ES2934158T3 - Biomateriales de colágeno bioactivo y métodos para su fabricación - Google Patents

Abstract

Un biomaterial de colágeno bioactivo de acuerdo con la invención que es biocompatible con células y tejidos y se distingue por contener ciertos constituyentes peptídicos crípticos y no crípticos para estimular las respuestas celulares y además hecho para incorporar una variedad de agentes para proporcionar una característica deseada, como propiedades antimicrobianas. . El biomaterial de colágeno bioactivo se puede proporcionar como una variedad de configuraciones y como varias matrices y dispositivos para su uso en aplicaciones médicas tales como en biotecnología, investigación básica, ingeniería de tejidos y en la reparación de heridas como un vendaje para heridas o un andamio de células/tejidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Biomateriales de colágeno bioactivo y métodos para su fabricación

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un biomaterial de colágeno bioactivo y métodos para su fabricación. Además, el biomaterial de colágeno bioactivo de acuerdo con la invención es biocompatible. El biomaterial de colágeno bioactivo puede proporcionarse como una variedad de configuraciones y como varias matrices y dispositivos para su uso en aplicaciones médicas tales como en biotecnología, investigación básica, ingeniería de tejidos y en la reparación de heridas como un apósito o un andamio de células/tejidos. El biomaterial de colágeno bioactivo puede distinguirse por contener ciertos constituyentes peptídicos crípticos y no crípticos para estimular las respuestas celulares y además incorporar una variedad de agentes para proporcionar una característica deseada, tal como propiedades antimicrobianas.

Antecedentes de la invención

La matriz extracelular (ECM) es una estructura compleja en el cuerpo que rodea y sostiene las células. In vivo, las células, que incluye las células madre que residen dentro de la ECM, reciben y responden a las señales físicas y bioquímicas de las células vecinas, los componentes de la ECM y los tejidos. La ECM consta de varias proteínas estructurales, como colágeno, laminina, fibronectina, vitronectina y elastina, que son susceptibles a la degradación y reensamblaje. La más abundante de las proteínas ECM es el colágeno.

El colágeno y otras proteínas estructurales de la ECM a menudo se asocian con proteoglicanos y glicoproteínas. Estas moléculas proporcionan señalización que regula la respuesta celular y el comportamiento celular. Las células se unen a la ECM a través de integrinas. Las integrinas vinculan el citoesqueleto celular interno con la ECM externa a través de proteínas de enlace citoplasmáticas y median la capacidad de las células para detectar el entorno de la ECM y responder en consecuencia. El aumento o incluso la reducción de la adhesión celular a través de las integrinas tiene efectos determinantes sobre el metabolismo y la función celular. Ahora se acepta ampliamente que la ECM y el colágeno participan en la regulación de la función de las células dentro de la ECM. Las interacciones entre las células y la matriz extracelular coordinan las vías de señalización que controlan varios aspectos del comportamiento celular. Las integrinas detectan las propiedades físicas de la matriz extracelular y organizan el citoesqueleto en consecuencia (Huveneers & Danen, Journal of Cell Science, 122: 1059-1069, 2009).

El colágeno nativo tiene una estructura triple helicoidal y forma microfibrillas. Una microfibrilla se compone de muchas hebras helicoidales de tropocolágeno, y cada una de ellas se ensambla a partir de tres cadenas polipeptídicas entrelazadas para formar la estructura nativa triple helicoidal compuesta de aminoácidos. En ciertos lugares dentro de cada una de las tres cadenas polipeptídicas, hay secuencias de aminoácidos repetidas específicas de arginina-glicina-aspartato (RGD, donde R es arginina, G es glicina y D es aspartato).

El colágeno tipo I triple helicoidal contiene dos residuos de RGD en cada una de sus dos cadenas a l y 4 unidades RGD en su cadena a2 para un total de 8 motivos RGD. Las secuencias RGD están enlazadas dentro de la estructura triple helicoidal del colágeno nativo y, por lo tanto, no se exponen fácilmente en la superficie de las moléculas de colágeno nativo triple helicoidal. Las secuencias RGD están así escondidas o "crípticas" dentro de la estructura nativa del colágeno y no se ponen en contacto fácilmente con las células expuestas al colágeno triple helicoidal en su conformación nativa o no desnaturalizada. Por lo tanto, en la forma nativa de colágeno, las células tales como fibroblastos, células endoteliales, plaquetas y células madre no interactúan fácilmente a través de las integrinas avp3 de las células con los motivos de los tripéptidos RGD. Además, el fenotipado por citometría de flujo y el fenotipado por inmunofluorescencia muestran que av, avp3 y avp5 se expresan en todas las células mononucleares (precursores musculares y células intersticiales) sembradas en moléculas extracelulares tales como gelatina, vitronectina y fibronectina (Sinanan y otros 2008, avp3 and avp5 integrins and their role in muscle precursor cell, adhesion. Biol. Cell. 100,465-477).

Se han identificado sitios RGD de unión a integrina en el colágeno y muchas otras proteínas de la ECM, que incluye vitronectina, fibrinógeno, factor de von Willebrand, colágeno, laminina, osteopontina, tenascina y sialoproteína ósea, así como también en proteínas de membrana. Se ha demostrado que ciertas integrinas se unen a moléculas de ECM de manera dependiente de RGD: a3p1; a5p1; a8p1; aIIp3; avp1; avp3; avp5; avp6; avp8; y hasta cierto punto a2p1 y a4p1 (Hersel y otros Biomaterials 24:4385-4415, 2003). Un papel predominante del sitio RGD es para la adhesión endotelial y para la unión de las integrinas avp3 y avp5 (Pedchenko y otros 2004, avp3 and avp5 integrins bind both the proximal RGD site and non-RGD motifs within noncollagenous (NCI) domain of the a3 chain of type IV collagen: implication forthe mechanism of endothelia cell adhesion. J Biol Chem., 23: 279). No es sorprendente que, dado que se descubrió que los motivos RGD promueven la adhesión celular e influyen en la supervivencia celular y el metabolismo celular, se han funcionalizado químicamente numerosos polímeros con péptidos RGD, que incluye el colágeno para aplicaciones biomédicas, que incluye, entre otras, la regeneración de tejido (Niu y otros J. Mater. Sci Technol. 21: 571-576,2005; Hersel y otros 2003).

El daño o trauma al colágeno, tales como daño térmico o ataque proteolítico in vivo por las enzimas gelatinasa, conduce al desenrollado del colágeno nativo o de triple helicoidal. La escisión y subsecuente desenrollado, también conocida como "desnaturalización" del colágeno nativo lo vuelve susceptible a una mayor degradación y fragmentación en varios péptidos por proteasas (por ejemplo, elastasa, colagenasas, gelatinasas secretadas por neutrófilos, macrófagos, fibroblastos y queratinocitos, y células madre) y más concretamente por las gelatinasas MMP2 y MMP9. El colágeno desnaturalizado (también conocido como gelatina) y las moléculas de colágeno degradadas conducen a la exposición de las secuencias de RGD que se vuelven biológicamente activas e influyen en las interacciones bioquímicas y celulares en estos sitios de unión de RGD. El colágeno nativo generalmente se remodela en el cuerpo mediante colagenasas y gelatinasas que sirven para exponer los residuos de RGD con la actividad biológica resultante hacia las células competentes, que incluye las plaquetas, los fibroblastos, los queratinocitos y las células madre. Otras células pueden interactuar con RGD, a través del contacto mediado por integrina.

Las células se unen al colágeno mediante el uso de los receptores de integrina a1p1, a10p1, a l lp l y a2 p1 que no son "crípticas" ni están ocultas dentro de la estructura helicoidal del colágeno tipo 1 nativo. Por otro lado, la desnaturalización parcial o total del colágeno tipo 1 revela motivos RGD crípticos que son reconocidos por los receptores avp3, avpl y a5p1, así como también por las integrinas alIB p3 en las plaquetas. Por lo tanto, las células muestran diferentes actividades biológicas, o pueden permanecer inactivas, en dependencia de si sus integrinas de superficie entran en contacto y se unen con colágeno nativo o colágeno desnaturalizado, ya que cada uno de estos colágenos tendrá distintas cantidades y diferentes ubicaciones de secuencias de aminoácidos bioactivos expuestos y no expuestos. Por ejemplo, los fibroblastos producen colágeno para la secreción y la remodelación de la matriz extracelular, y ayudan en la cicatrización de la herida, se unen a la secuencia RGD con las integrinas avp3.

En la industria, el colágeno desnaturalizado se deriva del colágeno nativo en presencia de tratamientos extremos de calor, ácido y base que dan como resultado la pérdida de la estructura triple helicoidal del colágeno y la degradación e hidrólisis de las cadenas polipeptídicas del colágeno. Generalmente, la pérdida de la configuración triple helicoidal (desnaturalización) del colágeno se considera una reacción adversa que debe evitarse cuando se purifica el colágeno nativo para aplicaciones biomédicas como la regeneración de tejido.

La cicatrización de la herida requiere angiogénesis y revascularización o formación de nuevos vasos sanguíneos e implica los procesos de adhesión, invasión, migración, proliferación y formación de tubos capilares por parte de las células específicas. Los nuevos vasos sanguíneos crecen a partir de células endoteliales. La angiogénesis requiere interacciones moleculares específicas entre las células vasculares y los componentes de la ECM. Se cree que los receptores de superficie de células endoteliales microvasculares que son específicos para la ECM provisional rica en fibrina están involucrados en la angiogénesis. Hay varios receptores de integrina, pero solo avp3 puede reconocer y unirse a todas las proteínas de matriz provisional, que incluye la fibrina y la fibronectina.

Debido a la bioactividad de la secuencia de RGD y ciertas imitaciones sintetizadas de RGD, ha habido intentos dirigidos a introducir residuos de RGD dentro de materiales para usar en productos de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, se ha practicado el acoplamiento químico de residuos de aminoácidos sintéticos, residuos RGD, agentes RGD cíclicos así como también otros compuestos. Sin embargo, tales reacciones de acoplamiento covalente son difíciles de controlar en proteínas grandes y generalmente no conducen a la modificación de materiales de colágeno integrados.

El documento US 7,671,016 describe las gelatinas enriquecidas con RGD en las que la gelatina enriquecida con RGD se prepara mediante tecnología de ADN recombinante. El documento US 2010/0184183 describe varios tratamientos físicos para estabilizar una matriz artificial de colágeno para procedimientos de ingeniería de tejidos antes o después de la asociación con péptidos de adhesión como RGD.

El DHT (tratamiento dehidrotermal) es una técnica para estabilizar el colágeno y los materiales compuestos de colágeno. Es un tratamiento físico que consiste en someter al colágeno a una temperatura elevada (>90 °C) al vacío. El proceso elimina el agua de las moléculas de colágeno, lo que da como resultado la formación de enlaces cruzados intermoleculares a través de reacciones de condensación, ya sea por esterificación o formación de amida. Se prefiere el tratamiento con DHT a otros métodos de reticulación, ya que no implica el uso de reactivos citotóxicos, es simple y confiable. Otra ventaja del tratamiento DHT es la esterilización proporcionada por las altas temperaturas y los tiempos de exposición usados. Los estudios sobre el tratamiento con DHT han demostrado que el aumento de la temperatura de DHT y la duración de la exposición mejoran las propiedades mecánicas de las fibras de colágeno (Haugh, MG y otros Crosslinking and Mechanical Properties Significantly Influence Cell Attachment, Proliferation, and Migration, Within Collagen Glycosaminoglycan Scaffolds. Tissue Engineering, PartA, 2011).

Yannas y otros (Phil. Trans. R. Soc. A 2010368, 2123-2139) enseñan que después de la liofilización, el andamiaje de colágeno altamente poroso se reticula mediante un proceso de dos etapas. La primera etapa es un tratamiento deshidrotérmico, que no requiere el uso de un agente de reticulación. En este proceso, el andamio se expone a temperaturas de 100 °C a 120 °C, o tan alto como 180 °C bajo alto vacío. Esta etapa conduce a la deshidratación del andamio a un nivel más abajo de aproximadamente el 2 % en peso. Se requiere una deshidratación drástica para la reticulación del colágeno por la formación de enlaces amida entre las cadenas de proteínas y probablemente también por la formación de enlaces colágeno-sulfato de condroitina, o enlaces colágeno-carboximetilcelulosa, si están solos o en combinación con colágeno. La desnaturalización o gelatinización, o fusión de la estructura triple helicoidal del colágeno, ocurre si el contenido de humedad al comienzo del proceso de calentamiento es lo suficientemente alto para inducir la fusión de la estructura triple helicoidal a la temperatura de deshidratación. Además de la pérdida de ligandos específicos para la unión celular, la gelatina se degrada in vivo a una velocidad muy acelerada. Así, Yannas y otros evitan el uso de colágeno procesado con DHT como cobertura de heridas, ya que sufriría la "pérdida de ligandos específicos para la unión, [y] la gelatina se degrada in vivo a una velocidad muy acelerada".

En la reticulación con DHT, una matriz de colágeno liofilizada, una esponja, una espuma, una almohadilla, etc. se exponen a calor y presión reducida o a ambos para causar una deshidratación inicial seguida de la pérdida de agua adicional y la formación de enlaces de reticulación a través de un proceso de condensación inter o intramolecular. El DHT implica deshidratar el producto que se va a reticular hasta un contenido de humedad inferior al 1 % y mediante el uso de suficiente calor o vacío adicional para lograr la densidad de reticulación deseada. Con contenidos de humedad muy por encima del 1 %, se espera la desnaturalización del contenido del colágeno triple helicoidal, tal y como señala Yannas y otros, (2010). Se ha demostrado que las altas temperaturas usadas durante la reticulación de DHT desnaturalizan el colágeno. La desnaturalización se define como la reorganización de la triple hélice en una configuración de cadena aleatoria. Las temperaturas usadas durante el tratamiento con DHT rompen los enlaces de hidrógeno que mantienen la estructura triple helicoidal del colágeno, con la alteración en una estructura en espiral al azar, especialmente cuando el contenido de humedad está muy por encima del 1 %. La destrucción de la estructura triple helicoidal es un detrimento, ya que reduce la diferenciación de ciertas células madre, como señalan Liu, Y. y otros (One-Step Derivation of Mesenchymal Stem Cell (MSC)-Like Cells from Human Pluripotent Stem Cells on a Fibrillar Collagen Coating, PlosOne, 2012, 7, e 33225). Por lo tanto, la reticulación de DHT que induce la desnaturalización de la estructura fibrilar del colágeno se considera indeseable para la preparación de andamios adecuados para la siembra celular y el mantenimiento celular.

Se sabe que los cambios químicos producidos por DHT también pueden afectar negativamente a las células incrustadas en el andamio. Si no se aplica adecuadamente, se sabe que la reticulación de DHT cambia la composición química de las membranas a base de colágeno. Los cambios inducidos por la reticulación de DHT en la composición química podrían alterar la citocompatibilidad del andamio para aceptar las células madre y, por lo tanto, comprometer la unión celular. Cualquier citotoxicidad de materiales a base de colágeno fuertemente reticulados podría modificar la forma celular y reducir significativamente el crecimiento celular. También se ha postulado que la reticulación de DHT disminuye significativamente la velocidad de migración celular al enmascarar los sitios de unión de la integrina que promueven la unión celular. Además, después de la reticulación, los fibroblastos se adhirieron y proliferaron en andamios de DHT; sin embargo, el metabolismo celular fue un 12 % menor en andamios de DHT (Haugh y otros 2011, The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds, Royal College of Surgeons in Ireland e-publications@RCSI, 2009, 21pp.) señaló que la desnaturalización del colágeno aumentó tanto con la exposición a la DHT como con la temperatura. El aumento del período de exposición no tuvo efecto sobre la desnaturalización a 105 °C y 180 °C. Sin embargo, a 120 °C y 150 °C la desnaturalización aumentó con el período de exposición. Los andamios contenían un 25 % de colágeno desnaturalizado después del tratamiento a 105 °C durante 24 h y un 60 % de colágeno desnaturalizado después de un tratamiento extenso a 180 °C durante 120 h. Por lo tanto, se sabe que el colágeno reticulado con DHT reduce el metabolismo celular y enmascara las integrinas (Jason W. Drexler y Heather M. Powell. Dehydrothermal crosslinking of electrospun collagen. Tissue Engineering Part C: Methods, 2011, 17: 9-17.

El documento US 4,412,947 describe la fabricación deshidrotérmica de una esponja de colágeno mediante el uso de colágeno nativo en forma sustancialmente pura. Una solución de colágeno se congela con una velocidad de reducción de temperatura de alrededor de -18° a -24 °C/hora para que los cristales de hielo formados sean extremadamente pequeños y no rompan los enlaces reticulados o las cadenas de colágeno, para retener así la naturaleza y las características insolubles naturales del colágeno particulado.

El documento US 4,948,540 enseña un material en lámina de colágeno mediante el uso de procesamiento DHT que debe permitir que el colágeno retenga su estructura nativa. El documento US 6,309,454 enseña que la desnaturalización del colágeno en las esponjas de colágeno liofilizadas debe minimizarse y que en las esponjas de colágeno liofilizadas el colágeno se estabiliza contra la desnaturalización por la radiación gamma en el ciclo de esterilización.

El documento US 7,393,437 enseña que las duras condiciones de procesamiento del tratamiento con DHT desnaturalizan el colágeno nativo y, como resultado, "ha existido una necesidad sentida desde hace mucho tiempo de métodos alternativos para mejorar las propiedades fisicoquímicas del colágeno junto con características tales como un procesamiento rápido y eficiente, sustancias tóxicas nulas, procesamiento no térmico y ausencia de desnaturalización del colágeno".

El documento US2010/0256774 enseña el uso del tratamiento DHT a temperaturas que van desde 80 °C-120 °C para preservar la banda visible de colágeno, lo que indica que la estructura nativa del colágeno se mantiene después del tratamiento con DHT. Las fibrillas de colágeno tipo I de forma nativa típicamente suelen mostrar un patrón de bandas con una separación de 67 nm cuando se visualizan con microscopía electrónica.

El documento US 2004/0028738 enseña que el tratamiento del colágeno con DHT provoca la fragmentación de las moléculas de colágeno y es desventajoso para la preparación de materiales de colágeno.

El documento US 2010/00184183 enseña “usar genipina asociada, o no, a otros tratamientos físicos como UV, haz de radiación ionizante, deshidratación y tratamiento térmico (reticulación dehidrotermal (DHT) KS Weadock y otros (1996) para estabilizar la matriz artificial de colágeno (colágeno, gelatina o quitosano), para los procedimientos de ingeniería de tejidos después o antes de la asociación con péptidos de adhesión como RGD". Por tanto, se añaden los residuos de RGD exógenos y se unen covalentemente al material de colágeno.

El documento US 2011/0171180 describe un sustituto de la piel que comprende un análogo de lámina basal que comprende proteína de matriz extracelular, una esponja dérmica y queratinocitos.

A partir de lo mencionado anteriormente, parece existir la necesidad para proporcionar materiales de colágeno con funcionalidades RGD que se presenten en la superficie de las moléculas de colágeno para aplicaciones biomédicas, de manera que mantengan la distribución biológica y la densidad de los motivos RGD en el colágeno y rindan RGD no críptico.

También existe la necesidad para proporcionar un método seguro para fabricar dichos materiales de colágeno deseados sin el uso de productos químicos tóxicos. El uso de DHT para proporcionar colágeno desnaturalizado con RGD expuesto para la activación celular no se ha deseado ni presentado previamente.

Resumen de la invención

La invención se define en las reivindicaciones y se relaciona con biomateriales de colágeno bioactivos y biocompatibles que proporcionan suficientes péptidos RGD expuestos para la activación celular y también suficiente colágeno nativo como soporte físico para una variedad de aplicaciones in vivo y ex vivo.

El biomaterial de colágeno bioactivo y biocompatible de la invención comprende una fuente de colágeno con motivos RGD suficientemente expuestos para provocar la activación celular y suficiente estructura de colágeno nativo de triple hélice para características físicas de manera que el biomaterial puede usarse en una amplia variedad de aplicaciones. El biomaterial de colágeno bioactivo de la invención comprende colágeno nativo, colágeno desnaturalizado (gelatina) y colágeno hidrolizado, cada uno de los cuales tiene motivos RGD expuestos para la activación celular.

El motivo peptídico RGD puede unir integrinas en la ECM y, por lo tanto, tener efecto sobre una variedad de proteínas de la ECM, como vitronectina, fibrinógeno, factor de von Willebrand, colágeno, laminina, osteopontina, tenascina y sialoproteína ósea. Tal unión es fortuita para influir en las interacciones bioquímicas y celulares en los sitios de unión de RGD para promover uno o más de la adhesión celular, influir en la supervivencia celular, metabolismo celular. Además, la fuente de péptido(s) RGD tiene una propiedad biodegradable/bioabsorbible. Por lo tanto, el biomaterial de colágeno bioactivo de la invención tiene propiedades estructurales, bioactivas y biodegradables/bioabsorbibles y, por lo tanto, puede fabricarse en una variedad de formatos y usarse junto con otros dispositivos o estructuras. El biomaterial de colágeno bioactivo de la invención es estable in vivo e in vitro.

El biomaterial de colágeno bioactivo se produce mediante el tratamiento con DHT.

Una composición de biomaterial de colágeno bioactivo que tiene motivos RGD crípticos puede usarse como material de partida para la fabricación sencilla de un biomaterial de colágeno bioactivo con colágeno desnaturalizado resultante con péptidos RGD expuestos (no crípticos) (es decir, motivos) para usar como recubrimiento de tejido o apósito para heridas crónicas y difíciles de tratar, tal como heridas de diabetes, úlceras en los pies, úlceras en las piernas, úlceras en la piel o escaras observadas en diabéticos y pacientes ancianos, y es uno que promueve la angiogénesis y el cierre de heridas al tener un material compuesto de colágeno.

Tal como se fabrican como apósitos, los péptidos RGD se exponen a fluidos de heridas que contienen células (tales como fibroblastos, granulocitos, queratinocitos, células endoteliales) y materiales ECM; las células pueden ser células derivadas del huésped, o pueden ser células madre autólogas o alogénicas añadidas previamente a la herida mediante inyección, infusión o aplicación tópica directa. Sin invocar ninguna teoría en particular, se describe que las células, que incluye las células madre expuestas a colágeno desnaturalizado en un material compuesto de colágeno reticulado de esta invención, provocan una cascada de cicatrización de la herida acelerada, por contacto con los péptidos RGD expuestos presentados (por tratamiento con DHT), in vivo para ser usado en seres humanos, y en aplicaciones veterinarias, específicamente equinos, caninos y felinos, y otras especies de mamíferos para inducir la regeneración de tejido de las heridas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, el colágeno para uso en la invención es una matriz de colágeno bovino o porcino nativo fibrilar de Tipo 1 en la que los residuos RGD son crípticos. El biomaterial se prepara como una composición de partida en forma de compuesto acoso/suspensión/coloide con solvente y se congela/liofiliza de manera que no contenga cantidades sustanciales de solvente y comprende colágeno fibrilar tipo 1 nativo, colágeno desnaturalizado y colágeno hidrolizado que tiene motivos RGD expuestos y compuestos terapéuticos opcionales; se añade EDT^a como conservante.

La composición del biomaterial se reticula mediante el uso de un método de reticulación deshidrotérmico. El tratamiento con DHT expone el colágeno nativo a altas temperaturas suficientes para causar la desnaturalización del colágeno nativo con la exposición posterior y beneficiosa de los motivos RGD, previamente crípticos en el colágeno nativo, mientras que la reticulación del colágeno estabiliza la estructura del compuesto de colágeno. Este método proporciona un método fácil para convertir una matriz de colágeno nativo de tipo 1 en su forma desnaturalizada y, al mismo tiempo, proporcionar RGD no críptico en un método rápido y simple que evita la necesidad de agregar RGD o péptidos miméticos de RGD inducidos por productos químicos y reduce los gastos.

Por su propia naturaleza, el momento del proceso de DHT puede proporcionar varias cantidades de colágeno desnaturalizado simplemente al aumentar el tiempo que el colágeno está expuesto al procesamiento de DHT.

El biomaterial de colágeno bioactivo puede comprender al menos un polímero biocompatible seleccionado del grupo que comprende carboximetilcelulosa, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, alginato, quitosano, y dicha mezcla se liofiliza y reticula mediante el uso de procesamiento DHT.

En aspectos de la invención, pueden añadirse uno o más agentes farmacéuticos, químicos u otros antes de la reacción de liofilización y reticulación de DHT.

El biomaterial de colágeno bioactivo proporciona suficientes motivos RGD no crípticos y suficiente estructura de triple hélice para el soporte físico para aplicaciones in vivo y ex vivo. En algunos aspectos, el biomaterial se liofiliza y, opcionalmente, se reticula y, opcionalmente, comprende agentes terapéuticos.

En cualquier aspecto de la invención, el colágeno nativo puede ser colágeno tipo 1 fibrilar.

En algunos aspectos, el biomaterial está ausente de cualquier modificación química.

El biomaterial de colágeno bioactivo puede comprender plastificantes.

La invención también abarca un método para la fabricación de un biomaterial de colágeno bioactivo como se define en las reivindicaciones.

El contenido de humedad se reduce a cualquier número entero en el intervalo de aproximadamente 2-15 % o de 1­ 15 %, que incluye los intervalos intermedios. Tal contenido de humedad al aplicar el DHT da como resultado la exposición de rGd en el colágeno nativo.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, el biomaterial como se describió en la presente descripción es para usar en un método de tratamiento de una herida, el método comprende aplicar el biomaterial de colágeno bioactivo a dicha herida.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, se trata de una cubierta de tejido o apósito que comprende el biomaterial de colágeno bioactivo y biocompatible descrito en la presente descripción.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se trata de un apósito bioabsorbible reticulado, poroso, flexible, liofilizado que comprende el biomaterial de colágeno bioactivo descrito en la presente descripción.

La DHT se usa para la activación del colágeno nativo en una matriz de colágeno liofilizado, en donde dicha activación comprende la exposición de motivos RGD y el mantenimiento de la estructura del colágeno.

En aspectos, el biomaterial descrito en la presente descripción es para usar en un método para el tratamiento de una herida, el método comprende aplicar el biomaterial como se describió en la presente descripción a dicha herida, los motivos RGD suficientemente expuestos provocan la activación celular.

En algunos aspectos es una cubierta de tejido que comprende el biomaterial como se describió en la presente descripción.

En algunos aspectos es un vendaje para heridas que comprende el biomaterial como se describió en la presente descripción.

En algunos aspectos, cuando se aplica a una herida abierta, la cubierta actúa como un recubrimiento que impide la contaminación microbiana, absorbe el exudado de la herida y funciona como depósito para las células dentro de un lecho de la herida que activa factores bioquímicos esenciales, incluidas enzimas, hormonas, aminoácidos, moléculas de señal celular, como RGD, moléculas de ECM y células que promueven efectos de activación biológica, tal como migración celular, remodelación de la ECM, angiogénesis y cierre de heridas.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un nuevo biomaterial de colágeno bioactivo que tiene RGD suficientemente expuesto (es decir, motivos tripéptidos RGD no crípticos) que proporciona interacción celular in vivo y ex vivo, que tiene así una variedad de usos en aplicaciones médicas y científicas. Los motivos RGD están suficientemente expuestos en el material y, por lo tanto, pueden estar disponibles para las integrinas celulares para provocar una respuesta celular y pueden promover funciones fisiológicas tales como reparación de heridas, adhesión celular, cierre de heridas, angiogénesis y similares.

El biomaterial de colágeno bioactivo se elabora inicialmente a partir de una composición que comprende un solvente, una fuente de colágeno con motivos RGD crípticos y/o no crípticos, agentes opcionales como plastificantes, quelantes, antisépticos, antimicrobianos, péptidos, factores de crecimiento, esteroides, células y similares y sus combinaciones. Esto forma un coloide/compuesto acuoso/mezcla/suspensión (cualquiera de estos términos puede aplicarse) que se liofiliza (seca por congelación) y además los niveles de humedad se reducen y forma un biomaterial de colágeno bioactivo que es poroso que se puede configurar en cualquier forma y grosor en dependencia del uso final. Este biomaterial se reticula aún más con DHT. Alternativamente, el biomaterial de colágeno bioactivo formado puede empaparse o sumergirse en una solución que comprende el agente para el cual se desea administrar a un tejido, órgano o célula(s). En otros aspectos, el agente puede proporcionarse inicialmente y liofilizarse en el biomaterial y luego sumergirse en una solución del agente deseado. Por lo tanto, el biomaterial de colágeno bioactivo de la invención se puede "cargar" con cualquier agente deseado antes y/o después de la liofilización.

El biomaterial de colágeno bioactivo es biocompatible, bioabsorbible y puede ser flexible. Como liofilizado es una estructura porosa adecuada para la incorporación de una variedad de agentes y/o polímeros biológicos. Los tamaños de poro pueden ser de 0,1 pm a aproximadamente 500 pm y cualquier número entero e intervalo entre ellos. Puede fabricarse en una variedad de formatos, una variedad de formas, una variedad de grosores, fijado a una variedad de superficies. También puede mezclarse o dispersar dentro de una variedad de otros materiales. Por lo tanto, el biomaterial de colágeno bioactivo es adecuado para varios tipos de aplicaciones científicas y médicas. El biomaterial de la invención puede fabricarse en una variedad de formatos tales como almohadillas, andamios, películas, recubrimientos de tejido, implantes quirúrgicos, implantes dentales, recubrimientos óseos, apósitos tópicos, barreras de tejido, barrera de órganos, esponjas y similares. El biomaterial de la invención puede fijarse a superficies como metales, polímeros sintéticos como silicona y cerámicas como implantes cerámicos. El biomaterial de la invención puede mezclarse con películas adhesivas de apósitos, como adhesivos de acrilato y adhesivos de silicona.

En otros aspectos de la presente invención, el biomaterial puede proporcionarse como un dispositivo oclusivo que comprende una estructura oclusiva y la matriz de colágeno, en donde el biomaterial tiene superficies opuestas de manera que una superficie del biomaterial se fija a una superficie de la estructura oclusiva, que es permeable a los líquidos y gases, que está adaptada la otra superficie de la matriz para recubrimiento y estar en contacto con el tejido. En tales aspectos, el dispositivo oclusivo puede ser una película de polímero que sea permeable a los líquidos y gases o puede estar equipada con poros u orificios o hendiduras para hacerla permeable a gases y líquidos.

El biomaterial de colágeno bioactivo de la invención también puede fabricarse como un dispositivo junto con otros materiales tales como, entre otros, metales útiles como implantes dentales y ortopédicos, láminas de polímero, películas, hilos, membranas o mallas de silicona, poliuretano, polietileno, fibras poliméricas, nailon, seda, celulosa y sus combinaciones. La fabricación puede llevarse a cabo al modificar químicamente la superficie del otro material mediante métodos de modificación química, irradiación gamma, descarga de plasma o corona y/o luz ultravioleta para que se introduzcan grupos reactivos en la superficie del material.

El biomaterial de colágeno bioactivo de la invención se fabrica como se define en las reivindicaciones. Las presiones adecuadas son alrededor de 10-5 mm o más.

El biomaterial de colágeno bioactivo comprende colágeno nativo, colágeno desnaturalizado y colágeno hidrolizado, cada uno con motivos RGD expuestos para la activación celular. Cualquiera de los colágenos para usar en el biomaterial puede ser de cualquier fuente humana y/o animal. En aspectos se usan fuentes bovinas y porcinas. Puede fabricarse o comprar de una fuente comercial. El colágeno nativo puede ser colágeno tipo 1 que también sirve para aumentar la estabilidad mecánica del biomaterial y para reducir su velocidad de resolución por el cuerpo.

En aspectos de la invención, el colágeno de Tipo 1 se desnaturaliza mediante el uso de cualquier método bien conocido. Por ejemplo, el colágeno se desnaturaliza por exposición al calor a 100 °C en solución acuosa durante varios períodos de tiempo. El colágeno tipo 1 también puede desnaturalizarse al hervirlo en ácido acético 0,02 M u otro método apropiado. Alternativamente, el colágeno de Tipo 1 natural, desnaturalizado o hidrolizado puede adquirirse de un fabricante apropiado como se conoce.

En aspectos de la invención, las soluciones de colágeno nativo, desnaturalizado e hidrolizado se mezclan en diversas cantidades para producir una composición de colágeno que comprende cualquier combinación de colágeno nativo y colágeno desnaturalizado e hidrolizado.

El colágeno nativo se desnaturaliza durante el procedimiento de liofilización al elevar la temperatura en una cantidad adecuada para efectuar la desnaturalización del colágeno nativo, para exponer así los motivos RGD. Esto se efectúa mediante el uso de la técnica de procesamiento DHT. El DHT se efectúa para proporcionar la cantidad deseada de exposición RGD mientras se mantiene algo de la estructura de triple hélice para la estabilidad. La presión y la temperatura reducidas se efectúan para proporcionar un contenido de humedad de aproximadamente por encima del 1 % durante un tiempo, temperatura y presión para provocar la desnaturalización y la reticulación deseados. Esto no se ha realizado previamente de manera que produzca un biomaterial que sea bioactivo y útil para la reparación de heridas, la adhesión celular, el cierre de heridas y/o la angiogénesis.

En aspectos de la invención, la solución de proteína preferida contiene tanto colágeno nativo como desnaturalizado, de manera que la relación de colágeno nativo: colágeno desnaturalizado: colágeno hidrolizado es, entre otras, las siguientes relaciones:1:0:0,1:1:1,1:2:1,1:3:1,1:4:1,1:5:1, 5:1:0,4:1:1, 3:1:1, 2:1:1, 0:2:1, 0:3:1, 0:4:1, y 0:5:0.

Se entiende que puede usarse cualquier combinación de colágenos para poner en práctica las modalidades de la presente invención. La cantidad total de colágeno en el biomaterial final es de al menos un 55 % en peso. Las relaciones proporcionadas sirven solo como pautas y uno no debe estar limitado por ninguna relación en particular. Los solventes adecuados para usar en la fabricación de la composición de biomaterial de colágeno bioactivo se seleccionan del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, isopropanol, sulfuro de dimetilo (DMS) y sus mezclas. Los solventes pueden proporcionarse en cualquier cantidad, como entenderá un experto en la técnica, ya que el solvente se evaporará en el biomaterial final. En aspectos de la invención, el solvente es agua o, si se usa además de un solvente orgánico polar, la relación de solvente es típicamente de aproximadamente 9:1, agua a disolvente orgánico polar, en la mezcla final. La solución/suspensión de colágeno nativo y/o colágeno desnaturalizado y/o colágeno hidrolizado se mezclan con el solvente y se congelan y liofilizan.

Antes de la congelación y liofilización, pueden añadirse agentes y/o polímeros biológicos adecuados. Alternativamente, dichos agentes y/o polímeros biológicos pueden proporcionarse después de la liofilización al sumergir el biomaterial así formado en una solución adecuada o sumergirlo en ella. Dichos agentes pueden proporcionarse en cantidades deseadas de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 5 % o más en peso del biomaterial.

Los agentes químicos adecuados para incorporar al biomaterial son quelantes de metales (como por ejemplo EDTA), antisépticos, antimicrobianos (por ejemplo, PHMB), productos farmacéuticos, agentes cosméticos, péptidos, factores de crecimiento, esteroides, células y sus combinaciones.

Más específicamente, los agentes cosméticos pueden incluir ingredientes activos destinados a ser aplicados externamente a humanos con el fin de limpiar, cuidar o influir en la apariencia o el olor corporal o para impartir impresiones de olor, a menos que estén destinados principalmente a aliviar o eliminar enfermedades, dolencias, lesiones físicas o dolencias patológicas. Dentro de este contexto, los materiales de acuerdo con la invención para uso cosmético son, por ejemplo, agentes para el lavado y limpieza de la piel, agentes para el cuidado de la piel, en particular agentes para el cuidado de la piel del rostro, cosméticos para los ojos, agentes para el cuidado de los labios, agentes para el cuidado de las uñas, agentes para el cuidado de los pies, agentes despigmentantes, desodorantes, antihidróticos, o dichos agentes en combinación. El uso como apósito cosmético o mascarilla también está dentro del alcance de la invención.

La actividad terapéutica dermatológica incluye: agentes antiacné, agentes antimicrobianos, antitranspirantes, astringentes, desodorantes, agentes depilatorios, agentes acondicionadores para la piel, agentes suavizantes de la piel, agentes para aumentar la hidratación de la piel como, por ejemplo, dexpantenol (pantenol, pantotenol), glicerol o urea así como también otros NMF (factores naturales de hidratación) como, por ejemplo, ácido pirrolidonacarboxílico, ácido láctico y aminoácidos, filtros solares, queratolíticos, aceptores de radicales libres, antioxidantes, antiseborreicos, anticaspa, ingredientes activos antisépticos, ingredientes activos para tratar los signos del envejecimiento de la piel y/o agentes que modulan la diferenciación y/o proliferación y/o pigmentación de la piel, inhibidores de proteasa, por ejemplo inhibidores de MMP (matriz metaloproteinasa), inhibidores de la glicación para reducir la formación de AGE (sustancias finales de la glicación avanzada), vitaminas como la vitamina C (ácido ascórbico) y sus derivados, como, tal como, por ejemplo, glucósidos tales como glucósido de ascorbilo, o ésteres de ácido ascórbico tales como fosfato de ascorbilo de sodio o magnesio o palmitato y estearato de ascorbilo, ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico, sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y potasio, de fosfato de ácido L-ascórbico ésteres; sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de magnesio y calcio, de ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico; sales de metales trivalentes, tales como sales de aluminio, de ésteres de fosfato de ácido L-ascórbico; sales de metales alcalinos de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico, tales como sales de sodio y potasio de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico; sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de magnesio y calcio, de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico; sales de metales trivalentes, tales como sales de aluminio, de ésteres de sulfato de ácido L-ascórbico; sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y potasio, de ésteres de ácido L-ascórbico; sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de magnesio y calcio, de ésteres de ácido L-ascórbico; y sales de metales trivalentes, tales como sales de aluminio, de L-ésteres de ácido ascórbico, cualquier péptido natural, idéntico a la naturaleza y artificial como, por ejemplo, neuropéptidos, péptidos antimicrobianos y matrikinas con y sin modificación por enlace covalente a un ácido graso o esterificación.

Agentes que tienen un efecto secundario irritante, tales como alfa-hidroxiácidos, p-hidroxiácidos, a-cetoácidos, pcetoácidos, retinoides (retinol, retinal, ácido retínico), antralinas (dioxiantranol), antranoides, peróxidos (benzoil peróxido), minoxidil, sales de litio, antimetabolitos, vitamina D y sus derivados; catecoles, flavonoides, ceramidas, ácidos grasos poliinsaturados y ácidos grasos esenciales.

Los agentes farmacéuticos (medicamentos) son aquellos que, dentro de la significación de la ley farmacéutica, están destinados, entre otras cosas, a curar, aliviar o prevenir enfermedades, dolencias, lesiones físicas o afecciones patológicas. Son adecuados de acuerdo con la invención en particular aquellos agentes e ingredientes activos destinados a la aplicación externa o transdérmica, en particular en el campo del tratamiento y cicatrización de heridas y en el campo del tratamiento de quemaduras, en particular para primeros auxilios para quemaduras.

Los agentes para la aplicación dérmica o transdérmica son, en particular, principios activos dérmicos pero también ingredientes activos transdérmicos. Que incluye, por ejemplo: agentes para el tratamiento de quemaduras, agentes para el tratamiento de enfermedades de la piel, analgésicos para aplicación externa, por ejemplo, dextropropoxifeno, pentazocina, petidina, buprenorfina; antirreumáticos/antiflogísticos (antiinflamatorios) (NSA^r ), por ejemplo, incienso o extracto de incienso, indometacina, diclofenaco, naproxeno, ketoprofeno, ibuprofeno, flurbiprofeno, ácido salicílico y sus derivados, como ácido acetilsalicílico, oxicams; hormonas esteroides, por ejemplo corticoides y glucocorticoides tales como hidrocortisona, cortisol, acetato de cortisona, cloprednol, prednisona, prednisolona, deflazacort, fluocortolona, triamcinolona, betametasona, valerato de betametasona, furoato de mometasona, dexametasona, metilprednisolona, etinilestradiol, medroergotamina, dihidroergotoxina; agentes antigotosos, por ejemplo, benzbromarona, alopurinol; agentes dérmicos externos, antihistamínicos tales como bromfeniramina, bamipina; antibióticos tales como eritromicina, clindamicina, tetraciclina, que incluyen agentes antibacterianos tales como, por ejemplo, plata coloidal y sales de plata tales como cloruro de plata, nitrato de plata, yoduro de plata u otros agentes para el tratamiento de heridas que contienen plata conocidos del estado de la técnica; antimicóticos, medicamentos peptídicos, ingredientes activos antivirales, ingredientes activos antiinflamatorios, ingredientes activos antipruriginosos tales como ingredientes activos anestésicos, por ejemplo, antihistamínicos, benzocaína, polidocanol o corticoides y glucocorticoides; agentes contra el acné; ingredientes activos antiparasitarios; hormonas para aplicación externa; terapia de venas; inmunosupresores tales como inhibidores de la calcineurina tales como tacrolimus y pimecrolimus, sustancias minerales y elementos trazas, tales como, por ejemplo, compuestos de selenio inorgánicos u orgánicos, zinc y sales de zinc, etc., todos para aplicación dérmica o transdérmica.

Los agentes pueden seleccionarse del grupo de lípidos similares a la piel, que comprende, por ejemplo, fosfolípidos, lípidos neutros y esfingolípidos, así como también componentes del factor de hidratación natural (NMF) de la piel, que comprende, por ejemplo, urea, aminoácidos y ácidos carboxílicos, ácido pirrolidonacarboxílico, sodio, potasio, calcio, magnesio, lactato (ácido láctico), citrato, cloruro, fosfato, etc., ácido úrico y otros ácidos orgánicos.

Además, se prefieren especialmente aquellos ingredientes activos que se usan en el campo del tratamiento de heridas, en particular para el tratamiento de heridas crónicas, decúbito, Ulcus cruris, síndrome del pie diabético, etc., como, por ejemplo, analgésicos, por ejemplo inmunosupresores, hormonas, ingredientes activos anestésicos, ingredientes activos antiparasitarios, fungicidas o antimicóticos y antibacterianos, como en particular plata, que contienen ingredientes activos como, por ejemplo, nitrato de plata, cloruro de plata, yoduro de plata, micropartículas de plata u otra plata -que contengan sustancias para el tratamiento de heridas conocidas del estado de la técnica, ingredientes activos para apoyar y regular el entorno de la herida como, en particular, electrolitos, sílice, sustancias minerales y elementos trazas como, por ejemplo, potasio, magnesio, calcio, selenio, yodo, etc., ingredientes activos para conseguir un desbridamiento de heridas como, por ejemplo, colagenasas u otros e proteolíticos adecuados enzimas conocidas en el estado de la técnica, así como también ingredientes activos para ayudar a la cicatrización de la herida como, por ejemplo, factores de crecimiento, inhibidores de enzimas, proteínas de matriz o constituyentes de matriz extracelular o constituyentes proteicos y peptídicos solubles (de bajo peso molecular), tipos de colágeno distintos de los colágenos de tipo I, III y V ya contenidos en la suspensión de colágeno usada de acuerdo con la invención.

Agentes particularmente útiles del campo de los agentes para el tratamiento de heridas se seleccionan de ingredientes activos que contienen plata tales como en particular nitrato de plata, cloruro de plata, micropartículas de plata, tacrolimus, pimecrolimus, antihistamínicos, polidocanol, incienso/extracto de incienso, capsaicina, tanino, aceite de hierba de San Juan/Extracto de hierba de San Juan, aceite de onagra, dexpantenol, así como también compuestos de selenio inorgánicos u orgánicos, zinc y sales de zinc.

Otros agentes útiles son aquellos del grupo de los ingredientes activos proteinogénicos, que comprenden preferentemente factores de crecimiento, hormonas proteinogénicas, enzimas, coenzimas, glicoproteínas, factores de coagulación sanguínea, otras citocinas y variantes de los ingredientes activos mencionados anteriormente preparados por técnicas recombinantes.

Los factores de crecimiento que pueden usarse de acuerdo con la invención se seleccionan del grupo que consiste en VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico), FGF-1 (factor de crecimiento de fibroblastos ácido), TGF-p, TGF-a (factor de crecimiento transformante p o a), EGF (factor de crecimiento endotelial), HGF (factor de crecimiento de hepatocitos), TNFa (factor de necrosis tumoral a), IGF I y II (factor de crecimiento similar a la insulina/factor de crecimiento ligado a la insulina I y II), factor de crecimiento I y II de unión a heparina, PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), PD-ECGF (factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas), BMP (factor de crecimiento morfogenético óseo), GHRP (factor de liberación de la hormona del crecimiento), factor A inductor de cartílago y B, factores de crecimiento óseo, interleucina 8, angiopoyetina, angiogenina, aprotinina y vWF (factor de von Willebrand).

Las glicoproteínas como ingredientes activos incluyen, por ejemplo, inmunoglobulinas y anticuerpos. Otras citocinas como ingredientes activos incluyen, por ejemplo, interleucinas e interferón. Otros ingredientes activos son aquellos que tienen una acción hemostática, como factores de coagulación de la sangre como, por ejemplo, trombina, fibrinógeno o sulfato de colesterilo (por ejemplo, sulfato de colesterilo sódico), o ingredientes activos que tienen una acción activadora sobre factores y sustancias del sistema extrínseco y/o cascada de coagulación intrínseca, tal como, por ejemplo, fosfolípidos, caolín, aprotinina, concentrados de factor o factores, factor tisular o iones de calcio. El material de colágeno per se también puede tener ciertas acciones terapéuticas, como en particular una acción hemostática o un efecto positivo de asistencia en la cicatrización de la herida. Sin embargo, no es un ingrediente activo dentro de la significación de la invención.

Los agentes mencionados anteriormente pueden añadirse y están presentes en el biomaterial de colágeno reticulado solos o en una combinación de una pluralidad de ingredientes activos, en aspectos en una cantidad de ventajosamente hasta 40 % en peso, o hasta 6o % en peso, o hasta 80 % en peso, basado en el producto final liofilizado. En un aspecto, el agente farmacéutico, químico y/u otro puede incorporarse en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 0,01 %, 0,01 % a aproximadamente 1,0 % o 1,0 %-10 % en el paso de formulación inicial o aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 25 % después de la liofilización. En otro aspecto, la matriz liofilizada puede remojarse en una solución del agente farmacéutico, químico y/o de otro tipo deseado y luego la matriz puede usarse después del remojo o puede volverse a liofilizar.

El biomaterial de colágeno bioactivo de la invención comprende polihexametilenbiguanida (PHMB) y puede comprender además N-(3-aminopropil)-imidodicarbonimidica diamida, o también conocida como polihexanida Poli(hexametilenbiguanida clorhidrato), poli(iminocarbonimidoiliminocarbonimidoilimino-1,6-hexanodiil) clorhidrato, Clorhidrato de poli(iminoimidocarbonilo-iminoimidocarbonilo-iminohexametileno), Clorhidrato de poli(iminoimidocarboniloliminoimidocarboniliminohexametileno, con los siguientes nombres comerciales, Baquacil, Caswell No. 676, Cosmocil CQ, Código químico de plaguicidas de la EPA 111801, Polihexanido, Polihexanidum, PP 073 y UNII-322U039G como un agente antiséptico para impedir la colonización del biomaterial de colágeno mientras protege la superficie de la piel o herida de la contaminación microbiana, o reduce la flora microbiana dentro de la herida. El PHMB se añade en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 5 % del biomaterial.

El biomaterial de la invención comprende además ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), un quelante de metales en combinación con el PHMB como agente conservante añadido en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 5 % del biomaterial.

En las modalidades, por ejemplo, para heridas, los agentes para usar junto con la presente invención incluyen, entre otros, células, células madre, factores angiogénicos tales como VEGF, factores de crecimiento derivados de plaquetas, hormonas de crecimiento, antisépticos, gluconato de polihexametilbiguanida, gluconato de clorohexidina, triclosán, povidona-yodo, lactato de plata o agentes tales como antibióticos, inmunosupresores, agentes antiproliferativos, agentes antiinflamatorios, antivirales, células y sus combinaciones.

La selección del agente a usar con la matriz de la invención dependerá de su uso final. Por ejemplo, si se usa para el tratamiento de úlceras cutáneas relacionadas con la diabetes, puede proporcionarse a la matriz un agente antimicrobiano, preferentemente PHMB y al menos EDTA, antes y/o después de la liofilización; o un factor angiogénico como hormonas de crecimiento humano o factores de crecimiento derivados de plaquetas, o lisado derivado de plaquetas puede añadirse a la matriz antes o después de la liofilización.

En otros aspectos de la invención, pueden añadirse polímeros y otras proteínas. Pueden incorporarse polímeros biocompatibles en el biomaterial. Los polímeros adecuados para su uso pueden seleccionarse del grupo que consiste en quitosano, celulosa, ácido hialurónico, sulfato de condroitina, carboximetilcelulosa y sus mezclas.

Pueden agregarse plastificantes opcionales a la composición de la invención y se seleccionan de glicerol, polietilenglicol y sorbitol y se proporcionan en la fase no entrecruzada del biomaterial, en un intervalo de aproximadamente 1-20 % en peso del peso total del material, o de aproximadamente 5 a 10 % en peso, o en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 % en peso. La cantidad presente en el producto liofilizado final es la misma cantidad proporcional una vez eliminado el solvente.

En algunos aspectos, pueden añadirse proteínas formadoras de estructuras tales como proteínas de matriz, constituyentes de la matriz extracelular o constituyentes proteicos y peptídicos solubles (de bajo peso molecular), preferentemente del grupo que comprende elastina, hidrolizados de elastina, glicosaminoglicanos, tales como sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, queratán sulfato, heparina y ácido hialurónico, proteoglicanos, como agrecano, fibromodulina, decorina, biglicano, versicano, perlecano, proteoglicano de membrana basal de alta densidad, sindecano y serglicina, fibrina, fibronectina, glucanos, como paramilón, etc. Los constituyentes de la matriz extracelular y los agentes formadores de estructuras de ese tipo más particularmente preferidos son la elastina y los hidrolizados de elastina, el ácido hialurónico y la fibronectina.

En el biomaterial liofilizado, tales proteínas pueden representar en total hasta aproximadamente el 10 % en peso, o hasta el 20 % en peso, en base a la masa seca del producto final liofilizado.

Para su uso en la terapia de heridas, la exposición de las células al colágeno y, más específicamente, a los materiales de colágeno especialmente configurados que tienen colágeno desnaturalizado, en forma de almohadillas, esponjas, espumas, gránulos, hidrogeles, lodos y similares, como tejidos o coberturas para heridas expondrían los bordes de la herida no avanzados a la secuencia de aminoácidos RGD y ayuda a promover y acelerar el cierre de la herida. De manera similar, al exponer las células madre a las secuencias rGd en almohadillas de colágeno desnaturalizado, esponjas, espumas, gránulos, hidrogeles, lodos y similares, se uniría a las integrinas avp3 de las células y se activarían las células. Por lo tanto, al colocar células madre en el lecho de una herida y subsecuentemente cubrir el lecho de la herida con material de colágeno preparado con DHT, se espera que se produzca una cicatrización de la herida acelerada. Además, se espera que las células residentes dentro del lecho de la herida, tal como fibroblastos, plaquetas, queratinocitos, células endoteliales, granulocitos, etc. entren en contacto con el colágeno tratado con DHT y se activen a través del contacto de sus integrinas con sus ligandos dentro del colágeno desnaturalizado. Si bien no se adscribe a ninguna teoría en particular de un conjunto de teorías, las células, que incluye las células madre expuestas a la secuencia RGD, se activan bioquímicamente para promover mejor la regeneración de tejidos, la angiogénesis, la deposición de colágeno por parte de los fibroblastos y el cierre de heridas por parte de fibroblastos y otras células.

También se divulga el biomaterial de colágeno bioactivo de acuerdo con la invención para su uso en al menos una indicación o aplicación seleccionada del siguiente grupo, las cuales consisten de: tratamiento de heridas agudas o crónicas, mejora de la cicatrización de la herida, compensación de defectos tisulares, revestimiento de defectos profundos de la piel mientras aumenta el volumen, ayuda a la regeneración de tejidos, regeneración de la dermis, tratamiento de quemaduras, uso en cirugía plástica, uso después de la escisión de cicatrices, terapia combinada con trasplantes autólogos de piel dividida, ayuda a la formación de tejido de granulación, ayuda a la angiogénesis, asegura una mejor calidad de la cicatriz, tratamiento de heridas crónicas como Ulcus cruris, decúbito y pie diabético, tratamiento de heridas abiertas, tratamiento de trastornos de cicatrización de la herida, tratamiento de enfermedades con defectos profundos de la piel, producción de un implante de mandíbula, producción de un implante óseo, producción de un implante de cartílago, producción de un implante de tejido, producción de un implante de piel, producción de un apósito médico, producción de un apósito transdérmico, producción de un vendaje para heridas, producción de un material para vendajes para heridas, producción de un apósito y producción de una matriz de cultivo celular para la multiplicación celular para la implantación de unidades de matriz celular, y en biotecnología en la producción de sistemas modelo para la reproducción in vitro de sistemas de tejidos (por ejemplo, modelo de piel) para la investigación básica, diagnóstico y análisis.

Además, el biomaterial de acuerdo con la invención también puede usarse en la terapia de tratamiento de heridas asistida por vacío, como se conoce en principio por el estado de la técnica y como se describió, por ejemplo, en el documento US 2007/0027414. Debido a que el biomaterial de acuerdo con la invención puede ser flexible, puede introducirse con éxito en el lecho de la herida en un tratamiento de vacío de este tipo, donde ayudan positivamente a eliminar el exceso de fluidos de la herida debido a sus buenas propiedades de absorción e hidratación. El transporte del exudado ya se logra, por un lado, mediante el material de matriz de colágeno poroso y permeable debido a su hidrofilicidad e hinchabilidad fundamentalmente altas. Además, el biomaterial de acuerdo con la invención tiene una alta porosidad, como consecuencia del proceso de liofilización, lo que facilita adicionalmente el paso de líquidos. Es una ventaja adicional que el biomaterial de colágeno de acuerdo con la invención per se ya tenga una influencia positiva en el proceso de cicatrización de la herida, en particular también debido al colágeno soluble de manera liberable, el péptido RGD y los componentes proteicos contenidos en él.

La reticulación sirve para aumentar la estabilidad mecánica del biomaterial y para reducir la velocidad de reabsorción por el cuerpo. La reticulación puede lograrse químicamente con aldehídos (por ejemplo, formaldehído, glioxal, glutaraldehído o aldehído almidonado, o similares), diisocianatos (por ejemplo, hexametilendiisocianato), carbodiimidas (por ejemplo, [1-etil-3(3-dimetilaminopropil) carbodiimida]- hidrocloruro (EDC)), o succinimidas (por ejemplo, N-hidroxisuccinimida (NHS)), poliaziridinas, diglicidil éteres y sus mezclas.

La reticulación puede lograrse mediante la reacción de condensación termodinámicamente endotérmica (deshidratación) bajo calor y vacío conocida como reticulación deshidrotérmica (DHT). La DHT puede usarse como efecto desnaturalizante del procesamiento de DHT a temperaturas y condiciones que desnaturalizan y/o gelatinizan el colágeno nativo de una manera que mantiene una cantidad adecuada de propiedades físicas, pero también suficiente desnaturalización para exponer los motivos RGD. Así, en la fabricación del biomaterial de colágeno bioactivo de la presente invención, el colágeno, esté desnaturalizado o no, se estabiliza químicamente mediante un proceso conocido como reticulación. La reticulación también puede lograrse mediante muchos métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. En esta invención, la reacción de condensación (deshidratación) endotérmica termodinámicamente desfavorable bajo calor y vacío, conocida como reticulación deshidrotérmica (DHT), es el método de reticulación, ya que conduce a la desnaturalización de la estructura helicoidal triple del colágeno nativo y la exposición de residuos crípticos de RGD. El uso de DHT se efectúa a temperaturas, presiones y tiempos para efectuar la exposición de los motivos RGD mientras se mantiene cierta integridad estructural del colágeno de manera que pueda formar un biomaterial para usar en una variedad de aplicaciones clínicas. El DHT se hace para reducir el contenido de humedad para el enlace reticulado, pero se proporciona suficiente humedad para desnaturalizar el colágeno y exponer el motivo RGD. Las temperaturas adecuadas son de aproximadamente de 45 °C a aproximadamente 180 °C durante varias horas a un vacío adecuado de alrededor de 10-5 mm de mercurio. Se desea un contenido de humedad de aproximadamente al menos 1 %, al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 3 % o más en peso del biomaterial final.

Si bien no hace referencia a ninguna teoría en particular, el biomaterial producido por el procesamiento de colágeno DHT a temperaturas superiores a 100 °C, cuando se aplica al tejido, como una herida abierta, actúa como un recubrimiento de tejido que impide la contaminación microbiana, absorbe el exudado de la herida y funciona como depósito para las células dentro del lecho de la herida, factores bioquímicos esenciales, como enzimas, hormonas, aminoácidos, moléculas de señal celular, tales como RGD, moléculas de ECM y células que promueven efectos de activación biológica, tales como migración celular, remodelación de la ECM, angiogénesis y cierre de heridas.

De acuerdo con una modalidad de la invención, un biomaterial de colágeno bioactivo comprende colágeno nativo, desnaturalizado e hidrolizado mezclado con carboximetilcelulosa, o alginato, y/o biocelulosa, y/o polímeros sintéticos en una única matriz, almohadilla, esponja, película u otra configuración que tenga tripéptidos RGD crípticos y no crípticos en cantidades variables y colágeno fibrilar nativo en cantidades variables, y carboximetilcelulosa, y/o alginato, y/o biocelulosa o sus combinaciones en varias cantidades que no están reticuladas y se mezcla además el antiséptico polihexametilenbiguanida (PHMB) y EDTA. La matriz se liofiliza de manera que no contenga cantidades sustanciales de solvente y comprende una mezcla de colágeno nativo, desnaturalizado e hidrolizado, polímeros biocompatibles, PHMB, EDTA y terapias o células opcionales.

Al comprender el alcance de la presente solicitud, los artículos "un", "una", "el" y "dicho" pretenden significar que hay uno o más de los elementos. Adicionalmente, el término "que comprende" y sus derivados, como se usa en la presente descripción, están destinados a ser términos abiertos que especifican la presencia de las características de las etapas, elementos, componentes, grupos, enteros y/o etapas establecidas, pero no excluyen la presencia de otras características no de las etapas, elementos, componentes, grupos, enteros y/o etapas. Lo anterior también se aplica a palabras que tienen significados similares, como los términos "que incluye", "que tiene" y sus derivados. Se debe entender que cualquier aspecto descrito como "que comprende" ciertos componentes también puede "consistir en" o "consistir esencialmente en", en donde "que consiste de" tiene un significado cerrado o restrictivo y "que consiste esencialmente en" significa que incluye los componentes especificado pero que excluye otros componentes, excepto los materiales presentes como impurezas, los materiales inevitables presentes como resultado de los procesos usados para proporcionar los componentes y los componentes agregados con un propósito distinto al de lograr los efectos técnicos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, una composición definida mediante el uso de la frase “que consiste esencialmente en” abarca cualquier aditivo, excipiente, diluyente, portador y similares farmacéuticamente aceptables conocidos. Típicamente, una composición que consta esencialmente de un conjunto de componentes comprenderá menos del 5 % en peso, normalmente menos del 3% en peso, más típicamente menos del 1 % en peso de componentes no especificados.

Se debe entender que cualquier componente definido en la presente descripción como incluido puede excluirse explícitamente de la invención reivindicada por medio de condición o limitación negativa. Por ejemplo, en algunos aspectos, algunos de los componentes enumerados, si se desea, pueden excluirse explícitamente de las composiciones y métodos descritos en la presente descripción.

En adición, todos los intervalos dados en la presente descripción incluyen el final de los intervalos y también cualquier punto intermedio de los intervalos, ya sea explícitamente en una etapa o no.

Finalmente, los términos de grado tales como "sustancialmente", y "aproximadamente" como se usa en la presente descripción significan una cantidad razonable de desviación del término modificado de manera que el resultado no cambie significativamente. Estos términos de grado pueden interpretarse como que incluyen una desviación de al menos ±5 % del término modificado si esta desviación no niega el significado del término que modifica.

La descripción anterior generalmente describe la presente invención. Se puede obtener una comprensión más completa al hacer referencia a los siguientes Ejemplos específicos. Estos Ejemplos se describen solamente para propósitos de ilustración y no se destinan a limitar el alcance de la invención. Se contemplan cambios en la forma y la sustitución de equivalentes, ya que las circunstancias pueden sugerir o hacerlo conveniente. Aunque se han empleado términos específicos en la presente descripción, tales términos están destinados en un sentido descriptivo y no con fines de limitación.

Ejemplos

Ejemplo 1

Soluciones de colágeno: las soluciones de colágeno tipo 1 pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos, como se conoce en la técnica anterior. Las soluciones de colágeno pueden prepararse en cualquier concentración que se considere adecuada para el propósito específico que es generalmente aceptable en la técnica anterior.

Fabricación de andamios: los andamios se producen al liofilizar una suspensión de colágeno. La preparación de soluciones de colágeno con y sin materiales poliméricos añadidos es generalmente conocida (los documentos US 4970298; US 4703108; US 2559395 y US 2011/0097402).

En resumen, los andamios de colágeno pueden prepararse al volver a disolver una solución de colágeno liofilizada al 0,6 % p/v en ácido acético 0,05 M u otra solución de ácido adecuada. Los aditivos, como la carboximetilcelulosa, el sulfato de condroitina, el alginato u otro material polimérico, pueden mezclarse o combinarse con la solución de colágeno. La mezcla puede mezclarse o agitarse con una licuadora (7000-15000 rpm) a una temperatura adecuada que oscila entre 4 °C-25 °C, o superior según corresponda, asegurar una mezcla adecuada en el caso de una suspensión y adicionalmente desgasificado al vacío. La mezcla se almacena a 4 °C durante al menos 1 hora a varias horas, hasta toda la noche. La solución se liofiliza en una bandeja de metal (12 cm x 12 cm) y se enfría a -40 °C a 0,9 °C/min en un liofilizador. Después de la congelación, los cristales de hielo se eliminaron mediante sublimación durante 17 horas a 0 °C y 200 mTorr. Este proceso produce una lámina altamente porosa de biomaterial de colágeno. Después de que las muestras de liofilización se prepararon para el procesamiento de DHT dentro de un horno de vacío, 105 °C-180 °C bajo un vacío de 0,05 bar. La reticulación se logró mediante reticulación deshidrotérmica. En la reticulación deshidrotérmica, la espuma liofilizada porosa se deshidrató para reducir el contenido de humedad a la temperatura a la que se produce la reticulación, aproximadamente 1-2 % de humedad, o aproximadamente 5-10 % de humedad o aproximadamente 15 % de humedad. El producto se sometió a temperaturas elevadas y/o condiciones de vacío hasta que se produjo dicha reticulación. Las combinaciones útiles de tales condiciones incluyen vacío de al menos alrededor de 105 mm de mercurio, y temperaturas de al menos unos 45 °C, al ser la temperatura de transición a la que se desnaturaliza el colágeno nativo. Se prefiere que la reticulación efectiva se logre por exposición a temperaturas de aproximadamente de 115 °C a aproximadamente de 125 °C durante períodos de aproximadamente de tres a alrededor de cuatro horas, hasta 24 horas. En algunos aspectos, la reticulación se produce a temperaturas de aproximadamente 150 °C a aproximadamente 180 °C durante varias horas.

Ejemplo 2

Haugh y otros (2009) describieron la fabricación de andamios de colágeno. Los biomateriales bioactivos de la invención se produjeron mediante liofilización de una suspensión de GAG de colágeno. Para preparar el componente acuoso, se mezclaron colágeno bovino tipo I (Integra Life Sciences, Plainsboro, NJ), sulfato de condroitina-6 (Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) y ácido acético glacial 0,05 M a 15000 rpm mediante el uso de una licuadora superior (Ultra TurraxT18, IKAWorks Inc., Wilmington, NC). La mezcla se llevó a cabo en un vaso de reacción, que se mantuvo a 4 °C mediante el uso de un sistema de refrigeración por circulación (WKL 230, Lauda, Alemania). La suspensión de colágeno-GAG resultante contenía 0,5 % (p/v) de colágeno y 0,044 % (p/v) de sulfato de condroitina-6. A continuación, la suspensión se desgasificó en un desecador al vacío durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire de la solución. Brevemente, se pipetearon 67,25 ml de la suspensión de colágeno-GAG en una bandeja de acero inoxidable ( 5 x 5 pulgadas, grado 304 SS). La bandeja se colocó en el estante del liofilizador (Advantage EL, VirTis Co., Gardiner, NY) y se enfrió a -40 °C a 0,9 °C/min. Este protocolo de congelación produce andamios con un tamaño medio de poro de alrededor de 96 pm. Una vez completada la congelación, los cristales de hielo se eliminaron por sublimación durante 17 h a 0 °C y 200 mTorr. Este proceso produjo una lámina altamente porosa de andamio Cg (biomaterial). El tratamiento DHT se llevó a cabo al colocar los andamios en un paquete de papel de aluminio dentro de un horno de vacío (Vacucell 22, MMM, Alemania) bajo un vacío de 0,05 bar. Para determinar el efecto de los parámetros de DHT sobre las propiedades del armazón CG, se variaron el período de exposición y la temperatura de reticulación. El período de exposición se varió de 24 h a 120 h, a intervalos de 24 h, y se usaron cuatro temperaturas de reticulación: 105 °C, 120 °C, 150 °C y 180 °C. La esterilización típicamente ocurre después de una exposición de aproximadamente tres a aproximadamente cuatro horas a 160?C o durante períodos de aproximadamente 24 horas a aproximadamente cuarenta horas a una temperatura de aproximadamente 125 °C. Se usaron diferentes temperaturas de reticulación, superiores a 90 °C, aunque se prefieren temperaturas de reticulación en el intervalo de 100 °C a 120 °C y se prefieren más temperaturas de reticulación de 120 °C a 150 °C, y temperaturas de reticulación de 170 °C-180 °C son los más preferidos. Los biomateriales de la invención, tal como se fabrican en la presente descripción, contienen un 25 % de colágeno desnaturalizado después del tratamiento a 105 °C durante 24 h y un 60 % de colágeno desnaturalizado después de un tratamiento extensivo a 180 °C durante 120 h. Los biomateriales que tienen un 60 % de colágeno desnaturalizado son una modalidad de la invención deseada. Las pruebas realizadas demuestran que el biomaterial de la invención exhibe los efectos celulares deseados.

También se prepararon los compuestos acuosos que comprende mezclas de colágeno tipo I junto con fuentes de motivos RGD expuestos, como colágeno desnaturalizado y/o colágeno hidrolizado, y luego se trataron más como se indicó anteriormente (secado por congelación y reticulado) para formar biomateriales como se describe en la presente descripción con las propiedades de estructura deseadas y la función es estable, bioactiva, biodegradable y bioabsorbible.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un biomaterial de colágeno bioactivo que comprende:

(a) colágeno nativo, colágeno desnaturalizado y colágeno hidrolizado, cada uno de dichos colágeno nativo, colágeno desnaturalizado y colágeno hidrolizado tiene motivos RGD expuestos para la activación celular; y

(b) polihexametilenbiguanida (PHMB) proporcionada en una cantidad de 0,001 % a 5 % en peso y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) proporcionado en una cantidad de 0,001 % a 5 % en peso;

en donde el biomaterial se produce mediante tratamiento deshidrotérmico (DHT) que expone motivos RGD en el colágeno nativo mientras mantiene la integridad física y la estabilización estructural, en donde la activación celular ocurre a través de motivos RGD que se unen a y activan receptores de integrina en células, tejidos y/u órganos cuando dicho biomaterial está en contacto con dichas células, tejidos y/u órganos.

2. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el colágeno nativo es colágeno fibrilar de tipo 1 y en donde el biomaterial comprende al menos un 55 % en peso de colágeno.

3. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el biomaterial no presenta ninguna modificación química.

4. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el biomaterial está liofilizado, tiene un contenido de humedad de 1 % hasta 15 % o 2 % hasta 15 % y es poroso con tamaños de poro en el intervalo de 0,1 |jm a 500 jm y es opcionalmente flexible.

5. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además uno o más agentes seleccionados del grupo que comprende plastificantes, quelantes, antisépticos, antimicrobianos, péptidos, factores de crecimiento, esteroides, células, proteínas formadoras de estructuras, agentes cosméticos, agentes antiinflamatorios, antibióticos, antivirales y sus combinaciones.

6. El biomaterial de acuerdo con la reivindicación 5, en donde:

(a) el plastificante se selecciona del grupo que comprende glicerol, polietilenglicol y sorbitol y el biomaterial comprende de 1 % a 20 % en peso del plastificante; y/o

(b) las proteínas formadoras de estructuras se seleccionan del grupo que consiste en proteínas de matriz; constituyentes de la matriz extracelular; y proteína de bajo peso molecular; constituyentes peptídicos; elastina; hidrolizados de elastina; glicosaminoglicanos seleccionados del grupo que consiste en sulfato de heparán, sulfato de condroitina, sulfato de dermatán, sulfato de queratán, heparina; proteoglicanos seleccionados del grupo que consiste en agrecano, fibromodulina, decorina, biglicano, versicano, perlecano, proteoglicano de membrana basal de alta densidad, sindecano y serglicinel; fibrina; fibronectina; y glucanos.

7. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además al menos un polímero biocompatible seleccionado del grupo que comprende carboximetilcelulosa, celulosa, ácido hialurónico, quitosano y sus mezclas.

8. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el biomaterial:

(a) está en una forma seleccionada del grupo que consiste en almohadillas, andamios, películas, revestimientos de tejidos, implantes quirúrgicos, implantes dentales, revestimientos óseos, apósitos tópicos, barreras de tejidos, barreras de órganos y esponjas; y/o

(b) forma parte de un dispositivo oclusivo que comprende una estructura oclusiva y el biomaterial, en donde el dispositivo oclusivo es una película de polímero que es permeable a gases y líquidos, o está equipada con poros u orificios o hendiduras para hacerla permeable a gases y líquidos; y/o

(c) se fabrica como un dispositivo junto con al menos otro material seleccionado del grupo que comprende metales útiles como implantes dentales y ortopédicos, láminas poliméricas, películas, hilos, membranas o mallas de silicona, poliuretano, polietileno, fibras poliméricas, nailon, seda, celulosa y sus combinaciones.

9. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para usar en terapia.

10. El biomaterial de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en el tratamiento de una herida o escisión, en donde el biomaterial está destinado al contacto con el borde de una herida que avanza para promover y/o acelerar el cierre de la herida.

11. Un método para fabricar un biomaterial de colágeno bioactivo que tiene motivos RGD expuestos para la activación celular, en donde la activación celular se produce a través de motivos RGD que se unen a y activan receptores de integrina en células, tejidos y/u órganos cuando dicho biomaterial está en contacto con dichas células, tejidos y/o u órganos, el método comprende:

mezclar colágeno fibrilar tipo 1 nativo, colágeno desnaturalizado y colágeno hidrolizado que tienen motivos RGD expuestos y un solvente seleccionado del grupo que consiste en agua, metanol, etanol, isopropanol, sulfuro de dimetilo (DMS) y mezclas de los mismos, para producir una mezcla;

reticular por tratamiento deshidrotérmico (DHT), en donde el tratamiento deshidrotérmico provoca la desnaturalización del colágeno nativo con la posterior exposición de motivos RGD previamente crípticos en el mismo, y provoca la estabilización estructural del biomaterial; y

liofilizar y/o reticular la mezcla, en donde la liofilización reduce el contenido de humedad de la mezcla del 2 % al 15 % o del 1 % al 15 % y en donde el biomaterial tiene tamaños de poro en el intervalo de 0,1 pm a 500 pm,

en donde el biomaterial de colágeno bioactivo puede proporcionarse en una forma seleccionada del grupo que consiste en almohadillas, andamios, películas, revestimientos de tejido, implantes quirúrgicos, implantes dentales, revestimientos óseos, apósitos tópicos, barreras de tejido, barreras de órganos y esponjas, en donde la mezcla comprende además:

antes y/o después de la liofilización y/o reticulación, mezclar polihexametilenbiguanida (PHMB) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).

12. El método de la reivindicación 11, en donde la mezcla comprende además:

antes y/o después de la liofilización y/o reticulación, mezclar uno o más agentes seleccionados del grupo que comprende plastificantes, quelantes, antisépticos, antimicrobianos, péptidos, factores de crecimiento, esteroides, células, proteínas formadoras de estructuras, plastificantes, quelantes, antisépticos, polímero biocompatible y sus combinaciones, opcionalmente en donde:

(i) el plastificante se selecciona del grupo que comprende glicerol, polietilenglicol y sorbitol;

(ii) las proteínas formadoras de estructuras se seleccionan del grupo que consiste en proteínas de matriz, constituyentes de la matriz extracelular y constituyentes proteicos y peptídicos de bajo peso molecular.