JP2006350005A - 共焦点顕微鏡システム - Google Patents

Abstract

【課題】 試料を３次元的に繰返し測定する場合に、１立体の画像取込みが終了した後、指定のＺ位置のスライス画像をライブ画像として表示することができる共焦点顕微鏡システムを実現する。
【解決手段】 共焦点スキャナに入力されるレーザ光を顕微鏡の対物レンズを介して試料に照射すると共に、前記対物レンズの焦点位置を焦点方向にシフトさせながら試料からの戻り蛍光を結像させた共焦点画像を３次元スライス画像として取り込む共焦点顕微鏡システムにおいて、
３次元測定のサイクルタイム毎の休止期間中に前記対物レンズの焦点位置を焦点方向における指定のＺ位置にシフトさせ、このＺ位置での前記試料のスライス画像を表示するＺ位置画像処理手段を備える。
【選択図】 図１

Description

本発明は、共焦点スキャナに入力されるレーザ光を顕微鏡の対物レンズを介して試料に照射すると共に、タイムラプス周期毎に前記対物レンズの焦点位置を焦点方向にシフトさせながら試料からの戻り蛍光を結像させた共焦点画像を３次元スライス画像として取り込む共焦点顕微鏡システムに関する。

図４は、従来の共焦点顕微鏡システムの構成例を示す機能ブロック図である。１は高速ビデオカメラであり、ＣＣＤセンサ１ａを有する。２は共焦点スキャナであり、ダイクロイックミラー２ａを有する。３は顕微鏡、４はアクチュエータであり、対物レンズ５を焦点方向にシフト操作する。６はステージであり、観察対象の試料７が搭載されている。

８は画像処理手段であり、試料の長時間変化を計測するために、タイムラプス的に画像を取り込む。高速ビデオカメラ１からのビデオ信号ＶＳをタイムラプス周期でサンプルして取り込み、画像処理を実行して画像データベース９に保存する。１０はタイムラプス周期設定手段であり、ビデオ信号ＶＳに同期して周期設定値ｔで設定される画像取り込み指令信号ＳＴを画像処理手段８に出力する。

１１は任意波形発生器であり、タイムラプス周期設定手段１０からの画像取り込み指令信号ＳＴを入力し、ＳＴの取得毎に一定ステップ増加して、所定ステップまで増加すると元のレベルに戻る三角波の走査信号ＳＣをアクチュエータドライバ１２に出力し、対物レンズ５のアクチュエータ４をＺ軸方向に走査させる。ＭＰはアクチュエータドライバ１２の操作信号である。

高速ビデオカメラ１、共焦点スキャナ２、顕微鏡３、アクチュエータ４、及び、対物レンズ５は、同じ光軸上に配置される。共焦点スキャナ２は、２万個のピンホールを持つニポウディスク、及び、それに対応するマイクロレンズアレイを有し、シンプルな光学系から成るニポウディスク方式が採用されるアドオンタイプであり、顕微鏡３のカメラポートに取り付けることにより、手持ちの顕微鏡３を共焦点顕微鏡にグレードアップすることができる。ニポウディスク方式の共焦点スキャナの詳細は、特許文献２に開示されている。

共焦点スキャナ２に入射されたレーザ光Ｒは、ダイクロイックミラー２ａで反射して、顕微鏡３、アクチュエータ４、対物レンズ５を経由して試料７に照射される。試料７からの戻り蛍光は、同一経路をダイクロイックミラー２ａまで戻り、これを透過して高速ビデオカメラのＣＣＤセンサ１ａに共焦点画像を結像する。

アクチュエータ４は、顕微鏡３の対物レンズレボルバーと対物レンズ５との間に取り付けられ、ピエゾ駆動により操作信号ＭＰのレベルに比例して画像の焦点方向（Ｚ方向）の長さが変化し、対物レンズ５の焦点位置を制御する。共焦点顕微鏡は、操作信号ＭＰに基づいて、焦点をシフトさせる走査により、試料７のスライス画像を取得する。

１３は、取得した試料７のスライス画像をリアルタイムに表示するためのライブ画像表示手段であり、モニタ１４を介してオペレータ１５は、ライブ画像を観察することができる。

図５は、３次元測定のサイクルタイム毎の対物レンズ５のＺ方向シフト制御を説明するタイムチャートである。この図では、第１回目の測定と次の測定サイクルタイムでの第２回目の測定を示している。各サイクルタイムは、測定期間と休止期間が略５０％ずつ配分されている。

第１回目の測定開始時刻Ｔ１１では、対物レンズの焦点位置は試料の底部以下の下限レベルＬ１にシフトされている。操作信号ＭＰに基づく対物レンズのＺ方向制御により、時間と共に対物レンズの焦点位置は上方にシフト制御され、１立体の測定が完了して試料の頂部以上の上限レベルＬ２まで制御された後に所定の勾配で下限レベルＬ１に戻され、これが測定終了時刻Ｔ１２となる。この時刻より所定の休止期間を経て次のサイクルタイムで第２回目の測定が時刻Ｔ１２よりＴ２２まで実行され、休止期間を経て以下同様の手順で繰り返される。

共焦点顕微鏡システムに関連する先行技術文献としては次のようなものがある。

特開２００２−７２１０２号公報

ニポウディスク方式の共焦点スキャナに関連する先行技術文献としては次のようなものがある。

特開平５−６０９８０号公報

従来の共焦点顕微鏡システムにおける対物レンズのＺ方向シフト制御では、次のような問題点がある。
（１）３次元長時間タイムラプス測定の場合、図５に示すように、１立体の測定が完了した後、次回の測定のために、対物レンズの焦点位置を測定開始位置のレベルＬ１に戻して休止期間をおくようにしている。この時、ライブ画面上に表示されるのは、測定終了位置（下限レベルＬ１）における画像であり、往々重要でない情報である。

（２）３次元繰り返し測定中の表示は、測定面の表示のみであるため、測定速度が遅い場合は、Ｚ方向の変化に付随するライブ画像が見えて３次元の測定中であることは分かるが、着目したいＺ位置の変化がオペレータには追従できないので、測定全体の良否が分からない。

（３）このため、測定が全て終了後、３次元構築した画像での判断となるため、判断に長い時間がかかる。また、貴重なサンプルの場合は、やり直しが利かず、大変な機会損失となっている。この背景には、例えば、測定環境の温度変化によって、顕微鏡筐体が熱膨張し、対物レンズの位置が実験開始直後と実験終了後で異なり、狙った試料の位置がずれてしまうことがあるが、このようなトラブルをリアルタイムで把握して対応処置をとることができない。

従って本発明が解決しようとする課題は、試料を３次元的に繰返し測定する場合に、１立体の画像取込みが終了した後、指定のＺ位置のスライス画像をライブ画像として表示することができる共焦点顕微鏡システムを実現することにある。

このような課題を達成するために、本発明の構成は次の通りである。
（１）共焦点スキャナに入力されるレーザ光を顕微鏡の対物レンズを介して試料に照射すると共に、前記対物レンズの焦点位置を焦点方向にシフトさせながら試料からの戻り蛍光を結像させた共焦点画像を３次元スライス画像として取り込む共焦点顕微鏡システムにおいて、
３次元測定のサイクルタイム毎の休止期間中に前記対物レンズの焦点位置を焦点方向における指定のＺ位置にシフトさせ、このＺ位置での前記試料のスライス画像を表示するＺ位置画像処理手段を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡システム。

（２）前記Ｚ位置画像処理手段は、前記対物レンズの焦点位置のシフト範囲の中間点を前記指定のＺ位置とすることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡システム。

（３）前記Ｚ位置画像処理手段は、前記対物レンズの焦点位置のシフト範囲の任意位置を前記指定のＺ位置とすることを特徴とする（１）に記載の共焦点顕微鏡システム。

（４）前記Ｚ位置画像処理手段は、前記試料の３次元スライス画像の取り込みと同期してＺ位置画像をリアルタイムのライブ画像として表示することを特徴とする（１）乃至（３）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。

（５）前記Ｚ位置画像処理手段は、前記試料の所定時間以上にわたる３次元測定中おける前記Ｚ位置画像に基づいて前記試料の褪色を検出したときに、測定中止指令を出力することを特徴とする（１）乃至（４）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。

（６）前記共焦点スキャナは、ニポウディスク方式であることを特徴とする（１）乃至（５）のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。

以上説明したことから明らかなように、本発明によれば次のような効果がある。
（１）１立体の３次元測定が終了後、指定Ｚ位置のスライス画像をライブ表示して、測定が正しかったか否かをオペレータがリアルタイムで判断できることで、測定の間、経時的に、立体毎の同じ断面の画像を比較できる。これにより、例えば、環境温度変化による焦点位置のずれによる急激な画像変化を監視することができ、対策を打つことができる。

（２）また、指定のＺ位置を試料の中央位置とすることで、常に中央位置のスライス画像を観察することによって、長時間測定の間に試料の蛍光が褪色したら、測定を中止する指令を出力することができる。

（３）従来システムでは、全ての測定が終了した後、初めて測定が妥当だったかどうかを判断する時、アクシデントがあった場合、やり直しが利かずに大変な機会損失となっていたが、本発明によれば、アクシデントは発生時点で把握可能でり、重大な機会損失を回避することができる。

以下、本発明を図面により詳細に説明する。図１は本発明を適用した共焦点顕微鏡システムの一実施形態を示す機能ブロック図である。図４で説明した従来システムと同一要素には同一符号を付して説明を省略する。以下、本発明の特徴部につき説明する。

図１において、１００は本発明で導入されたＺ位置画像処理手段であり、波形制御手段１０１、Ｚ位置画像ライブ表示手段１０２、褪色監視手段１０３を備えている。波形制御手段１０１は、タイムラプス周期設定手段１０からの画像取り込み信号ＳＴを入力して制御信号ＭＺを任意波形発生器１１に出力する。

図２は、図５と対応して示した、測定のサイクルタイム毎の対物レンズ５のＺ方向シフト制御を説明するタイムチャートである。図５との相違点は、休止期間における対物レンズ５のＺ位置制御にあり、この制御を波形制御手段１０１からの制御信号ＭＺにより、任意波形発生器１０で実行する。

第１回目の測定開始時刻Ｔ１１では、対物レンズの焦点位置は試料の底部以下の下限レベルＬ１にシフトされている。操作信号ＭＰに基づく対物レンズのＺ方向制御により、時間と共に対物レンズの焦点位置は上方にシフトされ、１立体の測定が完了した後試料の頂部以上の上限レベルＬ２まで制御された後に所定の勾配で下限レベルＬ１に戻され、これが測定終了時刻Ｔ１２となる。ここまでの操作は従来システムと同じである。

この終了時刻Ｔ１２より次のサイクルタイムの測定開始時刻Ｔ２１までの休止期間において、対物レンズの焦点位置を試料の所定のスライスレベルＬ３（指定のＺ位置）にシフトさせ、このＺ位置でのスライス画像を、画像処理手段８を経由してＺ位置画像ライブ表示手段１０２に渡し、モニタ１４でオペレータ１５が観察可能とする。次のサイクルタイムでも同様な処理を実行する。

所定スライスレベルＬ３（指定のＺ位置）は、波形制御手段１０１への設定値ＳＺにより任意レベルに設定可能であり、例えば測定範囲の中間位置のレベルを指定し、試料の中央部のスライス画像を表示できる

このように、本発明では、１立体の測定が終了後、指定Ｚ位置、例えば、測定範囲の中間位置の画像を表示して、測定が正しかったか否かをオペレータがライブ画像を監視してリアルタイムで判断できるので、測定結果の信頼を確保することが可能となる。また、立体毎の測定後、表示するＺの位置を任意に変えることができる。

図３は、Ｚ位置画像処理手段１００の信号処理手順を示すフローチャートである。ステップＳ１で条件設定のルーチンがスタートすると、ステップＳ２で１立体の３次元測定が実行された後に、ステップＳ３で繰り返し測定の終了がチェックされる。終了でなければステップＳ４に進む。

ステップＳ４では、ライブ表示するＺの位置を取得し、ステップＳ５で指定位置のスライス画像を表示してステップＳ６に進む。ステップＳ６では、サイクルタイムに達したか否かがチェックされ、達していなければステップＳ４に戻る。サイクルタイムに達していれば、ステップＳ２に戻る。ステップＳ３で繰り返し測定が終了であればステップＳ７で処理ルーチンを終了する。

褪色監視手段１０３は、Ｚ位置画像ライブ表示手段１０２から渡されるライブ画像を監視し、試料の蛍光画像の褪色が所定レベルを超えたときに測定中止指令を出力してシステムを停止することで無駄な画像取り込みを防止することができる。この機能は、オペレータ１５の目視判断に委ねることも可能である。

本発明において、高速ビデオカメラ１はこれに限定されるものではなく、通常のカメラ手段でもよい。また、共焦点スキャナ２も、ニポウディスク方式に限定されるものではない。

実施形態のように、タイムラプス周期より十分短い撮像周期を有する高速ビデオカメラとニポウディスク方式の共焦点スキャナの組み合わせによれば、ニポウディスクの回転同期制御、画像処理手段によるビデオ信号の取得の開始タイミング及び光学制御系による対物レンズの焦点位置の走査開始タイミングが、すべてビデオ信号に同期することになり、共焦点画像の位置精度が向上し、複数のスライス画像を取得する際に個々の取得時間のばらつきがなくなるので、信頼性の高いスライス画像が得られる。

本発明を適用した共焦点顕微鏡システムの一実施形態を示す機能ブロック図である。 測定のサイクルタイム毎の対物レンズのＺ方向シフト制御を説明するタイムチャートである。 Ｚ位置画像処理手段の信号処理手順を示すフローチャートである。 従来の共焦点顕微鏡システムの構成例を示す機能ブロック図である。 測定のサイクルタイム毎の対物レンズのＺ方向シフト制御を説明するタイムチャートである。

符号の説明

１ 高速ビデオカメラ
１ａ ＣＣＤセンサ
２ 共焦点スキャナ
２ａ ダイクロイックミラー
３ 顕微鏡
４ アクチュエータ
５ 対物レンズ
６ ステージ
７ 試料
８ 画像処理手段
９ 画像データベース
１０ タイムラプス周期設定手段
１１ 任意波形発生器
１２ アクチュエータドライバ
１４ モニタ
１５ オペレータ
１００ Ｚ位置画像処理手段
１０１ 波形制御手段
１０２ Ｚ位置ライブ画像表示手段
１０３ 褪色監視手段

Claims (6)

1. 共焦点スキャナに入力されるレーザ光を顕微鏡の対物レンズを介して試料に照射すると共に、前記対物レンズの焦点位置を焦点方向にシフトさせながら試料からの戻り蛍光を結像させた共焦点画像を３次元スライス画像として取り込む共焦点顕微鏡システムにおいて、
   ３次元測定のサイクルタイム毎の休止期間中に前記対物レンズの焦点位置を焦点方向における指定のＺ位置にシフトさせ、このＺ位置での前記試料のスライス画像を表示するＺ位置画像処理手段を備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
2. 前記Ｚ位置画像処理手段は、前記対物レンズの焦点位置のシフト範囲の中間点を前記指定のＺ位置とすることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡システム。
3. 前記Ｚ位置画像処理手段は、前記対物レンズの焦点位置のシフト範囲の任意位置を前記指定のＺ位置とすることを特徴とする請求項１に記載の共焦点顕微鏡システム。
4. 前記Ｚ位置画像処理手段は、前記試料の３次元スライス画像の取り込みと同期してＺ位置画像をリアルタイムのライブ画像として表示することを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
5. 前記Ｚ位置画像処理手段は、前記試料の所定時間以上にわたる３次元測定中おける前記Ｚ位置画像に基づいて前記試料の褪色を検出したときに、測定中止指令を出力することを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
6. 前記共焦点スキャナは、ニポウディスク方式であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の共焦点顕微鏡システム。
   

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