JP2006113462A - 単粒子三次元位置追跡方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 ｘ、ｙ、ｚ座標系で構成される三次元空間に存在する粒子の運動を実時間で追跡することを可能にする共焦点顕微鏡システム、および、画像処理方法を提供すること。
【解決手段】 共焦点顕微鏡において、駆動部の粘性抵抗を高めたピエゾアクチュエータを使用して、対物レンズをステップ状に動かした時のオーバーシュートの減衰を早める。この手法により、ビデオフレームの撮影時間外で焦点を移動させ、撮影時間内では焦点を固定することで、鮮明な二次元切片を高速に取得することができ、三次元画像の実時間観測が可能になる。また、三次元空間に存在する粒子の像を三次元ガウス関数で近似し、継時的に粒子の重心位置を求めることで、三次元空間を運動する粒子を実時間で追跡することが可能になる。
【選択図】 図１

Description

本発明は、三次元測定領域に存在する粒子の位置、挙動および状態を三次元的に解析する方法およびそのような方法を行う装置および解析法に関する。

光学顕微鏡の結像面にビデオレートカメラを設置することで、試料を実時間で観察できる。共焦点顕微鏡によって、光学切片の薄い試料の断面像を取得できるので、光軸方向に対物レンズを走査し、取得した光学切片を光軸方向に並べることで、三次元画像を取得することができる。共焦点顕微鏡を用いて、ビデオレートカメラの垂直同期信号と同期させて、ピエゾアクチュエータにより対物レンズの焦点位置を制御して、三次元画像を得る技術は、特許文献１に開示されている。この技術は、前記ビデオレートカメラの撮影時間の間は対物レンズを固定させ、それ以外の時間に対物レンズを目的の位置に移動させることで、必要とする焦点位置での共焦点像をビデオフレームに合わせて取得できる。図２に示すように階段状に対物レンズを移動させ、得た共焦点像をz軸方向に重ねれば、三次元な画像が構築される。

従来、蛋白質機能解析の研究では、エバネッセント蛍光顕微鏡、あるいは、共焦点蛍光顕微鏡を用いて、観察の対象となる蛋白質に蛍光粒子を負荷し、蛍光粒子から発せられる信号から、蛍光粒子の位置、すなわち、蛋白質の位置を継時的に検出することで、前記蛋白質の挙動および状態を解析していた。この解析方法に関しては、特許文献２に開示されている。しかし、上記のように、通常のビデオ顕微鏡では、ある一片の光学切片しか得ることができないので、二次元における前記蛋白質の挙動および状態しか解析することができない。上記の技術のように、共焦点顕微鏡を用いて三次元画像を得る技術は存在するが、対物レンズを高速に駆動させる技術がないため、実時間で三次元画像を取得することはできない。

上記の様に蛋白質に蛍光粒子を付加させる場合、蛋白質の機能を損なわせないために、蛋白質と同等、あるいは、それよりも小さな蛍光粒子を用いる。回折限界よりも小さな蛍光粒子より発せられた光は、顕微鏡における実像としては、点ではなく、光強度がガウス分布に従う円となる。その蛍光粒子の位置を可視化画像から計算するために、従来は、デジタル画像の各画素における光強度を重みとした重み重心を求める。

細胞内、あるいは、細胞表面において、蛋白質の運動、つまり、蛍光粒子の運動を観察する場合には、細胞の自家蛍光により背景光に斑が生じる。従来、細胞内、あるいは、細胞表面で運動を行う粒子の重心位置を取得するためには、上記の重み重心を求めるため、まず、取得した画像から背景光、つまり、細胞の自家蛍光像を除く必要がある。従来は、画像全体にある閾値を儲け、各画素のピクセル値が閾値以外であれば、画像から除去する。残った画素が連続点を形成していれば、蛍光粒子の像であると判別する。
特開２００４−１８４６９９ 特開２００３−２９４６３１

蛋白質に標識として蛍光粒子を負荷させ、蛋白質の運動を観察するという実験は、すでに一般化されつつあるが、上記のように従来の技術では、光学顕微鏡下において、あるひとつの光学切片しか観察できないという問題があった。

ビデオレートカメラの垂直同期信号と同期させて、ピエゾアクチュエータにより対物レンズの焦点位置を制御して三次元画像を得る場合には、前記ビデオレートカメラの露光時間内はできる限り対物レンズの焦点位置は留めておかなければならない。上記の従来の方法は、ビデオレートカメラの露光時間外に対物レンズをステップ状に高速に移動させるという技術である。しかし、この技術のみでは、対物レンズの重量が原因で、駆動時にオーバーシュートを起してしまい、対物レンズが振動してしまうため、焦点が固定されず、得られた共焦点像がぼけてしまうという問題点がある。

回折限界よりも小さな蛍光粒子より発せられた光は、顕微鏡における二次元像としては、ガウス分布の広がりを持つ。蛍光粒子からフォトンが発せられる過程は確率的に発生するため、蛍光粒子は瞬くように光る。また、微弱な蛍光粒子の光を検出する場合にはイメージインテンシファイア等の増強管を通すため、各画素におけるショットノイズやジョンソンノイズが像に写り込む。さらに、細胞の自家蛍光や、顕微鏡内の迷光等が背景光となる。これらの理由から、上記蛍光粒子より発せられた光の像は、ガウス分布に背景光とランダムなノイズが付加した画像として撮影される。その為、上記の従来の解析方法では、蛍光色素の位置が正確ではない。

上記の蛍光粒子の二次元デジタル像がガウス分布に従うとし、ガウス関数で近似して重心を求める手法がある。近似計算には、マルカート法を用いるのが一般的である。計算機上で上記の近似計算を行う場合、反復計算を行うのだが、その初期値によっては解が収束しない、あるいは、別解に収束する場合がある。特に継時画像の場合には、フレーム毎に初期値を設定する必要があり、非効率である。

また、共焦点光学系で観測した場合に、回折限界よりも小さな蛍光粒子より発せられた光の強度は、光軸方向にもガウス分布の広がりを持つ。つまり、ｘ，ｙ，ｚ軸座標における蛍光粒子の光強度は、三次元的なガウス分布に従う。この場合には、近似による解のパラメータは少なくとも9つ存在する。上記のように蛍光粒子の二次元画像を二次元的なガウス関数で近似するよりさらに、解が発散する場合が多い。継時的に上記蛍光色素の重心位置を計算する場合には、確実に解が収束するための初期値の決定が必要である。

ｘ，ｙ，ｚ軸座標からなる測定領域の臨界に蛍光粒子が存在する場合、ガウス分布を構成する光のうちの一部が、測定領域外に存在するため、ガウス関数で近似する際に情報の欠落が生じ、正確な値が算出されない。その為、前記のように測定領域の臨界に存在する蛍光粒子の画像がから計算された、蛍光粒子の重心位置には信用性がない。

細胞内、あるいは、細胞表面において、蛋白質の運動、つまり、蛍光粒子の運動を観察する場合には、細胞の自家蛍光により背景光に斑が生じる。従来の方法では、細胞の自家蛍光が一様でないため、部位によっては蛍光粒子の像も閾値以下となってしまい、画像から除去されてしまう。

また、蛍光蛋白質、蛍光色素等の蛍光分子を用いる場合は、蛍光分子が発する蛍光が微弱であるため、イメージインテンシファイア等を用いて、光信号を増強した後、カメラで像を取得する。この時、ショットノイズ等が生じ、画像に無数の円として映し出される。従来の画像処理方法では、閾値のみで、背景光と蛍光粒子の像を判別するため、前記ショットノイズもまた蛍光粒子の像であると認識される問題がある。

その為、コンピュータ等による細胞の画像から正確に蛍光粒子のみを自動的に抽出できる手法はまだない。

本発明は、光学ぼけを最小限に抑えた共焦点画像によって構成された蛍光粒子の三次元像を継時的に得ることのできる共焦点顕微鏡システムと、その蛍光粒子の重心位置を正確、かつ、迅速に計算する手法と、その蛍光粒子の重心位置を継時的に効率よく計算できる手法を提供することを目的としている。

本発明によれば、試料を照射するレーザーと、ｘ、ｙ軸座標で表される二次元光学切片をビデオ信号に変換するビデオレートカメラと、前記ビデオ信号を画像デジタルデータに変換する画像処理装置と、対物レンズの焦点位置を制御し、画像を得る焦点方向の深さ位置を指定するために対物レンズの焦点位置を制御するピエゾアクチュエータを備え、前記対物レンズ駆動時におけるオーバーシュートを減らし、駆動後の振動の減衰を早めるために、前記ピエゾアクチュエータの駆動部における粘性抵抗を高め、焦点方向の深さ位置を前記ビデオレートカメラの垂直同期信号毎にビデオフレームの撮影時間外にステップ状に変位させ、前記ビデオフレームの撮影時間内では焦点を固定させることで、鮮明な光学切片の取得を可能にし、前記の取得した光学切片をz軸座標にならべて構成した三次元的なデジタル画像データを実時間で連続的に取得することを可能にした共焦点顕微鏡システムが得られる。

本発明は、さらに、ｘ、ｙ軸座標で表される二次元光学切片をｚ軸座標にならべ構成した三次元的なデジタル画像データからなる互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域に配置された粒子の三次元的重心位置を求め、継時的に変化する粒子の重心位置を逐次計算し、前後のフレームで粒子の重心位置の差が、ある閾値以内であれば、同一の粒子であると判別しながら、三次元的に存在する多数の粒子の重心位置を継時的に追跡することを可能とした画像処理方法を提供する。

測定領域に多数の粒子が存在する場合に、すべての粒子の運動を追跡するために、粒子が収まる程度の範囲を設定し、デジタル画像データからなる互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域に配置された粒子の三次元的重心位置を求め、次フレームにおける粒子の三次元的重心位置が上記範囲内に存在する場合に同一の粒子であると判別することで、測定領域内に多数の粒子が存在する場合でも、すべての粒子の重心位置を継時的に取得することを可能とした画像処理方法を提供する。

また、本発明は、輝点の重心を計算する方法として、デジタル画像データのピクセル値を強度とした粒子の輝度分布を三次元ガウス関数としてマルカート法により近似し、粒子の三次元的重心位置を求める方法を用いることにより、上記の従来の重み重心により重心位置を求める方法よりも精度の高い計算が行われる。

さらに、粒子の輝度分布を三次元ガウス関数としてマルカート法により近似する際に、近似解が発散する問題点を解決するために、すべてのｚ切片に対するｘｙ平面画像において、ピクセル値を重みとした粒子の像の重み重心を計算し、粒子周辺の像の平均ピクセル値を背景光とし、それらの値を初期値としてデジタル画像データのピクセル値を強度としたｘｙ座標系における粒子の輝度分布を二次元ガウス関数でマルカート法により近似を行い、近似により計算された各ｘｙ平面画像におけるガウス関数の比例定数をz軸に配列し、それをさらに一次元ガウス関数により近似することにより、前記粒子のｘｙｚ座標系における輝度分布を三次元ガウス関数で近似する初期値とする。この方法により、近似解の発散を防ぐと共に、反復計算の回数を減らすことができ、計算時間が短縮される。

粒子が測定領域外近傍に存在する場合には、ひとつ前のフレームの粒子の輝度分布をガウス関数で近似した時の解である比例定数と標準偏差を固定して、現在のフレームの粒子の輝度分布を三次元ガウス関数としてマルカート法により近似して、現在の粒子の三次元的重心位置を計算する。この方法により、粒子が測定領域外近傍に存在する場合でも、粒子の三次元的重心位置を正確に計算することができる。

さらに、本発明では、粒子が収まる程度の範囲を設定し、デジタル画像データからなる互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域を前期粒子の重心位置を三次元ガウス関数として近似計算しながら走査し、前記計算の結果である比例定数と標準偏差を指標として、粒子の存在の有無を判別し、前記測定領域内にある全ての粒子の位置を検出した後、前記粒子の検出位置を始点として、前記検出された粒子すべての運動を一度に追跡することを可能にした画像処理方法を提供する。

また、本発明で開発された共焦点顕微鏡システムと画像処理法を用いて、蛋白質を含む回折限界以下の微小試料に標識として微小な蛍光粒子を付加し、互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域内における細胞内、あるいは、細胞外における蛍光粒子の運動を観察し、前記測定領域内に存在するすべての蛍光粒子を抽出し、前記検出された蛍光粒子すべての運動を一度に追跡し、蛍光粒子の運動を蛋白質の運動として、運動速度、運動距離、拡散係数等の物理量を取得する解析が可能となる。

上に記載の共焦点顕微鏡システムによって得られた、顕微空間内に存在する微小粒子の三次元的なデジタル画像データを用いて、顕微空間内に存在する微小蛍光粒子の三次元的な運動を継時的に追跡することがと可能なる。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
図１に本実施形態に係る共焦点顕微鏡システムの構成を示す。図示するように、共焦点顕微鏡装置は、試料1、試料1を載置するステージ２、対物レンズ3、対物レンズ３を光軸方向に駆動させるアクチュエータ4、共焦点スキャナユニット６、イメージインテンシファイア７、ビデオレートカメラ８、アクチュエータの駆動制御を行うＺ軸走査制御装置９、ビデオレートカメラ８からの垂直同期信号VSYNC出力に同期させてＺ軸走査制御装置に対物レンズｚ軸方向駆動位置を指定する第１のアナログ電圧信号V1を送るための制御用装置１０、ビデオレートカメラ８から送られるビデオ信号を蓄積し、画像処理を行うための画像処理装置１１、試料１に照射するためのレーザ光源１２から構成される。共焦点スキャナユニット6には、マイクロレンズアレイ（不図示）や、ピンホールアレイ（不図示）や、ビームスプリッタ（不図示）や、マイクロレンズアレイ（不図示）と前記ピンホールアレイを回転駆動する回転制御部（不図示）が収容されている。Ｚ軸走査制御装置９は、第２のアナログ電圧信号V２によって、アクチュエータ４を駆動させ対物レンズ３のｚ軸方向位置を変化させると同時に、対物レンズ３の現在の位置情報をフィードバック制御信号CNTとして受けている。

画像処理装置１１ビデオレートカメラ８よりビデオ信号VIDEOの取得を開始すると、それと同時にトリガ信号TRIGERが制御用装置１０に送られ、制御用装置１０は、垂直同期信号VSYNCの受け取りを開始する。制御用装置１０は、垂直同期信号VSYNCを受け取るとＺ軸走査制御装置９に図2aに示す電圧波形の送信を開始する。画像処理装置１１は、取得したビデオ信号VIDEOをデジタル信号へ変換し、記録媒体（不図示）に蓄積し、図2bに示すようにz軸方向に順番に取得した画像をフレーム順に並べることによって三次元画像を構築し、この作業を実時間で行う。

アクチュエータ４は、与えられた前記電圧波形に従い対物レンズ３を動かす。対物レンズ３のｚ軸方向位置をステップ状に変位させると、対物レンズ３のｚ軸方向動作はオーバーシュートを起し振動する。その後、振動の振幅は序々に減衰するが、このこの減衰時間を早めることで、ビデオレートカメラ８で撮影中の焦点ぶれを減少する。前記減衰時間は対物レンズ３の運動にかかる粘性抵抗の関数であり、粘性抵抗を高めれば減衰時間は短縮される。これによって、焦点ぶれのない鮮明な共焦点像が取得される。この結性抵抗を高めることは、アクチュエータ４に制動機構を設けることで実現できる。あるいは、制動機構ではなく、ｚ軸走査制御装置９の出力に制動のための信号を加えても良い。

上記の共焦点顕微鏡システムで観測されている、回折限界より小さな蛍光粒子から発せられる蛍光は、式１に示すガウス関数に従う。

ここで、(x0,y0,z0)は、蛍光粒子の重心位置の三次元的表現を現す。得られた蛍光粒子の蛍光画像をデジタル化し、式１により近似を行えば、蛍光粒子の重心が求められる。上記の近似計算には、マルカート法を用いる。

上記の近似計算において、初期値を適切に設定しなければ、近似解が発散する、あるいは、別の近似解に収束するおそれがある。これを回避するために、初期値は、収束する近似解に近くする。このアルゴリズムを図３に示す。まず、すべての光学切片、つまり、ｘｙ平面上において、蛍光粒子の像周辺の平均ピクセル値Cを求める。その後、式２によって、ピクセル値を重みとした第１の重み重心座標(X₀,Y₀
)を求める。

ただし、P_xyは、座標(X₀,Y₀)におけるピクセル値から背景光Cを引いた値
さらに第１の重み重心座標(X₀,Y₀)におけるピクセル値をA(z)、重み重心座標(X₀,Y₀)を中心とした蛍光粒子の画像が収まる程度の範囲でのピクセル値の標準偏差をσ_xyとする。その後、上記で求めた、A(z)、X₀、Y₀、σ_xy、Cを初期パラメータとして、式3によって近似計算を行い、ｘｙ平面上における輝点の第２の重心(X₀、Y₀)、および、他のパラメータA(z)、σ_xy、Cが正確に計算される。この時、すべてのパラメータが近似解に近い値となるため、近似解が発散する、あるいは、別解に収束することはない。

この処理をすべてのｚ切片に対するｘｙ平面画像において繰り返して、得られたA(z)をさらに、式４によって近似する。

上記の過程で得られたA、X₀、Y₀、Ｚ₀、σ_xy、σ_z、Cを初期値として、蛍光粒子の３次元像のデジタル値を式１により近似計算することで、xyz軸座標系における蛍光粒子の重心座標(X₀,Y₀,Ｚ₀
)を求めることができる。さらに、背景光を表すパラメータCを式５に示すように設定することで、より正確な計算が可能となる。

高速に、かつ、多数の粒子の運動を追跡するために、以下の方法を実施する。上記追跡方法の流れ図を図４に示す。

まず、上記の蛍光粒子の重心位置を計算するための範囲ROI(Region of Interest)を設定する。ROIは通常、蛍光粒子の画像が収まる程度の範囲として設定する。ROI内において、蛍光粒子の重心位置を計算する。

その後、次の三次元画像における蛍光粒子の重心位置も、同じROI内で計算する。この時、計算される蛍光粒子の重心位置がROI内である場合、ROIの中心を計算される蛍光粒子の重心位置に移動させ、新しいROI内において、傾向粒子の重心位置を計算して、記録媒体に記録していく。

前記の計算される蛍光粒子の重心位置がROI外である場合には、同一輝点を追跡していないと判断し、この時点で計算ループを終了する。上記作業を繰り返すことにより、運動している蛍光粒子の重心位置を、継時的に追跡することができる。ROIを幾つも用意すれば、各ROIが重ならない限り、用意したROIの数だけ並列にその運動を追跡することができる。

上記に示したようなROIを利用することによって、三次元画像、あるいは、二次元画像における輝点の抽出が可能である。ROIを蛍光粒子の画像が収まる程度の立方体で設定し、輝点の重心位置を計算させながら、画像全体を走査する。重心位置が計算される度、輝点の明るさを示すパラメータAが計算される。図3に示す、重心位置計算方法では、ROI内に蛍光粒子がなくても、ほとんどの場合に解が収束してしまう。この時、ROI内のピクセル値は、ROI内に蛍光粒子がある場合に比べ小さいので、パラメータAもまた小さい値に収束する。

つまり、蛍光粒子の重心位置計算時に、パラメータAを指標にすることで、輝点か否かを判別できる。同様に、パラメータσ_xy、σ_zも指標として使うことができる。予め、追跡前に、数個の蛍光粒子の重心位置計算を行い、パラメータA、σ_xy、σ_zの取りうる範囲を調べておき、上記のROIの走査時に、A、σ_xy、σ_zが取りうる範囲内にある場合に輝点であると判別できる。

この輝点抽出方法は、背景光が一様でなくても、輝点のみを抽出することが可能であり、例えば、細胞内における蛍光蛋白質の位置を抽出する場合に、細胞から発せられる自家蛍光等による背景光斑が存在しても、蛍光蛋白質による輝点のみを抽出することが可能である。

尚、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。その要旨の範囲内で数々の変形が可能である。例えば、粒子の重心位置の計算方法は、3次元画像に限らず、一般的な二次元の画像においても適応でき、また、上記の3次元粒子追跡方法は、共焦点画像から作られた3次元画像でなくても、ｘ、ｙ、ｚ座標で構成されるデジタル画像であれば使用することが可能である。

本発明によって製造された共焦点顕微鏡システムは、上下微動機構を備えた共焦点顕微鏡に関する各種産業に利用できる。また本発明によって開発された粒子追跡方法は、二次元、三次元、微小空間像を含む全ての動画像内を移動する移動粒子を自動的に抽出し追跡する動画像データに基づく移動物体を追跡する方法として広く用いることが出来る。

本発明の実施形態による対物レンズを光軸方向にスキャンできる共焦点顕微鏡システムのブロック図である。 図２ａは本発明の実施形態に係る対物レンズの走査シーケンスを示す図である。 図２ｂ：本発明の実施形態に係る二次元光学切片から三次元に構築する概念図である。 本発明の実施形態に係る蛍光粒子の三次元像を三次元ガウス関数で近似計算する流れ図を示す。 本発明の実施形態に係る蛍光粒子の重心位置を継時的に取得する流れ図を示す。

符号の説明

１ 試料
２ ステージ
３ 対物レンズ
４ アクチュエータ
５ ミラー
６ 共焦点スキャナユニット
７ イメージインテンシファイア
８ ビデオレートカメラ
９ ｚ軸走査制御装置
１０ 制御用装置
１１ 画像処理装置
１２ レーザ光源

Claims (14)

1. 共焦点顕微鏡システムにおいて、観測対象である試料に光焦点をしぼる対物レンズと、前記試料の焦点平面においてｘ、ｙ軸座標で表わされる二次元光学切片をビデオ信号に交換するビデオレートカメラと、前記ビデオ信号をデジタル画像データに交換する画像処置装置と、前記対物レンズを光軸方向（z軸方向）に移動し前記二次元光学切片を得る焦点方向の深さ位置を定めるアクチュエータと、前記アクチュエータをステップ状に変位させるz軸走査制御装置とを備え、前期画像処理装置において、前記対物レンズの前記ステップ状変位に対応した前期二次元光学切片の前記ビデオ信号をz軸座標にならべ前記ｘ、ｙ軸座標と共に三次元画像を生成することを特徴とする共焦点顕微鏡システム。
2. 前記アクチュエータはピエゾ素子であることを特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡システム。
3. 前記アクチュエータの駆動部に制動機構を設けた事を特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡システム。
4. 前記ｚ軸走査制御装置の出力に、前記アクチュエータのオーバーシュート動作を制動するための制動信号を含む事を特徴とする請求項１記載の共焦点顕微鏡システム。
5. 請求項１記載の前記アクチュエータをステップ状に変化させる時の、前記アクチュエータの移動期間は前記ビデオ信号の垂直同期信号期間内であり、前記ビデオ信号のビデオフレームの撮影期間は前記アクチュエータの移動を行わないことを特徴とする請求項１乃至４記載の共焦点顕微鏡システム。
6. 共焦点顕微鏡システムにおける回折限界に近い微細粒子の観測において、デジタル画像データからなる互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域に配置された粒子の三次元的重心位置を求め、継時的に変化する粒子の重心位置を逐次計算することで、前記の重心位置を継時的に取得することを可能にした画像処理方法。
   
7. 前記ビデオ信号内において前記粒子が収まる程度の画像範囲を設定し、前記デジタル画像データからなる互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される前記画像範囲内に表われる前記粒子の三次元的重心位置を求め、次フレームにおいて前記粒子の三次元的重心位置が上記画像範囲内に存在する場合に同一の粒子であると判別することを特徴とする請求項６に記載の画像処理方法。
8. 請求項６および７に記載のデジタル画像データから粒子の三次元的重心を計算する際に、前記デジタル画像データのピクセル値を強度とした粒子の輝度分布を三次元ガウス関数としてマルカート法により近似し、粒子の三次元的重心位置を求める請求項６および７に記載の画像処理方法。
9. 請求項２および３に記載のデジタル画像データから粒子の三次元的重心位置を求める際に、すべてのｚ切片に対するｘｙ平面画像において、ピクセル値を重みとした粒子の像の重み重心、重み重心位置におけるピクセル値、重み重心位置を中心とした蛍光粒子の画像が収まる程度の範囲でのピクセル値の標準偏差をを計算し、粒子周辺の像の平均ピクセル値を背景光とし、それらの値を初期値としてデジタル画像データのピクセル値を強度としたｘｙ座標系における粒子の輝度分布を二次元ガウス関数でマルカート法により近似を行い、近似により計算された各ｘｙ平面画像におけるガウス関数の比例定数をz軸に配列し、それをさらに一次元ガウス関数により近似することにより、前記粒子のｘｙｚ座標系における輝度分布を三次元ガウス関数で近似する初期値とし、近似解の発散を防ぐ、請求項８に記載の画像処理方法。
10. 請求項８および９に記載の粒子が前記画像範囲外近傍に存在する場合に、直前の粒子の輝度分布を三次元ガウス関数で近似した時の解である比例定数と標準偏差を固定して、現在の粒子の輝度分布を三次元ガウス関数としてマルカート法により近似して、現在の粒子の三次元的重心位置を計算する、請求項８および９に記載の画像処理方法。
11. 前記ビデオ信号内に前記粒子が収まる程度の範囲を設定し、前記デジタル画像データにおいてｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域を請求項８−１０記載の画像処理方法により前期粒子の重心位置を三次元ガウス関数として近似計算しながら走査し、前記計算の結果である比例定数と標準偏差を指標として、粒子の存在の有無を判別し、前記測定領域内にある全ての粒子の位置を検出する画像処理方法。
12. 前記ビデオ信号内に前記粒子が収まる程度の範囲を設定し、前記デジタル画像データにおいてｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域を請求項８−１０記載の画像処理方法により前期粒子の重心位置を三次元ガウス関数として近似計算しながら走査し、前記計算の結果である比例定数と標準偏差を指標として、粒子の存在の有無を判別し、前記測定領域内にある全ての粒子の位置を検出した後、前記粒子の検出位置を始点として、請求項７に示した画像処理方法によって、前記検出された粒子すべての運動を一度に追跡することを可能にした画像処理方法。
13. 請求項１記載の共焦点顕微鏡システムによって得られた、ｘ，ｙ，ｚ軸座標系からなる測定領域のデジタル画像データから、請求項１２の画像処理方法によって前記測定領域内に存在するすべての粒子を抽出し、前記検出された粒子すべての運動を一度に追跡することを可能にした画像処理方法。
14. 蛋白質を含む回折限界以下の微小試料に標識として微小な蛍光粒子を付加し、請求項１記載の共焦点顕微鏡システムにより観察することで、互いに垂直なｘ，ｙ，ｚ軸座標で表される測定領域内における細胞内、あるいは、細胞外における蛍光粒子の運動を観察し、請求項１２の画像処理方法によって前記測定領域内に存在するすべての蛍光粒子を抽出し、前記検出された蛍光粒子すべての運動を一度に追跡し、蛍光粒子の運動を蛋白質の運動として、運動速度、運動距離、拡散係数等の物理量を取得する解析方法。