JP2005106790A - 走査型プローブ顕微鏡および分子構造変化観測方法 - Google Patents

Abstract

【課題】生化学反応に起因して起こる生体分子一個の構造変化を実時間で観測し得る走査型プローブ顕微鏡を提供する。
【解決手段】走査型プローブ顕微鏡１００は、原子間力顕微鏡機構と、倒立型顕微鏡を利用したケージド解除光導入機構とを有している。ケージド解除光導入機構は、倒立型顕微鏡を利用して構成されており、顕微鏡筐体１０１、接眼レンズ１０２、観察用照明光源１０３、ダイクロイックミラー１０５、ＣＣＤカメラ１０６、テレビモニター１０７と、ケージド解除光を射出するケージド解除用光源ユニット１２０とを有している。ケージド解除用光源ユニット１２０は、ケージド解除光を発するケージド解除用光源１２１と、光ファイバー１２２と、レンズユニット１２３と、ケージド解除光の通過を制御するシャッター１２４とを有している。
【選択図】 図１

Description

本発明は、走査型プローブ顕微鏡、特に生物分子の分子レベルの反応すなわち形態や構造の変化の観測に好適な走査型プローブ顕微鏡に関する。本発明は、また、そのような走査型プローブ顕微鏡を利用した分子構造変化観測方法に関する。

走査型プローブ顕微鏡（ＳＰＭ）は、探針を機械的に走査して試料表面の情報を得る装置の総称であり、走査型トンネリング顕微鏡（ＳＴＭ）や原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）、走査型磁気力顕微鏡（ＭＦＭ）、走査型電気容量顕微鏡（ＳＣａＭ）、走査型近接場光学顕微鏡（ＳＮＯＭ）、走査型熱顕微鏡（ＳＴｈＭ）などを含んでいる。

最近では試料表面にダイヤモンド製の探針を押しつけ圧痕をつけその圧痕のつき具合を解析して試料の固さなどを調べるナノインデンテータなども走査型プローブ顕微鏡の一つと位置づけられており、前述の各種の顕微鏡とともに広く普及している。

走査型プローブ顕微鏡は、探針と試料とを相対的にＸＹ方向にラスター走査し、所望の試料領域の表面情報を探針を介して得てモニターＴＶ上にマッピング表示することができる。

走査型プローブ顕微鏡の中でも特に原子間力顕微鏡は最も広く使用されている。原子間力顕微鏡は、探針をその自由端に持つカンチレバーと、カンチレバーの変位を検出する光学式変位センサーと、探針と試料とを相対的に走査する走査機構とを備えている。その光学式変位センサーには、簡単な構成で高い変位検出感度を有する光てこ式の光学式変位センサーが最も広く使われている。

市販されている原子間力顕微鏡においては、光てこ式の光学式変位センサーは、カンチレバー上に直径１０〜３０μｍ程度の光束を照射し、レバーの反りに応じた反射光の反射方向の変化を二分割または四分割光ディテクタなどで検知することにより、カンチレバーの自由端にある探針の動きを反映した電気信号を出力する。

原子間力顕微鏡は、走査機構により試料に対して探針をＸＹ方向に走査しながら、光学式変位センサーの出力を一定に保つように走査機構により試料に対する探針のＺ方向位置を制御することにより、試料表面の凹凸の状態をマッピングすると共に、これをコンピュータのモニタ上に表示する。

原子間力顕微鏡は、液体中の生きた生物試料の動く様子を光学顕微鏡より高い解像度で観察できる可能性があるとして注目されている。

生物試料の動く様子を観察できる装置に光学顕微鏡がある。しかし、光学顕微鏡は、回折限界のため光の波長以下の解像度で試料を観察することができない。

ナノメートルオーダーの高い解像度を実現できる装置として電子顕微鏡がある。しかし、電子顕微鏡は、測定対象物を液体中に配置できないため、液体中の生きた生物試料を観察することはできない。

これに対して原子間力顕微鏡は、ナノメートルオーダーの高い解像度を期待でき、試料が液体中にあっても観察可能である。しかも、光学顕微鏡と組み合わせ易いことも注目されている理由の一つである。

また、ケージド化合物を用いた光学顕微鏡観察法が知られている。この観察法は、ケージド化合物存在下で試料を光学的に観察しながらケージドを適宜解除することにより、試料の特定の反応を実時間で観察することを可能にしている。

ケージド化合物とは、「かご」のなかに閉じ込められた分子を、外部刺激により「かご」から開放できる分子の総称である。ケージド化合物としては、もともと生理活性や蛍光特性をもつ分子Ａに光感受性をもつ分子Ｂを結合させてＡの生理活性あるいは蛍光発光能力を抑制しておき、光刺激によりＡとＢとの結合を切りＡを開放できる分子がよく使われている。

ケージド化合物を用いた光学顕微鏡観察法においては、このようなケージド化合物を含む液体中の試料を光学的に観察しながら紫外光等のケージド解除光を照射して光刺激を与えることによりケージド化合物のケージドを解除する。これにより、ケージド解除により開放された分子と観測対象の生体分子等の試料との反応を実時間で観察し得る。すなわち、試料とケージド解除により開放された分子との反応における反応前・反応時・反応後のそれぞれの状態を時系列的に観察し得る。

ケージド解除光の照射の際、ケージド解除光を照射する範囲や強さや時間などを制御することにより、試料と反応し得る物質を生成させる位置や量やタイミング等を任意に変化させることもできる。ケージド解除光の照射後、試料の応答を蛍光標識を用いて追跡する。この分析を行なう光学顕微鏡では、試料の目的の位置を視野に入れて、保護基を解除する光の焦点を結ばせることも可能である。このため、ケージド解除光の照射位置を確認した上で目的の部位に照射する。
特許第３２６８７９７号 特開平８−４０４４２０号公報 特開２００１−３３０４２５号公報 「細胞の分子生物学第３版」教育社

原子間力顕微鏡は、走査速度が十分に向上されれば、液中の生体分子一個の形態変化をナノメートルオーダーの解像度で捉え得る。更には、タンパク質や核酸等の生体分子と反応する分子を液中に混在させることにより、生化学反応に伴ってタンパク質や核酸等の生体分子がその構造形態を変えて行く様子を直接観察し得る。

生体分子すなわち試料の動的な振る舞いを観察するためには、試料は基板に強く固定してはならず、部分固定する。あるいは、基板に固定した分子に動的な挙動を観察すべき試料を結合させる。

しかし、試料は、たとえ基板に部分固定されていても、絶えずブラウン運動をしており、反応の有無に関わらず常に動的状態にある。従って、ブラウン運動による動的状態の変化と反応による構造形態の変化とを区別して認識する必要があるが、それらを実際に区別して認識することは難しい。また、それらの区別ができていることを証明することは難しい。

ケージド化合物を用いた光学顕微鏡観察法では、紫外線照射により、ケージド化合物の解除のタイミングを制御できるので反応の前後の差を明確にできるが、光学顕微鏡は分子一個の構造や形態を画像化するには空間分解能が不十分なため、分子一個の構造や形態の変化を画像化することは不可能である。

本発明の主な目的は、生化学反応や機械的または電気的刺激による分子一個の構造や形態の変化を実時間で観測し得る走査型プローブ顕微鏡と分子構造変化観測方法を提供することである。

本発明は、ひとつには、走査型プローブ顕微鏡に向けられている。本発明の走査型プローブ顕微鏡は、カンチレバーと、液中に存在するカンチレバーと試料を相対走査する走査機構と、液中または試料中に存在するケージド化合物に解除光を照射する照射機構とを有している。

本発明の別の走査型プローブ顕微鏡は、カンチレバーと、液中に存在するカンチレバーと試料を相対走査する走査機構と、カンチレバーと試料との間の相互作用によるカンチレバーの変位を光学的に検出する検出機構と、液中または試料中に存在するケージド化合物に解除光を照射する照射機構と、検出機構に解除光が届かないようにする光学素子と、試料またはカンチレバーまたはカンチレバーの自由端に保持された探針の内、少なくとも一つを観察する光学顕微鏡とを有している。

本発明は、ひとつには、分子構造変化観測方法に向けられている。本発明の分子構造変化観測方法は、液中の試料をカンチレバーで走査しながら液中または試料中に存在するケージド化合物の保護基を解除する光を照射する工程を有している。

本発明によれば、生体組織や細胞やタンパク質分子等の生物分子の生化学反応に起因して起こる形態変化を実時間で観測し得る走査型プローブ顕微鏡と分子構造変化観測方法とが提供される。これにより、生物分子の形態変化を、その生化学反応との直接の結果として他の条件から分離して観察・測定できるようになる。

以下、図面を参照しながら本発明の実施の形態について説明する。

本発明の実施形態の走査型プローブ顕微鏡について図１を参照しながら説明する。図１は、本実施形態の走査型プローブ顕微鏡の全体構成を示している。

図１において、走査型プローブ顕微鏡１００は、大まかに、原子間力顕微鏡機構と、倒立型顕微鏡を利用したケージド解除光導入機構とで構成されている。

ケージド解除光導入機構は、市販されている倒立型顕微鏡を利用して構成されており、顕微鏡筐体１０１、接眼レンズ１０２、観察用照明光源１０３、ダイクロイックミラー１０５、ＣＣＤカメラ１０６、テレビモニター１０７と、ケージド解除光を射出するケージド解除用光源ユニット１２０とを有している。

ケージド解除用光源ユニット１２０は、ケージド解除光を発するケージド解除用光源１２１と、ケージド解除光を伝達する光ファイバー１２２と、ケージド解除光のビームの広がりを適切に抑えるレンズユニット１２３と、ケージド解除光の通過を制御するシャッター１２４とを有している。

ケージド解除光導入機構は更に、ケージド解除用光源ユニット１２０から射出されるケージド解除光のビームをダイクロイックミラー１０５に導くためのミラー１２５を有している。

ケージドの解除が紫外光を用いて行なわれる場合、ケージド解除用光源１２１は、例えば、紫外光光源としてよく使用される水銀ランプで構成される。あるいは、ケージド解除用光源１２１は、イットリウムＹＡＧレーザーを含み、その波長１０２４ｎｍの三倍波を作り３５５ｎｍの紫外光を発するように構成された光源で構成されてもよい。

シャッター１２４はコンピュータ１１８から供給される制御信号に従って開閉する。シャッター１２４は、例えば、ケージド解除用光源ユニット１２０からケージド解除光がパルス的に射出されるように、間欠的に開くようにその開閉が制御される。

また、ケージド解除用光源１２１がイットリウムＹＡＧレーザーを用いた光源で構成されている場合、イットリウムＹＡＧレーザーを制御することにより、ケージド解除用光源ユニット１２０は、数ナノ秒のパルス幅を持つパルス状のケージド解除光を射出し得る。最近では、半導体レーザー光源により紫外領域のレーザー光を射出し、高速にＯＮ-ＯＦＦを繰り返すことができる。

原子間力顕微鏡機構は、顕微鏡筐体１０１に固定される板状構造部材１０８と、原子間力を検出するためのカンチレバー１１４と、試料を保持すると共に走査するための走査機構１２００を含む試料位置調整機構１０９と、カンチレバーの変位を検出するための光てこ式光学センサー１１３とを含んでいる。

顕微鏡筐体１０１には、通常のステ一ジの代わりに、低熱膨張材（例えば、インバー）で作られた板状構造部材１０８が取り付けられ固定されている。試料位置調整機構１０９と光てこ式光学センサー１１３は、それぞれ、倒立型顕微鏡の顕微鏡筐体に固定される板状構造部材１０８の上下に直に配置されている。

光てこ式光学センサー１１３は、板状構造部材１０８の下側に配置されており、板状構造部材１０８によって支持されている。光てこ式光学センサー１１３は、対物レンズ１１５とダイクロイックミラー１１６を含んでおり、対物レンズ１１５は、倒立型顕微鏡観察を行うための対物レンズの機能と、光てこ式光学センサー１１３の集光レンズの機能とを併せ持っている。ダイクロイックミラー１１６は、光てこ式光学センサー１１３のセンサー光とケージド解除のための光とを分離し、ケージド解除光が光てこ式光学センサー１１３に入らないように機能する。

試料位置調整機構１０９は走査機構１２００を含んでおり、走査機構１２００には、試料が固定された試料台ガラス１１１が取り付けられる。試料位置調整機構１０９は、これに取り付けられた試料台ガラス１１１がカンチレバー１１４と向き合うように、板状構造部材１０８の上に置かれる。

試料位置調整機構１０９は、その自重によって板状構造部材１０８の上に安定して載置されるが、バイトンゴム製等の輪ゴムなどを用いて板状構造部材１０８に一層強く固定されてもよい。

原子間力顕微鏡機構は更に、コントローラ１１７とコンピュータ１１８とモニターＴＶ１１９とを含んでいる。走査機構１２００と光てこ式光学センサー１１３は、コントローラ１１７とコンピュータ１１８に接続されており、これらによって制御される。

走査型プローブ顕微鏡１００では、倒立型顕微鏡においてステージが置かれる位置に、厚く剛性の高い板状構造部材１０８が配置され、これが倒立型顕微鏡の顕微鏡筐体１０１に固定されている。また、板状構造部材１０８は原子間力顕微鏡の構造上の中心部材を成しており、その上下に、走査機構１２００を含む試料位置調整機構１０９と、光てこ式光学センサー１１３とが配置されている。従って、走査型プローブ顕微鏡１００は、生物試料の観察への適用に満足な高速走査を実現するに十分な程、高い剛性を有し、振動ノイズに強い構造となっている。その結果、ＡＦＭ観察を高速で安定して行うことができる。

また、板状構造部材１０８の直上と直下に試料位置調整機構１０９と光てこ式光学センサー１１３とが配置されているため、原子間力顕微鏡機構はコンパクトに構成されている。その結果、この原子間力顕微鏡機構は、ＡＦＭ測定時に、装置周りの雰囲気による熱ドリフトが非常に少ない構造となっている。

次に、原子間力顕微鏡機構について図２を参照しながら詳しく説明する。図２は、図１の走査型プローブ顕微鏡１００の主要部分の構成を示している。図２において、図１と共通する部材は、同一の参照符号で示されている。

光てこ式光学センサー１１３は、その主要な光学要素を収容するユニットボックス２０１を有しており、このユニットボックス２０１は板状構造部材１０８にねじ止めにより固定されている。

光てこ式光学センサー１１３は、ユニットボックス２０１に収容される主要な光学要素として、対物レンズ１１５、対物レンズ支持台２０４、Ｚステージ２０３、ダイクロイックミラー１１６、四分の一波長板２０５、偏光ビームスプリッタ２０６、コリメータレンズ２０７、半導体レーザー２０８、レーザー位置調整ステージ２０９、位置検出フォトダイオード２１０、フォトダイオード位置調整ステージ２１１を有している。

ダイクロイックミラー１１６は、二つの三角プリズムを張り合わせて作られており、菱形様形状を有している。このため、ダイクロイックミラー１１６の端面は光軸に対して３〜４度程度傾いている。これにより、ダイクロイックミラー１１６の端面での反射で生じた迷光が光てこ式光学センサー１１３に与える悪影響が低減されている。

半導体レーザー２０８から発せられたレーザー光は、コリメータレンズ２０７で平行光にされ、偏光ビームスプリッタ２０６によって特定の直線偏光成分の光のみが反射される。反射された直線偏光のレーザー光は、四分の一波長板２０５によって円偏光に変換された後、ダイクロイックミラー１１６で反射され、対物レンズ１１５により集光され、カンチレバー１１４の背面に照射される。対物レンズ１１５は例えば２０倍の倍率を有しており、レーザー光のスポット径は２μｍ程度まで絞られる。高速なＡＦＭ観察のために形状の小さなカンチレバーを使用しても、レーザー光のスポット径はそのカンチレバーの背面の幅よりも狭い。これにより光てこ式光学センサーのセンサー光のほとんどはカンチレバー背面で反射され、カンチレバー１１４の上方に配置される試料に到達する光は少ない。

カンチレバー１１４の背面で反射されたレーザー光は、対物レンズ１１５を通り、ダイクロイックミラー１１６で反射された後、この円偏光は四分の一波長板２０５では直線偏光に変換され、偏光ビームスプリッタ２０６を直進して、位置検出フォトダイオード２１０に照射される。試料との相互作用によるカンチレバー１１４の先端の変位は、位置検出フォトダイオード２１０上のレーザー光スポットを移動させる。位置検出フォトダイオード２１０は、このレーザー光スポットの移動を反映した電気信号をプリアンプ回路２２１に出力する。

ユニットボックス２０１は下側に開口２０２を有しており、その下方にはダイクロイックミラー１０５が配置されている。ダイクロイックミラー１０５は、ケージド解除用光源ユニット１２０からのケージド解除光を開口２０２を介して対物レンズ１１５ヘと導き、ケージド解除光は、試料もしくはカンチレバー１１４付近の液中または試料中にあるケージド物質のケージドを解除する。ダイクロイックミラー１０５は、ダイクロイックミラー１１６と同様に、菱形様ミラープリズムで構成されており、これにより、その端面での反射で生じた迷光が光学顕微鏡観察像に与える悪影響が低減されている。

対物レンズ１１５の上方には透明板２２８が配置されており、透明板２２８は透明板２２８の周辺部を保持する透明板保持部材２１６を介して板状構造部材１０８に保持されている。透明板２２８にはカンチレバー１１４が接着により固定されている。カンチレバー１１４は、その探針が、下向きに保持された試料台ガラス１１１および試料と対峙するように、上向きに配置される。

原子間力顕微鏡の測定モードの一つに、カンチレバーを振動させながら行うＡＣモードＡＦＭ測定法がある。原子間力顕微鏡機構は、このＡＣモードＡＦＭ測定法の実施のために、カンチレバー１１４を振動させるための励振用圧電体２１９を更に有している。励振用圧電体２１９は透明板保持部材２１６に接着により固定されている。

励振用圧電体２１９には、カンチレバー１１４の共振周波数付近の周波数を持つ交流電圧が発振回路２２２から印加され、励振用圧電体２１９は、この交流電圧の印加に応じて振動する。この振動は、透明板保持部材２１６、透明板２２８を伝わって、カンチレバー１１４に達し、カンチレバー１１４は、その周波数の振動により共振を起こし、Ｚ方向に大きく振動する。

試料位置調整機構１０９は走査機構１２００とその支持機構を含んでいる。走査機構１２００は、特開２００１−３３０４２５号公報（特許文献３）に開示されたものと同じである。支持機構は、走査機構１２００を支持する走査機構支持台２１２と、これを板状構造部材１０８に対して三点支持する三本のマイクロメータヘッド２１３(図２には二本のみが描かれている)と、走査機構支持台２１２に設けられた粗動機構２１８とを有している。粗動機構２１８は、マイクロメータを利用した機構で、走査機構支持台２１２に対して走査機構１２００を移動し得る。

走査機構１２００は、走査機構支持台２１２に対して、三つの当て付け部材２１７(図２には二個だけ描かれている)により三点支持されており、自重により軽い力や振動では動かないようになっている。粗動機構２１８により、走査機構支持台２１２に対して走査機構１２００を移動させることにより試料のＸＹ方向の移動が行なわれる。また、三本のマイクロメータヘッド２１３の調整により、走査機構支持台２１２の高さ位置を変えることにより、試料のＺ方向の移動が行なわれる。

走査機構１２００は、Ｚ方向の走査を担うＺ走査用アクチュエータとＸ方向の走査を担うＸ走査用アクチュエータとＹ方向の走査を担うＹ走査用アクチュエータとを有しており、更に、Ｚ走査用アクチュエータの下端に固定された円錐台型の試料保持部材２２９を有している。試料保持部材２２９の下端には、試料を保持した試料台ガラス１１１がシリコーングリースを介して固定される。この固定は、シリコーングリースを試料保持部材２２９と試料台ガラス１１１とに塗りそれらを軽く押さえ付けることで行なわれる。また、別の試料を観察するための試料台ガラス１１１の交換の際には、試料台ガラス１１１は、これを試料保持部材２２９の接着面方向(横方向)に滑らせることで、簡単に取り外され得る。

試料保持部材２２９への試料台ガラス１１１の取り付けや取り外しは、試料位置調整機構１０９を走査型プローブ顕微鏡１００から外された状態で行われる。

図２において、試料、試料台ガラス１１１、カンチレバー１１４などは液２２７の中に保持されている。液２２７は、表面張力により試料やカンチレバー１１４近傍をおおい、蒸発するまでその領域に留まっている。

原子間力顕微鏡機構は、生きた生物試料を観察する時の必須の要件である液体中観察が可能であり、従って、走査型プローブ顕微鏡１００は、試料が液体中に置かれていても、光学顕微鏡観察および原子間力顕微鏡観察が可能である。

原子間力顕微鏡機構は、コントローラ１１７とコンピュータ１１８とモニターＴＶ１１９と組み合わされている。これらは、原子間力顕微鏡機構の制御駆動や信号処理を行ない、最終的に試料の凹凸情報をモニターＴＶ上に表示し、これにより、使用者は試料の表面情報に関する知見を得ることができる。

コントローラ１１７は、例えば、半導体レーザー駆動回路２２０、プリアンプ回路２２１、発振回路２２２、ＡＣ/ＤＣ変換回路２２３、フィードバック回路２２４、走査制御回路２２５、アクチュエータ駆動回路２２６を含んでいる。

走査型プローブ顕微鏡１００においては、生体分子の観測に先立って、カンチレバー１１４に対する光てこ式光学センサー１１３のセンサー光の照射位置を調整のために、カンチレバー周辺が観察される。その際には、観察用光源１０３からの光を対物レンズ１１５に導入するために、図示されていないが、ミラー１２５は光路から取り除かれ、ダイクロイックミラー１０５もセンサー光の波長を通すミラープリズムに切り替えられる。

続いて、走査機構１２００について図３と図４を参照しながら説明する。図３は、走査機構の斜視図であり、図４は、図３の走査機構を矢印Ｃの方向から見た側面図である。なお、走査はカンチレバーを駆動して試料と相対走査させてもよい。

走査機構１２００は、ベースプレートである走査機構保持台１２０１と、これに固定された第１のアクチュエータ保持部１２０６と、このアクチュエータ保持部１２０６に取り付けられたＹ軸に沿って伸縮可能なＹ走査用アクチュエータ１２０２と、Ｙ走査用アクチュエータ１２０２の他端に取り付けられたブロック１２０８と、ブロック１２０８に固定された第２のアクチュエータ保持部１２０９と、このアクチュエータ保持部１２０９に取り付けられたＸ軸に沿って伸縮可能なＸ走査用アクチュエータ１２０３と、Ｘ走査用アクチュエータ１２０３の他端に取り付けられたアクチュエータ連結部１２１１と、アクチュエータ連結部１２１１に固定されたＺ軸に沿って伸縮可能な二本のアクチュエータ１２０４、１２０５とを有している。

二本のアクチュエータ１２０４、１２０５とアクチュエータ連結部１２１１は、Ｚ走査用アクチュエータを構成している。Ｚ走査用アクチュエータを構成するアクチュエータ１２０４の自由端側１２２６には、試料保持部２２９が取り付けられる。第１のアクチュエータ保持部１２０６はねじ１２０７によって走査機構保持台１２０１に固定されており、第２のアクチュエータ保持部１２０９はねじ１２１０によってブロック１２０８に固定されている。

図４に示されるように、Ｙ走査用アクチュエータ１２０２の駆動に従ってＹ軸に沿って移動されるブロック１２０８は、走査機構保持台１２０１と第１の抑え板１２１２との間に位置しており、微小球１２１６、１２２２、１２２４、１２２５、１２１５(図３参照)によって挟み込まれている。走査機構保持台１２０１と抑え板１２１２は、互いに平行に固定されるように、ねじ１２１３、１２１４によって間隔が調整されている。これにより、ブロック１２０８は、Ｙ軸に沿った動きに関しては大きな制約を受けないが、Ｚ軸に沿った動きが制限される。

Ｘ走査用アクチュエータ１２０３の駆動に従ってＸ軸に沿って移動されるアクチュエータ連結部１２１１は、ブロック１２０８と第２の抑え板１２１７との間に位置しており、微小球１２１９、１２２０により上から、また微小球１２２１により下から支えられて、Ｚ軸に沿った動きが制限されている。ブロック１２０８と抑え板１２１７は、互いに平行に固定されるように、ねじ１２１８、１２２７によって間隔が調整されている。これにより、アクチュエータ連結部１２１１は、Ｘ軸に沿った動きに関しては大きな制約を受けないが、Ｚ軸に沿った動きが規制される。

このように走査機構１２００では、抑え板１２１２とねじ１２１３、１２１４と微小球１２１６、１２１５、１２２２、１２２４、１２２５を含む微小球の転がりあるいは滑り案内によって、Ｙ走査用アクチュエータ１２０２のたわみと振動が抑えられており、また、抑え板１２１７とねじ１２１８、１２２７と微小球１２１９、１２２０を含む微小球の転がりあるいは滑り案内によって、Ｘ走査用アクチュエータ１２０３のたわみと振動が抑えられている。

従って、走査機構１２００は、生物試料の観察への適用に満足な高速走査を実現し得るに十分な程、高い機械的剛性を有し、発生する振動が少ない。

以下、本実施形態の走査型プローブ顕微鏡１００の動作、すなわち本実施形態における分子構造変化観測方法について図５を参照しながら説明する。図５は、カンチレバー周辺を模式的に示している。図５において、図２と共通する部材は同一の参照符号で示されている。

図５に示されるように、透明板２２８の上に保持された液２２７は、試料台ガラス１１１やカンチレバー１１４を取り囲んでおり、その中には、ケージド化合物２３０が含まれている。ケージド化合物２３０は、例えば、生体分子である試料Ｓと反応する低分子化合物（例えば、ＡＴＰ、Ｃａ²⁺、Ｇｌｕなど）に光感受性分子を結合させて生化学的・生理的機能の発現をさせないように（以下、ケージド化と言う）した物質である。このようなケージド化合物２３０は、短時間の光刺激に対してケージドを解除して、活性を持つ化合物を瞬時に生成する。

走査型プローブ顕微鏡１００は、走査機構１２００により試料台ガラス１１１に保持された試料Ｓを移動させることによって、カンチレバー１１４の自由端部に位置する探針１１４ａに対して試料ＳをＸＹ方向に走査する。このＸＹ走査の間、光てこ式光学センサー１１３は、センサー光Ｌsをカンチレバー１１４の自由端部に照射して、カンチレバー１１４の自由端部すなわち探針１１４ａの変位を監視する。更に、コントローラ１１７は、光てこ式光学センサー１１３の検出信号を一定に保つように、走査機構１２００により試料台ガラス１１１に保持された試料Ｓを移動させて、探針１１４ａに対する試料ＳのＺ方向位置を制御する。コンピュータ１１８は、これらの一連の制御の信号、ＸＹ走査信号とＺ制御信号とに基づいて、試料Ｓの表面形状の情報を取得（以下、マッピングと言う）し、その像をモニターＴＶ１１９に表示すると共に適宜記録する。

走査型プローブ顕微鏡１００は、更に、このようにして試料Ｓの表面の形状を取得しながら、ケージド解除用光源ユニット１２０によりケージド解除光Ｌcを探針１１４ａの近傍領域に照射する。ケージド解除光Ｌcの照射を受けたケージド化合物２３０は、ケージドを解除して、瞬時に活性を持つ化合物を生成する。このように生成された活性を持つ化合物は、試料である生体分子Ｓと反応する。

走査型プローブ顕微鏡１００は、ケージド解除により生成された活性を持つ化合物と、試料である生体分子Ｓとの生化学反応が進行する間も、例えば生体分子である試料Ｓの表面形状のマッピングを続ける。従って、活性を持つ化合物と生体分子Ｓとの反応の経過が実時間で観察される。このようにして、その反応における反応前・反応時・反応後のそれぞれの状態の像が取得され得る。

走査型プローブ顕微鏡１００では、ケージド解除光の照射によって、観測対象の生体分子と反応し得る活性を持つ化合物の生成のタイミングを制御している。これにより、活性を持つ化合物と生体分子の反応のタイミングを実質的に制御できる。その結果、その反応の前後における生体分子の像を得ることができる。従って、ブラウン運動による生体分子の動的状態の変化と反応による生体分子の構造形態の変化とを明確に区別して認識することができる。すなわち、生体分子の反応に起因して起きる分子構造形態の変化を観測することができる。

次に、本実施形態の走査型プローブ顕微鏡１００をケージドＡＴＰとケージドＣａ²⁺を脳の輸送タンパク質のひとつであるミオシンＶの分子構造変化観測に適用した具体例について述べる。

ミオシンファミリーはモータータンパク質であり、ＡＴＰ加水分解で生ずるエネルギーを力学的エネルギーに変換するが、その変換がいかなる機構によって起こるかは長い間研究されているが、未解明のままである。ミオシンのＡＴＰ分解反応サイクル中に起こるであろう大きな構造変化が力学的作用として働くという考え方は古くから唱えられているが、それを直視することができずにいるため、はっきりした証拠は未だに得られていない。

一具体例においては、高速走査型プローブ顕微鏡１００を用いて、ミオシンＶをバッファー溶液中でマイカに部分吸着させた系にケージドＡＴＰを混在させ、そこにケージド解除光を当てる前後における生体分子Ｓの像を連続的に取得した。図６は、そのようにして得られた、ケージド解除光の照射前（I）と照射直後（II）と照射後しばらく（数秒）経過した後（III）の生体分子Ｓの像を示している。また、図７は、その反応による生体分子Ｓの構造形態の変化を模式的に示している。

また、ミオシンＶは、カルシウム非存在下でその頚部にカルモジュリン分子を４分子結合している。カルシウムを加えるとカルシウムはカルモジュリンに結合し、カルモジュリンは頚部から解離する。

別の具体例においては、高速走査型プローブ顕微鏡１００を用いて、ケージドＣａ²⁺を用いて、解除光を当てる前後における生体分子Ｓの像を連続的に取得した。図８は、そのようにして得られた、ケージド解除光の照射前（I）と照射後（II）の生体分子Ｓの像を示している。また、図９は、その反応による生体分子Ｓの構造形態の変化を模式的に示している。

これらの具体例から分かるように、本実施形態における走査型プローブ顕微鏡１００あるいは分子構造変化観測方法は、生化学反応と生体分子の構造形態とを同期させて観察でき、その構造形態が変化する原因を反応に直結できるという点で極めて優れている。

従って、本発明に従う走査型プローブ顕微鏡と分子構造変化観測方法は、その普及と共に今後多用されて行くものと予想される。例えば、本発明は、生物学の研究や、創薬や治療のための実験や検証等に利用され得る。

以上のような反応は、ｐＨやイオンの存在など、環境や触媒の存在によっても影響を受ける。反応を起こさせるための条件を時間制御すると、条件が満足される前と後の現象を捉えて比較することができる。反応に必要な物質、分子を液中にケージド化合物の状態で存在させ、ケージド解除光を照射する時間を制御することによってケージド化合物の状態から活性の状態に変化するタイミングと長さを制御する。液中ではケージド化合物は試料の近傍にも常に存在し、ケージドが解除されると、その瞬間に、または、短時間の内に反応が起こり、反応前後の差を捉えやすい。この時間はケージド化合物の濃度や他の条件に影響される。また、反応を瞬時に開始できるため、目的の反応のみの結果を反応直後から経時的に観察、測定、目的分子または結合分子の追跡が可能となる。

上述した実施形態では、ケージド化合物のケージドを解除するためのケージド解除光を、カンチレバーの変位を検出するための光てこ式光学センサーと共用する対物レンズを介して下方から照射しているが、ケージド解除光の照射形態は、これに限定されない。ケージド解除光は、側方から照射されてもよく、また試料台ガラス１１１を通して上方から照射されてもよい。

ケージド化合物はインジェクションにより組織内や細胞内に導入されてもよい。また、細胞膜や膜タンパク質の研究テーマではパッチクランプ法を応用して、キャピラリー内にケージド化合物を導入してもよい。探針の先端に核膜消失に寄与するタンパク質や物質、イオンなどをケージド化して修飾し、核膜に接触または近傍に導入してケージド解除光を照射する。これによって、細胞分裂時の核膜消失の機序を解明するための実験を行なうことが可能となる。逆に、探針の先端にＲＮＡ（リボ核酸）を吸着するためのＲＮＡ結合タンパク質をケージド化して修飾し、探針を核内に挿入してケージド解除光を照射する。これによって、核内のＲＮＡを取り出す量を制御することが可能となる。

ケージド解除の前後で目的分子上で、または、所定の場所でフォースカーブを測定してもよい。

カンチレバーや探針を分子または官能基で修飾し、その分子との反応を走査しながら検知するために、カンチレバー自由端の変位を検出するために四分割ダイオード等の二次元センサーを用いてもよい。カンチレバーや探針を例えばケージド化したタンパク質分子を修飾して、修飾したタンパク質分子と特異結合する別のタンパク質や物質との結合を検出する実験が行なわれている。この結合力検出または所定の結合力検出をした時点で解除光を照射する。結合力測定は継続しているので、結合がなくなっているか、または、結合力が強くなっているかの変化を知ることが可能となる。

ケージド解除光には、紫外光の他にも、可視域や赤外域の光が用いられてもよい。可視域や赤外域の光は、紫外光に比べてエネルギーが低いが、２フォトン効果やマルチフォトン効果を利用することにより、ケージド解除に十分なエネルギーを得ることが可能である。これらの波長帯では細胞やタンパク質など生体に対する毒性が少ないので紫外線をそのまま照射するよりアーティファクトが少ない観測結果を期待できる。

この実施形態では、倒立型顕微鏡を用いて説明したが、これに限る必要はなく、正立型光学顕微鏡としてもよい。カンチレバーと照明または励起光学系および観察光学系の配置も実施可能な範囲で選択することができる。例えば、図５において、試料台ガラス１１１の上方から観察してもよい。また、照明や励起光学系では透過型、落射型を用いてもよいし、カンチレバーの探針がある側から、および、探針がない側から照明光や励起光を導入してもよい。また、図１０に示すように、ケージド解除のためのエネルギーを供給する方法としてエバネッセント場の利用がある。試料が置かれた、または、固定された基板の試料とは反対側で光やレーザー光を全反射させる。このとき、試料がある基板表面近傍にエバネッセント場が発生する。このエバネッセント場に存在する蛍光物質から蛍光を出させる実験が行なわれている。全反射させる光を紫外域の光やレーザー光とすることによって、試料が存在する基板表面近傍のみの場所でケージド解除を行なうことができる。これらの光学顕微鏡は、解除光の照射の他、励起光の照射や観察を行なう装置とすることができる。

更に、光学顕微鏡は走査型共焦点顕微鏡とすることができる。共焦点顕微鏡の走査方法としては、ピンホールと共役な位置に合焦した光を二次元あるいは三次元に走査する方法、ピンホールやスリットを形成したディスクを回転する方法、複数のフォトンを蛍光物質に作用する２フォトンまたはマルチフォトン励起による方法等がある。共焦点顕微鏡に用いる共焦点光学系の効果は蛍光を励起させる領域を時間に加えて空間的にも限定し、かつ、指定できることである。つまり、励起させる領域は、細胞の表面の一部であったり、細胞内部のオルガネラや核内である。その空間的広がりは１ミクロン以下から大きくは非共焦点による照射領域まで目的に応じて調整する。「細胞の分子生物学第３版」教育社（非特許文献１）に開示されている実験では、細胞分裂期に紡錘体を形成し、その中央部に染色体の列を保持している複数の微小管に対して、片方の微小管のみに対して微小管を横切る面内に光を照射することができる。光は紫外線を用いてケージド解除を行なうことができる。また、微小管を標識する蛍光物質を用いて微小管が分解と成長をする様子が観測できる。このとき、カンチレバーは染色体が微小管上を移動する力や、染色体を運ぶタンパク質分子の移動する力を検出する。なお、走査型共焦点顕微鏡はその対物レンズとして対物レンズ１１５を用いて図５の下方に構成してもよいし、別の対物レンズを用いて上方に構成してもよい。

共焦点光学系の光照射空間限定の効果は、カンチレバー自由端の変位検出用のレーザー光学系に影響する確率を軽減できる。照明光・励起光側のピンホールを通過した光は試料近傍において結像系の光学系よりも限定された空間で光ビームを形成する。この光ビームがカンチレバーに当たって光が散乱して変位検出の検出器に導かれて影響を及ぼすことがなければ、その範囲で試料の広がりの内でカンチレバーにできるだけ近い部位を走査できる。条件が許せば共焦点光学系の走査中にカンチレバーによる散乱がある部位とない部位を繰り返しても構わない。このとき、共焦点光学系であれば結像系の光学系より散乱を受ける範囲は相対的に広くなる。走査型共焦点顕微鏡は、光学顕微鏡と同様に解除光の照射の他、励起光の照射や観察を行なう装置とすることができる。

走査型共焦点顕微鏡を含む光学顕微鏡による解除光・励起光・照明光の照射は、走査型プローブ顕微鏡による観測データにとって許される程度の極短い時間であれば、カンチレバーの自由端変位検出に影響しても構わない。一方、グレーティング法や特開平８−４０４４２０号公報（特許文献２）に開示されている方法により、解除光・励起光・照明光・観察光・カンチレバー自由端変位検出光などの内の使用する光を波長分別することで空間的・時間的な制約は解消される。

図５におけるカンチレバー１１４は、特許第３２６８７９７号（特許文献１）に開示されている近接場光学顕微鏡用のカンチレバーと装置に置き換えられてもよい。これにより、走査型プローブ顕微鏡の一つである走査型近接場光学顕微鏡はケージド解除機能を有する装置になる。ケージド化合物の導入やケージド解除の時間や空間の制御や制限はカンチレバー１１４を用いた場合と同様である。

そこで、以下では、反応性の物質、例えば、金属イオン、高分子イオン、タンパク質、等を空間的に一箇所に局在させておき、解放するための信号、例えば、電圧、電流、光、流れを入力することで、原子間力顕微鏡の観察対象となる細胞、分子などの試料に変化をもたらす誘因とする例を挙げる。

図１１は、試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するためのひとつの構成を示している。

図１１に示されるように、まず、試料に変化をもたらす物質３００がかろうじて通り抜けられるだけの穴の開いた先端を持つ細管（キャピラリ）３０１に特定の濃度で変化をもたらす物質３００を閉じ込めて置く。

試料Ｓおよびカンチレバー１１４を含む溶液中に、キャピラリ３０１の先端部分と、対向電極３０２とを配置する。

キャピラリ３０１内部には電極３０３があり、この電極３０３には電源３０４の一方の電極が接続される。電源３０４の他方の電極は対向電極３０２に接続される。電源３０４は対向電極３０２とキャピラリ内の電極３０３の間の電位差を制御する。キャピラリ内に存在するイオン性の物質は、キャピラリ内外に電位差をかけることにより、キャピラリ先端の細孔からイオン電流として試料の存在する液体領域２２７に移動する。

試料Ｓに変化をもたらす物質３００は、それ自身がイオン性を持つ物質であっても、イオン性の物質の流れに応じて移動する中性の物質であっても構わない。

電源３０４の作用する前後の画像を取り込み比較することにより物質３００による試料Ｓへの影響を観察できる。

電源３０４は、記載していない原子間力顕微鏡の測定および画像取り込みを制御するコントローラと接続され、画像取り込みの特定のタイミングに合わせて電位差を作ることを行っても構わない。更に、電源３０４は電流制御の機能を持つものでも構わない。

また、キャピラリ３０１の先端の空間を仕切る構造は、細孔であることに限らず、反応性の物質３００およびイオン電流の元となるイオンのブラウン運動による透過をイオン電流による移動に比べて著しく制限するものであればよく、例えば、多孔質の高分子膜、セラミクス、ゲル状物質、イオンチャネル等であっても構わない。

図１１では、キャピラリ３０１の先端は、溶液２２７の中に配置されているが、試料Ｓが細胞であれば細胞内に挿入されてもよく、その場合、反応性の物質３００が供給される位置を細胞内に限定することができる。

図１２は、試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するための別の構成を示している。

図１２に示されるように、キャピラリ３０１の周りに管状の圧電体３１０を設け、キャピラリ３０１内の容積を変動させる機能を付与している。圧電体３１０は、圧電体電源３１１からの信号供給に応じて振動し、キャピラリ３０１内の容積を変動させる。これにより、反応性の物質３００がキャピラリ３０１の先端から強制的に吐出される。

図１２の構成において、容積を変動させることに伴う振動の影響が有る場合には、キャピラリ３０１の先端部と容積変動を起こす部分とを柔軟な素材の管でつないで振動がキャピラリ３０１の先端部に伝わらないようにしてもよい。

図１２において、管状の圧電体３１０の代わりにヒーターを設け、ヒーターによる加熱により、キャピラリ３０１内の溶液（反応性の物質３００）を気化させることにより、あるいは、キャピラリ３０１自身を膨張・収縮させてキャピラリ内の容積を変動させることにより、反応性の物質３００をキャピラリ３０１の先端から強制的に吐出させてもよい。

図１１と図１２の構成において、ケージド解除光Ｌcを照射する機構が組み合わされてもよい。図１３は、その一例として、図１１の構成に対してケージド解除用の光Ｌcを照射する機構が組み合わされた構成を示している。

図１３において、ケージド解除光Ｌcは、ダイクロイックミラー１０５を透過し、対物レンズ１１５を介して、カンチレバー１１４付近の液中に照射される。

この構成においては、反応性の物質３００をケージド試薬とし、ケージド試薬の導入のタイミングとケージド解除光Ｌcを照射するタイミングを同期させることにより、少量のケージド試薬でも試料Ｓの反応を見ることが可能になる。

図１４は、試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するための別の構成を示している。この構成では、金コロイド等のナノ粒子の表面にケージド化合物を付与しておき、レーザトラップを用いて探針近傍位置にナノ粒子を集め、ケージド解除光の照射によりケージド化合物を解除する。

図１４に示されるように、ダイクロイックミラー１０５の下方に、ケージド解除光Ｌcを透過しトラップ光Ｌtを反射するダイクロイックミラー３３０が配置されている。なお、ダイクロイックミラー１０５は、ケージド解除光Ｌcに加えてトラップ光Ｌtをも透過する。

このような構成により、ケージド解除光Ｌcとトラップ光Ｌtは、ダイクロイックミラー３３０で結合され、ダイクロイックミラー１０５と対物レンズ１１５を介して、カンチレバー１１４付近の液中に照射される。従って、トラップ光Ｌtとケージド解除光Ｌcは同じ位置に照射される。

この手法においては、表面にケージド化合物を付与した金コロイド等のナノ粒子３２２をあらかじめ溶液２２７中に導入しておく。トラップ光Ｌtとケージド解除用のＵＶ光Ｌcとを、図１５に示されるように、カンチレバー１１４の探針１１４ａ近傍に、集光位置を一致させて、溶液２２７中に照射する。トラップ光Ｌtの照射に応じて、溶液２２７中のナノ粒子３２２はトラップ光Ｌtのスポット３２０に集まる。トラップ光Ｌtのスポット３２０にはケージド解除光Ｌcも照射されているため、トラップ光Ｌtのスポット３２０に集まったナノ粒子３２２の表面に付与されたケージド化合物が解除される。

ケージド解除光Ｌcをコロイド粒子の位置に合わせる方法としては、光軸の角度を変える方法のほか、視野位置を限定する方法でも行なうことができる。これは絞りや、デフォーマブルミラーのようなものを使って行なうことができる。

図１６は、試料Ｓと反応する荷電性の分子を試料周辺の溶液内への供給するための別の構成を示している。この構成では、キャピラリの代わりに、導電性の針を使用する。

図１６に示されるように、まず、導電性の針４００の先端部に、試料Ｓと反応する荷電性の分子４０１を付着させ、荷電性の分子４０１が付着した状態の導電性の針４００の先端部を溶液２２７中に配置する。また、溶液２２７中には対向電極４０３を配置しておく。

電源４０２により針４００と対向電極４０３との間に所定の電圧を印加すると、導電性の針４００の先端部に付着している荷電性の分子４０１は、針４００の先端部から解放され、溶液２２７中に放出され、試料Ｓに生化学的変化をもたらす。

図１６では、針４００の先端部は、溶液２２７の中に配置されているが、試料Ｓが細胞であれば細胞内に挿入されてもよく、その場合、荷電性の分子４０１が解放される位置を細胞内に限定することができる。

これまで、図面を参照しながら本発明の実施の形態を述べたが、本発明は、これらの実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において様々な変形や変更が施されてもよい。

試料への時間的または空間的に限られた範囲での刺激や作用はケージド解除法のみではなく、キャピラリーから作用物質を少量だけ吐出したり、荷電粒子を用いる方法がある。生体内で起きている反応により近い作用状態を実験で再現する形態であればよい。

本発明の第一実施形態の走査型プローブ顕微鏡の全体構成を示している。 図１の走査型プローブ顕微鏡の主要部分の構成を示している。 図１と図２に示された走査機構の斜視図である。 図３の走査機構を矢印Ｃの方向から見た側面図である。 図１の走査型プローブ顕微鏡における分子構造変化観測時のカンチレバー周辺を模式的に示している。 ケージドＡＴＰからＡＴＰが生成される前後におけるミオシンＶの構造形態の変化を示しており、ケージド解除光の照射前（I）と照射直後（II）と照射後しばらく経過した後（III）のミオシンＶの像を示している。 図６の反応によるミオシンＶの構造形態の変化を模式的に示している。 ケージドＣａ²⁺からＣａ²⁺を生成する前後におけるミオシンＶの構造形態の変化を示しており、ケージド解除光の照射前（I）と照射後（II）のミオシンＶの像を示している。 図８の反応によるミオシンＶの構造形態の変化を模式的に示している。 全反射によるエバネッセント場の発生を模式的に示している。 試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するためのひとつの構成を示している。 試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するための別の構成を示している。 図１１の構成に対してケージド解除光を照射する機構が組み合わされた構成を示している。 試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するための別の構成を示している。 図１４の構成におけるトラップ光とケージド解除光の照射スポットとカンチレバーとを含むモニター画像を示している。 試料Ｓと反応する物質を試料周辺の溶液内への供給するための別の構成を示している。

符号の説明

１００…走査型プローブ顕微鏡、１０１…顕微鏡筐体、１０５…ダイクロイックミラー、１０８…板状構造部材、１０９…試料位置調整機構、１１１…試料台ガラス、１１３…光てこ式光学センサー、１１４…カンチレバー、１１５…対物レンズ、１１７…コントローラ、１１８…コンピュータ、１１９…モニターＴＶ、１２０…ケージド解除用光源ユニット、１２１…ケージド解除用光源、１２２…光ファイバー、１２３…レンズユニット、１２４…シャッター、１２５…ミラー、１２００…走査機構。

Claims (14)

1. カンチレバーと、
   液中に存在するカンチレバーと試料を相対走査する走査機構と、
   液中または試料中に存在するケージド化合物に解除光を照射する照射機構とを有している、走査型プローブ顕微鏡。
2. カンチレバーと試料との間の相互作用によるカンチレバーの変位を光学的に検出する検出機構と、検出機構に用いる検出光とケージド化合物に照射する解除光とを分離する光学機構を有している、請求項１に記載の走査型プローブ顕微鏡。
3. 検出機構に解除光が届かないようにする光学素子を有している、請求項２に記載の走査型プローブ顕微鏡。
4. 解除光が紫外線である、請求項１ないし請求項３のいずれかひとつに記載の走査型プローブ顕微鏡。
5. カンチレバー、または、カンチレバーの自由端に保持された探針に官能基又は分子を修飾した、請求項１ないし請求項４のいずれかひとつに記載の走査型プローブ顕微鏡。
6. カンチレバーと、
   液中または試料中に存在するカンチレバーと試料を相対走査する走査機構と、
   カンチレバーと試料との間の相互作用によるカンチレバーの変位を光学的に検出する検出機構と、
   液中に存在するケージド化合物に解除光を照射する照射機構と、
   検出機構に解除光が届かないようにする光学素子と、
   試料またはカンチレバーまたはカンチレバーの自由端に保持された探針の内、少なくとも一つを観察する光学顕微鏡とを有している、走査型プローブ顕微鏡。
7. 光学顕微鏡の対物レンズを介して光学顕微鏡の視野の一部または全部に解除光を照射する、請求項６に記載の走査型プローブ顕微鏡。
8. 解除光が紫外線である、請求項６または請求項７に記載の走査型プローブ顕微鏡。
9. 解除光を照射する時間を制御する、請求項１ないし請求項８のいずれかひとつに記載の走査型プローブ顕微鏡。
10. 液中の試料をカンチレバーで走査しながら液中または試料中に存在するケージド化合物に解除光を照射する、分子構造変化観測方法。
11. 保護基を解除する光が紫外線である、請求項１０に記載の分子構造変化観測方法。
12. 試料またはカンチレバーまたはカンチレバーの自由端に保持された探針の内、少なくとも一つを観察する、請求項１０または請求項１１に記載の分子構造変化観測方法。
13. 解除光を照射する時間を制御する、請求項１０ないし請求項１２のいずれかひとつに記載の分子構造変化観測方法。
14. カンチレバーと、
    液中に存在するカンチレバーと試料とを相対走査する走査機構と、
    液中または試料中に、時間的または空間的に限られた範囲で作用する作用機構とを有している、走査型プローブ顕微鏡。

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