JP4128256B2 - 走査型レーザ顕微鏡 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料に対してレーザビームを走査しながら照射し、該試料からの光を検出することで画像情報を得るようにした走査型レーザ顕微鏡に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
走査型レーザ顕微鏡は、レーザビームなどの点光源を対物レンズを介して試料のＸ軸、Ｙ軸方向に走査しながら照射し、試料からの蛍光または反射光を再び対物レンズ、光学系を介して光検出器で検出し、２次元像の濃淡情報を得、この濃淡情報の２次元の分布を、点光源のＸ−Ｙ走査位置に対応させてＣＲＴモニタやカラープリンタなどの画像出力装置に輝点の分布として表示することにより画像情報として観察できるようにしている。
【０００３】
また、このような走査型レーザ顕微鏡には、検出器を有する検出光学系の試料と共役な位置に、照明光あるいは被測定光の回折限界程度の径を持つ絞りを設けることによって、焦点の合っている面の情報のみを検出可能にした共焦点走査型レーザ顕微鏡も知られている。
【０００４】
このような共焦点走査型レーザ顕微鏡では、合焦面の情報のみを検出できるため、試料に傷を付けることなく、光学的に断層像、つまり３次元情報が得られ、しかも、非合焦面の情報をカットすることで、非常にシャープな像が得られるという特徴を持っている。
【０００５】
ところで、一般的な光学顕微鏡では、非合焦面の情報の変化から、目的とする試料位置が現在の焦点位置から上下方向のいずれに有るか、大まかに見当付けることができる。例えば、特開昭５９−１８２４０９号公報や特開昭６４−４２４１６号に開示される光学顕微鏡は、デフォーカス量つまり非合焦面からの情報を用いて素早く合焦させるオートフォーカス機能が取付けられており、それにより簡単に合焦位置を得ることができる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上述した共焦点走査型レーザ顕微鏡では、光学顕微鏡のような非合焦面の情報が得られないため、目的とする試料を合焦位置に移動させるには、オペレータの経験と作業時間を要するという問題があった。
【０００７】
そのため、例え上述した光学顕微鏡と同様の原理のオートフォーカス機能を共焦点顕微鏡に取付けようとしても、共焦点走査型レーザ顕微鏡では、非合焦面の情報を得ることができないために適用することができない。
【０００８】
また、このような共焦点走査型レーザ顕微鏡では、点光源を試料面上で走査することで、２次元情報を画像化しているため、１枚の画像を得るのに１秒から数秒もの時間がかかり、さらに合焦位置の検索を困難にしている。
【０００９】
そこで、従来、合焦位置の検索を少しでも容易に行えるようにするため、１画面当たりの走査本数を減少させることで、１画像の取得に要する時間を短縮するなどの方法が考えられている。ところが、これまで用いられている方法では、走査により取得した画像を表示しながら試料の位置を調整するようにしているため、操作時間の短縮が十分でなく、また、試料に対して不必要に光を照射するようになるため試料に対してダメージを与えるなどの問題があった。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたもので、簡単かつ迅速に合焦位置を得ることができる走査型レーザ顕微鏡を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
ところで、一般に、走査型レーザ顕微鏡に用いられるスキャナとしては、ガルバノメータミラー（以下ガルバノ）が用いられる。このガルバノの走査の直線性を考慮すると、数百Ｈｚ以下の低い繰り返し周波数で駆動することが求められるが、走査線数が数百本から数千本程度である画像の取得には、上述したように１秒から数秒の時間が必要となる。しかし、走査の直線性を無視した場合、ガルバノは、通常の画像取得時の数倍から十倍程度の周波数まで駆動信号に応答可能である。また、試料が合焦位置にある場合は、大きな測定信号が得られのに対し、試料が非合焦位置にある場合は、測定信号が無信号である。
【００１１】
以上の点に着目して、本発明では、以下のように構成している。
請求項１記載の発明は、試料に対してレーザビームを走査しながら照射し、該試料からの光量に応じた検出信号から画像情報を得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、前記試料に対するレーザビームの走査速度を切換え制御可能にするとともに、前記試料が非合焦位置にあると、該試料が合焦位置にある場合に比べ、前記点光源の走査速度を高速に切換える走査速度制御手段を有し、この走査速度制御手段の高速制御の下で、前記試料に対する検出信号に基づいて前記試料の合焦位置を設定するようにしている。
【００１２】
請求項２記載の発明は、請求項１記載において、さらに、試料からの検出信号として走査範囲内の平均的な光量を得るためのフィルタ手段を有している。
請求項３記載の発明は、請求項１記載において、さらに、試料からの検出信号から前記試料の合焦位置を検出する合焦位置検出手段と、この合焦位置検出手段の検出出力に応じて前記試料に対する焦点位置を調整する焦点位置調整手段とを有している。
【００１３】
この結果、請求項１記載の発明によれば、通常の画像取得に比べて高速な更新時間で試料からの検出信号を得られるので、敏速な合焦操作を行うことができ、しかも、試料に対し不必要な光の照明時間を短くできる。
【００１４】
請求項２記載の発明によれば、試料上の走査範囲内での平均的な光量を検出信号として得られるので、的確な合焦操作を行うことができる。
請求項３記載の発明によれば、操作者の経験を必要としていた合焦操作をすべて自動化することができる。
【００１５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。
（第１の実施の形態）
図１は、本発明が適用される共焦点走査型レーザ顕微鏡の概略構成を示している。
【００１６】
この場合、レーザ発振器１からのレーザビーム（照明光）をビームエキスパンダ２を通して、ビームスプリッタやダイクロイックミラーなどの光路分割素子３で反射させ、ガルバノなどを用いたＸ方向スキャナ４およびＹ方向スキャナ５に入射させ２次元走査するように偏向させ、さらにＹ方向スキャナ５を出射したレーザビームを瞳投影レンズ６、結像レンズ７を介して対物レンズ８に入射させ、試料９面を２次元走査させるようにしている。
【００１７】
そして、試料９からの蛍光（または反射光）をレーザビームと同じ光路をたどって光路分割素子３に戻し、今度は、この光路分割素子３、共焦点光学系１０を透過させ、ダイクロイックミラーや干渉フィルタなどの波長選択素子１１を介して光電変換回路１２で受光するようにしている。
【００１８】
ここでは、簡単のため、光電変換回路１２が一つの場合を示しているが、複数の波長選択素子１１と光電変換回路１２により複数の蛍光波長を測定可能としたものにも適用できる。
【００１９】
光電変換回路１２は、波長選択素子１１を介して受光した試料９からの蛍光（または反射光）を輝度情報を示す電気信号に変換するもので、この輝度情報をローパスフィルタ１３を介してＡ／Ｄ変換回路１４でデジタルデータに変換してデータ処理装置１５に試料９に対する検出信号として入力するようにしている。ここで、ローパスフィルタ１３は、後述するＸ方向スキャナ４の駆動波形の周波数と同等あるいはそれ以下で、Ｙ方向スキャナ５の駆動波形の周波数以上のカットオフ周波数を有するものが用いられる。
【００２０】
データ処理装置１５は、Ａ／Ｄ変換回路１４からのデジタルデータを処理した後、ＣＲＴモニター１６に画像情報を表示させるようにしている。また、データ処理装置１５は、試料９が焦点位置にある場合と非焦点位置にある場合のそれぞれＡ／Ｄ変換回路１４から与えられる輝度情報の変化に応じて走査制御装置１７に指令を与え、走査駆動回路１８、１９の動作設定を制御させるようにしている。ここで、走査駆動回路１８は、Ｘ方向スキャナ４を駆動するためのもので、ス走査駆動回路１９は、Ｙ方向スキャナ１９を駆動するためのものである。
【００２１】
次に、このように構成した実施の形態の動作を説明する。
まず、試料９が焦点の合った位置に配置されている状態で、通常の画像を取得する場合を説明する。
【００２２】
この場合、走査制御装置１７の指示により、走査駆動回路１８には、図２（ａ）に示すような４００Ｈｚ程度のＸ方向スキャナ４の駆動波形を出力する波形データが書き込まれ、同時に走査駆動回路１９には、同図（ｂ）に示すようなＹ方向スキャナ５の駆動波形を出力する波形データが書き込まれる。
【００２３】
この状態で、レーザ発振器１からレーザビームが発せられると、ビームエキスパンダ２を通して、光路分割素子３で反射され、Ｘ方向スキャナ４およびＹ方向スキャナ５で２次元走査され、瞳投影レンズ６、結像レンズ７、そして対物レンズ８を通って試料９面で２次元走査される。
【００２４】
この場合、Ｘ方向スキャナ４およびＹ方向スキャナ５による試料９での走査は、図４（ａ）に示すように試料９面の上方から下方に向けて、一方向の走査線が順次走査されるようになる。
【００２５】
この状態で、試料９からの蛍光（または反射光）は、レーザビームと同じ光路をたどって光路分割素子３に戻され、光路分割素子３、共焦点光学系１０、さらには波長選択素子１１を介して光電変換回路１２で受光され、上述のＸ−Ｙ走査に同期された輝度情報を示す電気信号に変換され、さらにローパスフィルタ１３介してＡ／Ｄ変換回路１４でデジタルデータに変換され、データ処理装置１５で、２次元画像情報として処理された後、ＣＲＴモニター１６に表示される。
【００２６】
このような一連の動作は、試料９が焦点の合っている状態、つまり合焦していることが条件であり、Ａ／Ｄ変換回路１４からは、試料９の輝度情報が出力データとして出力され、データ処理装置１５によりＣＲＴモニター１６に画像情報が表示されている。
【００２７】
ところが、試料９が焦点の合っていない状態、つまり非合焦点位置にあると、Ａ／Ｄ変換回路１４への入力は無入力状態となり、これに伴いＣＲＴモニター１６上には画像が表示されなくなる。
【００２８】
操作者は、画像が表示されなくなったこと、つまり非合焦位置にあることを認識すると、走査制御装置１７に対して走査駆動回路１８に、上述した通常の画像取得の場合と比べて十分高速な繰り返し周波数の駆動波形、ここでは、図３（ａ）に示す１ＫＨｚ程度のＸ方向スキャナ４の駆動波形を出力する波形データを書き込み、同時に走査駆動回路１９に、同図（ｂ）に示すＹ方向スキャナ５の駆動波形を出力する波形データを書き込ませる操作を行う。また、無入力状態をデータ処理装置１５が自動的に認識し、上記指示を走査操作制御装置１７に行なうようにしてもよい。この場合のＸ方向スキャナ４の駆動波形は、ガルバノの特性を考慮して正弦波のような対称性の高い波形により繰り返し周波数を上げることが望ましい。
【００２９】
この状態から走査駆動回路１８、１９によりＸ方向スキャナ４およびＹ方向スキャナ５の高速走査を開始すると、レーザ光源１からのレーザビームは、図４（ｂ）に示すように試料９面で２次元走査され、これにともない光電変換回路１２からの電気信号がＡ／Ｄ変換回路１４に入力される。
【００３０】
この場合、Ａ／Ｄ変換回路１４の入力側には、Ｘ方向スキャナ４の駆動波形の周波数と同等あるいはそれ以下で、Ｙ方向スキャナ５の駆動波形の周波数以上のカットオフ周波数を有するローパスフィルタ１３が設けられることにより、Ａ／Ｄ変換回路１４からの出力データは、Ｘ方向走査１ライン分ないしＹ方向走査１フレーム内の平均的な光量を表すことになる。
【００３１】
そして、データ処理装置１５により、これら１ライン分ないし１フレーム内の平均光量を示すデータの時間的変化をＣＲＴモニター１６に、例えば棒グラフや折れ線グラフとして表示する。
【００３２】
操作者は、これらグラフ内容を参照し、試料９を載置したステージあるいは対物レンズ８を光軸方向で移動し、試料９と対物レンズ８の相対距離を変化させながら合焦操作を行う。そして、合焦位置に達してＡ／Ｄ変換回路１４への入力が立ち上がると、この時のＡ／Ｄ変換回路１４の出力データの上昇に伴うＣＲＴモニター１６上に表示されたグラフの変化から、操作者は、試料が焦点位置に到達した合焦を認識することができる。
【００３３】
そして、この合焦状態から、走査制御装置１７より、走査駆動回路１８に図２（ａ）に示すＸ方向スキャナ４の駆動波形を出力する波形データを書き込むとともに、走査駆動回路１９に、同図（ｂ）に示すＹ方向スキャナ５の駆動波形を出力する波形データをそれぞれ書き込み、再びＸ方向スキャナ４およびＹ方向スキャナ５により試料９上でレーザビームを２次元走査させることにより、ＣＲＴモニター１６に試料９の２次元画像情報を表示させる。
【００３４】
従って、このようにすれば、走査制御装置１７によりＸ方向スキャナ４およびＹ方向スキャナ５による試料９に対するレーザビームの走査速度を切換え可能にするとともに、試料９が非合焦位置にあると、この試料９が合焦位置にある場合に比べ、レーザビームの走査速度を高速に切換えるようにし、この高速制御の下で、試料９に対する検出信号に基づいて試料９と対物レンズ８の相対距離を変化させながら試料９の合焦位置を設定するようにしたので、通常の画像取得に比べて数倍から十倍程度もの高速な更新時間で試料９からの検出信号が得られ、敏速な合焦操作を行うことができる。この場合にＹ方向スキャナ５の駆動波形の周波数を上げることで、Ｘ方向スキャナ４の走査密度を下げるようにすれば、さらに走査の高速化を得られるので、さらに敏速な合焦操作を実現できる。この結果として、試料９に対し不必要な光の照明時間を短くできるので、試料９に対してダメージを与えるような不都合も回避できる。
【００３５】
また、Ｘ方向スキャナ４の駆動波形の周波数と同等あるいはそれ以下で、Ｙ方向スキャナ５の駆動波形の周波数以上のカットオフ周波数を有するローパスフィルタ１３を設けることにより、試料９の検出信号は、Ｘ方向走査１ライン分ないしＹ方向走査１フレーム内の平均的な光量として得られるので、さらに的確な合焦操作を行うことができる。
【００３６】
なお、Ｙ方向スキャナ５の駆動波形の周波数を変えることで、Ｘ方向スキャナ４の走査密度を任意に変化できることから、測定対象に応じてＹ方向スキャナ５の駆動波形の周波数を任意に設定できるようにしてもよい。
（第２の実施の形態）
第１の実施の形態では、操作者は、１ラインまたは１フレーム内の平均光量を示すグラフを参照しながら合焦操作を行うようにしているため、操作に対してある程度の経験が必要であった。
【００３７】
そこで、この第２の実施の形態では、合焦動作を自動化したものである。
図５は、本発明の第２の実施の形態の概略構成を示すもので、図１と同一部分には同符号を付して説明を省略する。
【００３８】
この場合、試料９と対物レンズ８の焦点位置を相対的に移動させる焦点位置調整手段２０と、Ａ／Ｄ変換回路１４からの出力データから合焦位置を判断する合焦位置検出手段２１を設けて、これら焦点位置調整手段２０と合焦位置検出手段２１により合焦操作の自動化を実現している。
【００３９】
ところで、一般的な顕微鏡では、観察対象の試料をステージに載置し、試料と対物レンズの焦点位置との相対位置を調整するため焦準機構が設置されている。特に、正立型顕微鏡では、対物レンズを上下に移動することで、試料と対物レンズの焦点位置との相対位置を調整するようにしているが、これらの調整動作を電動化するため、駆動源としての電動モータや圧電素子を用いたピエゾアクチュエータが通常用いられている。
【００４０】
この第２の実施の形態では、焦点位置調整手段２０での試料９と対物レンズ８の焦点位置との相対位置を調整するたるの駆動源として、上述のピエゾアクチュエータが用いられる。また、合焦位置検出手段２１は、Ａ／Ｄ変換回路１４から出力される測定信号に応じたデジタルデータと、予め設定された合焦検出レベルとを比較する機能を有し、Ａ／Ｄ変換回路１４からの測定信号に応じたデータが合焦検出レベル以上になった位置を合焦位置として、合焦検出信号を焦点位置調整手段２０に出力するようにしている。なお、合焦位置検出手段２１は、図示破線で示すようにＡ／Ｄ変換回路１４の入力側に接続して、Ａ／Ｄ変換回路１４に入力されるアナログ信号から合焦位置を検出するようにもできる。
【００４１】
このような構成において、合焦位置を検出するには、この場合も、走査制御装置１７から高速な走査波形が指示され、走査駆動回路１８、１９によりＸスキャナ４およびＹスキャナ５が高速走査を開始する。すると、焦点位置調整手段２０では、最初に、試料９と対物レンズ８の相対距離を離れる方向に移動し、所定距離離れた所で、今度は、一定の速度で試料９と対物レンズ８の相対距離を近付けて行く。この時の移動速度は、共焦点効果による光学的な深さ（Ｚ）方向の分解能、Ｘスキャナ４およびＹスキャナ５での走査速度、ローパスフィルタ１４のカットオフ周波数などにより適宜調整する必要があるが、具体的には、Ｙ方向スキャナ５が１フレーム分走査する間に、Ｚ方向の分解能と同等あるいは、その数倍の移動速度が望ましい。
【００４２】
この状態で、試料９と対物レンズ８との間の距離が近付いていって、試料９の一部が焦点位置に入ってＡ／Ｄ変換回路１４の出力データに変化が現れると、合焦位置検出手段２１では、Ａ／Ｄ変換回路１４の測定信号に応じたデータと予め設定された合焦検出レベルとを比較し、この時のデータが合焦検出レベル以上になると、この位置を合焦位置と判断し、合焦検出信号を焦点位置調整手段２０に出力する。これにより、焦点位置調整手段２０は、このときの合焦検出信号により試料９と対物レンズ８の相対距離の移動を停止する。また、この合焦検出信号によりスキャン制御装置１７は、高速走査を停止し、通常の画像取得のための走査を開始するようになり、第１の実施の形態で述べたようにＣＲＴモニタ１６には、試料９面が表示されるようになる。
【００４３】
従って、このようにすれば、これまで、ある程度操作者の経験を必要としていた合焦操作を自動化できるので、さらに敏速かつ確実な合焦操作を実現できる。
なお、上述した実施の形態では、ガルバノメータミラーについて述べたが、音響光学系スキャナを用いたものにも適用することができる。
【００４４】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、通常の画像取得に比べて高速な更新時間で試料からの検出信号を得られるので、敏速な合焦操作を行うことができ、しかも、試料に対し不必要な光の照明時間を短くできるので、試料に対してダメージを与えるような不都合も回避できる。
【００４５】
また、試料上の走査範囲内での平均的な光量を検出信号として得られるので、的確な合焦操作を行うことができる。
さらに操作者の経験を必要としていた合焦操作をすべて自動化することができるので、さらに敏速かつ確実な合焦操作を実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施の形態の概略構成を示す図。
【図２】第１の実施の形態のＸ、Ｙ方向スキャナの駆動波形を示す図。
【図３】第１の実施の形態のＸ、Ｙ方向スキャナの駆動波形を示す図。
【図４】第１の実施の形態の動作を説明するための図、
【図５】本発明の第２の実施の形態の概略構成を示す図。
【符号の説明】
１…レーザ発振器、
２…ビームエキスパンダ、
３…光路分割素子、
４…Ｘ方向スキャナ、
５…Ｙ方向スキャナ、
６…瞳投影レンズ、
７…結像レンズ、
８…対物レンズ、
９…試料、
１０…共焦点光学系、
１１…波長選択素子、
１２…光電変換回路、
１３…ローパスフィルタ、
１４…Ａ／Ｄ変換回路、
１５…データ処理装置、
１６…ＣＲＴモニター、
１７…走査制御装置、
１８、１９…走査駆動回路、
２０…焦点位置調整手段、
２１…合焦位置検出手段。

Claims (3)

1. 試料に対してレーザビームを走査しながら照射し、該試料からの光量に応じた検出信号から画像情報を得るようにした走査型レーザ顕微鏡において、
   前記試料に対するレーザビームの走査速度を切換え制御可能にするとともに、前記試料が非合焦位置にあると、該試料が合焦位置にある場合に比べ、前記点光源の走査速度を高速に切換える走査速度制御手段を有し、
   この走査速度制御手段の高速制御の下で、前記試料に対する検出信号に基づいて前記試料の合焦位置を設定することを特徴とする走査型レーザ顕微鏡。
2. さらに、試料からの検出信号として走査範囲内の平均的な光量を得るためのフィルタ手段を有することを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。
3. さらに、試料からの検出信号から前記試料の合焦位置を検出する合焦位置検出手段と、この合焦位置検出手段の検出出力に応じて前記試料に対する焦点位置を調整する焦点位置調整手段とを有することを特徴とする請求項１記載の走査型レーザ顕微鏡。

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