JP2004184699A

JP2004184699A - 共焦点顕微鏡装置

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Publication number: JP2004184699A
Application number: JP2002351577A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Ishida; 英之石田
Original assignee: Tokai University; Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Tokai University; Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-12-03
Filing date: 2002-12-03
Publication date: 2004-07-02
Anticipated expiration: 2022-12-03
Also published as: JP3612538B2

Abstract

【課題】より試料の光軸方向走査の位置制御の精度を向上する。
【解決手段】Ｚ軸走査制御装置９は、入力する垂直同期信号ｂに同期して、各映像フレームの撮像期間中にパルスを所定数、アクチエータ８に移動制御信号ｃとして出力する。また、入力する垂直同期信号をカウントし、所定カウントに達したならば、パルス出力を停止し、リセット信号ｄをアクチュエータ８に出力する。アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９から入力する移動制御信号のパルスを積分し、垂直同期信号の期間は一定値を保ち、映像フレームの撮像期間は一様に増加する駆動信号ｅ（ｆ）を生成し、この駆動信号によって対物レンズ７をＺ方向に移動する。
【選択図】図２

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点顕微鏡装置において光軸方向の走査を制御する技術に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来の共焦点顕微鏡装置としては、たとえば、図５ａに模式的に構成を示すニポウ板型の共焦点顕微鏡装置が知られている。
図示するように、この共焦点顕微鏡装置は、レーザ光を試料２０上に集光させるためのマイクロレンズアレイ１０１及びピンホールアレイ１０２（ニポウ板）及び対物レンズ１０３と、対物レンズ１０３を光軸方向（図中Ｚ方向）に移動するためのアクチュエータ１０４と、集光レンズ１０５を備えたカメラ１０６と、対物レンズ１０３とピンホールアレイ１０２を通過した試料からの反射光の進路をカメラ１０６方向に変化させるビームスプリッタ１０７とを有している。
【０００３】
そして、このような構成において、対物レンズ１０３のＺ方向の位置によってレーザ光の集光点のＺ座標が制御され、マイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２を回転させることによりレーザ光の集光点のＸＹ座標が制御される。すなわち、対物レンズ１０３のＺ方向位置と、マイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２の回転角によって、カメラ１０６に撮影される試料２０中の走査点を３次元的に制御できるようになっている。
【０００４】
さて、このような共焦点顕微鏡装置における、従来の走査の技術としては、図５ｂに示すように、カメラ１０６の垂直同期信号に同期してマイクロレンズアレイ１０１とピンホールアレイ１０２を回転させながら、トリガ信号入力直後に発生したカメラの垂直同期信号に同期して、対物レンズ１０３をＺ座標増加方向に複数フレーム期間より長い期間一様に移動する動作を開始する技術が知られている（たとえば特開２００２−７２１０２号公報）。
【０００５】
この出願の発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある。
【０００６】
【特許文献１】
特開２００２−７２１０２号公報
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
前記従来の技術では、対物レンズ１０３の移動を開始するタイミングを垂直同期信号に同期させているが、移動開始後の移動は垂直同期信号とは非同期に行っている。このため、カメラ１０６で撮影する各映像フレームに対して、走査点のＺ方向位置を精度良く制御することが比較的困難である。より具体的には、Ｚ方向位置の移動を行いながら繰り返し撮影する場合において、Ｚ方向位置のずれが累積的に大きくなり、また、そのようなずれを確認、修正等、することができない。
【０００８】
さて、前記従来の技術は、常時Ｚ座標を変化させながらＸＹ方向の走査を行い各走査点を撮影していくものである。そして、このように常時Ｚ座標を変化させながら撮影する手法によれば、全てのＸＹ座標についても走査されないＺ座標点の発生を抑止することができ、Ｚ方向に微少な構造であっても撮影映像中に少なくとも、その部分が現れる確率を高めることができる。
【０００９】
しかしながら、この従来の技術では、カメラ１０６において撮影が行われない垂直同期信号期間等の同期信号期間も対物レンズ１０３の座標は一様に変化する。そして、同期信号期間に対物レンズ１０３の移動した範囲に対応する試料２０中のＺ座標範囲は全く撮影されないことになるため、この従来の技術によれば、Ｚ方向に微少な構造が欠落してしまう確率を充分に抑制することができない。
【００１０】
一方で、共焦点顕微鏡装置を適用する用途によっては、Ｚ座標を固定して試料のＸＹ平面を撮影した映像フレームを、異なるＺ座標のそれぞれについて生成したい場合がある。たとえば、このようにして生成された映像フレームの集合は、そのままＸＹＺ座標系を持つボクセルとなるため、試料２０の３次元解析などの処理に好適である。
【００１１】
しかしながら、前記従来の技術によれば、カメラ１０６における映像撮影期間中も常時Ｚ座標を変化させるために、Ｚ座標を固定して試料のＸＹ平面を撮影した映像フレームを生成することができない。
そこで、本発明は、共焦点顕微鏡装置において、より試料の光軸方向走査の位置制御の精度を向上することを課題とする。また、併せて本発明は、共焦点顕微鏡装置において、微少な構造を撮影映像中に捉えることのできる確率を高めることを課題とする。また、さらに本発明は、共焦点顕微鏡装置において、光軸方向座標を固定して試料の光軸と垂直な平面を撮影した映像フレームを、異なる光軸方向座標のそれぞれについて生成することを課題とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
前記課題達成のために、本発明は、光ビームの焦点位置を試料に対して光軸と垂直な方向に走査する共焦点スキャナと、前記光ビームの焦点位置を試料に対して光軸方向に走査する移動機構と、試料の前記光ビームによる像を撮像するカメラと、前記カメラの垂直同期信号に同期して、垂直同期信号毎に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させる移動制御部とを備えた共焦点顕微鏡装置を提供する。
【００１３】
このような共焦点顕微鏡装置によれば、個々の垂直同期信号に同期して光ビームの焦点位置の移動を行うようので、光軸方向に関して、各映像フレーム毎に走査点を必ず一定の座標範囲内に収めることができる。したがって、焦点位置の光軸方向位置のずれが累積することはなく、試料の光軸方向走査を、より精度よく制御することができるようになる。
【００１４】
また、本発明は、このような共焦点顕微鏡装置において、前記移動制御部によって、少なくとも前記カメラの垂直同期信号期間中は、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を一定に保たせ、前記カメラの垂直同期信号期間を少なくとも除く期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させるようにしたものである。
【００１５】
このように、撮像が行われない垂直同期信号期間中には走査点の光軸方向への移動を行わないようにすることにより、撮影対象から欠落してしまう光軸方向の座標範囲の発生を小さく抑えることができる。したがって、微少な構造を撮影映像中に捉えることにできる確率を向上することができる。
また、本発明は、このような共焦点顕微鏡装置において、前記移動制御部によって、少なくとも前記カメラの画素撮像期間中は、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を一定に保たせ、前記カメラの画素撮像期間を少なくとも除く期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
【００１６】
このように画素撮像期間中を少なくとも除く期間にのみ走査点の光軸方向の移動を行うことにより、光軸方向座標を固定して試料の光軸と垂直な平面を撮影した映像フレームを、異なる光軸方向座標のそれぞれについて生成することができるようになる。
【００１７】
なお、この場合には、前記移動制御部において、前記カメラの垂直同期信号期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させるようにしても良い。
また、以上の共焦点顕微鏡装置には、前記カメラの撮像と並行して、前記カメラによって撮像された像より前記試料の３次元表現による像を再構成して表示すると共に、前記カメラによって新たに撮像された像によって前記３次元表現による像を更新する表示手段を備えることが好ましい。このようにすることにより、試料の３次元表現による像を、所謂リアルタイムに観察することができるようになる。
【００１８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態について説明する。
図１に本実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の構成を示す。
図示するように、共焦点顕微鏡装置は、本体部１、試料２０を載置するステージ２、レーザ光源３、共焦点スキャナユニット４、通信規格としてＩＥＥＥ１３９４を採用した６６フレーム／秒倍速カメラ等の高速なカメラ５、カメラ５にイメージ増強や高速シャッタ機能などを付加するイメージインテンシファイヤ６、対物レンズ７、対物レンズ７を光軸方向に移動するアクチュエータ８、Ｚ軸走査制御装置９、ビデオキャプチャインタフェースを備えたコンピュータ等である画像処理装置１０、表示装置１１とを有している。そして、共焦点スキャナユニット４には、前述したマイクロレンズアレイや、ピンホールアレイや、ビームスプリッタや、マイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する回転制御部が収容されている。
【００１９】
また、本共焦点顕微鏡装置は、照明光源１２を備えており、この照明光源１２と、本体部１に収容された光学系とより光学顕微鏡装置としても機能するようになっている。
以下、本共焦点顕微鏡装置における、走査制御について説明する。
図２に、本共焦点顕微鏡装置の走査シーケンスを示す。
本走査シーケンスは、図ａに示すＺ軸走査制御装置９が出力するＴＲＩＧＥＲ信号によって開始される。カメラ５は、ＴＲＩＧＥＲ信号を外部トリガ信号として入力し、図ｂに示すようにＴＲＩＧＥＲ信号に垂直同期信号を同期させ、撮影を開始する。
【００２０】
また、カメラ５の垂直同期信号ＶＳＹＮＣは、共焦点スキャナユニット４とＺ軸走査制御装置９に出力される。そして、共焦点スキャナユニット４の回転制御部は、入力する垂直同期信号ＶＳＹＮＣに同期して、各映像フレームの撮像期間毎に１回ＸＹ全域の走査を行うようにマイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する。ここで、撮像期間とは、１映像フレーム期間のうちの、垂直同期信号期間を少なくとも除く期間を指す。なお、撮像期間には水平同期信号期間や、水平同期信号期間や垂直同期信号期間の前後にある画素を撮像しない期間を含めないようにしてもよい。
【００２１】
一方、Ｚ軸走査制御装置９は、図ｃに示すように、入力する垂直同期信号ＶＳＹＮＣに同期して、各映像フレームの撮像期間中に所定周期のパルスを所定数アクチュエータに、移動制御信号ＣＮＴとして出力するステージを実行する。また、入力する垂直同期信号ＶＳＹＮＣをカウントし、所定カウントに達したならば、パルス出力を停止し、図ｄに示すようにリセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力するステージを実行する。そして、次の垂直同期信号ＶＳＹＮＣが入力したならば、以上と同様に、所定数の映像フレーム期間、各映像フレームの撮像期間中に所定数の所定周期のパルスを移動制御信号ＣＮＴとしてアクチュエータ８に出力するステージと、１映像フレーム期間パルス出力を停止すると共に、リセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力するステージとよりなるシーケンスを繰り返す。
【００２２】
一方、アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９から入力する移動制御信号ＣＮＴのパルスを積分し、図ｅ、ｆに示すように、垂直同期信号ＶＳＹＮＣの期間は一定値を保ち、映像フレームの撮像期間は一様に増加する駆動信号を生成し、この駆動信号によって対物レンズ７をＺ方向に移動する。なお、ここでは、対物レンズ７の移動量は、駆動信号の大きさに比例するものとしている。もし、対物レンズ７の移動量が、駆動信号の大きさにリニアに比例しない場合は、対物レンズ７が、垂直同期信号ＶＳＹＮＣの期間は移動せず、映像フレームの撮像期間は一様に移動するような波形を持つ駆動信号を生成するようにする。なお、対物レンズ７を移動する機構としては、ピエゾ素子を用いた機構などを用いることができる。
【００２３】
そして、アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９からリセット信号ＲＳＴが入力したならば、駆動信号を初期値に戻す。
以上の動作によって、試料２０中の走査点と各映像フレームとの関係は、図ｇに示すようになる。すなわち、各映像フレーム期間（図ではＴ１〜Ｔ８）のそれぞれにおいて、各映像フレーム期間毎に異なるＺ座標範囲内の映像が撮影される。ここで、本実施形態では、以上のように映像フレームの撮像期間にのみ対物レンズ７をＺ方向に移動する。したがって、いずれのＸＹ座標についても全く撮影されないＺ座標範囲の発生は少ない。
【００２４】
さて、図１に戻り、画像処理装置１０は、カメラ５から出力される各映像フレームＶＩＤＥＯを取り込み記憶すると共に、合成して表示装置１１に表示する処理を繰り返す。ここで、画像処理装置１０には、Ｚ軸走査制御装置９からＴＲＩＧＥＲ信号のタイミングなどを表すタイミング信号が供給されており、画像処理装置１０はこのタイミング信号に従って、各映像フレームとその映像フレームに撮像された試料２０の走査面のＺ方向の順番との対応を認識し、認識した順番に従って各映像フレームを合成又は配置して試料２０の３次元画像（ボクセル）を再構成し、３次元画像を適当なレンダリングアルゴリズム（たとえば、ボリュームレンダリング等）によって仮想的な２次元スクリーンに投影した３次元表現による画像を表示装置１１に表示する処理を繰り返す。すなわち、画像処理装置１０は、試料２０の３次元表現による画像のリアルタイム表示を行う。
【００２５】
以下、Ｚ軸走査制御装置９の一構成例について説明する。
図３に、Ｚ軸走査制御装置９の構成例を示す。
以下、図２に示した走査シーケンスにおいて、Ｚ軸走査制御装置９が、所定数Ｎの映像フレーム期間、各映像フレームの撮像期間中に所定数Ｍの所定周期Ｔのパルスを移動制御信号ＣＮＴとしてアクチュエータ８に出力するステージと、１映像フレーム期間パルス出力を停止すると共に、リセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力するステージとよりなるシーケンスを繰り返すものとして説明する。
【００２６】
さて、図３中において、シーケンス制御部９１は、画像処理装置１０からの要求やユーザ操作等に応じて、前述したＴＲＩＧＥＲ信号を生成する。
第１カウンタ９２は、ＴＲＩＧＥＲ信号でリセットされ、垂直同期信号ＶＳＹＮＣを０からカウントする。第１デコーダ９３は、第１カウンタ９２のカウント値をデコードし、カウント値が所定値Ｎとなるとリセットイネーブル信号をリセット出力回路９４とマスク回路９５に出力し、カウンタリセット信号を第１カウンタ９２に出力する。リセット出力回路９４は、リセットイネーブル信号が入力すると、所定パルス長のリセット信号ＲＳＴを生成し、アクチュエータ８に出力する。また、第１カウンタ９２は、カウンタリセット信号が入力されると、次の垂直同期信号ＶＳＹＮＣの入力に同期して０にリセットされる。
【００２７】
第２カウンタ９６は、発振器９７の出力する所定周期Ｔのクロック信号を０からカウントする。第２デコーダ９８は、カウント値をデコードし、カウント値がＭとなるとパルスマスク信号をマスク回路９５に出力すると共に、停止信号を第２カウンタ９６に出力する。マスク回路９５は、第１デコーダ９３からリセットイネーブル信号が出力されておらず、かつ、第２デコーダ９８からパルスマスク信号が出力されていない期間のみ、発振器９７の出力する所定周期Ｔのクロック信号を移動制御信号ＣＮＴのパルスとしてアクチュエータ８に出力する。ここで第２カウンタ９６は、停止信号が入力されると垂直同期信号ＶＳＹＮＣが入力されるまでカウント動作を停止し、垂直同期信号ＶＳＹＮＣが入力されるとカウント値を０にリセットしてカウント動作を開始する。
なお、以上のＺ軸走査制御装置９の構成は一例に過ぎず、Ｚ軸走査制御装置９の構成としては他の構成を採用することもできる。たとえば、ＰＬＬを用いて垂直同期信号に同期した撮像期間の１／Ｍ周期のパルス信号を生成し、このパルスを撮像期間のみ移動制御信号ＣＮＴとして出力するような構成をとることもできる。また、Ｚ軸走査制御装置９をＣＰＵ回路として構成し、以上のＺ軸走査制御装置９の動作を、ソフトウエア的に実施するようにしてもよい。
【００２８】
さて、次に、アクチュエータ８における駆動信号の生成は、前述したようにＺ軸走査制御装置９から入力する移動制御信号ＣＮＴのパルスを積分することによって行う。この積分は、周知のアナログ積分回路によって行うようにしてもよいが、たとえば、図に示すような移動制御信号ＣＮＴのパルスをカウントするカウンタ８１と、カウンタ８１のカウンタ値をＤ／Ａ変換するＤ／Ａコンバータ８２と、Ｄ／Ａコンバータ８２の出力を増幅するドライバ回路８３などによっても構成することができる。なお、カウンタ８１は、Ｚ軸走査制御装置９から入力するリセット信号ＲＳＴでリセットされる。
【００２９】
以上、本発明の実施形態について説明した。
さて、以上の実施形態における共焦点顕微鏡装置においては、さらに、次のような走査シーケンスを実行するようにしてもよい。
図示するように、この走査シーケンスも、図ａに示すＺ軸走査制御装置９が出力するＴＲＩＧＥＲ信号によって開始される。カメラ５は、ＴＲＩＧＥＲ信号を外部トリガ信号として入力し、図ｂに示すようにＴＲＩＧＥＲ信号に垂直同期信号を同期させ、撮影を開始する。
【００３０】
カメラ５の垂直同期信号ＶＳＹＮＣは、共焦点スキャナユニット４とＺ軸走査制御装置９に出力される。そして、共焦点スキャナユニット４の回転制御部は、入力する垂直同期信号ＶＳＹＮＣに同期して、各映像フレームの撮像期間毎に１回ＸＹ全域の走査を行うようにマイクロレンズアレイとピンホールアレイを回転駆動する。
【００３１】
一方、Ｚ軸走査制御装置９は、図ｃに示すように、入力する垂直同期信号ＶＳＹＮＣに同期して、垂直同期信号期間中にパルスを移動制御信号ＣＮＴとしてアクチュエータ８に出力するステージを実行する。また、入力する垂直同期信号をカウントし、所定カウントに達したならば、移動制御信号ＣＮＴのパルス出力を停止し、図ｄに示すようにリセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力するステージを実行する。そして、次の垂直同期信号ＶＳＹＮＣが入力したならば、以上と同様に、所定数の映像フレーム期間、垂直同期信号期間にパルスを移動制御信号ＣＮＴとしてアクチュエータ８に出力するステージと、１映像フレーム期間移動制御信号ＣＮＴのパルス出力を停止すると共に、リセット信号ＲＳＴをアクチュエータ８に出力するステージとよりなるシーケンスを繰り返す。
【００３２】
アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９から入力する移動制御信号ＣＮＴのパルスを積分し、図ｅ、ｆに示すように、垂直同期信号期間に増加し、映像フレームの撮像期間は一定を保つ駆動信号を生成し、この駆動信号によって対物レンズ７をＺ方向に移動する。なお、ここでは、対物レンズ７の移動量は、駆動信号の大きさに比例するものとしている。
【００３３】
そして、アクチュエータ８は、Ｚ軸走査制御装置９からリセット信号ＲＳＴが入力したならば、駆動信号を初期値に戻す。
以上の動作によって、試料２０中の走査点と各映像フレームとの関係は、図ｇに示すようになる。すなわち、各映像フレーム期間（図ではＴ１〜Ｔ８）のそれぞれにおいて、各映像フレーム期間毎に映像フレーム毎に離間した特定のＺ座標を持つＸＹ平面の映像が撮影される。
以上のような走査シーケンスによれば、映像フレームの素直期間にのみ対物レンズ７をＺ方向に移動する。したがって、Ｚ座標を固定して試料２０のＸＹ平面を撮影した映像フレームを、異なるＺ座標のそれぞれについて生成することができる。
【００３４】
【発明の効果】
以上のように、本発明によれば、共焦点顕微鏡装置において、より試料の光軸方向走査の位置制御の精度を向上することができる。また、共焦点顕微鏡装置において、微少な構造を撮影映像中に捉えることのできる確率を高めることができる。また、共焦点顕微鏡装置において、光軸方向座標を固定して試料の光軸と垂直な平面を撮影した映像フレームを、異なる光軸方向座標のそれぞれについて生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施形態に係る共焦点顕微鏡装置の構成を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施形態に係る走査シーケンスを示す図である。
【図３】本発明の実施形態に係るＺ軸走査制御装置とアクチュエータの構成例を示すブロック図である。
【図４】本発明の実施形態に係る他の走査シーケンスを示す図である。
【図５】従来の共焦点顕微鏡装置の構成と走査シーケンスを示す図である。
【符号の説明】
１：本体部、２：ステージ、３：レーザ光源、４：共焦点スキャナユニット、５：カメラ、６：イメージインテンシファイヤ、７：対物レンズ、８：アクチュエータ、９：Ｚ軸走査制御装置、１０：画像処理装置、１１：表示装置、１２：照明光源、２０：試料、８１：カウンタ、８２：Ｄ／Ａコンバータ、８３：ドライバ回路、９１：シーケンス制御部、９２：第１カウンタ、９３：第１デコーダ、９４：リセット出力回路、９５：マスク回路、９６：第２カウンタ、９７：発振器、９８：第２デコーダ。

Claims

光ビームの焦点位置を試料に対して光軸と垂直な方向に走査する共焦点スキャナと、
前記光ビームの焦点位置を試料に対して光軸方向に走査する移動機構と、
試料の前記光ビームによる像を撮像するカメラと、
前記カメラの垂直同期信号に同期して、垂直同期信号毎に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させる移動制御部とを備えたことを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
請求項１記載の共焦点顕微鏡装置であって、
前記移動制御部は、少なくとも前記カメラの垂直同期信号期間中は、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を一定に保たせ、前記カメラの垂直同期信号期間を少なくとも除く期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
請求項１記載の共焦点顕微鏡装置であって、
前記移動制御部は、少なくとも前記カメラの画素撮像期間中は、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を一定に保たせ、前記カメラの画素撮像期間を少なくとも除く期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
請求項３記載の共焦点顕微鏡装置であって、
前記移動制御部は、前記カメラの垂直同期信号期間に、前記移動機構に前記光ビームの焦点位置を光軸方向に所定距離移動させることを特徴とする共焦点顕微鏡装置。
請求項１、２、３または４記載の共焦点顕微鏡装置であって、
前記カメラの撮像と並行して、前記カメラによって撮像された像より前記試料の３次元表現による像を再構成して表示すると共に、前記カメラによって新たに撮像された像によって前記３次元表現による像を更新する表示手段を有することを特徴とする共焦点顕微鏡装置。