CN109219587A - 磷酸钙成型体的制造方法、磷酸钙成型体及移植用材料 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种迅速且以高造型精度制造具有高强度的磷酸钙成型体的方法、利用上述方法制造的磷酸钙成型体及移植用材料。根据本发明，提供一种磷酸钙成型体的制造方法，其包括：工序a，在基板上形成含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层；及工序b，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将上述有机酸溶液滴加于在上述工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。

Description

磷酸钙成型体的制造方法、磷酸钙成型体及移植用材料
技术领域
本发明涉及一种从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸溶液，并滴加于含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体的方法。本发明还涉及一种磷酸钙成型体。本发明还涉及一种移植用材料。
背景技术
正促进实现陷入功能障碍或功能不全的活体组织或器官的再生的再生医疗的实际应用。再生医疗是一种在无法仅通过活体所具有的天然愈合能力来恢复的活体组织中，使用细胞、支架及生长因子中的一种以上来再生与原始组织相似的形态和功能的医疗技术。在再生医疗中，有时使用磷酸钙成型体。
在专利文献1中记载有用于医疗用途、牙科用途的磷酸钙水泥及磷酸钙粉末。在专利文献1中，具体记载有如下磷酸钙水泥，其通过捏合磷酸钙粉末和固化用液体制剂而成，在粉末与液体制剂的粉液比在1.5～3.5的范围变化时，在JIS T6602中规定的稠度为2～100mm。在专利文献2中，记载有基于粉末层叠法的人造骨成型方法，该粉末层叠法具有如下步骤：a)粉末层形成步骤，将包括磷酸钙等无机成分及其他骨成分的粉末骨材料形成为平面状的粉末层；b)部分固化步骤，向部分粉末层喷射具有生物亲和性的水溶液，并固化喷射部分；及c)人造骨成型步骤，反复a)及b)的步骤进行层叠，成型固化部分连接而成的所希望的三维结构的人造骨。在专利文献3中，记载有如下磷酸钙类骨修复材料的制造方法：制备包含钙溶液及磷酸溶液的混合液，此时，使混合液中存在由磷酸钙构成的母材，从而在母基材上析出磷酸钙，并对所获得的复合物进行热处理。
在专利文献4中，记载有一种组织再生用部件，其包含含有细胞因子及磷酸钙的可生物降解的树脂膜，其中，利用喷墨方法来形成具有细胞因子与磷酸钙的比率在厚度方向上连续地增加或减少的倾斜结构的组织再生用部件。并且，在专利文献5中，记载有一种层叠造型用粉末材料，其含有磷酸钙粉末，其中，在磷酸钙粉末表面以规定量赋予具有磷酸基或者羧基的有机化合物，以规定量包含由具有磷酸基或羧基的有机化合物组成的粉末，并且通过固化层叠造型用粉末材料而成的固化物的羟基磷灰石(HAp)转移率为1％以下。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001-095913号公报
专利文献2：国际公开WO2005/011536号公报
专利文献3：日本特开2006-025915号公报
专利文献4：日本特开2013-106721号公报
专利文献5：日本特开2015-187058号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
如上所述，已知作为骨修复材料或组织再生用部件，使用包含磷酸钙的材料，但希望开发一种迅速且以高造型精度制造具有高强度的磷酸钙成型体的方法。
本发明的课题在于，提供一种迅速且以高造型精度制造具有高强度的磷酸钙成型体的方法、磷酸钙成型体及移植用材料。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，其结果发现在基板上形成含有Ca/P(钙/磷)的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层之后，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并滴加于含有上述磷酸钙粉末的层，从而能够迅速且以高造型精度制造具有高强度的磷酸钙成型体。本发明是基于这些见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下发明。
＜1＞一种磷酸钙成型体的制造方法，其包括：
工序a，在基板上形成含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层；及
工序b，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将上述有机酸溶液滴加于在上述工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
＜2＞根据＜1＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
在上述工序b中使用的有机酸为选自包括柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸及苹果酸的组中的至少1种。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
在上述工序b之后还包括：
工序c，含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层形成于在上述工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层上；及
工序d，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将上述有机酸溶液滴加于在上述工序c中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
＜4＞根据＜3＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
在上述工序d中使用的有机酸为选自包括柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸及苹果酸的组中的至少1种。
＜5＞根据＜1＞至＜4＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
上述磷酸钙粉末包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末，第1磷酸钙粉末相对于上述有机酸的溶解性比第2磷酸钙粉末相对于上述有机酸的溶解性高，
包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末的上述磷酸钙粉末至少包含粒径为5～15μm的粒子及粒径为25～100μm的粒子，且以体积基准包含20％以上的粒径为25μm以上的粒子。
＜6＞根据＜5＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
第1磷酸钙粉末的流函数小于4.00，
包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末的上述磷酸钙粉末的流函数为4.00以上，其中，在将断裂强度设为fc、最大主应力设为σ1时，流函数由σ1/f c表示。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的浓度为1.1mol/L以上且1.4mol/L以下。
＜8＞根据＜7＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸为柠檬酸。
＜9＞根据＜7＞或＜8＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的涂布量为0.20g/cm3以上且0.30g/cm3以下。
＜10＞根据＜1＞至＜9＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的pH为2.5以上且3.5以下。
＜11＞根据＜1＞至＜10＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其还包括去除在成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末的工序e。
＜12＞根据＜11＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其在上述工序e之后包括通过将成型体浸渍于水溶液来硬化成型体的工序f和/或通过加热成型体来硬化成型体的工序g。
＜13＞根据＜1＞至＜12＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其还包括在成型体上包覆生物亲和性高分子的工序h。
＜14＞根据＜13＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
上述生物亲和性高分子为重组明胶。
＜15＞根据＜13＞或＜14＞所述的磷酸钙成型体的制造方法，其在上述工序h之后还包括将细胞接种于上述生物亲和性高分子的工序i。
＜16＞根据＜1＞至＜15＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
磷酸钙成型体为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
＜17＞一种磷酸钙成型体，其利用＜1＞至＜16＞中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法来制造。
＜18＞根据＜17＞所述的磷酸钙成型体，其为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
＜19＞根据＜17＞或＜18＞所述的磷酸钙成型体，其具有与外部空间连通的孔。
＜20＞根据＜19＞所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通。
＜21＞根据＜19＞或＜20＞所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的孔的平均直径为200μm～2000μm。
＜22＞一种磷酸钙成型体，其由Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙形成，所述磷酸钙成型体具有与外部空间连通的第1孔及平均直径比该第1孔大的第2孔。
＜23＞根据＜22＞所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的第1孔的平均直径为200μm～2000μm。
＜24＞根据＜22＞或＜23＞所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的第1孔的数量多于平均直径比第1孔大的第2孔的数量。
＜25＞一种移植用材料，其包含表面的一部分或整个表面被重组明胶涂布的磷酸钙成型体。
＜26＞根据＜25＞所述的移植用材料，其中，
上述磷酸钙的Ca/P的原子数比为1.4～1.8。
＜27＞根据＜25＞或＜26＞所述的移植用材料，其中，
重组肽被热交联或化学交联。
＜28＞根据＜25＞至＜27＞中任一项所述的移植用材料，其中，
用重组肽涂布的磷酸钙成型体的表面存在于移植用材料的表面及内部。
＜29＞根据＜25＞至＜28＞中任一项所述的移植用材料，其中，
磷酸钙成型体为块状。
＜30＞根据＜25＞至＜28＞中任一项所述的移植用材料，其中，
磷酸钙成型体为颗粒状。
＜31＞一种磷酸钙成型体，其由磷酸钙形成，
所述磷酸钙成型体具有与外部空间连通的孔，
比重为0.7g/mL以上和/或基于汞注入法的孔隙率为75％以下，吸水渗透速度为0.05mm/秒以上，
其中，吸水渗透速度是指，通过以下条件测定的值。构建如下实验系统：将内径为2mm的塑料筒的一端连接于直径为8mm且高度为20mm的磷酸钙成型体，将上述塑料筒的另一端连接于长度为100mm的管的一端，将上述管的另一端连接于10mL的注射器。在将磷酸钙成型体与塑料筒的接触高度和注射器内的墨液水位的高度调整为从开始吸水渗透到结束为止相同的条件下，将注射器内的墨液吸水渗透到磷酸钙成型体中。当墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内成为15mm时，将15mm除以渗透所需要的时间而得的值作为吸水渗透速度，在墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内达不到15mm的情况下，将在5分钟的时间点墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度除以渗透所需要的时间即5分钟而得的值作为吸水渗透速度。
＜32＞根据＜31＞所述的磷酸钙成型体，其中，
上述磷酸钙的Ca/P的原子数比为1.4～1.8。
＜33＞根据＜31＞或＜32＞所述的磷酸钙成型体，其具有通过基于纳米焦点X射线CT或微焦点X射线CT的测定而判别的相对致密的层和相对稀疏的层交替层叠而成的结构。
＜34＞根据＜33＞所述的磷酸钙成型体，其中，
至少5层以上的相对致密的层和至少5层以上的相对稀疏的层交替层叠。
＜35＞根据＜33＞或＜34＞所述的磷酸钙成型体，其中，
第1相对致密的层与相邻于上述第1相对致密的层的第2相对致密的层的间距为50～300μm。
＜36＞根据＜31＞或＜32＞所述的磷酸钙成型体，其中，
在根据磷酸钙成型体的纳米焦点X射线CT图像而将成型体的一个方向上的距离表示于横轴且将相对CT强度表示于纵轴的波形图中，交替地具有山的峰和谷的峰。
＜37＞根据＜36＞所述的磷酸钙成型体，其中，
具有至少5个以上的山的峰。
＜38＞根据＜36＞或＜37＞所述的磷酸钙成型体，其中，
第1山的峰与相邻于上述第1山的峰的第2山的峰的间距为50～300μm。
发明效果
根据基于本发明的磷酸钙成型体的制造方法，能够迅速且以高造型精度制造具有高强度的磷酸钙成型体。本发明的磷酸钙成型体具有高强度。本发明的移植材料的细胞粘附性优异且骨形成能力强。
附图说明
图1表示具有第1孔的X连通孔、Y连通孔及Z连通孔的成型体。
图2表示具有结构强化区域的成型体。
图3表示基于3D打印机的成型体的制作设计图。
图4表示所制作的成型体。
图5表示确认了对β-TCP粒子的重组明胶修饰效果(细胞粘附性)的结果。
图6表示确认了对β-TCP粒子的重组明胶修饰效果(骨形成)的结果。
图7表示吸水渗透速度的测定中所使用的实验系统。
图8表示疏密层叠结构的解析中所使用的对象物的结构。
图9表示在纳米焦点X射线CT解析中，将视角调整为能够视觉辨认致密层(相对致密的层)及稀疏层(相对稀疏的层)的结果。
图10表示在纳米焦点X射线CT解析中，在Z轴方向选择3.14mm、在X轴方向选择3.14mm的区域的状态。
图11表示将在图10中选择的区域与黑色和白色的程度相匹配而进行波形化的图。
图12表示在纳米焦点X射线CT解析中，在Z轴方向选择3.12mm、在Y轴方向选择3.12mm的区域的状态。
图13表示将在图12中选择的区域与黑色和白色的程度相匹配而进行波形化的图。
图14表示混合粉末的粒度分布的测定结果。
图15表示TTCP粉末的粒度分布的测定结果。
图16表示DCPD粉末的粒度分布的测定结果。
图17表示大鼠试验中所使用的磷酸钙成型体的示意图。
图18表示关于试验A(控制：仅缺陷)的微焦点CT解析的结果。
图19表示成型体B的大鼠移植后8周期间的显微CT解析的结果。
图20表示所移植的成型体B的每0周至2周期间的显微CT解析的结果。
图21表示所移植的成型体B的8周后的显微CT解析的结果。
图22表示所移植的成型体B的8周后的病理标本、H&E染色的结果。
图23表示关于所移植的成型体B，大鼠(第2只)的8周后的病理标本、H&E染色的结果。
图24表示关于所移植的成型体B，大鼠(第2只)的8周后的病理标本、H&E染色的结果。
图25表示关于所移植的成型体B，大鼠(第3只)的8周后的病理标本、von Kossa染色的结果。
图26表示底面的翘曲评价中的等级1至5的样本。
图27表示关于磷酸钙成型体，涂布量与压缩强度的关系。
图28表示关于磷酸钙成型体，涂布量与底面的翘曲的关系。
图29表示关于磷酸钙成型体，压缩强度与底面的翘曲的关系。
图30表示具有3阶段连通孔的磷酸钙成型体的示意图。
图31表示具有3阶段连通孔的磷酸钙成型体的扫描型电子显微镜(Scann ingElectron Microscope；SEM)图像。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
以下记载的构成要件的说明是根据本发明的代表性实施方式而进行的，但本发明并不限定于这种实施方式。
另外，在本说明书中用“～”表示的数值范围是指，将记载于“～”前后的数值作为下限值及上限值而包括的范围。
[1]磷酸钙成型体的制造方法
基于本发明的磷酸钙成型体的制造方法包括：
工序a，在基板上形成含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层；及
工序b，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将上述有机酸溶液滴加于在上述工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
在本发明中，通过使用Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末、以及使用有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，从而能够迅速且以高造型精度(液滴的防渗出性高)制造具有高强度的磷酸钙成型体。作为可获得本发明的效果的机理，设想到以下机理，但本发明的范围不受以下机理的任何限定。
磷酸钙在pH为4以下时作为Ca/P的原子数比为1的磷酸氢钙(CaHPO4：也称为DCPA)而析出。在本发明中，使用pH为3.5以下的有机酸溶液，这是因为，喷出后的pH改变，具体而言，作为Ca/P的原子数比为1的DCPA而析出，因此Ca剩余，从而pH偏向碱性侧。设想到此时过量的Ca固化为溶解度小的盐，从而实现“高固化速度”、“成型体的高强度”以及“由防止液滴渗出引起的成型体的精度提高”。
在本说明书中所说的“具有高强度的磷酸钙成型体”是指，磷酸钙成型体具有能够承受成型后的处理(例如，从装置中取出成型体的操作等)程度的强度。
＜1＞磷酸钙粉末
在本发明中使用的磷酸钙粉末中的磷酸钙中，Ca/P的原子数比为1.4～1.8。Ca/P的原子数比优选为1.45～1.79，更优选为1.50～1.70。
Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的制造方法并没有特别限定，但能够通过如下方法来制造Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末：例如，作为原料使用Ca/P的原子数比为已知的2种以上的磷酸钙粉末，以规定的比率混合上述2种以上的磷酸钙粉末以使Ca/P的原子数比成为1.4～1.8。作为一例，能够通过如下方法来制造Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末：作为磷酸钙粉末的原料，使用Ca4(PO4)2O(磷酸四钙：也称为TTCP：Ca/P的原子数比为2.0)、CaHPO4·2H2O(磷酸氢钙二水合物：也称为DCPD：Ca/P的原子数比为1.0)，并改变TTCP与DCPD的混合比率。
从反应性的观点考虑，粉末的粒径越小越优异，但从容易形成粉末层的观点考虑，粒径优选为1μm～100μm，更优选为5μm～50μm，进一步优选为10μm～30μm。另外，能够通过激光衍射散射式粒度分布测定法来测定粒径，具体而言，能够利用激光衍射散射式粒度分布测定装置/HORIBA,Ltd.制造/LA-920或SEISHIN ENTERPRISE Co.,Ltd.制造的LMS-2000e来测定。
优选磷酸钙粉末包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末，第1磷酸钙粉末相对于有机酸(后述)的溶解性比第2磷酸钙粉末相对于有机酸(后述)的溶解性高。
优选包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末的上述磷酸钙粉末至少包含粒径为5～15μm的粒子及粒径为25～100μm的粒子，且以体积基准包含5.0％以上(更优选包含10％以上，进一步优选包含15％以上)的粒径为5～15μm的粒子，以体积基准包含20％以上(更优选为25％以上，进一步优选为30％以上)的粒径为25μm以上的粒子。
优选第1磷酸钙粉末的流函数小于4.00，且包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末的磷酸钙粉末的流函数为4.00以上。在此，在将断裂强度设为fc、最大主应力设为σ1时，流函数由σ1/fc表示。流函数能够使用Brookfield company制造的“Powder Flow Tester、PFT”等测定装置并依照后述实施例中的记载来进行测定。
＜2＞在基板上形成含有磷酸钙粉末的层的工序a
本发明中的工序a为在基板上形成含有磷酸钙粉末的层的工序。
基板的材质、形状及大小并没有特别限定，能够根据目的而使用适合的基板。作为基板，优选具有规定面积的平面的基板。基板的表面积并没有特别限定，优选为5～200cm2，更优选为20～100cm2。
作为基板的材质，可以举出丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯(聚甲基丙烯酸甲酯树脂等)、聚苯乙烯及聚丙烯等塑料原材料、玻璃等无机原材料、以及铜、铝及不锈钢等金属原材料等。
在基板上形成含有磷酸钙粉末的层的工序能够用任意方法来进行，该方法并没有特别限定，例如能够使用3D打印机(三维打印机)来进行。作为3D打印机的一例，能够使用Z-Printer310Plus(3D Systems Corporation(旧Z Corporation))等，但并不受特别限定。
＜3＞有机酸溶液
在本发明中，使用有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液。有机酸的钙盐的溶解度表示在25℃的温度下的溶解度。
关于有机酸溶液，只要有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下即可，优选为0.5g/100mL以下，更优选为0.1g/100mL以下。
作为满足上述溶解度的有机酸。优选为选自包括柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸及苹果酸的组中的至少1种，更优选为柠檬酸、草酸或酒石酸，进一步优选为柠檬酸。
有机酸溶液的pH为5以下，优选为1.0～3.5，更优选为2.5以上且3.5以下，进一步优选为3.0以上且3.5以下。
pH为3.5以下的有机酸溶液能够通过调整有机酸及有机酸的盐(有机酸的钠盐等)的混合比来制造。
有机酸溶液中的有机酸的浓度并没有特别限定，通常为0.1mol/L以上且5.0mol/L以下，优选为0.5mol/L以上且3.0mol/L以下，更优选为1.0mol/L以上且2.0mol/L以下，进一步优选为1.1mol/L以上且1.4mol/L以下。
＜4＞包括喷出有机酸溶液的制造磷酸钙成型体的工序b
在本发明中，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸溶液，并将上述有机酸溶液滴加于在工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
在本发明中，以液滴状态喷出有机酸溶液。液滴状态是指，从喷嘴部喷出的有机酸溶液不与喷嘴部及基板上的含有磷酸钙粉末的层中的任一个接触，并在空间中移动的状态。
在本发明中，以液滴状态喷出有机酸溶液时的温度并没有特别限定，通常为15℃以上且50℃以下，优选为20℃以上且40℃以下，例如为室温。
能够使用具有喷嘴部的喷墨头来进行有机酸溶液的喷出。已知有通过压电元件的致动器等而从喷嘴部喷出墨液液滴并弹落在介质上而在介质上形成图像的喷墨记录装置。在喷墨记录装置中，喷嘴部的排列间距成为高密度化，并且能够喷出几皮升～100皮升的微小的墨液液滴。在日本特开2012-004555号公报中，记载有基于喷墨方式的功能材料的制造方法及装置，能够使用如日本特开2012-004555号公报所记载的喷墨头来进行有机酸溶液的喷出。日本特开2012-004555号公报所记载的内容均引用于本说明书中。
喷墨头优选构成为能够在水平方向上移动自如。可以使喷墨头相对被固定的基板移动，也可以使喷墨头及基板这两个移动。喷墨头是将从墨盒供给的墨液(即，有机酸溶液)对基板上的含有粉末的层的所希望的位置进行喷出的喷墨头。
作为喷墨方式，可以为连续型、按需型中的任一种，但在向几十cm的平方以上的大面积喷出的情况下，优选为具有多个喷嘴的按需型。以按需型的喷出方式为特征的致动器能够使用压电方式、热方式、固体方式、静电吸附方式等各种方式。压电方式除了能够喷出水系以外，还能够喷出有机溶剂系。关于喷嘴的排列，可以配置成单行、配置成多行、配置成交错格子状中的任意一种。
关于上述包括喷出有机酸溶液的制造磷酸钙成型体的工序b，例如能够使用具备喷墨头的3D打印机(三维打印机)来进行。作为3D打印机的一例，能够使用Z-Printer310Plus(3D Systems Corporation(旧Z Corporation)等，但并不受特别限定。
通过本发明的方法来制造的磷酸钙成型体的大小并没有特别限定，在磷酸钙成型体近似为长方体的情况下，长方体的纵、横及高度分别优选为0.1mm～200mm，更优选为1mm～100mm。
＜5＞层叠
基于本发明的磷酸钙成型体的制造方法在上述工序b之后，可以还包括：
工序c，含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层形成于在工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层上；及工序d，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将上述有机酸溶液滴加于在工序c中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
上述工序c能够以与工序a相同的方式进行。工序c中使用的材料的种类可以与工序a相同，也可以不同，但优选相同。
上述工序d能够以与工序b相同的方式进行。工序d中使用的材料的种类可以与工序b相同，也可以不同，但优选相同。
工序d中使用的有机酸与工序b的情况同样地，优选为选自包括柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸及苹果酸的组中的至少1种，更优选为柠檬酸、草酸或酒石酸，进一步优选为柠檬酸。
在进行工序c及工序d的情况下，其次数并没有特别限定，能够进行1次以上的任意次数，例如能够进行1次～1000次。
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的涂布量通常为0.10g/cm3以上且0.40g/cm3以下，优选为0.20g/cm3以上且0.30g/cm3以下。
＜6＞去除磷酸钙粉末的工序
在本发明中，能够进一步设置去除成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末的工序e。去除磷酸钙粉末是指，从成型体的表面去除磷酸钙粉末。
通过去除成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末，能够回收以所希望的形状成型的成型体。另外，在本发明中，通过所形成的成型体具有规定强度，能够在不损坏成型体的情况下去除成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末。
去除成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末的方法并没有特别限定，例如可以使用压缩空气来进行。
＜7＞硬化成型体的工序
在本发明中，在去除成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末的工序e之后，能够进一步设置通过将成型体浸渍于水溶液来硬化成型体的工序f和/或通过加热成型体来硬化成型体的工序g。其中，工序f及工序g可以分别设置，也可以不设置。
通过进行上述工序f和/或工序g，能够去除所添加的有机酸，能够进一步提高成型体的强度。
并且，在进行上述工序c及工序d的情况下(即，层叠含有磷酸钙粉末的层的情况下)，通过工序f来硬化成型体，能够进一步提高成型体的强度。推断为由于含有磷酸钙粉末的层之间的强度的提高，成型体的强度得到进一步提高。即，在本发明的优选方式中，能够在进行工序a及工序b之后进行工序c及工序d，然后，进行去除成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末的工序e，进而，在工序e之后进行通过将成型体浸渍于水溶液来硬化成型体的工序f。
在通过将成型体浸渍于水溶液来硬化成型体的工序f中使用的水溶液的种类，只要能够硬化成型体，则并没有特别限定，例如可以举出磷酸水溶液等，更具体而言，能够使用0.1mol/L～1.0mol/L的磷酸二氢钠溶液等。上述水溶液的pH并没有特别限定，通常为pH3～11，优选为pH3～10，更优选为pH4～9。
将成型体浸渍于水溶液的时间并没有特别限定，通常为1小时至48小时，优选为2小时至24小时，更优选为4小时至24小时。
通过加热成型体来硬化成型体的工序g能够通过以如下温度加热成型体来进行：通常为100℃～2000℃，优选为200℃～1500℃，更优选为500℃～1500℃，进一步优选为1000℃～1300℃，尤其优选为1100℃～1200℃。其中，T〔开尔文：K〕＝t〔摄氏度：℃〕+273.15。
加热时间并没有特别限定，通常为1小时至48小时，优选为1小时至24小时，更优选为2小时至12小时，进一步优选为2小时至6小时。
能够通过使用马弗炉等并利用通常的方法来进行加热。
通过进行上述的硬化成型体的工序f和/或工序g，能够提高成型体的压缩强度。进行了工序f和/或工序g的成型体的压缩强度并没有特别限定，优选为2.5MPa以上，更优选为3.0MPa以上，进一步优选为3.5MPa以上，压缩强度的上限并没有特别限定，通常为10MPa以下。
＜8＞包覆生物亲和性高分子的工序
在本发明中，能够进一步设置在成型体上包覆生物亲和性高分子的工序h。其中，可以设置工序h，也可以不设置。通过以生物亲和性高分子包覆成型体，能够使细胞容易吸附。优选为通过进行在本说明书中如上记载的硬化成型体的工序f和/或工序g来从成型体中去除酸之后，在成型体上包覆生物亲和性高分子(优选为后述的重组明胶)，从而能够防止生物亲和性高分子与酸的反应。即，在本发明的优选方式中，能够在进行硬化成型体的工序f和/或工序g之后，进行在成型体上包覆生物亲和性高分子的工序h。
(8-1)生物亲和性高分子
生物亲和性是指，当与活体接触时，不引起如长期并且慢性的炎症反应等的显著的有害反应。生物亲和性高分子只要是对活体具有亲和性，则对于在活体内是否被分解并无特别限定，优选可生物降解的高分子。作为不可生物降解的材料，具体而言，可以举出聚四氟乙烯(PTFE)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不锈钢、钛、硅及MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱)等。作为可生物降解的材料，具体而言，可以举出源自天然的肽、重组肽(RCP)或化学合成肽等多肽(例如，以下说明的明胶等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、透明质酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、软骨素、纤维素、琼脂糖、羧甲基纤维素、甲壳素及壳聚糖等。在上述中，尤其优选为重组肽。可以对这些生物亲和性高分子实施提高细胞粘附性的设计。具体而言，能够使用诸如“对于基材表面的细胞粘附基质(纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白)、细胞粘附序列(以氨基酸单字母符号表示的、RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列)肽的涂布”、“基材表面的胺化、阳离子化”或“基于基材表面的等离子体处理、电晕放电的亲水性处理”的方法。
关于包含重组肽或化学合成肽的多肽的种类，只要具有生物亲和性，则并没有特别限定，例如优选为明胶、胶原、弹性蛋白、纤连蛋白、Pronectin、层粘连蛋白、腱生蛋白、纤维蛋白、丝蛋白、巢蛋白、血小板反应蛋白、Retr o Nectin，最优选为明胶、胶原、缺端胶原。
作为本发明中所使用的明胶，优选天然明胶、重组明胶或化学合成明胶，进一步优选为重组明胶。天然明胶是指由源自天然的胶原制成的明胶。衍生明胶的生物并没有特别限定，例如能够使用源自动物(哺乳类、鱼类等)的明胶。
化学合成肽或化学合成明胶是指，人工合成的肽或明胶。明胶等肽的合成可以为固相合成，也可以为液相合成，但优选为固相合成。肽的固相合成对于本领域的技术人员而言是公知的，例如可以举出使用Fmoc基(芴甲氧羰基(F luorenyl-Methoxy-Carbonyl基))作为氨基的保护的Fmoc基合成法、以及使用Boc基(叔丁氧羰基(tert-Butyl Oxy Carbonyl基))作为氨基的保护的Boc基合成法等。另外，化学合成明胶的优选方式中，能够应用在本说明书中后述的重组明胶中记载的内容。
关于重组明胶，在本说明书中进行后述。
生物亲和性高分子的亲水性值“1/IOB”值优选为0至1.0。更优选为0至0.6，进一步优选为0至0.4。IOB是指基于由藤田穆提出的表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲疏水性的指标，其详细内容例如在“Pharmaceu tical Bulletin”,vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,p p.719-725(1957)、“FRAGRANCE JOURNAL”,vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简言之，将所有有机化合物的根源设为甲烷(CH4)，其他化合物全部看作甲烷的衍生物，对其碳原子数、取代基、改性部、环等分别设定一定的数值，将其评分进行加法运算，求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，将该值绘制在以有机性值为X轴、无机性值为Y轴的图上。有机概念图中的IOB是指有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比、即“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容，请参考“新版有机概念图-基础与应用-”(甲田善生等著、SANKYO SHUPPAN Co.,Ltd.、2008)。本说明书中，由取IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲疏水性。是表示“1/IOB”值越小(接近0)越呈亲水性的符号。
在本发明中所使用的生物亲和性高分子为多肽的情况下，由亲水性的平均值(Grand average of hydropathicity)(GRAVY)值表示的亲疏水性指标中，优选为0.3以下且-9.0以上，进一步优选为0.0以下且-7.0以上。Grand ave rage of hydropathicity(GRAVY)值能够利用《Gasteiger E.,Hoogland C.,Gattiker A.,Duvaud S.,WilkinsM.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Prote in Identification and Analysis Tools on theExPASy Server；(In)Jo hn M.Walker(ed)：The Proteomics Protocols Handbook,HumanaPress
(2005).pp.571-607》及《Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,
Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31:3784-3788(2003).》的方法而获得。
(8-2)交联
生物亲和性高分子可以是交联的生物亲和性高分子，也可以是未交联的生物亲和性高分子。作为一般的交联方法，已知有热交联、基于醛类(例如，甲醛、戊二醛等)的交联、基于缩合剂(碳化二亚胺、氰胺等)的交联、酶交联、光交联、紫外线交联、疏水性相互作用、氢键、离子性相互作用等，本发明中也能够使用上述交联方法。作为在本发明中使用的交联方法，进一步优选为热交联、紫外线交联或酶交联，尤其优选为热交联。
当进行基于酶的交联时，作为酶，只要具有高分子材料间的交联作用，则并没有特别限定，能够优选使用谷氨酰胺转氨酶及漆酶、最优选使用谷氨酰胺转氨酶进行交联。作为用谷氨酰胺转氨酶进行酶交联的蛋白质的具体例，只要是具有赖氨酸残基及谷氨酰胺残基的蛋白质，则并没有特别限制。谷氨酰胺转氨酶可以是源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶，也可以是源自微生物的谷氨酰胺转氨酶，具体而言，可以举出AJINOMOTO CO.,INC.制Activa系列、作为试剂而销售的源自哺乳类的谷氨酰胺转氨酶，例如Oriental Yeast Co.,ltd.制造、U pstate USA Inc.制造、Biodesign International制造等的源自豚鼠肝的谷氨酰胺转氨酶、源自山羊的谷氨酰胺转氨酶、源自兔子的谷氨酰胺转氨酶等、以及源自人的凝血因子(Factor XIIIa，Haematologic Technologies,Inc.)等。
进行交联(例如，热交联)时的反应温度，只要能够进行交联，则并没有特别限定，优选为-100℃～500℃，更优选为0℃～300℃，进一步优选为50℃～300℃，进一步优选为100℃～250℃，进一步优选为120℃～200℃。
(8-3)重组明胶
作为本发明中所使用的明胶，优选为重组明胶。
重组明胶是指通过基因重组技术制成的具有与明胶相似的氨基酸序列的多肽或蛋白质样物质。本发明中能够使用的重组明胶优选具有由胶原中特征性的Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种)的重复结构。在此，多个Gly-X-Y可以各自相同，也可以不同。优选在一个分子中含有2个序列以上的细胞粘附信号。作为本发明中所使用的重组明胶，能够使用具有源自胶原的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。例如能够使用EP1014176、美国专利6992172号、国际公开WO2004/085473、国际公开WO2008/103041等中所记载的重组明胶，但并不限定于这些。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的是以下方式的重组明胶。
根据天然明胶原有的性能，重组明胶的生物亲和性优异，且由于不是源自天然，因此无需担心牛海绵状脑症(BSE)等，非感染性优异。并且，与天然明胶相比重组明胶更均匀，且序列已被确定，因此在强度及分解性方面，也能够通过交联等而减少抖动并进行精密设计。
重组明胶的分子量并没有特别限定，优选为2000以上且100000以下(2k Da(道尔顿(KiloDalton))以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95kDa以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选具有由胶原中特征性的Gly-X-Y表示的序列的重复结构。在此，多个Gly-X-Y可以各自相同，也可以不同。在Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y表示任意氨基酸(优选为除了甘氨酸以外的任意氨基酸)。由胶原中特征性的Gly-X-Y表示的序列是指，明胶及胶原的氨基酸组成及序列中的、与其他蛋白质相比非常特殊的部分结构。在该部分中，甘氨酸占整体的约3分之1，成为在氨基酸序列中3个中有1个甘氨酸的重复结构。甘氨酸是最简单的氨基酸，对分子链的配置的约束也少，大大有助于凝胶化时的螺旋结构的再生。由X及Y所表示的氨基酸中含大量亚氨基酸(脯氨酸、羟基脯氨酸)，优选占整体的10％～45％。优选为重组明胶的序列的80％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
在一般的明胶中，带电荷的极性氨基酸与无电荷的极性氨基酸以1:1存在。在此，极性氨基酸具体是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，这些之中极性无电荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有氨基酸中，极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例优选为5％以上且小于20％，更优选为5％以上且小于10％。而且，优选在序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任意一种氨基酸，更优选在序列中不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的2个以上的氨基酸。
已知有一般在多肽中作为细胞粘附信号而发挥作用的最小氨基酸序列(例如，Nagai co.,Ltd.出版发行的“Pathophysiology”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在一个分子中具有两个以上的这些细胞粘附信号。作为具体的序列，从所粘附的细胞种类多的观点考虑，优选由氨基酸单字母符号表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列、及HAV序列等序列。进一步优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质产生量。
作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD间的氨基酸数量在0～100之间且不均匀，更优选RGD间的氨基酸数量在25～60之间且不均匀。
从细胞粘附及增殖性的观点考虑，该最小氨基酸序列的含量在蛋白质的1个分子中优选为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
本发明中所使用的重组明胶中，RGD基序相对于氨基酸总数的比例优选至少为0.4％，在重组明胶含有350个以上的氨基酸的情况下，优选350个氨基酸的各段包含至少一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例更优选至少为0.6％，进一步优选至少为0.8％，更进一步优选至少为1.0％，尤其优选至少为1.2％，最优选至少为1.5％。重组肽中的RGD基序的数量相对于每250个氨基酸优选为至少4个，更优选为6个，进一步优选为8个，尤其优选为12以上且16以下。RGD基序的0.4％这一比例对应于相对于每250个氨基酸至少为一个RGD序列。RGD基序的数量为整数，因此为了满足0.4％的特征，由251个氨基酸组成的明胶必须包含至少两个RGD序列。本发明的重组明胶中，优选相对于每250个氨基酸包含至少两个RGD序列，更优选相对于每250个氨基酸包含至少3个RGD序列，进一步优选相对于每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。作为本发明的重组明胶的另一方式，包含至少4个RGD基序，优选包含6个、更优选包含8个、进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以被部分水解。
优选本发明中所使用的重组明胶由式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸中的任意一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任意一种。m优选为表示2～10的整数，更优选为表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，进一步优选为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任意的氨基酸或氨基酸序列，B表示任意的氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y可以各自相同，也可以不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-G ly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任意一种，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任意一种。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同，也可以不同。)表示。
优选在重复单元上键合多个天然存在的胶原的序列单元。在此所说的天然存在的胶原只要天然存在，则可以是任何胶原，优选为I型、II型、III型、IV型及V型。更优选为I型、II型、或III型胶原。根据另一方式，上述胶原的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠。更优选为人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，能够通过如下方式来实施：如等电点电泳法(Maxey，C.R.(1976)；参考Phitogr.Gelatin 2，Editor Cox，P.J.Academic，London，Engl.)中的记载那样测定将1质量％的明胶溶液通入阳离子及阴离子交换树脂的混合床柱之后的pH。
优选重组明胶不被去胺基化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为由编码氨基酸序列的核酸制备的实质上纯的多肽。
作为本发明中所使用的重组明胶，尤其优选为以下中的任意一种：
(1)由在序列号1中所记载的氨基酸序列组成的肽；
(2)由在序列号1中所记载的氨基酸序列中缺失、取代或附加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成且具有生物亲和性的肽；或
(3)由与在序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列一致性的氨基酸序列组成且具有生物亲和性的肽。
本发明中的序列一致性是指，由以下式计算的值。
％序列一致性＝[(同一残基数)/(比对长度)]×100
两个氨基酸序列中的序列一致性能够通过本领域的技术人员所公知的任意方法来确定，能够使用BLAST((Basic Local Alignment Search Tool))程序(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)等来确定。
“缺失、取代或附加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列”中的“一个或多个”是指，优选为1～20个，更优选为1～10个，进一步优选为1～5个，尤其优选为1～3个。
本发明中所使用的重组明胶能够通过本领域的技术人员所公知的基因重组技术来进行制造，例如能够按照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/085473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来进行制造。具体而言，获得编码规定的重组明胶的氨基酸序列的基因，将该基因导入表达载体以制作重组表达载体，并且将该载体导入适当的宿主中以制作转化体。通过在适当的培养基中培养所得到的转化体来产生重组明胶，因此通过从培养物回收所产生的重组明胶，能够制备本发明中所使用的重组明胶。
(8-4)基于生物亲和性高分子的包覆
将生物亲和性高分子包覆于成型体的方法并没有特别限定，能够使用生物亲和性高分子溶液。在生物亲和性高分子溶液中使用的溶剂只要是能够溶解生物亲和性高分子的溶剂，则并没有特别限定，通常为水、有机溶剂或水与有机溶剂的混合物，优选为水或水与有机溶剂的混合物等水性介质。作为有机溶剂，例如能够举出丙酮、乙醇等。为明胶溶液的情况下，能够优选使用明胶水溶液。
生物亲和性高分子溶液中的生物亲和性高分子的浓度并没有特别限定，通常为1质量％～50质量％，优选为2～40质量％，更优选为3～30质量％。
通过用上述生物亲和性高分子溶液来处理成型体，能够将生物亲和性高分子包覆于成型体。具体而言，通过将成型体浸入生物亲和性高分子溶液中并干燥，能够将生物亲和性高分子包覆于成型体。
＜9＞将细胞接种于生物亲和性高分子的工序
在本发明中，能够在上述在成型体上包覆生物亲和性高分子的工序h之后，进一步设置将细胞接种于生物亲和性高分子的工序i。
本发明中的成型体的用途是指如后述的再生医疗用支架材料或组织修复材料等，设想到将细胞接种于成型体而使用的情况和将细胞不接种于成型体而使用的情况。
所接种的细胞种类并没有特别限定，能够根据使用目的而适当选择。
作为所使用的细胞，优选为动物细胞，更优选为源自脊椎动物的细胞，尤其优选为源自人的细胞。源自脊椎动物的细胞(尤其，源自人的细胞)的种类可以是多能细胞、体干细胞、前体细胞或成熟细胞中的任意一种。作为多能细胞，例如能够使用胚胎干(ES)细胞、生殖干(GS)细胞或人工多能干细胞(iPS)细胞。作为体干细胞，例如能够使用间充质干细胞(MSC)、造血干细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、源自骨髓的细胞、心肌干细胞、源自脂肪的干细胞或神经干细胞。作为前体细胞及成熟细胞，例如能够使用源自皮肤、真皮、表皮、肌肉、心肌、神经、骨、软骨、内皮、脑、上皮、心脏、肾、肝、胰、脾、口腔内、角膜、骨髓、脐带血、羊膜或来自毛发的细胞。作为源自人的细胞，例如能够使用ES细胞、iPS细胞、MSC、软骨细胞、成骨细胞、成骨前体细胞、间充质细胞、成肌细胞、心肌细胞、心脏成肌细胞、神经细胞、肝细胞、β细胞、成纤维细胞、角膜内皮细胞、血管内皮细胞、角膜上皮细胞、羊膜细胞、脐带血细胞、源自骨髓的细胞或造血干细胞。并且，细胞的来源可以是自体细胞或异体细胞中的任一种。
＜10＞通过本发明的方法制造的磷酸钙成型体的用途
通过基于本发明的磷酸钙成型体的制造方法来制造的磷酸钙成型体的用途并没有特别限定，优选为再生医疗用支架材料或组织修复材料。关于磷酸钙成型体的用途将在本说明书中进行后述。
[2]磷酸钙成型体
本发明还提供一种通过上述[1]中所记载的基于本发明的磷酸钙成型体的制造方法来制造的磷酸钙成型体。
本发明的磷酸钙成型体具有高强度，并且能够迅速且以高造型精度制造。
本发明还提供一种磷酸钙成型体，其由磷酸钙形成，所述磷酸钙成型体具有与外部空间连通的孔，
比重为0.7g/mL以上和/或基于汞注入法的孔隙率为75％以下，吸水渗透速度为0.05mm/秒以上。
磷酸钙成型体的比重为0.7g/mL以上，优选为0.75g/mL以上，更优选为0.85g/mL以上。
基于磷酸钙成型体的汞注入法的孔隙率为75％以下，更优选为70％以下，进一步优选为67％以下，尤其优选为65％以下。
压汞法是利用汞的表面张力大而向粉末的细孔施加压力以使汞浸入，并根据压力及所压入的汞量来求出比表面积和细孔分布的方法，孔隙率能够通过使用POREMASTER60GT(Quantachrome Corporation制造)等装置来进行测定。
磷酸钙成型体的吸水渗透速度为0.05mm/秒以上，优选为0.10mm/秒以上，更优选为0.30mm/秒以上，更进一步优选为0.50mm/秒以上，进一步优选为0.70mm/秒以上，进一步更优选为0.80mm/秒以上，尤其优选为0.90mm/秒以上。
磷酸钙成型体的吸水渗透速度只要在X方向(描绘方向)、Y方向(重涂扫描方向)及Z方向(层叠方向)中的至少一个方向上，满足上述吸水渗透速度即可，但优选为上述中的任意两个方向上满足上述吸水渗透速度，更优选为在上述所有方向(3个方向)上满足上述吸水渗透速度。
本发明中的吸水渗透速度是指，在以下条件下测定的值。测定时的实验室温度为20～25℃、湿度保持在25～40％，并构建如下实验系统：将内径为2mm的塑料筒的一端连接于直径为8mm且高度为20mm的磷酸钙成型体，将上述塑料筒的另一端连接于长度为100mm的管的一端，将上述管的另一端连接于10mL的注射器。在将磷酸钙成型体与塑料筒的接触高度和注射器内的墨液水位的高度调整为从开始吸水渗透到结束为止相同的条件下，将注射器内的墨液吸水渗透到磷酸钙成型体中。当墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内成为15mm时，将15mm除以渗透所需要的时间而得的值作为吸水渗透速度。在墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内达不到15mm的情况下，用规尺测定在5分钟的时间点墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度，并除以渗透所需要的时间而得的值作为吸水渗透速度。
在上述磷酸钙成型体中的磷酸钙中，Ca/P的原子数比优选为1.4～1.8，更优选为1.45～1.79，进一步优选为1.50～1.70。
本发明的磷酸钙成型体优选具有相对致密的层和相对稀疏的层交替层叠而成的结构。相对致密的层和相对稀疏的层是指，能够通过基于纳米焦点X射线CT或微焦点X射线CT的测定而判别为相对致密的层和相对稀疏的层的层。相对致密的层是指，比相对稀疏的层致密，相对稀疏的层是指，比相对致密的层稀疏。
如后述实施例中的记载，在进行磷酸钙成型体的CT测定之后，通过使用软件，将观察白色、灰色及黑色的视角调整为可观察到磷酸钙成型体的内部结构的模样，进而能够视觉辨认相对致密的层及相对稀疏的层。调整磷酸Ca的取向，以使可观察到白色和黑色的条纹模样，并将与白色和黑色条纹模样正交的方向设为Z轴、与Z轴正交的方向设为XY平面(将X轴和Y轴也设为正交的方向)。在包括Z轴的、ZX平面或者YZ平面中，选择在Z轴方向上0.5mm至5.0mm的范围、在X轴方向上0.5mm至5.0mm的范围的区域。能够使用软件将选择区域的Z轴方向的距离作为横轴、将选择区域的黑色和白色的程度作为纵轴而进行波形化。根据所获得的波形，能够分析层数及相对致密的层与相对稀疏的层的间距。
在本发明中，优选至少5层以上(更优选为至少7层以上，进一步优选为至少10层以上)的相对致密的层和至少5层以上(更优选为至少7层以上、进一步优选为至少10层以上)的相对稀疏的层交替层叠。
第1相对致密的层与相邻于上述第1相对致密的层的第2相对致密的层的间距优选为50～300μm，更优选为60～200μm，进一步优选为70～150μm。
通过相对致密的层的存在，能够形成外形及内部结构，且被细胞吸收，并且被取代，因此能够保持整体形状。通过相对稀疏的层的存在，细胞能够更快、更广范围、并且更多地浸润。从而，通过具有相对致密的层和相对稀疏的层交替层叠而成的结构，具有细胞浸润变得比不具有相对致密的层和相对稀疏的层交替层叠而成的结构的磷酸钙成型体更容易、组织再生快的优点。
本发明的磷酸钙成型体的内部结构中优选存在约800μm的连通孔(大：也称为第1连通孔)、约20～约80μm的连通孔(中：也称为第2连通孔)、约1～10μm的连通孔(小：也称为第3连通孔)。将具有上述3阶段的连通孔的磷酸钙成型体的示意图示于图30，将SEM像示于图31。第1连通孔是通过3D打印机的设计而形成，第2连通孔是通过使粉末的凝聚残留，并且提高流动性而形成，第3连通孔是通过粉末的间隙而形成。第2连通孔与相对致密的层和相对稀疏的层有关。
关于本发明的磷酸钙成型体，优选在根据磷酸钙成型体的纳米焦点X射线CT图像而将成型体的一个方向上的距离表示于横轴且将相对CT强度表示于纵轴的波形图中，交替地具有山的峰和谷的峰。
优选为具有至少5个以上(更优选为至少7个以上，进一步优选为至少10个以上)的山的峰。
第1山的峰与相邻于上述第1山的峰的第2山的峰的间距优选为50～300μm，更优选为60～200μm，进一步优选为70～150μm。
本发明的磷酸钙成型体的用途并没有特别限定，例如能够用作再生医疗用支架材料、再生医疗等产品(在体外组织培养的产品)或组织修复材料，优选能够用作再生医疗用支架材料或组织修复材料。
本发明中的组织修复材料是指，通过植入活体内，而有助于该被植入的部位中的组织的形成的材料，可以包含细胞，也可以不包含细胞。并且，本发明的磷酸钙成型体可以包含如生长因子、药剂那样的促进生物体的反应的成分，也可以不包含这些成分。进而，本发明的磷酸钙成型体可以与羟基磷灰石等无机材料进行混合而使用，也可以作为与上述无机材料的复合材料而使用。本发明中的组织修复材料是指，不仅包含有助于植入部位中通常存在的正常组织的形成的材料，而且也包含促进包括瘢痕组织等非正常组织的形成的材料。
作为组织修复材料的具体例，并没有特别限定，能够举出软骨、半月板、皮肤或骨的修复材料。即，本发明的磷酸钙成型体能够作为用于软骨、半月板、皮肤或骨的再生的治疗剂而使用。只要需要进行上述再生，则并不限定疾病，作为一个例子，关于伴随软骨缺陷的疾病，能够举出变形性关节炎、骨软骨缺损、透皮骨软骨炎、外伤性软骨损伤、骨关节炎、复发性多软骨炎、软骨发育不良、椎间盘损伤、椎间盘突出等。
本发明的磷酸钙成型体还能够通过与移植细胞和骨诱导药剂组合使用而用作骨再生治疗剂。作为骨诱导药剂，例如可以举出BMP(骨形成因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，但并没有特别限定。
从本发明的磷酸钙成型体能够作为组织修复材料而使用的观点考虑，组织的修复方法、伴随组织的损伤的疾病等的治疗方法也包含于本发明中。本发明中的组织的修复方法中包括在对象组织的缺陷或损伤的部位应用作为磷酸钙成型体的组织修复材料，根据需要也可以包括其他工序。作为其他工序，例如可以举出在应用组织修复材料的前后或同时将移植细胞和/或骨诱导剂应用于应用组织修复材料的部位。
作为将磷酸钙成型体应用于对象组织的缺陷或损伤部位的方法，能够使用切开、注射、关节镜、内窥镜等。
本发明的磷酸钙成型体优选具有与外部空间连通的孔(第1孔)。在将具有上述孔的磷酸钙成型体移植到活体的情况下，细胞变得容易进入磷酸钙成型体的内部。与外部空间连通的孔更优选贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通。与外部空间连通的孔的平均直径并没有特别限定，优选为200μm～2000μm。
与外部空间连通的孔(第1孔)表示从成型体的一处表面形成至成型体的内部空间的孔。即，孔的内部空间与外部空间连通。“与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通”表示从成型体的某处的表面至成型体的内部空间形成孔，而且通过成型体的另一处的表面与外部空间连通。
例如，作为用于在移植前注入细胞的孔，成型体优选具有平均直径比该第1孔大的第2孔。
从第2孔注入的细胞等通过第1孔而浸润整个成型体。
第1孔及第2孔的形状可以是圆形、正方形、矩形、六边形、八边形、十字形、椭圆形中的任一种。
成型体为立方体或长方体的情况下，如图1所示，第1孔能够根据各方向而分别设置X连通孔、Y连通孔、Z连通孔。各连通孔可以相互交叉，也可以不相互交叉。各连通孔的平均直径优选在200μm～2000μm的范围，从细胞容易浸润的观点考虑，更优选为200μm～1200μm。例如，能够通过KEYENCE CO RPORATION制造的VHX-D510来测定平均直径。直径是指，在孔贯穿而位于成型体的外表面上时的在孔的外周上取某两点时，两点之间的距离成为最大的两点之间的距离，若孔的形状为圆形则表示直径，若为四边形则表示对角线中的长的对角线。并且其平均直径是指，当孔的数量为1～4个时，设为各自的直径的合除以孔的数量而得的值，当为5个以上时，设为4个直径的合除以4而得的值。
优选与外部空间连通的第1孔的数量多于平均直径比第1孔大的第2孔的数量。
只要成型体被成型，则可以为立方体或长方体、圆柱体、三角柱、圆锥等形状。
并且，关于成型体，例如优选将不具有孔的结构体的外缘部厚度设为1.3m m以上(图2的结构强化区域)，以使在移植后可承受体内的变形应力。具有各种外观形状或第1孔及第2孔的复杂的成型体的形状通过计算机上的各种三维CAD软件而构建，并且可以制作成固有的定制产品，也可以制作成形和形状确定的标准产品。
[3]移植用材料
本发明提供一种包含表面的一部分或整个表面被重组明胶涂布的磷酸钙成型体的移植用材料。
磷酸钙成型体并没有特别限定，优选能够使用本说明书中的上述方式的磷酸钙成型体。移植用材料中所使用的磷酸钙的Ca/P的原子数比优选为1.4～1.8，更优选为1.45～1.79，进一步优选为1.50～1.70。
重组明胶的详细内容如本说明书中的上述内容。优选重组明胶被热交联或化学交联。
被重组明胶涂布的磷酸钙成型体的表面优选存在于移植用材料的表面及内部。
被重组明胶涂布的磷酸钙成型体的表面存在于移植用材料的表面是指，移植用材料的表面被重组明胶涂布。
被重组明胶涂布的磷酸钙成型体的表面存在于移植用材料的内部是指，移植用材料即磷酸钙成型体为多孔质，并且形成存在于磷酸钙成型体的内部的孔的表面被重组明胶涂布。
磷酸钙成型体优选为块状或颗粒状。
块状不限于仅由平面构成的立体形状，而且包括具有曲面的曲面立体形状。作为块状的一个例子，能够举出具有纵2.0～100.0mm、横2.0～100.0mm及高度2.0～100.0mm的长方体形状。
颗粒状是指，粒径为约0.5～2.0mm左右的粒子集合。
根据以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但本发明并不受实施例的限定。
实施例
实施例1：
(1)磷酸钙粉末的制作方法
作为磷酸钙粉末的原料，使用了Ca4(PO4)2O(磷酸四钙：TTCP)和CaHPO4·2H2O(磷酸氢钙二水合物：DCPD)。TTCP的Ca/P的原子数比为2.0，DCPD的Ca/P的原子数比为1.0。通过改变TTCP与DCPD的混合比率而制作了整体的Ca/P的原子数比不同的混合粉末。将TTCP与DCPD的混合比率(摩尔比)及此时的混合粉末的Ca/P的原子数比示于表1。
[表1]
TTCP DCPD Ca/P的原子数比
1.0 0.0 2.00
0.9 0.1 1.95
0.8 0.2 1.89
0.7 0.3 1.82
0.65 0.35 1.79
0.5 0.5 1.67
0.33 0.67 1.50
0.25 0.75 1.40
0.2 0.8 1.33
0.1 0.9 1.18
0.0 1.0 1.00
(2)有机酸溶液的制作方法
通过调整有机酸与有机酸的钠盐的混合比，制作了所包含的有机酸离子的量恒定且pH不同的溶液。具体而言，例如，在柠檬酸的情况下，通过混合1mo l/L的柠檬酸溶液和1mol/L的柠檬酸三钠溶液来制作了所希望的pH的溶液。
(3)评价方法
将上述(2)中制作的有机酸溶液通过喷出而滴加到上述(1)中制作的磷酸钙粉末中。将粉末及有机酸溶液导入到Z-Printer310Plus(3D Systems Co rporation(旧ZCorporation))，制作了在20×20×5mm的长方体上沿薄方向开设有5处2×2mm的孔的样品。将供给于粉末的单位体积的有机酸溶液的体积的比率设为42％、磷酸钙粉末的层叠间距设为100μm。在基于Z-Printe r310Plus的成型体的制作中，通过反复进行在基板上形成含有磷酸钙粉末的层的工序、及从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸溶液并滴加于含有磷酸钙粉末的层而制造磷酸钙成型体的工序，从而制作上述成型体。
关于磷酸钙粉末及有机酸溶液的种类，如表2及表3所示。将滴加了有机酸溶液的磷酸钙粉末在约40℃下进行保温并放置30分钟之后，通过压缩空气去除了不需要部分的磷酸钙粉末(未经有机酸溶液成型的磷酸钙粉末)。以如下基准对不需要部分的磷酸钙粉末的去除进行了评价，并对磷酸钙粉末的强度进行了评价。评价A表示磷酸钙成型体具有充分的强度。
评价A：能够顺利地去除了不需要部分的情况
评价B：滴加了有机酸溶液的磷酸钙粉末中存在部分损坏的情况
评价C：滴加了有机酸溶液的磷酸钙粉末崩解的情况
(4)评价结果
将pH不同的柠檬酸溶液滴加于改变了Ca/P的原子数比的磷酸钙粉末时的评价的结果示于表2。
[表2]
将各种有机酸的pH为3的溶液滴加于Ca/P的原子数比为1.67的磷酸钙粉末时的评价结果示于表3。对于溶解度比苹果酸(钙盐相对于水的溶解度为0.92g/100g)小的酸(柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸)的评价为A，相对于此，对于琥珀酸(溶解度为1.27)的评价为B，对于溶解度更高的乳酸、醋酸及葡萄糖酸的评价为C。
[表3]
[关于精度和固化速度的评价]
实际制作具有2mm见方的孔的3D(三维)模型数据，测定了模型的孔的大小。实际测量值始终小于设计值，认为通过有机酸溶液的渗出而导致设计时未设想的部分也固化。并且，认为固化速度越快则渗出越少。因此，以(实际测量值)/(设计值)×100作为指标，进行了将75％以上设为A、50％以上且小于75％设为B、25％以上且小于50％设为C、无法测定的情况设为D的评价。该指标越接近100％，则表示越能够再现设计值。
其结果，钙盐相对于水的溶解度(g/100mL)为1.0以下的酸、葡萄糖酸由于样品崩解而无法测定，判定为D。
根据上述结果，示出通过喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并滴加于Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末中，能够达到良好的评价结果。
＜磷酸钙成型体的制造方法＞
作为墨液，以柠檬酸1.0mol/L:柠檬酸三钠二水合物1.0mol/L＝3:1的体积比进行混合，制备了将pH调整为3.15的柠檬酸钠水溶液。将该所制备的柠檬酸钠水溶液称为柠檬酸Na墨液。
作为粉末，当将从微细侧累积10％时的粒径(μm)表示为d10、将从微细侧累积25％时的粒径(μm)表示为d25、将从微细侧累积50％时的粒径(μm)表示为d50、将从微细侧累积75％时的粒径(μm)表示为d75、将从微细侧累积90％时的粒径(μm)表示为d90时，TTCP成为相当于中值粒径的d50＝7.4μm、DCPD成为d50＝19.5μm。将以最终的Ca/P的原子数比成为1.5的方式混合而成的、更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量混合而成的该混合物作为磷酸Ca粉末。
所混合的磷酸钙粉末的d50＝17.0μm，以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，且包含32％的粒径为25～100μm的粒子。作为激光衍射型粒度分布测定的装置使用SEISHIN ENTERPRISE Co.,Ltd.制造的LMS-2000e，分散介质使用乙醇而进行了测定。
使用3D打印机(Zprinter310plus)，将墨液和粉末替换为柠檬酸Na墨液、磷酸Ca粉末，将层叠厚度设为100μm，并设计成如图3所示。此时的尺寸设为X＝21.5mm，Y＝17mm，Z＝21mm。并且，设置4个直径为2mm的圆形的贯穿一侧的第2孔，且将未贯穿末端设在距外表面9mm处。关于第1孔，将正方形的平均直径为900μm的孔设计成与X、Y、Z方向正交，并分别作为第1孔的X连通孔、Y连通孔、Z连通孔，X连通孔设置了64个、Y连通孔设置了51个，Z连通孔设置了51个。并且，为了缝合固定成型体而设计了缝合孔。在通过3D打印机成型之后，在35℃的3D打印机内干燥1小时，并用压缩空气(从气枪喷出调整成0.15MPa的压缩空气的吹气流)去除了多余的粉末。使该成型体在马弗炉中以每1小时升温100℃之后，在1100℃下烧结2小时，关闭(off)用于烧结的加热，在不打开马弗炉的盖的状态下静置8小时。马弗炉成为100℃以下的温度之后，取出完成烧结的成型体，获得了成型体(图4)。
＜评价＞
为了评价对整个成型体区域的渗透性，使用向PBS+(本发明中使用了SIG MA-ALDORICH Co.,Ltd.制造的D8662。PBS是指磷酸缓冲生理盐水，是在生物化学等实验中所使用的缓冲液。由活体内普遍存在的离子构成，作为组成pH为7.4，含有NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。PBS+为在PBS中还含有钙及镁的缓冲液)加入1.0质量％染料墨液(PILOTCORPORATION制造的钢笔用Blue_Black、INK-30-BB)而成的10mL混合液，并对没有孔的成型体、仅具有第2孔的成型体、具有第1孔和第2孔的成型体的渗透性进行了调查。
以如下方式测定了渗透性。将加入有染料的10mL的PBS+溶液放入直径为55mm的塑料容器中，深度设为约3mm。将成型体浸渍于其中，并在刚浸渍后的几秒钟内，进行了成型体的整个区域是否被着色的测定。其结果，在没有孔的成型体中，即使渗透于整个成型体区域所需的时间经过1小时以上，上表面的一半以上也未被着色。仅具有第2孔的成型体中为10分钟，在具有第1孔及第2孔的成型体中，在5秒钟以内观察到整个成型体区域的着色。该结果表示，在具有第1孔及第2孔的成型体中，成型体的渗透性明显高。
实施例2：通过浸渍而硬化成型体的工序
将在实施例1的(1)中制作的Ca/P的原子数比为1.67的磷酸钙粉末导入到Z-Printer310Plus(3D Systems Corporation(旧Z Corporation))，使用pH为3的柠檬酸溶液，制作了5×5×12mm的成型体。将供给于粉末单位体积的有机酸溶液体积的比率设为42％，将磷酸钙粉末的层叠间距设为100μm。在基于Z-Printer310Plus的成型体的制作中，通过反复进行在基板上形成含有磷酸钙粉末的层的工序、及从喷嘴部以液滴状态喷出柠檬酸溶液，并滴加于含有磷酸钙粉末的层中以制造磷酸钙成型体的工序，从而制作5×5×12mm的成型体。
将上述制作的成型体浸渍到以下溶液A、溶液B或溶液C中的任意一种中12小时，并测定了浸渍前后的压缩强度。
溶液A：0.5mol/L磷酸二氢钠溶液(pH4.3)
溶液B：0.5mol/L磷酸氢二钠溶液(pH9)
溶液C：溶液A和溶液B的1:1混合溶液(pH6.6)
使用TA INSTRUMENTS CO.,LTD.的Electroforce5500进行了压缩强度的测定。在5×5×12mm样品的长边方向上，以0.17mm/秒的速度施加荷载，并通过样品断裂时的最大荷载(N)除以截面积来求出了压缩强度(MPa)。
浸渍前为2.2MPa的压缩强度当浸渍于溶液A时成为4.2MPa，浸渍于溶液B时成为3.5MPa，浸渍于溶液C时成为3.9MPa。确认到将成型体浸渍于溶液中，从而成型体的固化进行且强度增加。
实施例3：基于加热的成型体固化工序
使用马弗炉在1100℃或1200℃下将以与实施例2相同的方法制作的磷酸钙成型体加热了4小时。以与实施例2相同的方式测定了加热前后的压缩强度。加热前为2.2MPa的压缩强度在1100℃下加热的情况下成为3.5MPa，在1200℃下加热的情况下成为6.1MPa。确认到通过成型体的加热而强度增加。并且，也能够通过热分解而去除造型中使用的有机酸。
实施例4：细胞粘附性中的RCP修饰效果确认
(操作1)在37℃下，将作为β-TCP粒子的骨修复材料奥斯泛朗(OSferion)(OlympusTerumo Biomaterials Corp.制造)边振荡边浸渍于7.5％(由序列号1的氨基酸序列组成的RCP)溶液中3小时。然后，在50℃下干燥了12小时。进而在160℃下，实施20小时的热交联处理而获得了制剂。
(操作2)将制作的制剂以成为10mg/孔的方式放入24孔超低粘附板(Co rningIncorporatedCo.,Ltd.制造)中，并将细胞(NIH-3T3)以成为50000细胞/孔(cells/well)的方式进行了接种。
(操作3)在接种后，24小时内进行钙黄绿素染色后，用荧光观察及扫描型电子显微镜(Scanning Electron Microscope；SEM)进行了观察。
比较例4：
在实施例4中不实施操作1，除此以外，将实施了与实施例4相同的操作的例子作为比较例4。
将实施例4及比较例4的结果示于图5。与比较例4相比，在实施例4中确认到细胞粘附性的提高(图5)。
实施例5：大鼠顶骨缺损部中的基于骨再生诱导试验的RCP修饰效果确认
作为实验动物，使用SD大鼠(雄性、10-12周龄、0.3-0.5kg)，露出大鼠的顶骨，制作了直径为5mm的圆形骨缺陷部。将约10mg的实施例4的制剂填充于所制作的骨缺陷部之后，缝合了皮肤。
植入后的第8周，放血致死并取出了头部。通过HE染色对包含埋入部的顶骨进行了组织学观察。
比较例5：
在实施例5中使用比较例4的制剂来代替实施例4的制剂，除此以外，将实施了相同操作的例子作为比较例5。
将实施例5及比较例5的结果示于图6。与比较例5相比，在实施例5中确认到骨形成的提高(图6)。
实施例6：磷酸钙成型体的孔隙率、比重及吸水渗透速度
如以下方式制作了磷酸钙成型体。
＜磷酸钙成型体的制造方法＞
作为墨液，以柠檬酸1.2mol/L:柠檬酸三钠二水合物1.2mol/L＝3:1的体积比混合，制备了调整为pH3.15的柠檬酸钠水溶液。将该所制备的柠檬酸钠水溶液称为柠檬酸Na墨液。
作为粉末，当将从微细侧累积10％时的粒径(μm)表示为d10、将从微细侧累积25％时的粒径(μm)表示为d25、将从微细侧累积50％时的粒径(μm)表示为d50、将从微细侧累积75％时的粒径(μm)表示为d75、将从微细侧累积90％时的粒径(μm)表示为d90时，准备相当于中值粒径的d50＝7.4μm的TTCP、d50＝19.5μm的DCPD粉末，并以最终的Ca/P的原子数比成为1.5的方式进行了混合。更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量进行了混合。将该混合物作为磷酸Ca粉末。
所混合的磷酸Ca粉末以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，且包含32％的粒径为25～100μm的粒子。作为激光衍射型粒度分布测定的装置，用SEISHINENTERPRISE Co.,Ltd.制造的LMS-2000e，分散介质用乙醇进行了测定。
使用3D打印机(Zprinter310plus)，且将墨液及粉末替换为柠檬酸Na墨液、磷酸Ca粉末，将层叠厚度设为100μm。
·结构物为圆柱形，考虑到烧结时收缩10％，造型为直径Φ为8.8mm、高度为22mm。
在用3D打印机成型之后，在35℃的3D打印机内干燥1小时，并用压缩空气(从气枪喷出调整成0.15MPa的压缩空气的吹气流)去除了多余的粉末。使该成型体在马弗炉中以每1小时升温100℃之后，在1100℃下烧结2小时，关闭(off)用于烧结的加热，在不打开马弗炉的盖的状态下静置8小时以上。马弗炉成为100℃以下的温度之后，取出完成烧结的成型体，获得了直径Φ为8mm、高度为20mm的圆柱形成型体。
对于在上述制作的磷酸钙成型体、以及市售品(下述3种)，通过以下方法测定了孔隙率、比重及吸水渗透速度。
SUPERPORE(PENTAX CORPORATION制造)商品号KB-6-1、直径8×长度20mm
SUPERPORE(PENTAX CORPORATION制造)商品号HB-50-0820、直径8×长度20mm
SUPERPORE EX(PENTAX CORPORATION制造)商品号XC-0820、直径8×L20mm
上述3种SUPERPORE是由β型磷酸三钙构成的白色多孔体。
＜孔隙率的测定法＞
通过压汞法测定了孔隙率。压汞法是利用汞的表面张力大而向粉末的细孔施加压力以使汞浸入，并根据压力及所压入的汞量来求出比表面积和细孔分布的方法。使用POREMASTER 60GT(Quantachrome Corporation制造)进行了测定。在以下标准条件下进行了测定。
Hg表面张力(Surface Tension)480.00erg/cm2
Hg接触角(Contact Angle)(I)141.30°、(E)141.30°
温度20.00[℃]
样品尺寸的直径为0.462mm、高度为0.959mm的圆柱形。
＜比重的测定＞
用能够测定到1/1000g为止的电子天平测定在上述制作的磷酸钙成型体的重量，并且用能够测定到1/100mm为止的游标卡尺测定了直径和高度，并求出了体积。接着，通过重量除以体积而求出了比重。
＜吸水渗透速度的测定法＞
构建了求出吸水渗透速度的实验系统。
将实验室的温度设为23℃、湿度设为30％并进行了实验测定。作为钢笔墨液，使用了PILOT CORPORATION制造的INK-30-BB。
通过内径为2mm的塑料筒、管及注射器构建了图7所示的实验系统。在结构物的底面制作弯月(meniscus)面并从这里渗透。通过目视、手动调整了弯月面高度。磷酸钙成型体21设为直径8mm×20mm高度。塑料筒22的内径为2mm。管23的长度为100mm。关于水位24，从开始吸水渗透至结束为止调整为塑料筒22与磷酸钙成型体21的接触高度。注射器25使用了10mL的注射器。使内径大于磷酸钙成型体21的内径。
在图7所示的实验系统中，如上所述，在将磷酸钙成型体与塑料筒的接触高度和注射器内的墨液水位的高度调整为从开始吸水渗透到结束为止相同的条件下，将注射器内的墨液吸水渗透到磷酸钙成型体中。当墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内成为15mm时，将15mm除以渗透所需要的时间而得的值作为吸水渗透速度，在墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内达不到15mm的情况下，用规尺测定在5分钟的时间点墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度，并除以渗透所需要的时间即5分钟而得的值作为吸水渗透速度。
将孔隙率、比重及吸水渗透速度的测定结果示于下表。
[表4]
实施例7：磷酸钙成型体的疏密层叠结构
＜磷酸钙成型体的制造方法＞
作为墨液，以柠檬酸1.2mol/L:柠檬酸三钠二水合物1.2mol/L＝3:1的体积比进行混合，制备了将pH调整为3.15的柠檬酸钠水溶液。将该所制备的柠檬酸钠水溶液称为柠檬酸Na墨液。
作为粉末，准备中值粒径(以下标记为d50)为7.4μm的TTCP、d50＝19.5μm的DCPD粉末，以最终的Ca/P的原子数比成为1.5的方式进行了混合。
更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量进行了混合。将该混合物作为磷酸Ca粉末。所混合的磷酸Ca粉末以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，且包含32％的粒径为25～100μm的粒子。
使用3D打印机(Zprinter310plus)，将墨液和粉末替换为柠檬酸Na墨液、磷酸Ca粉末，将层叠厚度设为100μm。
结构物是将3个圆盘堆叠而成的结构，是最大的圆盘直径为14.4mm、总高度为7.8mm的圆盘状。
在用3D打印机成型之后，在35℃的3D打印机内干燥1小时，并用压缩空气(从气枪喷出调整成0.15MPa的压缩空气的吹气流)去除了多余的粉末。使该成型体在马弗炉中以每1小时升温100℃之后，在1100℃下烧结2小时，关闭(off)用于烧结的加热，在不打开马弗炉的盖的状态下静置8小时以上。马弗炉成为100℃以下的温度之后，取出完成烧结的成型体，获得了成型体。
＜纳米焦点X射线CT解析＞
将疏密层叠结构的解析中使用的对象物的结构示于图8。
利用General Electric Company制造的pHoenix nanotom m并在以下测定条件下进行了观察和解析。
管电压：120kV
管电流：90μA
X射线源至检测器的距离(FDD)：600mm
X射线源至对象样品的旋转中心的距离(FOD)：400mm
分辨率：X轴、Y轴、Z轴均为6.66μm
在如上述条件下进行测定后，通过与装置配合的能够解析CT图像的软件VGStudioMax 3.0.3 64bit而将观察白色、灰色及黑色的视角调整为可观察到磷酸钙成型体的内部结构的模样，进而能够视觉辨认致密层(相对致密的层)及稀疏层(相对稀疏的层)(图9)。
调整观察白色，灰色，黑色的视角的是图9的右下方的渲染功能的画面。表示得越白则表示物质的密度相对高，变得越黑则表示物质的密度相对低，本发明中越白则磷酸钙越多，越黑则磷酸钙越少而接近空隙。
将几何上彼此正交的XY平面、YZ平面、ZX平面作为图9的XY平面的图、YZ平面的图、ZX平面的图而显示于VGStudio Max 3.0.3 64位(bit)画面内的区域中。
通过渲染功能的画面进行调整，以使在画面内的YZ平面的图、XZ平面的图中能够观察到黑色和白色条纹模样。
进一步调整VGStudio Max 3.0.3 64位(bit)中的磷酸钙成型体的取向，以使YZ平面的图及XZ平面的图的黑色和白色的条纹模样朝向相同方向，进而以使白色条纹与白色条纹的间隔尽量一致。通过该操作，磷酸钙成型体的疏密层叠结构的稀疏层和致密层成为与XY平面平行。
如图9，调整磷酸钙成型体的取向，将与黑色和白色的条纹模样正交的方向作为磷酸钙成型体的Z轴。
将包含Z轴的ZX平面的图以TIFF形式保存在计算机上，通过在生物成像领域中实质上标准的图像解析的ImageJ 1.50i(ImageJ是美国国立卫生研究院(NIH)开发的开放源代码(open source)且为公共领域(Public domain)的图像处理软件)来打开TIFF图像数据。
通过ImageJ 1.50i选择在Z轴方向上3.14mm、在X轴方向上3.14mm的区域(图10)。ZX平面的图像呈交替，以便在Z方向上横穿致密层和稀疏层，在X方向上致密层大致线性延伸并且稀疏层也大致线性延伸。
在选择Z轴方向的区域时，在Z轴方向上优选0.5mm至5.0mm的距离范围，更优选2.0mm至4.0mm的距离。
由于不受磷酸钙成型体的局部性的影响，因此优选选择2.0mm以上的更广的区域，但在磷酸钙成型体小的情况下无法实施，因此进行适当调整。若过大，则后续操作变得困难，因此将5.0mm作为上限，更优选为4.0mm为止。
通过ImageJ 1.50i的绘制轮廓功能而能够将选择区域的Z轴方向距离作为横轴、将选择区域的黑色和白色的程度设为灰度值(Gray Value)作为纵轴进行波形化(图11)。
所表示的灰度值是根据Z轴的距离而对X轴的3.14mm内的各像素的灰度值进行平均而获得的值。本说明书中，在3.14mm之间成为153像素。
当选择X轴方向的区域时，在X轴方向上优选0.5mm至5.0mm的距离范围，更优选2.0mm至4.0mm的距离。
由于可避免来自磷酸钙成型体的局部性的影响及受像素的分辨率的影响，因此优选选择2.0mm以上的更广的区域，但在磷酸钙成型体小的情况下无法实施，因此进行适当调整。若过大，则会产生磷酸钙成型体的稀疏层和致密层的取向与在VGStudio Max 3.0.3 64位(bit)内构建的X轴、Y轴、Z轴取向的一致性的影响，因此将5.0mm作为上限，更优选设为4.0mm为止。
根据所获得的波形，对层数及相对致密的层与相对稀疏的层的间距进行分析。
计数致密层的顶点数量。致密层的顶点是指，物质密度相对高于其周边且波形的斜率系数从正传为负的位置。稀疏层的顶点是指，与其周边相比物质密度相对变小且波形的斜率系数从负转为正的位置。
在本发明的情况下，在Z轴的选择距离为3.14mm且通过绘制轮廓功能而形成的波形曲线中的3.0mm间存在34个致密层的顶点。
(致密层的顶点数量/Z轴的距离)＝磷酸钙成型体的疏密层叠结构的ZX平面的间距。本说明书中为3.0mm/34个且间距为88.2μm(图11)。
根据YZ平面的图(图12)并通过与XZ平面的图进行相同的处理，也导出了磷酸钙成型体的疏密层叠结构的YZ平面的间距(图12)。
(致密层的顶点数量/Z轴的距离)＝磷酸钙成型体的疏密层叠结构的YZ平面的间距。本说明书中为3.0mm/32个且间距为93.8μm(图13)。
将磷酸钙成型体的疏密层叠结构的ZX平面的间距与磷酸钙成型体的疏密层叠结构的YZ平面的间距的平均值作为磷酸钙成型体的疏密层叠结构的间距。在本说明书中，h(88.2μm+93.8μm)/2＝90.3μm成为磷酸钙成型体的疏密层叠结构的间距。
认为磷酸钙成型体的吸水渗透速度快与疏密层叠结构有关。在测定X方向与Y方向的吸水渗透速度时，即使通过目视或放大镜观察磷酸钙成型体的外观也能够确认到通过与XY平面平行的稀疏层而渗透的情况。并且，在测定Z方向的吸水渗透速度时也可知，在与Z方向正交的稀疏层和致密层中，在稀疏层中速度快而在致密层中速度慢，并且在Z方向上逐层渗透的情况。
认为是由于稀疏层的空隙遍及几mm至几十mm呈简单且线性的平面连接，而不是呈弯曲的三维连接，并且从磷酸钙成型体的一个表面至另一个对置的另一表面向两侧空出，因此所渗透的墨液在不受空气阻力的情况下渗透。
实施例8：磷酸钙粉末的激光衍射型粒度分布测定
作为磷酸钙粉末，使用Ca4(PO4)2O(磷酸四钙：TTCP)、CaHPO4·2H2O(磷酸氢钙二水合物：DCPD)及TTCP与DCPD的混合粉末(Ca/P的原子数比为1.5)，并通过以下方法及条件对粒度分布进行了测定。
装置：SEISHIN ENTERPRISE Co.,Ltd.制造的LMS-2000e
测定原理：激光照射分散于水或乙醇等分散介质的粒子，并测定来自粒子的散射光强度的角度依赖性，从而求出样品中所包含的粒子的粒径分布。
测定范围：0.02～2000μm
激光源：氦氖激光
分散介质：乙醇
测定方法：仅用分散介质进行空白测定之后，通过1分钟的超声波分散来分散试样，并将经超声波分散的试样放入分散槽中以循环方式进行粒度分布测定。
粒度分布：以体积基准表示。
将混合粉末的测定结果示于图14，将TTCP粉末的测定结果示于图15，将DCPD粉末的测定结果示于图16。
作为粉末，当将从微细侧累积10％时的粒径(μm)表示为d10，将从微细侧累积25％时的粒径(μm)表示为d25，将从微细侧累积50％时的粒径(μm)表示为d50，将从微细侧累积75％时的粒径(μm)表示为d75、将从微细侧累积90％时的粒径(μm)表示为d90时，TTCP成为相当于中值粒径的d50＝7.4μm，DCPD成为d50＝19.5μm。将以最终的原子数比Ca/P成为1.5的方式混合而成的、更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量混合而成的该混合物作为磷酸Ca粉末。
所混合的磷酸钙粉末的d50＝17.0μm，以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，且包含32％的粒径为25～100μm的粒子。
[表5]
实施例9：磷酸钙粉末的流动性试验
作为粉末，准备了平均粒径为7μm的TTCP、平均粒径为60μm的DCPD、以及TTCP与DCPD的混合物(以Ca/P的原子数比成为1.5的方式混合而成的混合物)。作为TTCP与DCPD的混合物，更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量进行了混合。
以如下方法测定了上述粉末的流动性(流函数)。作为测定装置，使用Brookfieldcompany制造的“粉末流动性测试仪(Powder Flow Tester)、PFT”，并通过选择标准流函数进行了测定的流函数是在将断裂强度设为fc、最大主应力设为σ1时，由σ1/fc表示的值。以如下基准对流函数值进行了评价。
[表6]
流函数值 流动性的基准 评价等级
10以上 极容易流动 5
4～小于10 容易流动 4
2～小于4 具有附着性，稍微不容易流动 3
1～小于2 附着性高，不容易流动 2
0～小于1 不流动 1
将流函数值与评价结果示于下述表。尽管所混合的TTCP和DCPD在重量和体积上没有太大变化，但似乎没有受到TTCP的很大影响，没有成为TTCP和DCPD的中间值，而是接近DCPD的值。
[表7]
流函数值 评价等级
TTCP 3.34 3
DCPD 5.13 4
混合粉末 4.87 4
如流函数的值所示，TTCP的流动性差，当仅用TTCP重涂粉末时，有时TTCP附着于辊子或本应该平坦的TTCP粉末的表层的面上出现可以用肉眼看到的几mm以上的凹凸。当混合DCPD时，能够以混合粉末不会附着到辊子上且混合粉末的表层的面上不会成为凹凸的状态进行重涂。
TTCP粉末对有机酸溶液的反应性高，从反应性的观点考虑，适合于3D粉末层叠打印机的造型，但流动性以流函数计为小于4.0，产生重涂不良。
一般而言，流动性与粒径有关，粒径小，则流动性变差。粒径越小，则比表面积变得越大，与质量成正比的体积相比，表面的影响突出，对与某一粉末粒子的表面相邻的粉末粒子的表面作用的范德华力、静电力等吸引粒子的引力的影响非常突出。
TTCP在可称为粒径的代表性尺寸的d50时为Φ7.4μm，比DCPD的d50＝Φ19.5μm小，在粒径分布大的一侧即d90时为16.0μm，也比DCPD的d90＝47.1μm小，也未混合有大粒子。
若以规定的摩尔比混合TTCP与DCPD，则成为d50＝17.0μm，即使以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，也产生包含32％的粒径为25～100μm的粒子的影响，仅为TTCP时，流动性为3.34的流函数值，在混合粉末时为4.87，接近仅为DCPD时的5.13这一值。由此，也不产生重涂不良，并且能过进行3D粉末层叠打印。
实施例10：大鼠试验
使用包覆有CBE3(由序列号1的氨基酸序列组成的重组明胶)的磷酸钙成型体进行了骨再生的评价试验。
以如下方式制作了磷酸钙成型体。
＜磷酸钙成型体的制造方法＞
作为墨液，以柠檬酸1.2mol/L:柠檬酸三钠二水合物1.2mol/L＝3:1的体积比进行混合并制备了调整为pH3.15的柠檬酸钠水溶液。将该制备的柠檬酸钠水溶液称为柠檬酸Na墨液。
作为粉末，当将从微细侧累积10％时的粒径(μm)表示为d10、将从微细侧累积25％时的粒径(μm)表示为d25、将从微细侧累积50％时的粒径(μm)表示为d50、将从微细侧累积75％时的粒径(μm)表示为d75、将从微细侧累积90％时的粒径(μm)表示为d90时，准备相当于中值粒径的d50＝7.4μm的TTCP、d50＝19.5μm的DCPD粉末，以最终的Ca/P的原子数比成为1.5的方式进行了混合。更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量进行了混合。将该混合物作为磷酸Ca粉末。
所混合的磷酸Ca粉末以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，且包含32％的粒径为25～100μm的粒子。
使用3D打印机(Zprinter310plus)，将墨液和粉末替换为柠檬酸Na墨液、磷酸Ca粉末，将层叠厚度设定为100μm。
在用3D打印机成型之后，在35℃的3D打印机内干燥1小时，并用压缩空气(从气枪喷出调整成0.15MPa的压缩空气的吹气流)去除了多余的粉末。使该成型体在马弗炉中以每1小时升温100℃之后，在1100℃下烧结2小时，关闭(off)用于烧结的加热，在不打开马弗炉的盖的状态下静置8小时以上。马弗炉成为100℃以下的温度之后，取出完成烧结的成型体，获得了成型体。将磷酸钙成型体的示意图示于图17。
·结构物为直径Φ5mm、高度1.9mm的圆盘状。
·在与圆盘的底面平行且圆盘的中间程度的高度上，0.7×1.0m的连通孔在X方向和Y方向上形成为十字形。
·在Z轴方向上以贯穿十字形的中心的方式形成有Φ1.1mm的连通孔。
·在圆盘的上表面侧且连通孔的上侧，在X方向和Y方向上形成有宽度为1.8mm且高度为0.4mm的凸部。
在成型体上包覆CBE3。CBE3水溶液的制作方法和磷酸Ca的CBE3包覆为如下。
在HIKARI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.制造的注射水溶液中溶解7质量％的CBE3，在45℃烘箱中加热30分钟并进行溶解而制作了CBE3水溶液。
将磷酸钙成型体浸渍于CBE3水溶液中，在干燥器内，从大气压至-0.09MPa进行真空脱气处理，去除溶解于水溶液中的空气或从存在于磷酸Ca成型体的内部的空隙中去除空气，并放置10分钟。在回到大气状态后，进行了2次相同的操作之后取出，去除附着于磷酸Ca成型体的多余的CBE3水溶液，在50℃的烘箱内干燥3小时。
以如下方式进行了CBE3的热交联。在能够进行抽真空和氮气置换的烘箱中，重复进行抽真空和氮气置换直至2hPa左右之后，在1013hPa的氮气气氛下并在约150℃下加热4小时左右。
在大鼠的顶骨上剥离骨膜之后设置直径为5mm的缺陷并设置试验材料，然后贴付所剥离的骨膜之后缝合了皮肤。
(病理标本的制作)
试验期结束后，从放血致死的大鼠中回收头部并去除眼球、脑等的软组织之后，从所获得的标本中修整植入部并包埋于树脂中。通过切片机从该包埋标本中切出厚度为5μm的切片，并进行了苏木精—伊红染色(H&E)及von Kossa染色。
(显微CT解析)
关于试验A(控制：仅缺陷)进行了微焦点CT解析。微焦点CT为RigakuCorporation制造的R-mCT，管电压为90kV、管电流为100μA、X射线焦点-检测器的距离(FDD)为292mm、X射线焦点-旋转中心的距离(FOD)为73mm。将微焦点CT的解析结果示于图18。在微焦点CT解析中，关于控制(仅缺陷)，观察到骨骼从现有骨的外周部再生，但未观察到诸如补偿大鼠头部的缺陷的再生。
将试验B(包覆有CBE3的磷酸Ca成型体(成型体B))的大鼠移植后8周期间的显微CT解析结果示于图19。在成型体B与大鼠自己骨骼接触的部位能够确认到充分的骨愈合。成型体B的外观形状及通过3D打印机形成的内部结构均维持形状。
将所移植的成型体B的每0周至2周期间的显微CT解析结果示于图20。能够确认到：在4周后，通过设计而制作的约0.7×1.0mm的十字形连通孔中新生骨骼，在6周后生长的情况。
将所移植的成型体B的8周后的显微CT解析的结果示于图21。解析条件与上述试验A相同。通过设计而制作的约0.7×1.0mm的连通孔中新生骨骼，在长的部位生长至3.5mm。并且，通过病理标本、von Kossa染色，也能够确认到在连通孔的内部长出的无疑就是骨骼。
将所移植的成型体B的8周后的病理标本、H&E染色的结果示于图22。图22的病理标本为图21的病理标本的附近部位。可知在通过3D打印设计而制作的0.7×1.0mm的十字形连通孔内部中，即使在新生骨骼附近，细胞也浸润并变成软组织。在3D打印粉末层叠时自主形成的疏密层叠结构的稀疏层(20～80um左右)中，细胞也浸润并成为软组织。
关于所移植的成型体B，将与上述不同的大鼠(第2只)的8周后的病理标本、H&E染色的结果示于图23及图24。在通过3D打印设计而制作的0.7×1.0mm的连通孔内部确认到新生血管。在3D粉末层叠打印时自主形成的疏密层叠结构的稀疏层(20～80um左右)中，也确认到新生血管。
关于所移植的成型体B，将与上述不同的大鼠(第3只)的8周后的病理标本、vonKossa染色的结果示于图25。能够确认到磷酸钙被吸收取代并替换为骨骼的情况。
实施例11：有机酸溶液的浓度的影响
＜磷酸钙成型体的制造方法＞
以柠檬酸1.0mol/L:柠檬酸三钠二水合物1.0mol/L＝3:1的体积比进行混合，制备了将pH调整为3.15的1.0mol/L的柠檬酸钠水溶液。
以柠檬酸1.2mol/L:柠檬酸三钠二水合物1.2mol/L＝3:1的体积比进行混合，制备了将pH调整为3.15的1.2mol/L的柠檬酸钠水溶液。
作为粉末，当将从微细侧累积10％时的粒径(μm)表示为d10，将从微细侧累积25％时的粒径(μm)表示为d25，将从微细侧累积50％时的粒径(μm)表示为d50，将从微细侧累积75％时的粒径(μm)表示为d75，将从微细侧累积90％时的粒径(μm)表示为d90时，准备相当于中值粒径的d50＝7.4μm的TTCP、d50＝19.5μm的DCPD粉末，以最终的Ca/P的原子数比成为1.5的方式进行了混合。更具体而言，以摩尔比计TTCP:DCPD＝1:2并以TTCP:DCPD＝219.8g:206.5g的量进行了混合。并将该混合物作为磷酸Ca粉末。
所混合的磷酸Ca粉末以体积基准包含约35％的粒径为5～15μm的粒子，且包含32％的粒径为25～100μm的粒子。作为激光衍射型粒度分布测定装置使用SEISHINENTERPRISE Co.,Ltd.制造的LMS-2000e，分散介质使用乙醇进行了测定。
通过对上述磷酸Ca粉末喷出1.0mol/L柠檬酸钠水溶液或1.2mol/L柠檬酸钠水溶液而进行了滴加。
关于有机酸溶液的涂布量，从3D打印机中除去磷酸钙粉末，并将测定完重量的塑料容器放置在本应形成磷酸钙成型体的位置，对塑料容器喷出有机酸溶液，以便造型1cm3设计的立体物体，在装有有机酸溶液的状态下测定塑料容器的重量并测定所喷出的有机酸溶液的重量。将造型1cm3设计的立体物体所需要的有机酸溶液的重量作为有机酸溶液的涂布量，以g/1cm3的单位来表示。
1.0mol/L柠檬酸钠水溶液在0.12g/1cm3至0.38g/1cm3的范围内进行了试验，1.0mol/L柠檬酸钠水溶液在0.215g/1cm3至0.29g/1cm3的范围内进行了试验。
将粉末及柠檬酸钠水溶液导入到Z-Printer310Plus(3D Systems Corpor ation(旧Z Corporation))中，制作了20×20×8mm的长方体。
使用3D打印机(Zprinter310plus)将墨液和粉末替换为柠檬酸Na墨液、磷酸Ca粉末，将层叠厚度设定为100μm。
在通过3D打印机成型之后，在35℃的3D打印机内干燥1小时，并用压缩空气(从气枪喷出调整成0.15MPa的压缩空气的吹气流)去除了多余的粉末。使该成型体在马弗炉中以每1小时升温100℃之后，在1100℃下烧结2小时，关闭(off)用于烧结的加热，在不打开马弗炉的盖的状态下静置8小时以上。马弗炉成为100℃以下的温度之后，取出完成烧结的成型体，获得了成型体。由于成型体在烧结后在各方向上收缩约10％，因此成为约18×18×7.2mm。
对所制作的磷酸钙成型体，进行了压缩强度的测定及底面翘曲的评价。
压缩强度的测定使用与IMADA CO.,LTD.制造的立式电动测量台MX2相同公司的IMADA CO.,LTD.制造的数字测力计ZTA-1000N来进行。在约18×18×7.2mm样品的长边方向上，以0.17mm/秒的速度施加荷载，通过游标卡尺精确地测定样品的形状，并通过样品断裂时的最大荷载(N)除以截面积来求出了压缩强度(MPa)。
通过以下基准进行了底面的翘曲的评价。将等级1至5的样本示于图26。
[表8]
注释
等级5 看起来稍微凹陷。
等级4 几乎没有翘曲。
等级3 有略微的翘曲。
等级2 翘曲大。
等级1 翘曲非常大。还有时产生裂缝。
关于使用1.0mol/L柠檬酸钠水溶液或1.2mol/L柠檬酸钠水溶液而制作的磷酸钙成型体，将涂布量与压缩强度的关系示于图27，将涂布量与底面翘曲的关系示于图28，将压缩强度与底面的翘曲关系示于图29。
根据图27可知，若作为设计事项而增加涂布量，则压缩强度也变大且造型物的强度增加。根据图28可知，若作为设计事项而增加涂布量，则翘曲变大而丧失形状精度。图29为将图27中的涂布量与压缩强度的关系及图28中的涂布量与底面的翘曲的关系进行了统合的、压缩强度与底面的翘曲的关系，明确可知压缩强度与底面的翘曲成为权衡关系。
根据1.0mol/L柠檬酸钠水溶液的结果，不存在压缩强度为2.0MPa以上且底面翘曲的等级为4以上的区域。但是，关于使用1.2mol/L柠檬酸钠水溶液制作的磷酸钙成型体，发现压缩强度为2.0MPa以上且底面翘曲的等级成为4以上的区域。
即使同样为pH3.15，但在使用1.2mol/L柠檬酸钠水溶液时，压缩强度及底面的翘曲的权衡关系被消除，而获得更良好的结果。即，通过使用1.2mol/L柠檬酸钠水溶液，能够兼顾高压缩强度及抑制底面的翘曲。
符号说明
11-第1孔的X连通孔，12-第1孔的Y连通孔，13-第1孔的Z连通孔，14-第1孔的XYZ连通孔，15、06-缝合孔，16、02-第2孔，17-结构强化区域，04-第1孔，21-磷酸钙成型体，22-塑料筒，23-管，24-水位，25-注射器。

Claims (38)

1.一种磷酸钙成型体的制造方法，其包括：
工序a，在基板上形成含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层；及
工序b，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将所述有机酸溶液滴加于在所述工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
2.根据权利要求1所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
在所述工序b中使用的有机酸为选自包括柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸及苹果酸的组中的至少1种。
3.根据权利要求1或2所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
在所述工序b之后还包括：
工序c，将含有Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙粉末的层形成于在所述工序a中形成的含有磷酸钙粉末的层上；及
工序d，从喷嘴部以液滴状态喷出有机酸的钙盐相对于水的溶解度为1g/100mL以下且pH为3.5以下的有机酸溶液，并将所述有机酸溶液滴加于在所述工序c中形成的含有磷酸钙粉末的层，从而制造磷酸钙成型体。
4.根据权利要求3所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
在所述工序d中使用的有机酸为选自包括柠檬酸、草酸、酒石酸、丙二酸及苹果酸的组中的至少1种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
所述磷酸钙粉末包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末，第1磷酸钙粉末相对于所述有机酸的溶解性比第2磷酸钙粉末相对于所述有机酸的溶解性高，
包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末的所述磷酸钙粉末至少包含粒径为5μm～15μm的粒子及粒径为25μm～100μm的粒子，且以体积基准包含20％以上的粒径为25μm以上的粒子。
6.根据权利要求5所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
第1磷酸钙粉末的流函数小于4.00，
包含第1磷酸钙粉末及第2磷酸钙粉末的所述磷酸钙粉末的流函数为4.00以上，其中，在将断裂强度设为fc、最大主应力设为σ1时，流函数由σ1/fc表示。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的浓度为1.1mol/L以上且1.4mol/L以下。
8.根据权利要求7所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸为柠檬酸。
9.根据权利要求7或8所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的涂布量为0.20g/cm3以上且0.30g/cm3以下。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
工序b和/或工序d中的有机酸溶液的pH为2.5以上且3.5以下。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其还包括去除在成型体的形成中未使用的磷酸钙粉末的工序e。
12.根据权利要求11所述的磷酸钙成型体的制造方法，其在所述工序e之后包括通过将成型体浸渍于水溶液来硬化成型体的工序f、和/或通过加热成型体来硬化成型体的工序g。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其还包括在成型体上包覆生物亲和性高分子的工序h。
14.根据权利要求13所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
所述生物亲和性高分子为重组明胶。
15.根据权利要求13或14所述的磷酸钙成型体的制造方法，其在所述工序h之后还包括将细胞接种于所述生物亲和性高分子的工序i。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法，其中，
磷酸钙成型体为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
17.一种磷酸钙成型体，其利用权利要求1至16中任一项所述的磷酸钙成型体的制造方法来制造。
18.根据权利要求17所述的磷酸钙成型体，其为再生医疗用支架材料或组织修复材料。
19.根据权利要求17或18所述的磷酸钙成型体，其具有与外部空间连通的孔。
20.根据权利要求19所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的孔贯穿成型体的内部，且在孔的两端与外部空间连通。
21.根据权利要求19或20所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的孔的平均直径为200μm～2000μm。
22.一种磷酸钙成型体，其由Ca/P的原子数比为1.4～1.8的磷酸钙形成，
所述磷酸钙成型体具有与外部空间连通的第1孔、及平均直径比该第1孔大的第2孔。
23.根据权利要求22所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的第1孔的平均直径为200μm～2000μm。
24.根据权利要求22或23所述的磷酸钙成型体，其中，
与外部空间连通的第1孔的数量多于平均直径比第1孔大的第2孔的数量。
25.一种移植用材料，其包含表面的一部分或整个表面被重组明胶涂布的磷酸钙成型体。
26.根据权利要求25所述的移植用材料，其中，
所述磷酸钙的Ca/P的原子数比为1.4～1.8。
27.根据权利要求25或26所述的移植用材料，其中，
重组肽被热交联或化学交联。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的移植用材料，其中，
用重组肽涂布的磷酸钙成型体的表面存在于移植用材料的表面及内部。
29.根据权利要求25至28中任一项所述的移植用材料，其中，
磷酸钙成型体为块状。
30.根据权利要求25至28中任一项所述的移植用材料，其中，
磷酸钙成型体为颗粒状。
31.一种磷酸钙成型体，其由磷酸钙形成，
所述磷酸钙成型体具有与外部空间连通的孔，
比重为0.7g/mL以上、和/或基于汞注入法的孔隙率为75％以下，吸水渗透速度为0.05mm/秒以上，
其中，吸水渗透速度是指，通过以下条件测定的值：
构建如下实验系统：将内径为2mm的塑料筒的一端连接于直径为8mm且高度为20mm的磷酸钙成型体，将所述塑料筒的另一端连接于长度为100mm的管的一端，将所述管的另一端连接于10mL的注射器；
在将磷酸钙成型体与塑料筒的接触高度和注射器内的墨液水位的高度调整为从开始吸水渗透到结束为止相同的条件下，将注射器内的墨液吸水渗透到磷酸钙成型体中，当墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内成为15mm时，将15mm除以渗透所需要的时间而得的值作为吸水渗透速度，在墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度在5分钟以内达不到15mm的情况下，将在5分钟的时间点墨液所渗透的磷酸钙成型体的区域的高度除以渗透所需要的时间即5分钟而得的值作为吸水渗透速度。
32.根据权利要求31所述的磷酸钙成型体，其中，
所述磷酸钙的Ca/P的原子数比为1.4～1.8。
33.根据权利要求31或32所述的磷酸钙成型体，其具有通过基于纳米焦点X射线CT或微焦点X射线CT的测定而判别的相对致密的层和相对稀疏的层交替层叠而成的结构。
34.根据权利要求33所述的磷酸钙成型体，其中，
至少5层以上的相对致密的层和至少5层以上的相对稀疏的层交替层叠。
35.根据权利要求33或34所述的磷酸钙成型体，其中，
第1相对致密的层与相邻于所述第1相对致密的层的第2相对致密的层的间距为50μm～300μm。
36.根据权利要求31或32所述的磷酸钙成型体，其中，
在根据磷酸钙成型体的纳米焦点X射线CT图像而将成型体的一个方向上的距离表示于横轴且将相对CT强度表示于纵轴的波形图中，交替地具有山的峰和谷的峰。
37.根据权利要求36所述的磷酸钙成型体，其中，
具有至少5个以上的山的峰。
38.根据权利要求36或37所述的磷酸钙成型体，其中，
第1山的峰与相邻于所述第1山的峰的第2山的峰的间距为50μm～300μm。
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