CN115154643B - 一种芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种芦荟多糖‑胶原蛋白复合敷料的制备方法及其应用，所述芦荟多糖‑胶原蛋白复合敷料采用以下步骤制得：提取(1)芦荟多糖β‑D‑乙酰化甘露聚糖；(2)采用“一步法”交联冻干成形制备所述敷料，为了优化支架的孔结构、增加支架的力学强度和抗降解能力，引入硫酸软骨素，将胶原溶液和硫酸软骨素溶液混合，胶原蛋白分子和硫酸软骨素分子经过静电相互作用复合沉积得到胶原‑软骨素复合液。胶原‑软骨素复合液与芦荟多糖混合均匀后冷藏，再冻干得所述芦荟多糖‑胶原蛋白复合敷料。所述敷料可应用于制备治疗烧烫伤创面、溃疡创面、创伤创面的药物或医疗器械中。
Description
技术领域
本发明涉及一种芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法及其应用。
背景技术
烧伤，特别是严重烧伤，机体会出现一系列免疫炎症反应、代谢性变化和不同程度的休克反应，最终导致多器官衰竭。皮肤是人体最大的器官，不仅可以调节人体体温、感受外界刺激，而且可防止机体水份、电解质等丢失，作为机体天然的防护屏障防止外来异物侵入。烧伤后，作为人体天然保护屏障的皮肤会发生不同程度的损伤，创面的形成极易导致微生物入侵，并发脓毒症、败血症等棘手的医疗问题。创面治疗的主要目的即是实现伤口的快速愈合和不留下影响美观的疤痕。烧伤后创面修复需要经历一系列动态的、相互作用的阶段，包括炎症、增生和组织重塑等。
芦荟具有不同药理活性，其具有抗炎、抗菌、抗感染等生物学效应价值，本发明的发明人在研究中发现，芦荟多糖及芦荟凝胶能促进创面修复细胞增殖，调控细胞因子和生长因子，促进创面愈合，有望用于创面敷料的制备中。但芦荟多糖及芦荟凝胶并不能直接作为敷料用于烧伤创面或其他创面的愈合治疗中。一些现有的敷料制品，会用医用棉纱布作为活性成分的负载物，制得相应的敷料，但是通过此方式得到的敷料，并不是理想的生物敷料。敷料的主要作用是刺激宿主产生多种细胞因子、防止机体脱水、减少炎症发生和增加肉芽组织形成，进而促进创面愈合生物敷料作为创面覆盖物起着暂时性屏障作用，以避免或控制创面感染。理想情况下，敷料不仅覆盖和保护皮肤受损区域，避免创面污染和感染，而且可为创面愈合提供最适环境，保护组织免受细菌的感染、减少炎症并诱导细胞增殖，促进受损组织的重建，因此，良好的敷料必须在愈合过程中发挥积极作用。而理想生物敷料不仅要具备上述功能，还应具备无抗原性，良好生物相容性，可控的生物降解性，无排斥反应，对创面组织无毒性和刺激性，且具有抗菌、促凝等功能；与创面接触时应有合适的生物黏附性，有利于敷料与创面接触，能更有效地吸收渗出液，保持最适宜的湿度，以防止周围组织浸渍和细菌定植，并确保敷料药物成分能有效地渗入到创面组织，同时还能避免与创面发生粘连，引起更换敷料产生疼痛和继发性损伤，从而促进创面组织的修复，缩短愈合时间，提高愈合率。
本发明拟应用库拉索芦荟凝胶提取芦荟多糖，制备芦荟多糖-胶原蛋白复合创面敷料，该敷料兼具良好物理化学性能和生物安全性能，是一种理想的生物敷料。本发明还对所制备的敷料进行了物理化学性能和生物安全性评价，并通过动物全层皮肤损伤模型进行药效评估，探讨其促创面愈合的作用，为该敷料用于临床验证奠定基础。本发明还研究通过制作大鼠全层皮肤缺损模型，观察芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)对创面愈合状况、微血管形成与调节以及胶原形成等方面的影响，为该敷料用于临床验证提供理论基础。另外，本发明研究通过制作大鼠全层皮肤缺损模型，观察芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)对创面组织中炎症介质、趋化因子和生长因子等的影响，探讨其促创面愈合的可能作用机制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法及其应用，所述芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料较好的生物敷料性能，具有良好生物相容性，无排斥反应，对机体无毒性和刺激性，且具备有效地吸水性能，是一种潜在的理想生物敷料。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法，它包括以下步骤：
(1)芦荟多糖β-D-乙酰化甘露聚糖的提取：应用醇沉淀法从库拉索芦荟凝胶冻干粉中提取粗芦荟多糖，并通过SephadexG-100凝胶柱层析进行纯化和冷冻干燥浓缩，得芦荟多糖，经检测鉴定该纯化的芦荟多糖为β-D-乙酰化甘露聚糖；
(2)芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)的制备：
①胶原-软骨素复合液的制备：将胶原蛋白和硫酸软骨素按质量比为10:1(g/g)的比例混合，并加入蒸馏水配制成胶原蛋白质量分数为0.66％的胶原-软骨素复合液。
②制备芦荟多糖-胶原蛋白敷料：将提取的芦荟多糖加入胶原-软骨素复合液中，形成敷料溶液，接着机械搅拌，使之充分混匀，将混匀后的敷料溶液注入模具中，-60℃冰箱冷冻2h，接着放入冷冻干燥机中干燥24h，最终得到芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料。
其中，步骤(1)的具体操作方法为：将市售2000:1库拉索芦荟凝胶冻干粉按水料比为100:1(mL/g)加入到蒸馏水中，常温下搅拌240min后装入到SephadexG-100柱上，用蒸馏水洗脱，收集后用95％(v/v)乙醇沉淀，然后用以蒸馏水为洗脱液的DEAE-琼脂糖凝胶FF柱进行分离，经冷冻干燥后，得到纯化的白色芦荟多糖固体，鉴定该纯化的芦荟多糖为β-D-乙酰化甘露聚糖。
步骤②中所述的敷料溶液，芦荟多糖质量分数为5％～15％，对应得到的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料为5％～15％的敷料。
步骤②中机械搅拌的转速为300-400rpm，搅拌时间为1-2h。
一种由所述制备方法制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料。
所述的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料在制备治疗烧烫伤创面、溃疡创面、创伤创面的药物或医疗器械中的应用。
为了表述方便将所述芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料简写为AP-CD。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.本发明制得的AP-CD具有较好的生物敷料性能，具有良好生物相容性，无排斥反应，对机体无毒性和刺激性，且具备有效地吸水性能，是一种理想的生物敷料。AP-CD生物学评价符合国家制定的标准，为动物实验奠定基础。
2.本发明制得的敷料可通过有效调控创面炎症因子释放，减轻炎症反应，促进生长因子表达，从而加速创面愈合。
3.本发明制得的敷料可通过减轻创面炎性反应，促进创面肉芽组织和微血管形成，从而加速创面愈合。
附图说明
图1是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD的微观结构图。
图2是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD的X衍射分析图。
图3是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD的吸水率结果图。
图4是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对HUVEC增殖的影响结果图。
图5是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD的细胞毒性试验结果图。其中，A：完全培养基对照组；B：CD组；C：5％AP-CD组；D：10％AP-CD组。
图6是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对HUVEC释放LDH的影响结果图。
图7是扫描电镜观察HUVEC在AP-CD上生长情况图。
图8是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对创面愈合率的影响结果图。
图9是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对创面组织病理学改变(×20)图。
图10是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对创面组织微血管形成的影响(×20)图。
图11是本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中TNF-α表达的影响结果图。
图12本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中IL-1β表达的影响结果图。
图13本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中IL-6表达的影响结果图。
图14本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中IL-8表达的影响结果图。
图15本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中IL-10表达的影响结果图。
图16本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中VEGF表达的影响结果图。
图17本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中EGFL7表达的影响结果图
图18本发明制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料AP-CD对大鼠创面组织中PDGF表达的影响结果图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
实施例一：芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)的制备
所述芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法，它包括以下步骤：
(1)芦荟多糖β-D-乙酰化甘露聚糖的提取：应用醇沉淀法从库拉索芦荟凝胶冻干粉(由云南万绿生物股份有限公司提供)中提取粗芦荟多糖，并通过SephadexG-100凝胶柱层析进行纯化和冷冻干燥浓缩，得芦荟多糖，经检测鉴定该纯化的芦荟多糖为β-D-乙酰化甘露聚糖；
步骤(1)的具体操作方法为：将市售2000:1库拉索芦荟凝胶冻干粉按水料比为100:1(mL/g)加入到蒸馏水中，常温下搅拌240min后装入到SephadexG-100柱上，用蒸馏水洗脱，收集后用95％(v/v)乙醇沉淀，然后用以蒸馏水为洗脱液的DEAE-琼脂糖凝胶FF柱进行分离，经冷冻干燥后，得到纯化的白色芦荟多糖固体，鉴定该纯化的芦荟多糖为β-D-乙酰化甘露聚糖。
(2)芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)的制备：
①胶原-软骨素复合液的制备：将胶原蛋白和硫酸软骨素按质量比为10:1(g/g)的比例混合，并加入蒸馏水配制成胶原蛋白质量分数为0.66％的胶原-软骨素复合液。
②制备芦荟多糖-胶原蛋白敷料：称取不同质量的芦荟多糖加入胶原-软骨素复合液中，形成不同的敷料溶液，各敷料溶液中芦荟多糖的质量分数分别5％(w/w)、10％(w/w)，之后，对敷料溶液进行机械搅拌(300-400rpm)1-2h，使之充分混匀，将混匀后的敷料溶液注入固定大小的模具中，放入-60℃冰箱冷冻2h，再放入冷冻干燥机干燥24h，最终分别得到5％AP-CD和10％AP-CD。不加芦荟多糖的胶原-软骨素复合液(即芦荟多糖的质量分数分别0％)，参照5％AP-CD和10％AP-CD的制备方法，经冻干形成的敷料为胶原蛋白敷料(CD)。
本发明采用“一步法”交联冻干成形制备AP-CD。为了优化支架的孔结构、增加支架的力学强度和抗降解能力，引入硫酸软骨素，将胶原蛋白、硫酸软骨素以及蒸馏水混合，胶原蛋白分子和硫酸软骨素分子经过静电相互作用复合沉积得到胶原-软骨素复合液。
实施例二：芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)的理化性能、生物安全性评估
2.1AP-CD微观结构及成份分析
采用高分辨场发射扫描电镜及X衍射仪观察AP-CD微观结构及成份分析。
2.2 AP-CD吸水性
AP-CD制成1x1cm，称重(干重)，加蒸馏水浸泡，每隔1-2小时(后面可加长时间)称重(湿重)一次，直至敷料重量不再增加为止，称重时将敷料表面水滴轻微擦干即可。将稳定后的湿重减去敷料干重的重量除以干重的重量，换算成敷料吸水率(％)。
2.3 AP-CD生物安全性评价
按照国家药监局医疗器械敷料产品的技术要求，对AP-CD进行体内和体外生物安全性评估，以确定敷料的生物安全性。
2.3.1 AP-CD对HUVEC增殖的影响
HUVECs常规复苏，DMEM完全培养液(含10％胎牛血清)，37℃，5％CO2饱和湿度下培养，每3天换液一次，达到75％～80％的融合时传代，3-4代供试验使用。
将5％和10％AP-CD以及CD裁剪成Φ6mm的圆片为实验组和敷料对照组(CD组)，以完全培养基为空白对照组(control组)，经完全培养基浸泡处理后，将其加入HUVEC贴壁培养后96孔板中继续培养24h，加入CCK-8继续培养2h后，每孔中吸取100μL在450nm处测OD值。
2.3.2 AP-CD直接接触实验
将HUVEC悬液接种至12孔板中，37℃二氧化碳培养箱中培养24h。观察板中每孔细胞生长状态，在每个孔的中央部位的细胞层轻轻放置一个受试样品(5％和10％AP-CD或CD)，确保样品覆盖细胞层表面约十分之一，并防止受试样品不必要的移动，避免细胞的损伤，置于37℃二氧化碳培养箱继续培养24h，显微镜下观察细胞形态并记录。以完全培养基为空白对照组(control组)。
2.3.3 AP-CD对HUVEC释放LDH的影响
将细胞按8×104个/ml浓度接种于24孔培养板中，每孔1ml，在37℃、5％CO2培养。次日细胞贴壁后，吸弃培养液，用D-Hank’S缓冲液冲洗细胞1次，分别加入上述准备的受试样品完全培养液，每孔600μl，每个浓度6个复孔。收集培养24h、48h后培养上清液和细胞，细胞需超声波破碎细胞处理，采用全自动生化分析仪分别测定上清液和细胞内LDH的含量。细胞培养液LDH漏出率(％)＝培养液LDH总活性/(培养液LDH总活性+细胞匀浆LDH总活性)×100％。以完全培养基为空白对照组(control组)。
2.3.4 AP-CD细胞生长实验
将HUVEC悬液分别滴加到96孔板各孔内的样品上，37℃二氧化碳培养箱中培养，每1-2d换液一次。细胞在敷料上培养3d和7d后，将材料从培养基中取出，PBS(pH＝7.4)清洗两次洗去支架中的培养基，加入固定液，4℃冰箱固定过夜，将样品进行冷冻干燥处理，干燥后的样品进行离子溅射仪喷镀后，扫描电镜观察。
2.3.5 AP-CD皮肤刺激试验
选用雄性健康新西兰大白兔15只，采用同体左右侧自身对比法，左右两侧分别备皮，各两个3x3cm范围，随机分成四组，分别为实验组(5％和10％AP-CD)、对照组(CD)、阳性对照组(3.5％甲醛溶液)和阴性对照组(生理盐水)，敷贴时间为4h。分别于去除受试物后1h、24h、48h和72h观察皮肤局部反应，计算平均原发刺激指数，进行记分并评价。
2.3.6 AP-CD皮内刺激试验
选用雄性健康新西兰大白兔6只，皮下注射生理盐水、生理盐水敷料样本浸提液(5％和10％AP-CD、CD)、玉米油敷料样本浸提液((5％和10％AP-CD、CD)和玉米油0.2ml，注射药物浸液，观察注射后即刻、24h、48h、72h每个注射部位及周围组织反应，进行记分并评价，按GB/T16886.10-2005规定评分标准，72h评分后计算出浸提液和浸提介质的综合平均记分，最后计算出浸提液和浸提介质的综合平均记分之差。
2.3.7 AP-CD眼刺激试验
选用雄性健康新西兰大白兔12只，双眼无异常，左右眼下结合膜囊内分别滴入0.1mL敷料(5％和10％AP-CD、CD)药液和介质液，闭眼1s观察滴入后1h，24h，48h，72h兔双眼角膜、虹膜及结膜的情况。
2.3.8 AP-CD致敏试验
选用雄性豚鼠60只，随机分为阴性对照组、阳性对照组、CD组、5％和10％AP-CD组各10只。
2.3.8.1皮内诱导阶段(0d)
在豚鼠背部肩胛骨部位，每个样品成对皮内注射0.1mL，两点之间距离为1-2cm，注射前用碘伏擦拭消毒。两侧从上至下设3个注射点为A、B和C点，在A点部位左右注射弗氏完全佐剂与生理盐水等体积混合的乳化剂；B点部位按照敷料组、阳性组、阴性组分别注射5％和10％AP-CD、CD浸提液、阳性试剂、生理盐水；C点部位分别注射5％和10％AP-CD、CD样品与乳化剂等体积的混合溶液，阳性对照试剂与乳化剂等体积的混合溶液，生理盐水与乳化剂等体积的混合溶液。
2.3.8.2局部诱导阶段(7±1d)
为增加致敏效果，皮内诱导6d在注射部位涂抹10％十二烷基硫酸钠石蜡液，按摩导入皮肤，诱导敷贴前用清水擦拭干净。皮内诱导7d后，在注射肩胛骨部位再次去毛，用碘伏消毒。采用浸有浸提液(阳性组和阴性组分别用阳性试剂和生理盐水)的面积为2×4cm2敷贴片(滤纸)局部贴敷于每只动物的肩胛骨内侧部位，覆盖诱导注射点，外侧加略大于敷贴片面积的蜡纸。用医用胶带固定敷贴片，48h后除去包扎带和敷贴片。
2.3.8.3激发阶段(14±1d)
实验前24h每只动物腹部右侧剔除5×5cm2面积的毛发，每个敷贴片加浸提液(阳性组和阴性组分别用阳性试剂和生理盐水)浸透，局部贴敷于去毛处，用医用胶带密封固定，在24h后除去包扎带和敷贴片。
2.3.8.4评价标准
在去除敷贴片12h、24h、48h三个时间点，分别观察各组动物激发部位的皮肤情况，按Magnusson和Kligman分级标准评分，对每一激发部位的皮肤红斑和水肿进行描述并分级。
2.3.9 AP-CD全身急性毒性试验
选用KM小鼠20只，随机分为实验组(5％和10％AP-CD、CD)3组和阴性对照组，每组5只，尾静脉分别注射生理盐水浸提液(5％和10％AP-CD、CD浸提液三种)和生理盐水阴性对照，剂量为50mL/kg，注射速度不超过0.1mL/s，腹腔分别注射玉米油浸提液(5％和10％AP-CD、CD浸提液三种)和玉米油阴性对照，剂量为50mL/kg，注射完毕观察小鼠反应，并于4h、24h、48h和72h观察试验组和对照组的一般状态，毒性表现和死亡动物数，在72h称量动物体重。
2.3.10统计学处理
数据以均数±标准差表示，采用SPSS 22.0统计软件分析，各组数据之间比较采用One-Way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2.4结果
2.4.1 AP-CD微观结构及成分分析
高分辨场发射扫描电镜观察AP-CD，可看到在CD呈片状结构，AP-CD表面有芦荟多糖颗粒附着，整体外观较为平整细致，敷料表面未见到裂纹，见图1。随机选取其中一点用X衍射分析其成分分布情况，X衍射图显示主要由C、O和N元素组成，见图2。
2.4.2 AP-CD吸水性
将5％AP-CD、10％AP-CD和CD制成1x1cm2，在水中浸泡至6h后三种敷料的重量趋于稳定，直至12h，吸水率最高可达6000％，见图3。
2.4.3 AP-CD对HUVEC增殖的影响
与完全培养基对照组(control组)比较，CD、5％AP-CD和10％AP-CD完全培养基浸泡对HUVEC增殖无明显影响，见图4。
2.4.4 AP-CD直接接触实验
与完全培养基对照组比较，CD、5％AP-CD和10％AP-CD直接接触对HUVEC形态与增殖无明显影响，见图5。
表1 AP-CD细胞毒性试验结果
2.4.5 AP-CD对HUVEC释放LDH的影响
与完全培养基对照组(control组)比较，CD、5％AP-CD和10％AP-CD完全培养基浸泡液对HUVEC释放LDH无明显影响，见图6。
2.4.6 AP-CD细胞生长实验
扫描电镜观察，HUVEC分别在5％AP-CD和10％AP-CD上细胞生长良好，如图7所示。
2.4.7 AP-CD皮肤刺激试验
观察发现CD、5％AP-CD和10％AP-CD各组各时相点皮肤每个部位没有红斑和水肿，而阳性对照组则出现红斑和水肿，结果评定见表2，表明AP-CD刺激试验符合标准。
表2：皮肤刺激试验结果
2.4.8 AP-CD皮内刺激试验
新西兰大白兔皮下注射敷料浸提液后，结果显示敷料浸提液反应程度未大于溶剂对照组，且样品浸提液与溶剂对照平均记分之差小于1.0，按标准判定这些敷料无皮内反应，见表3。
表3：AP-CD皮内反应试验结果
2.4.9 AP-CD眼刺激试验
CD、5％AP-CD和10％AP-CD与阴性对照组中，新西兰大白兔眼角膜透明、虹膜正常、无混浊、无充血肿胀，结膜没有充血水肿和分泌物，结果评定CD、5％AP-CD和10％AP-CD的刺激反应均为0级，认为这些敷料刺激试验合格。
2.4.10 AP-CD致敏试验
CD、5％AP-CD和10％AP-CD与阴性对照组中，豚鼠皮肤均未发现红斑、疹块或水肿发生，致敏率为0；而阳性对照组(5％甲醛)则出现显著的红斑和水肿，致敏性强，致敏率为100％，提示CD、5％AP-CD和10％AP-CD致敏试验合格。
结果表明，各敷料组豚鼠激发部位反应小于阴性对照组，豚鼠反应等级也小于阴性对照组(等级小于1)，按标准判定，三种敷料皮肤致敏反应为阴性，见表4。
表4：AP-CD皮肤致敏试验结果
2.4.11 AP-CD全身急性毒性试验
结果显示，小鼠各项生理指标正常，活动正常，未见毒性反应和动物死亡。对照组小鼠平均体重增加为(3.25±0.35g,n＝5)，给药CD、5％AP-CD和10％AP-CD组小鼠平均体重分别增加为(3.25±0.18g,n＝5；3.27±0.40g,n＝5；3.29±0.41g,n＝5)，无明显差异。结果提示CD、5％AP-CD和10％AP-CD全身急性毒性实验合格。
本发明应用从库拉索芦荟凝胶冻干粉中提取的芦荟多糖(AP)与胶原蛋白进行交联冻干成形制备芦荟多糖与胶原蛋白敷料(AP-CD)，其含AP浓度分别为0、5％和10％。从高分辨场发射扫描电镜观察AP-CD，CD呈均匀片状折叠结构，AP-CD表面附有芦荟多糖颗粒，整体外观较为平整细致，敷料表面未见到裂纹；对其成分进行分析，主要由C、O和N元素组成。对AP-CD进行吸水性实验，结果显示将5％AP-CD、10％AP-CD和CD在水中浸泡1h，三种敷料吸水率均近4000％，6h至12h三种敷料的吸水重量均趋于稳定，吸水率约达6000％，研究表明AP对敷料的吸水性无明显影响，AP-CD具有良好的吸水性能，能有效地吸收渗出液。
医用生物敷料在使用过程中直接接触创面，应确保敷料的生物安全性，对创面组织无毒性和刺激性或过敏反应。在对AP-CD对HUVEC影响的研究发现，HUVEC增殖实验显示CD、5％AP-CD和10％AP-CD对HUVEC增殖无明显影响；直接接触实验结果显示这三种对HUVEC形态正常无明显影响，细胞生长良好，未见死亡细胞；在研究5％AP-CD、10％AP-CD和CD对HUVEC释放的影响中结果显示，与正常情况下培养基的HUVEC比较，CD、5％AP-CD和10％AP-CD对细胞释放LDH无明显影响，表明这三种敷料对HUVEC没有损伤作用；扫描电镜观察，5％AP-CD和10％AP-CD上HUVEC也生长良好。以上体外细胞毒性评价表明，5％AP-CD和10％AP-CD对细胞无毒副作用。
在对AP-CD皮肤刺激试验发现，新西兰大白兔局部斑贴除去敷料后，CD、5％AP-CD和10％AP-CD各时相点各部位均无红斑和水肿，而阳性对照组则均有红斑和水肿，结果评定这三种敷料均无刺激反应，表明所制备的AP-CD刺激试验合格。在AP-CD对皮内刺激试验中发现，新西兰大白兔皮下注射CD、5％AP-CD和10％AP-CD浸提液后，结果显示这三种敷料浸提液反应程度未大于溶剂对照组，且这三种敷料浸提液与溶剂对照组平均记分之差小于1.0，根据标准判定这三种敷料无皮内反应。在对AP-CD进行眼刺激试验发现，CD、5％AP-CD和10％AP-CD与阴性对照组的新西兰大白兔眼角膜透明、虹膜正常、无混浊、无充血肿胀，结膜没有充血水肿和分泌物，结果评定这三种敷料无刺激反应，表明这三种敷料眼刺激试验合格。
对AP-CD进行致敏试验结果表明这三种敷料致敏试验均合格，皮肤致敏反应为阴性。全身急性毒性试验则显示，小鼠各项生理指标正常，活动正常，未发现死亡动物或毒性反应，对照组小鼠平均体重增加与三种敷料组比较无明显差异，表明这三种敷料全身急性毒性实验合格。
综上所述，AP-CD较好的生物敷料性能，具有良好生物相容性，无排斥反应，对机体无毒性和刺激性，且具备有效地吸水性能。AP-CD生物学评价符合国家制定的标准，为下一步动物实验奠定基础。
实施例三：芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)对大鼠创面愈合的影响实验
3.1材料
3.1.1试剂
异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供)；Anti-CD34 antibody及二抗(美国Abcam公司提供)；伊红染料、苏木素染料(福建医科大学附属协和医院病理科提供)；I型胶原、III型胶原、一氧化氮(NO)和内皮素-1(ET-1)ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司提供)，其它试剂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供)。
3.1.2仪器
R540增强式小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；电子天平(瑞士Mettler公司)；MAX 190酶标仪(美国Molecula Devices公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；低温冰箱(日本SANYO公司)；低温组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；振荡器(德国IKA公司)；微量移液器(美国Thermolyne公司)；数字显示隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；洗板机(芬兰Thermo公司)。
3.1.3动物
清洁级雄性Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002，雄性，60-70日龄，体重250-300g。大鼠适应性喂养一周以上，动物房内保持恒温(22-25℃)，恒湿(湿度40-60％)；自由食饮。所有的动物实验均已获得福建医科大学实验动物委员会的伦理批准，并严格依照实验动物委员会的规定及相关推荐进行。
3.2方法
3.2.1动物分组和造模
SD大鼠30只随机分为5个时相点(1d、3d、7d、10d和14d)，每个时相点6只。实验前12h禁食、自由饮水。使用小动物麻醉机对大鼠进行麻醉，异氟烷诱导浓度为3-4％，从诱导盒取出大鼠，将其头/鼻放置于麻醉面罩里固定，维持浓度为2-2.5％，检查大鼠是否处于完全麻醉状态，可用两手指头捏压大鼠脚爪或尾巴，若大鼠无反应，表明大鼠已完全麻醉，此时可以开始实验。实验前一天，背部剃毛，再用脱毛膏脱毛。实验时，大鼠背部脊柱两侧4个创面，眼科剪剪取皮肤制备直径为1cm的全层皮肤缺损创面，每只大鼠4个创面分别覆盖生理盐水纱布(control)、胶原蛋白敷料(CD)、5％芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(5％AP-CD)和10％芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(10％AP-CD)，每组设6个平行对照。每只大鼠背部4个创面轮流换用不同的敷料，以排除部位不同的干扰，并用细铁丝网缝合遮蔽，单笼饲养，以防大鼠舔食药物和搔抓创面，室温25℃、湿度50％环境，自由摄食、饮水。
3.2.2临床观察与创面处理
实验全过程中观察大鼠的精神状态，反应能力，生命体征，眼睛有无分泌物，皮肤、毛发的外观情况，摄食及排尿是否正常，有无腹泻及血便等。大鼠隔天换药。换药时，伤口清洗及伤口的必要处理需符合临床规范，同时观察其创面变化、肉芽组织生长和创面愈合等情况。
3.2.3创面愈合率
创面愈合率用描记称重法测定，以伤后第1d创面面积作为原创面面积，于第7d、10d和14d进行创面残留面积测算，创面愈合率＝(原创面面积-各时相点创面面积)/原创面面积×100％。
3.2.4标本处理
分别于伤后1d、3d、7d、10d和14d取下各组创缘组织，有痂皮者先去除痂皮，滤纸吸去血迹，一份用于病理检测，一份用于检测。
3.2.5病理学改变
分别于伤后3d、7d、10d和14d取创面全层皮肤，经常规多聚甲醛固定、洗涤与脱水、透明、浸蜡与包埋、切片后，苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察创面组织结构、肉芽生长、炎症细胞浸润、血管生成等情况。
3.2.6创面组织微血管密度检测
以CD34抗体对标本进行免疫组织化学染色，观察创面组织微血管密度，操作步骤如下：
3.2.6.1石蜡切片脱蜡至水切片置60℃干燥箱10分钟，二甲苯Ⅰ中浸泡5分钟，二甲苯Ⅱ中浸泡5分钟，无水乙醇中浸泡5分钟，95％乙醇中浸泡5分钟，75％乙醇中浸泡5分钟，自来水冲洗，PBS浸泡5分钟。
3.2.6.2抗原修复0.25％胰蛋白酶20分钟，PBS冲洗，3分钟3次。
3.2.6.3消除内源性过氧化物酶3％H2O2室温孵育15分钟，PBS冲洗3分钟3次。
3.2.6.4封闭吸去PBS液，滴加试剂A(封闭用正常山羊血清工作液)室温孵育15分钟，倾去，勿洗。
3.2.6.5 CD34抗体免疫组化染色滴加CD34抗体(1:2000)，4℃过夜；PBS冲洗，3分钟3次；除去PBS液，滴加生物素化二抗工作液，室温孵育15分钟；PBS冲洗，3分钟3次；除去PBS液，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育15分钟；PBS冲洗，3分钟3次；除去PBS液，每片加2滴DAB显色剂(显色剂应在30分钟内新鲜配制)，显微镜下观察3-10分钟。自来水冲洗。苏木素复染(约20秒)，自来水冲洗。0.1％盐酸酒精分化，自来水冲洗。氨水返蓝，自来水冲洗。梯度酒精脱水，75％－95％酒精各30秒。60℃干燥箱10分钟。中性树胶封片。显微镜下观察并拍照。
3.2.7组织匀浆制备与蛋白定量
3.2.7.1组织样本处理分别于烫伤后3d、7d、10d和14d取下各组创缘组织，称重后尽快放入PBS中，碾磨制成匀浆，4℃以下10000rpm离心10分钟，取上清液进行蛋白定量。
3.2.7.2组织样本匀浆蛋白定量
3.2.7.2.1取蛋白标准配制液1.2ml加入至一管蛋白标准中(30mg BSA)，充分混匀溶解后配成蛋白标准溶液(25mg/ml)。配制后可即可使用，也可-20℃长期保存。
3.2.7.2.2取适量25mg/ml的蛋白标准，以0.01M PBS稀释直至终浓度为0.5mg/ml，稀释完后仍可-20℃长期保存。
3.2.7.2.3依据样品数量，按50:1(50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B)配制适量的BCA工作液，充分混匀。
3.2.7.2.4将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl的顺序加到96孔板的标准品孔中，加入0.01M PBS补足到20μl。
3.2.7.2.5加1μl样品至96孔板的样品孔中，加入0.01M PBS补足到20μl。
3.2.7.2.6各孔中分别加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min或者室温放置2h。
3.2.7.2.7用酶标仪测定A560nm的OD值，并绘制标准曲线。依据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
3.2.8统计学处理
数据以均数±标准差表示，采用SPSS22.0统计软件分析，各组数据之间比较采用One-Way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。
3.3结果
3.3.1临床常规观察
每日观察可见大鼠精神状态良好，反应灵活，生命体征平稳，眼睛无分泌物，毛色光泽，皮肤未见水肿、红斑、化脓，摄食正常，排尿正常，无腹泻及血便。
3.3.2 AP-CD对创面愈合率的影响
制备直径为1cm的大鼠全层皮肤缺损创面，分别观察伤后第7d、10d和14d创面愈合率，结果显示，5％AP-CD组和10％AP-CD组各时相点创面愈合率均明显高于control组和CD组(P<0.05)，见图8。
3.3.3 AP-CD对创面组织病理学改变
HE染色结果显示，伤后第3d，control组、CD组、5％AP-CD组和10％AP-CD组表皮缺损，汗腺被破坏，许多炎性细胞浸润，尤其是control组和CD组炎性细胞明显增多。伤后第7d，5％AP-CD组和10％AP-CD组可见创缘部分上皮化趋势，炎症细胞浸润减少，有肉芽组织和新生血管生成，而control组和CD组则仍有大量炎症细胞浸润，肉芽组织和新生血管生成较少。伤后第10d，5％AP-CD组和10％AP-CD组可见创缘已部分上皮化，炎症细胞浸润少，有肉芽组织和新生血管生成，胶原排列较为有规律，而control组和CD组则仍有较多炎症细胞浸润，创缘部分上皮化趋势，有肉芽组织和新生血管生成。伤后第14d，5％AP-CD组和10％AP-CD组创面中肉芽组织形成增强，炎症细胞浸润减少，伤口缺损区域均上皮化，并伴有较多新生血管形成；control组和CD组则仍有部分未完全上皮化，伤口缺损区可见分化成熟的再生上皮细胞，有新生血管形成，炎症细胞浸润也减少，见图9。
3.3.4 AP-CD对创面组织微血管形成的影响
结果显示：5％AP-CD组和10％AP-CD组各时相点与control组和CD组比较，创面组织中微血管数量均明显增多，见图10。
实施例四：芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)对大鼠创面组织中炎症因子及生长因子的影响实验
4.1材料
4.1.1试剂
异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供)；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、EGFL7和PDGF ELISA试剂盒(上海西唐生物科技有限公司提供)，其它试剂(上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供)。
4.1.2仪器
R540增强式小动物麻醉机(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；电子天平(瑞士Mettler公司)；MAX 190酶标仪(美国Molecula Devices公司)；高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；低温冰箱(日本SANYO公司)；低温组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司)；振荡器(德国IKA公司)；微量移液器(美国Thermolyne公司)；数字显示隔水式电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂)；洗板机(芬兰Thermo公司)。
4.1.3动物
清洁级雄性Sprague Dawley大鼠(SD大鼠)购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2012-0002，雄性，60-70日龄，体重250-300g。大鼠适应性喂养一周以上，动物房内保持恒温(22-25℃)，恒湿(湿度40-60％)；自由食饮。所有的动物实验均已获得福建医科大学实验动物委员会的伦理批准，并严格依照实验动物委员会的规定及相关推荐进行。
4.2方法
4.2.1动物分组和造模
SD大鼠30只随机分为5个时相点(1d、3d、7d、10d和14d)，每个时相点6只。实验前12h禁食、自由饮水。使用小动物麻醉机对大鼠进行麻醉，异氟烷诱导浓度为3-4％，从诱导盒取出大鼠，将其头/鼻放置于麻醉面罩里固定，维持浓度为2-2.5％，检查大鼠是否处于完全麻醉状态，可用两手指头捏压大鼠脚爪或尾巴，若大鼠无反应，表明大鼠已完全麻醉，此时可以开始实验。实验前一天，背部剃毛，再用脱毛膏脱毛。实验时，大鼠背部脊柱两侧4个创面，眼科剪剪取皮肤制备直径为1cm的全层皮肤缺损创面，每只大鼠4个创面分别覆盖生理盐水纱布(control)、胶原蛋白敷料(CD)、5％芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(5％AP-CD)和10％芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(10％AP-CD)，每组设6个平行对照。每只大鼠背部4个创面轮流换用不同的敷料，以排除部位不同的干扰，并用细铁丝网缝合遮蔽，单笼饲养，以防大鼠舔食药物和搔抓创面，室温25℃、湿度50％环境，自由摄食、饮水。
4.2.2标本处理
分别于伤后3d、7d、10d和14d取下各组创缘组织，有痂皮者先去除痂皮，滤纸吸去血迹，一份用于病理检测，一份-80℃冰箱保存用于检测。
4.2.3组织匀浆制备与蛋白定量
4.2.3.1组织样本处理分别于烫伤后3d、7d、10d和14d取下各组创缘组织，称重后尽快放入PBS中，碾磨制成匀浆，4℃以下10000rpm离心10分钟，取上清液进行蛋白定量。
4.2.3.2组织样本匀浆蛋白定量
4.2.3.2.1取蛋白标准配制液1.2ml加入至一管蛋白标准中(30mg BSA)，充分混匀溶解后配成蛋白标准溶液(25mg/ml)。配制后可即可使用，也可-20℃长期保存。
4.2.3.2.2取适量25mg/ml的蛋白标准，以0.01M PBS稀释直至终浓度为0.5mg/ml，稀释完后仍可-20℃长期保存。
4.2.3.2.3依据样品数量，按50:1(50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B)配制适量的BCA工作液，充分混匀。
4.2.3.2.4将标准品按照0、1、2、4、8、12、16、20μl的顺序加到96孔板的标准品孔中，加入0.01M PBS补足到20μl。
4.2.3.2.5加适当体积(一般为1μl)样品至96孔板的样品孔中，加入0.01M PBS补足到20μl。
4.2.3.2.6各孔中分别加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min或者室温放置2h。
4.2.3.2.7用酶标仪测定A560nm的OD值，并绘制标准曲线。依据标准曲线计算样品的蛋白浓度。
4.2.4组织匀浆中TNF-α测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠TNF-α单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的TNF-α与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠TNF-α，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，TNF-α浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-α浓度。
4.2.4.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆(20倍稀释)100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.4.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应TNF-α含量。组织匀浆中TNF-α含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中TNF-α水平。
4.2.4.3试剂盒性能
4.2.4.3.1灵敏度最小的TNF-α检测浓度小于17pg/ml。
4.2.4.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠TNF-α。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.4.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.5组织匀浆中IL-1β测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠IL-1β单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-1β与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-1β，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-1β浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-1β浓度。
4.2.5.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.5.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应IL-1β含量。组织匀浆中IL-1β含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中IL-1β水平。
4.2.5.3试剂盒性能
4.2.5.3.1灵敏度最小的IL-1β检测浓度小于16pg/ml。
4.2.5.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠IL-1β。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.5.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.6组织匀浆中IL-6测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠IL-6单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-6与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-6，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-6浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-6浓度。
4.2.6.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.6.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品8000、4000、2000、1000、500、250、125、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应IL-6含量。组织匀浆中IL-6含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中IL-6水平。
4.2.6.3试剂盒性能
4.2.6.3.1灵敏度最小的IL-6检测浓度小于61pg/ml。
4.2.6.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠IL-6。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.6.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.7组织匀浆中IL-8测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠IL-8单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-8与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-8，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-8浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-8浓度。
4.2.7.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆(6倍稀释)100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.7.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应IL-8含量。组织匀浆中IL-8含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中IL-8水平。
4.2.7.3试剂盒性能
4.2.7.3.1灵敏度最小的IL-8检测浓度小于16pg/ml。
4.2.7.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠IL-8。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.7.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.8组织匀浆中IL-10测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠IL-10单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-10与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠IL-10，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-10浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-10浓度。
4.2.8.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.8.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应IL-10含量。组织匀浆中IL-10含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中IL-10水平。
4.2.8.3试剂盒性能
4.2.8.3.1灵敏度最小的IL-10检测浓度小于16pg/ml。
4.2.8.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠IL-10。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.8.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.9组织匀浆中VEGF测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠VEGF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的VEGF与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠VEGF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，VEGF浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中VEGF浓度。
4.2.9.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.9.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品4000、2000、1000、500、250、125、62.5、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应VEGF含量。组织匀浆中VEGF含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中VEGF水平。
4.2.9.3试剂盒性能
4.2.9.3.1灵敏度最小的VEGF检测浓度小于30pg/ml。
4.2.9.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠VEGF。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.9.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.10组织匀浆中EGFL7测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠EGFL7单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的EGFL7与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠EGFL7，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，EGFL7浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中EGFL7浓度。
4.2.10.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆(10倍稀释)100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.10.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应EGFL7含量。组织匀浆中EGFL7含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中EGFL7水平。
4.2.10.3试剂盒性能
4.2.10.3.1灵敏度最小的EGFL7检测浓度小于16pg/ml。
4.2.10.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠EGFL7。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.10.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.11组织匀浆中PDGF测定
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠PDGF单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的PDGF与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠PDGF，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，PDGF浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中PDGF浓度。
4.2.11.1组织匀浆检测每孔各加入标准品或组织匀浆(6倍稀释)100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟，同前洗板。每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟，同前洗板。每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。.每孔加入100ul终止液混匀。30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
4.2.11.2结果计算与判断所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。根据样品OD值计算出相应PDGF含量。组织匀浆中PDGF含量除以组织匀浆总蛋白浓度即为每g组织中PDGF水平。
4.2.11.3试剂盒性能
4.2.11.3.1灵敏度最小的PDGF检测浓度小于15pg/ml。
4.2.11.3.2特异性可同时检测重组或天然的大鼠PDGF。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
4.2.11.3.3重复性板内、板间变异系数均小于10％。
4.2.12统计学处理
数据以均数±标准差表示，采用SPSS 22.0统计软件分析，各组数据之间比较采用One-Way ANOVA分析，P<0.05为差异有统计学意义。
4.3结果
4.3.1 AP-CD对大鼠创面组织中TNF-α表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中TNF-α水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中TNF-α表达的影响，结果如图11所示：与control组和CD组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第3d和7d创面组织中TNF-α表达有所下降，其中伤后第7d下降更为显著(P<0.05)。其它时相点无明显差异。
4.3.2 AP-CD对大鼠创面组织中IL-1β表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中IL-1β水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中IL-1β表达的影响，结果如图12所示：与control组和CD组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组各时相点创面组织中IL-1β表达无明显差异。
4.3.3 AP-CD对大鼠创面组织中IL-6表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中IL-6水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中IL-6表达的影响，结果如图13所示：与control组和CD组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第7d和第14d创面组织中IL-6表达略有上升趋势，其中第7d上升更为显著(P<0.05)。但其它时相点无明显变化。
4.3.4 AP-CD对大鼠创面组织中IL-8表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中IL-8水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中IL-8表达的影响，结果如图14所示：与control组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第3d和第7d创面组织中IL-8表达有所上升，其中伤后第3d上升更为明显(P<0.05)，但伤后第10d则有明显下降(P<0.05)；与CD组比较，伤后第10d则有明显下降(P<0.05)。其它时相点无明显变化。
4.3.5 AP-CD对大鼠创面组织中IL-10表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中IL-10水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中IL-10表达的影响，结果如图15所示：与control组和CD组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第7d创面组织中IL-10表达明显上升(P<0.05)，随后有所下降。但其它时相点无明显变化。
4.3.6 AP-CD对大鼠创面组织中VEGF表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中VEGF水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中VEGF表达的影响，结果如图16所示：与control组比较，CD组、5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第3d创面组织中VEGF表达明显上升；与control组和CD组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第7d创面组织中VEGF表达也呈显著上升(P<0.05)。但其它时相点无明显变化。
4.3.7 AP-CD对大鼠创面组织中EGFL7表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中EGF水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中EGFL7表达的影响，结果如图17所示：与control组和CD组比较，5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第3d、7d和10d创面组织中EGFL7表达明显上升(P<0.05)。但其它时相点无明显变化。
4.3.8 AP-CD对大鼠创面组织中PDGF表达的影响
采用ELISA法检测大鼠创面组织中PDGF水平，观察伤后3d、7d、10d和14dAP-CD对创面组织中PDGF表达的影响，结果如图18所示：与control组比较，CD组、5％AP-CD组和10％AP-CD组伤后第7d创面组织中PDGF表达明显上升，其中5％AP-CD组和10％AP-CD组更为显著(P<0.05)。但其它时相点无明显变化。
本发明研究结果显示，使用AP-CD后创面组织中IL-6水平与对照组比较在伤后第7d明显升高。IL-6在伤口愈合过程中对角质形成细胞表现出促有丝分裂和增殖作用，IL-6缺乏会减少中性粒细胞和巨噬细胞浸润并抑制角质形成细胞增殖。
创面组织中巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞等均能产生IL-8。本发明研究结果显示，创面使用AP-CD在第3d和第7d创面组织中IL-8表达明显增强，但于伤后第10d则有明显下降，创伤早期IL-8可结合并刺激中性粒细胞表面受体CXCR1和CXCR2，导致中性粒细胞大量募集到组织损伤部位，一旦中性粒细胞迁移到创面，可自分泌IL-8，从而形成促炎反馈回路；IL-8也可增加内皮通透性，进一步促进炎症细胞流入伤口部位。
抗炎细胞因子IL-10是一个组织修复的重要调节因子，IL-10在组织修复过程中炎症反应的限制和终止中起着重要作用。本发明研究结果显示，创面使用AP-CD在第3d创面组织中IL-10表达有所增强，第7d则达到峰值，与对照组比较有明显差异。
本发明研究还发现，创面使用AP-CD后创面组织中生长因子VEGF、EGFL7和PDGF表达均有不同程度升高，特别是伤后第7d与对照组比较明显升高。VEGF在愈合过程中起着关键作用，启动血管生成，并协助内皮细胞的迁移和增殖。EGF是由活化的巨噬细胞产生的，并作为刺激上皮细胞增殖的。EGFL7是EGF样蛋白家族的成员，是一种在许多不同细胞类型中表达的有效血管生成因子；在胚胎发生、器官发生过程中控制血管生成和维持骨骼稳态方面发挥着至关重要的作用。PDGF的血管生成作用是组织特异性的，在受伤皮肤的情况下，分泌的PDGF促进HIF复合物的形成，导致VEGF及其受体的表达增加；PDGF对于新血管的成熟也是必需的，将周细胞招募到毛细血管区域，也召回平滑肌细胞，促进血管结构的完整性和功能；此外，PDGF在增加成纤维细胞增殖、ECM分泌、向肌成纤维细胞分化、角质形成细胞迁移和上皮化方面发挥重要作用。
综上所述，5％AP-CD和10％AP-CD可通过有效调控创面炎症因子释放，减轻炎症反应，促进生长因子表达，从而加速创面愈合。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：
（1）芦荟多糖β-D-乙酰化甘露聚糖的提取：应用醇沉淀法从库拉索芦荟凝胶冻干粉中提取粗芦荟多糖，并通过SephadexG-100 凝胶柱层析进行纯化和冷冻干燥浓缩，得芦荟多糖，经检测鉴定该纯化的芦荟多糖为β-D-乙酰化甘露聚糖；
（2）芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料(AP-CD)的制备：
①胶原-软骨素复合液的制备：将胶原蛋白和硫酸软骨素按质量比为10:1（g/g）的比例混合，并加入蒸馏水配制成胶原蛋白质量分数为0.66%的胶原-软骨素复合液；
②制备芦荟多糖-胶原蛋白敷料：将提取的芦荟多糖加入胶原-软骨素复合液中，形成敷料溶液，接着机械搅拌，使之充分混匀，将混匀后的敷料溶液注入模具中，-60℃冰箱冷冻2h，接着放入冷冻干燥机中干燥24h，最终得到芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料；
其中，步骤②中所述的敷料溶液，芦荟多糖质量分数为5%或10%，对应得到的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料为5%或10%的敷料。
2.根据权利要求1所述的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作方法为：将市售2000:1 库拉索芦荟凝胶冻干粉按水料比为100:1（mL/g）加入到蒸馏水中，常温下搅拌240min后装入到SephadexG-100柱上，用蒸馏水洗脱，收集后用95%(v/v)乙醇沉淀，然后用以蒸馏水为洗脱液的DEAE-琼脂糖凝胶FF柱进行分离，经冷冻干燥后，得到纯化的白色芦荟多糖固体，鉴定该纯化的芦荟多糖为β-D-乙酰化甘露聚糖。
3.根据权利要求1所述的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料的制备方法，其特征在于：步骤②中机械搅拌的转速为300-400rpm，搅拌时间为1-2h。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述的制备方法制得的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料。
5.如权利要求4所述的芦荟多糖-胶原蛋白复合敷料在制备治疗烧烫伤创面、溃疡创面、创伤创面的药物或医疗器械中的应用。
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