JPH09189864A - 光走査型顕微鏡 - Google Patents

光走査型顕微鏡

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JPH09189864A
JPH09189864A JP8018366A JP1836696A JPH09189864A JP H09189864 A JPH09189864 A JP H09189864A JP 8018366 A JP8018366 A JP 8018366A JP 1836696 A JP1836696 A JP 1836696A JP H09189864 A JPH09189864 A JP H09189864A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 画像を取得したい範囲以外への光の照射を確
実かつ容易に阻止する。 【解決手段】 光ビームLBを発する光源2から試料4
までの光路中に配置され、光ビームLBが試料4へ向か
うのを阻止する遮光状態と光ビームLBが試料4へ向か
うのを許す透光状態とを切換えるAOM11と、スキャ
ナ制御回路20から得られる走査位置情報20aに基づ
き、スキャナ制御回路20による走査範囲内の所定の部
分領域でAOM11を透光状態にする制御回路30とを
備える。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】この発明は光走査型顕微鏡に
関する。
【0002】
【従来の技術】生物試料に光を照射し、生物試料に起き
る現象を観察する顕微鏡として光走査型顕微鏡が知られ
ている。
【0003】上記光走査型顕微鏡、例えばレーザ走査型
顕微鏡では、通常レーザ光を長方形や正方形のように2
次元的に走査するが、分解能を上げるためにレーザ光が
回折しない限界のスポットまで絞り、そのスポット径に
見合うように試料面上を走査するため、走査には高精度
に動作可能なスキャニングユニットとその制御装置とが
必要となる。
【0004】しかし、スキャニングユニットを用いてレ
ーザ光を走査する場合、走査の折り返し部で加速度が1
80゜変化し、機械式のスキャナを用いたときは、慣性
によってミラーのウォブリング、歪が発生し易いため、
走査制御が非常に難く、通常は画像を取得したい範囲よ
りもやや広めに走査し、スキャナの両端の折り返し部を
画像取得に使わないようにしている。
【0005】特に、レゾナントスキャナのように高速の
スキャナを用いたときは、加速度の変化が大きいため、
より広めに走査している。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】ところで、生物試料は
レーザ光のように強い光を受けると、退色を起こし、蛍
光量が落ちてしまうため、生物試料を蛍光観察する場
合、余計な光を生物試料に与えないことが重要である。
【0007】しかし、従来の光走査型顕微鏡において
は、上記したように画像を取得したい範囲よりもやや広
めに走査しているため、試料はどうしても画像を取得し
たい範囲を越えてレーザ光が照射され、画像を取得した
くない部分にまでダメージを与えてしまう。
【0008】この事態を解消するため、従来においては
スキャニングユニットと試料との間の一次結像面(試料
と共役な面)に画像を取得する範囲外を遮光するための
マスクを置いて試料が照射されないようにしていたが、
試料は様々な形状をしており各形状毎にマスクを用意す
るのは煩雑であり、マスクを正確に試料の形状に合わせ
るのは非常に困難である。また、試料に正確に合わせる
には複雑な機構を必要とするため調整が難しく、しかも
調整の間に余計なレーザ光を試料に照射してしまうとい
う問題があった。
【0009】この発明はこのような事情に鑑みてなされ
たもので、その課題は画像を取得したい範囲以外への光
の照射を確実かつ容易に阻止できる光走査型顕微鏡を提
供することである。
【0010】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
請求項1に記載の発明の光走査型顕微鏡は、光ビームを
発する光源と、試料上で前記光ビームを2次元的に走査
する走査手段と、前記試料からの光を検出する検出手段
と、この検出手段の出力と走査手段から得られる走査位
置情報に基づき前記試料の画像を得る画像取得手段とを
備えた光走査型顕微鏡において、前記光源から前記試料
までの光路中に配置され、前記光ビームが前記試料へ向
かうのを阻止する第1の状態と前記光ビームが前記試料
へ向かうのを許す第2の状態とを切換える光ビーム切換
手段と、前記走査手段から得られる走査位置情報に基づ
き、前記走査手段による走査範囲内の所定の部分領域で
前記光ビーム切換手段を前記第2の状態にする制御回路
とを備えることを特徴とする。
【0011】制御回路が走査位置情報に基づき走査範囲
内の所定の部分領域で光ビーム切換手段を第2の状態に
するので、画像を取得したい範囲と光ビームが照射され
る範囲が一致し、画像を取得したい範囲以外に光ビーム
が照射されない。また、走査手段による走査範囲は、光
ビームが照射される範囲より広いので、走査手段のスキ
ャン制御が容易であり、良好な画像を得ることができ
る。
【0012】請求項2に記載の発明の光走査型顕微鏡
は、前記画像取得手段は前記走査手段からの走査位置情
報に基づいて前記走査範囲内の少なくとも一部の領域を
画像取得領域とし、前記制御回路は、前記画像取得領域
を前記所定の部分領域とするように、前記走査手段から
の走査位置情報に基づいて前記光ビーム切換手段の切換
えを制御することを特徴とする。
【0013】制御回路が走査位置情報に基づき走査範囲
内の一部の領域を画像取得領域とするように光ビーム切
換手段を切換えるので、画像を取得したい範囲と光ビー
ムが照射される範囲が一致し、画像を取得したい範囲以
外に光ビームが照射されない。また、走査手段による走
査範囲は、光ビームが照射される範囲より広いので、走
査手段のスキャン制御が容易であり、良好な画像を得る
ことができる。
【0014】請求項3に記載の発明の光走査型顕微鏡
は、前記画像取得手段で得られる前記画像を表示するモ
ニタと、このモニタで表示された画像の少なくとも一部
の領域を指定する領域指定手段とを備え、前記制御回路
は、前記モニタの画面を構成する各画素に対応するデー
タメモリ部を有し、前記領域指定手段で指定された領域
内の全ての画素に対応するデータメモリ部の全てのアド
レスに、前記光ビーム切換手段を前記第2の状態にする
ためのデータを予め記憶しておき、前記走査手段からの
走査位置位置情報に対応する前記メモリ部のデータに基
づいて前記光ビーム切換手段を前記第2の状態に維持す
ることを特徴とする。
【0015】制御回路が走査位置位置情報に対応するメ
モリ部のデータに基づき走査範囲内の所定の部分領域で
光ビーム切換手段を第2の状態にするので、画像を取得
したい試料の形状に対応する範囲と光ビームが照射され
る範囲が一致し、画像を取得したい範囲以外の試料に光
ビームが照射されない。また、走査手段による走査範囲
は、光ビームが照射される範囲より広いので、走査手段
のスキャン制御が容易であり、良好な画像を得ることが
できる。
【0016】
【発明の実施の形態】以下、この発明の実施の形態を図
面に基づいて説明する。
【0017】図1はこの発明の第1実施形態に係るレー
ザ走査型顕微鏡のブロック構成図である。
【0018】レーザ走査型顕微鏡1は、光ビームを発す
る光源2と、ステージ3に載置された試料4上でレーザ
光LBを2次元的に走査させる水平スキャナ(例えば、
レゾナントスキャナ)5及び垂直スキャナ(例えば、ガ
ルバノスキャナ)6と、CPU7の画像取得開始指令7
aに基づいて水平スキャナ5及び垂直スキャナ6の駆動
を制御する走査手段であるスキャナ制御回路20と、試
料4の蛍光を検出し、入力した蛍光を光強度を表す信号
9aに変換する検出手段である蛍光検出器9と、蛍光検
出器9の信号9aとスキャナ制御回路20から得られる
走査位置情報20a(水平同期信号HD、垂直同期信号
VD、ピクセルクロックPC)に基づき試料4の画像化
を図る画像取得手段である画像処理回路10と、試料4
へ向かうレーザ光LBを遮断する遮光状態(第1の状
態)と試料4へ向かう光ビームLBを透光させる(第2
の状態)とに切換える光ビーム切換手段である高速シャ
ッタ、例えばAOM(音響光学変調器)11と、スキャ
ナ制御回路20から得られる走査位置情報20aに基づ
いてAOM11の遮光状態と透光状態を切換える制御回
路である切換制御回路30と、レーザ光と蛍光を分離す
るダイクロイックミラー13と、レーザ光をカットする
バリアフィルタ14とからなる。
【0019】なお、上記蛍光検出器9のサンプリング周
波数は10MHz程度である。
【0020】また、上記画像処理回路10は、A/D変
換素子、フレームメモリ、D/A変換素子等の画像化す
るための回路及びCPUからの操作で画像にラインを重
ね書きするためのオーバーレイメモリ回路からなる。
【0021】また、高速シャッタとしては、AOM11
に限られるものではなく、正確なサンプリング周波数や
遮光を得られるものであればよく、例えばEOM(El
ectro Optic Modulation)やM
OM(Magnetic Optic Modulat
ion)を用いることもできる。
【0022】レーザ光源2から照射されたレーザ光LB
は、AOM11を通過した後、ダイクロイックミラー1
3で反射され、水平スキャナ5及び垂直スキャナ6へ導
かれ、スキャナ制御回路20によって試料4上で2次元
走査される。レーザ光LBの照射によって励起され試料
4から発せられた蛍光は、レーザ光LBの光路を逆行
し、水平スキャナ5及び垂直スキャナ6でデスキャニン
グされ、ダイクロイックミラー13を透過し、レーザ光
と分離される。ダイクロイックミラー13を透過した蛍
光はバリアフィルタ14で完全に蛍光だけとなり、蛍光
検出器9に入射する。
【0023】図2はスキャナ制御回路の詳細ブロック図
であり、この図を参照してスキャナ制御回路の動作を説
明する。
【0024】スキャナ制御回路20は垂直同期信号発生
回路21と、垂直スキャナ駆動回路22と、水平同期信
号発生回路23と、水平スキャナ駆動回路24と、ピク
セルクロック発生回路25と、1水平ラインカウント回
路26と、1フレームカウント回路27とからなる。
【0025】垂直同期信号発生回路21は、システムを
コントロールしているCPU7から画像取得開始指令7
aを受けて垂直走査を開始させる垂直同期信号VDを出
力する。
【0026】垂直スキャナ駆動回路22は、垂直同期信
号VDを入力すると、垂直スキャナ6の駆動信号(ノコ
ギリ波)VDDを出力し、垂直スキャナ6を駆動する。
【0027】垂直同期信号発生回路21からの垂直同期
信号VDは同時に水平同期信号発生回路23に入力さ
れ、水平同期信号発生回路23は水平走査を開始させる
水平同期信号HDを出力する。
【0028】水平スキャナ駆動回路24は、水平同期信
号HDを入力し、水平スキャナ5の駆動信号(ノコギリ
波)HDDを出力し、水平スキャナ5を駆動する。
【0029】水平同期信号HDは同時にピクセルクロッ
ク発生回路25に入力し、ピクセルクロック発生回路2
5は蛍光データをサンプリングするピクセルクロックP
Cを画像処理回路10へ出力する。
【0030】1水平ラインカウント回路26は、水平同
期信号HDとピクセルクロックPCを入力し、水平同期
信号HDの入力に同期してピクセルクロックPCのカウ
ントを開始し、予め設定されたクロック数(1水平ライ
ンの1周期に当たるピクセルクロックの数、例えば54
0)をカウントし終えると、トリガ信号TR1を出力す
る。
【0031】水平同期信号発生回路23は、トリガ信号
TR1を入力すると、次のラインを走査するための水平
同期信号HDを出力する。
【0032】1フレームカウント回路27は、垂直同期
信号VDと水平同期信号HDとを入力し、垂直同期信号
VDの入力に同期して水平同期信号HDのカウントを開
始し、予め設定された数(1フレームの1周期に当たる
水平同期信号の数、例えば、500)をカウントし終え
ると、トリガ信号TR2を出力する。
【0033】垂直同期信号発生回路21はトリガ信号T
R2を入力すると、次のフレームの走査を開始し、垂直
同期信号VDを出力する。
【0034】スキャナ制御回路20は、上記のようにし
て、水平スキャナ5と垂直スキャナ6とを、例えば同期
信号発生器を用いて同期をとって駆動することでレーザ
光LBを2次元的に走査する。
【0035】この際、CPU7は水平スキャナ5及び垂
直スキャナ6が実際に画像を取得する範囲よりも広く
(540×500)レーザ光LBを走査するように画像
取得開始指令7aを出力している。したがって、走査の
折り返し付近の画像は画像を取得する範囲外となるた
め、ミラーのウォブリングや、ミラーの歪の影響を受け
ない。
【0036】図3は切換制御回路の詳細ブロック図であ
り、この図を参照して切換制御回路の動作を説明する。
【0037】切換制御回路30は有効水平同期信号カウ
ント回路(有効HDカウント回路と称する)31と、有
効ピクセルクロックカウント回路(有効PCカウント回
路と称する)32と、AOM駆動回路33とからなる。
【0038】有効HDカウント回路31は、垂直同期信
号VDと水平同期信号HDとを入力し、垂直同期信号V
Dの入力に同期して水平同期信号HDのカウントを開始
し、予め設定された数(画像として有効な垂直同期信号
の数、例えば、480)までカウントし、カウントして
いる間は、例えばHレベルのHDイネーブル信号HDE
を出力する。
【0039】一方、有効PCカウント回路32は、水平
同期信号HDとピクセルクロックPCとを入力し、水平
同期信号HDに同期してピクセルクロックをカウント
し、予め設定された数(画像として有効な1水平ライン
のピクセルクロックの数、例えば512)までカウント
し、カウントしている間は、例えばHレベルのピクセル
クロックイネーブル信号PCEを出力する。
【0040】AOM駆動回路33は、有効HDカウント
回路31及び有効PCカウント回路32の出力が共にH
レベルのとき、AOM11を透光状態に駆動する信号3
0aを出力する。
【0041】上記第1実施形態の光走査型顕微鏡によれ
ば、水平スキャナ5及び垂直スキャナ6は共に画像取得
範囲(512×480)以上に駆動されるが、実際にレ
ーザ光を走査する領域と画像をサンプリングする上記範
囲とを1画素もずれずに一致させることができ(画像取
得範囲以外は画像をサンプリングするピクセルクロック
に同期して制御されたAOM11で遮断される)、生物
試料の観察時、生物試料は観察したい領域を含む限られ
た範囲のみが照射されるため、試料は限られた範囲以外
はダメージを受けず、退色を防止できる。
【0042】図4はこの発明の第2実施形態に係るレー
ザ走査型顕微鏡のブロック構成図である。第1の実施形
態と同一部分については同一符号を付し、その説明を省
略する。
【0043】この実施形態の光走査型顕微鏡では、図1
の光走査型顕微鏡に画像処理回路10で得られる画像信
号10aを再生するモニタ40と、このモニタ40に表
示された画像の少なくとも一部の領域を指定するポイン
ティングデバイス(領域指定手段)16とが付加されて
いる。
【0044】モニタ40にはCRTが用いられ、画像処
理回路10は、画面を構成する画素に対応したバッファ
メモリを持ち、その内容をモニタ40に常に出力し繰り
返し表示する。なお、バッファメモリの内容は動的に変
更可能となっている。
【0045】ポインティングデバイス16は、例えばタ
ブレット(デジタイザ)、ライトペン、マウス等であ
り、CPU7に接続されており、画像処理回路10を介
してモニタ画面上の任意の1点を指示することができる
ようになっている。
【0046】図5は切換制御回路の詳細ブロック図であ
る。
【0047】切換制御回路30はピクセルクロックカウ
ンタ35、メモリ36、AOM駆動回路37からなる。
【0048】ピクセルクロックカウンタ35は、 垂直
同期信号VDとピクセルクロックPCとを入力し、垂直
同期信号VDの入力に同期してピクセルクロックPCの
カウント値をリセットし、ピクセルクロックPCのカウ
ントを開始し、そのカウント値35aを出力する。
【0049】メモリ36は、例えばRAMから構成さ
れ、画像の画素サイズと同じかそれ以上で1ビットデー
タが記憶できる容量を有し、画素単位でアドレスが定義
されており、CPU7によって画素と対応したアドレス
にシャッタコントロールデータ36aが後述する方法で
予め書込まれている。
【0050】このメモリ36は、ピクセルクロックPC
のカウント値35aをメモリのアドレスとして入力し、
インクリメントされたカウント値が入力する度に、アド
レスに書込まれている1ビットのシャッタコントロール
データ36aを出力する。
【0051】AOM駆動回路37は、シャッタコントロ
ールデータ36aを入力し、このシャッタコントロール
データ36aに基づいてAOM11の駆動する信号30
aを出力する。
【0052】次に、予め行われる上記メモリ36へのシ
ャッタコントロールデータの書き込みについて説明す
る。
【0053】図6はモニタ画面上に表示されたラスタス
キャンして取得された1フレームの蛍光画面を示す図、
図7はシャッタコントロールデータを記憶してあるメモ
リのマッピングデータを表す図である。なお、図7にお
いて、説明を簡略化するため、画素サイズを25×25
としている。
【0054】まず、1フレーム(1画像)だけラスタス
キャンして得た蛍光画面41の全体を図6に示すように
モニタ40上に表示させる。
【0055】次に、このモニタ40を見ながら、実際に
画像を取得したい領域をポインティングデバイス16を
用いてトレースし、図6に示すような軌跡42で囲まれ
た領域43を表示させる。
【0056】なお、表示させる領域は1つに限るもので
はなく、任意の数の領域を指定してもよい。
【0057】上記領域43を画像を取得したい範囲とす
るとき、CPU7は図7に示すように画素と対応したア
ドレスをたよりにメモリ36にアクセスし、AOM11
の透光状態又は遮光状態を示すシャッタコントロールデ
ータ36aをメモリ36に直接書込む。
【0058】図7において、 1 は透光状態にするこ
と、 0 は遮光状態にすることをそれぞれ表してい
る。
【0059】この第2の実施形態の光走査型顕微鏡によ
れば、水平スキャナ5及び垂直スキャナ6は共に画像取
得範囲(領域43)以上に駆動されるが、実際にレーザ
光LBが走査する範囲は、予め行われた走査に基づいて
メモリ36に記憶された領域43(この領域43以外は
画像をサンプリングするピクセルクロックの同期して制
御されたAOM11で遮断される)であり、画像をサン
プリングする範囲と1画素もずれずに一致させることが
できる、生物試料の観察時、生物試料は観察したい領域
のみに照射されるため、観察したい領域以外の試料はダ
メージを受けず、退色を防止できる。
【0060】なお、上記第1及び第2実施形態では、光
路に高速シャッタを配置することで試料への照射を制御
しているが、制御方法はこれに限るものではなく、例え
ば光ビームを光路外へ向けることで試料への照射を制御
するようにしてもよい。
【0061】
【発明の効果】以上に説明したように請求項1記載の発
明の光走査型顕微鏡によれば、走査手段による走査範囲
は光ビームが照射される範囲よりも広いので、走査手段
のスキャン制御が容易であり、良好な画像を得ることが
できるとともに、画像を取得したい範囲と光ビームが照
射される範囲とが一致するので、画像を取得したい範囲
以外に光ビームが照射されることによる試料への悪影響
を防ぐことができる。また、マスクに代えて光ビーム切
換手段を採用したので、煩雑なマスク作りやマスクの位
置合わせが不要となり、画像を取得したい範囲と光ビー
ムが照射される範囲とを一致させる作業が簡単になる。
【0062】請求項2記載の発明の光走査型顕微鏡によ
れば、走査手段による走査範囲は光ビームが照射される
範囲より広いので、走査手段のスキャン制御が容易であ
り、良好な画像を得ることができるとともに、画像を取
得したい試料を含む範囲と光ビームが照射される範囲が
一致するので、画像を取得したい範囲以外の試料に光ビ
ームが照射されることによる試料への悪影響を防ぐこと
ができる。また、マスクに代えて光ビーム切換手段を採
用したので、煩雑なマスク作りやマスクの位置合わせが
不要となり、画像を取得したい範囲と光ビームが照射さ
れる範囲とを一致させる作業が簡単になる。
【0063】請求項3に記載の発明の光走査型顕微鏡に
よれば、走査手段による走査範囲は光ビームが照射され
る範囲より広いので、走査手段のスキャン制御が容易で
あり、良好な画像を得ることができるとともに、画像を
取得したい試料の形状に対応する範囲と光ビームが照射
される範囲が一致するので、画像を取得したい範囲以外
の試料に光ビームが照射されることによる試料への悪影
響を防ぐことができる。また、マスクに代えて光ビーム
切換手段を採用したので、煩雑なマスク作りやマスクの
位置合わせが不要となり、画像を取得したい範囲と光ビ
ームが照射される範囲とを一致させる作業が簡単にな
る。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1はこの発明の第1実施形態に係るレーザ走
査型顕微鏡のブロック構成図である。
【図2】図2はスキャナ制御回路の詳細ブロック図であ
る。
【図3】図3は切換制御回路の詳細ブロック図である。
【図4】図4はこの発明の第2実施形態に係るレーザ走
査型顕微鏡のブロック構成図である。
【図5】図5は切換制御回路の詳細ブロック図である。
【図6】図6はモニタ画面上に表示されたラスタスキャ
ンして取得された1フレームの蛍光画面を示す図であ
る。
【図7】図7はシャッタコントロールデータを記憶して
あるメモリのマッピングデータを表す図である。
【符号の説明】
1 レーザ走査型顕微鏡 2 光源 3 ステージ 4 試料 5 水平スキャナ 6 垂直スキャナ 7 CPU 9 蛍光検出器 10 画像処理回路 11 AOM(音響光学変調器) 13 ダイクロイックミラー 14 バリアフィルタ 16 ポインティングデバイス 20 スキャナ制御回路 21 垂直同期信号発生回路 22 垂直スキャナ駆動回路 23 水平同期信号発生回路 24 水平スキャナ駆動回路 25 ピクセルクロック発生回路 26 1水平ラインカウント回路 27 1フレームカウント回路 30 切換制御回路 31 有効水平同期信号カウント回路(有効HDカウン
ト回路) 32 有効ピクセルクロックカウント回路(有効PCカ
ウント回路) 33 AOM駆動回路 35 ピクセルクロックカウンタ 36 メモリ 37 AOM駆動回路 40 モニタ 41 蛍光画面 42 軌跡 43 領域

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 光ビームを発する光源と、試料上で前記
    光ビームを2次元的に走査する走査手段と、前記試料か
    らの光を検出する検出手段と、この検出手段の出力と前
    記走査手段から得られる走査位置情報とに基づき前記試
    料の画像を得る画像取得手段とを備えた光走査型顕微鏡
    において、 前記光源から前記試料までの光路中に配置され、前記光
    ビームが前記試料へ向かうのを阻止する第1の状態と前
    記光ビームが前記試料へ向かうのを許す第2の状態とを
    切換える光ビーム切換手段と、 前記走査手段から得られる走査位置情報に基づき、前記
    走査手段による走査範囲内の所定の部分領域で前記光ビ
    ーム切換手段を前記第2の状態にする制御回路とを備え
    ることを特徴とする光走査型顕微鏡。
  2. 【請求項2】 前記画像取得手段は前記走査手段からの
    走査位置情報に基づいて前記走査範囲内の少なくとも一
    部の領域を画像取得領域とし、 前記制御回路は、前記画像取得領域を前記所定の部分領
    域とするように、前記走査手段からの走査位置情報に基
    づいて前記光ビーム切換手段の切換えを制御することを
    特徴とする請求項1に記載の光走査型顕微鏡。
  3. 【請求項3】 前記画像取得手段で得られる前記画像を
    表示するモニタと、このモニタで表示された画像の少な
    くとも一部の領域を指定する領域指定手段とを備え、 前記制御回路は、 前記モニタの画面を構成する各画素に対応するデータメ
    モリ部を有し、前記領域指定手段で指定された領域内の
    全ての画素に対応するデータメモリ部の全てのアドレス
    に、前記光ビーム切換手段を前記第2の状態にするため
    のデータを予め記憶しておき、前記走査手段からの走査
    位置情報に対応する前記メモリ部のデータに基づいて前
    記光ビーム切換手段を前記第2の状態に維持することを
    特徴とする請求項1に記載の光走査型顕微鏡。
JP01836696A 1996-01-09 1996-01-09 光走査型顕微鏡 Expired - Lifetime JP3694956B2 (ja)

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