WO2017209136A1

WO2017209136A1 - リン酸カルシウム成形体の製造方法、リン酸カルシウム成形体及び移植用材料

Info

Publication number: WO2017209136A1
Application number: PCT/JP2017/020130
Authority: WO
Inventors: 浩史太田; 学勝村; 和也川崎; 石井　善雄; 英生伏見; 崇浩平塚; 愛岡村; 守西谷; 将之江角
Original assignee: 富士フイルム株式会社
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2017-05-30
Publication date: 2017-12-07
Also published as: CN109219587A; JPWO2017209136A1; EP3466905B1; JP2020168426A; CN109219587B; JP6728350B2; KR102204763B1; KR20190004760A; EP3974403A1; US20190167841A1; US10953131B2; EP3466905A4; EP3466905A1

Abstract

本発明の課題は、高い強度を有するリン酸カルシウム成形体を、迅速かつ高い造形精度で製造する方法、上記方法で製造されるリン酸カルシウム成形体、及び移植用材料を提供することである。本発明によれば、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記有機酸溶液を上記工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｂ；を含む、リン酸カルシウム成形体の製造方法が提供される。

Description

リン酸カルシウム成形体の製造方法、リン酸カルシウム成形体及び移植用材料

　本発明は、有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、リン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることにより、リン酸カルシウム成形体を製造する方法に関する。本発明はさらに、リン酸カルシウム成形体に関する。本発明はさらに移植用材料に関する。

　機能障害又は機能不全に陥った生体組織又は臓器の再生を図る再生医療の実用化が進められている。再生医療は、生体が持っている自然治癒能力だけでは回復できなくなった生体組織において、細胞、足場及び成長因子の一種以上を使って元の組織と同じような形態及び機能を再生する医療技術である。再生医療においては、リン酸カルシウム成形体を使用する場合がある。

　特許文献１には、医科用、歯科用に用いられるリン酸カルシウムセメント及びリン酸カルシウム粉体が記載されている。特許文献１には、具体的には、リン酸カルシウムの粉体と、硬化用の液剤とを練和してなるリン酸カルシウムセメントであって、粉体と液剤との粉液比を１．５～３．５の範囲で変えたとき、JIS T6602で規定される稠度が２～１００ｍｍであるリン酸カルシウムセメントが記載されている。特許文献２には、ａ）燐酸カルシウム等の無機成分とその他の骨成分からなる粉末骨材を平面状の粉末層に形成する粉末層形成ステップと、ｂ）粉末層の一部に生体適合性を有する水溶液を噴射し、噴射部分を硬化させる部分硬化ステップと、ｃ）ａ）とｂ）のステップを繰り返して積層し、硬化部分が連結した所望の３次元構造の人工骨を成形する人工骨成形ステップとを有する粉末積層法による人工骨成形方法が記載されている。特許文献３には、カルシウム溶液とリン酸溶液とを含む混合液を調製し、その際混合液中にリン酸カルシウムからなる母材が存在するようにし、もって母材にリン酸カルシウムを析出させ、得られた複合体を熱処理するリン酸カルシウム系骨補填材の製造方法が記載されている。

　特許文献４には、サイトカインとリン酸カルシウムとを含有する生分解性樹脂膜を含む組織再生用部材であって、サイトカインとリン酸カルシウムとの比率が厚み方向で連続的に増加又は減少する傾斜構造を有する、組織再生用部材を、インクジェット方法により形成することが記載されている。また、特許文献５には、リン酸カルシウム粉末を含有してなる積層造形用粉末材料であって、リン酸カルシウム粉末表面にリン酸基もしくはカルボキシル基を有する有機化合物が所定の量で付与され、リン酸基もしくはカルボキシル基を有する有機化合物からなる粉末を所定の量で含み、かつ積層造形用粉末材料を硬化させてなる硬化物のハイドロキシアパタイト（ＨＡｐ）転移率が１％以下である積層造形用粉末材料が記載されている。

特開２００１－９５９１３号公報国際公開ＷＯ２００５／０１１５３６号公報特開２００６－２５９１５号公報特開２０１３－１０６７２１号公報特開２０１５－１８７０５８号公報

　上記の通り、リン酸カルシウムを含む材料を骨補填材又は組織再生用部材として使用することは知られているが、高い強度を有するリン酸カルシウム成形体を、迅速かつ高い造形精度で製造する方法の開発が望まれていた。

　本発明は、高い強度を有するリン酸カルシウム成形体を、迅速かつ高い造形精度で製造する方法、リン酸カルシウム成形体、及び移植用材料を提供することを解決すべき課題とした。

　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、Ｃａ／Ｐ（カルシウム／リン）の原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成した後に、有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記のリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによって、高い強度を有するリン酸カルシウム成形体を、迅速かつ高い造形精度で製造できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。

　即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞　Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び
有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記有機酸溶液を上記工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｂ；
を含む、リン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜２＞　上記工程ｂで使用する有機酸が、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸及びリンゴ酸からなる群から選択される少なくとも１種である、＜１＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜３＞　上記工程ｂの後に、
Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を、上記工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層の上に形成する工程ｃ；及び
有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記有機酸溶液を上記工程ｃで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｄ；
をさらに含む、＜１＞又は＜２＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜４＞　上記工程ｄで使用する有機酸が、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸及びリンゴ酸からなる群から選択される少なくとも１種である、＜３＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。

＜５＞　上記リン酸カルシウム粉末は、第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含み、第一のリン酸カルシウム粉末の上記有機酸に対する溶解性が、第二のリン酸カルシウム粉末の上記有機酸に対する溶解性よりも高く、
第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含む上記リン酸カルシウム粉末は、粒子径５～１５μｍの粒子と、粒子径２５～１００μｍの粒子とを少なくとも含み、粒子径２５μｍ以上の粒子を体積基準で２０％以上含む、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜６＞　第一のリン酸カルシウム粉末のフローファンクションが４．００未満であり、
第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含む上記リン酸カルシウム粉末のフローファンクションが４．００以上である、＜５＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法：但し、フローファンクションは、破壊強度をｆｃ、最大主応力をσ１とした時、σ１／ｆｃで表される。
＜７＞　工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液の濃度が１．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．４ｍｏｌ／Ｌ以下である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜８＞　工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸が、クエン酸である、＜７＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜９＞　工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液の塗布量が、０．２０ｇ／ｃｍ³以上０．３０ｇ／ｃｍ³以下である、＜７＞又は＜８＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜１０＞　工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液のｐＨが、２．５以上３．５以下である、＜１＞から＜９＞の何れか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。

＜１１＞　成形体の形成に使用されなかった、リン酸カルシウム粉末を除去する工程ｅをさらに含む、＜１＞から＜１０＞のいずれか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜１２＞　上記工程ｅの後、成形体を水溶液に浸漬することにより成形体を硬化させる工程ｆ、及び／又は成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｇを含む、＜１１＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜１３＞　成形体に生体親和性高分子を被覆する工程ｈをさらに含む、＜１＞から＜１２＞のいずれか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜１４＞　上記生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、＜１３＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜１５＞　上記工程ｈの後に、上記生体親和性高分子に細胞を播種する工程ｉをさらに含む、＜１３＞又は＜１４＞に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
＜１６＞　リン酸カルシウム成形体が、再生医療用足場材又は組織修復材である、＜１＞から＜１５＞のいずれか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。

＜１７＞　＜１＞から＜１６＞のいずれか一に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法により製造されるリン酸カルシウム成形体。
＜１８＞　再生医療用足場材又は組織修復材である、＜１７＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜１９＞　外部空間と連通している孔を有している、＜１７＞又は＜１８＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜２０＞　外部空間と連通している孔が、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通している、＜１９＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜２１＞　外部空間と連通している孔の平均径が２００μｍ～２０００μｍである、＜１９＞又は＜２０＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜２２＞　Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウムから形成されるリン酸カルシウム成形体であって、外部空間と連通している第一の孔及び当該第一の孔よりも平均径が大きい第二の孔を有する、リン酸カルシウム成形体。
＜２３＞　外部空間と連通している第一の孔の平均径が２００μｍ～２０００μｍである、＜２２＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜２４＞　外部空間と連通している第一の孔の数が、第一の孔よりも平均径が大きい第二の孔の数よりも多い、＜２２＞又は＜２３＞に記載のリン酸カルシウム成形体。

＜２５＞　表面の一部又は全部がリコンビナントゼラチンでコートされているリン酸カルシウム成形体を含む、移植用材料。
＜２６＞　上記リン酸カルシウムのＣａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８である、＜２５＞に記載の移植用材料。
＜２７＞　リコンビナントペプチドが、熱架橋又は化学架橋されている、＜２５＞又は＜２６＞に記載の移植用材料。
＜２８＞　リコンビナントペプチドでコートされているリン酸カルシウム成形体の表面が、移植用材料の表面および内部に存在する、＜２５＞から＜２７＞の何れか一に記載の移植用材料。
＜２９＞　リン酸カルシウム成形体が、ブロック状である、＜２５＞から＜２８＞の何れか一に記載の移植用材料。
＜３０＞　リン酸カルシウム成形体が、顆粒状である、＜２５＞から＜２８＞の何れか一に記載の移植用材料。

＜３１＞　リン酸カルシウムから形成されるリン酸カルシウム成形体であって、
外部空間と連通している孔を有し、
比重が０．７ｇ／ｍＬ以上であるか、および／又は水銀注入法による気孔率が７５％以下であり、
吸水浸透速度が、０．０５ｍｍ／秒以上である、
リン酸カルシウム成形体；
但し、吸水浸透速度とは、以下の条件で測定したものである。直径８ｍｍ高さ２０ｍｍのリン酸カルシウム成形体に、内径２ｍｍのプラスチック筒の一端を連結し、上記プラスチック筒の他端を長さ１００ｍｍのチューブの一端に連結し、上記チューブの他端を１０ｍＬのシリンジに連結した実験系を構築する。リン酸カルシウム成形体とプラスチック筒の接する高さと、シリンジ内のインキの水位の高さとが吸水浸透の開始から終了まで同じになるように調整した条件下において、シリンジ内のインキをリン酸カルシウム成形体に吸水浸透させる。インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとなったときは、15mmを浸透に要した時間で割った値を吸水浸透速度とし、インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとならない場合は、5分の時点においてインキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さを、浸透に要した時間である5分で割った値を、吸水浸透速度とする。
＜３２＞　上記リン酸カルシウムのＣａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８である、＜３１＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜３３＞　ナノフォーカスＸ線ＣＴ又はマイクロフォーカスＸ線ＣＴによる測定により判別される相対的に密な層と相対的に疎な層とが交互に積層された構造を有している、＜３１＞又は＜３２＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜３４＞　少なくとも５層以上の相対的に密な層と、少なくとも５層以上の相対的に疎な層とが交互に積層されている、＜３３＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜３５＞　第一の相対的に密な層と、上記第一の相対的に密な層の隣の第二の相対的に密な層とのピッチが５０～３００μｍである、＜３３＞又は＜３４＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜３６＞　リン酸カルシウム成形体のナノフォーカスＸ線ＣＴ画像に基づいて、成形体の一方向の距離を横軸に、相対ＣＴ強度を縦軸に表示した波形図において、山のピークと谷のピークとを交互に有する、＜３１＞又は＜３２＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜３７＞　少なくとも５つ以上の山のピークを有する、＜３６＞に記載のリン酸カルシウム成形体。
＜３８＞　第一の山のピークと、上記第一の山のピークの隣の第二の山のピークとのピッチが５０～３００μｍである、＜３６＞又は＜３７＞に記載のリン酸カルシウム成形体。

　本発明によるリン酸カルシウム成形体の製造方法によれば、高い強度を有するリン酸カルシウム成形体を、迅速かつ高い造形精度で製造することができる。本発明のリン酸カルシウム成形体は、高い強度を有する。本発明の移植材料は、細胞接着性に優れ、骨形成能が高い。

図１は、第一の孔のＸ連通孔、Ｙ連通孔及びＺ連通孔を有する成形体を示す。図２は、構造強化領域を有する成形体を示す。図３は、３Ｄプリンターによる成形体の作製の設計図を示す。図４は、作製した成形体を示す。図５は、β－ＴＣＰ粒子へのリコンビナントゼラチン修飾効果（細胞接着性）を確認した結果を示す。図６は、β－ＴＣＰ粒子へのリコンビナントゼラチン修飾効果（骨形成）を確認した結果を示す。図７は、吸水浸透速度の測定に用いた実験系を示す。図８は、疎密積層構造の解析に用いた対象物の構造を示す。図９は、ナノフォーカスＸ線ＣＴ解析において、密層（相対的に密な層）と疎層（相対的に疎な層）が視認できるように見え方を調整した結果を示す。図１０は、ナノフォーカスＸ線ＣＴ解析において、Z軸方向に３．１４ｍｍ、X軸方向に３．１４ｍｍの領域を選択した様子を示す。図１１は、図１０において選択した領域を白黒の程度に合わせて、波形化したものを示す。図１２は、ナノフォーカスＸ線ＣＴ解析において、Z軸方向に３．１２ｍｍ、Ｙ軸方向に３．１２ｍｍの領域を選択した様子を示す。図１３は、図１２において選択した領域を白黒の程度に合わせて、波形化したものを示す。図１４は、混合粉体の粒度分布の測定結果を示す。図１５は、ＴＴＣＰ粉体の粒度分布の測定結果を示す。図１６は、ＤＣＰＤ粉体の粒度分布の測定結果を示す。図１７は、ラット試験に用いたリン酸カルシウム成形体の模式図を示す。図１８は、試験Ａ（コントロール：欠損のみ）について、マイクロフォーカスＣＴ解析の結果を示す。図１９は、成形体Ｂのラット移植後８週間のマイクロＣＴ解析の結果を示す。図２０は、移植した成形体Ｂの０週から２週間ごとのマイクロＣＴ解析の結果を示す。図２１は、移植した成形体Ｂの８週間後のマイクロＣＴ解析の結果を示す。図２２は、移植した成形体Ｂの８週間後の病理標本、Ｈ＆Ｅ染色の結果を示す。図２３は、移植した成形体Ｂについてラット（２匹目）の８週間後の病理標本、Ｈ＆Ｅ染色の結果を示す。図２４は、移植した成形体Ｂについてラット（２匹目）の８週間後の病理標本、Ｈ＆Ｅ染色の結果を示す。図２５は、移植した成形体Bについてラット（３匹目）の8週間後の病理標本、von Kossa染色の結果を示す。図２６は、底面の反りの評価におけるクラス１から５の見本を示す。図２７は、リン酸カルシウム成形体について塗布量と圧縮強度の関係を示す。図２８は、リン酸カルシウム成形体について塗布量と底面の反りの関係を示す。図２９は、リン酸カルシウム成形体について圧縮強度と底面の反りの関係を示す。図３０は、３段階の連通孔を有するリン酸カルシウム成形体の模式図を示す。図３１は、３段階の連通孔を有するリン酸カルシウム成形体の走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）像を示す。

　以下、本発明について詳細に説明する。
　以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施態様に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施態様に限定されるものではない。
　なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。

［１］リン酸カルシウム成形体の製造方法
　本発明によるリン酸カルシウム成形体の製造方法は、
Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び
有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記有機酸溶液を上記工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｂ；
を含む。

　本発明においては、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を使用すること、並びに有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液を使用することにより、高い強度を有するリン酸カルシウム成形体を、迅速かつ高い造形精度（液滴のにじみ防止性が高い）で製造することができる。本発明の効果が得られるメカニズムとしては以下のメカニズムが想定されるが、以下のメカニズムによって本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

　リン酸カルシウムはｐＨ４以下ではＣａ／Ｐの原子数の比が１であるリン酸水素カルシウム（ＣａＨＰＯ₄：ＤＣＰＡとも言う）として析出する。本発明では、ｐＨ３．５以下である有機酸溶液を使用するが、これは、吐出後のｐＨ変化、具体的には、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１であるＤＣＰＡとして析出するのでＣａが余り、ｐＨはアルカリ側へシフトするためである。この際、余分となるＣａが溶解度の小さい塩として固化し、「高い硬化速度」、「成形体の高い強度」、並びに「液滴のにじみ防止による成形体の精度向上」という効果が達成されることが想定される。
　本明細書で言う「高い強度を有するリン酸カルシウム成形体」とは、リン酸カルシウム成形体が、成形後の取り扱い（例えば、成形体を装置から取り出する操作など）に耐えうる程度の強度を有していることを意味する。

＜１＞リン酸カルシウム粉末
　本発明で使用するリン酸カルシウム粉末におけるリン酸カルシウムにおいては、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８である。Ｃａ／Ｐの原子数の比は、好ましくは１．４５～１．７９であり、より好ましくは１．５０～１．７０である。
　Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末の製造方法は特に限定されないが、例えば、Ｃａ／Ｐの原子数の比が既知である２種類以上のリン酸カルシウム粉末を原料として使用し、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８となるように、上記２種類以上のリン酸カルシウム粉末を所定の比率で混合することにより、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を製造することができる。一例としては、リン酸カルシウム粉末の原料として、Ｃａ₄（ＰＯ₄）₂Ｏ（リン酸四カルシウム：ＴＴＣＰとも言う：Ｃａ／Ｐの原子数の比は２．０）と、ＣａＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ（リン酸水素カルシウム二水和物：ＤＣＰＤとも言う：Ｃａ／Ｐの原子数の比は１．０）とを用いて、ＴＴＣＰとＤＣＰＤとの混合比率を変化させることにより、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を製造することができる。

　粉末の粒径は、反応性の点では小さい方が優れるが、粉末層を形成しやすくする点では、粒径は、好ましくは１μｍ～１００μｍであり、より好ましくは５μｍ～５０μｍであり、さらに好ましくは１０μｍ～３０μｍである。なお、粒径は、レーザ回折散乱式粒度分布測定法で測定することができ、具体的には、レーザ回折散乱式粒度分布測定装置／堀場製作所製／ＬＡ－９２０や株式会社セイシン企業製のＬＭＳ－２０００ｅにより測定することができる。

　好ましくは、リン酸カルシウム粉末は、第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含み、第一のリン酸カルシウム粉末の有機酸（後記する）に対する溶解性が、第二のリン酸カルシウム粉末の有機酸（後記する）に対する溶解性よりも高い。
　好ましくは、第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含む上記のリン酸カルシウム粉末は、粒子径５～１５μｍの粒子と、粒子径２５～１００μｍの粒子とを少なくとも含み、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で5.0%以上（より好ましくは10%以上、さらに好ましくは15%以上含む）、粒子径２５μｍ以上の粒子を体積基準で２０％以上（より好ましくは２５％以上、さらに好ましくは３０％以上）含む。

　好ましくは、第一のリン酸カルシウム粉末のフローファンクションが４．００未満であり、第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含むリン酸カルシウム粉末のフローファンクションが４．００以上である。ここで、フローファンクションは、破壊強度をｆｃ、最大主応力をσ１とした時、σ１／ｆｃで表される。フローファンクションは、ブルックフィールド製の「パウダーフローテスター、PFT」などの測定装置を用いて後記する実施例の記載に準じて測定することができる。

＜２＞リン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ
　本発明における工程ａは、リン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程である。
　基板の材質、形状、及び大きさは、特に限定されず、目的に応じて適切な基板を使用することができる。基板としては、所定の面積の平面を有する基板が好ましい。基板の表面積は特に限定されないが、好ましくは５～２００ｃｍ²であり、より好ましくは２０～１００ｃｍ²である。

　基板の材質としては、アクリル、メタクリル（ポリメタクリル酸メチル樹脂など）、ポリスチレン、及びポリプロピレン等のプラスチック素材、ガラス等の無機素材、並びに銅、アルミニウム及びステンレス鋼などの金属素材等が挙げられる。

　リン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程は、任意の方法で行うことができ、その方法は特に限定されないが、例えば、３Ｄプリンタ（三次元プリンター）を用いて行うことができる。３Ｄプリンタの一例としては、Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓ（３Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧　Ｚ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））等を使用できるが、特に限定されない。

＜３＞有機酸溶液
　本発明においては、有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液を使用する。有機酸のカルシウム塩の溶解度は、温度２５℃における溶解度を意味する。
　有機酸溶液について、有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であればよいが、好ましくは０．５ｇ／１００ｍＬ以下であり、より好ましくは０．１ｇ／１００ｍＬ以下である。
　上記の溶解度を満たす有機酸としては、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸及びリンゴ酸からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、クエン酸、シュウ酸又は酒石酸がより好ましく、クエン酸がさらに好ましい。

　有機酸溶液のｐＨは５以下であり、好ましくは１．０～３．５であり、より好ましくは２．５以上３．５以下であり、さらに好ましくは３．０以上３．５以下である。
　ｐＨ３．５以下である有機酸溶液は、有機酸及び有機酸の塩（有機酸のナトリウム塩など）の混合比を調整することにより、製造することができる。
　有機酸溶液における有機酸の濃度は、特に限定されないが、一般的には０．１ｍｏｌ／Ｌ以上５．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ以上３．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、より好ましくは１．０ｍｏｌ／Ｌ以上２．０ｍｏｌ／Ｌ以下であり、さらに好ましくは１．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．４ｍｏｌ／Ｌ以下である。

＜４＞有機酸溶液の吐出を含むリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｂ
　本発明においては、有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記有機酸溶液を工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることにより、リン酸カルシウム成形体を製造する。

　本発明においては、有機酸溶液を液滴状態で吐出させる。液滴状態とは、ノズル部から吐出した有機酸溶液が、ノズル部と基板上のリン酸カルシウム粉末を含有する層のいずれにも接触せずに、空間中を移動する状態である。

　本発明においては、有機酸溶液を液滴状態で吐出させる際の温度は特に限定されないが、一般的には　１５℃以上５０℃以下であり、好ましくは　２０℃以上４０℃以下であり、例えば、室温である。

　有機酸溶液の吐出は、ノズル部を有するインクジェットヘッドを用いて行うことができる。インク液滴をピエゾ素子のアクチュエータ等によりノズル部から吐出し、媒体に着弾させて媒体上に画像を形成するインクジェット記録装置が知られている。インクジェット記録装置では、ノズル部の配列ピッチが高密度化されるとともに、数ピコリットル～１００ピコリットルの微小なインク液滴を吐出することが可能である。特開２０１２－４５５５号公報には、インクジェット方式による機能材料の製造方法及び装置が記載されているが、有機酸溶液の吐出は、特開２０１２－４５５５号公報に記載されているようなインクジェットヘッドを用いて行うことができる。特開２０１２－４５５５号公報に記載の内容は全て本明細書に引用されるものとする。

　インクジェットヘッドは水平方向について自在に移動可能に構成されていることが好ましい。固定された基板に対してインクジェットヘッドを移動させてもよいし、インクジェットヘッド及び基板の両方を移動させてもよい。インクジェットヘッドは、インクタンクから供給されるインク（即ち、有機酸溶液）を基板上の粉末を含有する層の所望の位置に対して吐出するものである。

　インクジェットの方式としては、コンティニュアス型、オンデマンド型のいずれでもよいが、数１０ｃｍ四方以上の大面積に吐出する場合には、ノズルが複数あるオンデマンド型が好ましい。オンデマンド型の吐出方式を特徴付けるアクチュエータは、ピエゾ方式、サーマル方式、ソリッド方式、静電吸引方式等の種々の方式を用いることができる。ピエゾ方式は、水系以外に、有機溶剤系を吐出することも可能である。ノズルの並びについても、単列に配置、複数列に配置、千鳥格子状に配置のいずれでも構わない。

　上記の有機酸溶液の吐出を含むリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｂは、例えば、インクジェットヘッドを備えた３Ｄプリンタ（三次元プリンター）を用いて行うことができる。３Ｄプリンタの一例としては、Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓ（３Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧　Ｚ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等を使用できるが、特に限定されない。

　本発明の方法で製造されるリン酸カルシウム成形体の大きさは特に限定されないが、リン酸カルシウム成形体を直方体に近似した場合で、直方体の縦、横及び高さはそれぞれ、好ましくは０．１ｍｍ～２００ｍｍであり、より好ましくは１ｍｍ～１００ｍｍである。

＜５＞積層
　本発明によるリン酸カルシウム成形体の製造方法は、上記の工程ｂの後に、
Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を、工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層の上に形成する工程ｃ；及び有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、上記の有機酸溶液を工程ｃで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｄ；
をさらに含んでいてもよい。

　上記の工程ｃは、工程ａと同様に行うことができる。工程ｃで使用する材料の種類は、工程ａと同一でもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
　上記の工程ｄは、工程ｂと同様に行うことができる。工程ｄで使用する材料の種類は、工程ｂと同一でもよいし、異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
　工程ｄで使用する有機酸は、工程ｂの場合と同様に、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸及びリンゴ酸からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましく、クエン酸、シュウ酸又は酒石酸がより好ましく、クエン酸がさらに好ましい。

　工程ｃ及び工程ｄを行う場合、その回数は特に限定されず、１回以上の任意の回数で行うことができ、例えば、１回～１０００回行うことができる。
　工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液の塗布量は、一般的には０．１０ｇ／ｃｍ³以上０．４０ｇ／ｃｍ³以下であり、好ましくは、０．２０ｇ／ｃｍ³以上０．３０ｇ／ｃｍ³以下である。

＜６＞リン酸カルシウム粉末を除去する工程
　本発明においては、成形体の形成に使用されなかったリン酸カルシウム粉末を除去する工程ｅをさらに設けることができる。リン酸カルシウム粉末を除去するとは、リン酸カルシウム粉末を、成形体の表面から除去することである。
　成形体の形成に使用されなかったリン酸カルシウム粉末を除去することによって、所望の形状に成形された成形体を回収することができる。なお、本発明においては、形成された成形体が所定の強度を有していることにより、成形体を破損することなく、成形体の形成に使用されなかったリン酸カルシウム粉末を除去することができる。

　成形体の形成に使用されなかったリン酸カルシウム粉末を除去する方法は特に限定されず、例えば、圧縮空気を用いて行ってもよい。

＜７＞成形体を硬化させる工程
　本発明においては、成形体の形成に使用されなかったリン酸カルシウム粉末を除去する工程ｅの後に、成形体を水溶液に浸漬することにより成形体を硬化させる工程ｆ、及び／又は成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｇをさらに設けることができる。但し、工程ｆ及び工程ｇはそれぞれ設けてもよいし、設けなくてもよい。
　上記の工程f及び／又は工程ｇを行うことにより、添加した有機酸を除去することができ、成形体の強度を更に高めることができる。

　また、上記の工程ｃ及び工程ｄを行う場合（即ち、リン酸カルシウム粉末を含有する層を積層する場合）には、工程ｆにより成形体を硬化させることによって、成形体の強度をより高めることができる。リン酸カルシウム粉末を含有する層の間の強度の向上に起因して、成形体の強度がより高められるものと推定される。即ち、本発明の好ましい態様においては、工程ａ及び工程ｂを行った後に、工程ｃ及び工程ｄを行い、その後、成形体の形成に使用されなかったリン酸カルシウム粉末を除去する工程ｅを行い、さらに工程ｅの後に、成形体を水溶液に浸漬することにより成形体を硬化させる工程ｆを行うことができる。

　成形体を水溶液に浸漬することにより成形体を硬化させる工程ｆにおいて使用する水溶液の種類は、成形体を硬化できる限り特に限定されず、例えば、リン酸水溶液などが挙げられ、より具体的には、０．１ｍｏｌ／Ｌ～１．０ｍｏｌ／Ｌのリン酸二水素ナトリウム溶液などを使用することができる。上記水溶液のｐＨは特に限定されないが、一般的にはｐＨ３～１１であり、好ましくはｐＨ３～１０であり、より好ましくはｐＨ４～９である。
　成形体を水溶液に浸漬する時間は、特に限定されないが、一般的には１時間から４８時間であり、好ましくは２時間から２４時間であり、より好ましくは４時間から２４時間である。

　成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｇは、成形体を、一般的には１００℃～２０００℃、好ましくは２００℃～１５００℃であり、より好ましくは５００℃～１５００℃、さらに好ましくは１０００℃～１３００℃、特に好ましくは１１００℃～１２００℃の温度で加熱することにより行うことができる。但し、Ｔ〔ケルビン：Ｋ〕＝ｔ〔セルシウス度：℃〕＋２７３．１５である。

　加熱時間は、特に限定されないが、一般的には１時間から４８時間であり、好ましくは１時間から２４時間であり、より好ましくは２時間から１２時間であり、さらに好ましくは２時間から６時間である。
　加熱は、マッフル炉などを用いて常法により行うことができる。

　上記した成形体を硬化させる工程ｆ及び／又は工程ｇを行うことにより、成形体の圧縮強度を高めることができる。工程ｆ及び／又は工程ｇを行った成形体の圧縮強度は特に限定されないが、好ましくは２．５ＭＰａ以上であり、より好ましくは３．０ＭＰａ以上であり、さらに好ましくは３．５ＭＰａ以上であり、圧縮強度の上限は特に限定されないが、一般的には１０ＭＰａ以下である。

＜８＞生体親和性高分子を被覆する工程
　本発明においては、成形体に生体親和性高分子を被覆する工程ｈをさらに設けることができる。但し、工程ｈは設けてもよいし、設けなくてもよい。成形体を生体親和性高分子で被覆することにより、細胞を吸着させ易くすることができる。好ましくは、本明細書で上記したような成形体を硬化させる工程ｆ及び／又は工程ｇを行うことにより酸を成形体から除去した後に、成形体に生体親和性高分子（好ましくは、後記するリコンビナントゼラチン）を被覆することにより、生体親和性高分子と酸との反応を防止することができる。即ち、本発明の好ましい態様においては、成形体を硬化させる工程ｆ及び／又は工程ｇを行った後に、成形体に生体親和性高分子を被覆する工程ｈを行うことができる。

（８－１）生体親和性高分子
　生体親和性とは、生体に接触した際に、長期的かつ慢性的な炎症反応などのような顕著な有害反応を惹起しないことを意味する。生体親和性高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性高分子であることが好ましい。非生分解性材料として具体的には、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコーン、及びＭＰＣ（2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）などが挙げられる。生分解性材料としては、具体的には、天然由来のペプチド、リコンビナントペプチド（ＲＣＰ）又は化学合成ペプチドなどのポリペプチド（例えば、以下に説明するゼラチン等）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、及びキトサンなどが挙げられる。上記の中でも、リコンビナントペプチドが特に好ましい。これら生体親和性高分子には細胞接着性を高める工夫がなされていてもよい。具体的には、「基材表面に対する細胞接着基質（フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン）や細胞接着配列（アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列）ペプチドによるコーティング」、「基材表面のアミノ化、カチオン化」、又は「基材表面のプラズマ処理、コロナ放電による親水性処理」といった方法を使用できる。

　リコンビナントペプチド又は化学合成ペプチドを含むポリペプチドの種類は、生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。

　本発明で用いるゼラチンとしては、好ましくは、天然ゼラチン、リコンビナントゼラチン又は化学合成セラチンであり、さらに好ましくはリコンビナントゼラチンである。天然ゼラチンとは天然由来のコラーゲンより作られたゼラチンを意味する。ゼラチンが由来する生物は特に限定されず、例えば、動物（哺乳類、魚類など）由来のゼラチンを使用することができる。

　化学合成ペプチド又は化学合成ゼラチンとは、人工的に合成したペプチド又はゼラチンを意味する。ゼラチン等のペプチドの合成は、固相合成でも液相合成でもよいが、好ましくは固相合成である。ペプチドの固相合成は当業者に公知であり、例えば、アミノ基の保護としてＦｍｏｃ基（Fluorenyl-Methoxy-Carbonyl基）を使用するＦｍｏｃ基合成法、並びにアミノ基の保護としてＢｏｃ基（tert-Butyl Oxy Carbonyl基）を使用するＢｏｃ基合成法などが挙げられる。なお、化学合成ゼラチンの好ましい態様は、本明細書中後記のリコンビナントゼラチンに記載した内容を当てはめることができる。
　リコンビナントゼラチンについては、本明細書中後記する。

　生体親和性高分子の親水性値「１／ＩＯＢ」値は、０から１．０が好ましい。より好ましくは、０から０．６であり、さらに好ましくは０から０．４である。ＩＯＢとは、藤田穆により提案された有機化合物の極性/非極性を表す有機概念図に基づく、親疎水性の指標であり、その詳細は、例えば、"Pharmaceutical Bulletin",vol.2, 2, pp.163-173（1954）、「化学の領域」vol.11, 10, pp.719-725（1957）、「フレグランスジャーナル」,vol.50, pp.79-82（1981）等で説明されている。簡潔に言えば、全ての有機化合物の根源をメタン（ＣＨ₄）とし、他の化合物はすべてメタンの誘導体とみなして、その炭素数、置換基、変態部、環等にそれぞれ一定の数値を設定し、そのスコアを加算して有機性値（ＯＶ）、無機性値（ＩＶ）を求め、この値を、有機性値をＸ軸、無機性値をＹ軸にとった図上にプロットしていくものである。有機概念図におけるＩＯＢとは、有機概念図における有機性値（ＯＶ）に対する無機性値（ＩＶ）の比、すなわち「無機性値（ＩＶ）／有機性値（ＯＶ）」をいう。有機概念図の詳細については、「新版有機概念図－基礎と応用－」（甲田善生等著、三共出版、２００８）を参照されたい。本明細書中では、ＩＯＢの逆数をとった「１／ＩＯＢ」値で親疎水性を表している。「１／ＩＯＢ」値が小さい（０に近づく）程、親水性であることを表す表記である。

　本発明で用いる生体親和性高分子がポリペプチドである場合は、Grand average of hydropathicity（GRAVY）値で表される親疎水性指標において、０．３以下、マイナス９．０以上であることが好ましく、０．０以下、マイナス７．０以上であることがさらに好ましい。Grand average of hydropathicity（GRAVY）値は、『Gasteiger E., Hoogland C., Gattiker A., Duvaud S., Wilkins M.R., Appel R.D., Bairoch A.;Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server;(In) John M. Walker (ed): The Proteomics Protocols Handbook, Humana Press (2005). pp. 571-607』及び『Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D., Bairoch A.; ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.; Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003).』の方法により得ることができる。

（８－２）架橋
　生体親和性高分子は、架橋されているものでもよいし、架橋されていないものでもよい。一般的な架橋方法としては、熱架橋、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）による架橋、縮合剤（カルボジイミド、シアナミドなど）による架橋、酵素架橋、光架橋、紫外線架橋、疎水性相互作用、水素結合、イオン性相互作用などが知られており、本発明においても上記の架橋方法を使用することができる。本発明で使用する架橋方法としては、さらに好ましくは熱架橋、紫外線架橋、又は酵素架橋であり、特に好ましくは熱架橋である。

　酵素による架橋を行う場合、酵素としては、高分子材料間の架橋作用を有するものであれば特に限定されないが、好ましくはトランスグルタミナーゼ及びラッカーゼ、最も好ましくはトランスグルタミナーゼを用いて架橋を行うことができる。トランスグルタミナーゼで酵素架橋するタンパク質の具体例としては、リジン残基及びグルタミン残基を有するタンパク質であれば特に制限されない。トランスグルタミナーゼは、哺乳類由来のものであっても、微生物由来のものであってもよく、具体的には、味の素（株）製アクティバシリーズ、試薬として販売されている哺乳類由来のトランスグルタミナーゼ、例えば、オリエンタル酵母工業（株）製、Upstate USA Inc.製、Biodesign International製などのモルモット肝臓由来トランスグルタミナーゼ、ヤギ由来トランスグルタミナーゼ、ウサギ由来トランスグルタミナーゼなど、ヒト由来の血液凝固因子（Factor XIIIa、Haematologic Technologies，Inc.社）などが挙げられる。

　架橋（例えば、熱架橋）を行う際の反応温度は、架橋ができる限り特に限定されないが、好ましくは、－１００℃～５００℃であり、より好ましくは０℃～３００℃であり、更に好ましくは５０℃～３００℃であり、更に好ましくは１００℃～２５０℃であり、更に好ましくは１２０℃～２００℃である。

（８－３）リコンビナントゼラチン
　本発明で用いるゼラチンとしては、リコンビナントゼラチンが好ましい。
　リコンビナントゼラチンとは、遺伝子組み換え技術により作られたゼラチン類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくは蛋白様物質を意味する。本発明で用いることができるリコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列（Ｘ及びＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す）の繰り返しを有するものが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。好ましくは、細胞接着シグナルが一分子中に２配列以上含まれている。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとしては、コラーゲンの部分アミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を有するリコンビナントゼラチンを用いることができる。例えばＥＰ１０１４１７６、米国特許６９９２１７２号、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１等に記載のものを用いることができるが、これらに限定されるものではない。本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして好ましいものは、以下の態様のリコンビナントゼラチンである。

　リコンビナントゼラチンは、天然のゼラチン本来の性能から、生体親和性に優れ、且つ天然由来ではないことで牛海綿状脳症（ＢＳＥ）などの懸念がなく、非感染性に優れている。また、リコンビナントゼラチンは天然ゼラチンと比べて均一であり、配列が決定されているので、強度及び分解性においても架橋等によってブレを少なく精密に設計することが可能である。

　リコンビナントゼラチンの分子量は、特に限定されないが、好ましくは２０００以上１０００００以下（２ｋＤａ（キロダルトン）以上１００ｋＤａ以下）であり、より好ましくは２５００以上９５０００以下（２．５ｋＤａ以上９５ｋＤａ以下）であり、さらに好ましくは５０００以上９００００以下（５ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）であり、最も好ましくは１００００以上９００００以下（１０ｋＤａ以上９０ｋＤａ以下）である。

　リコンビナントゼラチンは、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列の繰り返しを有することが好ましい。ここで、複数個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙにおいて、Ｇｌｙはグリシンを表し、Ｘ及びＹは、
任意のアミノ酸（好ましくは、グリシン以外の任意のアミノ酸）を表す。コラーゲンに特徴的なＧｌｙ－Ｘ－Ｙで示される配列とは、ゼラチン及びコラーゲンのアミノ酸組成及び配列における、他のタンパク質と比較して非常に特異的な部分構造である。この部分においてはグリシンが全体の約３分の１を占め、アミノ酸配列では３個に１個の繰り返しとなっている。グリシンは最も簡単なアミノ酸であり、分子鎖の配置への束縛も少なく、ゲル化に際してのヘリックス構造の再生に大きく寄与している。Ｘ及びＹで表されるアミノ酸はイミノ酸（プロリン、オキシプロリン）が多く含まれ、全体の１０％～４５％を占めることが好ましい。好ましくは、リコンビナントゼラチンの配列の８０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上のアミノ酸が、Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙの繰り返し構造である。

　一般的なゼラチンは、極性アミノ酸のうち電荷を持つものと無電荷のものが１：１で存在する。ここで、極性アミノ酸とは具体的にシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン及びアルギニンを指し、このうち極性無電荷アミノ酸とはシステイン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンを指す。本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいては、構成する全アミノ酸のうち、極性アミノ酸の割合が１０～４０％であり、好ましくは２０～３０％である。上記極性アミノ酸中の無電荷アミノ酸の割合が好ましくは５％以上２０％未満であり、より好ましくは５％以上１０％未満である。さらに、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうちいずれか１アミノ酸を配列上に含まないことが好ましく、セリン、スレオニン、アスパラギン、チロシン及びシステインのうち２以上のアミノ酸を配列上に含まないことがより好ましい。

　一般にポリペプチドにおいて、細胞接着シグナルとして働く最小アミノ酸配列が知られている（例えば、株式会社永井出版発行「病態生理」Ｖｏｌ．９、Ｎｏ．７（１９９０年）５２７頁）。本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、これらの細胞接着シグナルを一分子中に２以上有することが好ましい。具体的な配列としては、接着する細胞の種類が多いという点で、アミノ酸一文字表記で現わされる、ＲＧＤ配列、ＬＤＶ配列、ＲＥＤＶ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＲＹＶＶＬＰＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＲＮＩＡＥＩＩＫＤＩ配列、ＩＫＶＡＶ配列、ＬＲＥ配列、ＤＧＥＡ配列、及びＨＡＶ配列の配列が好ましい。さらに好ましくはＲＧＤ配列、ＹＩＧＳＲ配列、ＰＤＳＧＲ配列、ＬＧＴＩＰＧ配列、ＩＫＶＡＶ配列及びＨＡＶ配列、特に好ましくはＲＧＤ配列である。ＲＧＤ配列のうち、好ましくはＥＲＧＤ配列である。細胞接着シグナルを有するリコンビナントゼラチンを用いることにより、細胞の基質産生量を向上させることができる。

　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおけるＲＧＤ配列の配置としては、ＲＧＤ間のアミノ酸数が０～１００の間で均一でないことが好ましく、ＲＧＤ間のアミノ酸数が２５～６０の間で均一でないことがより好ましい。
　この最小アミノ酸配列の含有量は、細胞接着及び増殖性の観点から、タンパク質１分子中３～５０個が好ましく、さらに好ましくは４～３０個、特に好ましくは５～２０個である。最も好ましくは１２個である。

　本発明で用いるリコンビナントゼラチンにおいて、アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は少なくとも０．４％であることが好ましい。リコンビナントゼラチンが３５０以上のアミノ酸を含む場合、３５０のアミノ酸の各ストレッチが少なくとも１つのＲＧＤモチーフを含むことが好ましい。アミノ酸総数に対するＲＧＤモチーフの割合は、より好ましくは少なくとも０．６％であり、更に好ましくは少なくとも０．８％であり、更に一層好ましくは少なくとも１．０％であり、特に好ましくは少なくとも１．２％であり、最も好ましくは少なくとも１．５％である。リコンビナントペプチド内のＲＧＤモチーフの数は、２５０のアミノ酸あたり、好ましくは少なくとも４、より好ましくは６、更に好ましくは８、特に好ましくは１２以上１６以下である。ＲＧＤモチーフの０．４％という割合は、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも１つのＲＧＤ配列に対応する。ＲＧＤモチーフの数は整数であるので、０．４％の特徴を満たすには、２５１のアミノ酸からなるゼラチンは、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含まなければならない。好ましくは、本発明のリコンビナントゼラチンは、２５０のアミノ酸あたり、少なくとも２つのＲＧＤ配列を含み、より好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも３つのＲＧＤ配列を含み、さらに好ましくは２５０のアミノ酸あたり、少なくとも４つのＲＧＤ配列を含む。本発明のリコンビナントゼラチンのさらなる態様としては、少なくとも４つのＲＧＤモチーフ、好ましくは６つ、より好ましくは８つ、さらに好ましくは１２以上１６以下のＲＧＤモチーフを含む。

　リコンビナントゼラチンは部分的に加水分解されていてもよい。

　好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ａ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）_n］_m－Ｂで示されるものである。ｎ個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、ｎ個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。ｍは好ましくは２～１０の整数を示し、より好ましくは３～５の整数を示す。ｎは３～１００の整数が好ましく、１５～７０の整数がさらに好ましく、５０～６５の整数が最も好ましい。Ａは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示し、Ｂは任意のアミノ酸又はアミノ酸配列を示す。なお、ｎ個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。

　より好ましくは、本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－［（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）₆₃］₃－Ｇｌｙ（式中、６３個のＸはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示し、６３個のＹはそれぞれ独立にアミノ酸の何れかを示す。なお、６３個のＧｌｙ－Ｘ－Ｙはそれぞれ同一でも異なっていてもよい。）で示されるものである。

　繰り返し単位には天然に存在するコラーゲンの配列単位を複数結合することが好ましい。ここで言う天然に存在するコラーゲンとは天然に存在するものであればいずれでも構わないが、好ましくはＩ型、II型、III型、IV型、又はV型コラーゲンである。より好ましくは、I型、II型、又はIII型コラーゲンである。別の形態によると、上記コラーゲンの由来は好ましくは、ヒト、ウシ、ブタ、マウス又はラットであり、より好ましくはヒトである。

　本発明で用いるリコンビナントゼラチンの等電点は、好ましくは５～１０であり、より好ましくは６～１０であり、さらに好ましくは７～９．５である。リコンビナントゼラチンの等電点の測定は、等電点電気泳動法（Ｍａｘｅｙ，Ｃ．Ｒ．（１９７６；Ｐｈｉｔｏｇｒ．Ｇｅｌａｔｉｎ２，ＥｄｉｔｏｒＣｏｘ，Ｐ．Ｊ．Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌ．参照）に記載されたように、１質量％ゼラチン溶液をカチオン及びアニオン交換樹脂の混晶カラムに通したあとのｐＨを測定することで実施することができる。

　好ましくは、リコンビナントゼラチンは脱アミン化されていない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンはテロペプタイドを有さない。
　好ましくは、リコンビナントゼラチンは、アミノ酸配列をコードする核酸により調製された実質的に純粋なポリペプチドである。

　本発明で用いるリコンビナントゼラチンとして特に好ましくは、
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド；
（２）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；又は
（３）配列番号１に記載のアミノ酸配列と８０％以上（さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ生体親和性を有するペプチド；の何れかである。

　本発明における配列同一性は、以下の式で計算される値を指す。
％配列同一性＝［（同一残基数）／（アラインメント長）］×１００
　２つのアミノ酸配列における配列同一性は当業者に公知の任意の方法で決定することができ、ＢＬＡＳＴ（(Basic Local Alignment Search Tool)）プログラム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０，１９９０）等を使用して決定することができる。

　「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」における「１若しくは数個」とは、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個、特に好ましくは１～３個を意味する。

　本発明で用いるリコンビナントゼラチンは、当業者に公知の遺伝子組み換え技術によって製造することができ、例えばＥＰ１０１４１７６Ａ２号公報、米国特許第６９９２１７２号公報、国際公開ＷＯ２００４／８５４７３号、国際公開ＷＯ２００８／１０３０４１号等に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、所定のリコンビナントゼラチンのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで、組み換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、リコンビナントゼラチンが産生されるので、培養物から産生されたリコンビナントゼラチンを回収することにより、本発明で用いるリコンビナントゼラチンを調製することができる。

（８－４）生体親和性高分子による被覆
　成形体に生体親和性高分子を被覆する方法は、特に限定されないが、生体親和性高分子溶液を使用することができる。生体親和性高分子溶液に使用する溶媒は、生体親和性高分子を溶解できる溶媒であれば、特に限定されないが、一般的には、水、有機溶媒、又は水と有機溶媒の混合物であり、好ましくは水、又は水と有機溶媒の混合物などの水性媒体である。有機溶媒としては、例えば、アセトン、エタノール等があげられる。ゼラチン溶液の場合には、好ましくは、ゼラチン水溶液を使用することができる。

　生体親和性高分子溶液における生体親和性高分子の濃度は特に限定されないが、一般的には１質量％～５０質量％であり、好ましくは２～４０質量％であり、より好ましくは３～３０質量％である。

　上記の生体親和性高分子溶液で成形体を処理することによって、成形体に生体親和性高分子を被覆することができる。具体的には、成形体を生体親和性高分子溶液に浸し、乾燥することにより、成形体に生体親和性高分子を被覆することができる。

＜９＞生体親和性高分子に細胞を播種する工程
　本発明においては、上記した成形体に生体親和性高分子を被覆する工程ｈの後に、生体親和性高分子に細胞を播種する工程ｉをさらに設けることができる。
　本発明における成形体の用途は、後記の通り、再生医療用足場材又は組織修復材などが意図されるが、成形体に細胞を播種して使用する場合と、成形体に細胞を播種せずに使用する場合とが想定される。

　播種する細胞の種類は特に限定されず、使用目的に応じて適宜選択することができる。
　使用する細胞として、好ましくは、動物細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞、特に好ましくはヒト由来細胞である。脊椎動物由来細胞（特に、ヒト由来細胞）の種類は、万能細胞、体性幹細胞、前駆細胞、又は成熟細胞の何れでもよい。万能細胞としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、生殖幹（ＧＳ）細胞、又は人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を使用することができる。体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、又は神経幹細胞を使用することができる。前駆細胞及び成熟細胞としては、例えば、皮膚、真皮、表皮、筋肉、心筋、神経、骨、軟骨、内皮、脳、上皮、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、口腔内、角膜、骨髄、臍帯血、羊膜、又は毛に由来する細胞を使用することができる。ヒト由来細胞としては、例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ＭＳＣ、軟骨細胞、骨芽細胞、骨芽前駆細胞、間充織細胞、筋芽細胞、心筋細胞、心筋芽細胞、神経細胞、肝細胞、ベータ細胞、線維芽細胞、角膜内皮細胞、血管内皮細胞、角膜上皮細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞、又は造血幹細胞を使用することができる。また、細胞の由来は、自家細胞又は他家細胞の何れでも構わない。

＜１０＞本発明の方法で製造されるリン酸カルシウム成形体の用途
　本発明によるリン酸カルシウム成形体の製造方法で製造されるリン酸カルシウム成形体の用途は特に限定されないが、好ましくは再生医療用足場材又は組織修復材である。リン酸カルシウム成形体の用途については本明細書中において後記する。

［２］リン酸カルシウム成形体
　本発明はさらに、上記［１］に記載した本発明によるリン酸カルシウム成形体の製造方法により製造されるリン酸カルシウム成形体を提供する。
　本発明のリン酸カルシウム成形体は、高い強度を有し、かつ迅速かつ高い造形精度で製造することができる。

　本発明はさらに、リン酸カルシウムから形成されるリン酸カルシウム成形体であって、外部空間と連通している孔を有し、
比重が０．７ｇ／ｍＬ以上であるか、および／又は水銀注入法による気孔率が７５％以下であり、吸水浸透速度が、０．０５ｍｍ／秒以上である、リン酸カルシウム成形体を提供する。

　リン酸カルシウム成形体の比重は０．７ｇ／ｍＬ以上であり、好ましくは０．75ｇ／ｍＬ以上であり、より好ましくは０．85ｇ／ｍＬ以上である。

　リン酸カルシウム成形体の水銀注入法による気孔率は７５％以下であり、より好ましくは７０％以下であり、さらに好ましくは６７％以下であり、特に好ましくは６５％以下である。
　水銀圧入法とは、水銀の表面張力が大きいことを利用して粉体の細孔に水銀を浸入させるために圧力を加え、圧力と圧入された水銀量から比表面積や細孔分布を求める方法であり、気孔率はＰＯＲＥＭＡＳＴＥＲ　６０ＧＴ（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製）等の装置を使用して測定することができる。

　リン酸カルシウム成形体の吸水浸透速度は、０．０５ｍｍ／秒以上であり、好ましくは０．１０ｍｍ／秒以上であり、より好ましくは０．３０ｍｍ／秒以上であり、より一層好ましくは０．５０ｍｍ／秒以上であり、さらに好ましくは０．７０ｍｍ／秒以上であり、更に一層好ましくは０．８０ｍｍ／秒以上であり、特に好ましくは０．９０ｍｍ／秒以上である。
　リン酸カルシウム成形体の吸水浸透速度は、Ｘ方向（描画方向）、Ｙ方向（リコート走査方向）及びＺ方向（積層方向）のうちの少なくとも一つの方向において、上記の吸水浸透速度を満たしていればよいが、好ましくは上記のうちの何れか二つの方向において上記の吸水浸透速度を満たし、より好ましくは上記の全方向（三方向）において上記の吸水浸透速度を満たしている。

　本発明における吸水浸透速度とは、以下の条件で測定したものである。測定中の実験室の温度を20～25℃、湿度を25～40%に保ち、直径８ｍｍ高さ２０ｍｍのリン酸カルシウム成形体に、内径２ｍｍのプラスチック筒の一端を連結し、上記プラスチック筒の他端を長さ１００ｍｍのチューブの一端に連結し、上記チューブの他端を１０ｍＬのシリンジに連結した実験系を構築する。リン酸カルシウム成形体とプラスチック筒の接する高さと、シリンジ内のインキの水位の高さとが吸水浸透の開始から終了まで同じになるように調整した条件下において、シリンジ内のインキをリン酸カルシウム成形体に吸水浸透させる。インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとなったときは、15mmを、浸透に要した時間で割った値を、吸水浸透速度とする。インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとならない場合は、5分の時点においてインキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さを定規で測定し、浸透に要した時間で割った値を、吸水浸透速度とする。

　上記のリン酸カルシウム成形体におけるリン酸カルシウムにおいては、Ｃａ／Ｐの原子数の比が、好ましくは１．４～１．８であり、より好ましくは１．４５～１．７９であり、さらに好ましくは１．５０～１．７０である。

　本発明のリン酸カルシウム成形体は、好ましくは、相対的に密な層と相対的に疎な層と交互に積層された構造を有している。相対的に密な層及び相対的に疎な層とは、ナノフォーカスＸ線ＣＴ又はマイクロフォーカスＸ線ＣＴによる測定により、相対的に密な層および相対的に疎な層であると判別できる層を意味する。相対的に密な層とは、相対的に疎な層よりも密であることを意味し、相対的に疎な層とは、相対的に密な層よりも、疎であることを意味する。

　後記する実施例に記載のように、リン酸カルシウム成形体のＣＴ測定を行った後に、ソフトウエアを用いることにより、リン酸カルシウム成形体の内部構造の模様が見えるよう、さらに、相対的に密な層と相対的に疎な層が視認できるように、白、グレー、黒の見え方を調整する。白と黒のストライプ模様が見えるように、リン酸Ｃａの向きを調整し、白と黒のストライプ模様に対し、直交する方向をＺ軸とし、Ｚ軸と直交する方向を、ＸＹ平面とする（Ｘ軸とＹ軸も直交する方向とする）。Z軸を含む、ZX平面もしくはYZ平面にて、Z軸方向に０．５ｍｍから５．０ｍｍの範囲、Ｘ軸方向に０．５ｍｍから５．０ｍｍの範囲の領域を選択する。ソフトウエアをもちいて、選択領域のＺ軸方向の距離を横軸に、選択領域を白黒の程度を縦軸として、波形化することができる。得られた波形から、層の数、及び相対的に密な層と相対的に疎な層のピッチを分析することができる。

　本発明においては、好ましくは少なくとも５層以上（より好ましくは少なくとも７層以上、さらに好ましくは少なくとも１０層以上）の相対的に密な層と、少なくとも５層以上（より好ましくは少なくとも７層以上、さらに好ましくは少なくとも１０層以上）の相対的に疎な層とが交互に積層されている。
　第一の相対的に密な層と、上記第一の相対的に密な層の隣の第二の相対的に密な層とのピッチは、好ましくは５０～３００μｍであり、より好ましくは６０～２００μｍであり、さらに好ましくは７０～１５０μｍである。

　相対的に密な層が存在することにより、外形と内部構造を形成することができる、細胞に吸収されつつ置換されるので全体形状を保つことができる。相対的に疎な層が存在することにより、細胞が、より早く、より広範囲に、かつより多く浸潤することができる。従って、相対的に密な層と相対的に疎な層と交互に積層された構造を有することにより、相対的に密な層と相対的に疎な層と交互に積層された構造を有さないリン酸カルシウム成形体よりも、細胞浸潤が容易になる、組織再生が早いという利点がある。

　本発明のリン酸カルシウム成形体の内部構造には、約８００μｍの連通孔（大：第一連通孔とも言う）と、約２０～約８０μｍの連通孔（中：第二連通孔とも言う）と、約１～１０μｍの連通孔（小：第三連通孔とも言う）が存在することが好ましい。上記した３段階の連通孔を有するリン酸カルシウム成形体の模式図を図３０に、SEM像を図３１に示す。第一連通孔は、３Ｄプリンターの設計により形成され、第二連通孔は、粉体の凝集を残しつつ流動性を高めたことによるものであり、第三連通孔は粉体の隙間によるものである。第二連通孔は相対的に密な層と相対的に疎な層と関係している。

　本発明のリン酸カルシウム成形体は、好ましくは、リン酸カルシウム成形体のナノフォーカスＸ線ＣＴ画像に基づいて、成形体の一方向の距離を横軸に、相対ＣＴ強度を縦軸に表示した波形図において、山のピークと谷のピークとを交互に有する。
　好ましくは、少なくとも５つ以上（より好ましくは少なくとも７個以上、さらに好ましくは少なくとも１０個以上）の山のピークを有する。
　第一の山のピークと、上記第一の山のピークの隣の第二の山のピークとのピッチは、好ましくは５０～３００μｍであり、より好ましくは６０～２００μｍであり、さらに好ましくは７０～１５０μｍである。

　本発明のリン酸カルシウム成形体の用途は、特に限定されないが、例えば、再生医療用足場材、再生医療等製品（体外で組織培養するもの）、又は組織修復材として使用することができ、好ましくは、再生医療用足場材、又は組織修復材として使用することができる。

　本発明における組織修復材とは、生体内に埋植されることにより、この埋植された部位における組織の形成に寄与する材料のことであり、細胞を含んでいても含んでいなくてもよい。また、本発明のリン酸カルシウム成形体は、増殖因子や薬剤のような生体の反応を促す成分を含んでいても含んでいなくてもよい。さらに、本発明のリン酸カルシウム成形体は、ハイドロキシアパタイト等の無機材料と混合して使用してもよいし、上記無機材料とのコンポジットとして使用してもよい。本発明における組織修復材とは、埋植部位に通常存在する正常組織の形成に寄与するものだけではなく、瘢痕組織等を含む非正常組織の形成を促進する材料も包含するものである。

　組織修復材の具体例としては、特に限定されないが、軟骨、半月板、皮膚又は骨の修復材を挙げることができる。即ち、本発明のリン酸カルシウム成形体は、軟骨、半月板、皮膚又は骨の再生のための治療剤として使用することができる。上記した再生が必要である限り、疾患は限定されるものではないが、一例として、軟骨欠損を伴う疾患としては、変形性関節症、骨軟骨欠損、離断性骨軟骨炎、外傷性軟骨損傷、骨関節炎、再発性多発軟骨炎、軟骨無形成症、椎間板損傷、椎間板ヘルニア等を挙げることができる。

　本発明のリン酸カルシウム成形体は、移植細胞や骨誘導薬剤と併用することによっても骨再生治療剤として用いることもできる。骨誘導薬剤としては、例えばＢＭＰ（骨形成因子）やｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）が挙げられるが、特に限定はされない。

　本発明のリン酸カルシウム成形体は、組織修復材として使用できることから、組織の修復方法や、組織の損傷を伴う疾患等の治療方法も本発明に包含される。本発明における組織の修復方法は、対象組織が欠損又は損傷した部位に、リン酸カルシウム成形体である組織修復材を適用することを含み、必要に応じて他の工程を含んでいてもよい。他の工程としては、例えば、移植細胞及び／又は骨誘導剤を、組織修復材の適用の前後、又は同時に、組織修復材を適用する部位へ適用することが挙げられる。
　対象組織が欠損又は損傷した部位に、リン酸カルシウム成形体を適用する方法としては、切開、注射、関節鏡、内視鏡などが使用可能である。

　本発明のリン酸カルシウム成形体は、外部空間と連通している孔（第一の孔）を有していることが好ましい。上記孔を有するリン酸カルシウム成形体を生体に移植した場合、細胞がリン酸カルシウム成形体の内部に入り易くなる。外部空間と連通している孔は、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通していることがより好ましい。外部空間と連通している孔の平均径は、特に限定されないが、好ましくは２００μｍ～２０００μｍである。

　外部空間と連通している孔（第一の孔）とは、孔が、成形体の一か所の表面から成形体の内部の空間に形成されていることを示す。即ち、孔の内部の空間が、外部空間と連通することになる。
「外部空間と連通している孔が、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通している」とは、孔が、成形体のある箇所の表面から成形体の内部の空間に形成され、さらに成形体の別の箇所の表面を通じて外部空間と連通していることを示す。

　成形体は、例えば、移植前に細胞を注入するための孔として、第一の孔よりも平均径が大きい第二の孔を有することが好ましい。
　第二の孔より、注入された細胞等は、第一の孔を通り成形体全体に浸潤する。
　第一の孔及び第二の孔の形状は、円形、正方形、長方形、六角形、八角形、十字型、楕円のいずれでも良い。
　成形体が立方体又は長方体である場合、第一の孔は、図１のように各方向に応じて、それぞれＸ連通孔、Ｙ連通孔、Ｚ連通孔を設けることができる。各連通孔は、互いに交わっても、交わらなくても良い。各連通孔の平均径は２００μｍ～２０００μｍの範囲が好ましく、細胞の浸潤のし易さから２００μｍ～１２００μｍがより好ましい。平均径は、例えば、キーエンス社製ＶＨＸ－Ｄ５１０で測定することができる。径とは、孔が貫通し成形体の外表面上にあるときの孔の外周上においてある二点をとったときに、二点間の距離が最も大きくなる二点間の距離のことであり、孔の形状が円形であれば直径を意味し、四角形であれば、対角線の内の長い方を意味する。またその平均径とは、孔の数が１～４個のときには、それぞれの径の和を孔の数で割ったものを指し、５個以上のときには、４個の径の和を４で割ったものを指すものとする。
　外部空間と連通している第一の孔の数は、第一の孔よりも平均径が大きい第二の孔の数よりも多いことが好ましい。

　成形体は、成形されていれば、立方体又は長方体、円柱、三角注、円錐等どの形状でも良い。
　また、成形体は、例えば、移植後に体内での変形応力に耐えられるように、孔を有さない構造体の外縁部の厚さを１．３ｍｍ以上にすることが好ましい（図２の構造強化領域）。　様々な外観形状や第一の孔と第二の孔を有する複雑な成形体の形状は、コンピューター上の各種3次元CADソフト上で構築され、固有のオーダーメイド品として作成しても良いし、形と形状が定まった定型品として作成しても良い。

［３］移植用材料
　本発明は、表面の一部又は全部がリコンビナントゼラチンでコートされているリン酸カルシウム成形体を含む、移植用材料を提供する。
　リン酸カルシウム成形体は特に限定されないが、好ましくは、本明細書中に上記した形態のリン酸カルシウム成形体を使用することができる。移植用材料に用いるリン酸カルシウムのＣａ／Ｐの原子数の比は、好ましくは１．４～１．８であり、より好ましくは１．４５～１．７９であり、さらに好ましくは１．５０～１．７０である。
　リコンビナントゼラチンの詳細は本明細書中上記した通りである。リコンビナントゼラチンは、好ましくは熱架橋又は化学架橋されている。

　リコンビナントゼラチンでコートされているリン酸カルシウム成形体の表面は、好ましくは、移植用材料の表面および内部に存在する。
　リコンビナントゼラチンでコートされているリン酸カルシウム成形体の表面が、移植用材料の表面に存在するとは、移植用材料の表面が、リコンビナントゼラチンでコートされていることを意味する。
　リコンビナントゼラチンでコートされているリン酸カルシウム成形体の表面が、移植用材料の内部に存在するとは、移植用材料、即ち、リン酸カルシウム成形体が、多孔質であり、リン酸カルシウム成形体の内部に存在する孔を形成する表面が、リコンビナントゼラチンでコートされていることを意味する。

　リン酸カルシウム成形体は、好ましくは、ブロック状又は顆粒状である。
　ブロック状とは、平面のみで構成された立体形状に限らず、曲面を有する曲面立体を含む。ブロック状の一例としては、縦2.0～100.0ｍｍ、横2.0～100.0ｍｍ、及び高さ　2.0～100.0ｍｍを有する直方体形状を挙げることができる。
　顆粒状とは、粒径が約0.5～2.0ｍｍ程度の粒子の集まりを言う。
　以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：
（１）リン酸カルシウム粉末の作製方法
　リン酸カルシウム粉末の原料として、Ｃａ₄（ＰＯ₄）₂Ｏ（リン酸四カルシウム：ＴＴＣＰ）と、ＣａＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ（リン酸水素カルシウム二水和物：ＤＣＰＤ）とを用いた。ＴＴＣＰのＣａ／Ｐの原子数の比は２．０であり、ＤＣＰＤのＣａ／Ｐの原子数の比は１．０である。ＴＴＣＰとＤＣＰＤとの混合比率を変化させることにより、全体のＣａ／Ｐの原子数の比が異なる混合粉末を作製した。ＴＴＣＰとＤＣＰＤの混合比率（モル比）とその際の混合粉末のＣａ／Ｐの原子数の比を表１に示す。

（２）有機酸溶液の作製方法
　有機酸及び有機酸のナトリウム塩の混合比を調整することにより、含まれる有機酸イオンの量を一定にしながらｐＨの異なる溶液を作製した。具体的には、例えばクエン酸の場合、１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸溶液と１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸三ナトリウム溶液を混合することにより、所望のｐＨの溶液を作製した。

（３）評価方法
　上記（１）で作製したリン酸カルシウム粉末に対して、上記（２）で作製した有機酸溶液を吐出により滴下させた。粉末および有機酸溶液を、Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓ（３Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧　Ｚ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に導入し、２０×２０×５ｍｍの直方体に、２×２ｍｍの穴が薄手方向に５カ所あいたサンプルを作製した。粉末単位体積に供給される有機酸溶液体積の比率は４２％とし、リン酸カルシウム粉末の積層ピッチは１００μｍとした。Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓによる成形体の作製においては、リン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程と、有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、リン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程とを反復することにより、上記の成形体が作製される。

　リン酸カルシウム粉末と有機酸溶液の種類については表２及び表３に示す通りである。有機酸溶液を滴下したリン酸カルシウム粉末を約４０℃で保温しながら３０分間放置した後、圧縮空気により、不要部分のリン酸カルシウム粉末（有機酸溶液による成形がなされていないリン酸カルシウム粉末）の除去を行った。不要部分のリン酸カルシウム粉末の除去について以下の基準で評価し、リン酸カルシウム粉末の強度を評価した。評価Ａは、リン酸カルシウム成形体が十分な強度を有していることを示す。

評価Ａ：不要部分を問題なく除去することができた場合
評価Ｂ：有機酸溶液を滴下したリン酸カルシウム粉末について一部破損があった場合
評価Ｃ：有機酸溶液を滴下したリン酸カルシウム粉末が崩壊した場合

（４）評価の結果
　Ｃａ／Ｐの原子数の比を変化させたリン酸カルシウム粉末に、ｐＨが異なるクエン酸溶液を滴下させた場合の評価の結果を表２に示す。

　Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．６７であるリン酸カルシウム粉末に対して、各種有機酸のｐＨ３溶液を滴下させた場合の評価の結果を表３に示す。リンゴ酸（カルシウム塩の水に対する溶解度が０．９２ｇ／１００ｇ）より溶解度が小さい酸（クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸）については評価がＡであったのに対し、コハク酸（溶解度１．２７）では評価がＢであり、より溶解度が大きい乳酸、酢酸及びグルコン酸では評価がＣであった。

［精度と硬化速度に関する評価］
　２ｍｍ角の穴を有する３Ｄ（三次元）造型物データを実際に造形して、造型物の穴の大きさを測定した。実測値は常に設計値より小さく、有機酸溶液がにじむことにより、設計時に想定していない部分まで硬化してしまうと考えられる。またにじみは硬化速度が速いほど小さくなると考えられる。そこで、(実測値)/(設計値)×１００を指標とし、７５％以上をＡ、５０％以上７５％未満をＢ、２５％以上５０％未満をＣ、測定不能な場合をＤとする評価を行った。この指標は１００％に近いほど、設計値を再現できることを意味する。

　その結果、カルシウム塩の水に対する溶解度(ｇ／１００ｍＬ)が１．０以下である酸、グルコン酸はサンプル崩壊のため測定できずＤ判定となった。

　上記の結果から、Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末に対して、有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液を吐出させて滴下させることにより、良好な評価結果が達成できることが示された。

＜リン酸カルシウム成形体の製造方法＞
インクとして、クエン酸１．０ｍｏｌ／Ｌ：クエン酸三ナトリウム二水和物１．０ｍｏｌ／Ｌ＝３：１、の体積比で混合し、ｐＨ３．１５に調整したクエン酸ナトリウム水溶液を調製した。この調製したクエン酸ナトリウム水溶液をクエン酸Ｎａインクと称する。

　粉体として、微細側から累積１０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ１０、微細側から累積25％のときの粒径（μ ｍ）をｄ25、微細側から累積５０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ５０、微細側から累積75％のときの粒径（μ ｍ）をｄ75、微細側から累積９０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ９０と表したとき、TTCPはメジアン径にあたるｄ５０＝７．４μｍ、DCPDはｄ５０＝１９．５μｍとなる。　最終的にＣａ／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合した、より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した、この混合物をリン酸Ｃａ粉体とする。
　混合したリン酸カルシウム粉体は、ｄ５０＝１７．０μｍであり、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含み、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む。レーザー回折式粒度分布測定の装置として、株式会社セイシン企業製のＬＭＳ－２０００ｅにて、分散媒はエタノールで測定した。

　３Ｄプリンター（Ｚｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ）を用い、インクと粉体をクエン酸Ｎａインク、リン酸Ｃａ粉体に置き換え、積層厚みを１００μｍとし、図３のように設計した。このときのサイズは、Ｘ＝２１．５ｍｍ，Ｙ＝１７ｍｍ，Ｚ＝２１ｍｍとした。また、直径２ｍｍの円形の片側貫通の第二の孔を４個設け、非貫通末端を外表面から９ｍｍの所とした。第一の孔は、正方形の平均径９００μｍの孔をＸ，Ｙ，Ｚ方向に直交するように設計し、それぞれ第一の孔のＸ連通孔、Ｙ連通孔、Ｚ連通孔とし、Ｘ連通孔を６４個、Ｙ連通孔を５１個，Ｚ連通孔を５１個設けた。また、成形体を縫合固定するために、縫合孔を設計した。３Ｄプリンターで成形した後、３５℃の３Ｄプリンター内で１時間、乾燥させ、余剰な粉体を圧空（エアーガンから０．１５ＭＰａに調整した圧縮空気をだすエアーブロー流）で除去した。この成形体をマッフル炉にて、１時間につき１００℃ずつ昇温させた後、１１００℃で２時間焼結し、焼結の為の加熱をｏｆｆにし、マッフル炉の蓋は開けない状態で、８時間静置する。マッフル炉が１００℃以下の温度になった後、焼結の済んだ成形体を取り出し、成形体（図４）を得た。

＜評価＞
　成形体全域への浸透性を評価する為、ＰＢＳ＋（本件では、ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＯＲＩＣＨ社製、Ｄ８６６２を使用した。ＰＢＳとは、リン酸緩衝生理食塩水のことであり、生化学等の実験で使用される緩衝液である。生体内に普遍的にあるイオンで構成されていて、組成としてはｐＨ７．４で、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄などが入っている。ＰＢＳ＋は、ＰＢＳにカルシウムとマグネシウムも入ったものである）に１．０質量％染料インク（パイロットコーポレーション製、万年筆用のＢｌｕｅ＿Ｂｌａｃｋ、ＩＮＫ－３０－ＢＢ）を加えた混合液１０ｍＬを用いて、孔のない成形体、第二の孔だけをもった成形体、第一の孔と第二の孔をもった成形体の浸透性を調べた。

　以下のように浸透性を測定した。直径５５ｍｍのプラスチック容器に、染料入りＰＢＳ＋溶液を１０ｍＬいれ、約３ｍｍ深さとする。そこに成形体を浸漬し、浸漬直後から何秒で、成形体の全域が着色されたかを測定した。その結果、成形体全域に浸透するのに要した時間は、孔のない成形体では１時間以上たっても、上面の半分以上が直色されることはない。第二の孔だけをもった成形体では１０分、第一の孔と第二の孔をもった成形体では５秒以内で成形体全域に着色が見られた。この結果から、成形体の浸透性は、第一の孔と第二の孔をもった成形体で顕著に高いことが示された。

実施例２：浸漬による成形体を硬化する工程
　実施例１の（１）で作製したＣａ／Ｐの原子数の比が１．６７であるリン酸カルシウム粉末を、Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓ（３Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧　Ｚ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に導入し、ｐＨ３のクエン酸溶液を用いて、５×５×１２ｍｍの成形体を作製した。粉末単位体積に供給される有機酸溶液体積の比率は４２％とし、リン酸カルシウム粉末の積層ピッチは１００μｍとした。Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓによる成形体の作製においては、リン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程と、クエン酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、リン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程とを反復することにより、５×５×１２ｍｍの成形体が作製される。

　上記で作製した成形体を、以下の溶液Ａ、溶液Ｂ又は溶液Ｃの何れかに１２時間浸漬し、浸漬前後における圧縮強度を測定した。
溶液Ａ：０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸二水素ナトリウム溶液（ｐＨ４．３）
溶液Ｂ：０．５ｍｏｌ／Ｌリン酸水素二ナトリウム溶液（ｐＨ９）
溶液Ｃ：溶液Ａと溶液Ｂの１：１混合溶液（ｐＨ６．６）

　圧縮強度の測定は、ＴＡインスツルメント社のＥｌｅｃｔｒｏｆｏｒｃｅ５５００を用いて行った。５×５×１２ｍｍサンプルの長手方向に，０．１７ｍｍ／秒の速度で荷重をかけ、サンプル破壊時の最大荷重（Ｎ）を断面積で割ることにより圧縮強度（ＭＰａ）を求めた。

　浸漬前は２．２ＭＰａであった圧縮強度が、溶液Ａに浸漬した場合には４．２ＭＰａ、溶液Ｂに浸漬した場合には３．５ＭＰａ、溶液Ｃに浸漬した場合には３．９ＭＰａとなった。成形体を溶液に浸漬することにより成形体の硬化が進行し、強度が大きくなることが確認された。

実施例３：加熱による成形体硬化工程
　実施例２と同様にして作製したリン酸カルシウム成形体を、マッフル炉を用いて１１００℃又は１２００℃で４時間加熱した。加熱前後における圧縮強度を実施例２と同様に測定した。加熱前は２．２ＭＰａであった圧縮強度が、１１００℃での加熱の場合には３．５ＭＰａ、１２００℃での加熱の場合には６．１ＭＰａとなった。成形体の加熱により、強度が大きくなることが確認された。また、造形に用いた有機酸も熱分解により除去することができる。

実施例４：細胞接着性におけるRCP修飾の効果確認
（操作１）β-TCP粒子として骨補填材オスフェリオン（オリンパステルモバイオマテリアル株式会社製）を37℃にて、7.5%（配列番号１のアミノ酸配列からなるＲＣＰ）溶液に3時間、振とうしながら浸漬させた。その後、50℃にて12時間、乾燥させた。更に160℃にて20時間の熱架橋処理を施して製剤を得た。
（操作２）作製した製剤を10mg/wellとなるように 24well超低接着プレート（コーニング社製）に入れ、細胞（NIH-3T3）を50000cells/wellとなるように播種した。
（操作３）播種後、24時間で、カルセイン染色後、蛍光観察及び走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）で観察を行った。

比較例４：
　実施例４において、操作１を施さない以外は、実施例４と同様の操作を施した例を比較例４とした。

　実施例４と比較例４の結果を図５に示す。比較例４に対して実施例４では、細胞接着性の向上が認められた（図５）。

実施例５：ラット頭頂骨欠損部における骨再生誘導試験によるRCP修飾の効果確認
　実験動物として、ＳＤラット（雄、10-12週齢、0.3-0.5kg）を用い、ラットの頭頂骨を露出し、直径5 mmの円形の骨欠損部を作製した。実施例4の製剤、約10mgを作製した骨欠損部へ充填した後、皮膚を縫合した。
埋植後8週目に放血致死させて頭部を摘出した。埋入部を含む頭頂骨をHE染色にて組織学的観察をおこなった。

比較例５：
　実施例５において、実施例４の製剤の代わりに比較例４の製剤を用いる以外は、同様の操作を施した例を比較例５とした。

　実施例５及び比較例５の結果を図６に示す。比較例５に対して実施例５では、骨形成の向上が認められた（図６）。

実施例６：リン酸カルシウム成形体の気孔率、比重および吸水浸透速度
　リン酸カルシウム成形体を以下の通り作製した。
＜リン酸カルシウム成形体の製造方法＞
　インクとして、クエン酸１．２ｍｏｌ／Ｌ：クエン酸三ナトリウム二水和物１．２ｍｏｌ／Ｌ＝３：１、の体積比で混合し、ｐＨ３．１５に調整したクエン酸ナトリウム水溶液を調製した。　この調製したクエン酸ナトリウム水溶液をクエン酸Ｎａインクと称する。

　粉体として、微細側から累積１０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ１０、微細側から累積25％のときの粒径（μ ｍ）をｄ25、微細側から累積５０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ５０、微細側から累積75％のときの粒径（μ ｍ）をｄ75、微細側から累積９０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ９０と表したとき、メジアン径にあたるｄ５０＝７．４μｍのＴＴＣＰ、ｄ５０＝１９．５μｍのＤＣＰＤ粉体を用意し、最終的にＣａ／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合した。より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した。この混合物をリン酸Ｃａ粉体とする。
　混合したリン酸Ｃａ粉体は、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含み、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む。　レーザー回折式粒度分布測定の装置として、株式会社セイシン企業製のＬＭＳ－２０００ｅにて、分散媒はエタノールで測定した。

　３Ｄプリンター（Ｚｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ）を用い、インクと粉体をクエン酸Ｎａインク、リン酸Ｃａ粉体に置き換え、積層厚みを１００μｍとした。
・構造物は円柱状であり、焼結すると10%縮むことを考えて、直径Φ8.8ｍｍ、高さ22ｍｍで造形した。

３Ｄプリンターで成形した後、３５℃の３Ｄプリンター内で１時間、乾燥させ、余剰な粉体を圧空（エアーガンから０．１５ＭＰａに調整した圧縮空気をだすエアーブロー流）で除去した。この成形体をマッフル炉にて、１時間につき１００℃ずつ昇温させた後、１１００℃で２時間焼結し、焼結の為の加熱をｏｆｆにし、マッフル炉の蓋は開けない状態で、８時間以上静置する。マッフル炉が１００℃以下の温度になった後、焼結の済んだ成形体を取り出し、直径Φ8ｍｍ、高さ20ｍｍの円柱状の成形体を得た。

　上記で作製したリン酸カルシウム成形体、並びに市販品（下記３種）について、以下の方法で気孔率、比重、及び吸水浸透速度を測定した。
スーパーポア（ペンタックス社製）品番ＫＢ－６－１、径８×長さ２０ｍｍ
スーパーポア（ペンタックス社製）品番ＨＢ－５０－０８２０、径８×長さ２０ｍｍ
スーパーポアＥＸ（ペンタックス社製）品番ＸＣ－０８２０、径８×Ｌ２０ｍｍ
　上記３種のスーパーポアは、β型リン酸三カルシウムからなる白色多孔体である。

＜気孔率の測定法＞
　気孔率は、水銀圧入法で測定した。水銀圧入法とは、水銀の表面張力が大きいことを利用して粉体の細孔に水銀を浸入させるために圧力を加え、圧力と圧入された水銀量から比表面積や細孔分布を求める方法である。ＰＯＲＥＭＡＳＴＥＲ　６０ＧＴ（Ｑｕａｎｔａｃｈｒｏｍｅ社製）を使用して測定した。以下の標準的な条件で測定した。
Ｈｇ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｔｅｎｓｉｏｎ　４８０．００ｅｒｇ／ｃｍ²
Ｈｇ　Ｃｏｎｔａｃｔ　Ａｎｇｌｅ　（Ｉ）１４１．３０°，（Ｅ）１４１．３０°
温度２０．００［℃］
サンプルサイズは、径０．４６２ｍｍ、高さ０．９５９ｍｍの円柱状である。

＜比重の測定＞
　上記で作製したリン酸カルシウム成形体の重量を１／１０００gまで測定可能な電子天秤で測定し、直径と高さを１／１００mmまで測定可能なノギスで、測定して体積を求めた。　次に、重量を体積で割って、比重を求めた。

＜吸水浸透速度の測定法＞
　吸水浸透速度を求める実験系を構築した。
　実験室の温度を23℃、湿度を30%とし実験測定した。　万年筆インクとして、パイロットコーポレーション製のＩＮＫ－３０－ＢＢを使用した。
　内径２ｍｍのプラスチック筒とチューブとシリンジにより、図７に示す実験系を構築した。構造物の底面にメニスカス面を作ってそこから浸透させた。メニスカス高さは、目視、手動で調整した。リン酸カルシウム成形体２１は、径８ｍｍ×２０ｍｍ高さとした。プラスチック筒２２の内径は２ｍｍである。チューブ２３の長さは１００ｍｍである。水位２４については、プラスチック筒２２とリン酸カルシウム成形体２１の接する高さに、吸水浸透の開始から終了まで調整した。シリンジ２５は、１０ｍＬのシリンジを使用した。リン酸カルシウム成形体２１より内径を大きくした。

　図７に示す実験系において、上記の通り、リン酸カルシウム成形体とプラスチック筒の接する高さと、シリンジ内のインキの水位の高さとが吸水浸透の開始から終了まで同じになるように調整した条件下において、シリンジ内のインキをリン酸カルシウム成形体に吸水浸透させた。インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとなったときは、15mmを浸透に要した時間で割った値を、吸水浸透速度とし、インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとならない場合は、5分の時点においてインキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さを定規で測定し、浸透に要した時間である5分で割った値を、吸水浸透速度とする。

　気孔率、比重、及び吸水浸透速度の測定結果を下記表に示す。

実施例７：リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造
＜リン酸カルシウム成形体の製造方法＞
　インクとして、クエン酸１．２ｍｏｌ／Ｌ：クエン酸三ナトリウム二水和物１．２ｍｏｌ／Ｌ＝３：１、の体積比で混合し、ｐＨ３．１５に調整したクエン酸ナトリウム水溶液を調製した。　この調製したクエン酸ナトリウム水溶液をクエン酸Ｎａインクと称する。
　粉体として、メジアン径（以下ｄ５０と表記）７．４μｍのＴＴＣＰ、ｄ５０＝１９．５μｍのＤＣＰＤ粉体を用意し、最終的にＣａ／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合した。
より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した。この混合物をリン酸Ｃａ粉体とする。混合したリン酸Ｃａ粉体は、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含み、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む。
　３Ｄプリンター（Ｚｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ）を用い、インクと粉体をクエン酸Ｎａインク、リン酸Ｃａ粉体に置き換え、積層厚みを１００μｍとした。
　構造物は円盤を３個重ねた構造であり、一番大きな円盤は直径１４．４ｍｍで、全高７．８ｍｍの円盤状である。
　３Ｄプリンターで成形した後、３５℃の３Ｄプリンター内で１時間、乾燥させ、余剰な粉体を圧空（エアーガンから０．１５ＭＰａに調整した圧縮空気をだすエアーブロー流）で除去した。この成形体をマッフル炉にて、１時間につき１００℃ずつ昇温させた後、１１００℃で２時間焼結し、焼結の為の加熱をｏｆｆにし、マッフル炉の蓋は開けない状態で、８時間以上静置する。マッフル炉が１００℃以下の温度になった後、焼結の済んだ成形体を取り出し、成形体を得た。

＜ナノフォーカスＸ線ＣＴ解析＞
　疎密積層構造の解析に用いた対象物の構造を図８に示す。
　ゼネラルエレクトロ二クス社製のｐｈｏｅｎｉｘ　ｎａｎｏｔｏｍ　ｍにより以下の測定条件において観察及び解析を行った。
管電圧：　１２０ｋＶ
管電流：　９０μＡ
X線源から検出器までの距離 (FDD)：　６００ mm
X線源から対象サンプルの回転中心までの距離 (FOD)：　400 mm
解像度：　Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸ともに６．６６μｍ

　上記のような条件で測定したのち、装置と連携しているCT画像を解析できるソフトウエア、ＶＧＳｔｕｄｉｏ　Ｍａｘ　3.0.3 64bitにより、リン酸カルシウム成形体の内部構造の模様が見えるよう、さらに、密層（相対的に密な層）と疎層（相対的に疎な層）が視認できるように、白、グレー、黒の見え方を調整した（図9）。

　白、グレー、黒の見え方を調整するのは、図9の右下のレンダリング機能の画面である。白く表示されるほど相対的に物質の密度が高くなり、黒くなるほどが相対的に物質の密度が低くなることを示し、本件では白いほど、リン酸カルシウムが多くなり、黒いほどリン酸カルシウムが少なくなり空隙に近づくことになる。

　幾何学的に互いに直交するXY平面、YZ平面、ZX平面を、図9のXY平面の図、YZ平面の図、ZX平面の図として、ＶＧＳｔｕｄｉｏ　Ｍａｘ　3.0.3 64bit画面内の領域に表示する。

　画面内のYZ平面の図と、XZ平面の図にて、白と黒のストライプ模様が見えるようにレンダリング機能の画面にて調整する。

　さらに、YZ平面の図とXZ平面の図の白と黒のストライプ模様が同一の方向に向くように、さらに、白の筋と白の筋の間隔が、出来るだけ一致するように、ＶＧＳｔｕｄｉｏ　Ｍａｘ　3.0.3 64bitでのリン酸カルシウム成形体の向きを調整する。　この操作により、リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造の疎層と密層は、XY平面と平行になる。
　図9のように、リン酸カルシウム成形体の向きを調整し、白と黒のストライプ模様に対し、直交する方向をリン酸カルシウム成形体のＺ軸とする。

　Z軸を含む、ＺＸ平面の図をＴＩＦＦ形式でコンピューター上で保存しを、生物学のイメージング分野ではディファクトスタンダードな画像解析、ImageJ　1.50i（ImageJとは、アメリカ国立衛生研究所 (NIH) で開発されたオープンソースでパブリックドメインの画像処理ソフトウェアである）にてＴＩＦＦ画像データを開く。

　ImageJ　1.50i にて、Z軸方向に３．１４ｍｍ、X軸方向に３．１４ｍｍの領域を選択する（図１０）。ZX平面の画像は、Ｚ方向に密層と疎層を横断するように交互になっていて、X方向は密層がほぼ直線的に延び、疎層もほぼ直線的に延びている。

　Ｚ軸方向の領域を選択する際は、Z軸方向に、０．５ｍｍから５．０ｍｍの距離範囲が好ましく、２．０ｍｍから4.0mmの距離がより好ましい。
　2.0mm以上のより広い領域を選択するのが、リン酸カルシウム成形体の局所性に影響されずに済むので好ましいが、リン酸カルシウム成形体が小さい場合は実施できないので適宜調整する。　大きすぎると後の作業が大変になるので、５．０mmを上限とし、４．０ｍｍまでがより好ましい。

　ImageJ　1.50iのプロットプロファイル機能により、選択領域のＺ軸方向の距離を横軸に、選択領域を白黒の程度をＧｒａｙ　Ｖａｌｕｅ値として縦軸に、波形として表示することができる（図１１）。

　表示されているＧｒａｙ　Ｖａｌｕｅ値は、Ｚ軸の距離に応じて、Ｘ軸の３．１４ｍｍ内にある各ピクセルのＧｒａｙ　Ｖａｌｕｅ値を平均した値となっている。　本件では、3.14mmの間に153ピクセルとなっている。

　Ｘ軸方向の領域を選択する際は、Ｘ軸方向に、０．５ｍｍから５．０ｍｍの距離範囲が好ましく、２．０ｍｍから４．０ｍｍの距離がより好ましい。
２．０ｍｍ以上のより広い領域を選択するのがリン酸カルシウム成形体の局所性からの影響とピクセルの分解能に影響されずに済むので好ましいが、リン酸カルシウム成形体が小さい場合は実施できないので適宜調整する。大きすぎると、リン酸カルシウム成形体の疎層と密層の向きとＶＧＳｔｕｄｉｏ　Ｍａｘ　３．０．３　６４ｂｉｔ内で構築するＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸向きの一致性の影響がでるので、５．０ｍｍを上限とし、４．０ｍｍまでとするのがより好ましい。

　得られた波形から、層の数、及び相対的に密層と相対的に疎層のピッチを分析する。
　密層の頂点の数を数える。　密層の頂点とは、相対的にその周辺より物質密度が高くなる、波形の傾きの係数がプラスからマイナスに転じるところである。　疎層の頂点とは、相対的にその周辺より物質密度が小さくなるところであり、波形の傾きの係数がマイナスからプラスに転じるところである。

　本ケースでは、Z軸の選択距離は3.14mmで、プロットプロファイル機能にて形成した波形グラフ内の３．０mmの間に密層の頂点は3４個存在した。
（密層の頂点の数／Z軸の距離）= リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のZX平面のピッチとする。本件は３．０ｍｍ／3４個で８８.２μmがピッチとなる（図１１）。

　ＹＺ平面の図からも（図１２）、ＸＺ平面の図と同様の処理にて、リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のＹＺ平面のピッチ（図１２）を導きだした。
（密層の頂点の数／Z軸の距離）= リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のＹＺ平面のピッチとする。　本件は３．０ｍｍ／3２個で93.8μmがピッチとなる（図１３）

　リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のＺＸ平面のピッチとリン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のＹＺ平面のピッチの平均を、リン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のピッチとする。　本件でｈ（８８．２μｍ＋９３．８μｍ）／２＝９０．３μｍがリン酸カルシウム成形体の疎密積層構造のピッチとなる。

　リン酸カルシウム成形体の吸水浸透速度が速いことと、疎密積層構造との間には関係があると考えられる。Ｘ方向とＹ方向の吸水浸透速度をはかるとき、リン酸カルシウム成形体の外観を目視やルーペで観察しても、ＸＹ平面と平行にある疎層を通じて浸透する様子が確認できる。また、Ｚ方向の吸水浸透速度をはかるときでも、Ｚ方向と直交する疎層と密層にて、疎層ではやく、密層で遅くなりつつ、１層ごとにＺ方向に浸透する様子が分かる。

　疎層の空隙が数ｍｍから数１０ｍｍに渡って、折れ曲がった３次元的な連結でなく、シンプルでストレートな平面的な連結をしていて、さらにリン酸カルシウム成形体の一方の表面から他の対向する別の表面まで両側に抜けていることにより、浸透したインクが空気の抵抗を受けることなく浸透するためと考えられる。

実施例８：リン酸カルシウム粉末のレーザー回折式粒度分布測定
　リン酸カルシウム粉末として、Ｃａ₄（ＰＯ₄）₂Ｏ（リン酸四カルシウム：ＴＴＣＰ）、ＣａＨＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ（リン酸水素カルシウム二水和物：ＤＣＰＤ）、及びＴＴＣＰとＤＣＰＤとの混合粉体（Ｃａ／Ｐの原子数の比は１．５）を用いて、以下の方法及び条件で粒度分布を測定した。

装置：　株式会社セイシン企業製のＬＭＳ－２０００ｅ
測定原理：　水やエタノールなどの分散媒に分散された粒子にレーザー光照射し、粒子からの散乱光強度の角度依存性を測定することにより、サンプルに含まれる粒子の粒子径分布を求める。
測定範囲：　０．０２～２０００μｍ
レーザー光源：ヘリウムネオンレーザー
分散媒：　エタノール
測定方法：　分散媒のみでブランク測定を行ったのち、１分間の超音波分散により試料を分散させ、超音波分散した試料を分散槽に入れ循環式にて粒度分布測定を行う。
粒度分布：　体積基準で表示。

　混合粉体の測定結果を図１４に示し、ＴＴＣＰ粉体の測定結果を図１５に示し、ＤＣＰＤ粉体の測定結果を図１６に示す。
　粉体として、微細側から累積１０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ１０、微細側から累積25％のときの粒径（μ ｍ）をｄ25、微細側から累積５０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ５０、微細側から累積75％のときの粒径（μ ｍ）をｄ75、微細側から累積９０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ９０と表したとき、TTCPはメジアン径にあたるｄ５０＝７．４μｍ、DCPDはｄ５０＝１９．５μｍとなる。　最終的にＣａ／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合した、より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した、この混合物をリン酸Ｃａ粉体とする。
　混合したリン酸カルシウム粉体は、ｄ５０＝１７．０μｍであり、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含み、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む。

実施例９：リン酸カルシウム粉体の流動性試験
　粉体として、平均粒子径７μｍのＴＴＣＰ、平均粒子径６０μｍのＤＣＰＤ、並びにＴＴＣＰとＤＣＰＤの混合物（Ｃa／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合したもの）を用意した。ＴＴＣＰとＤＣＰＤの混合物としては、より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した。
　上記の粉体の流動性（フローファンクション）を以下の方法で測定した。測定装置としては、ブルックフィールド製の「パウダーフローテスター、PFT」を用いて、スタンダードフローファンクションを選択して測定した、フローファンクションは、破壊強度をｆｃ、最大主応力をσ１とした時、σ１／ｆｃで表される値である。フローファンクション値は、以下の基準で評価した。

　フローファンクション値と評価結果を下記表に示す。混合したTTCPとDCPDは重量と体積とも大きく変わらないにも関わらず、ＴＴＣＰの影響は大きく受けていないようで、ＴＴＣＰとＤＣＰＤの中間的な値とならず、ＤＣＰＤに近い値であった。

　ＴＴＣＰはフローファンクションの値が示すように、流動性が悪く、ＴＴＣＰのみで粉体をリコートすると、ローラーにＴＴＣPが付着したり、本来、平らになるはずのＴＴＣＰ粉体の表層面に目で見える数ｍｍ以上の凹凸ができたりする。　ＤＣＰＤを混合するとローラーに混合粉体が付着することなく、混合粉体の表層面が凹凸になることなくリコートできる。

　ＴＴＣＰ粉体は、有機酸溶液に対する反応性は高く、反応性の観点からは３Ｄ粉体積層プリンター造形に適しているが、流動性はフローファンクションで４．０未満でリコート不良が発生する。
　一般的に、流動性は粒子径と関係あって、粒子径が小さいと流動性が悪くなる。　粒子径が小さいほど、比表面積が大きくなり、質量と比例する体積よりも、表面の影響がでて、ある粉体粒子の表面と隣り合う粉体粒子の表面に働く、ファンデルワールス力、静電気力など、粒子を引き合わせる引力の影響が大きくでる。

　ＴＴＣＰは粒子径の代表サイズといえるｄ５０においてΦ７．４μmで、ＤＣＰＤのｄ５０＝Φ１９．５μmより小さく、粒子径分布の大きい側であるｄ９０でも１６．０μｍとＤＣＰＤのｄ90＝４７．１μｍより小さく、大粒子も混合していない。
　ＴＴＣＰとＤＣＰＤを所定のモル比で混合するとｄ５０＝１７．０μｍとなり、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含んでいても、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む影響がでて、流動性がＴＴＣＰのみでは３．３４というフローファンクション値であったのが、混合粉体では４．８７と、ＤＣＰDのみでの５．１３とう値に近くづく。　これによりリコート不良も発生せず、3Ｄ粉体積層プリントすることが可能になる。

実施例１０：ラット試験
　ＣＢＥ３（配列番号１のアミノ酸配列からなるリコンビナントゼラチン）を被覆したリン酸カルシウム成形体を用いて骨再生の評価試験を行った。

　リン酸カルシウム成形体を以下の通り作製した。
＜リン酸カルシウム成形体の製造方法＞
　インクとして、クエン酸１．２ｍｏｌ／Ｌ：クエン酸三ナトリウム二水和物１．２ｍｏｌ／Ｌ＝３：１、の体積比で混合し、ｐＨ３．１５に調整したクエン酸ナトリウム水溶液を調製した。　この調製したクエン酸ナトリウム水溶液をクエン酸Ｎａインクと称する。

　粉体として、微細側から累積１０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ１０、微細側から累積25％のときの粒径（μ ｍ）をｄ25、微細側から累積５０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ５０、微細側から累積75％のときの粒径（μ ｍ）をｄ75、微細側から累積９０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ９０と表したとき、メジアン径にあたるｄ５０＝７．４μｍのＴＴＣＰ、ｄ５０＝１９．５μｍのＤＣＰＤ粉体を用意し、最終的にＣａ／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合した。より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した。この混合物をリン酸Ｃａ粉体とする。
　混合したリン酸Ｃａ粉体は、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含み、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む。

　３Ｄプリンター（Ｚｐｒｉｎｔｅｒ３１０ｐｌｕｓ）を用い、インクと粉体をクエン酸Ｎａインク、リン酸Ｃａ粉体に置き換え、積層厚みを１００μｍ設定とした。

　３Ｄプリンターで成形した後、３５℃の３Ｄプリンター内で１時間、乾燥させ、余剰な粉体を圧空（エアーガンから０．１５ＭＰａに調整した圧縮空気をだすエアーブロー流）で除去した。この成形体をマッフル炉にて、１時間につき１００℃ずつ昇温させた後、１１００℃で２時間焼結し、焼結の為の加熱をｏｆｆにし、マッフル炉の蓋は開けない状態で、８時間以上静置する。マッフル炉が１００℃以下の温度になった後、焼結の済んだ成形体を取り出し、成形体を得た。　リン酸カルシウム成形体の模式図を図１７に示す。
・構造物は直径Φ５ｍｍ、高さ１．９ｍｍの円盤状である。
・円盤の底面と平行に、円盤の中間くらいの高さに、Ｘ方向とＹ方向に、０．７×１．０ｍの連通孔が十字形状に形成されている。
・十字形状の中心を貫くようにZ軸方向にΦ1．１mmの連通孔が形成されている。
・円盤の上面側にも、連通孔と上側に、Ｘ方向とＹ方向に、幅１．８ｍｍで高さ０．４ｍｍの凸部が形成されている。

　成形体にＣＢＥ３を被覆する。ＣＢＥ３水溶液の作成方法、リン酸ＣａのＣＢＥ３の被覆は以下の通りである。
　光製薬株式会社製の注射水溶液に７質量％のＣＢＥ３を溶解させ、４５℃のオーブンで３０分加熱し、溶解して、ＣＢＥ３水溶液を作製した。
　ＣＢＥ３水溶液に、リン酸カルシウム成形体を浸漬し、デシケーター内で、大気圧から－０．０９ＭＰａまで真空脱気処理し、水溶液に溶解している空気やリン酸Ｃａ成形体の内部にある空隙から空気を取り除きつつ、１０分間放置する。大気状態に戻したあと２回同様の操作を行ったあと、取り出して、リン酸Ｃａ成形体に付着している余剰なＣＢＥ３水溶液を取り除き、５０℃のオーブンにて３時間乾燥する。
　ＣＢＥ３の熱架橋は以下の通り行った。真空引きと窒素置換が可能なオーブンにて、２ｈＰａ程度まで真空引きと窒素置換を数度繰り返したのち、１０１３ｈＰａの窒素雰囲気下で約１５０℃の４時間程度に加熱する。

　ラットの頭頂骨に、骨膜を剥離後直径5mmの欠損を設け試験材料を設置後、剥離した骨膜を貼付したのち皮膚を縫合した。

（病理標本の作製）
　試験期間終了後、放血死させたラットより頭部を回収し、眼球、脳等の軟組織を除去したのち。得られた標本より埋植部をトリミングし、樹脂包埋した。同包埋標本からミクロトームにより５μｍ厚の切片を切出し、ヘマトキシリン＆エオジン染色（H&E）とｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色を行った。

（マイクロＣＴ解析）
　試験Ａ（コントロール：欠損のみ）について、マイクロフォーカスＣＴ解析を行った。マイクロフォーカスCTは株式会社リガク製のR-mCTであり、管電圧は90kV 、管電流は100μA、X線焦点-検出器の距離(FDD)は292 mm、X線焦点-回転中心の距離 (FOD)は73 mmである。マイクロフォーカスCTの解析結果を図１８に示す。マイクロフォーカスＣＴ解析において、コントロール（欠損のみ）は、既存骨の外周部からの骨再生は見られるが、ラット頭部の欠損を補填するような再生はみられない。

　試験Ｂ（ＣＢＥ３を被覆したリン酸Ｃａ成形体（成形体Ｂ））のラット移植後８週間のマイクロＣＴ解析の結果を図１９に示す。成形体Ｂとラット自骨が接触しているところで、十分な骨癒合が確認できる。成形体Ｂの外観形状、３Ｄプリンターにより形成した内部構造ともに形状維持されている。

　移植した成形体Ｂの０週から２週間ごとのマイクロＣＴ解析の結果を図２０に示す。４週間後に、設計して作成した約０．７×１．０ｍｍの十字形状の連通孔に骨が新生し、６週間後に成長している様子が確認でできる。

　移植した成形体Ｂの８週間後のマイクロＣＴ解析の結果を図２１に示す。解析条件は上記の試験Aと同様である。設計して作成した約０．７×１．０ｍｍの連通孔に骨が新生し、長いところで３．５ｍｍまで成長している。また、病理標本、ｖｏｎ　Ｋｏｓｓａ染色により、連通孔の内部できたものが、間違いなく骨であることも確認できる。

　移植した成形体Ｂの８週間後の病理標本、Ｈ＆Ｅ染色の結果を図２２に示す。図２２の病理標本は、図２１の病理標本の近くである。３Ｄプリント設計により作成した、０．７×１．０ｍｍの十字形状の連通孔内部で、骨が新生している近くでも、細胞が浸潤し、軟組織となっていることが分かる。　３Ｄプリント粉体積層時に、自律形成された疎密積層構造の疎層にも（２０～８０ｕｍ程度）にも、細胞が浸潤し、軟組織となっている。

　移植した成形体Ｂについて、上記とは異なるラット（２匹目）の８週間後の病理標本、Ｈ＆Ｅ染色の結果を図２３と図２４に示す。３Ｄプリント設計により作成した、０．７×１．０ｍｍの連通孔内部にて血管の新生を確認した。　3D粉体積層プリント時に自律形成された疎密積層構造の疎層にも（２０～８０ｕｍ程度）にも、血管の新生を確認した。

　移植した成形体Bについて、上記とは違うラット（３匹目）の8週間後の病理標本、 von Kossa染色の結果を図２５に示す。リン酸カルシウムが吸収置換され、骨に置き換わっている様子が確認できる。

実施例１１：有機酸溶液の濃度の影響
＜リン酸カルシウム成形体の製造方法＞
　クエン酸１．０ｍｏｌ／Ｌ：クエン酸三ナトリウム二水和物１．０ｍｏｌ／Ｌ＝３：１、の体積比で混合し、ｐＨ３．１５に調整した１．０ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム水溶液を調製した。
　クエン酸１．２ｍｏｌ／Ｌ：クエン酸三ナトリウム二水和物１．２ｍｏｌ／Ｌ＝３：１、の体積比で混合し、ｐＨ３．１５に調整した１．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液を調製した。

　粉体として、微細側から累積１０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ１０、微細側から累積25％のときの粒径（μ ｍ）をｄ25、微細側から累積５０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ５０、微細側から累積75％のときの粒径（μ ｍ）をｄ75、微細側から累積９０％のときの粒径（μ ｍ）をｄ９０と表したとき、メジアン径にあたるｄ５０＝７．４μｍのＴＴＣＰ、ｄ５０＝１９．５μｍのＤＣＰＤ粉体を用意し、最終的にＣａ／Ｐの原子数の比が１．５になるように混合した。より具体的には、モル比でＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝１：２、ＴＴＣＰ：ＤＣＰＤ＝２１９．８ｇ：２０６．５ｇで混合した。この混合物をリン酸Ｃａ粉体とする。
　混合したリン酸Ｃａ粉体は、粒子径５～１５μｍの粒子を体積基準で約３５％含み、粒子径２５～１００μｍの粒子を３２％含む。レーザー回折式粒度分布測定の装置として、株式会社セイシン企業製のＬＭＳ－２０００ｅにて、分散媒はエタノールで測定した。

　上記のリン酸Ｃａ粉体に対して、１．０ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液又は１．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液を吐出により滴下させた。
有機酸溶液の塗布量は、３Ｄプリンターからリン酸カルシウム粉体を除き、重量を測定したおいたプラスチック容器を、本来、リン酸カルシウム成形体が形成される場所おいて、プラスチック容器に対し、１ｃｍ³設計の立体物を造形するよる有機酸溶液を吐出し、有機酸溶液がのった状態でプラスチック容器の重量を測定し、吐出された有機酸溶液の重量を測定する。　１ｃｍ³設計の立体物を造形するのに要した有機酸溶液の重量を有機酸溶液の塗布量として、ｇ/１ｃｍ³という単位であらわす。

　１．０ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液は0.12ｇ/１ｃｍ³から0.38ｇ/１ｃｍ³の範囲で試験し、１．０ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液は0.215ｇ/１ｃｍ³から0.29ｇ/１ｃｍ³の範囲で試験した。

　粉末およびクエン酸ナトリウム水溶液を、Ｚ－Ｐｒｉｎｔｅｒ３１０　Ｐｌｕｓ（３Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧　Ｚ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））に導入し、２０×２０×8ｍｍの直方体を作成した。

　３Ｄプリンターで成形した後、３５℃の３Ｄプリンター内で１時間、乾燥させ、余剰な粉体を圧空（エアーガンから０．１５ＭＰａに調整した圧縮空気をだすエアーブロー流）で除去した。この成形体をマッフル炉にて、１時間につき１００℃ずつ昇温させた後、１１００℃で２時間焼結し、焼結の為の加熱をｏｆｆにし、マッフル炉の蓋は開けない状態で、８時間以上静置する。マッフル炉が１００℃以下の温度になった後、焼結の済んだ成形体を取り出し、成形体を得た。　成形体は焼結後に各方向に約1割縮むので約18×18×7.2ｍｍとなった。

　作製したリン酸カルシウム成形体について、圧縮強度の測定及び底面の反りの評価を行った。
　圧縮強度の測定は、株式会社イマダ製の縦型電動計測スタンドＭＸ２と同じく株式会社イマダ製のデジタルフォースゲージＺＴＡ－１０００Ｎを用いて行った。約１８×１８×７．２ｍｍサンプルの長手方向に，０．１７ｍｍ／秒の速度で荷重をかけ、サンプルの形状は正確にノギスにより測定し、サンプル破壊時の最大荷重（Ｎ）を断面積で割ることにより圧縮強度（ＭＰａ）を求めた。
　底面の反りの評価は、以下の基準で行った。クラス１から５の見本を図２６に示す。

　１．０ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液又は１．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液を用いて作製したリン酸カルシウム成形体について、塗布量と圧縮強度の関係を図２７に示し、塗布量と底面の反りの関係を図２８に示し、圧縮強度と底面の反りの関係を図２９に示す。

図２７から、設計事項として塗布量を増やすと、圧縮強度も大きくなり造形物しての強度が高まることが分かる。図２８から、設計事項として塗布量が増やすと反りが大きなって形状精度が失われることが分かる。図２９は、図２７の塗布量と圧縮強度の関係と、図２８の塗布量と底面の反りの関係を統合した、圧縮強度と底面の反りの関係であり、圧縮強度と底面の反りがトレードオフの関係になっていることが明瞭に分かる。

　１．０ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液の結果からは、圧縮強度2.0MPa以上で、底面の反りのクラスが４以上となる領域はない。　しかし、１．2ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液を用いて作成したリン酸カルシウム成形体について、圧縮強度2.0MPa以上で、底面の反りのクラスが４以上となる領域が見つかる。

　ｐH3.15と同じであっても、１．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液を用いた方が、圧縮強度及び底面の反りのトレードオフは解消され、より良好な結果が得られる。即ち、１．２ｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム水溶液を用いることにより、高い圧縮強度と、底面の反りの抑制とを両立することができる。

１１　第一の孔のＸ連通孔
１２　第一の孔のＹ連通孔
１３　第一の孔のＺ連通孔
１４　第一の孔のＸＹＺ連通孔
１５，０６　縫合孔
１６，０２　第二の孔
１７　構造強化領域
０４　第一の孔
２１　リン酸カルシウム成形体
２２　プラスチック筒
２３　チューブ
２４　水位
２５　シリンジ

Claims

Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を基板上に形成する工程ａ；及び
有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、前記有機酸溶液を前記工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｂ；
を含む、リン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記工程ｂで使用する有機酸が、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸及びリンゴ酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記工程ｂの後に、
Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウム粉末を含有する層を、前記工程ａで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層の上に形成する工程ｃ；及び
有機酸のカルシウム塩の水に対する溶解度が１ｇ／１００ｍＬ以下であり、かつｐＨ３．５以下である有機酸溶液をノズル部から液滴状態で吐出させて、前記有機酸溶液を前記工程ｃで形成したリン酸カルシウム粉末を含有する層に対して滴下させることによりリン酸カルシウム成形体を製造する工程ｄ；
をさらに含む、請求項１又は２に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記工程ｄで使用する有機酸が、クエン酸、シュウ酸、酒石酸、マロン酸及びリンゴ酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記リン酸カルシウム粉末は、第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含み、第一のリン酸カルシウム粉末の前記有機酸に対する溶解性が、第二のリン酸カルシウム粉末の前記有機酸に対する溶解性よりも高く、
第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含む前記リン酸カルシウム粉末は、粒子径５～１５μｍの粒子と、粒子径２５～１００μｍの粒子とを少なくとも含み、粒子径２５μｍ以上の粒子を体積基準で２０％以上含む、請求項１から４の何れか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
第一のリン酸カルシウム粉末のフローファンクションが４．００未満であり、
第一のリン酸カルシウム粉末と第二のリン酸カルシウム粉末とを含む前記リン酸カルシウム粉末のフローファンクションが４．００以上である、請求項５に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法：但し、フローファンクションは、破壊強度をｆｃ、最大主応力をσ１とした時、σ１／ｆｃで表される。
工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液の濃度が１．１ｍｏｌ／Ｌ以上１．４ｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１から６の何れか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸が、クエン酸である、請求項７に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液の塗布量が、０．２０ｇ／ｃｍ³以上０．３０ｇ／ｃｍ³以下である、請求項７又は８に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
工程ｂおよび／又は工程ｄにおける有機酸溶液のｐＨが、２．５以上３．５以下である、請求項１から９の何れか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
成形体の形成に使用されなかった、リン酸カルシウム粉末を除去する工程ｅをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記工程ｅの後、成形体を水溶液に浸漬することにより成形体を硬化させる工程ｆ、及び／又は成形体を加熱することにより成形体を硬化させる工程ｇを含む、請求項１１に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
成形体に生体親和性高分子を被覆する工程ｈをさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記生体親和性高分子が、リコンビナントゼラチンである、請求項１３に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
前記工程ｈの後に、前記生体親和性高分子に細胞を播種する工程ｉをさらに含む、請求項１３又は１４に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
リン酸カルシウム成形体が、再生医療用足場材又は組織修復材である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法。
請求項１から１６のいずれか一項に記載のリン酸カルシウム成形体の製造方法により製造されるリン酸カルシウム成形体。
再生医療用足場材又は組織修復材である、請求項１７に記載のリン酸カルシウム成形体。
外部空間と連通している孔を有している、請求項１７又は１８に記載のリン酸カルシウム成形体。
外部空間と連通している孔が、成形体の内部を貫通し、孔の両端において外部空間と連通している、請求項１９に記載のリン酸カルシウム成形体。
外部空間と連通している孔の平均径が２００μｍ～２０００μｍである、請求項１９又は２０に記載のリン酸カルシウム成形体。
Ｃａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８であるリン酸カルシウムから形成されるリン酸カルシウム成形体であって、
外部空間と連通している第一の孔及び当該第一の孔よりも平均径が大きい第二の孔を有する、リン酸カルシウム成形体。
外部空間と連通している第一の孔の平均径が２００μｍ～２０００μｍである、請求項２２に記載のリン酸カルシウム成形体。
外部空間と連通している第一の孔の数が、第一の孔よりも平均径が大きい第二の孔の数よりも多い、請求項２２又は２３に記載のリン酸カルシウム成形体。
表面の一部又は全部がリコンビナントゼラチンでコートされているリン酸カルシウム成形体を含む、移植用材料。
前記リン酸カルシウムのＣａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８である、請求項２５に記載の移植用材料。
リコンビナントペプチドが、熱架橋又は化学架橋されている、請求項２５又は２６に記載の移植用材料。
リコンビナントペプチドでコートされているリン酸カルシウム成形体の表面が、移植用材料の表面および内部に存在する、請求項２５から２７の何れか一項に記載の移植用材料。
リン酸カルシウム成形体が、ブロック状である、請求項２５から２８の何れか一項に記載の移植用材料。
リン酸カルシウム成形体が、顆粒状である、請求項２５から２８の何れか一項に記載の移植用材料。
リン酸カルシウムから形成されるリン酸カルシウム成形体であって、
外部空間と連通している孔を有し、
比重が０．７ｇ／ｍＬ以上であるか、および／又は水銀注入法による気孔率が７５％以下であり、
吸水浸透速度が、０．０５ｍｍ／秒以上である、
リン酸カルシウム成形体；
但し、吸水浸透速度とは、以下の条件で測定したものである。直径８ｍｍ高さ２０ｍｍのリン酸カルシウム成形体に、内径２ｍｍのプラスチック筒の一端を連結し、前記プラスチック筒の他端を長さ１００ｍｍのチューブの一端に連結し、前記チューブの他端を１０ｍＬのシリンジに連結した実験系を構築する。リン酸カルシウム成形体とプラスチック筒の接する高さと、シリンジ内のインキの水位の高さとが吸水浸透の開始から終了まで同じになるように調整した条件下において、シリンジ内のインキをリン酸カルシウム成形体に吸水浸透させる。インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとなったときは、15mmを浸透に要した時間で割った値を吸水浸透速度とし、インキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さが5分以内に15mmとならない場合は、5分の時点においてインキが浸透したリン酸カルシウム成形体の領域の高さを、浸透に要した時間である5分で割った値を、吸水浸透速度とする。
前記リン酸カルシウムのＣａ／Ｐの原子数の比が１．４～１．８である、請求項３１に記載のリン酸カルシウム成形体。
ナノフォーカスＸ線ＣＴ又はマイクロフォーカスＸ線ＣＴによる測定により判別される相対的に密な層と相対的に疎な層とが交互に積層された構造を有している、請求項３１又は３２に記載のリン酸カルシウム成形体。
少なくとも５層以上の相対的に密な層と、少なくとも５層以上の相対的に疎な層とが交互に積層されている、請求項３３に記載のリン酸カルシウム成形体。
第一の相対的に密な層と、前記第一の相対的に密な層の隣の第二の相対的に密な層とのピッチが５０～３００μｍである、請求項３３又は３４に記載のリン酸カルシウム成形体。
リン酸カルシウム成形体のナノフォーカスＸ線ＣＴ画像に基づいて、成形体の一方向の距離を横軸に、相対ＣＴ強度を縦軸に表示した波形図において、山のピークと谷のピークとを交互に有する、請求項３１又は３２に記載のリン酸カルシウム成形体。
少なくとも５つ以上の山のピークを有する、請求項３６に記載のリン酸カルシウム成形体。
第一の山のピークと、前記第一の山のピークの隣の第二の山のピークとのピッチが５０～３００μｍである、請求項３６又は３７に記載のリン酸カルシウム成形体。