而次级和三级预防水平包括以防止疾病进展和症状出现为目的的活动，还包括以通过恢复功能和减少疾病相关的并发症来减少既发疾病的负面影响为目的的活动。本发明包括多种多样的以减轻癌症特别是膀胱癌的严重程度为目的的预防疗法。

分离的作用剂可以直接给药，或者可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。药物制剂可包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括颊或舌下)、阴道或非消化道(包括肌内、皮下和静脉内)施用的制剂，以及适于通过吸入或吹入(insufflation)施用的制剂。例如，根据需要，作用剂可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药学可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将作用剂与药理学可接受的载体或介质一起混合成通常接受的药物配制方式(drug implementation)所要求的单位剂型，所述载体或介质具体为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、溶媒(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。这些制剂中活性成分的量构成(make)可获得的指定范围内的合适剂量。

能够混合到片剂和胶囊中的添加剂的例子有：粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶(tragacanth gum)和阿拉伯胶；赋形剂例如结晶纤维素；溶胀剂例如玉米淀粉、明胶和海藻酸(alginic acid)；润滑剂例如硬脂酸镁；增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精；调味剂例如薄荷(peppermint)、Gaultheria adenothrix油和樱桃。当单位剂型为胶囊剂时，上述成分中还可以包括液体载体，例如油。注射用无菌组合物可以使用溶媒例如注射用蒸馏水按照标准的药物配制方式进行配制。

生理盐水、葡萄糖以及包含辅料(adjuvants)如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠的其它等渗液体，可用作注射用水溶液。这些可以与合适的增溶剂组合使用，所述增溶剂例如醇，特别是乙醇、多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂，例如Polysorbate 80(TM)和HCO-50。

芝麻油或大豆油可以作为油质液体使用，并且可以与苯甲酸苄酯或苯甲醇组合使用作为增溶剂，还可与缓冲剂，如磷酸盐缓冲剂和乙酸钠缓冲剂；镇痛剂，如盐酸普鲁卡因；稳定剂，如苯甲醇、苯酚；以及抗氧化剂一起配制。制备好的注射剂可以装入到合适的安瓿(ampoule)中。

适于口服施用的药物制剂可便宜地作为离散单位提供，所述离散单位例如：胶囊剂、扁囊剂(cachet)或片剂，每个单位含有预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；或作为溶液，悬浮液或作为乳液。活性成分还可以以大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)的形式提供，以及纯的形式，即没有载体。用于口服给药的片剂和胶囊剂可含有常规赋形剂诸如结合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂或湿润剂。片剂可通过压缩或模制来制备，其中任选含有一种或多种配方成分。压缩片剂可通过如下方法制备：将活性成分以自由流动的形式(如粉末或颗粒)任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合，并在适当的机器中进行压缩。模制片剂可通过如下方法制备：在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润过的粉末化合物的混合物进行模制。所述片剂可根据本领域已知的方法进行包覆(coated)。口服液体制备物可以是例如水性或油性的悬浊液、溶液、乳液、糖浆或酏剂的形式，或者也可以作为干燥产物提供，以便在使用前用水或其它适宜溶媒加以构成。所述液体制备物可含有常规添加剂诸如悬浮剂，乳化剂，非水性溶媒(可包括食用油)或防腐剂。片剂可任选地配制以提供其中活性成分的缓释或控释。

供非消化道施用的制剂包括水性和非水性的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂(bacteriostat)和使得制剂与目标受者的血液等张(isotonic)的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可含有悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以以单位剂量或多剂量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶；还可以在冷冻-干燥(冻干的)条件下保存，这样仅需要在即将使用前添加无菌液体载体例如盐水、注射用水。或者，可提供所述制剂用于连续输注(continuous infusion)。可由前述的无菌粉末、颗粒及片剂的类型制备即配即用的注射溶液和悬浮液。

适于直肠给药的制剂可提供为含有常用载体如可可脂或聚乙二醇的栓剂(suppository)。用于口内局部给药，例如颊(buccal)或舌下给药的制剂包括锭剂(lozenge)和软锭剂(pastille)，其中锭剂在调味基质，如蔗糖和阿拉伯胶(acacia)或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质，如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中包含活性成分。鼻内给药时，通过本发明得到的化合物可以用作液体喷雾剂或可分散粉末，或采取滴剂(drop)的形式。滴剂可用水性或非水性基质配制，该基质中也含有一种或多种分散剂、增溶剂或悬浮剂。液体喷雾剂便宜地从加压包装中递送。

吸入给药时，可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurized pack)或其它输送气溶胶喷雾的便利装置方便地输送化合物。加压包装可含有适宜的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下，可通过提供输送计量量(metered amount)的阀门来确定剂量单位。

或者，通过吸入或吹入给药时，化合物可以是干粉组合物的形式，例如该化合物与适宜粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以以单位剂型提供，这些剂型例如胶囊、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或发泡包(blister pack)，借助吸入器或吹入器，可由上述剂型施用所述粉末。

需要时，可以采用经过改造而适于缓释活性成分的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂，免疫抑制剂或防腐剂。

优选的单位剂型包含以下列举的有效量、或活性成分的适宜部分。

可以采用本领域技术人员公知方法将采用本发明的方法鉴别出的作用剂施用于患者，所述方法例如动脉注射、静脉注射、皮内注射的形式，以及作为鼻腔内给药、经支气管给药、肌肉给药或口服给药的形式。施用剂量和施用方法因患者的体重和年龄、以及施用方法而有变化，但本领域技术人员能够按常规对它们进行选择。若该作用剂可被DNA编码，则可以将该DNA插入基因治疗用载体，并施用该载体来实施治疗。施用剂量和施用方法因患者的体重、年龄和症状而有变化，但本领域技术人员能够适当地对它们进行选择。

采用本发明的方法鉴别出的作用剂的用量依赖于症状等，对于成人而言，其组合物可在0.1-约250mg/kg每天的范围内施用。成人的剂量范围通常为约5mg-约17.5g/天，优选为约5mg-约10g/天，更优选为约100mg-约3g/天。片剂或其它以离散单位提供的包装规格的单位剂量形式可以方便地包含在该剂量有效的量，或是作为多个这样的剂量有效的量，例如，含有约5mg至约500mg，通常为约100mg至约500mg的单位。

当以注射剂形式向标准成年人(体重60kg)非胃肠道给药时，虽然根据患者、靶器官、症状和给药方法存在一些差异，但便宜地静脉内注射约0.01mg-约30mg每天，优选约0.1mg-约20mg每天，更优选约0.1mg-约10mg每天的剂量。而且，在其它动物的情况下，可以按换算为60kg体重的量施用。

作用剂优选通过口服或注射(静脉内或皮下)来施用，给患者施用的确切的量将由主治医师在考虑包括患者年龄和性别、治疗的确切疾患及其严重程度在内的多种因素的基础上，在其职权范围内确定。或者，施用途径也可能因病情或其严重程度而不同。

采用本发明的方法鉴别出的作用剂还可以用于膀胱癌的治疗或预防。通过施用，可以实现对患有MPHOSPH1蛋白与PRC1蛋白的结合相关的疾病、或者存在患病风险(或可能性)的患者中的疾病进行预防或治疗。该方法中包括减少膀胱癌细胞中MPHOSPH1与PRC1的结合。通过施用采用本发明的筛选方法获得的作用剂，可以抑制其功能。

除非另有说明，本文使用的全部技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的意思相同。如有冲突，以本说明书中包含的定义为准。

以下，更具体地描述本发明的实施例。但是，以下的材料、方法、实施例仅仅是对发明的方面进行说明，而不是对本发明范围的限定。因此，与本说明书中描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可以用于本发明的实施或测试。

实施例

1.材料和方法

(1)膀胱癌细胞系和组织样品

人膀胱癌细胞系HT1197、UM-UC-3、J82、HT1376、SW780和RT4购自美国典型培养物中心(America Type Culture Collection)(ATCC；Rockville，MD)。所用膀胱癌细胞系COS7和NIH3T3细胞均在合适的培养基中进行单层培养，即对于HT1197、UMUC3、J82和HT1376使用含0.1mM必需氨基酸(Roche)、1mM丙酮酸钠(Roche)的EMEM(Sigma、St.Louis，MO)；对于SW780使用L-15；对于RT-4使用McCoy’s5a(sigma)；对于COS7和NIH3T3使用Dulbecco改进的Eagle培养基(Invitrogen、Carlsbad，CA)。各培养基中添加了10％胎牛血清(Cansera)和1％抗生素/抗真菌溶液(Sigma)。SW 780细胞在不含CO₂的湿润空气气氛中于37℃维持。其它细胞系在含5％CO₂的湿润空气气氛中于37℃维持。

外科切除的浸润性或浅表性膀胱癌组织样品以及它们的相应临床信息是在取得各患者书面知情同意后获得的。

(2)半定量RT-PCR分析

使用RNeasy微试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从培养细胞和临床组织提取总RNA。提取的RNA和正常人组织PolyA+RNA用DNase I(NipponGene、东京、日本)处理，然后使用寡聚(dT)引物和SuperScript II逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA)进行逆转录。半定量逆转录PCR(RT-PCR)实验使用以下MPHOSPH1特异性引物或作为内部标准的GAPDH特异性引物实施；即，

MPHOSPH1

5′-CCGGGAAAGTAAACTGACTCAC-3′(SEQ ID NO：3)和

5′-TTCTAGCTCCTCAACCAAATCCT-3′(SEQ ID NO：4)；以及GADH

5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′(SEQ ID NO：5)和

5′-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3′(SEQ ID NO：6)。

PCR反应中循环数经过最优化以保证对产物强度在扩增的线性范围内。

(3)Northern印迹分析

将由6个膀胱癌细胞系和8个正常人器官的mRNA组成的膀胱癌细胞印迹以及人多组织部印迹(Takara Clontech、Palo Alto，CA)与³²P标记的MPHOSPH1 cDNA进行了杂交。探针即MPHOSPH1 cDNA是使用引物5′-TGCTGGTTCAGAACGAACTATG-3′(SEQ ID NO：7)和5′-TCCTCGTGGCTAATGAAAGC-3′(SEQ ID NO：8)通过RT-PCR制备的。预杂交、杂交和清洗按厂商的推荐进行。印迹的放射自显影使用增感屏在-80℃进行14日。

(4)表达载体的构建

MPHOSPH1和PRC1的开放阅读框序列是使用KOD-Plus DNA聚合酶(东洋纺、大阪、日本)和以下引物通过PCR扩增的：

MPHOSPH1，正向：

5′-ATAAGAATGCGGCCGCAATGGAATCTAATTTTAATCAAGAGG-3′(SEQID NO：9)和

反向：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3′(SEQ IDNO：10)(下划线为NotI限制酶位点)；以及

PRC1，正向：

5’-CCGGAATTCTCCGCCATGAGGAGAAGTGA-3’(SEQ ID NO：11)(下划线部为EcoRI限制酶位点)和

反向：5’-TTGCCGCTCGAGGGACTGGATGTTGGTTGAA-3’(SEQ ID NO：12)(下划线部为XhoI限制酶位点)。

将MPHOSPH1和PRC1的PCR产物分别插入HA标签pCAGGS表达载体的NotI位点和FLAG标签pCAGGS的EcoRI和XhoI位点。通过DNA序列测定确证了这些构建体的DNA序列。用于扩增截短的MPHOSPH1的序列的引物如下所示：

1182至1302

正向：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAAATCACACAGTTAACAAATAATTTGC-3’(SEQ ID NO：13)和

反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCACCTGAATGGTTCGCTGTTTCAT-3’(SEQ ID NO：14)；以及

1295至1465

正向：5’-CCGGAATTCATGAAACAGCGAACCATTCAG-3’(SEQ ID NO：15)

和

反向：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGTCAGTATTTCCATTTCATTCTGTT-3’(SEQ ID NO：16)；以及

1456至1662

正向：5’-CCGGAATTCATGAAGCAACAGAATGAAATGGAAATACT-3’(SEQ ID NO：17)和

反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTCTGGACGTATGGCAACCTTTT-3’(SEQ ID NO：18)；以及

1655至1725

正向：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTATGGAACAAAAGGTTGCCATACGTC-3’(SEQ ID NO：19)和

反向：

5’-ATAAGAATGCGGCCGCTGTGCTTCTACATTTGAGAGCTTTGA-3’(SEQID NO：20)；以及

1718至1780

正向：5’-CCGGAATTCATGTCAAAGCTCTCAAATGTAGAAGCA-3’(SEQ ID NO：21)和

反向：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTTGGCTGTTTTTGTTCGA-3’(SEQID NO：10)(下划线分为NotI或EcoRI限制酶位点)。

(5)抗MPHOSPH1特异性多克隆抗体

使用pET21载体(Novagen、Madison，WI)制备了下述质粒，所述质粒被设计成表达在C末端具有His标签表位的MPHOSPH1部分(第1612～1780位氨基酸)或PRC1部分(第234～360位氨基酸)。在大肠杆菌BL21codon-plus株(Stratagene、La Jolla，CA)中分别表达这些重组肽，使用Ni-NTA树脂琼脂糖(Qiagen)和TALON(Takara Clontech)按厂商的规程进行纯化。将纯化的重组蛋白接种于兔，按标准方法用亲和柱纯化了免疫血清。将亲和纯化的抗MPHOSPH1抗体和抗PRC1抗体用于下文所述的western印迹、免疫沉淀法和免疫细胞化学染色中。通过western印迹分析确认了这些抗体在UMUC3膀胱癌细胞中特异性识别内源性PHOSPH1。

(6)同步化和流式细胞术分析

转染24小时后，用阿非迪霉素(2μg/ml)进一步作用，使细胞停滞在G1期16个小时。通过用PBS(-)清洗5次解除细胞周期停滞。解除细胞周期停滞后，在所示的时间点回收细胞。为了进行FACS分析，将400μl等份的同步化的贴壁细胞和脱壁细胞混合，4℃用70％乙醇进行固定。用PBS(-)清洗后，将细胞与含RNase I 1mg的PBS 1ml一起在37℃温育30分钟。然后将细胞在含碘化丙锭(PI)50mg的PBS 1ml中进行染色。使用流式细胞仪(FACScalibur；Becton Dickinson、San Diego，CA)测定至少10000个细胞中细胞周期各阶段的部分的比例。为了进行免疫细胞化学分析，在所示时间点对同步化细胞进行固定，并如下述地进行了染色。

(7)免疫细胞化学分析

以1×10⁵个细胞每孔接种了UMUC3细胞。24小时后，使用含4％多聚甲醛(paraformaldehyde)的PBS固定细胞，并用含0.1％Triton X-100的PBS于室温处理2分钟以使细胞可通透。接下来，于4℃用含3％BSA的PBS覆盖细胞12小时，以阻断非特异性抗体结合位点。接着，再将细胞与用封闭液1∶100稀释的亲和纯化的抗MPHOSPH1特异性多克隆抗体一起温育。用PBS清洗后，将UMUC3细胞用1∶1000稀释的Alexa 488-偶联抗兔第二抗体(Molecular Probe)染色。用4′，6′-二脒基-2′-苯基吲哚二盐酸(DAPI)对细胞核进行了复染。在显微镜(Leica，Tokyo，Japan)下获取了荧光影像。

(8)免疫组织化学分析

从外科标本获得了常规石蜡包埋膀胱癌组织切片。为了研究临床材料中的MPHOSPH1蛋白表达，将组织切片脱石蜡后用高压灭菌器在高pH抗原修复溶液(DAKO)中于108℃处理15分钟进行抗原修复，然后用ENVISION+Kit/HRP(DakoCytomation，Glostrup，Denmark)进行染色。在封闭内源性过氧化物酶和蛋白质后，将这些切片与1∶80稀释的抗MPHOSPH1多克隆抗体一起温育。使用过氧化物酶标记抗兔免疫球蛋白(EnvisionKit，Dako Cytomation，Carpinteria，CA)进行了免疫检测。最后，将反应物用3，3’-二氨基联苯胺(Dako)显色，将细胞用苏木精进行复染。

(9)小分子干扰RNA测定

基于载体的RNA干扰(RNAi)系统——psiU6BX3.0是以前建立的，该系统被设计成在哺乳动物细胞中合成小分子干扰RNA(Shimokawa T et al.，Cancer Res 2003，63：6116-20)。通过将双链寡核苷酸克隆到psiU6BX载体中，制备了设计为表达siRNA的质粒。分别按厂商的推荐使用Lipofectamine2000(Invitrogen)或FuGENE6(Roche)，用siRNA表达载体转染了J82或UMUC3细胞。将转染细胞分别在0.6或1.0mg/ml遗传霉素(G418)存在下培养28日或21日，采用Giemsa染色分别测定了集落数。处理后28日或14日，采用MTT测定评价了细胞存活力。

为了确认MPHOSPH1蛋白表达的抑制，使用亲和纯化的抗MPHOSPH1特异性多克隆抗体进行了western印迹分析，并且按标准的规程进行了半定量RT-PCR。而且，使用特异性引物通过半定量RT-PCR确认了PRC1特异性siRNA的敲低效果。作为内部对照的GAPDH引物同前。PRC1特异性引物如下。5′-GTTTGTCCCTTGGCTCTCATC-3′(SEQ ID NO：22)和

5′-AGTCCACACTGGTAAGCTTTTGA-3′(SEQ ID NO：23)。RNAi用合成寡核苷酸的靶标序列如下。作为对照的EGFP：

5′-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3′(SEQ ID NO：24)；

siRNA-MPHOSPH1：5′-GTGAAGAAGTGCGACCGAA-3′(SEQ ID NO：25)；

siRNA-MPHOSPH1错配：5′-TTGTAGAAGTGCGACCGAG-3′(SEQ ID NO：26)；

siRNA-PRC1#1 5′-GGAAAGACTCATCAAAAGC-3′(SEQ ID NO：27)；

siRNA-PRC1#2 5′-GCATATCCGTCTGTCAGAAT-3′(SEQ ID NO：31)和

siRNA-PRC1#2错配 5′-TCATATCCCTCTGTAAGAT-3′(SEQ ID NO：35)。

(10)稳定表达MPHOSPH1的NIH3T3细胞的建立

使用FUGENE6，如上述地用MPHOSPH1表达载体或模拟载体转染NIH3T3细胞。将转染后的细胞在含0.9mg/ml遗传霉素(G418)(Invitrogen)的培养基中温育。采用有限稀释法对克隆的NIH3T3细胞进行了亚克隆。通过使用抗HA单克隆抗体的western印迹分析评价了HA标签MPHOSPH1的表达。最后，建立了数个克隆并命名为MPHOSPH1-NIH3T3。

为了研究体外的MPHOSPH1生长促进效果，接种了3种独立的MPHOSPH1-NIH3T3细胞和3种独立的模拟-NIH3T3细胞各5000个，在5日内每日通过MTT测定法测定了细胞数。

体内实验是按照机构指导方针(institutional guidelines)在动物设施内进行的。为了进一步研究MPHOSPH1对裸小鼠中肿瘤生长的效果，对于16只BALB/cA Jcl-nu小鼠(雌、7周龄)皮下注射NIH3T3-MPHOSPH1-#1、NIH3T3-MPHOSPH1-#3、NIH3T3-模拟-#1或NIH3T3-模拟-#3(5×10⁶个细胞)。在3周内，每3日对肿瘤进行测定，用以下公式估算其体积：0.5×(长径(longer diameter))×(短径(shorter diameter))²，如前所述。

(11)免疫沉淀法和western印迹

将细胞用裂解缓冲液(50mM Tris-HCL(pH8.0)、150mM NaCl、0.5％NP-40、蛋白酶抑制剂合剂组(Calbiochem、San Diego，CA))裂解。将相等量的总蛋白与大鼠抗HA抗体(Roche)或小鼠抗c-myc抗体(Sigma)2μg一起于4℃温育2小时。将免疫复合物与蛋白G Sepharose(Zymed Laboratories，SouthSan Francisco，CA)一起温育2小时，其后，用裂解缓冲液清洗。对于共沉淀的蛋白，用SDS-PAGE进行了分离。

将用SDS-PAGE分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，其后，与小鼠抗c-myc抗体(Sigma)或大鼠抗HA抗体(Roche)一起温育。接着，与HRP偶联的第二抗体一起温育，然后用ECLKit(Amersham Biosciences)使信号可视化。

(12)MPHOSPH1和PRC1对细胞生长的敲低效果

使用FuGENE6(Roche)，用下述质粒转染了UMUC3细胞，所述质粒被设计成表达si-EGFP(阴性对照)、si-MPHOSPH1或si-PRC1(参照上述的siRNA测定)，然后，在4日内考察细胞形态。转染后第4日，用Alexa594鬼笔环肽(Molecular probes)和DAPI对细胞进行了免疫细胞化学染色。在共聚焦显微镜(Leica，日本，东京)下获得了荧光影像。为了研究siRNA对MPHOSPH1表达的抑制效果，使用亲和纯化的抗MPHOSPH1抗体按标准规程进行了western印迹分析。

2.结果

(1)鉴定MPHOSPH1作为膀胱癌中的上调基因

为了鉴定可能适用于新治疗剂的靶标的分子，先前使用代表27,648个基因或EST的cDNA微阵列进行了26个浸润性膀胱癌的病例的全基因组表达模式分析(Takata R et al.，Clin Cancer Res April 1，2005，11(7)：2625-36)。

通过该分析，鉴定出了一组在所研究的大多数膀胱癌细胞中表达上调的基因。这其中，MPHOSPH1(M期磷蛋白1)基因在临床膀胱癌病例中与膀胱癌细胞系中(数据未给出)通过半定量RT-PCR分析确认都有上调(图1A)，而其表达在除睾丸外的任何被检查的正常器官中均未检出，因此，选择该基因用于进一步研究。随后的Northern印迹分析中证明，约7kb的MPHOSPH1基因转录物在测试的6个膀胱癌细胞系中全部上调，而在除睾丸外的被检查的正常器官中不表达(图1B、1C)。

然后，开发了针对MPHOSPH1的多克隆抗体以考察膀胱癌组织中该蛋白质的表达(参照“材料和方法”)。

利用亲和纯化的抗MPHOSPH1多克隆抗体进行的免疫组织化学分析，在被检的临床浸润性膀胱癌组织切片的膀胱癌细胞中显示阳性染色，但在被检的正常膀胱组织中未检出(图1D)。而且，在被检的初期阶段的膀胱癌中检出了MPHOSPH1的上调表达(图1D)，尽管MPHOSPH1的上调最初是通过浸润性膀胱癌表达模式分析而鉴定的，上述事实提示MPHOSPH1与膀胱癌的发生而不是进展相关。

(2)膀胱癌细胞中MPHOSPH1的细胞定位

为了进一步阐明MPHOSPH1基因的性质，通过使用抗MPHOSPH1抗体的免疫组织化学分析研究了膀胱癌细胞系UMUC3中的内源性MPHOSPH1的细胞定位。内源性MPHOSPH1在间期主要定位在细胞核，但在核膜消失后的M期细胞中见于整个细胞质。由于免疫细胞化学分析显示MPHOSPH1的表达图式依赖于细胞周期，因此用阿非迪霉素使UMUC3细胞同步化以研究细胞周期中不同点上的MPHOSPH1定位。如图2所示，内源性MPHOSPH1定位在前期、中期和早后期的细胞质。且该蛋白质于晚后期蓄集在细胞的中间区，最后于末期浓缩到收缩环。这些认识提示MPHOSPH1在细胞质分裂中的重要功能。

(3)MPHOSPH1的致癌活性

为了评价MPHOSPH1的致癌功能，在显示MPHOSPH1高表达水平的膀胱癌细胞系J82和UMUC3中，采用基于哺乳动物载体的RNA干扰(RNAi)技术，敲低了MPHOSPH1内源表达(参照“材料和方法”)。通过半定量RT-PCR和western印迹分析考察了MPHOSPH1表达水平，结果发现，与对照siRNA构建体(si-EGFP)相比，MPHOSPH1特异性siRNA(si-MPHOSPH1)显著抑制了该基因表达(图3A)。使用siRNA构建体进行的集落形成测定和MTT测定显示：MPHOSPH1特异性siRNA的导入抑制了J82和UMUC3细胞的生长(图3B、3C)。而且，构建了si-MPHOSPH1的含3个碱基替换的siRNA(si-MPHOSPH1错配、参照材料和方法)并进行实验，结果发现其其不具有对MPHOSPH1表达或膀胱癌细胞生长的抑制效果(图3A)。

为了进一步确认MPHOSPH1的生长促进效果，建立了稳定表达外源性MPHOSPH1的NIH3T3衍生细胞(NIH3T3-MPHOSPH1-1、2和3细胞)。在western印迹显示3个衍生克隆具有高水平的外源性MPHOSPH1蛋白(图4A)。其后的MTT测定显示：与转染了模拟质粒的细胞(NIH3T3模拟-1、2、3细胞)相比，3个衍生细胞系NIH3T3-MPHOSPH1-1、2、3生长快得多(图4B)，这暗示MPHOSPH1表达很可能提高细胞生长。然后，进行了FACS分析以考察表达外源性MPHOSPH1的NIH3T3衍生细胞是否加快细胞周期的运行。如图4C所示，NIH3T3-MPHOSPH1细胞的细胞周期运行在全部时间点，特别是G2/M期细胞(6小时)中，比NIH3T3-模拟细胞更快(MPHOSPH1：模拟＝35.71％：22.10％)。最终：NIH3T3-模拟细胞在12小时时基本上回到G0/G1期，而NIH3T3-MPHOSPH1细胞在12小时时经过G0/G1期移至了S期(图4C)。

为了考察MPHOSPH1的体内功能，通过皮下注射将NIH3T3-MPHOSPH1细胞或NIH3T3-模拟细胞移植到BALB/cA Jcl-nu小鼠(雌性，7周龄)中。与移植了NIH3T3-模拟(-#1或-#2)细胞的小鼠相比较，移植了NIH3T3-MPHOSPH1细胞(-#1或-#2)的全部12只小鼠，在裸小鼠中显著更迅速地形成了更大的肿瘤(图4D)。该认识显示了MPHOSPH1体内和体外在膀胱癌形成中的致癌功能。

(4)MPHOSPH1与PRC1的相互作用

为了进一步研究膀胱癌细胞中MPHOSPH1的功能，考察了与MPHOSPH1相互作用的蛋白质。搜寻的结果是鉴定了胞质分裂蛋白调控因子1(protein-regulating cytokinesis 1，PRC1)作为与MPHOSPH1相互作用的可能候选，因为已知该蛋白于晚后期或末期细胞中定位在中间体中或收缩环附近，并在中间区形成(midzone formation)和细胞质分裂中发挥功能。而且，已经报道PRC1与数个驱动蛋白家族蛋白质相互作用(Ban R et al.，J BiolChem 2004，279：16394-402；Kurasawa Y et al.，EMBO J 2004，23：3237-48；Zhu C&Jiang W，Proc Natl Acad Sci USA 2005，102：343-8；Gruneberg U et al.，J Cell Biol 2006，172：363-72)。

利用半定量RT-PCR进行的膀胱癌病例PRC1表达图式分析发现：在膀胱癌病例中PRC1与MPHOSPH1均上调(图5A)。然后，使用HA标签MPHOSPH1和FLAG标签PRC1共转染COS7细胞，进行了共免疫沉淀实验。在使用抗FLAG抗体或抗HA抗体时，发现HA标签MPHOSPH1与FLAG标签PRC1共沉淀，或者，也发现FLAG标签PRC1相反地与HA标签MPHOSPH1的共沉淀(图5B)，这显示了这2种蛋白的相互作用。随后的细胞免疫化学分析显示：在UMUC细胞的间期，外源性PRC1定位于被染色的纤维阵列丝(fiber array filament)，并且与内源性MPHOSPH1共定位(图5C)。

而且，观察到这些蛋白在M期、特别是晚后期中共定位，转移至纺锤体中间区，在中间区以一组狭长的微管束条的形式共定位。但是，令人感兴趣的是，2种蛋白质在末期细胞中的定位却是分离的。PRC1(红)如前述地定位在中间体的中央，而MPHOSPH1(绿)存在于微小管的正向末端(plus end)附近。该发现强烈地提示，除膀胱细胞末期外，MPHOSPH1在细胞周期期间都与PRC1相互作用。

(5)MPHOSPH1与PRC1的相互作用的鉴定

为了鉴定与PRC1相互作用的MPHOSPH1区域，使用一系列带HA标签的MPHOSPH1截短型与带FLAG标签的全长PRC1共转染COS7细胞，进行了共免疫沉淀实验(图6A)。使用抗FLAG或抗HA抗体进行的免疫印迹分析显示2个MPHOSPH1构建体(第1188-1456位和第1662-1718位的氨基酸)结合于PRC1，这提示：MPHOSPH1通过MPHOSPH1的茎柄(stalk)区域的C末端和尾部(tail)区域这2个结合区域与PRC1相互作用(图6B)。

(6)膀胱癌中PRC1特异性siRNA的生长抑制效果

为了进一步确认膀胱癌发生过程中PRC1的生物学作用，构建了PRC1特异性siRNA表达载体，用于考察过表达PRC1的膀胱癌细胞系J82和UMUC3中各构建体的敲低效果。在半定量RT-PCR中，si-PRC1#1与si-PRC1-#2显著地敲低了PRC1表达，而si-PRC1#1的包含3个碱基取代的si-PRC1错配构建体或阴性对照si-EGFP完全或者基本上未显示出敲低效果。将si-PRC1#1或si-PRC1#2导入J82和UMUC3细胞，结果集落数与细胞存活率显著减少，而对照siRNA和si-PRC1错配对集落形成与细胞存活力完全或基本上没有效果(图7A和7B)。这些发现提示PRC1在膀胱癌细胞的生长中具有重要功能。

而且，如图7C所示，实施了免疫细胞化学分析来考察癌细胞中MPHOSPH1和PRC1的敲低对细胞质分裂的效果。分别用MPHOSPH1或PRC1特异性siRNA表达载体转染UMUC3细胞，在转染后4天的时间内对细胞形态进行观察。令人感兴趣的是，在转染后第4天，在转染2种siRNA中的任一种的细胞中均观察到多核形成(图7C)。该发现提示，MPHOSPH1或PRC1的缺失导致细胞质分裂失败，结果形成多核细胞，最终诱导细胞死亡。

工业实用性

本发明涉及通过检测抑制MPHOSPH1蛋白与PRC1的结合的化合物来鉴定和筛选用于治疗和预防癌症特别是膀胱癌的作用剂的方法。根据本发明证明，通过敲低MPHOSPH1和PRC1，观察到细胞质分裂失败以及多核形成。因此，本筛选方法将会可望帮助开发膀胱癌治疗或预防的新治疗战略。

本说明书中报告的数据加深了对膀胱癌的整体认识，为鉴定用于治疗用药物和预防剂的分子靶标提供了线索。这种信息为更深入理解癌发生作出了贡献，为面向膀胱癌的治疗以及最终的预防的新战略的开发提供了指标。

本说明书提及的所有专利、专利申请和出版物皆以提述方式全文并入本说明书。

另外，尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但可理解的是上述说明书实际上是例示性和解释性的，意欲阐明本发明及其优选实施方案。通过常规的实验，本领域技术人员将容易地想到，可对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明并不意欲受到上述说明的限定，而由如下权利要求及其等同物限定。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司(ONCOTHERAPY SCIENCE，INC.)

<120>抑制MPHOSPH1与PRC1的结合的作用剂的筛选方法

<130ONC-A0615P

<150>US 60/840,124

<151>2006-08-25

<160>37

<170>Patent In vers ion 3.4

<210>1

<211>6319

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(73)..(5415)

<400>1

attgtttgaa tttgaaaacg gtaacatcgc agtgctgctc gcgggtctgg ctagtcaggc    60

gaagtttgca ga atg gaa tct aat ttt aat caa gag gga gta cct cga cca    111

              Met Glu Ser Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg Pro

              1               5                   10

tct tat gtt ttt agt gct gac cca att gca agg cct tca gaa ata aat    159

Ser Tyr Val Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg Pro Ser Glu Ile Asn

    15                  20                  25

ttc gat ggc att aag ctt gat ctg tct cat gaa ttt tcc tta gtt gct    207

Phe Asp Gly Ile Lys Leu Asp Leu Ser His Glu Phe Ser Leu Val Ala

30                  35                  40                  45

cca aat act gag gca aac agt ttc gaa tct aaa gat tat ctc cag gtt    255

Pro Asn Thr Glu Ala Asn Ser Phe Glu Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val

                50                  55                  60

tgt ctt cga ata aga cca ttt aca cag tca gaa aaa gaa ctt gag tct    303

Cys Leu Arg Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser Glu Lys Glu Leu Glu Ser

            65                  70                  75

gag ggc tgt gtg cat att ctg gat tca cag act gtt gtg ctg aaa gag    351

Glu Gly Cys Val His Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu Lys Glu

        80                  85                  90

cct caa tgc atc ctt ggt cgg tta agt gaa aaa agc tca ggg cag atg    399

Pro Gln Cys Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu Lys Ser Ser Gly Gln Met

    95                  100                 105

gca cag aaa ttc agt ttt tcc aag gtt ttt ggc cca gca act aca cag    447

Ala Gln Lys Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe Gly Pro Ala Thr Thr Gln

110                 115                 120                 125

aag gaa ttc ttt cag ggt tgc att atg caa cca gta aaa gac ctc ttg    495

Lys Glu Phe Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln Pro Val Lys Asp Leu Leu

                130                 135                 140

aaa gga cag agt cgt ctg att ttt act tac ggg cta acc aat tca gga    543

Lys Gly Gln Ser Arg Leu Ile Phe Thr Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Gly

            145                 150                 155

aaa aca tat aca ttt caa ggg aca gaa gaa aat att ggc att ctg cct    591

Lys Thr Tyr Thr Phe Gln Gly Thr Glu Glu Asn Ile Gly Ile Leu Pro

        160                 165                 170

cga act ttg aat gta tta ttt gat agt ctt caa gaa aga ctg tat aca    639

Arg Thr Leu Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Thr

    175                 180                 185

aag atg aac ctt aaa cca cat aga tcc aga gaa tac tta agg tta tca    687

Lys Met Asn Leu Lys Pro His Arg Ser Arg Glu Tyr Leu Arg Leu Ser

190                 195                 200                 205

tca gaa caa gag aaa gaa gaa att gct agc aaa agt gca ttg ctt cgg    735

Ser Glu Gln Glu Lys Glu Glu Ile Ala Ser Lys Ser Ala Leu Leu Arg

                210                 215                 220

caa att aaa gag gtt act gtg cat aat gat agt gat gat act ctt tat    783

Gln Ile Lys Glu Val Thr Val His Asn Asp Ser Asp Asp Thr Leu Tyr

            225                 230                 235

gga agt tta act aac tct ttg aat atc tca gag ttt gaa gaa tcc ata    831

Gly Ser Leu Thr Asn Ser Leu Asn Ile Ser Glu Phe Glu Glu Ser Ile

        240                 245                 250

aaa gat tat gaa caa gcc aac ttg aat atg gct aat agt ata aaa ttt    879

Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Asn Leu Asn Met Ala Asn Ser Ile Lys Phe

    255                 260                 265

tct gtg tgg gtt tct ttc ttt gaa att tac aat gaa tat att tat gac    927

Ser Val Trp Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp

270                 275                 280                 285

tta ttt gtt cct gta tca tct aaa ttc caa aag aga aag atg ctg cgc    975

Leu Phe Val Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln Lys Arg Lys Met Leu Arg

                290                 295                 300

ctt tcc caa gac gta aag ggc tat tct ttt ata aaa gat cta caa tgg    1023

Leu Ser Gln Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe Ile Lys Asp Leu Gln Trp

            305                 310                 315

att caa gta tct gat tcc aaa gaa gcc tat aga ctt tta aaa cta gga    1071

Ile Gln Val Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Lys Leu Gly

        320                 325                 330

ata aag cac cag agt gtt gcc ttc aca aaa ttg aat aat gct tcc agt    1119

Ile Lys His Gln Ser Val Ala Phe Thr Lys Leu Asn Asn Ala Ser Ser

    335                 340                 345

aga agt cac agc ata ttc act gtt aaa ata tta cag att gaa gat tct    1167

Arg Ser His Ser Ile Phe Thr Val Lys Ile Leu Gln Ile Glu Asp Ser

350                 355                 360                 365

gaa atg tct cgt gta att cga gtc agt gaa tta tct tta tgt gat ctt    1215

Glu Met Ser Arg Val Ile Arg Val Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu

                370                 375                 380

gct ggt tca gaa cga act atg aag aca cag aat gaa ggt gaa agg tta    1263

Ala Gly Ser Glu Arg Thr Met Lys Thr Gln Asn Glu Gly Glu Arg Leu

            385                 390                 395

aga gag act ggg aat atc aac act tct tta ttg act ctg gga aag tgt    1311

Arg Glu Thr Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu Leu Thr Leu Gly Lys Cys

        400                 405                 410

att aac gtc ttg aag aat agt gaa aag tca aag ttt caa cag cat gtg    1359

Ile Asn Val Leu Lys Asn Ser Glu Lys Ser Lys Phe Gln Gln His Val

    415                 420                 425

cct ttc cgg gaa agt aaa ctg act cac tat ttt caa agt ttt ttt aat    1407

Pro Phe Arg Glu Ser Lys Leu Thr His Tyr Phe Gln Ser Phe Phe Asn

430                 435                 440                 445

ggt aaa ggg aaa att tgt atg att gtc aat atc agc caa tgt tat tta    1455

Gly Lys Gly Lys Ile Cys Met Ile Val Asn Ile Ser Gln Cys Tyr Leu

                450                 455                 460

gcc tat gat gaa aca ctc aat gta ttg aag ttc tcc gcc att gca caa    1503

Ala Tyr Asp Glu Thr Leu Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Ile Ala Gln

            465                 470                 475

aaa gtt tgt gtc cca gac act tta aat tcc tct caa gag aaa tta ttt    1551

Lys Val Cys Val Pro Asp Thr Leu Asn Ser Ser Gln Glu Lys Leu Phe

        480                 485                 490

gga cct gtc aaa tct tct caa gat gta tca cta gac agt aat tca aac    1599

Gly Pro Val Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Asp Ser Asn Ser Asn

    495                 500                 505

agt aaa ata tta aat gta aaa aga gcc acc att tca tgg gaa aat agt    1647

Ser Lys Ile Leu Asn Val Lys Arg Ala Thr Ile Ser Trp Glu Asn Ser

510                 515                 520                 525

cta gaa gat ttg atg gaa gac gag gat ttg gtt gag gag cta gaa aac    1695

Leu Glu Asp Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu Val Glu Glu Leu Glu Asn

                530                 535                 540

gct gaa gaa act caa aat gtg gaa act aaa ctt ctt gat gaa gat cta    1743

Ala Glu Glu Thr Gln Asn Val Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Asp Leu

            545                 550                 555

gat aaa aca tta gag gaa aat aag gct ttc att agc cac gag gag aaa    1791

Asp Lys Thr Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys

        560                 565             570

aga aaa ctg ttg gac tta ata gaa gac ttg aaa aaa aaa ctg ata aat    1839

Arg Lys Leu Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu Lys Lys Lys Leu Ile Asn

    575                 580                 585

gaa aaa aag gaa aaa tta acc ttg gaa ttt aaa att cga gaa gaa gtt    1887

Glu Lys Lys Glu Lys Leu Thr Leu Glu Phe Lys Ile Arg Glu Glu Val

590                 595                 600                 605

aca cag gag ttt act cag tat tgg gct caa cgg gaa gct gac ttt aag    1935

Thr Gln Glu Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln Arg Glu Ala Asp Phe Lys

                610                 615                 620

gag act ctg ctt caa gaa cga gag ata tta gaa gaa aat gct gaa cgt    1983

Glu Thr Leu Leu Gln Glu Arg Glu Ile Leu Glu Glu Asn Ala Glu Arg

            625                 630                 635

cgt ttg gct atc ttc aag gat ttg gtt ggt aaa tgt gac act cga gaa    2031

Arg Leu Ala Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly Lys Cys Asp Thr Arg Glu

        640                 645                 650

gaa gca gcg aaa gac att tgt gcc aca aaa gtt gaa act gaa gaa gct    2079

Glu Ala Ala Lys Asp Ile Cys Ala Thr Lys Val Glu Thr Glu Glu Ala

    655                 660                 665

act gct tgt tta gaa cta aag ttt aat caa att aaa gct gaa tta gct    2127

Thr Ala Cys Leu Glu Leu Lys Phe Asn Gln Ile Lys Ala Glu Leu Ala

670                 675                 680                 685

aaa acc aaa gga gaa tta atc aaa acc aaa gaa gag tta aaa aag aga    2175

Lys Thr Lys Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys Glu Glu Leu Lys Lys Arg

                690                 695                 700

gaa aat gaa tca gat tca ttg att caa gag ctt gag aca tct aat aag    2223

Glu Asn Glu Ser Asp Ser Leu Ile Gln Glu Leu Glu Thr Ser Asn Lys

            705                 710                 715

aaa ata att aca cag aat caa aga att aaa gaa ttg ata aat ata att    2271

Lys Ile Ile Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys Glu Leu Ile Asn Ile Ile

        720                 725                 730

gat caa aaa gaa gat act atc aac gaa ttt cag aac cta aag tct cat    2319

Asp Gln Lys Glu Asp Thr Ile Asn Glu Phe Gln Asn Leu Lys Ser His

    735                 740                 745

atg gaa aac aca ttt aaa tgc aat gac aag gct gat aca tct tct tta    2367

Met Glu Asn Thr Phe Lys Cys Asn Asp Lys Ala Asp Thr Ser Ser Leu

750                 755                 760                 765

ata ata aac aat aaa ttg att tgt aat gaa aca gtt gaa gta cct aag    2415

Ile Ile Asn Asn Lys Leu Ile Cys Asn Glu Thr Val Glu Val Pro Lys

                770                 775                 780

gac agc aaa tct aaa atc tgt tca gaa aga aaa aga gta aat gaa aat    2463

Asp Ser Lys Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys Arg Val Asn Glu Asn

            785                 790                 795

gaa ctt cag caa gat gaa cca cca gca aag aaa ggg tct atc cat gtt    2511

Glu Leu Gln Gln Asp Glu Pro Pro Ala Lys Lys Gly Ser Ile His Val

        800                 805             810

agt tca gct atc act gaa gac caa aag aaa agt gaa gaa gtg cga ccg    2559

Ser Ser Ala Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys Ser Glu Glu Val Arg Pro

    815                 820                 825

aac att gca gaa att gaa gac atc aga gtt tta caa gaa aat aat gaa    2607

Asn Ile Ala Glu Ile Glu Asp Ile Arg Val Leu Gln Glu Asn Asn Glu

830                 835                 840                 845

gga ctg aga gca ttt tta ctc act att gag aat gaa ctt aaa aat gaa    2655

Gly Leu Arg Ala Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn Glu Leu Lys Asn Glu

                850                 855                 860

aag gaa gaa aaa gca gaa tta aat aaa cag att gtt cat ttt cag cag    2703

Lys Glu Glu Lys Ala Glu Leu Asn Lys Gln Ile Val His Phe Gln Gln

            865                 870                 875

gaa ctt tct ctt tct gaa aaa aag aat tta act tta agt aaa gag gtc    2751

Glu Leu Ser Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr Leu Ser Lys Glu Val

    880                     885                 890

caa caa att cag tca aat tat gat att gca att gct gaa tta cat gtg    2799

Gln Gln Ile Gln Ser Asn Tyr Asp Ile Ala Ile Ala Glu Leu His Val

    895                 900                 905

cag aaa agt aaa aat caa gaa cag gag gaa aag atc atg aaa ttg tca    2847

Gln Lys Ser Lys Asn Gln Glu Gln Glu Glu Lys Ile Met Lys Leu Ser

910                 915                 920                 925

aat gag ata gaa act gct aca aga agc att aca aat aat gtt tca caa    2895

Asn Glu Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ser Ile Thr Asn Asn Val Ser Gln

                930                 935                 940

ata aaa tta atg cac acg aaa ata gac gaa cta cgt act ctt gat tca    2943

Ile Lys Leu Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu Arg Thr Leu Asp Ser

            945                 950                 955

gtt tct cag att tca aac ata gat ttg ctc aat ctc agg gat ctg tca    2991

Val Ser Gln Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn Leu Arg Asp Leu Ser

        960                 965                 970

aat ggt tct gag gag gat aat ttg cca aat aca cag tta gac ctt tta    3039

Asn Gly Ser Glu Glu Asp Asn Leu Pro Asn Thr Gln Leu Asp Leu Leu

    975                 980                 985

ggt aat gat tat ttg gta agt aag caa gtt aaa  gaa tat cga att caa    3087

Gly Asn Asp Tyr Leu Val Ser Lys Gln Val Lys  Glu Tyr Arg Ile Gln

990                 995                 1000                 1005

gaa ccc aat agg gaa  aat tct ttc cac tct  agt att gaa gct att        3132

Glu Pro Asn Arg Glu  Asn Ser Phe His Ser  Ser Ile Glu Ala Ile

                1010                1015                  1020

tgg gaa gaa tgt aaa  gag att gtg aag gcc  tct tcc aaa aaa agt    3177

Trp Glu Glu Cys Lys  Glu Ile Val Lys Ala  Ser Ser Lys Lys Ser

                1025                 1030                 1035

cat cag att gag gaa  ctg gaa caa caa att  gaa aaa ttg cag gca    3222

His Gln Ile Glu Glu  Leu Glu Gln Gln Ile  Glu Lys Leu Gln Ala

                1040                 1045                 1050

gaa gta aaa ggc tat  aag gat gaa aac aat  aga cta aag gag aag    3267

Glu Val Lys Gly Tyr  Lys Asp Glu Asn Asn  Arg Leu Lys Glu Lys

                1055                 1060                 1065

gag cat aaa aac caa  gat gac cta cta aaa  gaa aaa gaa act ctt    3312

Glu His Lys Asn Gln  Asp Asp Leu Leu Lys  Glu Lys Glu Thr Leu

                1070                 1075                 1080

ata cag cag ctg aaa  gaa gaa ttg caa gaa  aaa aat gtt act ctt    3357

Ile Gln Gln Leu Lys  Glu Glu Leu Gln Glu  Lys Asn Val Thr Leu

                1085                 1090                 1095

gat gtt caa ata cag  cat gta gtt gaa gga  aag aga gcg ctt tca    3402

Asp Val Gln Ile Gln  His Val Val Glu Gly  Lys Arg Ala Leu Ser

                1100                 1105                 1110

gaa ctt aca caa ggt  gtt act tgc tat aag  gca aaa ata aag gaa    3447

Glu Leu Thr Gln Gly  Val Thr Cys Tyr Lys  Ala Lys Ile Lys Glu

                1115                 1120                 1125

ctt gaa aca att tta  gag act cag aaa gtt  gaa tgt agt cat tca    3492

Leu Glu Thr Ile Leu  Glu Thr Gln Lys Val  Glu Cys Ser His Ser

                1130                 1135                 1140

gcc aag tta gaa caa  gac att ttg gaa aag  gaa tct atc atc tta    3537

Ala Lys Leu Glu Gln  Asp Ile Leu Glu Lys  Glu Ser Ile Ile Leu

                1145                 1150                 1155

aag cta gaa aga aat  ttg aag gaa ttt caa  gaa cat ctt cag gat    3582

Lys Leu Glu Arg Asn  Leu Lys Glu Phe Gln  Glu His Leu Gln Asp

                1160                 1165                 1170

tct gtc aaa aac acc  aaa gat tta aat gta  aag gaa ctc aag ctg    3627

Ser Val Lys Asn Thr  Lys Asp Leu Asn Val  Lys Glu Leu Lys Leu

                1175                 1180                 1185

aaa gaa gaa atc aca  cag tta aca aat aat  ttg caa gat atg aaa    3672

Lys Glu Glu Ile Thr  Gln Leu Thr Asn Asn  Leu Gln Asp Met Lys

                1190                 1195                 1200

cat tta ctt caa tta  aaa gaa gaa gaa gaa  gaa acc aac agg caa    3717

His Leu Leu Gln Leu  Lys Glu Glu Glu Glu  Glu Thr Asn Arg Gln

                1205                 1210                 1215

gaa aca gaa aaa ttg  aaa gag gaa ctc tct  gca agc tct gct cgt    3762

Glu Thr Glu Lys Leu  Lys Glu Glu Leu Ser  Ala Ser Ser Ala Arg

                1220                 1225                 1230

acc cag aat ctg aaa  gca gat ctt cag agg  aag gaa gaa gat tat    3807

Thr Gln Asn Leu Lys  Ala Asp Leu Gln Arg  Lys Glu Glu Asp Tyr

                1235                 1240                 1245

gct gac ctg aaa gag  aaa ctg act gat gcc  aaa aag cag att aag    3852

Ala Asp Leu Lys Glu  Lys Leu Thr Asp Ala  Lys Lys Gln Ile Lys

                1250                 1255                 1260

caa gta cag aaa gag  gta tct gta atg cgt  gat gag gat aaa tta    3897

Gln Val Gln Lys Glu  Val Ser Val Met Arg  Asp Glu Asp Lys Leu

                1265                 1270                 1275

ctg agg att aaa att  aat gaa ctg gag aaa  aag aaa aac cag tgt    3942

Leu Arg Ile Lys Ile  Asn Glu Leu Glu Lys  Lys Lys Asn Gln Cys

                1280                 1285                 1290

tct cag gaa tta gat  atg aaa cag cga acc  att cag caa ctc aag    3987

Ser Gln Glu Leu Asp  Met Lys Gln Arg Thr  Ile Gln Gln Leu Lys

                1295                 1300                 1305

gag cag tta aat aat  cag aaa gtg gaa gaa  gct ata caa cag tat    4032

Glu Gln Leu Asn Asn  Gln Lys Val Glu Glu  Ala Ile Gln Gln Tyr

                1310                 1315                 1320

gag aga gca tgc aaa  gat cta aat gtt aaa  gag aaa ata att gaa    4077

Glu Arg Ala Cys Lys  Asp Leu Asn Val Lys  Glu Lys Ile Ile Glu

                1325                 1330                 1335

gac atg cga atg aca  cta gaa gaa cag gaa  caa act cag gta gaa    4122

Asp Met Arg Met Thr  Leu Glu Glu Gln Glu  Gln Thr Gln Val Glu

                1340                 1345                 1350

cag gat caa gtg ctt  gag gct aaa tta gag  gaa gtt gaa agg ctg    4167

Gln Asp Gln Val Leu  Glu Ala Lys Leu Glu  Glu Val Glu Arg Leu

                1355                 1360                 1365

gcc aca gaa ttg gaa  aaa tgg aag gaa aaa  tgc aat gat ttg gaa    4212

Ala Thr Glu Leu Glu  Lys Trp Lys Glu Lys  Cys Asn Asp Leu Glu

                1370                 1375                 1380

acc aaa aac aat caa  agg tca aat aaa gaa  cat gag aac aac aca    4257

Thr Lys Asn Asn Gln  Arg Ser Asn Lys Glu  His Glu Asn Asn Thr

                1385                 1390                 1395

gat gtg ctt gga aag  ctc act aat ctt caa  gat gag tta cag gag    4302

Asp Val Leu Gly Lys  Leu Thr Asn Leu Gln  Asp Glu Leu Gln Glu

                1400                 1405                 1410

tct gaa cag aaa tat  aat gct gat aga aag  aaa tgg tta gaa gaa    4347

Ser Glu Gln Lys Tyr  Asn Ala Asp Arg Lys  Lys Trp Leu Glu Glu

                1415                 1420                 1425

aaa atg atg ctt atc  act caa gcg aaa gaa  gca gag aat ata cga    4392

Lys Met Met Leu Ile  Thr Gln Ala Lys Glu  Ala Glu Asn Ile Arg

                1430                 1435                 1440

aat aaa gag atg aaa  aaa tat gct gag gac  agg gag cgt ttt ttt    4437

Asn Lys Glu Met Lys  Lys Tyr Ala Glu Asp  Arg Glu Arg Phe Phe

                1445                 1450                 1455

aag caa cag aat gaa  atg gaa ata ctg aca  gcc cag ctg aca gag    4482

Lys Gln Gln Asn Glu  Met Glu Ile Leu Thr  Ala Gln Leu Thr Glu

                1460                 1465                 1470

aaa gat agt gac ctt  caa aag tgg cga gaa  gaa cga gat caa ctg    4527

Lys Asp Ser Asp Leu  Gln Lys Trp Arg Glu  Glu Arg Asp Gln Leu

                1475                 1480                 1485

gtt gca gct tta gaa  ata cag cta aaa gca  ctg ata tcc agt aat    4572

Val Ala Ala Leu Glu  Ile Gln Leu Lys Ala  Leu Ile Ser Ser Asn

                1490                 1495                 1500

gta cag aaa gat aat  gaa att gaa caa cta  aaa agg atc ata tca    4617

Val Gln Lys Asp Asn  Glu Ile Glu Gln Leu  Lys Arg Ile Ile Ser

                1505                 1510                 1515

gag act tct aaa ata  gaa aca caa atc atg  gat atc aag ccc aaa    4662

Glu Thr Ser Lys Ile  Glu Thr Gln Ile Met  Asp Ile Lys Pro Lys

                1520                 1525                 1530

cgt att agt tca gca  gat cct gac aaa ctt  caa act gaa cct cta    4707

Arg Ile Ser Ser Ala  Asp Pro Asp Lys Leu  Gln Thr Glu Pro Leu

                1535                 1540                 1545

tcg aca agt ttt gaa  att tcc aga aat aaa  ata gag gat gga tct    4752

Ser Thr Ser Phe Glu  Ile Ser Arg Asn Lys  Ile Glu Asp Gly Ser

                1550                 1555                 1560

gta gtc ctt gac tct  tgt gaa gtg tca aca  gaa aat gat caa agc    4797

Val Val Leu Asp Ser  Cys Glu Val Ser Thr  Glu Asn Asp Gln Ser

                1565                 1570                 1575

act cga ttt cca aaa  cct gag tta gag att  caa ttt aca cct tta    4842

Thr Arg Phe Pro Lys  Pro Glu Leu Glu Ile  Gln Phe Thr Pro Leu

                1580                 1585                 1590

cag cca aac aaa atg  gca gtg aaa cac cct  ggt tgt acc aca cca    4887

Gln Pro Asn Lys Met  Ala Val Lys His Pro  Gly Cys Thr Thr Pro

                1595                 1600                 1605

gtg aca gtt aag att  ccc aag gct cgg aag  agg aag agt aat gaa    4932

Val Thr Val Lys Ile  Pro Lys Ala Arg Lys  Arg Lys Ser Asn Glu

                1610                 1615                 1620

atg gag gag gac ttg  gtg aaa tgt gaa aat  aag aag aat gct aca    4977

Met Glu Glu Asp Leu  Val Lys Cys Glu Asn  Lys Lys Asn Ala Thr

                1625                 1630                 1635

ccc aga act aat ttg  aaa ttt cct att tca  gat gat aga aat tct    5022

Pro Arg Thr Asn Leu  Lys Phe Pro Ile Ser  Asp Asp Arg Asn Ser

                1640                 1645                 1650

tct gtc aaa aag gaa  caa aag gtt gcc ata  cgt cca tca tct aag    5067

Ser Val Lys Lys Glu  Gln Lys Val Ala Ile  Arg Pro Ser Ser Lys

                1655                 1660                 1665

aaa aca tat tct tta  cgg agt cag gca tcc  ata att ggt gta aac    5112

Lys Thr Tyr Ser Leu  Arg Ser Gln Ala Ser  Ile Ile Gly Val Asn

                1670                 1675                 1680

ctg gcc act aag aaa  aaa gaa gga aca cta  cag aaa ttt gga gac    5157

Leu Ala Thr Lys Lys  Lys Glu Gly Thr Leu  Gln Lys Phe Gly Asp

                1685                 1690                 1695

ttc tta caa cat tct  ccc tca att ctt caa  tca aaa gca aag aag    5202

Phe Leu Gln His Ser  Pro Ser Ile Leu Gln  Ser Lys Ala Lys Lys

                1700                 1705                 1710

ata att gaa aca atg  agc tct tca aag ctc  tca aat gta gaa gca    5247

Ile Ile Glu Thr Met  Ser Ser Ser Lys Leu  Ser Asn Val Glu Ala

                1715                 1720                 1725

agt aaa gaa aat gtg  tct caa cca aaa cga  gcc aaa cgg aaa tta    5292

Ser Lys Glu Asn Val  Ser Gln Pro Lys Arg  Ala Lys Arg Lys Leu

                1730                 1735                 1740

tac aca agt gaa att  tca tct cct att gat  ata tca ggc caa gtg    5337

Tyr Thr Ser Glu Ile  Ser Ser Pro Ile Asp  Ile Ser Gly Gln Val

                1745                 1750                 1755

att tta atg gac cag  aaa atg aag gag agt  gat cac cag att atc    5382

Ile Leu Met Asp Gln  Lys Met Lys Glu Ser  Asp His Gln Ile Ile

                1760                 1765                 1770

aaa cga cga ctt cga  aca aaa aca gcc aaa  taa atcacttatg    5425

Lys Arg Arg Leu Arg  Thr Lys Thr Ala Lys

                1775                 1780

gaaatgttta atataaattt tatagtcata gtcattggaa cttgcatcct gtattgtaaa    5485

tataaatgta tatattatgc attaaatcac tctgcatata gattgctgtt ttatacatag    5545

tataatttta attcaataaa tgagtcaaaa tttgtatatt tttataaggc ttttttataa    5605

tagcttcttt caaactgtat ttccctatta tctcagacat tggatcagtg aagatcctag    5665

gaaagaggct gttattctca tttattttgc tatacaggat gtaataggtc aggtatttgg    5725

tttacttata tttaacaatg tcttatgaat tttttttact ttatctgtta tacaactgat    5785

tttacatatc tgtttggatt atagctagga tttggagaat aagtgtgtac agatcacaaa    5845

acatgtatat acattattta gaaaagatct caagtcttta attagaatgt ctcacttatt    5905

ttgtaaacat tttgtgggta catagtacat gtatatattt acggggtatg tgagatgttt    5965

tgacacaggc atgcaatgtg aaatacgtgt atcatggaga atgaggtatc catcccctca    6025

agcatttttc ctttgaatta cagataatcc aattacattc tttagatcat ttaaaaatat    6085

acaagtaagt tattattgat tatagtcact ctattgtgct atcagatagt agatcattct    6145

ttttatctta tttgtttttg tacccattaa ccatccccac ctccccctgc aaccgtcagt    6205

acccttacca gccactggta accattcttc tactctgtat gcccatgagg tcaattgatt    6265

ttatttttag atcccataaa taaatgagaa catgcagtct ttgtcaaaaa aaaa          6319

<210>2

<211>1780

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>2

Met Glu Ser Asn Phe Asn Gln Glu Gly Val Pro Arg Pro Ser Tyr Val

1               5                   10                  15

Phe Ser Ala Asp Pro Ile Ala Arg Pro Ser Glu Ile Asn Phe Asp Gly

            20                  25                  30

Ile Lys Leu Asp Leu Ser His Glu Phe Ser Leu Val Ala Pro Asn Thr

        35                  40                  45

Glu Ala Asn Ser Phe Glu Ser Lys Asp Tyr Leu Gln Val Cys Leu Arg

    50                  55                  60

Ile Arg Pro Phe Thr Gln Ser Glu Lys Glu Leu Glu Ser Glu Gly Cys

65                  70                  75                  80

Val His Ile Leu Asp Ser Gln Thr Val Val Leu Lys Glu Pro Gln Cys

                85                  90                  95

Ile Leu Gly Arg Leu Ser Glu Lys Ser Ser Gly Gln Met Ala Gln Lys

            100                 105                 110

Phe Ser Phe Ser Lys Val Phe Gly Pro Ala Thr Thr Gln Lys Glu Phe

        115                 120                 125

Phe Gln Gly Cys Ile Met Gln Pro Val Lys Asp Leu Leu Lys Gly Gln

    130                 135                 140

Ser Arg Leu Ile Phe Thr Tyr Gly Leu Thr Asn Ser Gly Lys Thr Tyr

145                 150                 155                 160

Thr Phe Gln Gly Thr Glu Glu Asn Ile Gly Ile Leu Pro Arg Thr Leu

                165                 170                 175

Asn Val Leu Phe Asp Ser Leu Gln Glu Arg Leu Tyr Thr Lys Met Asn

            180                 185                 190

Leu Lys Pro His Arg Ser Arg Glu Tyr Leu Arg Leu Ser Ser Glu Gln

        195                 200                 205

Glu Lys Glu Glu Ile Ala Ser Lys Ser Ala Leu Leu Arg Gln Ile Lys

    210                 215                 220

Glu Val Thr Val His Asn Asp Ser Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Leu

225                 230                 235                 240

Thr Asn Ser Leu Asn Ile Ser Glu Phe Glu Glu Ser Ile Lys Asp Tyr

                245                 250                 255

Glu Gln Ala Asn Leu Asn Met Ala Asn Ser Ile Lys Phe Ser Val Trp

            260                 265                 270

Val Ser Phe Phe Glu Ile Tyr Asn Glu Tyr Ile Tyr Asp Leu Phe Val

        275                 280                 285

Pro Val Ser Ser Lys Phe Gln Lys Arg Lys Met Leu Arg Leu Ser Gln

    290                 295                 300

Asp Val Lys Gly Tyr Ser Phe Ile Lys Asp Leu Gln Trp Ile Gln Val

305                 310                 315                 320

Ser Asp Ser Lys Glu Ala Tyr Arg Leu Leu Lys Leu Gly Ile Lys His

                325                 330                 335

Gln Ser Val Ala Phe Thr Lys Leu Asn Asn Ala Ser Ser Arg Ser His

            340                 345                 350

Ser Ile Phe Thr Val Lys Ile Leu Gln Ile Glu Asp Ser Glu Met Ser

        355                 360                 365

Arg Val Ile Arg Val Ser Glu Leu Ser Leu Cys Asp Leu Ala Gly Ser

    370                 375                 380

Glu Arg Thr Met Lys Thr Gln Asn Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Thr

385                 390                 395                 400

Gly Asn Ile Asn Thr Ser Leu Leu Thr Leu Gly Lys Cys Ile Asn Val

                405                 410                 415

Leu Lys Asn Ser Glu Lys Ser Lys Phe Gln Gln His Val Pro Phe Arg

            420                 425                 430

Glu Ser Lys Leu Thr His Tyr Phe Gln Ser Phe Phe Asn Gly Lys Gly

        435                 440                 445

Lys Ile Cys Met Ile Val Asn Ile Ser Gln Cys Tyr Leu Ala Tyr Asp

    450                 455                 460

Glu Thr Leu Asn Val Leu Lys Phe Ser Ala Ile Ala Gln Lys Val Cys

465                 470                 475                 480

Val Pro Asp Thr Leu Asn Ser Ser Gln Glu Lys Leu Phe Gly Pro Val

                485                 490                 495

Lys Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Asp Ser Asn Ser Asn Ser Lys Ile

            500                 505                 510

Leu Asn Val Lys Arg Ala Thr Ile Ser Trp Glu Asn Ser Leu Glu Asp

        515                 520                 525

Leu Met Glu Asp Glu Asp Leu Val Glu Glu Leu Glu Asn Ala Glu Glu

    530                 535                 540

Thr Gln Asn Val Glu Thr Lys Leu Leu Asp Glu Asp Leu Asp Lys Thr

545                 550                 555                 560

Leu Glu Glu Asn Lys Ala Phe Ile Ser His Glu Glu Lys Arg Lys Leu

                565                 570                 575

Leu Asp Leu Ile Glu Asp Leu Lys Lys Lys Leu Ile Asn Glu Lys Lys

            580                 585                 590

Glu Lys Leu Thr Leu Glu Phe Lys Ile Arg Glu Glu Val Thr Gln Glu

        595                 600                 605

Phe Thr Gln Tyr Trp Ala Gln Arg Glu Ala Asp Phe Lys Glu Thr Leu

    610                 615                 620

Leu Gln Glu Arg Glu Ile Leu Glu Glu Asn Ala Glu Arg Arg Leu Ala

625                 630                 635                 640

Ile Phe Lys Asp Leu Val Gly Lys Cys Asp Thr Arg Glu Glu Ala Ala

                645                 650                 655

Lys Asp Ile Cys Ala Thr Lys Val Glu Thr Glu Glu Ala Thr Ala Cys

            660                 665                 670

Leu Glu Leu Lys Phe Asn Gln Ile Lys Ala Glu Leu Ala Lys Thr Lys

        675                 680                 685

Gly Glu Leu Ile Lys Thr Lys Glu Glu Leu Lys Lys Arg Glu Asn Glu

    690                 695                 700

Ser Asp Ser Leu Ile Gln Glu Leu Glu Thr Ser Asn Lys Lys Ile Ile

705                 710                 715                 720

Thr Gln Asn Gln Arg Ile Lys Glu Leu Ile Asn Ile Ile Asp Gln Lys

                725                 730                 735

Glu Asp Thr Ile Asn Glu Phe Gln Asn Leu Lys Ser His Met Glu Asn

            740                 745                 750

Thr Phe Lys Cys Asn Asp Lys Ala Asp Thr Ser Ser Leu Ile Ile Asn

        755                 760                 765

Asn Lys Leu Ile Cys Asn Glu Thr Val Glu Val Pro Lys Asp Ser Lys

    770                 775                 780

Ser Lys Ile Cys Ser Glu Arg Lys Arg Val Asn Glu Asn Glu Leu Gln

785                 790                 795                 800

Gln Asp Glu Pro Pro Ala Lys Lys Gly Ser Ile His Val Ser Ser Ala

                805                 810                 815

Ile Thr Glu Asp Gln Lys Lys Ser Glu Glu Val Arg Pro Asn Ile Ala

            820                 825                 830

Glu Ile Glu Asp Ile Arg Val Leu Gln Glu Asn Asn Glu Gly Leu Arg

        835                 840                 845

Ala Phe Leu Leu Thr Ile Glu Asn Glu Leu Lys Asn Glu Lys Glu Glu

    850                 855                 860

Lys Ala Glu Leu Asn Lys Gln Ile Val His Phe Gln Gln Glu Leu Ser

865                 870                 875                 880

Leu Ser Glu Lys Lys Asn Leu Thr Leu Ser Lys Glu Val Gln Gln Ile

                885                 890                 895

Gln Ser Asn Tyr Asp Ile Ala Ile Ala Glu Leu His Val Gln Lys Ser

            900                 905                 910

Lys Asn Gln Glu Gln Glu Glu Lys Ile Met Lys Leu Ser Asn Glu Ile

        915                 920                 925

Glu Thr Ala Thr Arg Ser Ile Thr Asn Asn Val Ser Gln Ile Lys Leu

    930                 935                 940

Met His Thr Lys Ile Asp Glu Leu Arg Thr Leu Asp Ser Val Ser Gln

945                 950                 955                 960

Ile Ser Asn Ile Asp Leu Leu Asn Leu Arg Asp Leu Ser Asn Gly Ser

                965                 970                 975

Glu Glu Asp Asn Leu Pro Asn Thr Gln Leu Asp Leu Leu Gly Asn Asp

            980                 985                 990

Tyr Leu Val Ser Lys Gln Val Lys  Glu Tyr Arg Ile Gln  Glu Pro Asn

        995                 1000                 1005

Arg Glu  Asn Ser Phe His Ser  Ser Ile Glu Ala Ile  Trp Glu Glu

    1010                 1015                 1020

Cys Lys  Glu Ile Val Lys Ala  Ser Ser Lys Lys Ser  His Gln Ile

    1025                 1030                 1035

Glu Glu  Leu Glu Gln Gln Ile  Glu Lys Leu Gln Ala  Glu Val Lys

    1040                 1045                 1050

Gly Tyr  Lys Asp Glu Asn Asn  Arg Leu Lys Glu Lys  Glu His Lys

    1055                 1060                 1065

Asn Gln  Asp Asp Leu Leu Lys  Glu Lys Glu Thr Leu  Ile Gln Gln

    1070                 1075                 1080

Leu Lys  Glu Glu Leu Gln Glu  Lys Asn Val Thr Leu  Asp Val Gln

    1085                 1090                 1095

Ile Gln  Hi s Val Val Glu Gly  Lys Arg Ala Leu Ser  Glu Leu Thr

    1100                 1105                 1110

Gln Gly  Val Thr Cys Tyr Lys  Ala Lys Ile Lys Glu  Leu Glu Thr

    1115                 1120                 1125

Ile Leu  Glu Thr Gln Lys Val  Glu Cys Ser His Ser  Ala Lys Leu

    1130                 1135                 1140

Glu Gln  Asp Ile Leu Glu Lys  Glu Ser Ile Ile Leu  Lys Leu Glu

    1145                 1150                 1155

Arg Asn  Leu Ly s Glu Phe Gln  Glu His Leu Gln Asp  Ser Val Lys

    1160                 1165                 1170

Asn Thr  Lys Asp Leu Asn Val  Lys Glu Leu Lys Leu  Lys Glu Glu

    1175                 1180                 1185

Ile Thr  Gln Leu Thr Asn Asn  Leu Gln Asp Met Lys  His Leu Leu

    1190                 1195                 1200

Gln Leu  Lys Glu Glu Glu Glu  Glu Thr Asn Arg Gln  Glu Thr Glu

    1205                 1210                 1215

Lys Leu  Lys Glu Glu Leu Ser  Ala Ser Ser Ala Arg  Thr Gln Asn

    1220                 1225                 1230

Leu Lys  Ala Asp Leu Gln Arg  Lys Glu Glu Asp Tyr  Ala Asp Leu

    1235                 1240                 1245

Lys Glu  Lys Leu Thr Asp Ala  Lys Lys Gln Ile Lys  Gln Val Gln

    1250                 1255                 1260

Lys Glu  Val Ser Val Met Arg  Asp Glu Asp Lys Leu  Leu Arg Ile

    1265                 1270                 1275

Lys Ile  Asn Glu Leu Glu Lys  Lys Ly s Asn Gln Cys  Ser Gln Glu

    1280                 1285                 1290

Leu Asp  Met Lys Gln Arg Thr  Ile Gln Gln Leu Lys  Glu Gln Leu

    1295                 1300                 1305

Asn Asn  Gln Lys Val Glu Glu  Ala Ile Gln Gln Tyr  Glu Arg Ala

    1310                 1315                 1320

Cys Lys  Asp Leu Asn Val Lys  Glu Lys Ile Ile Glu  Asp Met Arg

    1325                 1330                 1335

Met Thr  Leu Glu Glu Gln Glu  Gln Thr Gln Val Glu  Gln Asp Gln

    1340                 1345                 1350

Val Leu  Glu Ala Lys Leu Glu  Glu Val Glu Arg Leu  Ala Thr Glu

    1355                 1360                 1365

Leu Glu  Lys Trp Lys Glu Lys  Cys A sn Asp Leu Glu  Thr Lys Asn

    1370                 1375                 1380

Asn Gln  Arg Ser Asn Lys Glu  His Glu Asn Asn Thr  Asp Val Leu

    1385                 1390                 1395

Gly Lys  Leu Thr Asn Leu Gln  Asp Glu Leu Gln Glu  Ser Glu Gln

    1400                 1405                 1410

Lys Tyr  Asn Ala Asp Arg Lys  Lys Trp Leu Glu Glu  Lys Met Met

    1415                 1420                 1425

Leu Ile  Thr Gln Ala Lys Glu  Ala Glu Asn Ile Arg  Asn Lys Glu

    1430                 1435                 1440

Met Lys  Lys Tyr Ala Glu Asp  Arg Glu Arg Phe Phe  Lys Gln Gln

    1445                 1450                 1455

Asn Glu  Met Glu Ile Leu Thr  Ala Gln Leu Th r Glu  Lys Asp Ser

    1460                 1465                 1470

Asp Leu  Gln Lys Trp Arg Glu  Glu Arg Asp Gln Leu  Val Ala Ala

    1475                 1480                 1485

Leu Glu  Ile Gln Leu Lys Ala  Leu Ile Ser Ser Asn  Val Gln Lys

    1490                 1495                 1500

Asp Asn  Glu Ile Glu Gln Leu  Lys Arg Ile Ile Ser  Glu Thr Ser

    1505                 1510                 1515

Lys Ile  Glu Thr Gln Ile Met  Asp Ile Lys Pro Lys  Arg Ile Ser

    1520                 1525                 1530

Ser Ala  Asp Pro Asp Lys Leu  Gln Thr Glu Pro Leu  Ser Thr Ser

    1535                 1540                 1545

Phe Glu  Ile Ser Arg Asn Lys    Ile Glu Asp Gly Ser  Val Val Leu

    1550                 1555                 1560

Asp Ser  Cys Glu Val Ser Thr  Glu Asn Asp Gln Ser  Thr Arg Phe

    1565                 1570                 1575

Pro Lys  Pro Glu Leu Glu Ile  Gln Phe Thr Pro Leu  Gln Pro Asn

    1580                 1585                 1590

Lys Met  Ala Val Lys His Pro  Gly Cys Thr Thr Pro  Val Thr Val

    1595                 1600                 1605

Lys Ile  Pro Lys Ala Arg Lys  Arg Lys Ser Asn Glu  Met Glu Glu

    1610                 1615                 1620

Asp Leu  Val Lys Cys Glu Asn  Lys Lys Asn Ala Thr  Pro Arg Thr

    1625                 1630                 1635

Asn Leu  Lys Phe Pro Ile Ser  Asp Asp Arg Asn Ser  Ser Val Lys

    1640                 1645                 1650

Lys Glu  Gln Lys Val Ala Ile  Arg Pro Ser Ser Lys  Lys Thr Tyr

    1655                 1660                 1665

Ser Leu  Arg Ser Gln Ala Ser  Ile Ile Gly Val Asn  Leu Ala Thr

    1670                 1675                 1680

Lys Lys  Lys Glu Gly Thr Leu  Gln Lys Phe Gly Asp  Phe Leu Gln

    1685                 1690                 1695

His Ser  Pro Ser Ile Leu Gln  Ser Lys Ala Lys Lys  Ile Ile Glu

    1700                 1705                 1710

Thr Met  Ser Ser Ser Lys Leu  Ser Asn Val Glu Ala  Ser Lys Glu

    1715                 1720                 1725

Asn Val  Ser Gln Pro Lys Arg  Ala Lys Arg Lys Leu  Tyr Thr Ser

    1730                 1735                 1740

Glu Ile  Ser Ser Pro Ile Asp  Ile Ser Gly Gln Val  Ile Leu Met

    1745                 1750                 1755

Asp Gln  Lys Met Lys Glu Ser  Asp His Gln Ile Ile  Lys Arg Arg

    1760                 1765                 1770

Leu Arg  Thr Lys Thr Ala Lys

    1775                 1780

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>3

ccgggaaagt aaactgactc ac             22

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>4

t tctagctcc tcaaccaaat cct            23

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>5

cgaccacttt gtcaagctca                 20

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>6

ggttgagcac agggtacttt att              23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>7

tgctggttca gaacgaacta tg               22

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>8

tcctcgtggc taatgaaagc                   20

<210>9

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>9

ataagaatgc ggccgcaatg gaatctaatt ttaatcaaga gg           42

<210>10

<211>35

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物

<400>10

ataagaatgc ggccgctttg gctgtttttg ttcga                  35

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>11

ccggaattct ccgccatgag gagaagtga                        29

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>12

ttgccgctcg agggactgga tgttggttgaa                      31

<210>13

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>13

ataagaatgc ggccgctatg gaaatcacac agttaacaaa taatttgc   48

<210>14

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>14

ataagaatgc ggccgcacct gaatggttcg ctgtttcat             39

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>15

ccggaattca tgaaacagcg aaccattcag                    30

<210>16

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>16

ataagaatgc ggccgctgtg tcagtatttc catttcattc tgtt    44

<210>17

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>17

ccggaattca tgaagcaaca gaatgaaatg gaaatact           38

<210>18

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>18

ataagaatgc ggccgctctg gacgtatggc aacctttt           38

<210>19

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>19

ataagaatgc ggccgctatg gaacaaaagg ttgccatacg tc     42

<210>20

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>20

ataagaatgc ggccgctgtg cttctacatt tgagagcttt ga    42

<210>21

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于PCR的人工合成引物序列

<400>21

ccggaattca tgtcaaagct ctcaaatgta gaagca           36

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>22

gtttgtccct tggctctcat c                           21

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>23

agtccacact ggtaagcttt tga                         23

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>24

gaagcagcac gacttcttc                              19

<210>25

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>25

gtgaagaagt gcgaccgaa                              19

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸(错配)

<400>26

ttgtagaagt gcgaccgag                              19

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA的靶序列

<400>27

ggaaagactc atcaaaagc                                        19

<210>28

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>28

caccggaaag actcatcaaa agcttcaaga gagcttttga tgagtctttc c    51

<210>29

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>29

aaaaggaaag actcatcaaa agctctcttg aagcttttga tgagtctttc c    51

<210>30

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹设计

<400>30

ggaaagactc atcaaaagct tcaagagagc ttttgatgag tctttcc         47

<210>31

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA的靶序列

<400>31

gcatatccgt ctgtcagaat                                       20

<210>32

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>32

caccgcatat ccgtctgtca gaattcaaga gattctgaca gacggatatg c    51

<210>33

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸

<400>33

aaaagcatat ccgtctgtca gaatctcttg aattctgaca gacggatatg c         51

<210>34

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA发夹设计

<400>34

gcatatccgt ctgtcagaat tcaagagatt ctgacagacg gatatgc               47

<210>35

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成寡核苷酸(错配)

<400>35

tcatatccct ctgtaagat                                               19

<210>36

<211>3128

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<400>36

gcttcgcccc gtggcgcggt ttgaaatttt gcggggctca acggctcgcg gagcggctac   60

gcggagtgac atcgccggtg tttgcgggtg gttgttgctc tcggggccgt gtggagtagg  120

tctggacctg gactcacggc tgcttggagc gtccgccatg aggagaagtg aggtgctggc  180

ggaggagtcc atagtatgtc tgcagaaagc cctaaatcac cttcgggaaa tatgggagct  240

aattgggatt ccagaggacc agcggttaca aagaactgag gtggtaaaga agcatatcaa  300

ggaactcctg gatatgatga ttgctgaaga ggaaagcctg aaggaaagac tcatcaaaag  360

catatccgtc tgtcagaaag agctgaacac tctgtgcagc gagttacatg ttgagccatt  420

tcaggaagaa ggagagacga ccatcttgca actagaaaaa gatttgcgca cccaagtgga  480

attgatgcga aaacagaaaa aggagagaaa acaggaactg aagctacttc aagagcaaga  540

tcaagaactg tgcgaaattc tttgtatgcc ccactatgat attgacagtg cctcagtgcc  600

cagcttagaa gagctgaacc agttcaggca acatgtgaca actttgaggg aaacaaaggc  660

ttctaggcgt gaggagtttg tcagtataaa gagacagatc atactgtgta tggaagaatt  720

agaccacacc ccagacacaa gctttgaaag agatgtggtg tgtgaagacg aagatgcctt  780

ttgtttgtct ttggagaata ttgcaacact acaaaagttg ctacggcagc tggaaatgca  840

gaaatcacaa aatgaagcag tgtgtgaggg gctgcgtact caaatccgag agctctggga  900

caggttgcaa atacctgaag aagaaagaga agctgtggcc accattatgt ctgggtcaaa  960

ggccaaggtc cggaaagcgc tgcaattaga agtggatcgg ttggaagaac tgaaaatgca    1020

aaacatgaag aaagtgattg aggcaattcg agtggagctg gttcagtact gggaccagtg    1080

cttttatagc caggagcaga gacaagcttt tgcccctttc tgtgctgagg actacacaga    1140

aagtctgctc cagctccacg atgctgagat tgtgcggtta aaaaactact atgaagttca    1200

caaggaactc tttgaaggtg tccagaagtg ggaagaaacc tggaggcttt tcttagagtt    1260

tgagagaaaa gcttcagatc caaatcgatt tacaaaccga ggaggaaatc ttctaaaaga    1320

agaaaaacaa cgagccaagc tccagaaaat gctgcccaag ctggaagaag agttgaaggc    1380

acgaattgaa ttgtgggaac aggaacattc aaaggcattt atggtgaatg ggcagaaatt    1440

catggagtat gtggcagaac aatgggagat gcatcgattg gagaaagaga gagccaagca    1500

ggaaagacaa ctgaagaaca aaaaacagac agagacagag atgctgtatg gcagcgctcc    1560

tcgaacacct agcaagcggc gaggactggc tcccaataca ccgggcaaag cacgtaagct    1620

gaacactacc accatgtcca atgctacggc caatagtagc attcggccta tctttggagg    1680

gacagtctac cactcccccg tgtctcgact tcctccttct ggcagcaagc cagtcgctgc    1740

ttccacctgt tcagggaaga aaacaccccg tactggcagg catggagcca acaaggagaa    1800

cctggagctc aacggcagca tcctgagtgg tgggtaccct ggctcggccc ccctccagcg    1860

caacttcagc attaattctg ttgccagcac ctattctgag tttgcgaagg atccgtccct    1920

ctctgacagt tccactgttg ggcttcagcg agaactttca aaggcttcca aatctgatgc    1980

tacttctgga atcctcaatt caaccaacat ccagtcctga gaagccctga tcagtcaacc    2040

agctgtggct tcctgtgcct agactggacc taattatatg ggggtgactt tagtttttct    2100

tcagcttagg cgtgcttgaa accttggcca ggttccatga ccatgggcct aacttaaaga    2160

tgtgaatgag tgttacagtt gaaagcccat cataggttta gtggtcctag gagacttggt    2220

tttgacttat atacatgaaa agtttatggc aagaagtgca aattttagca tatggggcct    2280

gacttctcta ccacataatt ctacttgctg aagcatgatc aaagcttgtt ttatttcacc    2340

actgtaggaa aatgattgac tatgcccatc cctgggggta attttggcat gtatacctgt    2400

aactagtaat taacatcttt tttgtttagg catgttcaat taatgctgta gctatcatag    2460

ctttgctctt acctgaagcc ttgtccccac cacacaggac agccttcctc ctgaagagaa    2520

tgtctttgtg tgtccgaagt tgagatggcc tgccctactg ccaaagaggt gacaggaagg    2580

ctgggagcag ctttgttaaa ttgtgttcag ttctgttaca cagtgcattg ccctttgttg    2640

ggggtatgca tgtatgaaca cacatgcttg tcggaacgct ttctcggcgt ttgtcccttg    2700

gctctcatct cccccattcc tgtgcctact ttgcctgagt tcttctaccc ccgcagttgc    2760

cagccacatt gggagtctgt ttgttccaat gggttgagct gtctttgtcg tggagatctg    2820

gaactttgca catgtcacta ctggggaggt gttcctgctc tagcttccac gatgaggcgc    2880

cctctttacc tatcctctca atcactactc ttcttgaagc actattattt attcttccgc    2940

tgtctgcctg cagcagtact actgtcaaca tagtgtaaat ggttctcaaa agcttaccag    3000

tgtggacttg gtgttagcca cgctgtttac tcatacagta cgtgtcctgt ttttaaaata    3060

tacaattatt cttaaaaata aattaaaatc tgtatactta catttcaaaa agaaaaaaaa    3120

aaaaaaaa                                                  3128

<210>37

<211>620

<212>PRT

<213>人类(Homo sapiens)

<400>37

Met Arg Arg Ser Glu Val Leu Ala Glu Glu Ser Ile Val Cys Leu Gln

1               5               10                  15

Lys Ala Leu Asn His Leu Arg Glu Ile Trp Glu Leu Ile Gly Ile Pro

            20                  25                  30

Glu Asp Gln Arg Leu Gln Arg Thr Glu Val Val Lys Lys His Ile Lys

        35                  40                  45

Glu Leu Leu Asp Met Met Ile Ala Glu Glu Glu Ser Leu Lys Glu Arg

    50                  55                  60

Leu Ile Lys Ser Ile Ser Val Cys Gln Lys Glu Leu Asn Thr Leu Cys

65                  70                  75                  80

Ser Glu Leu His Val Glu Pro Phe Gln Glu Glu Gly Glu Thr Thr Ile

                85                  90                  95

Leu Gln Leu Glu Lys Asp Leu Arg Thr Gln Val Glu Leu Met Arg Lys

            100                 105                 110

Gln Lys Lys Glu Arg Lys Gln Glu Leu Lys Leu Leu Gln Glu Gln Asp

        115                 120                 125

Gln Glu Leu Cys Glu Ile Leu Cys Met Pro His Tyr Asp Ile Asp Ser

    130                 135                 140

Ala Ser Val Pro Ser Leu Glu Glu Leu Asn Gln Phe Arg Gln His Val

145                 150                 155                 160

Thr Thr Leu Arg Glu Thr Lys Ala Ser Arg Arg Glu Glu Phe Val Ser

                165                 170                 175

Ile Lys Arg Gln Ile Ile Leu Cys Met Glu Glu Leu Asp His Thr Pro

            180                 185                 190

Asp Thr Ser Phe Glu Arg Asp Val Val Cys Glu Asp Glu Asp Ala Phe

        195                 200                 205

Cys Leu Ser Leu Glu Asn Ile Ala Thr Leu Gln Lys Leu Leu Arg Gln

    210                 215                 220

Leu Glu Met Gln Lys Ser Gln Asn Glu Ala Val Cys Glu Gly Leu Arg

225                 230                 235                 240

Thr Gln Ile Arg Glu Leu Trp Asp Arg Leu Gln Ile Pro Glu Glu Glu

                245                 250                 255

Arg Glu Ala Val Ala Thr Ile Met Ser Gly Ser Lys Ala Lys Val Arg

            260                 265                 270

Lys Ala Leu Gln Leu Glu Val Asp Arg Leu Glu Glu Leu Lys Met Gln

        275                 280                 285

Asn Met Lys Lys Val Ile Glu Ala Ile Arg Val Glu Leu Val Gln Tyr

    290                 295                 300

Trp Asp Gln Cys Phe Tyr Ser Gln Glu Gln Arg Gln Ala Phe Ala Pro

305                 310                 315                 320

Phe Cys Al a G lu Asp Tyr Thr Glu Ser Leu Leu Gln Leu His Asp Ala

                  325                 330                 335

Glu Ile Val Arg Leu Lys Asn Tyr Tyr Glu Val His Lys Glu Leu Phe

            340                 345                 350

Glu Gly Val Gln Lys Trp Glu Glu Thr Trp Arg Leu Phe Leu Glu Phe

            355                 360                 365

Glu Arg Lys Ala Ser Asp Pro Asn Arg Phe Thr Asn Arg Gly Gly Asn

    370                 375                 380

Leu Leu Lys Glu Glu Lys Gln Arg Ala Lys Leu Gln Lys Met Leu Pro

385                 390                 395                 400

Lys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Ala Arg Ile Glu Leu Trp Glu Gln Glu

                405                 410                 415

His Ser Lys Ala Phe Met Val Asn Gly Gln Lys Phe Met Glu Tyr Val

            420                 425                 430

Ala Glu Gln Trp Glu Met His Arg Leu Glu Lys Glu Arg Ala Lys Gln

        435                 440                 445

Glu Arg Gln Leu Lys Asn Lys Lys Gln Thr Glu Thr Glu Met Leu Tyr

    450                 455                 460

Gly Ser Ala Pro Arg Thr Pro Ser Lys Arg Arg Gly Leu Ala Pro Asn

465                 470                 475                 480

Thr Pro Gly Lys Ala Arg Lys Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Asn Ala

                485                 490                 495

Thr Ala Asn Ser Ser Ile Arg Pro Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr His

            500                 505                 510

Ser Pro Val Ser Arg Leu Pro Pro Ser Gly Ser Lys Pro Val Ala Ala

        515                 520                 525

Ser Thr Cys Ser Gly Lys Lys Thr Pro Arg Thr Gly Arg His Gly Ala

    530                 535                 540

Asn Lys Glu Asn Leu Glu Leu Asn Gly Ser Ile Leu Ser Gly Gly Tyr

545                 550                 555                 560

Pro Gly Ser Ala Pro Leu Gln Arg Asn Phe Ser Ile Asn Ser Val Ala

                565                 570                 575

Ser Thr Tyr Ser Glu Phe Ala Lys Asp Pro Ser Leu Ser Asp Ser Ser

            580                 585                 590

Thr Val Gly Leu Gln Arg Glu Leu Ser Lys Ala Ser Lys Ser Asp Ala

        595                 600                 605

Thr Ser Gly Ile Leu Asn Ser Thr Asn Ile Gln Ser

    610                 615                 620

Claims (6)

1.一种鉴定抑制MPHOSPH1与PRC1之间的结合的作用剂的方法，该方法包括下述步骤：

a)使第一多肽与第二多肽在作用剂的存在下相接触；其中，所述第一多肽选自下组：

i)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；

ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列构成的多肽等价的对PRC1的结合活性，

iii)包含与SEQ ID NO：2至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性，和

vi)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；

所述第二多肽选自下组：

i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽；

ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；

iii)包含与SEQ ID NO：37至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；和

vi)与由SEQ ID NO：36的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；

b)检测所述第一多肽与第二多肽之间的结合水平；

c)将所述第一和第二多肽的结合水平与不存在作用剂的条件下检出的所述第一和第二多肽的结合水平相比较；以及

d)选择降低所述第一与第二多肽之间的结合水平的作用剂。

2.权利要求1的方法，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：2的第1188～1718位的氨基酸残基。

3.一种鉴定抑制膀胱癌细胞增殖的作用剂的方法，该方法包括下述步骤：

a)使第一多肽与第二多肽在作用剂的存在下相接触；其中，所述第一多肽选自下组：

i)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；

ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；

iii)包含与SEQ ID NO：2至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；和

vi)与由SEQ ID NO：1的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；

所述第二多肽选自下组：

i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽、

ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性，

iii)包含与SEQ ID NO：37至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性，和

vi)与由SEQ ID NO：36的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；

b)检测所述第一多肽与第二多肽之间的结合水平；

c)将所述第一和第二多肽的结合水平与不存在作用剂的条件下检出的所述第一和第二多肽的结合水平相比较；以及

d)选择降低所述第一与第二多肽之间的结合水平的作用剂作为抑制膀胱癌细胞增殖的作用剂。

4.权利要求3的方法，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：2的第1188～1718位的氨基酸残基。

5.一种鉴定用于治疗或预防膀胱癌的作用剂的方法，该方法包括下述步骤：

a)使第一多肽与第二多肽在作用剂的存在下相接触；其中，所述第一多肽选自下组：

i)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽；

ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；

iii)包含与SEQ ID NO：2至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；和

iv)与由SEQ ID NO：1的核酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：2的氨基酸序列组成的多肽等价的对PRC1的结合活性；

所述第二多肽选自下组：

i)包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽、

ii)包含添加、取代、缺失或插入了一个或多个氨基酸的SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性，

iii)包含与SEQ ID NO：37至少约80％同源的氨基酸序列的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性，和

vi)与由SEQ ID NO：36的核苷酸序列组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸所编码的多肽，条件是该多肽具有与由SEQ ID NO：37的氨基酸序列组成的多肽等价的对MPHOSPH1的结合活性；

b)检测所述第一多肽与第二多肽时间的结合水平；

c)将所述第一和第二多肽的结合水平与不存在作用剂的条件下检出的所述第一和第二多肽的结合水平相比较；以及

d)选择降低第一与第二多肽之间的结合水平的作用剂作为用于预防或治疗膀胱癌的作用剂。

6.权利要求5的方法，其中所述第一多肽包含SEQ ID NO：2的第1188～1718位的氨基酸残基。

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