JP2007528699A - 増強した細胞結合性を有するrgdエンリッチゼラチン様タンパク質 - Google Patents
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Abstract
Description
i)容積に対する表面積の高い割合。これは、マイクロキャリアの密度を変化させることにより、変動可能であり、単位容積あたり高い細胞密度となり、高密度の細胞製品を得られる可能性がある。ii)多数の低生産性容器を使用せずに、単一の高生産性容器で細胞を伝播することができる。その結果、培地を有効に使用することができ、著しく節約することができる。iii)マイクロキャリア培養はよく混合されているため、pH、pO2、pCO2等の様々な環境条件を容易にモニター、制御することができる。iv)細胞のサンプリングを容易に行うことができる。v)ビーズを容易に設置できるので、細胞の回収及び製品のダウンストリーム処理を容易に行うことができる。vi)適切に改善された例えば醗酵槽等の従来の装置使用して、マイクロキャリア培養を比較的容易にスケールアップすることができる。
i)ビーズの表面の特性は、細胞が迅速に付着し、増殖できなくてはならない。外形は均等であることが好ましい。ii)容易に単離できるように、ビーズの密度は、培養培地より若干高くなければならない。従来の天然の培養培地は水性であり、密度は1.03〜1.09g/ccである。しかし、密度は、1.03〜1.045g/mlである適切な範囲を一定以上超えてはならない。剪断に感受性を有する細胞を傷つけないような緩やかな攪拌で、懸濁状態を維持することができ、ビーズが配置された場合には、細胞の増殖が抑制される。iii)ビーズのサイズの分布は、全てのマイクロキャリアの懸濁が達成され、細胞が同時にコンフルエントになるように、小さくなければならない。さらに、溶液内のマイクロキャリアのクラスター形成を防止しなければならない。iv) 光学特性は、顕微鏡で、容易に観察できなければならない。v)細胞の生存と増殖のためだけでなく、獣医学的又は臨床目的で使用される細胞培養製品のためにも、毒性であってはならない。vi)ビーズのマトリックスは、培養の攪拌中に起きる衝突が、ビーズを断片化しないようなものでなければならない。
CA12_HUMAN(P02458)コラーゲンα1(II)鎖前駆物質[コンドロカルシンを含む]{遺伝子:COL2A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA13_HUMAN(P02461)コラーゲンα1(III)鎖前駆物質{遺伝子:COL3A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA14_HUMAN(P02462)コラーゲンα1(IV)鎖前駆物質{遺伝子:COL4A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA15_HUMAN(P20908)コラーゲンα1(V)鎖前駆物質{遺伝子:COL5A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA16_HUMAN(P12109)コラーゲンα1(VI)鎖前駆物質{遺伝子:COL6A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA17_HUMAN(Q02388)コラーゲンα1(VII)鎖前駆物質(長鎖コラーゲン)(LCコラーゲン){遺伝子:COL7A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA18_HUMAN(P27658)コラーゲンα1(VIII)鎖前駆物質(内皮コラーゲン){遺伝子:COL8A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA19_HUMAN(P20849)コラーゲンα1(IX)鎖前駆物質{遺伝子:COL9A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1A_HUMAN(Q03692)コラーゲンα1(X)鎖前駆物質{遺伝子:COL10A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1B_HUMAN(P12107)コラーゲンα1(XI)鎖前駆物質{遺伝子:COL11A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1C_HUMAN(Q99715)コラーゲンα1(XII)鎖前駆物質{遺伝子:COL12A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1E_HUMAN(P39059)コラーゲンα1(XV)鎖前駆物質{遺伝子:COL15A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1F_HUMAN(Q07092)コラーゲンα1(XVI)鎖前駆物質{遺伝子:COL16A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1G_HUMAN(Q9UMD9)コラーゲンα1(XVII)鎖(類天疱瘡抗原2)(180kDa類天疱瘡抗原2){遺伝子:COL17A1又はBPAG2又はBP180}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1H_HUMAN(P39060)コラーゲンα1(XVIII)鎖前駆物質(エンドスタチンを含む){遺伝子:COL18A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA1I_HUMAN(Q14993)コラーゲンα1(IXI)鎖前駆物質(コラーゲンα1(Y)鎖){遺伝子:COL19A1}−ホモサピエンス(ヒト)
CA21_HUMAN(P08123)コラーゲンα2(I)鎖前駆物質{遺伝子:COL1A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA24_HUMAN(P08572)コラーゲンα2(IV)鎖前駆物質{遺伝子:COL4A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA25_HUMAN(P05997)コラーゲンα2(V)鎖前駆物質{遺伝子:COL5A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA26_HUMAN(P12110)コラーゲンα2(VI)鎖前駆物質{遺伝子:COL6A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA28_HUMAN(P25067)コラーゲンα2(VIII)鎖前駆物質(内皮コラーゲン){遺伝子:COL8A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA29_HUMAN(Q14055)コラーゲンα2(IV)鎖前駆物質{遺伝子:COL9A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA2B_HUMAN(P13942)コラーゲンα2(XI)鎖前駆物質{遺伝子:COL11A2}−ホモサピエンス(ヒト)
CA34_HUMAN(Q01955)コラーゲンα3(IV)鎖前駆物質(グットパスチャー抗原){遺伝子:COL4A3}−ホモサピエンス(ヒト)
CA35_HUMAN(P25940)コラーゲンα3(V)鎖前駆物質{遺伝子:COL5A3}−ホモサピエンス(ヒト)
CA36_HUMAN(P12111)コラーゲンα3(VI)鎖前駆物質{遺伝子:COL6A3}−ホモサピエンス(ヒト)
CA39_HUMAN(Q14050)コラーゲンα3(IX)鎖前駆物質{遺伝子:COL9A3}−ホモサピエンス(ヒト)
CA44_HUMAN(P53420)コラーゲンα4(IV)鎖前駆物質{遺伝子:COL4A4}−ホモサピエンス(ヒト)
CA54_HUMAN(P29400)コラーゲンα5(IV)鎖前駆物質{遺伝子:COL4A5}−ホモサピエンス(ヒト)
CA64_HUMAN(Q14031)コラーゲンα6(IV)鎖前駆物質{遺伝子:COL4A6}−ホモサピエンス(ヒト)
EMD2_HUMAN(Q96A83)コラーゲンα1(XXVI)鎖前駆物質(タンパク質2を含むEMI領域)(Emu2タンパク質)(タンパク質2を含むエミリン(emilin)及びマルチメリン(multimerin)領域){遺伝子:EMID2又はCOL26A1又はEMU2}−ホモサピエンス(ヒト)
平均直径が100マイクロメートルのポリスチレンビーズを用いた。ポリスチレンビーズ上にゼラチンをコバレントに固定するためにヘテロ二機能性クロスリンク剤であるBBA−EAC−NOSを用いた。BBA−EAC−NOSをポリスチレンビーズに添加し、吸着させる。次に、ゼラチンを添加し、NOS合成ポリマーと反応させ、スペーサーにコバレントなカップリングを産出した。スペーサー(及びコバレントにカップリングしたゼラチン)をコバレントにポリスチレンビーズに固定するために、感光(320nm)した。最後に、接着の弱いゼラチンを、リン酸緩衝液(pH7.2)内で弱い漂白剤Tween 20で一晩洗浄して取り除いた。
細胞数の計数には、細胞を、0.1Mのクエン酸内にクリスタルバイオレット(0.1%w/w)を等量混合して染色し、血球計数器で計数した。培地からの細胞の減少は、ビーズに付着した細胞の指標として用いた。
Claims (19)
- アミノ酸総数に対するRGDモチーフの割合が少なくとも0.4であり、RGDエンリッチゼラチンが350以上のアミノ酸を含む場合に、350のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも1つのRGDモチーフを含むRGDエンリッチゼラチンを含むセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチン内の割合が、少なくとも0.6、好ましくは少なくとも0.8、さらに好ましくは少なくとも1.0、さらに好ましくは少なくとも1.2、最も好ましくは少なくとも1.5であることを特徴とする、請求項1記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチン内のRGDモチーフの数が、250のアミノ酸あたり少なくとも4であることを特徴とする、請求項1又は2記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンが、RGDモチーフを少なくとも4、好ましくは6、さらに好ましくは8、より好ましくは12以上16以下含むことを特徴とする、請求項1〜3いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンの分子量が約30kDa〜約200kDaであることを特徴とする、請求項1〜4いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンの分子量が、60kDa超、好ましくは70kDa超であることを特徴とする、請求項1〜5いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンの分子量が、約150kDa未満であることを特徴とする、請求項1〜6いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンが、5%未満、好ましくは3%未満のヒドロキシプロリン残基を含むことを特徴とする、請求項1〜7いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンが、pH7〜7.5において正味の正電荷を有することを特徴とする、請求項1〜8いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンの少なくとも80%が、天然ヒトコラーゲン配列の1又は複数の部分からなり、該天然ヒトコラーゲン配列が少なくとも30のアミノ酸の長さを有することを特徴とする、請求項1〜9いずれかに記載のセルサポート。
- RGDエンリッチゼラチンが、天然ヒトコラーゲン配列の1又は複数の部分からなることを特徴とする、請求項10記載のセルサポート。
- アミノ酸総数に対するRGDモチーフの割合が少なくとも0.4であり、RGDエンリッチゼラチンが350以上のアミノ酸を含む場合に、350のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも1つのRGDモチーフを含み、かつ、該ゼラチンの少なくとも80%が、天然ヒトコラーゲン配列の1又は複数の部分からなり、該天然ヒトコラーゲン配列が、少なくとも30のアミノ酸の長さを有することを特徴とする、RGDエンリッチゼラチン。
- RGDエンリッチゼラチンの分子量が、最大10kDa、好ましくは最大5kDaであることを特徴とする、請求項12記載のRGDエンリッチゼラチン。
- セルサポートがマイクロキャリアであることを特徴とする、請求項1〜11いずれかに記載のセルサポート、又はクレーム12記載のRGDエンリッチゼラチンを含むセルサポート。
- セルサポートが、RGDエンリッチでコーティングしたインプラント又は移植材料、RGDエンリッチでコーティングした組織工学用の足場、歯科製品(一部)、創傷治癒用製品(一部)、人工皮膚マトリックス材料(一部)及び組織接着剤(一部)からなる群から選択されることを特徴とする、クレーム1〜11いずれかに記載のセルサポート、又はクレーム12又は13記載のRGDエンリッチゼラチンを含むサポート。
- クレーム12記載のRGDエンリッチゼラチンの、トラッグデリバリーシステム成分としての使用。
- クレーム13記載のRGDエンリッチゼラチンの、ガン転移抑制剤としての使用。
- クレーム12又は13記載のRGDエンリッチゼラチンの、血小板凝集予防剤としての使用。
- クレーム13記載のRGDエンリッチゼラチンの、手術後の組織接着予防剤としての使用。
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