JP2006147430A - 電子顕微鏡 - Google Patents

Abstract

【課題】 任意の試料（生細胞など生の生物試料を含む）に対して、前処理を全く必要とせず、大気圧の状態で観察を行うことができる電子顕微鏡を提供する。
【解決手段】 真空筐体１００に電子透過膜（例えば、コロジオン膜）１３２付きの微小なオリフィス１３０を設けて差動排気を行う。また、電子線Ｂを走査する代わりに、可動ステージ２０２（特にスキャナ２０４）を用いて試料Ｓを走査する。さらに、試料Ｓを電子透過膜（コロジオン膜）１３２に近づけて、電子線Ｂの照射による試料Ｓからの反射電子Ｒ（および二次電子）を、高真空側の上部反射電子検出器３０４と大気圧側の下部反射電子検出器３０６（ならびに高真空側の二次電子検出器３０２）を用いて検出する。
【選択図】 図２

Description

本発明は、電子顕微鏡に関し、特に、試料を大気圧に置いた状態で使用することができる新方式の電子顕微鏡に関する。

電子顕微鏡としては、現在、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ：Scanning Electron Microscope）が広く一般的に使用されている。ＳＥＭは、物質表面を電子線によって走査し、表面からの反射電子や二次電子によって、物質表面の形状や構成を観察する装置であって、基礎研究のツールとして約半世紀経過し、物質科学・デバイス開発分野では必須の道具となっている。ＳＥＭは、電子線を用いるため、高真空環境を条件としており、そのため、当初より、そのほとんどは半導体評価用に用いられている。

一方で、近年、医学生物学分野での必要性の高まりに伴って、試料作成法が考案され、大気圧（１０^５Ｐａ）またはそれに近い環境でのＳＥＭ観察が可能になった。また、生物の細胞をなるべく生に近い状態で観察したい要求に応じるため、低真空ＳＥＭ（環境制御型ＳＥＭ、１０^３Ｐａ）が開発されている。

すなわち、大気圧（１０^５Ｐａ）またはそれに近い環境でＳＥＭ観察する方法として、従来、試料を特殊なカプセル（ポリマーカプセル）に包む方法（例えば、特許文献１）や、雰囲気・環境制御を行う方法（例えば、特許文献２）、試料の温度を４℃以下に冷却する方法（例えば、特許文献３）などが開発されている。
特表２００４−５１５０４９号公報 特開平１１−６７１３３号公報 特開２００２−２１４０９１号公報

しかしながら、従来の方法にはそれぞれ次のような問題がある。

まず、試料を特殊なカプセルに包む方法においては、その特殊なカプセルに適合するように、事前に試料を処理する必要があり、また、その特殊なカプセルに適合しなければならないため、観察可能な試料にもおのずから一定の制限がある。

また、雰囲気・環境制御を行う方法においては、装置が大型で、ユビキタス（いつでもどこでも）の観点からは問題があり、また、方法自体がそもそも大気圧の状態まで至っていない。

また、試料の温度を４℃以下に冷却する方法においては、依然として試料の前処理が必要であることに加えて、試料の温度を４℃以下に冷却すると、水が凍り細胞の機能が停止してしまうため、機能に伴って変化する細胞構造などを観察することができないという問題がある。

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、任意の試料（生細胞など生の生物試料や液中の試料を含む）に対して、前処理を全く必要とせず、大気圧の状態で観察を行うことができる電子顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の電子顕微鏡は、真空に耐えることができ、かつ、電子に対する透過性を有する電子透過膜と、前記電子透過膜が取り付けられたオリフィスを一部に有する真空筐体と、前記真空筐体の内部において電子線を前記電子透過膜に向かって案内する電子線照射手段と、前記電子透過膜近傍の前記真空筐体の外部に配置され、前記電子線に対して相対移動可能に試料を載置する可動ステージと、前記電子線の照射に基づく前記試料からの電子を検出する電子検出手段と、を有する構成を採る。

本発明によれば、任意の試料（生細胞など生の生物試料や液中の試料を含む）に対して、前処理を全く必要とせず、大気圧の状態で観察を行うことができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。

（実施の形態１）
本発明は、従来の真空型ＳＥＭでは達成し得なかった大気圧（１０^５Ｐａ）で正常に動作するＳＥＭの開発に関する。しかも、光学顕微鏡観察と同様に、試料を大気圧の状態で、いつでもどこでも観察できる新方式の（ユビキタス）電子顕微鏡の開発に関する。

本発明者は、大気圧で試料を観察できる電子顕微鏡を開発するためには、従来の真空型ＳＥＭに対して、（ａ）差動排気システム、（ｂ）試料ステージスキャンシステム、（ｃ）電子線検出システム、といった個々の要素技術を開発し、これらの要素技術を有機的に統合する必要があることを見出した。

まず、本発明の原理を説明する。

電子線源を高真空（１０^−２Ｐａ以下）に保ちつつ試料環境を大気圧（１０^５Ｐａ）に保つためには、途中に微小穴（オリフィス）を設けてガス分子の流れの隘路を作り、いわゆる差動排気の原理を利用する。その際、大きな差圧を維持し、かつ、ガス分子の流れをなくすために、オリフィスの径を非常に小さくし、かつ、そのオリフィスに電子透過膜を取り付ける。オリフィスの径は、電子透過膜の種類（特に差圧に対する強度）に応じて決定される。例えば、電子透過膜がコロジオン膜である場合、オリフィスの径は、例えば、１０μｍ以下、好ましくは１μｍ以下である。なお、かかる微小オリフィスは、例えば、収束イオンビーム加工機を用いて加工される。

ここで用いる電子透過膜は、真空に耐えることができ、かつ、電子に対する透過性（減衰なしに通過すること）を有することが必要である。さらに、生細胞を観察する場合には、細胞（水も含む）と反応しないことも求められる。電子透過膜の例としては、上記コロジオン膜のほかに、ポリイミド、ポリアミド、ポリアミド−イミド、ポリエチレン、ポリピロールおよび付加的な導電性重合体、パルロジオン、コロジオン、カプトン（Kapton）、フォームバー（FormVar）、ビニレック（Vinylec）、ブトバー（ButVar）、ピオロフォーム（Pioloform）、二酸化ケイ素、一酸化ケイ素、ならびに炭素などを挙げることができる。

特に、コロジオン膜は、窒素含有量が１０.５〜１２.２％のニトロセルロース（ピロキシリン）をエーテル・アルコール混液に溶かし、溶媒を蒸発させた後に残る透明で可燃性の半透膜であって、幅広い応用範囲を持つ材料である。例えば、コロジオン膜は、従来から、傷口の被覆・包帯の固定に使われたり、透析膜として試料の濃縮・脱塩などの目的に使われたり、電子顕微鏡用試料を載せる支持膜としても使われている。

一般に差動排気はオリフィスを多段にすれば効果が上がる。しかし、本発明では、オリフィスは電子線が通過する絞りも兼用しているため、多段のオリフィスを設けた場合には、電子線を精度良く通過させる必要が生じる。この点、簡単な見積もりによれば、１つのオリフィス（直径１μｍ）でも、排気速度が毎秒１リットルの真空ポンプにより高真空（１０^−２Ｐａ）と大気圧（１０^５Ｐａ）の差動排気が可能である。すなわち、オリフィスのコンダクタンス（分子流）は、Ｃ＝９.１２Ｄ^２（リットル／ｓ）（Ｄ：直径（ｃｍ））で与えられるため、オリフィスの径を１μｍとすると、Ｃ＝９.１２×１０^−８（リットル／ｓ）となり、一方、オリフィスを通って流れる流量は、Ｑ＝Ｃ×ΔＰで与えられるため、片方を大気圧（１０^５Ｐａ）、もう片方を高真空（１０^−２Ｐａ）とすると、Ｑ＝９.１２×１０^−３（Ｐａ・リットル／ｓ）となる。この流量を排気して高真空（１０^−２Ｐａ）を保つのに必要な真空ポンプの排気速度は、Ｓ＝Ｑ／Ｐ＝０.９１２（リットル／ｓ）となる。したがって、後述する実施の形態では、オリフィスの数は１つである。なお、多段のオリフィスに対して電子線を精度良く通過させることが保証されれば、複数のオリフィスを設けることも可能である。

上記のように電子透過膜付きのオリフィスを用いて差動排気を行う場合、通常のＳＥＭの原理で電子線を走査すると、観察領域がオリフィスの径を越えることができないため、ＳＥＭとして機能しなくなる。そのため、本発明では、電子線を光軸の中心またはその近傍に固定し、試料を走査する。

後述する実施の形態では、試料を走査する方法として、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Atomic Force Microscope）と同様に、ピエゾ素子をスキャナ（走査素子）として利用する。ピエゾ素子は、一般的には、ＰＺＴ（チタン酸ジルコン酸鉛：Ｐｂ(Ｚｒ,Ｔｉ)Ｏ_３）と呼ばれる強誘電性を有するセラミック材料を用いて製作される。すなわち、ピエゾ素子は、棒状の３本をＸ、Ｙ、Ｚ方向に組み合わせ、それぞれのセラミックス棒に電圧を印加することにより、各棒を機械的に伸縮させることができる。あるいは、筒状セラミックスの側壁にＸ、Ｙ、Ｚ方向の電極を配置して電圧を印加することにより、筒を三次元的に機械的に伸縮させることができる。

しかし、ピエゾ素子がカバーする領域は、実用上、大きくても１５０μｍ程度が限度であるため、観察したい試料が、例えば、１ｍｍもあれば、到底、試料全体をカバーすることができない。そこで、後述する実施の形態では、ピエゾ素子を粗動機構（例えば、±５ｍｍ程度）と組み合わせることにより、試料のどの部分でも観察領域に持ってくることができるようにしている。すなわち、実際に観察する試料は、一般に数ｍｍ〜数ｃｍ程度であり、かかる試料の全表面を１つの走査素子（ピエゾ素子）で観察するのは、下記の理由から現実的ではないため、ピエゾ素子を機械的な微動機構の上に設置することにより、試料表面全体の観察を可能にしている。

なお、ピエゾ素子を大きくしてそれ自体で１ｍｍ程度をカバーすることも原理的には可能であるが、ＰＺＴ材料自体の物性に基づく非直線性（印加電圧と伸縮量とが線形関係になく、印加電圧を大きくすると、伸縮量が一様ではなく、大きくなること）、印加電圧の高圧化に伴う電子線への影響（電子線が電界によって曲がること）、倍率を高くしたときのＰＺＴに起因するノイズ（大きな変位を得るためには大きな構造体にする必要があるため、小さな電圧でも大きな機械的変化をする構造体になり、ナノメートルを安定的に見ることができなくなる）の点で、現実的ではない。

ＳＥＭの重要な技術である電子線検出については、エネルギーの低い二次電子が大気中を伝播すると、減衰が大きいため、検出器で十分な信号強度を得ることは困難である。そこで、本発明では、基本的に反射電子を検出する方法を採用する。このとき、好ましくは、観察試料からの反射電子を、高真空側の検出器と大気圧側の検出器の両者を用いて検出する。

大気圧側の検出器を用いて反射電子を検出する場合、反射電子の効率的な検出を大気圧環境の下でいかに実現するかが極めて重要である。なぜなら、大気圧の環境においては、通常の電子線検出器（シンチレータ）は動作せず、また、電子の平均飛行距離も非常に短く（簡単な計算によれば約４００ｎｍ）、さらに、二次電子を集めるために電圧を印加すると放電する、といった問題が存在するためである。すなわち、シンチレータとは、放射線（電子線を含む）が当たると光を発する蛍光物質であるが、空気や水分に非常に犯されやすい（特に動作させることができない）ため、一般に大気中では使用することができない。また、窒素ガス（Ｎ_２）の平均自由行程は、１Ｐａで６.６ｍｍであるため、１気圧（１０^５Ｐａ）では約７０ｎｍである。電子の平均飛行距離（平均自由行程）は、気体分子のそれの４√２倍であるため、約４００ｎｍである。したがって、大気中では電子は約４００ｎｍ進むと消失することになる。さらに、二次電子を検出するためには、通常、数十ｋＶの電圧を印加して二次電子を検出器に集めるが、大気圧中では、放電するため、使用することができない。

そこで、本発明では、観察する試料を数百ｎｍの距離までオリフィス（または電子透過膜のいずれか近い方）に近づけることにより、電子行程を短くして電子（反射電子や二次電子）の散乱を軽減する。これにより、電子による大気圧中のガス分子のイオン化、電離（放電）現象を抑制することもできる。この結果、反射電子（および二次電子）を一段前の真空領域（１０^−２Ｐａ）まで引き込むことができ、その空間に設置した従来型の電子線検出器（後述する上部反射電子検出器（および二次電子検出器））で反射電子を検出することが可能になる。また、オリフィスの直下に別の反射電子検出器（後述する下部反射電子検出器）を取り付けて、試料から反射してくる電子線を試料の直上で検出することも可能になる。ここで、反射電子を大気圧またはこれに近い環境で検出する方法としては、例えば、ＹＡＧ単結晶や半導体結晶を用いる。

また、一般に細胞の表面は凹凸が大きいため（数μｍ程度）、その試料を大気圧中に置いた場合、凸部は数百ｎｍの距離まで近づけることにより観察可能であるが、凹部は反射電子が減衰してしまい観察することができない。これを解決する方法としては、観察対象の試料をオリフィスに取り付けられた電子透過膜（例えば、コロジオン膜）に押し付けて凹部を減少させるという方法を採ることができる。

また、本発明では、液（例えば、水）中の試料についても観察を行うことができる。例えば、電子透過膜（例えば、コロジオン膜）に試料を押し付ければ、それまで液中にあった試料も界面の液体（水）がなくなり、観察を行うことが可能になる。

以上のように、本発明は、試料の前処理を全く必要としない、大気圧で試料の観察が可能な電子顕微鏡である。大気圧観察が可能であるため、観察可能になるまでの時間の短縮が図られ、試料の取り扱いも非常に簡単になる。また、試料についても、大気圧観察が可能であるため、生の生物試料の観察も可能になる。さらに、大気圧観察を可能にするために環境制御型ＳＥＭのような特別の設備を設ける必要がないため、装置の大型化を避けることができる。また、高圧電源部分の安全性が確保されれば、小型化と相俟って、何人も、いつでもどこでも（ユビキタス）使用可能な顕微鏡の実現が図られる。

なお、本発明では、試料の大気圧観察が可能になるが、適用可能な圧力範囲は、もちろん、大気圧に限定されるわけではなく、大気圧以下であれば、任意の圧力で適用可能である。例えば、低真空（１０^３Ｐａ）は、細胞が生存し得る限界状態であり、生細胞を観察するためには、真空度を低真空（１０^３Ｐａ）以下に下げる必要があるが、本発明は、もちろん、低真空（１０^３Ｐａ）と大気圧（１０^５Ｐａ）の範囲内でも適用可能である。さらには、細胞以外の試料であれば、高真空（１０^−２Ｐａ）でも観察可能である、つまり、高真空（１０^−２Ｐａ）と大気圧（１０^５Ｐａ）の範囲内で適用可能である。

図１は、本発明の実施の形態１に係る電子顕微鏡の全体構成を示すブロック図、図２は、図１に示す電子顕微鏡の要部を示す詳細図、図３は、図２に示す電子顕微鏡のさらに要部を示す詳細図である。

図１に示す電子顕微鏡１０は、電子線Ｂを試料Ｓに向けて照射するための真空筐体１００と、試料Ｓを格納する試料室２００と、電子線Ｂの照射に基づく試料Ｓからの電子を検出する電子検出器３００と、真空筐体１００に設置された各装置を総合的に制御するＳＥＭ制御部４００と、試料Ｓの走査を制御するとともに試料Ｓの画像データを取得・表示する計算機部５００とを有する。本実施の形態では、真空筐体１００および試料室２００は、支持台６００に固定されている。

真空筐体１００には、排気によって筐体内に真空状態を作り出す真空排気部１０２が取り付けられている。真空排気部１０２は、真空ポンプで構成されている。本実施の形態では、図２に示すように、真空筐体１００の内部は、互いに連通する３つの部屋、つまり、第１室１０４、第２室１０６、第３室１０８に分かれている。図２の例では、第１室１０４と第３室１０８に真空ポンプ１０２ａ、１０２ｂがそれぞれ取り付けられている。真空排気部１０２（真空ポンプ１０２ａ、１０２ｂ）によって、真空筐体１００内は、高真空（１０^−２Ｐａ）状態に設定・維持される。

真空筐体１００の第１室１０４には、電子線（熱電子）Ｂを発生する電子源１１０と、電子源１１０からの電子線Ｂを集束させるための第１コンデンサレンズ１１２とが設けられている。また、第１室１０４と第２室１０６の間の隔壁１１４には、コンデンサ絞り１１６が設けられている。

真空筐体１００の第２室１０６には、コンデンサ絞り１１６を通過した電子線Ｂを集束させるための第２コンデンサレンズ１１８と、第２コンデンサレンズ１１８を通過した電子線Ｂを振らせるための偏向コイル１２０と、偏向コイル１２０を通過した電子線Ｂを試料Ｓに向かって最終的に照射させるための対物レンズ１２２とが設けられている。また、第２室１０６と第３室１０８の間の隔壁１２４には、対物絞り１２６が設けられている。対物絞り１２６の直径は、例えば、一例として、５０μｍである。

真空筐体１００の第３室１０８には、電子線Ｂの照射により試料表面から放出される二次電子を検出する二次電子検出器３０２と、電子線Ｂの照射により試料表面から反射される反射電子Ｒを検出する上部反射電子検出器３０４とが設けられている。二次電子検出器３０２では、エネルギーの低い二次電子を効率良く集めるために、電圧を印加して二次電子を加速するようにしている。これに対し、反射電子Ｒは、エネルギーが高いため、二次電子の場合のように付加的な加速は必ずしも必要ないが、本実施の形態では、反射電子Ｒをより一層確実に集めるために、電圧を印加するようにしている。

真空筐体１００の底面１２８には、差動排気用のオリフィス１３０が形成されている。このオリフィス１３０は、電子線Ｂが通過する絞りとしても機能する。オリフィス１３０の直径は、例えば、一例として、１μｍ以下である。また、このオリフィス１３０には、図３に示すように、電子透過膜（例えば、コロジオン膜）１３２が取り付けられている。電子透過膜１３２に要求される条件は、上記のように、真空に耐えることができること、電子に対する透過性を有すること、および、生細胞を観察する場合には、細胞（水も含む）と反応しないことである。このように電子透過膜１３２付きのオリフィス１３０を用いて差動排気を行うことにより、真空筐体１００の内部を高真空（１０^−２Ｐａ以下）に保ちつつ、試料室２００の内部を大気圧（１０^５Ｐａ）に保つことができる。

また、好ましくは、図３に示すように、真空筐体１００の底面１２８には、試料Ｓの直上にあって電子線Ｂの照射により試料表面から反射される反射電子Ｒを直接検出する下部反射電子検出器３０６が設けられている。下部反射電子検出器３０６は、反射電子を大気圧またはこれに近い環境で検出することを可能にするため、例えば、ＹＡＧ単結晶または半導体結晶で製作されている。また、下部反射電子検出器３０６の中心部は、オリフィス１３０を構成している。すなわち、下部反射電子検出器３０６を利用する場合、オリフィス１３０は、真空筐体１００の底面１２８に取り付けられた下部反射電子検出器３０６に形成されていることになる。したがって、この場合、電子透過膜（コロジオン膜）１３２は、真空筐体１００の外側からオリフィス１３０（つまり、下部反射電子検出器３０６）に取り付けられていることになる。これにより、劣化した電子透過膜１３２を極めて容易に交換・再生することができ、作業性が向上する。

なお、図３中、符号「３０８」は、ファイバプレート、「３１０」は、光ファイバ、「３１２」は、光電子倍増管（ＰＭＴ：photomultiplier tube）である。ここで、ファイバプレート３０８は、１本が数ミクロン径の光ファイバを多数束ねて接合した板であり、光電子倍増管３１２は、光電管に電子増倍部を組み込んだもので、微弱な光を検出して電気信号に変換し増幅する機能を有する。

また、図３の例では、作業性を重視して、電子透過膜（コロジオン膜）１３２を下部反射電子検出器３０６の外側（真空筐体１００の外部に向かう側）に取り付けているが、これに限定されるわけではない。例えば、図４に示すように、電子透過膜（コロジオン膜）１３２ａを下部反射電子検出器３０６の内側（真空筐体１００の内部に向かう側）に取り付けることも可能である。この場合、図３の例に比べて、作業性は劣るが、反射電子の検出可能範囲が拡大するというメリットがある。

また、微小なオリフィス１３０に電子線Ｂを通過させるためには、全体的な軸合わせが必要不可欠である。具体的には、電子源１１０、第１コンデンサレンズ１１２、コンデンサ絞り１１６、第２コンデンサレンズ１１８、偏向コイル１２０、対物レンズ１２２、対物絞り１２６、およびオリフィス１３０は、図示しない調整機構により、それぞれの中心軸が同一の光軸上に来るように位置関係が調整されている。

本実施の形態では、基本的には電子線Ｂを光軸の中心またはその近傍に固定し、試料Ｓを走査する。そのため、図１に示すように、試料室２００には、試料Ｓを走査するための可動ステージ２０２が設けられている。可動ステージ２０２は、好ましくは、スキャナ（走査素子）２０４と、粗動ステージ２０６とで構成されている。試料Ｓはスキャナ２０４の上に載置され、スキャナ２０４は粗動ステージ２０６の上に載置されている。

スキャナ２０４は、例えば、ピエゾ素子で構成されており、電圧を印加することにより、ＸＹＺ軸の各方向に機械的に伸縮し、試料Ｓに対して精密な三次元走査を行う機能を有する。例えば、走査範囲は、ＸＹ軸が最大約１５０μｍ、Ｚ軸が最大約２０μｍでの観察が可能である。

スキャナ２０４は、駆動信号に基づいて電気的に動作され、一方で、その駆動信号と同期させて電子検出器３００（二次電子検出器３０２、上部反射電子検出器３０４、下部反射電子検出器３０６）で検出される信号強度を画像にする。そのため、スキャナ２０４は、ステージドライバ５０４に電気的に接続されている。ステージドライバ５０４は、スキャン信号発生器５０２からのスキャン信号を入力し、このスキャン信号に従って、スキャナ２０４に対する駆動信号を出力する。スキャナ２０４は、上記のように、三次元的にナノメートルの精度で駆動される。

粗動ステージ２０６は、試料Ｓの観察部を選び出すために、スキャナ２０４を機械的に三次元的に粗動させる機能を有する。粗動ステージ２０６は、例えば、手動で操作される。このように、粗動ステージ２０６は、三次元的に作動するが、あくまで試料Ｓの観察位置を探し出すためのものである。ＳＥＭとしての画像を取るときには、スキャナ２０４が使用される。このようにスキャナ２０４を粗動ステージ２０６の上に載置することにより、試料表面全体を観察することができる。

また、本実施の形態では、試料Ｓからの反射電子Ｒおよび二次電子を真空領域（１０^−２Ｐａ）まで引き込んで高真空側の上部反射電子検出器３０４および二次電子検出器３０２でそれぞれ検出可能にするとともに、試料Ｓからの反射電子Ｒを大気圧側の下部反射電子検出器３０６で直接検出可能にするために、観察する試料Ｓを数百ｎｍの距離まで電子透過膜（コロジオン膜）１３２に近づける。具体的には、まず、大まかに粗動ステージ２０６の三次元移動で近づけ、その後、スキャナ２０４の三次元走査で精密な位置制御を行う。

図５は、電子の平均飛行距離と圧力との関係を示すグラフ図である。図５のグラフによれば、大気圧（１０^５Ｐａ）の場合、電子の平均飛行距離は、約０.４μｍ（＝４００ｎｍ）であるため、大気圧観察を行う場合、好ましくは、電子透過膜（コロジオン膜）１３２と可動ステージ２０２（スキャナ２０４）の距離は、約０.２μｍ（＝２００ｎｍ）以下に設定される。このように、電子透過膜（コロジオン膜）１３２と可動ステージ２０２（スキャナ２０４）の距離は、試料室２００内の圧力に応じて適切に調整すればよい。

試料室２００内には、ガス供給管２０８を介して、例えば、試料との反応性や、電離（放電）の具合、電子の平均自由行程などの観点から選択されたいろいろなガスが供給される。図１の例では、例えば、窒素ガス（Ｎ_２）が供給されている。窒素ガスの供給量を調整することにより、試料室２００内の圧力を低真空（１０^３Ｐａ）から大気圧（１０^５Ｐａ）まで任意に設定することができる。なお、低真空（１０^３Ｐａ）は、上記のように、細胞が生存し得る限界状態であり、生細胞を観察するためには、真空度を低真空（１０^３Ｐａ）以下に下げる必要がある。

検出系について、本実施の形態では、上記のように、試料Ｓからの反射電子を、高真空側の上部反射電子検出器３０４と大気圧側の下部反射電子検出器３０６の両者を用いて検出する。また、試料Ｓからの二次電子を高真空側の二次電子検出器３０２を用いて検出する。各検出器３０２、３０４、３０６で検出された信号強度は、アナログの電気信号として出力され、信号増幅器５０６で増幅された後、スキャン信号発生器５０２からのスキャン信号に同期してＡＤ変換器５０８でデジタル信号に変換される。ＡＤ変換器５０８からのデジタル信号は、画像処理され、画像データとしてフレーム単位でフレームメモリ５１０に記憶される。フレームメモリ５１０に記憶された画像データは、フレーム単位で画像表示装置５１２に表示される。すなわち、本実施の形態では、試料Ｓの観察結果（試料表面の画像）がリアルタイムで表示される。

なお、本実施の形態では、３つの検出器３０２、３０４、３０６を用いて試料表面の観察を行うようにしているが、これに限定されるわけではない。必要とされる性能に応じて、３つの検出器３０２、３０４、３０６のうち、任意の２つ、または、任意の１つのみを用いて電子顕微鏡を構成することも可能である。具体例は、実施の形態２以降に示す。

次いで、上記構成を有する電子顕微鏡１０の動作について説明する。なお、ここでは、光軸の調整は完了し、かつ、真空筐体１００内は真空状態（１０^−２Ｐａ）に設定されているものとする。また、試料Ｓは大気圧で観察するものとする。

まず、ユーザが、試料Ｓをスキャナ２０４上に載置して試料室２００内に格納する。そして、粗動ステージ２０６を手動で操作して、試料Ｓの観察部を選び出すとともに、電子透過膜（コロジオン膜）１３２と可動ステージ２０２（スキャナ２０４）の距離を約２００ｎｍ以下に設定する。

そして、ユーザが電子源１１０をオンすると、電子源１１０から発射された電子線Ｂは、第１コンデンサレンズ１１２、コンデンサ絞り１１６、第２コンデンサレンズ１１８、偏向コイル１２０、対物レンズ１２２、対物絞り１２６、オリフィス１３０、および電子透過膜（コロジオン膜）１３２を通過して試料Ｓに照射される。このとき、電子線Ｂの照射により試料表面から放出される二次電子は、電子透過膜（コロジオン膜）１３２およびオリフィス１３０を通過して真空領域（１０^−２Ｐａ）に引き込まれ、二次電子検出器３０２によって検出される。また、電子線Ｂの照射により試料表面から反射される反射電子Ｒは、一部は、電子透過膜（コロジオン膜）１３２およびオリフィス１３０を通過して真空領域（１０^−２Ｐａ）に引き込まれ、上部反射電子検出器３０４によって検出され、また、他の一部は、試料Ｓの直上に位置する下部反射電子検出器３０６によって検出される。そして、各検出器３０２、３０４、３０６で検出された信号強度は、信号増幅器５０６で増幅され、ＡＤ変換器５０８でデジタル信号に変換された後、画像処理され、フレームメモリ５１０を介して画像として画像表示装置５１２に表示される。そして、以上の処理を、スキャン信号に基づいて、スキャナ２０４を三次元的に駆動しながら、これと同期をとって行う。

なお、細胞など表面の凹凸が大きい試料を観察する場合には、可動ステージ２０２を操作して観察対象の試料Ｓを電子透過膜（コロジオン膜）１３２に押し付けることにより、観察を行う。

このように、本実施の形態によれば、真空筐体１００に電子透過膜（例えば、コロジオン膜）１３２付きの微小なオリフィス１３０を設けて差動排気を行い、かつ、電子線Ｂを走査する代わりに、可動ステージ２０２（特にスキャナ２０４）を用いて試料Ｓを走査し、かつ、試料Ｓを電子透過膜（コロジオン膜）１３２に近づけて、電子線Ｂの照射による試料Ｓからの反射電子Ｒ（および二次電子）を、高真空側の上部反射電子検出器３０４と大気圧側の下部反射電子検出器３０６（ならびに高真空側の二次電子検出器３０２）を用いて検出するため、任意の試料（生細胞など生の生物試料を含む）に対して、前処理を全く必要とせず、大気圧の状態で観察を行うことができる。

なお、本実施の形態では、試料室２００内にガスを供給するようにしているが、これに限定されるわけではない。例えば、試料室２００内に液体を供給して液体中での試料を観察することも可能である。

（実施の形態２）
実施の形態２は、実施の形態１に対応する電子顕微鏡の廉価版である。

図６は、本発明の実施の形態２に係る電子顕微鏡の要部を示すブロック図である。なお、この電子顕微鏡は、図１〜図３に示す実施の形態１に対応する電子顕微鏡と同様の基本的構成を有しており、同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。

本実施の形態の特徴は、既存のＳＥＭの構造をできるだけ利用しつつ、本発明の電子顕微鏡を安価に製造するために、実施の形態１に対応する電子顕微鏡１０から下部反射電子検出器３０６を省略したことである。そのため、この電子顕微鏡２０では、真空筐体１００の底面１２８に形成されたオリフィス１３０に、真空筐体１００の外側から直接電子透過膜（例えば、コロジオン膜）１３２が取り付けられている。

このように、本実施の形態によれば、下部反射電子検出器３０６を有しないため、実施の形態１に対応する電子顕微鏡１０と比較して、性能は若干劣るものの、より安価に製造することができる。

（実施の形態３）
実施の形態３は、実施の形態１に対応する電子顕微鏡１０を用いて、生細胞をその場観察しながら操作する場合である。

図７は、本発明の実施の形態３に係る電子顕微鏡の要部を示すブロック図である。なお、この電子顕微鏡は、図１〜図３に示す実施の形態１に対応する電子顕微鏡と同様の基本的構成を有しており、同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。また、図７では、簡単化のため、便宜上、真空筐体１００の底面１２８においてファイバプレート３０８（図３参照）の図示を省略している。

本実施の形態の特徴は、先端にカーボンナノチューブ（ＣＮＴ）探針７００を持つカンチレバー７０２を有することである。カンチレバー７０２は、微小な板ばねであって、ピエゾ抵抗体で構成されている。

本実施の形態では、カンチレバー７０２とスキャナ２０４を組み合わせていわゆるＡＦＭ（Atomic Force Microscope）像観察を行うとともに、カンチレバー７０２を駆動しながらその先端のＣＮＴ探針７００を試料（例えば、生細胞）Ｓに挿入することにより、生細胞内の特定の部位に刺激を与えたときの細胞表面構造の変化を電子線でその場観察を行う。このとき、ＣＮＴ探針７００を直接細胞に押し付けて内部に挿入しようとしても、一般には細胞膜が硬くて挿入が困難である。そこで、例えば、５０層程度の多層ＣＮＴを用いること、その先端を先鋭化すること、振動運動を重畳すること（ＣＮＴ探針に数ｋＨｚから数百ｋＨｚの振動を重ねて押し付けること）により、比較的簡単に挿入できるようにする。

このように、本実施の形態によれば、実施の形態１に対応する電子顕微鏡１０とＣＮＴ探針７００とを組み合わせるため、その場観察しながら試料（例えば、生細胞）の観察・操作を行うことができる。

なお、以下に、本実施の形態の変更例をいくつか説明する。

図８は、ＣＮＴ探針７００と組み合わせる電子顕微鏡が、実施の形態２に対応する廉価版の電子顕微鏡２０の場合である。

図９は、ピンセット型のカンチレバーを示し、（Ａ）はその平面図、（Ｂ）はその側面図である。このカンチレバー７０４は、シリコンで出来たカンチレバー本体部７０６と、同じくシリコンで出来た探針部７０８とを有する。探針部７０８には、電子線通過用のオリフィス７１０（直径：数μｍ）が形成されている。また、探針部７０８の先端には、一対のＣＮＴ探針７００が取り付けられている。図１０は、このピンセット型カンチレバー７０４の使用状態を示している。このピンセット型カンチレバー７０４を用いることにより、試料（例えば、ＤＮＡなどのナノスケールの分子やタンパク質）を拾い上げたり、挟み付けるなどの操作を電子線でその場観察しながら行うことができる。また、ピンセットの一方から他方へ電圧を印加するなど刺激を与えたときの形態変化を電子線で観察することができる。

図１１は、図７の例に加えて、試料（生細胞）に励起光を照射して試料（生細胞）が出す蛍光やラマン光を観察する場合である。

本発明に係る電子顕微鏡は、任意の試料（生細胞など生の生物試料を含む）に対して、前処理を全く必要とせず、大気圧の状態で観察を行うことができる電子顕微鏡として有用である。

本発明の実施の形態１に係る電子顕微鏡の全体構成を示すブロック図 図１に示す電子顕微鏡の要部を示す詳細図 図２に示す電子顕微鏡のさらに要部を示す詳細図 実施の形態１の一変更例を示す図 電子の平均飛行距離と圧力との関係を示すグラフ図 本発明の実施の形態２に係る電子顕微鏡の要部を示すブロック図 本発明の実施の形態３に係る電子顕微鏡の要部を示すブロック図 実施の形態３の一変更例を示す図 実施の形態３の他の変更例を示す図であって、（Ａ）はピンセット型カンチレバーの平面図、（Ｂ）はその側面図 図９に示すピンセット型カンチレバーの使用状態を示す図 実施の形態３のさらに他の変更例を示す図

符号の説明

１０、１０ａ、２０ 電子顕微鏡
１００ 真空筐体
１１０ 電子源
１１２ 第１コンデンサレンズ
１１６ コンデンサ絞り
１１８ 第２コンデンサレンズ
１２０ 偏向コイル
１２２ 対物レンズ
１２６ 対物絞り
１３０ オリフィス
１３２ 電子透過膜
２００ 試料室
２０２ 可動ステージ
２０４ スキャナ
２０６ 粗動ステージ
３００ 電子検出器
３０２ 二次電子検出器
３０４ 上部反射電子検出器
３０６ 下部反射電子検出器
７００ カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）探針
７０２、７０４ カンチレバー
Ｂ 電子線
Ｒ 反射電子
Ｓ 試料

Claims (13)

1. 真空に耐えることができ、かつ、電子に対する透過性を有する電子透過膜と、
   前記電子透過膜が取り付けられたオリフィスを一部に有する真空筐体と、
   前記真空筐体の内部において電子線を前記電子透過膜に向かって案内する電子線照射手段と、
   前記電子透過膜近傍の前記真空筐体の外部に配置され、前記電子線に対して相対移動可能に試料を載置する可動ステージと、
   前記電子線の照射に基づく前記試料からの電子を検出する電子検出手段と、
   を有することを特徴とする電子顕微鏡。
2. 前記電子透過膜と前記可動ステージの距離は、前記試料が存在する雰囲気の圧力と電子の平均飛行距離との関係に基づいて決定される、ことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
3. 前記電子透過膜がコロジオン膜である場合、前記オリフィスの径は１０μｍ以下であり、前記電子透過膜と前記可動ステージの距離は２００ｎｍ以下である、ことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
4. 前記試料が存在する雰囲気の圧力は、高真空（１０^−２Ｐａ）と大気圧（１０^５Ｐａ）の範囲内である、ことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
5. 前記電子検出手段は、
   前記電子線の照射に基づく前記試料からの反射電子を検出する反射電子検出手段を有する、
   ことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
6. 前記反射電子検出手段は、
   前記真空筐体の内部に配置され、前記電子透過膜を透過した前記試料からの反射電子を検出する、
   ことを特徴とする請求項５記載の電子顕微鏡。
7. 前記反射電子検出手段は、
   前記真空筐体の外部の雰囲気中に配置され、前記試料からの反射電子を直接検出する、
   ことを特徴とする請求項５記載の電子顕微鏡。
8. 前記反射電子検出手段は、
   前記真空筐体の内部に配置され、前記電子透過膜を透過した前記試料からの反射電子を検出する内部反射電子検出手段と、
   前記真空筐体の外部の雰囲気中に配置され、前記試料からの反射電子を直接検出する外部反射電子検出手段と、
   を有することを特徴とする請求項５記載の電子顕微鏡。
9. 前記電子検出手段は、
   前記電子線の照射に基づく前記試料からの二次電子を検出する二次電子検出手段と、
   を有することを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
10. 前記電子検出手段は、
    前記電子線の照射に基づく前記試料からの反射電子を検出する反射電子検出手段と、
    前記電子線の照射に基づく前記試料からの二次電子を検出する二次電子検出手段と、
    を有することを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
11. 前記電子透過膜は、前記真空筐体の外側から前記オリフィスに取り付けられている、ことを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。
12. 前記反射電子検出手段は、
    前記真空筐体上に一部が前記オリフィスを構成するように配置され、
    前記電子透過膜は、
    前記反射電子検出手段の外側から前記オリフィスに取り付けられている、
    ことを特徴とする請求項５記載の電子顕微鏡。
13. カーボンナノチューブの探針を用いて前記試料を観察および／または操作する試料観察／操作手段、をさらに有することを特徴とする請求項１記載の電子顕微鏡。

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