WO2010001578A1

WO2010001578A1 - 骨成長因子を吸着し，その活性を阻害しない骨補填剤

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Publication number: WO2010001578A1
Application number: PCT/JP2009/002989
Authority: WO
Inventors: 鄭雄一; 佐々木伸雄; 鈴木茂樹
Original assignee: 国立大学法人東京大学; 株式会社ネクスト２１
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2009-06-29
Publication date: 2010-01-07
Also published as: EP2308518A1; JPWO2010001578A1; CN102131529A; US20110166672A1; EP2308518A4

Abstract

　【課題】本発明は，ＰＲＰなどの成長因子による骨再生効果を促進できる骨補填剤を提供することを目的とする。【解決手段】本発明者らは，骨補填剤がＰＲＰなどの成長因子を吸着し，これにより骨補填剤とＰＲＰとを併用した場合に，ＰＲＰの骨再生効果が損なわれているという予見した。そして，本発明は，基本的には，キャッピング剤を用いることで，骨補填剤の吸着効果を抑えたものである。このように，骨補填剤の吸着効果が抑えられるので，骨補填剤とＰＲＰとを併用した場合に，ＰＲＰが骨再生効果を発揮できる。

Description

骨成長因子を吸着し，その活性を阻害しない骨補填剤

　本発明は，骨成長因子による骨成長を阻害しない骨補填剤などに関する。より詳しく説明すると，骨補填剤埋植後の滲出体液や多血小板血漿に含まれる骨成長因子の活性を阻害しない骨補填剤などに関する。

　骨の欠損部などを修復する目的で，骨補填剤が用いられている。たとえば，特開平８－２２４２６１号公報には，複数の突起を有する骨補填剤が開示されている。

　一方，多血小板血漿（以下，ＰＲＰともいう）は，骨の成長を促す成長因子（又は増殖因子）を含むことが知られている。そこで，近年，骨補填剤とともにＰＲＰを併用する技術が提案されている（たとえば，特開２００７－１０５１８６号公報，特開２００６－２３０６８３号公報）。

　しかしながら，実際に骨補填剤とＰＲＰとを併用した場合，必ずしもＰＲＰによる骨再生効果が認められない。

特開２００７－１０５１８６号公報特開２００６－２３０６８３号公報

　そこで，本発明は，ＰＲＰなどが含有する成長因子による骨再生効果を阻害しない骨補填剤を提供することを目的とする。

　骨補填剤は，骨再生を促進するものである。よって，従来は，骨補填剤が，成長因子などの活性を阻害するとは全く考えられていなかった。しかし，本発明者らは，例えばＰＲＰに含まれる成長因子などを骨補填剤が吸着し，これにより骨補填剤とＰＲＰとを併用した場合であっても，ＰＲＰの骨再生効果が損なわれていると考えた。本発明は，基本的には，表面処理剤で骨補填剤用人工骨の成長因子が吸着されるサイトをブロックすることで，骨補填剤を患者に投与した場合，細胞の増殖が促進されるという知見に基づくものである。また，このような骨補填剤とＰＲＰとを併用することで，効果的に細胞増殖を促進することができるという知見に基づくものである。本発明は，表面処理剤を用いることで，骨補填剤の吸着効果を制御したものである。このように，骨補填剤の吸着効果が抑えられるので，骨補填剤とＰＲＰとを併用した場合に，ＰＲＰが骨再生効果を発揮できる。また，このような骨補填剤を用いることで，生体に内在するＰＲＰや成長因子などが骨補填剤に吸着することも防ぐことができ，骨再生を促進することができる。

　本発明の第１の側面は，カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨と，前記骨補填剤用人工骨に塗布された表面処理剤，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された表面処理剤とを含む骨補填剤に関する。前記表面処理剤により成長因子の吸着性を抑制し，これにより骨補填剤が投与された際に骨補填剤用人工骨に成長因子が吸着されてその成長因子の活性が阻害される事態を防止する骨補填剤である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記成長因子が,前記骨補填剤を投与した投与部位に湿潤する体液中に含まれる骨成長因子である。後述する実施例で示されたとおり，本発明の骨補填剤は，成長因子の吸着性が抑制されている。よって，本発明の骨補填剤は，体液中に含まれる骨成長因子の吸着も効果的に抑制されると考えられるので，骨再生を妨害しない骨補填剤として好適に用いることができる。

　本発明の第1の側面の好ましい態様は，前記成長因子が，多血小板血漿に含まれる成長因子である上記の骨補填剤である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨は，焼結された焼結体である上記の骨補填剤である。

　　本発明の第1の側面の好ましい態様は，前記骨補填剤用人工骨と前記表面処理剤の重量比が１×１０^２：１～１×１０^１０：１である上記の骨補填剤である。骨補填剤に対するキャッピング剤の比率を１×１０^２：１～１×１０^１０：１とすることで，骨補填剤用人工骨が有する成長因子吸着サイトをブロックするキャッピング剤の効果を効果的に得ることができる。このような比率とすることで，成長因子の吸着が効果的に抑制された骨補填剤となる。また，このような比率の骨補填剤とすることで，骨補填剤を投与した投与部位に湿潤する体液中に含まれる骨成長因子の吸着を効果的に抑制することができる。そして，後述する実施例に示されたとおり，本発明の骨補填剤を用いることで，効果的に骨再生を促進することができる。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記カルシウム系物質は，水酸アパタイト，炭酸アパタイト，フッ素アパタイト，塩素アパタイト，β－ＴＣＰ，α－ＴＣＰ，メタリン酸カルシウム，リン酸四カルシウム，リン酸水素カルシウム，リン酸二水素カルシウム，ピロリン酸カルシウム，炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，それらの塩，又はそれらの溶媒和物から選択される１種又は２種以上の混合物である，上記に記載の骨補填剤である。カルシウム系物質を用いることで，多孔質の骨補填剤用人工骨を得ることができるので，キャッピング剤を骨補填剤用人工骨の表面だけでなく，内部にまで浸透させることができる。後述する実施例に示されたとおり，カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨にキャッピング剤を浸漬することによって，効果的に細胞増殖を促進する骨補填剤を得ることができる。そして，後述する実施例に示されたように，本発明の骨補填剤を用いることで，骨再生を促進することができる。

　本発明の好ましい態様は，前記骨補填剤用人工骨の形状は，顆粒状，ブロック状基材，オーダーメイド基材，歯根用インプラント，又は硬化型人工骨のいずれかである，上記に記載の骨補填剤である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記骨補填剤用人工骨は，顆粒状であり，複数の突起を有し，前記骨補填剤用人工骨を収容できる球の直径の大きさが，１×１０^－２ｍｍ～５ｍｍである，上記に記載の骨補填剤である。複数の突起を有する形状の骨補填剤を用いると，骨補填剤を患部に投与した際，骨補填剤が動かないように骨補填剤同士が組み合わさるので，骨再生に関与する細胞の好ましい足場となる。また，細胞が吸着する骨補填剤の表面積が大きくなるので，骨再生を促進できる。後述する実施例で示されたとおり，このような複数の突起を有する形状の骨補填剤を用いることで，効果的に細胞増殖を促進することができる。そして，このような骨補填剤を用いることで，骨再生を促進することができる。

　本発明の第１の側面好ましい態様は，前記表面処理剤は，アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，キレート剤，カップリング剤，又は架橋剤のいずれか１種又は２種以上の混合物である，上記に記載の骨補填剤である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記キレート剤は，鎖状ポリリン酸キレート剤，グルコン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸，メタクリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ三酢酸，及びメチルグリシン二酢酸からなる郡から選ばれる１種または２種以上の混合物である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記キャッピング剤は，アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，レクチン，プロテオグリカン，糖タンパク，及び糖脂質のいずれか１種以上である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記カップリング剤は，アルミネート系カップリング剤，チタノール系カップリング剤，またはシラノール系カップリング剤である上記の骨補填剤である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記表面処理剤は，トレハロース，セリン，又はデキストランである上記の骨補填剤である。後述する実施例で示されたとおり，トレハロース，セリン，又はデキストランを含むことで，効果的に細胞増殖が良くなる。よって，本発明の骨補填剤は，骨再生を促進でき，骨補填のために好適に使用されうる。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記表面処理剤は，トレハロースである上記の骨補填剤である。後述する実施例で示されたとおり，トレハロースを含む溶液を含む骨補填剤を用いることで，効果的に細胞増殖を促進することができる。そして，後述する実施例で示されたとおり，本発明の骨補填剤を用いることで，骨再生を促進することができる。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記骨補填剤は，さらに前記骨補填剤用人工骨に塗布された骨成長剤，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された骨成長剤を含む。本発明の骨補填剤は成長因子を吸着しないので，成長因子を含有する骨成長剤を含ませることで，効果的に骨再生を促進することができる。後述する実施例で示されたとおり，成長因子を含有する骨成長剤と骨補填剤を用いることで，効果的に細胞増殖を促進することができる。このような骨成長剤と骨補填剤を用いることで，骨再生を促進することができる。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記骨補填剤は，さらに前記骨補填剤用人工骨に塗布された多血小板血漿，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された多血小板血漿を含む。本発明の骨補填剤は，成長因子の吸着が制御されているので，多血小板血漿中の成長因子の活性を阻害しない。よって，多血小板血漿を含む骨補填剤を用いることで，骨再生を効果的に促進することができる。

　本発明の第２の側面は，骨補填剤用人工骨に表面処理剤を浸透させる工程と，前記表面処理剤を浸透させた骨補填剤用人工骨に，骨成長剤を含ませる工程とを含む，骨補填剤の製造方法に関する。前記骨補填剤用人工骨に表面処理剤を浸透させる工程は，骨補填剤用人工骨に表面処理剤を塗布するか，又は骨補填剤用人工骨を表面処理剤の溶液に浸漬する工程である。前記骨成長剤を含ませる工程は，前記表面処理剤が塗布又は浸漬された骨補填剤用人工骨に，骨成長剤を塗布するか，又は，前記表面処理剤が塗布又は浸漬された骨補填剤用人工骨を，骨成長剤の溶液に浸漬する工程である。前記骨補填剤用人工骨は，カルシウム系物質を含有する。この方法によって，骨再生効果を促進できる骨補填剤を製造することができる。

　本発明の第３の側面は，多血小板血漿調整用の容器を含む医療用キットに関する。本発明は，骨補填剤と，表面処理剤と，多血小板血漿と，多血小板血漿調製用の容器とをキット中に含む。前記表面処理剤により多血小板血漿の成長因子の吸着性を制御し，これにより骨補填剤が投与された際に骨補填剤用人工骨に成長因子が吸着されてその成長因子の活性が阻害される事態を防止するものである。前記多血小板血漿調製キットを使用する際に，前記多血小板血漿用の容器に前記表面処理剤と前記多血小板血漿を収容し，前記骨補填剤を浸漬させるか，又は前記多血小板血漿用の容器に収容された表面処理剤及び多血小板血漿を，前記骨補填剤に塗布し，これにより前記多血小板血漿を前記骨補填剤に含ませる。

　本発明によれば，成長因子による骨再生効果を阻害しない骨補填剤を提供することができる。

図１は，テトラポッド形状の骨補填剤の例を説明するための概念図である。図２は，トレハロース，Ｌ－セリン，デキストラン４０の各キャッピング剤溶液に浸漬したテトラポッド型人工骨が細胞増殖に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図３は,トレハロース処理が骨補填剤の成長因子の吸着性に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図４は，ＰＲＰが骨芽細胞様細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の細胞増殖に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図５は，トレハロース水溶液に浸漬したテトラポッド型骨補填剤が，ＰＲＰが有する細胞増殖能に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図６は，骨補填剤への表面処理が生体内における骨再生に与える影響を示した図面に替わる写真である。図６Ａは，表面処理していないテトラポッド型骨補填剤を移植したラット大腿骨の組織切片を示す図面に替わる写真である。図６Ｂは，図６Ａに示した組織切片の拡大写真に，１００個のマス目を持つ網を設定した図面に替わる写真である。図６Ｃは，表面処理したテトラポッド型骨補填剤を移植したラット大腿骨の組織切片を示す図面に替わる写真である。図６Ｄは，図６Ｃに示した組織切片の拡大写真に，１００個のマス目を持つ網を設定した図面に替わる写真である。図７は，骨補填剤を移植したラット大腿骨の組織切片を示す図面に替わる写真である。

　本発明の第１の側面は，カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨と，前記骨補填剤用人工骨に塗布された表面処理剤，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された表面処理剤とを含む骨補填剤に関する。前記表面処理剤により成長因子の吸着性を抑制し，これにより骨補填剤が投与された際に骨補填剤用人工骨に成長因子が吸着されてその成長因子の活性が阻害される事態を防止する骨補填剤である。以下，本発明の各要素について説明する。

　［骨補填剤］
　骨補填剤は，骨欠損部や骨変形部などに投与し，又はインプラントとして埋入するものである。骨補填剤は，次第に骨組織と置換される性質を有する。骨補填剤中の官能基を表面処理剤により不活性化させることで，骨成長剤と骨補填剤との吸着力を制御することができる。これにより，骨成長剤に含まれる成長因子が，骨補填剤に吸着される事態を防止できる。

［骨補填剤用人工骨］
　骨補填剤用人工骨は，カルシウム系物質を含む組成物から製造され，例えば顆粒状やブロック状などの形状を有する物体である。骨補填剤用人工骨の形状は上記した形状に限定されるものではなく，例えば，顆粒状，ブロック状基材に加えて，オーダーメイド基材，歯根用インプラント，又は硬化型人工骨などがあげられる。顆粒状の骨補填剤用人工骨は，テトラポッド状など，複数の突起部を有する形状のものがあげられる。その場合，複数個の骨補填剤を患部に投与等することとなる。また，骨補填剤は，インプラントのように患者の骨形状を考慮して設計された形状（オーダーメイド基材）を有してもよい。そのような骨補填剤は，通常，外科手術などにより患部に埋入され，次第に骨組織と置換される。

　[骨補填剤用人工骨の製造方法]
　骨補填剤用人工骨は，公知である。以下では，簡単に骨補填剤用人工骨の製造方法の例を説明する。この骨補填剤用人工骨の製造方法は，混練工程と，成形工程と，脱バインダ（脱脂）工程と，焼結工程とを含む。混練工程は，カルシウム系物質を含む原材料，及びバインダを含む材料を混練するための工程である。成形工程は，混練工程で得られた混練物を用いて，金型を有する射出成形機を用いた射出成形により所定の形状を持った成形体を得るための工程である。脱バインダ（脱脂）工程は，成形工程で得られた成形体に含まれるバインダを取り除き脱脂体を得るための工程である。焼結工程は，脱バインダ工程後の脱脂体を加熱し，焼結し焼結体を得るための工程である。なお，成形体の後処理を行うための後処理工程など公知の工程を適宜含んでもよい。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨は，焼結された焼結体である。焼結体は，上記骨補填剤用人工骨の製造方法の焼結工程を経ることによって製造することができる。本発明の焼結体を得るための焼結温度は，５００～２０００℃があげられる。焼結時間としては，１時間～６０時間があげられる。焼結時間は，焼結温度及びカルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨に応じて，適宜調整すればよい。焼結体を用いることで，骨補填剤の硬度が増し，骨補填剤としてより好適に用いることができる。

　本発明の骨補填剤用人工骨として好ましいものは，複数の突起部を有する形状である。本発明の骨補填剤用人工骨として，さらに好ましいものは，複数の突起部が線対称，面対称，又は空間的に対称となるように配置されたものである。骨補填剤用人工骨の好ましい具体的な形状として，テトラポッド状（正四面体の中心から各頂点へ向けた方向に伸びる４つの突起部を有する形状），又は正ｎ面体（ｎ＝６，８，１２など）の中心から各頂点へ向けた方向に伸びるｎ個の突起部を有する形状のものがあげられる。骨補填剤用人工骨の大きさ（骨補填剤を収容できる球の直径の大きさ）として，１×１０^－２ｍｍ～５ｍｍがあげられ，好ましくは５×１０^－２ｍｍ～３ｍｍであり，さらに好ましくは１×１０^－１ｍｍ～２ｍｍであり，より好ましくは２×１０^－１ｍｍ～１．５ｍｍである。骨補填剤の形状は，骨補填剤用人工骨の形状を反映したものである。以下，図面を用いて，本発明の骨補填剤の好ましい形状を説明する。

　図１は，テトラポッド形状の骨補填剤用人工骨の例を説明するための概念図である。図１Ａは，側面図，図１Ｂは上面図，図１Ｃは斜視図を示す。なお，図中，“Fig.”は“図”を意味する（以下同様である）。図１Ａ～図１Ｃに示される骨補填剤(１１)は，テトラポッド状（正四面体の中心から各頂点へ向けた方向に伸びる４つの突起部(１２)を有する形状）の骨補填剤用人工骨である。なお，各突起部(１２)の先端部(１３)はテーパーが設けられており滑らかな形状とされているものが好ましい（以下同様である）。図１Ａ～図１Ｃに示されるように，各突起部(１２)は,実質的に同一の形状を有するものがあげられるが，そのひとつまたは二つが小さい形状であっても構わない。また，各突起部は，先端部(１３)に近づくほど細くなる円錐台状の形状を有するものであるものがあげられる。各突起部の先端は，半球状とされるものであってもよい。

　［カルシウム系物質］
　カルシウム系物質は，通常，骨充填剤の主成分を構成するものである。カルシウム系物質は，骨の成分に近いものであれば特に限定されない。カルシウム系物質として，リン酸カルシウム系物質，炭酸カルシウム系物質，乳酸カルシウム及びグルコン酸カルシウムがあげられる。これらの中ではリン酸カルシウム系物質又は炭酸カルシウム系物質が好ましい。原料粉末としてのリン酸カルシウム系物質を，より具体的に説明すると，水酸アパタイト，炭酸アパタイト，フッ素アパタイト，塩素アパタイト，β－ＴＣＰ，α－ＴＣＰ，メタリン酸カルシウム，リン酸四カルシウム，リン酸八カルシウム，リン酸水素カルシウム，リン酸水素カルシウム，リン酸二水素カルシウム，ピロリン酸カルシウム，それらの塩，又はそれらの溶媒和物のうちいずれか１種又は２種以上があげられ，これらの中ではβ－ＴＣＰ，又は水酸アパタイトが好ましい。また，炭酸カルシウム系物質として，炭酸カルシウム及び炭酸水素カルシウムがあげられ，これらの中では炭酸カルシウムが好ましい。上記のカルシウム系物質は，上記の化合物が主成分であれば，上記以外の化合物などが適宜含まれていてもよい。このようなカルシウム系物質を用いることによって，多孔質の骨補填剤を作製することができる。このような多孔質の骨補填剤は，効率よくキャッピング剤，及び骨成長剤を含むことができるので，効果的に骨再生を促進することができる。

［表面処理剤］
　表面処理剤は，骨補填剤用人工骨の吸着サイトをブロックするために骨補填剤用人工骨に塗布又は浸漬することによって浸透させる。表面処理剤は，キレート剤，キャッピング剤，カップリング剤又は架橋剤のいずれか１種又は２種以上の混合物があげられる。本発明の表面処理剤は，表面処理剤を溶解できる公知の溶液に溶解すればよいが，好ましくは水，生理食塩水，アルコールなどである。表面処理剤溶液の濃度は，表面処理剤が溶解しうる濃度であれば特に限定されない。しかし，濃度が高すぎると粘度が高くなり，常圧下では，表面処理剤が骨補填剤用人工骨に浸透しにくくなるので，陰圧下，又は加圧下で行うことが好ましい。表面処理剤の浸透を陰圧下，または加圧下で行う場合は，常圧下で表面処理剤を浸透させる時よりも，短時間で高粘度（高濃度）の表面処理剤溶液を浸透させることが可能になる。陰圧下，又は加圧下で表面処理剤溶液に浸漬し，骨補填剤用人工骨に表面処理剤溶液を浸透させる条件は，表面処理剤溶液や骨補填剤用人工骨の性質に応じて，当業者が適宜設定すればよい。本発明の表面処理剤は，異なる表面処理剤を２種以上混合して用いてもよい。表面処理剤の混合比は，特に限定されない。等比で混合してもよいし，用いる表面処理剤の性質に応じて，当業者が適宜混合比を調整すればよい。表面処理剤を混合することで，ブロックできる吸着サイトが増え，単独で用いるよりも強い表面処理効果を有する骨補填剤を得ることができる。

　［キレート剤］
　本発明のキレート剤として，鎖状ポリリン酸キレート剤，グルコン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），メタリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ酢酸，メチルグリシン二酢酸，１，２－シクロヘキサンジアミン四酢酸，ジエチレントリアミン酢酸２－ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸，トリエチレンテトラアミン六酢酸，ジメチルグリオキシム，ジチゾン，オキシン，アセチルアセトン，又はそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選ばれる１種又は２種以上の混合物があげられる。これらの中では，鎖状ポリリン酸キレート剤，グルコン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），メタリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ三酢酸，及びメチルグリシン二酢酸からなる郡より選ばれる１種又は２種以上の混合物が望ましい。さらに，グルコン酸を含むものが好ましい。キレート剤を骨補填剤用人工骨に浸透させる場合，常圧下では，キレート剤溶液の濃度は，０．１～４０重量％が挙げられ，１～１０重量％でもよく，５～１５重量％でもよい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，キレート剤が溶解しうる濃度であれば，４０重量％を超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，骨補填剤の材質，キレート剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

　［キャッピング剤］
　本発明のキャッピング剤として，アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，レクチン，プロテオグリカン，糖タンパク，及び糖脂質のいずれか１種以上を含むのが好ましい。

　キャッピング剤に含まれるアミノ酸として，“アラニン,アルギニン,アスパラギン,アスパラギン酸,システイン,グルタミン,グルタミン酸,グリシン,ヒスチジン,イソロイシン,ロイシン,リシン,メチオニン,フェニルアラニン,プロリン,セリン,スレオニン,トリプトファン,チロシン,及びバリン”からなる群から選ばれるアミノ酸，アミノ酸の誘導体，またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれか１種又は２種以上を含むものがあげられる。アミノ酸は天然に存在するＬ体であることが好ましい。これらのアミノ酸の中では，骨補填剤用人工骨中の吸着サイトとの結合性が良い，セリン，スレオニン，チロシン，システイン，又はメチオニンが好ましく，さらにセリンがより好ましい。常圧下で浸透を行う場合のアミノ酸溶液の濃度としては，０．０１～１０ｍｏｌ／Ｌが好ましく，０．０５～５ｍｏｌ／Ｌがより好ましく，０．１～２ｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，アミノ酸が溶解しうる濃度であれば，１０ｍｏｌ／Ｌを超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，骨補填剤の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

　キャッピング剤に含まれるペプチドとして，“アラニン,アルギニン,アスパラギン,アスパラギン酸,システイン,グルタミン,グルタミン酸,グリシン,ヒスチジン,イソロイシン,ロイシン,リシン,メチオニン,フェニルアラニン,プロリン,セリン,スレオニン,トリプトファン,チロシン,及びバリン”からなる群から選ばれ任意の組み合わせによりなるジペプチド，トリペプチド，テトラペプチド，ペンタペプチド，またはそれらの薬学的に許容される塩のいずれか１種又は２種以上を含むものがあげられる。ペプチドの中では，キャッピング剤を骨補填剤に早く浸透させるため，ペプチド鎖が短い，ジペプチド又はトリペプチドが好ましい。常圧下で浸透を行う場合のペプチド溶液の濃度としては，０．０１～１０ｍｏｌ／Ｌが好ましく，０．０５～５ｍｏｌ／Ｌがより好ましく，０．１～２ｍｏｌ／Ｌがさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，ペプチドが溶解しうる濃度であれば，１０ｍｏｌ／Ｌを超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，骨補填剤の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

　キャッピング剤に含まれる多糖類として，プルラン，グァーガム，ラムダカラギナン，トラガントガム，ペクチン，マンナン，デキストラン，マルトデキストラン，グルコマンナン，アミロース，アミロペクチン，アガロース，タマリンドシードガム，カラギーナン，ジェランガム，カルボキシメチルセルロース，キサンタンガム，カラヤガム，アラビアガム，ガッディガム，アラビノガラクタン，カードランまたはこれらの酸性塩（例えば硫酸塩）のうち，いずれか又は２種以上があげられる。これらの中では，プルラン，デキストラン，またはマルトデキストランが好ましく，デキストランがより好ましい。常圧下で浸透を行う場合の多糖類溶液の濃度としては，１～４０重量％が好ましく，５～３０重量％がより好ましく，１５～２５重量％がさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，多糖類が溶解しうる濃度であれば，４０重量％を超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，骨補填剤の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

　キャッピング剤に含まれる二糖類として，麦芽糖（マルトース），イソマルトース，セロビオース，ゲンチオビオース，ニゲロース，ラミナリビオース，コージビオース，スホロース，メリビオース，ラクトース，ツラノース，ソホロース，トレハロース，イソトレハロース，ショ糖，スクロース，ラクトース及びイソサッカロースがあげられる。これらの中では，トレハロース，イソトレハロース，マルトース，イソマルトース，セロビオース，またはゲンチオビオースが好ましく，トレハロースがより好ましい。常圧下で浸透を行う場合の２糖類溶液の濃度としては，１～４０重量％が好ましく，５～３０重量％がより好ましく，１５～２５重量％がさらに好ましい。陰圧下，又は加圧下で浸透を行う場合は，多糖類が溶解しうる濃度であれば，４０重量％を超える濃度であってもよい。陰圧，又は加圧の条件は，骨補填剤の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

　キャッピング剤に含まれる糖タンパクとして，プロテオグリカン，ムチン，またはアビジンがあげられ，プロテオグリカンが好ましい。プロテオグリカンとしてムコ多糖とタンパク質の複合体があげられる。さらにムコ多糖の例として，ヒアルロン酸，コンドロイチン硫酸，へパラン硫酸，ケラタン硫酸，デルマタン硫酸，へパリンなどがあげられる。糖タンパクの溶液濃度としては，１～３０重量％があげられ，好ましくは１５～２５重量％である。キャッピング剤に含まれる糖脂質として，ガラクト脂質，スルホ脂質，スフィンゴ脂質（セレブロシド，ガングリオシド），糖スフィンゴリン脂質などがあげられる。糖脂質の濃度としては，１～３０重量％があげられ，好ましくは１０～２０重量％である。このような濃度の溶液を用いることで，効果的に表面処理を行うことができる。

　表面処理剤に含まれるカップリング剤として，アルミネート系カップリング剤,チタノール系カップリング剤，またはシラノール系カップリング剤などがあげられる。これらの中では，シラノール系カップリング剤が好ましい。カップリング剤溶液の濃度としては，１～１５重量％があげられ，好ましくは５～１０重量％である。そして，本発明においてカップリング剤は，弱酸性（ｐＨ４．５～６．５）の溶液で溶解することが好ましい。このようなｐＨの溶液を用いることで，表面処理剤としての効果を高めることができる。

　表面処理剤に含まれる架橋剤として，グルタルアルデヒド，エポキシド（例，ビス－オキシラン），酸化デキストラン，ｐ－アジドベンゾイルヒドラジン，Ｎ－［α－マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル，ｐ－アジドフェニルグリオキサル一水和物，ビス－［β－（４－アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド（ＢＡＳＥＤ），ビス［スルホスクシンイミジル］スベレート，ジチオビス［スクシンイミジル］プロピオネート，ジスクシンイミジルスベレート，１－エチル－３－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミドヒドロクロリド，又はエトキシル化（２０）トリメチルプロパントリアクリレートなどがあげられる。浸透を行う場合の架橋剤溶液の濃度としては，０．０１～２０重量％が挙げられ，０.１～１０重量％が好ましい。陰圧，又は加圧の条件は，骨補填剤の材質，キャッピング剤溶液の粘度等に応じて，当業者は適宜調整することができる。

　［成長因子］
　成長因子とは，個体の初期発生から個体の維持さらに老化に至る多細胞動物の過程において，細胞の増殖や分化の調節因子として機能する因子である。具体的な例として，上皮成長因子（ＥＧＦ：Epidermal　Growth　Factor），インスリン様成長因子（ＩＧＦ：Insulin－like　Growth　Factor），トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ：Transforming　Growth　Factor），血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ：Vascular　Endothelial　Growth　Factor），肝細胞成長因子（ＨＧＦ：Hepatocyte　Growth　Factor），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ：Platelet－derived　Growth　Factor），胎児型平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭｅｍｂ：Embryonic　Smooth　Mascule　Myosin　heavy　chain），骨形成因子（ＢＭＰ：Bone　Morphogenetic　protein），顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ：Granulocyte　colony－stimulating　Factor），エリスロポエチン（ＥＰＯ：Erythropoietin），トロンボポエチン（ＴＰＯ：thrombopoietin），又は，塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ：basic　Fibroblast　Growth　Factor）などがあげられる。そして，骨成長因子とは，上記のような成長因子のうち骨成長に関与する生体内で産生されうる因子である。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記成長因子が，前記骨補填剤を投与した投与部位に湿潤する体液中に含まれる骨成長因子である。このような骨成長因子として，例えば，上皮成長因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β），インシュリン様成長因子（ＩＧＦ），血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ），肝細胞成長因子（ＨＧＦ），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）,胎児型平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭｅｍｂ），骨形成因子（ＢＭＰ）などがあげられる。このような骨成長因子は公知の方法で得ることができ，１種または２種以上を混合して，骨成長剤としても使用できる。後述する実施例で示されたとおり，本発明の骨補填剤は，骨補填剤用人工骨の成長因子吸着サイトを表面処理剤でブロックしているので，成長因子が骨補填剤に吸着し，成長因子の作用が妨害されるのを防ぐことができ，細胞増殖を促進することができる。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記成長因子を含む溶液が，多血小板血漿である。多血小板血漿は，ＥＧＦ，ＴＧＦ－β，ＩＧＦなどの骨成長因子を含むので，骨成長剤として好ましい。このようなＰＲＰを含む溶液の調整は，公知の方法で行うことができる。例えば，特開２００６－１０４１０６号公報などがあげられる。後述する実施例で示されたとおり，本発明の表面処理剤を浸透させた骨補填剤は，成長因子の吸着が抑制される。また，後述する実施例で示されたとおり，本発明の骨補填剤に骨成長剤を含有させることで，細胞増殖を促進させることができる。さらに，後述する実施例で示されたとおり，本発明の骨成長剤を含む骨補填剤を用いることで，骨再生効果を促進することができる。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記骨補填剤用人工骨と前記表面処理剤の重量比は，１×１０^２：１～１×１０^１０：１である。表面処理剤の割合が少なすぎると，成長因子の活性阻害を防止することができない。一方，表面処理剤の割合が多すぎると，骨補填剤の大きさが大きくなる。そのため，患部に骨補填剤を十分量投与することができず，投与後，十分な強度を得ることができなくなる。また，骨補填剤の吸収が遅くなるので，自家骨への置換が遅れてしまい，患者に負担がかかる。そのため，本発明において，骨補填剤用人工骨と表面処理剤の重量比は，１×１０^２：１～１×１０^１０：１が好ましく，１．５×１０^２：１～１×１０^５：１がより好ましく，２×１０^２：１～１×１０^３：１がさらに好ましい。

　本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記骨補填剤は，さらに，前記骨補填用人工骨に塗布された骨成長剤，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された骨成長剤を含む。骨成長剤が塗布された又は浸漬された骨補填剤用人工骨は，後述する骨成長剤の浸漬又は塗布工程などにより得ることができる。骨成長剤としては，上記のとおり，上皮成長因子（ＥＧＦ），トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β），インシュリン様成長因子（ＩＧＦ），血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ），肝細胞成長因子（ＨＧＦ），血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）,胎児型平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭｅｍｂ），骨形成因子（ＢＭＰ）などを１種または２種以上含む混合物や多血小板血漿などを用いるのが好ましい。より好ましくは，多血小板血漿である。上記のとおり，多血小板血漿は，公知の方法で得ることができ，投与する患者自身の多血小板血漿を用いることで，効果的に骨補填剤投与後の骨成長が進むと考えられる。

　骨補填剤を患部に投与すると，投与部位に体液が浸潤してくる。この体液中には，骨成長剤に含まれる骨成長因子が存在する。このように体液が浸潤し骨成長因子が作用するまで時間がかかるので，骨補填剤に含まれる骨成長剤の量が少ないと骨成長が遅くなる。一方，骨成長剤の量が多すぎると，骨成長に関与する骨芽細胞の好ましい増殖が望めない。よって，本発明において，骨補填剤用人工骨と骨成長剤の重量比は，１×１０^２：１～１×１０^５：１があげられ，好ましくは，５×１０^２：１～５×１０^４：１であり，さらに好ましくは，１×１０^３：１～１×１０^４：１である。このような重量比とすることで，骨補填剤が含む骨成長剤と，投与部位に浸潤してくる体液中の骨成長因子等が，それぞれ好ましく作用し，骨成長を早めることができる。

　本発明の第２の側面は，骨補填剤用人工骨に表面処理剤を浸透させる工程と，前記表面処理剤を浸透させた骨補填剤用人工骨に，骨成長剤を含ませる工程とを含む，骨補填剤の製造方法に関する。骨補填剤用人工骨は,上記した製造方法で製造することができる。本発明において，骨補填剤用人工骨は，上記したカルシウム系物質を含むことが望ましい。

　［表面処理剤の浸透工程］
　前記骨補填剤用人工骨に表面処理剤を浸透させる工程は，骨補填剤用人工骨に表面処理剤を塗布するか，又は骨補填剤用人工骨を表面処理剤の溶液に浸漬する工程である。表面処理剤を浸漬又は塗布するための工程として，骨補填剤用人工骨に表面処理剤を含浸又は塗布できる方法であれば特に限定されない。骨補填材用人工骨の製造工程において，原料として表面処理剤を混合してもよい。具体的には，骨補填剤用人工骨を表面処理剤溶液中に浸漬し，常温常圧にて１時間以上６時間以下静置することにより，表面処理剤を含浸させるものがあげられる。また，表面処理剤を含浸させる工程は，陰圧下，または加圧下で行ってもよい。陰圧，または加圧時の圧等の条件は，用いる骨補填剤用人工骨や表面処理剤溶液に応じて，当業者が適宜調整すればよい。表面処理剤を含浸させた後，予備乾燥又は滅菌処理を行ってもよい。その後，表面処理剤を浸漬又は塗布した骨補填剤用人工骨を乾燥させてもよい。

　[骨成長剤の浸漬又は塗布工程]
　骨成長剤を含ませる工程は，前記表面処理剤が塗布又は浸漬された骨補填剤用人工骨に，骨成長剤を塗布するか，又は，前記表面処理剤が塗布又は浸漬された骨補填剤用人工骨を，骨成長剤の溶液に浸漬する工程である。上記のようにして表面処理剤を含浸又は塗布された骨補填剤用人工骨に，適宜骨成長剤を含浸又は塗布することにより本発明の骨充填剤を製造できる。骨成長剤の塗布方法として，骨成長剤を公知の薬学的に許容される希釈剤（溶媒）に溶解させて組成物を得て，その組成物を用いて浸漬塗布，スプレー塗布，又はスピンコート塗布するものがあげられる。これらの中では，浸漬塗布が好ましい。骨成長剤を浸漬塗布すると骨成長剤が骨補填剤の表面又は内部に浸透することとなる。すなわち，本発明では，所定の骨成長剤を含浸又は塗布した骨補填剤をも提供できる。なお，インクジェット法を用いて骨成長剤を所定の位置に塗布してもよい。具体的には，インクジェット装置を用いて，ある設計した位置に骨成長剤を塗布するようにすればよい。また，ラピッドプロトタイプなどコンピュータ支援デザインを用いて，骨補填剤を製造する場合は，骨補填剤又は骨補填材用の人工骨を製造する過程において，所定のプログラムや入力情報に従って，骨成長剤が塗布されるようにされてもよい。骨成長剤としては，上記したとおり，多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いることが好ましい。多血小板血漿（ＰＲＰ）は，繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ），トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β），インシュリン用成長因子（ＩＧＦ）などの骨成長因子を含むので，骨成長剤として好ましい。さらに，本発明のキットの骨成長剤には，さらに成長因子を含ませても良い。このような成長因子して，上記した成長因子があげられる。このように成長因子を含有する骨成長剤を含ませることで，効果的に骨再生を促進することができる。当業者であれば，浸漬又は塗布工程に必要な多血小板血漿（ＰＲＰ）量を算出し，必要量を公知の方法で調整することができる。

　［表面処理剤の乾燥工程］
　本発明の第２の側面の好ましい態様は，さらに前記表面処理剤を浸透させた骨補填剤用人工骨を乾燥させる乾燥工程を含む。表面処理剤を浸透させた骨補填剤用人工骨を乾燥させた後に骨成長剤を含ませる工程を行うことで，骨成長剤をむらなく骨補填剤用人工骨に含ませることができる。乾燥工程は，表面処理剤の性質等に応じて適宜調整すればよいが，例えば，３０～１００℃の乾燥機中に静置があげられる。乾燥時間は２分～６０分があげられるが，６０分を超えてもよい。乾燥時間を短縮するために，送風下に静置してもよい。風速としては０．１～５ｍ／秒があげられるが，送風速度が速すぎると，むらができてしまい，遅すぎると乾燥に時間がかかり製造効率が低下するので，０．２～３ｍ／秒が好ましく，０．５～１．５ｍ／秒がより好ましい。

　［骨補填剤の使用方法］
　本発明の製造方法により製造された骨補填剤は，骨欠損部位，骨粗鬆症部位又は骨延長部位に注入する。また，骨欠損部位などの骨の間隙に骨補填剤を充填する他，所定の骨成長剤の担体として利用されうる。

　本発明の第３の側面は，多血小板血漿調整用の容器を含む医療キットに関する。本発明のキットは，表面処理剤と，骨補填剤と，多血小板血漿と，多血小板血漿調製用の容器とを含む。前記表面処理剤により多血小板血漿の成長因子の吸着性を制御し，これにより骨補填剤が投与された際に骨補填剤用人工骨に成長因子が吸着されてその成長因子の活性が阻害される事態を防止する。前記多血小板血漿調整キットを使用する際は，前記多血小板血漿用の容器に前記表面処理剤と前記多血小板血漿を収容し，前記骨補填剤を前記収容させた表面処理剤と前記多血小板血漿に浸漬させるか，または前記多血小板血漿用の容器に収容された表面処理剤及び多血小板血漿を，前記骨補填剤に塗布し，これにより前記多血小板血漿を前記骨補填剤に含ませる。本発明のキットの一態様として，あらかじめ表面処理剤が塗布された，または浸漬された骨補填剤を用いることもできる。

　浸漬工程に用いる多血小板血漿調整用容器は，表面処理剤，多血小板血漿，及び骨補填剤を収容できる大きさであればよく，適宜調整することができる。具体的には，容器の容積は，１～５０ｍＬがあげられ，２～２５ｍＬでもよい。容器の形状は，特に限定されないが，例えば，一端がふさがれ，液体が漏れない円筒状，多角筒状の容器があげられる。また，本発明に用いる容器としてシリンジ状の容器を用いてもよい。シリンジの放出口は，シール又はキャップ（ネジ式のものが好ましい）で塞いでおく。このようなシリンジは公知のものを適宜使用することができる。このようなシリンジ容器を用いて浸漬する場合は，放出口がふさがれたシリンジの他端（フランジ側）の開放端から骨補填剤をいれる。その後，表面処理剤および多血小板血漿のいずれか，又は両方（あらかじめ混合させたもの）を注入する。シリンジ内に骨補填剤と表面処理剤および多血小板血漿を入れる順番は逆でもよいが，多血小板血漿に含まれる成長因子の高い作用効果を得るためには，骨補填剤と表面処理剤を入れた後に多血小板血漿を入れることが望ましい。その後，プランジャーをシリンジのフランジ側の開放端から挿入し，シール又はキャップが外れない程度に圧力を加える。これにより，浸漬工程を容易に加圧下で行うことができ，表面処理剤および多血小板血漿を早く浸漬させることが可能になる。浸漬工程に用いる多血小板血漿調製用容器の素材は，公知のものを使用することができるが，表面処理剤や多血小板血漿中のタンパク質などが吸着しにくい素材が好ましい。このような素材は，当業者には公知であり，例えば，ガラスやポリプロピレンなどがあげられる。

　塗布工程に用いる容器は，スプレー容器などがあげられる。スプレー容器としては，公知のものを使用することができる。スプレー容器を用いて塗布する工程は公知の方法で行えばよい。たとえば，骨補填剤を重ならず置くことができる平面を有する容器に，骨補填剤を並べる。容器の底は，骨補填剤が落下しない程度の網目状となっていることが望ましい。そして，その上から，及び下からスプレーすることで，骨補填剤に表面処理剤や多血小板血漿を塗布することができる。スプレー容器には，表面処理剤および多血小板血漿を別々に入れてもよいし，両者を混合して容器に入れてもよい。スプレー容器を用いて塗布する場合，容器から放出される液は霧状となる。そのため，表面処理剤および多血小板血漿の粘度は，高くない方が好ましい。高すぎると，均一にスプレー塗布することが困難である。この様な粘度は，用いる表面処理剤の性質などに応じて，当業者であれば適宜調整することができる。

　実施例１では，表面処理剤に浸漬した骨補填剤が，細胞増殖に与える影響を検討した。実施例１で用いた試薬は以下のとおりであった。α－ＴＣＰとして，太平化学産業株式会社製のものを用いた。大塚蒸留水として，大塚製薬株式会社製のものを用いた。Ｌ型セリンとして,ナカライテスク株式会社製のものを用いた。デキストランとして,名糖産業株式会社製のものを用いた。トレハロースとして,株式会社林原化学研究所製のものを用いた。コハク酸として，川崎化成工業株式会社製のものを用いた。コハク酸二ナトリウムとして，和光純薬工業株式会社のものを用いた。骨補填剤を製造するために，Ｚｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製のＺプリンター４０６を用いた。

　テトラポッド型骨補填剤（Ｔｅｔｏｒａ　Ｂｏｎｅ）の製造工程
　α－ＴＣＰを主原料として，Ｚプリンター４０６を用いてテトラポッド型骨補填剤を製造した。このテトラポッド型骨補填剤を硬化液に浸漬した。硬化液は，０．２ｍｏｌ／Ｌのコハク酸水溶液（ｐＨ６）を使用した。硬化液に浸漬後，テトラポッド型骨補填剤を大塚蒸留水で２回洗浄し，真空低温乾燥機（ヤマト科学社製）を用いて，１２時間減圧乾燥した。

　表面処理剤浸透工程
　次に，前記の工程で得られたテトラポッド型人工骨１ｇを表面処理剤溶液５０ｍＬ中に浸漬し，室温にて２４時間静置することにより，表面処理剤を浸透させた。なお，表面処理剤を，公知の方法に従って塗布してもかまわない。表面処理剤を浸透させた後，オートクレーブを用いて１２１℃の環境で２０分間予備乾燥及び滅菌処理を行った。その後，常温，陰圧下にて，２４時間乾燥させた。このようにしてテトラポッド型人工骨（以下，Ｔｅｔｒａ　Ｂｏｎｅ，テトラボーンとも呼ぶ）を作製した。なお，高温又は低湿度環境において，乾燥を行っても良い。なお，対照として，表面処理剤溶液に浸漬しなかったテトラポット型人工骨を作製した。本工程で用いた表面処理剤（ブロッキング剤），及びその濃度を表１に示す。

　テトラポッド型骨補填剤（Ｔｅｔｏｒａ　Ｂｏｎｅ）の生体適合性評価
　テトラポッド型骨補填剤と細胞の共培養を行い，生体適合性の評価を行った。細胞には骨芽細胞様細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。培養培地は，１０％ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）と，１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ－ＭＥＭ）を使用した。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１をコンフルエントになるまで培養した後，培養培地をＦＢＳを含まない培地（ＤＭＥＭ（ＦＢＳ－））に交換し，９６マルチウェルプレートに５００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し，インキュベーター内（３７℃，ＣＯ_２５％）で，２４時間培養した。その後，各ウェルに３個／ｗｅｌｌとなるようにテトラポッド型人工骨を入れ，さらに２４時間培養した。培養後，Ｃｅｌl　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁科学研究所社製）を加え，呈色反応を行った。反応後，マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定し，細胞増殖性を調べた。結果を図５に示した。

　図２は，トレハロース（Ｔｒｅ），Ｌ－セリン（Ｓｅｒ），デキストラン４０（Ｄｅｘ）の各表面処理剤溶液に浸漬したテトラポッド型人工骨が細胞増殖に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図２の縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度の値を示す。すなわち，縦軸の値が高いほど細胞増殖が良いことを示す。図２の結果より，トレハロース（Ｔｒｅ），Ｌ－セリン（Ｓｅｒ），デキストラン４０（Ｄｅｘ）の各表面処理剤溶液に浸漬したテトラポッド型骨補填剤を入れた細胞は，骨補填剤を入れていない細胞（Ｃ）と比較して，細胞増殖が良いことが示された。それに対し，表面処理剤溶液に浸漬していない骨補填剤（ｎｏｎ）を入れた細胞は，骨補填剤を入れていない細胞（Ｃ）と比較して，細胞増殖が悪いことが示された。この結果より，表面処理剤によって骨補填剤用人工骨の成長因子が吸着するサイトがブロックされていないため，血清（ＦＢＳ）中に含まれる成長因子が骨補填剤用人工骨に吸着し，細胞増殖が阻害されたと考えられる。よって，表面処理剤溶液としてトレハロース，Ｌ－セリン，デキストラン４０を用いることによって，骨補填剤用人工骨の成長因子吸着部位がブロックされるため，成長因子による骨成長効果を阻害しない骨補填剤として好適に使用することができる。

　成長因子の吸着性の検討
　表面処理剤を含む骨補填剤は，成長因子の吸着が抑制されることを調べるため,表面処理剤で処理した骨補填剤と，未処理の骨補填剤を用いて，細胞増殖性に与える影響を検討した。成長因子として，成長因子を含む多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いた。

　ＰＲＰの調整
　ヒトから採血し，１回目の遠心分離（２１００ｒｐｍ，２０℃，１０分）を行った。遠心後，上層（ＰＰＰ）及び中間層（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）を採取し，１本のチューブに集めた。その後，２回目の遠心分離（３４００ｒｐｍ，２０℃，１０分）を行った。遠心後，上層（乏血小板血漿（ＰＰＰ））採取した。

　実施例１と同様に，細胞は骨芽細胞様細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。培地は，１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭを用いた。ＭＣ３Ｔ３Ｅ１細胞を９６マルチウェルプレートに５００細胞／ウェルとなるように細胞を播種し，２４時間培養した。調整したＰＲＰを４０倍希釈（１／４０）となるように，１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで希釈した。トレハロースで処理した（Ｔｒｅ（＋）），またはトレハロースで未処理（Ｔｒｅ（－））の骨補填剤（テトラボーン）２５０ｍｇをＰＲＰ希釈液１．５ｍＬ中に添加し，１時間静置した。静置後，上清と骨補填剤（テトラボーン）を回収した。２４時間培養した細胞に上澄１０ｕＬ／ウェルで添加，または骨補填剤（テトラボーン）を各ウェルに投下し，４８時間培養した。培養後，Ｃｅｌl　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁科学研究所社製）を加え，呈色反応を行った。反応後，マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定し，細胞増殖性を調べた。その結果を図３に示した。

　図３は，トレハロース処理が骨補填剤（テトラボーン）の成長因子の吸着性に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図３の縦軸は，波長４５０ｎｍでの吸光度の値を示す。縦軸の値が高いほど骨芽細胞の増殖活性がよい，すなわち，成長因子の吸着が抑制されていることを示す。図３の結果より，トレハロース処理した骨補填剤（テトラボーン）を添加した細胞は，トレハロース未処理の骨補填剤（テトラボーン）を添加した細胞と比較して，細胞増殖活性が上昇することがわかった。すなわち，トレハロース処理をすることによって，骨補填剤（テトラボーン）の成長因子の吸着性が抑制されたことがわかる。

　多血小板血漿（ＰＲＰ）の骨再生促進効果
　多血小板血漿（ＰＲＰ）の骨再生促進効果について検討した。

　ＰＲＰの調整
　ヒトから採血し，１回目の遠心分離（２１００ｒｐｍ，２０℃，１０分）を行った。遠心後，上層（ＰＰＰ）及び中間層（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）を採取し，１本のチューブに集めた。その後，２回目の遠心分離（３４００ｒｐｍ，２０℃，１０分）を行った。遠心後，上層（乏血小板血漿（ＰＰＰ））及び下層（多血小板血漿（ＰＲＰ））をそれぞれ採取した。

　実施例１と同様に，細胞は骨芽細胞様細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１をコンフルエントになるまで培養した後，ＦＢＳを含まない培地（ＤＭＥＭ（ＦＢＳ－））に交換し，９６マルチウェルプレートに５００ｃｅｌｌｓ／９０ｕＬ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し，インキュベーター内（３７℃，ＣＯ_２５％）で，２４時間培養した。その後，各ウェルに１０ｕＬのＰＲＰ（２０倍希釈（ＰＲＰ１／２０），４０倍希釈（ＰＲＰ１／４０），又は８０倍希釈（ＰＲＰ１／８０）），ＰＰＰ，又は対照としてＤＭＥＭ（ＦＢＳ（－））を添加し，４８時間培養した。培養後，Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁科学研究所社製）を加え，呈色反応を行った。反応後，マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定し，細胞増殖性を調べた。結果を図４に示した。

　図４は，ＰＲＰが骨芽細胞様細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の細胞増殖に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図４の縦軸は，波長４５０ｎｍでの吸光度の値を示す。すなわち，縦軸の値が高いほど骨芽細胞の増殖が良い，すなわち骨再生促進効果があることを示す。図４の結果より，対照となる細胞（ＤＭＥＭを添加）と比較して，ＰＲＰを添加した細胞は，濃度依存的に細胞増殖が良いことが示された。すなわち，ＰＲＰの濃度依存的に，骨再生促進効果が高くなることがわかる。

　テトラポッド型骨補填剤（Ｔｅｔｏｒａ　Ｂｏｎｅ）と多血小板血漿（ＰＲＰ）の共培養特性　
　実施例４では，表面処理剤（トレハロース）に浸漬したテトラポッド型骨補填剤が，多血小板血漿（ＰＲＰ）による骨再生促進効果に与える影響について検討した。

　トレハロース水溶液に浸漬した（以下，「Ｔｒｅ（＋）」と略す）テトラポッド型骨補填剤（テトラボーン）を用いて，多血小板血漿（ＰＲＰ）との共培養による細胞増殖性を調べた。対象として，トレハロース水溶液に浸漬していない（以下，「Ｔｒｅ（－）」と略す）テトラポッド人工骨を用いた。細胞は，実施例１と同様に，骨芽細胞様細胞であるＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１をコンフルエントになるまで培養した後，培養培地にＦＢＳを含まない培地（ＤＭＥＭ（ＦＢＳ－））に交換し，９６マルチウェルプレートに５００ｃｅｌｌｓ／９０ｕＬ／ｗｅｌｌとなるように細胞を播種し，インキュベーター内（３７℃，ＣＯ_２５％）で，２４時間培養した。その後，各ウェルに１０ｕＬのＰＲＰ（２０倍希釈（ＰＲＰ１／２０））と所定の個数（０，２，４，８個）のテトラポッド型骨補填剤を添加し，４８時間培養した。培養後，Ｃｅｌl　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８（同仁科学研究所社製）を加え，呈色反応を行った。反応後，マイクロプレートリーダーを用いて吸光度（４５０ｎｍ）を測定し，細胞増殖性を調べた。結果を図５に示した。

　　図５は，トレハロース水溶液に浸漬したテトラポッド型骨補填剤（テトラボーン）が，ＰＲＰが有する細胞増殖能に与える影響を示した図面に替わるグラフである。図５の縦軸は波長４５０ｎｍでの吸光度の値を示す。すなわち，縦軸の値が高いほど細胞増殖が良い，すなわち骨再生促進効果があることを示す。図５の結果より，Ｔｒｅ（－）の人工骨とＴｒｅ（＋）の人工骨を比較すると，Ｔｒｅ（＋）の骨補填剤の方が，細胞増殖が良いことが示された。よって，Ｔｒｅ（＋）の骨補填剤を用いることで，効果的にＰＲＰの骨再生効果を得ることができることがわかった。さらに，図５では，テトラポッド骨補填剤の数が多い方が，細胞増殖が良いことが示された。よって，表面処理剤を浸透させた骨補填剤は，細胞増殖のための良好な足場となりえ，ＰＲＰと併用することによって効果的に骨再生効果を促進することができると考えられる。

　以上より，骨補填剤を表面処理剤に浸漬することにより，細胞増殖が促進されることが示された。すなわち，表面処理剤を浸透した骨補填剤は，効果的に骨再生を促進することができる。さらに，骨補填剤を表面処理剤に浸漬することにより，効果的にＰＲＰの骨再生効果を得ることができるばかりでなく，骨再生効果を促進することができることが示された。

　骨補填剤の表面処理が生体における骨再生に与える影響の検討
　骨補填剤への表面処理が生体における骨再生にどのような影響を与えるかを調べるため，ラット大腿骨欠損モデルを作製して，表面未処理テトラポッド型骨補填剤もしくはトレハロースによって表面処理を施したテトラポッド型骨補填剤を骨欠損部に埋植し，骨再生の程度を組織学的解析によって評価した。ラット(メス,１０．５～１２．５週齢)の大腿骨に作製した欠損部(直径２ｍｍ,深さ２．５ｍｍ)にテトラポッド型骨補填剤１１～１２個を埋植し，１週間後安楽殺させ，欠損部を含んだ大腿骨を採材した。試料をホルマリンで固定した後，プランクリュクロを用いて脱灰し，組織切片を作製した。組織切片はヘマトキシリンエオジンによって染色をした。そして，骨再生の程度を評価するために，骨補填剤に囲まれており，さらに骨が最終的に新生される部位に着目し，組織画像上に１００個のマス目(１メモリの径が２５μｍ)を持つ網を設定して骨再生が行われていると確認できるマスの数を測定した（図６Ｂ，図６Ｄ）。その結果を図６に示した。

　図６は，骨補填剤への表面処理が生体内における骨再生に与える影響を示した図面に替わる写真である。図６Ａは，表面処理していないテトラポッド型骨補填剤を移植したラット大腿骨の組織切片を示す図面に替わる写真である。図６Ｂは，図６Ａに示した組織切片の拡大写真に，１００個のマス目を持つ網を設定した図面に替わる写真である。図６Ｃは，表面処理したテトラポッド型骨補填剤を移植したラット大腿骨の組織切片を示す図面に替わる写真である。図６Ｄは，図６Ｃに示した組織切片の拡大写真に，１００個のマス目を持つ網を設定した図面に替わる写真である。

　結果，表面処理を施したテトラポッド型骨補填剤では豊富な骨再生が確認された（図６Ｃ，図６Ｄ）(図６Ｄ中，矢印で示されている箇所が，骨再生が見られた箇所)）が，未処理のテトラポッド型骨補填剤を用いた場合では骨再生は見られなかった（図６Ａ，図６Ｂ）。

　さらに，試行回数を増やして同様の解析を行い，骨再生について統計処理した。試行回数は，未処理のテトラポッド型骨補填剤の移植個体について２４回，表面処理したテトラポッド型骨補填剤について１８回である。その結果を図７に示した。図７の縦軸は，再生された骨量（新生人工骨量）を示す。図７の結果より，骨補填剤の表面処理が有意に骨再生を促進させることが示された(図７)。この結果は，骨再生に必要な因子の骨補填剤表面への過度な吸着が，表面処理を施すことによって防がれていると考えることができる。

　以上より，表面処理剤に浸漬した骨補填剤を用いることによって，骨再生が促進されることが示された。すなわち，表面処理剤が浸透した骨補填剤は，骨再生に必要な因子が骨補填剤に吸着することが抑えられている。よって，表面処理剤が浸透した骨補填剤は，効果的に骨再生を促進することができることが示された。

　本発明の骨補填剤は，骨変形部位，骨欠損部位，又は骨粗鬆症部位などに注入し，又は骨欠損部位などに充填として利用されうる。よって，本発明の骨補填剤は，医薬産業などの分野で利用される。

１１　　骨補填剤
１２　　突起部
１３　　先端部

Claims

　カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨と；
　前記骨補填剤用人工骨に塗布された表面処理剤，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された表面処理剤と；
　を含む骨補填剤であって，
　前記表面処理剤により成長因子の吸着性を制御し，これにより骨補填剤が投与された際に骨補填剤用人工骨に成長因子が吸着されてその成長因子の活性が阻害される事態を防止できる，
　骨補填剤。
　前記成長因子が，前記骨補填剤を投与した投与部位に湿潤する体液中に含まれる骨成長因子である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記成長因子が，多血小板血漿に含まれる成長因子である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記カルシウム系物質を含む骨補填剤用人工骨は，
　焼結された焼結体である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記骨補填剤用人工骨と前記表面処理剤の重量比が１×１０^２：１～１×１０¹⁰：１である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記カルシウム系物質は，
　　水酸アパタイト，炭酸アパタイト，β－ＴＣＰ，α－ＴＣＰ，メタリン酸カルシウム，リン酸四カルシウム，リン酸水素カルシウム，リン酸二水素カルシウム，ピロリン酸カルシウム，炭酸カルシウム，硫酸カルシウム，それらの塩，又はそれらの溶媒和物から選択される１種又は２種以上の混合物である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記骨補填剤用人工骨は；
　　顆粒状人工骨，ブロック状人工骨，オーダーメイド人工骨，歯根用インプラント，又は硬化型人工骨のいずれかである，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記骨補填剤用人工骨は；
　　顆粒状であり，
　　複数の突起を有し，
　　前記骨補填剤用人工骨を収容できる球の直径の大きさが，１×１０^－２ｍｍ～５ｍｍである，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記表面処理剤は，
　　キレート剤，キャッピング剤，カップリング剤，又は架橋剤のいずれか１種又は２種以上の混合物である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記表面処理剤は，キレート剤であり，
　前記キレート剤は,鎖状ポリリン酸キレート剤，グルコン酸，アスパラギン酸，エチレンジアミン四酢酸，メタリン酸，クエン酸，リンゴ酸，ニトリロ三酢酸，及びメチルグリシン二酢酸，等からなる郡より選ばれる１種又は２種以上のキレート剤の混合物である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記表面処理剤は，キャッピング剤であり，
　前記キャッピング剤は，
　　アミノ酸，ペプチド，多糖類，二糖類，レクチン，プロテオグリカン，糖タンパク，及び糖脂質のいずれか１種以上のキャッピングを含む，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記表面処理剤は，カップリング剤であり，
　前記カップリング剤は，アルミネート系カップリング剤，チタノール系カップリング剤，又はシラノール系カップリング剤，である，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記表面処理剤は，トレハロース，セリン，又はデキストランである，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記表面処理剤は，トレハロースである，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記骨補填剤は，
　さらに，前記骨補填剤用人工骨に塗布された骨成長剤，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された骨成長剤を含む，
　請求項１に記載の骨補填剤。
　前記骨補填剤は，
　さらに，前記骨補填剤用人工骨に塗布された多血小板血漿，又は前記骨補填剤用人工骨に浸漬された多血小板血漿を含む
　請求項１に記載の骨補填剤。
　骨補填剤用人工骨に表面処理剤を浸透させる工程と；
　前記表面処理剤を浸透させた骨補填剤用人工骨に，骨成長剤を含ませる工程と；
　を含む，骨補填剤の製造方法であって，

　前記骨補填剤用人工骨に表面処理剤を浸透させる工程は，
　　骨補填剤用人工骨に表面処理剤を塗布するか，又は骨補填剤用人工骨を表面処理剤の溶液に浸漬する工程であり，

　前記骨成長剤を含ませる工程は，
　　前記表面処理剤が塗布又は浸漬された骨補填剤用人工骨に，骨成長剤を塗布するか，
　又は，
　　前記表面処理剤が塗布又は浸漬された骨補填剤用人工骨を，骨成長剤の溶液に浸漬する工程であり，

　前記骨補填剤用人工骨は，カルシウム系物質を含む，

　骨補填剤の製造方法。
　骨補填剤と，表面処理剤と，多血小板血漿と，多血小板血漿調整用の容器を含む医療用キットであって，

　前記医療用キットを使用する際に，

　前記多血小板血漿用の容器に前記表面処理剤と前記多血小板血漿を収容し，
　前記骨補填剤を前記収容させた表面処理剤と前記多血小板血漿に浸漬させるか，又は前記多血小板血漿用の容器に収容された表面処理剤及び多血小板血漿を前記骨補填剤に塗布し，これにより前記多血小板血漿を前記骨補填剤に含ませ，
　前記表面処理剤により多血小板血漿による成長因子の吸着性を制御し，これにより骨補填剤が投与された際に骨補填剤用人工骨に成長因子が吸着されてその成長因子の活性が阻害される事態を防止する，

　医療用キット。