JP2001507203A - 部位特異的組換え方法およびそのためのベクター - Google Patents

部位特異的組換え方法およびそのためのベクター

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Abstract

(57)【要約】 本発明は細胞内での部位特異的組換えの方法ならびにそのような方法において使用され得るベクターを提供する。本発明の方法およびベクターは、細胞内での永続性の遺伝子発現を得るために、又、遺伝子発現を調節する為に使用され得る。本発明の好適なひとつの方法は、細胞を、同方向に位置する第１および第２組換え部位の間に位置する噛乳類細胞内で機能的な複製起点を含むベクターと接触させることを包含する。別の好適な方法は、部分的に、細胞をベクターが細胞によって内部に取り込まれるように、アンチパラレルな配向に第１および第２組換え部位を含むベクターと接触させることを包含する。両方法ともに、当該細胞にはさらに該ベクターの第１および第２組換え部位間での組換えをもたらす部位特異的リコンビナーゼが供給される。

Description

【発明の詳細な説明】 部位特異的組換え方法およびそのためのベクター 発明の技術分野 本発明は、細胞における部位特異的組換え方法、並びにこのような方法に使用 され得るベクターに関する。本発明の方法およびベクターは、細胞内での永続的 な遺伝子発現を獲得し、遺伝子発現を調節するのに用いることができる。 発明の背景 過去数年間、遺伝子治療への新たなアプローチの利用可能性、およびいわゆる 「治療遺伝子」を用いた治療で律する可能性がありそうな疾患の数の急激な増大 が伝えられている。一般に、治療遺伝子とは、所定の病状もしくは症候群におい て、内在するタンパク質欠損を修正もしくは相殺する遺伝子、あるいは特定の遺 伝子を抑制的に制御し得るかもしくはそれがコードする産物のネガティブな効果 を無効にする遺伝子である。さらに、治療遺伝子は、例えば癌の遺伝子治療にお いて、細胞を殺すのを仲介する遺伝子であってもよい。遺伝子治療を用いて首尾 よい治療結果が得られるかどうかは、治療遺伝子が適切に発現するか、また、そ れが宿主中で長期間持続するかにかかっている可能性もある。発現は、当業者に 周知の種々のクローニング戦略を用いて、一般的に効果的に調節することができ るが、持続性（すなわち、宿主細胞中での遺伝子の長期間の発現）はなかなか保 てないことがわかっている。 延長された遺伝子発現を獲得するための一般的なアプローチとして、研究者は 、宿主中で長い寿命を示すベクターを、治療遺伝子を導入するための媒体として 使用する。安定性は、宿主ゲノム中に組み込まれ、それが担持する治療遺伝子の 同時組込みを可能にするベクターの使用により最大となる。このような手法に従 うと、その生活環の一部として宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスが、 有用な道具であることがわかっている。しかしながら、レトロウイルスの使用は 不 可避的な問題を伴う。例えば、レトロウイルスベクターの安定な組込みは活発に ＤＮＡを合成している標的細胞に制限される、該ベクターのサイズが比較的小さ いためにその担持容量が制限される、該ベクターは組織親和性（向組織性）の欠 如を示す、およびこのようなベクターは全身に与えられると抗体によって急速に 不活性化される。これらの、およびレトロウイルスの使用に付随する他の欠点の 結果、研究者の多くは代替の遺伝子治療用ベクターとしてアデノウイルス（Ａｄ ）に目を向けるようになった（例えば、Rosenfeldら，Science，252，431-434(1 991)；Rosenfeldら，Cell，68，143-155(1992)を参照）。 Ａｄ類（Ａｄｓ）は非エンベロープ型の正二十面体で、直径で６５〜８０ｎｍ 、外部キャプシドと内部コアからなる（Ginsberg編，The Adenoviruses，Plenum Press，ＮＹ(1984)）。Ａｄのコアは直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子を含有する。２ つのヒト血清型、すなわちＡｄ２およびＡｄ５が集中的に研究され、Ａｄ類に関 して入手可能な情報を大量に提供してきた。この情報並びにＡｄの種々の有用な 特性（とりわけ、複製欠損組換えウイルスが容易に作られ、相補的な細胞株を用 いて大量に生産されること、Ａｄは最終分化した細胞や非増殖細胞を含むほとん どすべての細胞種に感染し得ること、およびＡｄ感染に付随する悪影響がないこ と）が、インビボおよびインビトロの両方でＡｄを効率よい遺伝子導入ベクター として利用することを可能にしている（例えば、Rosenfeldら，(1991)上述；Ros enfeldら，(1992)上述；Engelhardtら，Hum ．Gene Ther.，4，79-769（1993）； Crystalら，Nat ．Genet.，8，42-51（1994）；Lemarchandら，Circ ．Res.，72， 1132−1138（1993）；Guzmanら，Circ ．Res.，73，1202-1207（1993）；Bajocch iら，Nat ．Genet.，3，229-234（1993）；Mastrangeliら，J ．Clin．Invest.，9 1 ，225-234(1993)）。 Ａｄベクターのこのような利点にもかかわらず、Ａｄを遺伝子導入媒体として 用いると、投与された治療遺伝子の満足のいく長期発現は得られていない。第一 世代のＡｄベクターは、該ウイルスの不可欠なＥ１領域を欠失していた(Rosenfe ldら(1992)上述；Boucherら，Hum ．Gene Ther.，5，615-39(1994))。齧歯類 モデル系では、これらのウイルスベクター由来のトランス遺伝子産物が約２週間 検出された後バックグラウンドレベルに戻る。これと比較して、免疫抑制された マウスでは、感染後遺伝子発現が検出できる期間の長さは、発現レベルと同様に 実質的に増加する（Yangら，J ．Virol.，69，2004-15(1995);Yangら，Proc．Nat l ．Acad．Sci. ，10，4407-11(1994)）。これらのデータは、第一世代Ａｄベクタ ーの性能が比較的悪い原因が免疫サベイランスであることを示唆している。さら に、Ａｄが宿主細胞ゲノム中に組み込まれた細胞内で維持され得ないことは、該 ベクターによってコードされる治療遺伝子を発現する細胞が最終的に細胞から消 失することを意味する。 したがって、Ａｄで研究している研究者の多くは長寿命の遺伝子発現を得るこ とができるように組換えベクターを安定化する代替手段を求めてきた。他の系に おいて有効であることが分かっているそのような手段の１つは、エピソームの形 態で、導入された遺伝子を宿主中で完全な状態のまま維持するというものである 。エピソームは宿主細胞ゲノムから独立して複製する染色体外遺伝因子である。 この目的のために、研究者は、エプスタイン−バール・ウイルス（ＥＢＶ）がそ の潜伏状態においてエピソームを形成する能力を、種々の二本鎖ＤＮＡ鋳型から エピソームを生じさせる手段として都合よく使用してきた。 ＥＢＶは感染性単核症を引き起こし、少なくとも２つのヒトの癌と結びつくヒ ト向リンパ性ヘルペスウイルスである（Reismanら，Molec ．Cell．Biol.，5，18 22-1832(1985)）。ＥＢＶは２つの複製起点oriLytとoriPを含む。潜伏中、ＥＢ Ｖは複製にoriPを使用し、細胞あたり１０〜２００の範囲のコピー数で維持され る閉環二本鎖ＤＮＡ分子として存在する(Youngら，Gene，62，171-185(1988))。 oriPを担持するプラスミドは核抗原ＥＢＮＡ−１も発現する細胞内で維持され得 る（例えば、Yatesら，Nature，313，812-815(1985);Jalankoら，Biochemica et Biophvsica Acta ，949，206-212(1988);Kioussisら，EMBO J.，6，355-361(198 7);Jalankoら，Arch ．Virol.，103，157-166(1988);Sugdenら、J ．Virol.，63， 2644-2649(1989)を参照）。ＥＢＮＡ−１の存在下で、oriＰ は、培養ではＥＢＶが感染できない様々な哺乳動物細胞においてプラスミド複製 を可能にする（Reismanら，上述；Yatesら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，81，3806 -3810(1984)）。oriP起点はその活性に必要な２つのシス活性化因子を含む（Mid dletonら，Advances in Virus Research，40，19-55(1991)で総説）。該エレメ ントは１，０００塩基対（ｂｐ）隔たっており、両方とも３０ｂｐ部分の多数の 退化したコピーからなっている。反復ファミリー（family of repeats）あるい はＦＲと名付けられた第一のエレメントは、２０個のタンデムな３０ｂｐリピー トを含む。第二のエレメントは、６５ｂｐのダイアド・シンメトリー・エレメン トあるいはＤＳを含む１１４ｂｐの部分からなる。 変異誘発研究によって、oriPのこの２つの領域が、配向および距離に依存しな いやり方でお互いに相対して機能することが明らかになる（Middletonら，上述 ）。介在するスペーサー領域を欠失しても、また、この領域に１，０００ｂｐ以 上を付加しても、oriPの機能には影響がない。ＦＲエレメントはエンハンサーと して機能することが知られているが、複製におけるその役割は未だに明らかでは ない。さらに、ＦＲを含む２０個のタンデムリピートはＤＳの多コピーによって 置換することができる。ＦＲエンハンサー中に見られる２０個のタンデムリピー トの８個だけでも、短期間の測定では、エンハンサー活性とプラスミド複製の両 方について十分である。 ＥＢＮＡ−１はoriPの両エレメント中に存在する３０ｂｐリピートに結合する 。ＥＢＮＡ−１タンパク質は、ＥＢＶ細胞周期のＳ期の間に１周期あたり１回起 こるＤＳ近傍でのＤＮＡ複製の開始に必要である（Middletonら，上述）。該タ ンパク質の約１／３および該タンパク質のカルボキシル末端中の小領域を含むグ リシン−アラニン反復配列はプラスミド複製に必要ではない（Yatesら，(1985) ，上述；Luptonら，Mol ．Cell．Biol.，5，2533-2542(1985)）。しかしながら、 この配列は免疫系がＥＢＮＡ−１を検知するのを防ぎ、したがって、ＥＢＶおよ びＥＢＶ由来ベクターの持続性のために必要であるらしい（Levitskayaら，Natu re ，375，685-688(1995)）。 新しく合成されたエピソームを娘細胞間で分割する際に誤りを起こす可能性が 少なくともいくらかはあるので、また、染色体外遺伝因子に関して誤まらせる負 の選択圧を考慮すると、ＥＢＶを用いて得られるエピソームの安定性が長期持続 性と治療遺伝子の発現にとって制限的である可能性がある。ゲノム中の無害な遺 伝子座中へのエピソームの組込み、すなわち、導入された遺伝子にとっての安全 な安息の地が、この安定性の欠如の可能性を除去するだろう。このような道筋に 沿って、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はヒト染色体19q13.3-qter中に高頻度に 組み込まれるユニークな能力を示す(Kotinら，Human Gene Therapy，5，793-801 (1994))。限定された都合のよいゲノム部位に組み込まれるというＡＡＶのこの 能力は、ＤＮＡのランダムな挿入に伴う偶発的な遺伝子の活性化もしくは不活性 化による挿入突然変異誘発の危険性を排除する(Shellingら，Gene Therapy，165 -169(1994))。 一般的な特徴に関しては、ＡＡＶは、組み込まれたプロウイルスとしてか、溶 解感染によるかのいずれかで繁殖し得るヒトパルボウイルスであり(Muzyczka,Cu rrent Topics in Microbiol ．and Immunol. ，158，97-129(1992))、真核細胞用 のベクターとして用いられている（例えば、米国特許第4,797,368号および第5,1 73,414号；Tratschinら，Mol ．Cell．Biol.，4，2072-2081(1984);Gen Bankデー タベース登録番号J01901またはAA2C）。ＡＡＶ感染の溶解期にはＡｄ初期遺伝子 産物Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ２ａ，Ｅ４およびＶＡ ＲＮＡの発現が必要である（Ko tinら，上述）。潜伏感染はヘルパーウイルスの非存在下でのＡＡＶ感染により もたらされる。このような状況の下で、ＡＡＶは細胞ゲノムに効率よく組み込ま れ、Ａｄにより刺激されない限りその状態で維持される。 ヒトゲノムへの外来遺伝子の遺伝子座特異的組込みには、ＡＡＶの２つの構成 要素、Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）だけが必要と される。４つのＲｅｐタンパク質はそれぞれ同じ遺伝子にコードされ、初期ｍＲ 47-2957(1994)）。大きい方の２つのＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅ ｐ６８は、ＡＡＶ ＩＴＲに結合し、ＡＡＶ ＤＮＡ複製の際にＩＴＲ領域をほ どくためのヘリカーゼ活性を有するＡＴＰ依存的で配列特異的なエンドヌクレア い方のＲｅｐタンパク質、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、ウイルスのパッケー ジングに用いられる−本鎖子孫ゲノムの蓄積に不可欠であるらしい。 ＡＡＶ ＩＴＲはゲノムの両端に位置する。ウイルスＩＴＲが一本鎖の時は、 それらはＴ字型のヘアピン構造を形成する（Snyderら，J ．Virol.，67，6096-61 04(1993)）。複製起点、パッケージング、組込みおよび切り出しのシグナルもま たウイルスＩＴＲの領域内に見出される。ＡＡＶ ＩＴＲへのＲｅｐタンパク質 の結合は、ＩＴＲ依存的複製および遺伝子座特異的組込みにおけるこの領域の不 可欠な役割に一致するものである。Ｒｅｐタンパク質の非存在下では複製は起こ らず、ゲノムへの組込みはランダムに起こるようである(Kotinら，上述)。ＩＴ Ｒはネイティブな状態において、あるいは二本鎖ＤＮＡとしてプラスミドにクロ ーニングされた状態でのいずれかで機能し得る。Ｒｅｐタンパク質を適切に適用 することにより（例えば、トランスに位置するコード配列を通じてＲｅｐタンパ ク質を提供することにより）、ＩＴＲの間に組み込まれた外来の配列をプラスミ ドから切り出し、複製させ、宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。 エピソームを生成させるＥＢＶ戦略または宿主細胞ゲノム中への組込みを通じ てエピソームもしくはエピソームに担持された配列を安定化させるＡＡＶ戦略の 実行には、それぞれの系において、関連する調節タンパク質（例えば、ＥＢＶに ついてはＥＢＮＡ−１、およびＡＡＶについてはＲｅｐタンパク質）の厳重な調 節が必要である遺伝子発現の厳重な調節を達成するために研究者らが用いてきた １つのアプローチは、部位特異的組換えによって遺伝子もしくは遺伝子配列の発 現を調節することである。部位特異的組換えが可能で様々な応用に使用されてい る２つのよく研究された系は、ファージＰ１のＣｒｅ／Ｌｏｘ系および酵母のＦ ｌｐ／Ｆｒｔ系である。 ＣｒｅおよびＦｌｐタンパク質はＤＮＡリコンビナーゼのλインテグラーゼフ ァミリーに属する（Kilbyら，TIG，9，413-421(1993)に総説;Landy，Current Op inion in Genetics and Development ，3，699-707(1993);Argosら，EMBO J.，5 ，433-440(1986)）。ＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼはそれらが行う反応の 種類と、標的部位の構造および組換えのメカニズムのどちらについても著しい類 似性を示す（例えば、Jayaram，TIBS，19，78-82(1994);Leeら，J ．Biolog．Che m. ，270，4042-4052(1995);Whangら，Molec ．Cell．Biolog.，14，7492-7498(19 94);Leeら，EMBO J.，13，5346-5354(1994);Abremskiら，J ．Mol．Biol.，192， 17-26(1986);Adamsら，J ．Mol．Biol.，226，661-673(1992)を参照）。例えば、 組換えは複製およびＡＴＰのような外因性エネルギー源には依存せず、スーパー コイルおよび直鎖状ＤＮＡ鋳型の両方において機能する。 ＣｒｅおよびＦｌｐリコンビナーゼは、２つの標的組換え部位間（それぞれ、 Ｌｏｘ間およびＦｒｔ間）での組換えを促進することによりその効果を発揮する 。両標的部位は非対称配列によって隔てられた逆位回文配列で構成される（例え ば、Mackら，Nucleic Acids Research，20，4451-4455(1992);Hoessら，Nucleic Acids Research ，14，2287-2300(1986);Kilbyら，上述）。非対称性は組換えに 方向性を与える。すなわち、同一直鎖状ＤＮＡ分子上で同方向（parallel）に配 置された標的部位（すなわち、いわゆる「ダイレクトリピート」）間での組換え の結果、介在ＤＮＡ配列が１つの環状分子として切り出される（Kilbyら，上述 ）。環状ＤＮＡ分子上のダイレクトリピート間の組換えでは、介在ＤＮＡが切り 出されて２つの環状分子が生成する。これと比較して、直鎖状または環状ＤＮＡ 分子上のアンチパラレル（antiparallel）の部位（すなわち、反対の配向（oppo site oroentation）である部位つまり、いわゆる「逆位反復配列」）間での組換 えの結果、内部配列の反転が生じる。標的が分離した直鎖状分子上にある時に、 リコンビナーゼの作用の結果、該標的に対して遠位の領域の相互交換が生じると しても、分子内組換えが分子間組換えよりも優先される。 Ｃｒｅ／ＬｏｘおよびＦｌｐ／Ｆｒｔ組換え系の両方が広範で多数の目的に使 用されてきた。例えば、植物、昆虫、細菌、酵母および哺乳動物染色体への部位 特異的組込みが報告されている（例えば、Sauerら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，8 5 ，5166-5170(1988);Fukushigeら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89，7905-7907(19 92);Baubonisら，Nucleic Acids Research，21，2025-2029(1993);Hasanら，Gen e ，150，51-56(1994);Golicら，Cell，59，499-509(1989);Sauerら，Mol ．Cell ．Biolog. ，7，2087-2096(1987);Sauerら，Methods:Companion to Methods in E nzymol. ，4，143-149(1992);Sauerら，The New Biologist，2，441-449(1990);S auerら，Nucleic Acids Res.，17，147-161(1989);Qinら，Proc ．Natl．Acad．S ci. ，91，1706-1710(1994);Orbanら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89，6861-6865( 1992)）。これらの系を用いて真核ウイルスベクターを集合させ、挿入ＤＮＡが 回収されている（例えば、Sauerら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，84，9108-9112(1 987);Gageら，J ．Virol.，66，5509-5515(1992);Holtら，Gene，133，95-97(199 3);Peakmanら，Nucleic Acids Res.，20，495-500(1992)を参照）。染色体配列 の特異的欠失およびリアレンジメントもまた操作されており、λベクターから外 来ＤＮＡをプラスミドとして切り出すことも現在は可能である（例えば、Barina ga，Science，265，27-28(1994);Rossantら，Nature Medicine，1，592-594(199 5);Sauer，Methods in Enzymol.，225，890-900(1993);Sauerら，Gene，70，331 -341(1988);Brunelliら，Yeast，9，1309-1318(1993);InVitrogen（San Diego， CA）1995 Catalog，35;Clontech（Palo Alto，CA）1995/1996 Catalog，187-188 を参照）。組換え部位間の配列を欠失させるかあるいは反転させることによって 、組換えが機能的な転写単位を再構成するかあるいは不活性化するように、クロ ーニング案が生み出されてきた（例えば、Odellら，Plant Physiol.，106，447- 458(1994);Guら，Cell，73，1155-1164(1993);Laksoら，Proc ．Natl．Acad．Sci . ，89，6232-6236(1992);Fieringら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，90，8469-8473( 1973);O'Gormanら，Science，251，1351-55(1991);Jungら，Science，259，984- 987(1993)を参照）。同様に、組換え体を選択またはスクリーニングす るポジティブおよびネガティブな戦略が開発されてきた（例えば、Sauerら，J ． Mol．Biol. ，223，911-928(1992)を参照）。ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼ をコードする遺伝子が、構成的、誘導的または発生的に制御されたプロモーター のいずれかの制御下でトランスに提供されるか、あるいは精製されたリコンビナ ーゼが導入されてきた（例えば、Baubonisら，上述；Dangら，Develop ．Genet. ，13，367-375(1992);Chouら，Genetics，131，643-653(1992);Morrisら，Nucle ic Acids Res. ，19， 5895-5900（1991）を参照）。とりわけ、トランスジェニッ クマウス、植物および昆虫における該組換え系またはその構成要素の使用により 、宿主が外見上有害な影響を受けずにリコンビナーゼ遺伝子を発現することが明 らかとなり、該タンパク質が一般に寛容性に優れていることが確認された（例え ば、Orbinら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，89，6861-6865(1992)を参照）。 さらに最近になって、研究者らは、細胞内でのＣｒｅにより媒介される組換え を研究する手段として、ファージＰ１ Ｃｒｅ遺伝子を含む複製欠損Ａｄベクタ ーを使用している(Antonら，J ．Virol.，69，4600-4606(1995))。これらの実験 において、Ｃｒｅ発現Ａｄベクターは、リポーター遺伝子のコード配列が同方向 に並ぶＬｏｘ部位がフランキングした外因性スペーサー配列によりいずれのプロ モーターからも隔てられた、別のＡｄベクターとともに細胞に供給された。Ｃｒ ｅが媒介する組換えの結果、該スペーサー配列が切り出され、以前はサイレント だったリポーター遺伝子が作動した。組換えによりスイッチがオンになる遺伝子 は、複製欠損Ａｄベクターが宿主細胞中で維持される限りにおいてのみ発現され るだろうから、このようなアプローチは遺伝子発現の正の調節のみを可能にする だけであり、安定な遺伝子発現を可能にはしないようである。さらに、宿主細胞 中での継続的なＣｒｅ産生のせいで、同時にリポーター遺伝子のスイッチをオフ にし、得られる発現のレベルに上限を課す逆組換え反応が起こる可能性がある（ Antonら，上述，第4605頁）。 したがって、Ａｄおよび他の遺伝子治療ベクターの可能性をより十分に具現化 することができる発現系が依然必要である。本発明はこのような発現系を提供す ることを目的とする。特に、本発明の目的は、延長された遺伝子発現および遺伝 子発現調節を可能にし、従来の遺伝子発現系に固有の上記問題のいくつかを克服 する、細胞内での部位特異的組換え方法、およびそのような方法に使用され得る ベクターを提供することである。本発明のこれらのおよび他の目的および利点、 並びにさらなる本発明の特徴は、ここに与えられた発明の説明から明らかになる であろう。 発明の簡単な要約 本発明は、細胞内での部位特異的組換え方法、およびそのような方法に使用さ れ得るベクターに関する。本発明の方法およびベクターは、細胞内での持続的な 遺伝子発現を得るために、また、遺伝子発現を調節するために使用することがで きる。 より詳細には、本発明の好ましい方法は、(a)同方向に位置する第一および第 二の組換え部位の間に位置する、哺乳動物細胞で機能する複製起点を含有するベ クターと細胞とを接触させて、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれる ようにする工程、および(b)該ベクターの第一および第二の組換え部位の間で組 換えを起こさせる部位特異的リコンビナーゼを該細胞に与える工程を含む。 本発明の別の好ましい方法は、部分的に、(a)第一および第二の組換え部位を アンチパラレルに含有するベクターと細胞とを接触させて、該ベクターが該細胞 によって内部に取り込まれるようにする工程、および(b)該ベクターの第一およ び第二の組換え部位の間で組換えを起こさせる部位特異的リコンビナーゼを該細 胞に与える工程を含む。 図面の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｃは、宿主細胞への導入前（図１Ａ）の、本発明において有用な同 方向の組換え部位を有するベクター、並びに本発明にしたがって宿主細胞にベク ターを導入した後に起こる細胞内での組換えの結果得られる、切り詰められたウ イルスまたは環状構造（図１Ｂ）およびエピソーム（図１Ｃ）を示す模式図であ る。宿主細胞へのエピソームの導入には閉環状ベクター（すなわち、点線で示さ れたフランキングするプラスミドまたはウイルス配列）か直鎖状ベクター（すな わち、点で描かれたボックスで示されるフランキングするウイルス配列）のいず れかを使用することができる。ＦＲＳとＳＣＳの間およびＦＲＳとＳＣＳを含め た領域は、フランキングするベクター配列に対していずれの配向であってもよい 。矢印は転写の方向を示す。略語：ＲＳ，組換え部位；ＦＲＳ，第一組換え部位 ；ＳＲＳ，第二組換え部位；ＳＡ，スプライス受容体部位；ＳＤ，スプライス供 与体部位；ＦＣＳ，第一コード配列；ＳＣＳ，第二コード配列；Ｐ，プロモータ ー；ＰＧ，パッセンジャー遺伝子；ｏｒｉ，複製起点 図２Ａ〜２Ｆは、コード配列（ＣＳ）およびホルモン結合ドメイン（ＨＢＤ） に対してグリシン−アラニン（Ｇｌｙ Ａｌａ）反復のとり得る位置を示す模式 図である。グリシン−アラニン反復は、ホルモン結合ドメインが全く存在せずと も同様に使用することができる。 図３Ａ〜３Ｘは、同方向組換え方法についての本発明のさらなる適用を示す模 式図である。矢印は転写の方向を示す。点線は、ベクターが直鎖状でも環状でも よいことを示す。オープンキャロットは指定された配列がベクター上のどこにあ ってもよいことを示す。ベクターの限定された領域内の白抜きのバーは、指定さ れた配列が位置することができるベクターの部分を示す。略語：ＲＳ，組換え部 位；ＦＲＳ，第一組換え部位；ＳＲＳ，第二組換え部位；ＳＡ，スプライス受容 体部位；ＳＤ，スプライス供与体部位；ＦＣＳ，第一コード配列；ＳＣＳ，第二 コード配列；ＴＣＳ，第三コード配列；Ｐ，プロモーター；ＳＰ，第二プロモー ター；ＰＧ，パッセンジャー遺伝子；Ｎ，複製起点；ＩＴＲ，逆位末端反復配列 ；Ｒｅｐ，Ｒｅｐタンパク質コード配列。 図４は、本発明、特にエピソームが切り出されない部位特異的組換えによる遺 伝子発現調節において有用なアンチパラレルの組換え部位を有するベクターを示 す模式図である。閉環状ベクター（すなわち、点線で示されたフランキングする プラスミドまたはウイルス配列）または直鎖状ベクター（すなわち、点で描かれ たボックスで示されたフランキングするウイルス配列に隣接する）のいずれかを 用いることができる。ＦＣＳとＳＣＳの間およびＦＣＳとＳＣＳを含めた領域は 、フランキングするウイルス配列に対していずれの配向であってもよい。矢印は 転写の方向を示す。略語：ＦＲＳ，第一組換え部位；ＳＲＳ，第二組換え部位； ＳＡ，スプライス受容体部位；ＳＤ，スプライス供与体部位；ＦＣＳ，第一コー ド配列；ＳＣＳ，第二コード配列；Ｐ，プロモーター。 図５Ａ〜５Ｇは、アンチパラレル組換え法の、本発明によるさらなる適用を示 す模式図である。矢印は転写の方向を示す。点線はベクターが直鎖状でも環状で もよいことを示す。略語：ＲＳ，組換え部位；ＦＲＳ，第一組換え部位；ＳＲＳ ，第二組換え部位；ＳＡ，スプライス受容体部位；ＳＤ，スプライス供与体部位 ；ＦＣＳ，第一コード配列；ＳＣＳ，第二コード配列；Ｐ，プロモーター。 図６はプラスミドpEOBspLx-Puro-CMVLxを示す制限地図である。 図７はプラスミドpEOBspLx-Puro-CMVLx−βgluを示す制限地図である。 図８はプラスミドpAdCMV Creを示す制限地図である。 図９はプラスミドpAdCMVCreRSVOrf6を示す制限地図である。 図１０はプラスミドpKSEBNAOriP(NR)を示す制限地図である。 図１１はプラスミドpKSEBNA(NS)を示す制限地図である。 図１２はプラスミドpAdCLxPyTagOriを示す制限地図である。 図１３はプラスミドpAdEPrR1rを示す制限地図である。 図１４は線状化したプラスミドpCGE1E2oriを示す制限地図である。該プラスミ ドは通常閉環状態で存在する。 発明の詳細な説明 本発明は、宿主細胞内での持続的な遺伝子発現を獲得する方法およびそのよう な方法において使用することができるベクターを提供する。該方法およびベクタ ーは、遺伝子発現を調節するのにも用いることができる。本発明の方法およびベ クターは、（１）ＥＢＶおよびＡＡＶの独特の能力（すなわち、エピソームを生 成するＥＢＶの能力およびヒトゲノムに組み込まれるというＡＡＶの能力）、（ ２）Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系およびＦｌｐ／Ｆｒｔ系のような組換え系のリコンビナー ゼ活性、および（３）Ａｄおよび他の類似のウイルスおよびプラスミドベクター の種々の望ましい性質を、新規なやり方で結びつける。定義 参照を容易にするために、本発明の方法およびベクターを記載するのに、ここ で使用する略語および名称について表１に明示する。 また、本発明によれば、およびここでさらに定義するように、「ベクター」と は、宿主細胞にコード情報を導入する役割を果たす分子（例えば、ウイルスまた はプラスミド）である。「複製起点」とは、ゲノム外因子（例えば、ウイルスま たはプラスミド）を、宿主細胞ゲノムとは独立して複製し得るようにするベクタ ーまたは宿主細胞染色体上の配列である。 「遺伝子」とは、タンパク質または初期ｍＲＮＡ分子をコードするあらゆる核 酸配列である。「パッセンジャー遺伝子」とは、通常はベクター中に存在せず、 本発明によりベクター中にサブクローニングされ、且つ宿主へ導入すると細胞内 環境の識別できる変化（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮ Ａ）、ペプチドまたはタンパク質のレベルの増加、あるいはそれらの生産または 分解速度の変化）を伴うあらゆる遺伝子である。「遺伝子産物」とは、所定の遺 伝子またはコード配列から転写された、未だ翻訳されていないＲＮＡ分子（例え ば、ｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ）、あるいは所定の遺伝子またはコード 配列から転写されたｍＲＮＡ分子から翻訳されたポリペプチド鎖（すなわち、タ ンパク質またはペプチド）のいずれかである。遺伝子はコード配列に加えていず れかの非コード配列を含むが、「コード配列」はいかなる非コード（例えば、調 節）ＤＮＡも含まない。遺伝子またはコード配列は、もし該分子に沿う塩基配列 が、天然に通常見出される遺伝子またはコード配列を有する配列から変化してい れば、または該塩基配列が天然に通常見出されないものであれば、「組換え体」 である。本発明によれば、遺伝子またはコード配列は全体または部分的に合成で 作ることができ、ゲノミックまたは相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を含むことがで き、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの形態で提供され得る。 非コード配列または調節配列にはプロモーター配列が包含される。「プロモー ター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進 するＤＮＡ配列である。「エンハンサー」は、隣接する遺伝子の転写を刺激また は阻害するＤＮＡのシス活性化因子である。転写を阻害するエンハンサーはまた 、「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、それがいずれの配向におい ても、数キロ塩基対までならその距離を越えて、転写される領域の下流の位置か らでさえ機能し得るという点で、プロモーター中にのみ見出される配列特異的Ｄ ＮＡ結合タンパク質のためのＤＮＡ結合部位とは異なる。 本発明によれば、「組換え部位」は、部位特異的組換え反応が起こり得る非対 称な配列によって隔てられた逆位回文配列で構成される。本発明では、複数の組 換え部位（例えば、第一および／または第二組換え部位）が好ましく使用される 好ましい態様を記載する。しかしながら、より多くのもしくはより少ない組換え 部位（例えば、１つまたは、例えば３，４，５もしくは６つの組換え部位のよう な多数の部位）もまた使用することができる。さらに、異なるタイプの組換え部 位、例えば、２つのＬｏｘ部位と２つのＦｌｐ部位を組み合わせて使用すること ができる。「リコンビナーゼ（組換え酵素）」は、特定の組換え部位間での組換 えを行うタンパク質である。 また本発明によれば、プロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合、該 コード配列は該プロモーターに「機能的に結合している」。プロモーターが、組 換え部位の領域を通る転写において、該組換え部位に結合する配列のに影響を及 ぼすことができる場合、該プロモーターは該組換え部位（すなわち、第一または 第二組換え部位）に「隣接している」。コード配列（すなわち、コード配列また は第二コード配列）が、組換え部位（すなわち、第一または第二組換え部位）か らの距離が、該組換え部位に結合し、該組換え部位の領域を通って、該コード配 列にその効果を発揮するプロモーターによってその転写が制御され得るような距 離である場合、該コード配列は該組換え部位に「隣接している」。これが起こる ためには、好ましくは、該コード配列は該組換え部位の約１０００ｂｐ以内に位 置し、いっそう好ましくは、該コード配列は該組換え部位の約５００ｂｐ以内に 位置する。しかしながら、プロモーターが、反対向きに配向した介在コード配列 によって、それが制御するコード配列から隔てられている場合、該プロモーター とそれが制御する該コード配列の間の距離は約５０００ｂｐ以下であることが好 ましく、約２０００ｂｐ以下であることがより好ましい。「ポリシストロニック メッセージ」とは、あとでさらに記載されるように、２以上のペプチドまたはタ ンパク質がそこから翻訳される単独のｍＲＮＡである。部位特異的組換えの方法 本発明は、細胞内での部位特異的組換えを達成するための２つの方法を提供す る。どちらの組換え方法も、第一および第二組換え部位を含むベクターを細胞に 接触させて、該ベクターが該細胞により内部に取り込まれるようにし、次いで、 該細胞に、該ベクターの第一および第二組換え部位間での組換えをもたらす部位 特異的リコンビナーゼを供給することを含む。第一の部位特異的組換え方法が、 同じ向きに配向した第一および第二組換え部位を含むベクター（すなわち、「同 方向組換えベクター」）の使用を含むのに対し、第二の部位特異的組換え方法は 、アンチパラレル（opposite）に配向した第一および第二組換え部位を含むベク ター（すなわち、「アンチパラレル組換えベクター」）の使用を含む。 同方向組換え法は、組換えが起こることによって哺乳動物細胞内で機能し得る 複製起点を含むエピソームが生成するような、細胞内での部位特異的組換えをも たらし得る。該エピソームは宿主ゲノムとは自律的に複製することができ、１つ 以上のパッセンジャー遺伝子を担持するベクターの宿主細胞内における安定な維 持をもたらすために用いることができる。同方向組換え法は、通常は宿主細胞ゲ ノムに組み込まれないベクター（例えば、ＡｄまたはＨＳＶベクター）を、その ようなベクターに「溶原様の」経路により複製する能力を付与することによって 安定化するのに用いることができるという点で有用である。したがって、該方法 は、１つ以上のパッセンジャー遺伝子を担持するベクターを安定化することによ って、安定な遺伝子発現を得るのに使用することができる。 同方向組換え法はまた、組換えが起こることによって、哺乳動物細胞内で機能 し得る複製起点を含まず、宿主ゲノムとは自律的に複製することができないいわ ゆる「ミニプラスミド」が生成するような、細胞内での部位特異的組換えをもた らすのに使用することもできる。注目すべきことに、同方向組換えが起こること によって生成する第二の組換え産物（すなわち、エピソームやミニプラスミド以 外の産物で、それ自身は、組換え反応のための最初の基質が、それぞれ、直鎖状 または閉環状のいずれであるかによって、直鎖状または閉環状のいずれかの構造 を含む）もまた、細胞内で機能的であるかもしれない。このようなミニプラスミ ドは、以下にさらに記載されるように、細胞へのタンパク質（例えば、Ｒｅｐタ ンパク質）の短期間の送達に有用であることが分かるだろう。 あるいは、部位特異的組換えに用いられるベクターは、組換えが起こる前に２ つ以上の複製起点を含んでいることもあり得る。２つ以上の複製起点を含むベク ターは当該分野で公知である。 以下にさらに記載されるように、同方向およびアンチパラレル組換え法は、組 換えを通して、コード配列の転写を上向きまたは下向きのいずれかに調節するか 、あるいは同時に、１つのコード配列の転写を上向きに且つ別のコード配列の転 写を下向きに調節するのに使用することができる。アンチパラレル組換え法は、 エピソームやミニプラスミドを形成しないという点で同方向組換え法とは異なる 。 本発明の組換え方法は、細胞内、好ましくは真核細胞内でのものである。真核 細胞は、核膜によって囲まれた真の核を有する細胞である。好ましくは、真核細 胞は多細胞種のもの（例えば、単細胞の酵母細胞とは対照的に）であり、いっそ う好ましくは哺乳動物の（最適にはヒトの）細胞である。しかしながら、該方法 は、非常に多様な異なる細胞種を用いても効果的に行うことができ、その例とし ては、鳥類や魚類の細胞、哺乳動物細胞（齧歯類、サル、チンパンジー、ネコ、 イヌ、有蹄類（反芻動物やブタのような）、およびヒト細胞が挙げられるが、そ れらに限定されない）等がある。さらに、もし特定の細胞種へのベクターの導入 が、例えば、アデノウイルスのような特定のウイルスに対するレセプターを欠如 するために制限されるならば、例えば、ヒトアデノウイルスを血液または他の細 胞種に運ぶために用いられる方法を使用して、導入を増すことができる。例えば 、哺乳動物細胞に対するリガンド（例えば、トランスフェリン）を含むＤＮＡ− ポリリジン複合体にウイルスを結合させることができ（Wagnerら，Proc ．Natl． Acad．Sci. ，89，6099-6103(1992)）、あるいは当業者に知られている他の類似 の方法を用いることによっても可能である。 適当なベクターは全て本発明の方法に利用することができ、特にここに記載さ れる新規ベクターを用いることができる。したがって、本発明の方法に従って利 用されるベクターは、その存在のある時期の間、主として二本鎖ＤＮＡで構成さ れている限り、真核細胞への核酸の導入に適当であり、当業者がその用語を理解 する通りの意味で、ベクターとして機能し得るいかなるベクターも、直鎖状であ れ環状であれ包含し得る。好ましくは、得られるベクターは、宿主細胞に適合す るもの、すなわち、該ベクター中にサブクローニングされた核酸配列を転写し得 るものであり、もし所望であれば、さらに初期ｍＲＮＡを翻訳し得るものである 。 最も好ましくは、該ベクターはウイルス起源であり、１つ以上の異種または組 換え配列、例えば、コード配列、パッセンジャー遺伝子、プロモーター等を含ん でもよい。好ましくは、該ベクターは、パッケージングおよび細胞への送達に必 要とされる最小限の配列を含む。該ベクターは、一部は、エンベロープ型または 非エンベロープ型のいずれかのウイルスで構成されることが望ましい。例えば、 ベクターは、好ましくは、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、パポーバウ イルス科またはアデノウイルス科由来の非エンベロープ型ウイルスである。本発 明の好ましい非エンベロープ型ウイルスは、ヘパドナウイルス科、とりわけヘパ ドナウイルス属のウイルスである。パルボウイルス科のウイルスは、望ましくは パルボウイルス属（例えば、哺乳動物および鳥類のパルボウイルス）またはデペ ンドウイルス属（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））のウイルスである。 パポーバウイルス科のウイルスは、好ましくはパピローマウイルス亜科（例えば 、これに限らないが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１〜４８およびウシパ ピ ローマウイルス（ＢＰＶ）を含むパピローマウイルス）またはポリオーマウイル ス亜科（例えば、これに限らないが、ＪＣ、ＳＶ４０、ＢＫウイルス、およびマ ウスポリオーマウイルスを含むポリオーマウイルス）のウイルスである。アデノ ウイルス科のウイルスは、望ましくはマストアデノウイルス属（例えば、哺乳動 物のアデノウイルス）またはアビアデノウイルス属（例えば、鳥類のアデノウイ ルス）のウイルスである。同様に、ベクターはヘルペスウイルス科由来のエンベ ロープ型ウイルス、またはシンドビスウイルスであってもよい。本発明の好まし いエンベロープ型ウイルスは、ヘルペスウイルス科、とりわけ、アルファヘルペ スウイルス亜科（例えば、ヘルペス単純様ウイルス）、シンプレックスウイルス 属（例えば、ヘルペス単純様ウイルス）、ワリセラウイルス属（例えば、ワリセ ラおよび偽狂犬病様ウイルス）、ベータヘルペスウイルス亜科（例えば、サイト メガロウイルス）、サイトメガロウイルス属（例えば、ヒトサイトメガロウイル ス）、ガンマヘルペスウイルス亜科（例えば、リンパ球関連ウイルス）またはリ ンホクリプトウイルス属（例えば、ＥＢ様ウイルス）のウイルスである。特に、 該ベクターのウイルス成分は、好ましくは、Ａｄ、ＩおよびII型ヘルペス単純ウ イルス（ＨＳＶ）、ＥＢＶ、ワクシニアウイルス、パピローマウイルス（例えば 、ヒト（ＨＰＶ）またはウシ（ＢＰＶ）のいずれか）、ＪＣ、シミアンウイルス ４０（ＳＶ４０）、ポリオーマウイルス（例えば、ヒトまたはマウスのいずれか ）、Ｂ型肝炎ウイルス、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からなる群より 選択される。さらに、望ましくはエピソームが形成される同方向組換え法を行う ためには、該ベクターは、ある程度、その複製サイクルの一部としてプロウイル スを形成しないウイルス由来のベクターで構成されることが好ましい。 特に好ましい本発明のベクターはアデノウイルスベクター（すなわち、アデノ ウイルス科、最適にはマストアデノウイルス属のウイルスベクター）である。ア デノウイルスはあらゆる血清型ベクターのウイルスである。アデノウイルスのソ ースとして使用することができるアデノウイルスのストックは、アメリカン・タ イプ・カルチャー・コレクション（ATCC，Rockville，MD）から現在入手できる アデノウイルス血清型１〜４７型、あるいは他のいずれかのソースから入手でき る他のいずれかのアデノウイルスの血清型から増幅することができる。例えば、 アデノウイルスはＡ亜群（例えば、血清型１２，１８，３１）、Ｂ亜群（例えば 、血清型３，７，１１，１４，１６，２１，３４，３５）、Ｃ亜群（例えば、血 清型１，２，５，６）、Ｄ亜群（例えば、血清型８，９，１０，１３，１５，１ ７，１９，２０，２２〜３０，３２，３３，３６〜３９，４２〜４７）、Ｅ亜群 （血清型４）Ｆ亜群（血清型４０，４１）または他のいずれのアデノウイルス血 清型であってもよい。しかしながら、アデノウイルスは、好ましくはＡｄ２また はＡｄ５血清型である。 核酸の導入に用いられるＡｄは野生型（すなわち、複製能力がある）であって よい。あるいは、Ａｄは、ウイルスを複製欠損にすることができる少なくとも１ つの修飾をその中に有する遺伝的材料を含んでもよい。Ａｄゲノムに対する修飾 としては、ＤＮＡセグメントの付加、ＤＮＡセグメントのリアレンジメント、Ｄ ＮＡセグメントの欠失、ＤＮＡセグメントの置換、またはＤＮＡ損傷の導入が挙 げられるが、それらに限定されない。ＤＮＡ部分は、小さいもので１ヌクレオチ ド、大きいもので３６キロ塩基対（ｋｂ）（すなわち、おおよそＡｄゲノムのサ イズ）あるいはまた、Ａｄビリオン中にパッケージングできる最大量（すなわち 、約３８ｋｂ）と同等であればよい。Ａｄゲノムに対する好ましい修飾としては 、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３またはＥ４領域における修飾が挙げられる。 本発明の方法およびベクターにおいて、ベクターはさらにパッセンジャー遺伝 子を含んでもよい。パッセンジャー遺伝子はベクター中でいずれに配向していて もよい。パッセンジャー遺伝子が、ベクターが内部に取り込まれた細胞内で発現 し得る限り、リポーター遺伝子や治療遺伝子のように、いかなる適当なパッセン ジャー遺伝子も用いることができる。例えば、該遺伝子はリポーター遺伝子、す なわち、何らかのやり方で細胞内で検出することができるタンパク質をコードす る核酸配列を包含し得る。該遺伝子はまた、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルで その効果を発揮する治療遺伝子を包含し得る。例えば、嚢胞性線維症の治療のた めの嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子ｃＤＮＡのように、タンパク質 を遺伝病の治療に用いることができる。治療遺伝子にコードするタンパク質は結 果的に細胞を殺すこと（殺細胞）によってその治療効果を発揮するかもしれない 。例えば、ジフテリア毒素Ａ遺伝子の発現のように、遺伝子発現そのものが殺細 胞を導くか、あるいは、遺伝子発現により、細胞をある特定の薬剤の殺作用に選 択的に感受性となるようにすることができる（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ 遺伝子の発現により、細胞はアシクロビル、ガンシクロビル、およびＦＩＡＵ（ １−（２−デオキシ−２−フルオローβ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨー ドウラシル）を含む抗ウイルス性化合物に感受性となる）。遺伝子治療（例えば 、癌の治療に用いることができる）に対するこの殺細胞のアプローチは、あとで さらに記載されるように、ベクター中にいわゆる「ランナウェイ複製起点」を使 用することによりさらに増進され得る。しかしながら、このようなランナウェイ 複製系の使用は殺細胞に限定されず、例えば、一時的に高レベルの発現が所望さ れる状況下で（例えば、組換え手段によるタンパク質の「大丸薬型（bolus-type ）」送達のために）用いることができる。 さらに、治療遺伝子は、例えば、アンチセンスメッセージもしくはリボザイム 、スプライシングや３’プロセッシング（例えば、ポリアデニル化）に影響する タンパク質をコードすることによってＲＮＡレベルでその効果を発揮することが でき、あるいは、おそらくはとりわけｍＲＮＡ蓄積速度の変化、ｍＲＮＡ輸送の 変化、および／または転写後調節の変化を仲介することによって、細胞内で別の 遺伝子の発現レベルに影響することで作用するタンパク質をコードすることがで きる（すなわち、ここでは遺伝子発現は、転写開始からプロセスされたタンパク 質の生産までのすべての工程を含めるものと広く解釈されている）。このような パッセンジャー遺伝子は他のいかなるタンパク質、例えばＥＢＮＡ−１、をもコ ードすることができ、単独で存在しても、または第一および第二組換え部位間に 位置するさらなるパッセンジャー遺伝子に加えて存在してもよい。 導入されるパッセンジャー遺伝子は、小さいもので１繰り返し単位（すなわち 、 ＤＮＡの場合は１ヌクレオチド）、大きいもので、単離し、合成し、または本発 明の方法を用い、且つウイルスベクターのパッケージングの制限もしくはプラス ミドベクター上限サイズを考慮して、宿主細胞に導入するのに相応なものであり 得るＤＮＡを含むことができる。該パッセンジャー遺伝子は、リボザイム、すな わち、当該分野で記載されるような触媒的ＲＮＡ種（Hampelら，Nucleic Acids Research ，18，299-304(1990);Cechら，Annual Rev ．Biochem.，55，599-629(19 86)）を含めて、コードまたは非コード配列、センスまたはアンチセンス配列、 および操作された配列、すなわち、インビボで通常存在しない配列を構成または コードすることができる。 同様に、同方向およびアンチパラレル組換え法の両方に用いられるベクターは 、他の遺伝子またはコード配列を含んでいてもよい。例えば、本発明のコード配 列または第二コード配列は、ＣｒｅまたはＦｌｐのコード配列、ＥＢＮＡ−１の コード配列、またはここに記載される他のいかなるコード配列も含むことができ る。 特に、本発明の同方向およびアンチパラレル組換え法は、Ｒｅｐタンパク質を 、コード配列またはパッセンジャー遺伝子のいずれかとして、細胞に送達するの に使用することができる。既知の、且つ文献に報告されている種々の変異Ｒｅｐ タンパク質およびＲｅｐコード配列上の変異（例えば、McCartyら，J ．Virol.， 該方法は１つ以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲ（または当業者に公知のこれらＩ ＴＲを含む配列）がフランキングする配列の、ヒト第１９染色体または当該分野 で記載されている配列（例えば、Lindenら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，93，7966 -7972(1996)を参照）へのＲｅｐを介した組換えの促進を可能にする。Ｒｅｐタ ンパク質は第１９染色体への組換えを優先的に指示するが、他の部位への組換え も指示することができるので、該方法はまた、アデノ随伴ウイルスＩＴＲがフラ ンキングする配列の、他のゲノム領域へのＲｅｐを介した組換えを促進するのに も用いることができる。該ウイルスＩＴＲはパッケージングに欠損を生じたもの であることが好ましい（例えば、Muzyczka，上述）。 本発明によれば、いかなるコード配列（例えば、第一、第二または他のコード 配列）またはパッセンジャー遺伝子の後にもポリシストロニックメッセージの産 生を可能にする配列を続けることができる。このようなポリシストロニックメッ セージ−−それはベクターのスペースの非常に効率のよい使用を反映する−−を 産生することができるいくつかの方法がある。例えば、ポリオウイルス由来の３ ００〜４００ｂｐフラグメントを２つのコード領域の間に置くことにより、リボ ソームを本質的に第二メッセージのＡＵＧ開始コドンの領域に新たに補充するこ とができる。これによって、キャップに非依存的な翻訳バイパス、すなわち真核 細胞におけるキャップのないメッセージの翻訳が可能となる。このような戦略（ したがって、他の種における該戦略の使用を可能にするこのような類似の配列） はまた、アルファモザイクウイルスにおいても記載されている。ポリシストロニ ックメッセージを生成する第三のアプローチにおいては、カルジオウイルスの配 列をポリシストロニックメッセージのコード配列の間にインフレームに置く。下 流のタンパク質のコード配列には開始コドン（ＡＵＧ）が必要ではない。翻訳に おいて、タンパク質は活発に研究されているメカニズムによって遊離される。同 じ道筋にしたがって、ポリシストロニックメッセージの産生を可能にする配列を コード配列のコード領域の後ろに置くこともできる。 したがって、これらのアプローチは、コード配列、および第一組換え部位と該 コード配列の間に介在するコード配列からポリシストロニックメッセージを生成 するのに用いることができる。例えば、ＥＢＮＡ−１コード配列（または他のコ ード配列）を、組換えによって活性化されるジシストロニック（またはポリシス トロニック）カセットにおける第二オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ ）とすることができる。ＥＢＮＡ−１の発現を駆動するＥＢＶウイルスプロモー ターは、ＣＭＶプロモーターの使用により観察されるプロモーター活性の約０． １％しか提供しない。しかしながら、ジシストロニックカセットでは、第二の遺 伝子は第一の遺伝子の０．１％で、またバックグラウンドより１０倍高く発現す る。このシナリオでは、ＥＢＮＡ−１は組換えが起こることにより誘導されるの だろ う。このことは、ウイルスベクターの増殖中のＥＢＮＡ−１の発現がoriＰで作 用してウイルスを不安定化する場合に特に望ましい。あるいは、oriＰは細胞周 期あたり１回だけ複製するので、ある状況においては、ＥＢＮＡ−１が調節され ず、代わりに弱い構成的プロモーターの制御下にあるウイルスを創り出すことが できるだろう。 組換え部位とリコンビナーゼのいかなる適当な組み合わせも、同方向およびア ンチパラレル組換え法およびベクターとともに利用することができる。好ましく は、第一および第二組換え部位がＬｏｘ部位を含み、リコンビナーゼがＣｒｅを 含むか、または第一および第二組換え部位がＦｒｔ部位を含み、リコンビナーゼ がＦｌｐを含む。あるいは、リコンビナーゼはλインテグラーゼファミリーのリ コンビナーゼの別の一員（または他のいずれかの適当なリコンビナーゼ）であっ てもよく、組換え部位は該リコンビナーゼが作用する対応の配列であってもよい 。リコンビナーゼはいかなる適当な手段によっても細胞に供給されてよく、例え ば、送達ベクター上に（例えば、コード配列またはパッセンジャー遺伝子として ）リコンビナーゼのコード配列を置く、リコンビナーゼ遺伝子をコードする第二 のベクターを併用投与する、または外因性のリコンビナーゼを供給することによ って供給される。 好ましくは、Ｃｒｅコード配列は、バクテリオファージＰ１のリコンビナーゼ Ｃｒｅまたは当該分野で記載されるようなこの配列の種々の変異（例えば、Wier zbickiら，J ．Mol．Biol.，195，785-794(1987);Abremskiら.，J ．Mol．Biol.， 202，59-66(1988);Abremskiら，J ．Mol．Biol.，184，211-20(1988);Abremskiら ，Protein Engineering，5，87-91(1992);Hoessら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，8 4 ，6840-6844(1987);Sternbergら，J ．Mol．Biol.，187，197-212(1986)）で構 成され、細胞に供給されたＣｒｅタンパク質は組換え手段によりこれらの配列の １つから産生される。未だ単離されていないこのコード配列のさらなる変異もま た、そのような変異から得られる変異タンパクがＬｏｘ部位での組換えをもたら し得る限り使用することができる。さらに、核内のＣ ｒｅタンパク質の濃度を増加させるために、核局在化シグナルをＣｒｅコード配 列に付属させることができる。さらに、遺伝子内もしくは遺伝子間相補によるリ コンビナーゼ活性を見越して、細胞に、相補的なＣｒｅまたは他の変異リコンビ ナーゼタンパク質をコードするベクターを一緒に供給することができる。Ｌｏｘ 部位でのＣｒｅ機能のアッセイはAbremskiら（Abremskiら，J ．Biolog．Chem.，259 ，1509-1514(1984)）およびSauerら（Sauerら，(1990)上述）に記載されるよ うに行うことができる。 Ｃｒｅ／Ｌｏｘにより駆動される組換えに関して、好ましくは、Ｌｏｘ部位と してLoxＰ部位が用いられ、あるいは、文献に記載されるように、この配列の種 々の変異が組み込まれる（例えば、Mackら，上述;Hoessら，(1986)上述;Hoessら ，Biochemistry，81，1026-29(1984);Hoessら，Gene，40，325-329(1985);Abrem skiら，J ．Biolog．Chem.，261，391-396(1986)を参照）。未だ単離されていな いLoxＰの類似の変異配列もまた、そのような配列がＣｒｅに対する組換え部位 として働き得る限り使用することができる。 第一の、すなわち同方向の組換え方法、および第二の、すなわちアンチパラレ ルの組換え方法は、ここに参照されるように、添付の図面、特に、本発明の同方 向およびアンチパラレル組換え法において有用な、同方向およびアンチパラレル 組換えベクターの種々の実施態様をそれぞれ示す図１Ａ〜１Ｃ乃至図５Ａ〜５Ｇ を参照すると、よりよく理解できるだろう。 ａ．同方向組換え法 本発明の同方向組換え法は、染色体外遺伝因子からのミニプラスミドまたはエ ピソームのいずれかの生成を可能にする。ミニプラスミドが細胞内で複製しない （したがって、配列の一時的な送達または組込みが所望される場合に有用）のに 対し、エピソームは、細胞内でゲノム外で複製することができる。組換えが起こ った結果として環状化する組換え基質の部分に複製起点が存在する場合（図１Ａ 〜１Ｃに示されるように）、エピソームが得られ、そのような起点がない場合に ミニプラスミドが得られる。したがって、同方向組換え法は、宿主ゲノム中にプ ロウイルスとして組み込まれる能力がない結果として、細胞内で安定に維持され ないウイルスベクターや、あるいはＨＳＶのように潜伏状態ではそのゲノムが不 活発なウイルスについて特に利用性がある。この方法は、通常安定に維持されな いか潜伏時に不活発な、パッセンジャー遺伝子を担持するベクターが、宿主細胞 内で安定に維持されるようにすることによって持続的な遺伝子発現を得るために 、また、該ベクターに担持される遺伝子の発現を調節するために使用することが できる。一般に、この方法によるエピソームの送達については、（１）複製起点 、（２）送達ベクターからエピソームを切り出す手段、および（３）有糸分裂に おいて各細胞に娘分子を確実に分離させる方法、という３つの考慮すべき点があ る。 したがって、真核細胞における部位特異的組換えをもたらす同方向組換え法は 、（ａ）同じ向きに配向した第一および第二組換え部位の間に位置する、哺乳動 物細胞で機能する複製起点を含有するベクターを細胞に接触させて該ベクターが 該細胞によって内部に取り込まれるようにすること、および（ｂ）該細胞に、該 ベクターの第一および第二組換え部位間での組換えをもたらす部位特異的リコン ビナーゼを供給することを含む。 図１Ａに示される好ましいベクターによって明らかなように、直鎖状ウイルス （すなわち、点で描かれたボックスで示されるウイルス配列）または環状分子（ すなわち、点線で示されるプラスミドまたはウイルス配列）のいずれかを同方向 組換え法と連携して利用することができる。エピソームの送達に関する前記の考 慮点に従って、同方向組換え法は、また好ましくはアンチパラレル組換え法も、 哺乳動物細胞で機能する複製起点（例えば、哺乳動物細胞から単離された起点、 または、これらに限られないが、Ａｄ、ＨＳＶ、ＥＢＶ、パピローマウイルス、 ワクシニアウイルス、またはポリオーマウイルス由来の複製起点のような、ウイ ルスの複製起点）を使用することができる。したがって、本発明は、単独の組み 込まれた鋳型、細胞あたり少ないもしくは中程度の数のエピソームもしくはミニ プラスミド、あるいは細胞あたり何千にも達するエピソームのいずれかを供給す る一連のベクターを提供し、それらの各々が、ここに記載されるように、種々の コード配列、プロモーター、および／またはパッセンジャー遺伝子を含むことが できる。 望ましくは、本発明の方法に使用されるベクターは、ＥＢＶの潜伏レプリコン 配列であるoriＰまたは当該分野で知られ、記載されているこの配列の変異（例 えば、Middletonら，上述;Reismanら，上述）を含む複製起点を有する。この配 列は、さらに未だ得られていないoriＰ配列の変異を含むことができる。但し、 当業者に公知の方法（例えば、Middletonら，上述;Reismanら，上述）を用いて 測定したとき、このような変異配列がゲノム外ＤＮＡに自律複製能を付与し得る ならである。さらに、同方向およびアンチパラレル組換え法において、複製起点 は、非真核細胞または単細胞の真核細胞（例えば、原核生物および酵母）を含め て、いかなる細胞で機能し得るいかなる複製起点であってもよい（例えば、M．D epamphilis編，DNA Replication in Eukaryotic Cells(Cold Spring Harbor Pre ss，NY，1996)を参照）。 注目すべきことに、oriＰはウイルスから特性解析されている多くのＤＮＡ複 製起点とは異なる生物学的機能を果たす。すなわち、oriＰは細胞の生存が損な われないようにプラスミドＤＮＡの制御された複製を可能にする。対照的に、「 ランナウェイ複製起点」と呼ばれる他の複製起点は、細胞周期の間、指数関数的 な速度でのＤＮＡ複製を可能にし、該ベクター上に存在する他の遺伝子が何かに よっては、最終的に細胞死を誘導することができる。このようなランナウェイ複 製起点としては、ＳＶ４０、ＢＫ、ポリオーマウイルス、ＡｄおよびＨＳＶ−１ の複製起点が挙げられるが、それらに限定されない。これらのランナウェイ複製 起点もまた、本発明の方法およびベクターに好ましく用いることができ、殺細胞 以外の適用にも使用することができる。もちろん、細胞内で該起点が正しく機能 するために、他の補因子を一緒に供給する必要があるかもしれない。 特に、ポリオーマウイルスのランナウェイ複製起点（例えば、Muller，Mol ．C ell．Biol. ，8，5000-5015(1988)およびＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号J0 2288あるいはPLY 2CG)に記載）を使用する場合には、ウイルスのラージＴ抗原 がウイルスＤＮＡの複製開始に必要とされる。このタンパク質は、複製起点の領 域内に結合し、この付近でＤＮＡをほどいて、（ＤＮＡポリメラーゼのような） 他の細胞酵素が作用できるようにすることで作用する。したがって、このような ポリオーマウイルスの複製起点を使用する場合には、少なくともウイルスのＴ抗 原も、例えば、コード配列（例えば、第一、第二または他のコード配列）または パッセンジャー遺伝子として（すなわち、シスまたはトランスに）、細胞に供給 することが好ましい。ウイルスＴ抗原はまた、外部から供給することができる。 いくつかの場合においては、ウイルス複製を最適にするために許される因子をさ らに供給することが望ましいだろう。望ましくは、使用されるポリオーマウイル スの起点はマウスポリオーマウイルスの起点である。しかしながら、ヒト、また は他のポリオーマウイルスの起点もまた好ましい。これらの起点をコードする配 列およびこれらの配列の変異は当該分野で公知である（Muller，上述）。 同様に、細胞あたり多コピー数のエピソームが得られるのを可能にする起点を 使用することができる。例えば、パピローマウイルスの起点（例えば、ＧｅｎＢ ａｎｋデータベース登録番号X02346に記載されているＢＰＶ１の完全なゲノムと ともにＧｅｎＢａｎｋデータベース登録番号PAPABPV1に記載、およびＧｅｎＢａ ｎｋデータベース登録番号D00146に記載されているＢＰＶ４の初期コード配列） を本発明のベクター中に使用することができる。パピローマウイルスゲノムは形 質転換細胞内で多コピーのプラスミドとして維持される。このようなパピローマ ウイルスの起点を用いる場合には、該ウイルスＥ１のタンパク質も細胞に供給す ることが望ましい（例えば、コード配列またはパッセンジャー遺伝子としてシス またはトランスに、あるいは外部から供給して）。いくつかの場合においては、 複製を最適にするために、ウイルスＥ２タンパク質の源を細胞に供給することも また望ましいだろう。パピローマウイルスの起点、Ｅ１およびＥ２タンパク質は 当業者に知られており、これらの配列またはこれらの配列の変異（例えば、Pirs ooら，EMBO J.，15，1-11(1996)，Grosselら，Virology，217，301-310(1996)を 参照）を使用することができる。特に、パピローマウイルスの起点はウシの ものが好ましい。あるいは、パピローマウイルスはヒトのものが好ましいが、他 のいかなる源のウイルスであってもよい。 環状ＤＮＡエレメントに宿主細胞ゲノム内で自律複製する能力を同様に付与す るこれらの、および他の複製起点をoriＰの代わりに用いることができるが、ori Ｐ起点を用いた場合、ＥＢＮＡ−１もまた細胞に供給することができる。他の細 胞複製タンパク質については、ＥＢＮＡ−１タンパク質は外部から供給するか、 あるいは、リコンビナーゼの細胞への送達について記載したと同じやり方で、Ｅ ＢＮＡ−１コード配列をoriＰに対してシスまたはトランスに供給することがで きる。たとえＥＢＮＡ−１タンパク質の非存在下にoriＰを有するプラスミドが ＥＢＶで感染させた細胞内で安定に維持され得るとしても（Luptonら，上述;Tes higawaraら，Nuc ．Acids Res.，20，2607(1992)）、oriＰとともにＥＢＮＡ−１ のコード配列は、ＥＢＶに感染していない培養細胞においてＥＢＶ由来環状プラ スミドを安定に維持するための最小必要成分を構成する。さらに、さらに記載さ れるように、同方向組換え法は、複製起点を利用せずに、Ｒｅｐタンパク質（お よび他のタンパク質）を細胞に送達するのに使用することができる。 同方向組換えベクターからのエピソームまたはミニプラスミドの切り出しおよ びその後の環状化は、ベクター中の第一および第二組換え部位（図１Ａ中のＦＲ ＳおよびＳＲＳ）、並びに該ベクターの第一および第二組換え部位間での組換え をもたらすための、第一および第二組換え部位で作用する部位特異的リコンビナ ーゼからなる組換え系の適用を通して達成される。単独のＤＮＡ分子上に同じ向 きに位置する２つの組換え部位が存在することにより、適当なリコンビナーゼに より閉環状分子を形成するような介在配列の切り出しが起こる。エピソームの娘 細胞への分割は、宿主細胞ゲノムおよびoriＰ（または他の複製起点）に結合し て生じようとしている細胞中に、エピソームを本質的に引っ張って作用するよう に思えるＥＢＮＡ−１、または類似の機能を有するタンパク質を利用することに より達成することができる。 したがって、ベクター中の２つの同方向の組換え部位の間にoriＰまたは哺乳 動物で機能する別の複製起点をコードすることにより、細胞へのリコンビナーゼ の適切な適用による組換えによってエピソームが生成するだろう。すなわち、同 方向組換えベクターを内部に取り込んだ細胞にこのような部位特異的リコンビナ ーゼを供給することにより、（図１Ａに例示されるような）同方向組換えベクタ ーは、（図１Ｃに例示されるような）エピソームを形成するように、第一および 第二組換え部位の間で組換えられる。ミニプラスミドは、同方向の組換え部位間 に複製起点が存在しない場合に、同様に生成し得る。エピソームまたはミニプラ スミドの送達媒体としてウイルスベクターを用いると、（図１Ｂに例示されるよ うな）組換えによる第二の産物は切り詰められたウイルスであり、プラスミドを 用いた場合は、切り詰められたプラスミドまたはミニプラスミドが同様に得られ る。 好ましくは、該ベクターはさらにリコンビナーゼのコード配列、特にＣｒｅの コード配列を含む。該ベクターはまた、第一、第二および／または第三コード配 列のような、１つ以上のさらなるコード配列、および／またはパッセンジャー遺 伝子のような、プロモーターを含むさらなるコード配列を好ましく含むこともで きる。したがって、同方向組換え法において、該ベクターは、好ましくはさらに パッセンジャー遺伝子を含む。最も好ましくは、パッセンジャー遺伝子は、図１ Ａの同方向組換えベクターにおいて示されるように、第一および第二組換え部位 の間に位置し、結果として図１Ｃに示されるように、パッセンジャー遺伝子（Ｐ Ｇ）を担持するエピソームを生じる。 同様に、該ベクターは、好ましくはさらにコード配列を含む。このようなコー ド配列はいかなる適当なコード配列でもよいが、最も好ましくはＥＢＮＡ−１ま たはＲｅｐのコード配列、または当該分野で知られ、また記載されているこれら の配列の種々の変異（例えば、Yatesら(1985),上述;Luptonら，上述，Middleton ら，J ．Virol.，66，1795-1798(1992);Levitskayaら，上述を参照）である。ori Ｐ以外の複製起点を用いる場合は、他のウイルス複製タンパク質（例えば、ラー ジＴ抗原、Ｅ１、またはＥ１およびＥ２）を同様にコード配列として提 供することができる。望ましくは、該コード配列は複製起点を含む第一および第 二組換え部位間に位置し、該コード配列を担持するエピソームが得られる。 このような道筋にしたがえば、同方向組換え法は、組換えを通して、１つのコ ード配列を上向きまたは下向きに調節すること、または同時に、１つのコード配 列を上向きに且つ別のコード配列を下向きに調節することを可能にする。例えば 、図１Ａに示されるように、第一コード配列（ＦＣＳ）は第一および第二組換え 部位（ＦＲＳおよびＳＲＳ）の間に位置し、且つ第一組換え部位（ＦＲＳ）から 第二組換え部位（ＳＲＳ）の方向に転写されるべく配向することができる。同じ ＤＮＡ分子上で、プロモーター（Ｐ）は、ＰがＳＲＳの下流のコード配列を転写 し得るように、ＦＣＳとＳＲＳの間に位置すればよい。このような状況では、組 換えの前にはＦＣＳは初期ｍＲＮＡに転写されないだろう。しかしながら、組換 えの後では、ＦＣＳをＰの制御下に置く組換えが起こった結果として、ＦＣＳは 転写されるだろう。 同方向組換え法はまた、組換えを通して、別のコード配列を上向きに調節する と同時に、１つのコード配列の転写を下向きに調節することを可能にする。すな わち、もし第二コード配列（ＳＣＳ）がＰのすぐ下流に位置し、ＰがＳＣＳの発 現を制御し得るように、Ｐに機能的に結合していれば、組換えの前にはＳＣＳは 転写されるだろう。組換えの後、以前はＳＣＳの転写を命令していたＰがＦＣＳ の上流に置かれ、ＦＣＳが転写されるが、ＳＣＳは転写されないだろう。しかし ながら、プロモーターは、組換えに先だっていかなる下流の配列の発現も制御す る必要はない。同様に、プロモーターは、組換えの後に別のコード配列の発現を 制御する必要はない。この方法はまた、例えば、ＦＣＳの非存在下に図１Ａのベ クターにＳＣＳを組み込むことにより、単独のコード配列を独立に下向きに調節 することも可能である したがって、１つのコード配列を上向きに調節するのに用いることができる同 方向組換え法の一態様において、該方法は、好ましくは、（ａ）コード配列が、 起点を含む第一および第二組換え部位の間の領域に位置し、且つ第一組換え部位 から該コード配列を通過して先にある第二組換え部位の方向に、該コード配列が 転写されるべく配向するように、第一組換え部位に隣接する、（ｂ）該コード配 列がいずれのプロモーターにも機能的に結合していない、および（ｃ）プロモー ターが、起点を含む第一および第二組換え部位間の領域に位置し、且つ第一組換 え部位から該プロモーターを通過して先にある第二組換え部位の方向に、該プロ モーターが転写を指示すべく配向するように、第二組換え部位に隣接することに より行われる。第一組換え部位と該コード配列の間に位置するコード配列、プロ モーターおよび転写終結部位がないことが最も好ましい。 好ましくは、１つのコード配列の発現を上向きに調節するのに用いられるベク ターは、起点を含む第一および第二組換え部位間の領域以外の領域に位置し、第 二組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に結合している第二コード 配列をさらに含む。この方法は隔たったコード配列の上向きおよび下向きの同時 調節を可能にする。該プロモーターと第二コード配列の間に位置するコード配列 、プロモーターおよび転写終結部位がないことが最も好ましい。 別の配列を上向きに調節することなく、１つのコード配列を独立に下向きに調 節するのに用いることができる、同方向組換え法の別の態様において、該方法は 、好ましくは、（ａ）プロモーターが、起点を含む第一および第二組換え部位の 間の領域に位置し、且つ第一組換え部位から該プロモーターを通過して先にある 第二組換え部位の方向に、該プロモーターが転写を指示すべく配向するように、 第二組換え部位に隣接する、（ｂ）コード配列が、起点を含む第一および第二組 換え部位間の領域以外の領域に位置し、且つ該コード配列が該プロモーターに機 能的に結合するように第二組換え部位に隣接することにより行われる。 これらの方法は、エピソーム送達ベクターがさらにパッセンジャー遺伝子を担 持する場合にも好ましく用いることができる。さらに、組換えの後で、コード配 列によりコードされるタンパク質の生産を最適にするために、スプライス供与体 および受容体部位を、同方向組換え法に用いられるベクター中に含めてもよい。 本発明によれば、天然から単離されたものであれ、組換えＤＮＡもしくは合成 技術により製造されたものであれ、それが真核（望ましくは哺乳動物）細胞内で 転写を好ましくは指示し得る限り、いかなるプロモーター（例えば、組換えの結 果としてコード配列に結合したプロモーター、およびパッセンジャー遺伝子の一 部として存在するプロモーター）も遺伝子の転写を提供するために使用すること ができる。 真核細胞内での発現に適当なＤＮＡ配列（すなわち、「真核プロモーター」） は、原核細胞内での発現に適当なＤＮＡ配列とは異なる。一般に、真核プロモー ターおよび付属の遺伝的シグナルは原核の系では認識されないか、もしくは機能 しないし、原核プロモーターは真核細胞内では認識されないか、もしくは機能し ない。 真核細胞内で機能するプロモーター配列の比較から、保存された配列エレメン トが明らかとなっている。一般に、ＲＮＡポリメラーゼIIによって転写される真 核プロモーターは、転写開始を正確に位置づけるのに不可欠であるらしい−２５ 位付近に集中する「ＴＡＴＡボックス」によって特徴づけられる。ＴＡＴＡボッ クスは、哺乳動物の系ではＲＮＡポリメラーゼが約３０ｂｐ下流から転写を始め るように指示する。ＴＡＴＡボックスはしばしば、転写開始点の上流約４０ｂｐ および１１０ｂｐに位置する少なくとも２つの他の上流配列と連携して機能する 。通常、いわゆる「ＣＣＡＡＴボックス」が２つの上流配列の１つとして働き、 もう一方はしばしばＧＣに富んだ部分（例えば、「ＧＣボックス」（例えば、配 列「ＧＧＧＣＧＧ」で構成される）、または配列「ＧＣＣＡＣＡＣＣＣおよびＡ ＴＧＣＡＡＡＴ」）である。ＣＣＡＡＴの相同性はＤＮＡの異なる鎖にも存在し 得る。上流のプロモーター因子もまた、当該分野で記載され、遺伝子のある特定 の小さな組を特徴づけるらしいシグナルのように、特殊化したシグナルであるか もしれない。 転写を開始するためには、ＴＡＴＡボックスと上流の配列はそれぞれこれらの 部位に結合する調節タンパク質によって認識され、ＲＮＡポリメラーゼIIが該Ｄ ＮＡ部分に結合して正しく転写を開始できるようにすることによって転写を活性 化する。ＴＡＴＡボックスおよび上流配列内部の塩基変化により、転写速度が実 質的に低下し得る（例えば、Myersら，Science，229，2342-7（1985）；McKmigh tら，Science ，217，316-324(1982)）。お互いの、および転写開始点に対するこ れらの要素の相対的な位置および配向が、すべてではないがいくつかのコード配 列の効率よい転写に重要である。例えば、いかなるＴＡＴＡボックスも存在しな くても、よく機能するプロモーターもある。同様に、ＲＮＡポリメラーゼＩまた はIIIまたは他のＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモーターにとっての 、これらのまたは他の配列の必要性は異なるかもしれない。 したがって、プロモーター領域は長さおよび配列で変化し、部位特異的ＤＮＡ 結合タンパクに対する１つ以上のＤＮＡ結合部位および／またはエンハンサーも しくはサイレンサーをさらに包含することができる。本発明では、目的の遺伝子 またはコード配列（例えば、さらに記載されるような「第一コード配列」または 「第二コード配列」）を調節するためのプロモーターとして、優先的にＣＭＶプ ロモーターまたはＰ５プロモーターを用いる。このようなプロモーターおよびそ の変異体は当該分野で知られ、また記載されている（例えば、Hennighausenら，EMBO J. ，5 ，1367-1371(1986)；Lehnerら，J ．Clin．Microbiol.，29，2492-250 2（1991）；Langら，Nucleic Acids Res.，20，3287-95（1992）；Srivastavaら ，J ．Virol.，45，555-564（1983）；Greenら，J ．Virol.，36，79-92(1980) プロモーターおよび３つに分かれたリーダー、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ロ ングターミナルリピート、並びに文献に記載されているような他の構成的プロモ ーターのような、他のプロモーターもまた使用することができる。例えば、ヘル ペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，78， 144-145(1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら，Nature，2 96 ，39-42(1982)）、ＧＡＬ４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロ モーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、およびアルカリホスフ ァターゼプロモーターのような酵母または真菌由来のプロモーター因子を用いる ことができる。同様に、哺乳動物細胞のゲノムまたはこれらの細胞で増殖するウ イルス（例えば、Ａｄ、ＳＶ４０、ＣＭＶ等）から単離されたプロモーターを使 用することができる。 構成的プロモーターを用いる代わりに、プロモーターはまた、適当なシグナル に応答して上向きおよび／または下向きに好ましく調節され得る。例えば、ＴＮ Ｆや別のサイトカインに応答するＩＬ−８プロモーターのような誘導プロモータ ーを用いることができる。適当な誘導プロモーター系の他の例としては、メタロ チオネイン誘導プロモーター系、細菌のｌａｃ発現系、およびＴ７ポリメラーゼ 系が挙げられるが、それらに限定されない。さらに、異なる発生段階で選択的に 活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は胚と成体で特異的に転写 される）を用いることができる。特に、テトラサイクリンまたはＲＵ−４８６な どの合成ホルモンのような外因性因子により調節され得るプロモーターを用いる ことができる。これらのプロモーター（および同様に細胞に供給され得る付属の 調節因子）は全て当該分野で記載されている（例えば、Delortら，Human Gene T herapy ，7 ，809-820（1996）；Clontech，CLONTECHniques，"Tet-OffTM nd Tet -OnTM ene Expression Systems and Cell Lines"，Volume XI，No．3，2-5（Ju ly 1996）を参照）。 別の選択肢は、アルブミンやα1−アンチトリプシンに対する肝細胞特異的プ ロモーター（Frainら，Mol．Cell．Biol.，10:991-999(1990)；Cilibertoら，Ce ll 41:531-540（1985）；Pinkertら，Genes and Devel.，1 ，268-276（1987）； Kelseyら，Genes and Devel.，1 ，161-171（1987））、膵臓腺房細胞で活性なエ ラスターゼＩ遺伝子の制御領域（例えば、Swiftら，Cell，38，639-646（1984） ；MacDonald，Hepatology ，7，425-515(1987)）、膵臓β細胞で活性なインスリ ン遺伝子の制御領域（Hanahan，Nature ，315，115-122(1985)）、睾丸、乳房、 リンパおよびマスト細胞で活性なマウス乳癌ウイルスの制御領域(Lederら，Cell ，45，485-495(1986)）、脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエ リン塩基性タンパク遺伝子の制御領域（Readheadら，Cell，48，703-712（1987 ））および視床下部で活性な生殖腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子の制御領域 （Masonら，Science ，234，1372-1378(1986)）のような組織特異的プロモーター （すなわち、所定の組織で優先的に活性化され、結果として活性化された組織で の遺伝子産物の発現を生じるプロモーター）を使用することである。同様に、結 腸癌に対する胎児性癌抗原のような腫瘍特異的プロモーター（Schreweら，Mol． Cell．Biol．10:2738-2748(1990)）を該ベクターに使用することができる。本発 明によれば、いかなるプロモーターも、所望の結合能力とプロモーター強度を有 する限り、変異誘発により変化させてもよい。 さらに、ホルモンレセプターのＣ末端リガンド結合ドメインをある特定のタン パク質のコード配列に融合させることによって、誘導活性が得られ得ることが今 や知られている（例えば、Kellendockら，Nucleic Acids Res.，24，1404-1411 （1996）；Metzgerら，Proc ．Natl．Acad．Sci.，92，6991-6995(1995)を参照） 。このアプローチは、リコンビナーゼの融合を創るのに使用した場合、組換えが 誘導的に起こるようになり、且つステロイドレセプターに結合する外因性基質の 制御下におかれるという点で有利である。しかしながら、該方法はまた、本発明 のいかなるコード配列（例えば、第一および第二コード配列）および／またはい かなるパッセンジャー遺伝子を伴っても好ましく用いることができる。特に、該 方法は、外因性の、しかし天然には存在しないステロイドを結合し得るホルモン レセプターのリガンド結合ドメイン（例えば、ホルモン結合ドメイン）を使用し て、好ましく用いることができる。例えば、ＲＵ−４８６のような合成ホルモン には低いレベルで応答するが、内因性のステロイドには応答しない変異ホルモン プロゲステロンレセプター（ｈＰＲ８９１）のリガンド結合ドメインを用いるこ とができる（Kellendockら，上述）。あるいは、エストロゲン、グルココルチコ イド、およびアンドロゲンのレセプター由来のリガンド結合ドメインをリコンビ ナーゼまたは他のコード配列に融合することができる。他の類似のアプローチも また当該分野で記載されており、結果としてキメラタンパク質を生じる翻訳時の 融合、あるいは先に記載したような、遺伝子を外因性基質の制御下に置く転写時 の融合のいずれかを通じて、リコンビナーゼまたは本発明のコード配列にコード される他のタンパク質の活性をリガンド依存的にするために、ここで用いること ができる。さらに、ラパマイシンのような独特のタンパク質は、ここに記載され る系にさらに別のレベルの制御を加えて、通常はお互いに無視するタンパク質の 結合を可能にする（例えば、Balterら，Science，273，183（1996）；Choiら，S cience，273，239-242(1996)を参照）。 さらに、ある場合には、ベクターの自律複製のために用いられる起点はまた、 プロモーターとして機能する配列を含んでもよい（例えば、ＤＮＡ複製と転写が 密接に絡み合っているために）。例えば、ポリオーマウイルスの起点は、例えば パッセンジャー遺伝子の発現を駆動するのに用いることができる構成的プロモー ターを含む。同様に、ウシパピローマウイルスの複製起点は、パピローマウイル スＥ２タンパク質により誘導されるプロモーターを含む。この起点は、本発明の ベクター中の遺伝子の手段として使用できる可能性がある。同様に、ＥＢＶの起 点はＥＢＮＡ−１の存在下でエンハンサーとして働く反復（配列）を含む。これ らの反復は、例えば、ＥＢＮＡ−１の組換えを介した上向き調節をして、遺伝子 の発現を上向きに調節するのに用いることができる。 当業者は、例えば、転写、ｍＲＮＡの翻訳および転写後のプロセッシングのよ うな、様々な遺伝的シグナルおよびプロセッシングが、細胞内の核酸およびタン パク質／ペプチドのレベルを制御することを承知している。ＤＮＡのＲＮＡへの 転写には機能的なプロモーターが必要である。転写の量は、ＲＮＡポリメラーゼ が特異的なシグナルにおいて転写を認識、開始および終結する効率によって調節 される。これらの工程、並びに生じようとしているｍＲＮＡの伸長および他の工 程は、細胞内にやはり存在する種々の他の成分、例えば、転写過程の一部となり 得る他のタンパク質、細胞内に存在するリボ核酸の濃度等によって影響を受けや すい。 タンパク質の発現もまた、ＤＮＡシグナルによって調節されるＲＮＡ転写のレ ベルおよびＤＮＡ鋳型のレベルに依存する。同様に、ｍＲＮＡの翻訳には、最低 限、メッセージの５’末端の１０〜１００ヌクレオチドの中に普通位置する開始 コドン（好ましくはＡＵＧ開始コドン）が必要である。ＡＵＧ開始コドンにフラ ンキングする配列が、結果として最適な翻訳を生じる完全なコザックのコンセン サス配列との相似により、真核のリボソームのよる認識に影響することが明らか になっている（例えば、Kozak，J．Molec．Biol.，196，947-950（1987）を参照 ）。また、細胞内で外来核酸配列が首尾よく発現するには、得られるタンパク質 ／ペプチドの翻訳後の修飾が必要となり得る。したがって、組換えタンパク質ま たはペプチドの生産は、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される効率、ｍＲＮＡがタンパ ク質に翻訳される効率、および翻訳後の修飾を行う細胞の能力によって影響され 得る。これらはすべて当業者が承知し、所望の最終結果を達成するための標準の 手段を用いて操作し得るものである。 このような道筋にしたがえば、組換え後のタンパク質生産を最適にするために 、好ましくは、別個のコード配列を上向きおよび下向きに同時調節するのに用い られるベクターは、（ａ）起点を含む第一および第二組換え部位間の領域中の第 一組換え部位とコード配列の間に位置するスプライス受容部位、および（ｂ）起 点を含む第一および第二組換え部位間の領域中のプロモーターと第二組換え部位 の間に位置するスプライス供与部位、および（ｃ）起点を含む第一および第二組 換え部位間の領域を含む領域以外の領域中の第二組換え部位と第二コード配列と の間に位置するスプライス受容部位を含む。 当業者はまた、ある特定の免疫原性のあるタンパク質に対する免疫応答が、結 果としてインビボでの該タンパク質のレベルを減少させることを承知している。 Ｃｒｅタンパク質は、免疫応答を生じさせ得るこのようなタンパク質の一例であ る。これに比べて、ＥＢＮＡ−１タンパク質は効率よく免疫系による検出から逃 れる。したがって、本発明はまた、Ｃｒｅまたは本発明において用いられる他の 免疫原性のあるタンパク質を免疫系が検知できないようにする方法を提供する。 この方法は、該タンパク質のＣまたはＮ末端のいずれかに、何コピーものＥＢＮ Ａ−１タンパク質（またはその保守的な変異種）のグリシン−アラニン反復を置 くことを含む。このような配置は、好ましくはコード配列中の（例えば、第一ま たは第二コード配列、他のコード配列またはパッセンジャー遺伝子の）ＤＮＡレ ベルでなされる。グリシン−アラニン反復は当該分野で公知である（例えば、Ya tesら，上述；Luptonら，上述；Levitskayaら，上述を参照）。好ましくは、こ れはグリシン−アラニン反復（またはその変異種）の核酸配列を目的のコード配 列の５’または３’末端のいずれかに組み込むことによりなされる。特に、この アプローチはまた、先に記載したように、リガンド結合ドメインを使用して用い ることもできる。図２Ａ〜２Ｆに示されるように、グリシン−アラニン反復（Ｇ ｌｙ Ａｌａ）はコード配列（ＣＳ）および存在すればリガンド結合ドメイン（ ＨＢＤ）と向かい合って様々な位置で用いることができる。 同方向組換え法は遺伝子およびコード配列の一時的な調節を提供するのに使用 することができる。例えば、第一コード配列は、先に記載したようにＥＢＮＡ− １またはＲｅｐのコード配列であってよい。また、第二コード配列も先に記載し たようにＣｒｅまたはＦｌｐのコード配列を含むことができる。しかしながら、 より一般的には、第一または第二（または他の）コード配列のいずれかはＥＢＮ Ａ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗原、Ｅ１またはＥ２のコード配列 のいずれかを含むことができる。 組換えが起こることによってもたらされる調節は、リコンビナーゼのコード配 列の一時的な発現を提供するのにも用いることができる。すなわち、リコンビナ ーゼのコード配列を図１Ａ中のＳＣＳの位置に置くことができる。エピソームが 切り出された後、リコンビナーゼはもはや宿主細胞内で産生されないだろう。こ のアプローチは、リコンビナーゼ活性がエピソームの生成後に存在しないことが 好ましいという点で有利である。これによって、エピソームの再組込みあるいは 分子間組換えによる多量体化の可能性が減少する。 同じ道筋に従えば、ＥＢＮＡ−１のコード配列を図１Ａ中のＦＣＳの位置に置 くことができる。これによりＥＢＮＡ−１のコード配列の発現を調節することが 可能となるが、このことは、ウイルス産生（すなわち、ウイルスがエピソーム送 達ベクターとして使用される場合）中にシスにＥＢＮＡ−１を介したoriＰの複 製が起こると望ましくないゲノムの不安定性および収率の減少が起こり得ること があるので、有利である。もしＥＢＮＡ−１のコード配列がＦＣＳとして供給さ れれば、その発現は、それが最も必要な、エピソームの切り出しの後にのみ起こ るだろう。 その転写がＰにより命令されるコード配列（すなわち、ＦＣＳまたはＳＣＳ） にコードされるＥＢＮＡ−１または他のいかなるタンパク質の生産も、ＳＲＳを イントロンの内側に置くことによって最大となる。このことによりＳＲＳ内部に 存在するいかなる偶然の開始コドンでの開始も不可能となり、同様にいかなる融 合タンパク質の形成も不可能となる。これは、図１Ａに示されるように、ＦＲＳ とＦＣＳの間、およびＳＲＳとＳＣＳの間にスプライス受容部位（ＳＡ）を置き 、また、ＰとＳＲＳの間にスプライス供与部位（ＳＤ）をおくことによって達成 することができる。ＦＣＳ、ＳＣＳまたはＴＧにコードされるタンパク質の産生 は、これらの配列のコード領域のすぐ下流にポリアデニレーション部位を置くこ とによって同様に最大にすることができる。 ＥＢＮＡ−１の発現を制御するのに用いられるアプローチは、同様に、ＡＡＶ 由来のＲｅｐタンパク質の転写およびその後の翻訳を制御する手段としても用い ることができる。２つの可能性のある問題を回避するために、Ｒｅｐ遺伝子の一 時的発現および発現レベルは厳密に調節される。第一に、ＥＢＮＡ−１と同様、 ウイルスをエピソーム送達ベクターとして用いた場合、ウイルス産生中に宿主細 胞内にＲｅｐタンパク質が存在すると、ウイルスの不安定性および収率の減少が 起こり得るだろう。第二に、Ｒｅｐ遺伝子の過剰発現は細胞にとって毒性であり 免疫応答を誘発し得るだろう。Ｒｅｐコード配列を図１Ａ中のＦＣＳの位置にク ローニングすることによって、これらの可能性のある問題を回避することができ る。こうすることによって、ウイルス産生中にＲｅｐ遺伝子が発現しないことが 保証されるだろう。Ｒｅｐをコードするベクターを含む細胞への感染およびリコ ンビナーゼの送達（例えば、同じベクター上で、ことのよるとＳＣＳとしてリコ ンビナーゼのコード配列を供給するか、あるいは同時投与されるベクター上で供 給するかのいずれかにより）によって、ＰをＲｅｐコード配列の上流に持ってき てＲｅｐコード配列をＰの制御下に置く組換えが起こるだろう。Ｒｅｐ遺伝子の 天然のプロモーターであるＰ５プロモーターは、このプロモーターが細胞毒性効 果や免疫応答の誘発なしに、Ｒｅｐを介したゲノムの組込みを可能にする、適当 なレベルのＲｅｐ遺伝子の発現を命令するはずであるから、Ｐとして使用するこ とができる。 １つ以上のＡＡＶ ＩＴＲがフランキングする配列は、Ｒｅｐタンパク質が存 在すると、ヒト第１９染色体に優先的に組み込まれる。したがって、本発明の方 法の一態様において、コード配列はＲｅｐコード配列である。好ましくは、ベク ターはさらに１つ以上の（例えば、第一および第二の）アデノ随伴ウイルスのＩ ＴＲを含む。理論的には、ＩＴＲは位置非依存的であるから、本発明の方法にお いて、ＡＡＶ ＩＴＲの様々な配置が使用できる。したがって、この方法では、 １つ以上のＡＡＶ ＩＴＲは、起点を含む第一および第二組換え部位の間の領域 に好ましくは位置する。しかしながら、１つ以上のＩＴＲは、起点を含む第一お よび第二組換え部位間の領域以外の領域にも位置することができる。１つ以上の ＡＡＶ ＩＴＲがパッセンジャー遺伝子に直にフランキングして位置づけられる と、この遺伝子の別の遺伝的位置への組込みが可能となるだろう。Ｒｅｐによっ て指示される組換えにより、Ｒｅｐタンパク質が不活性化されるように、１つ以 上のＡＡＶ ＩＴＲを置くことも可能である。例えば、１つ以上のＡＡＶ ＩＴ Ｒを、ＲｅｐをコードするＦＣＳと下流のポリアデニレーション部位の間に置く ことができる。この場合、エピソーム配列の別の遺伝的位置へのＲｅｐを介した 組換えが起これば、ポリアデニレーション部位からＲｅｐコード配列が切り取ら れ、ポリアデニル化されなければ真核細胞内で転写物は急速に分解されるので、 Ｒｅｐ活性はなくなってしまうだろう。さらに、他の遺伝子も同様に、本発明の 同方向組換え法を用いて調節、活性化または不活性化することができる。 あるいは、Ｒｅｐタンパク質を、同方向組換え法を用いて生成するミニプラス ミド上にコードして供給することによって、細胞に送達することができる。この アプローチは、先に記載したように、２つのダイレクトリピートした組換え部位 間に位置する目的の配列は含むが、該組換え部位間に同様に位置する複製起点が ないベクターの使用を通して、Ｒｅｐまたは他のタンパク質コード配列を含むミ ニプラスミドの生成を含む。 したがって、Ｒｅｐタンパク質を細胞に供給する方法は、（ａ）同じ向きに位 置した第一および第二組換え部位の間に位置するＲｅｐコード配列を含むベクタ ーを細胞に接触させて、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれるように すること、および（ｂ）該細胞に、該ベクターの第一および第二組換え部位間で の組換えをもたらす部位特異的リコンビナーゼを供給することを含む。最も好ま しくは、Ｒｅｐコード配列は該ベクター中のプロモーターに機能的に結合してい るか、あるいは組換えが起こった結果、該ベクター中のプロモーターに機能的に 結合する。 好ましくは、この方法は、（ａ）Ｒｅｐコード配列は、第一組換え部位から該 コード配列を通過して第二組換え部位の方向に、該コード配列が転写されるべく 配向するように、第一組換え部位に隣接する、（ｂ）該コード配列がいずれのプ ロモーターにも機能的に結合していない、および（ｃ）プロモーターが、該コー ド配列を含む第一および第二組換え部位間の領域に位置し、且つ第一組換え部位 から該コード配列を通過して第二組換え部位の方向での転写を、該プロモーター が指示すべく配向するように、第二組換え部位に隣接することにより行われる。 また、好ましくは、Ｒｅｐタンパク質の送達に用いられるベクターは、さらに 第一および第二のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含む。最も好ましくは、１つ以上 のＩＴＲは、コード配列を含む第一および第二組換え部位間の領域に位置する。 あるいは、１つ以上のＩＴＲは、起点を含む第一および第二組換え部位間の領域 以外の領域に位置する。 同方向組換え法のこれらの態様のいくつかを図３Ａ〜３Ｘに示す。詳細には、 図３Ａは、同方向の組換え部位（ＦＲＳおよびＳＲＳ）およびこれらの部位の間 に位置する複製起点を含むベクターが細胞に供給される、本発明の方法を示す。 リコンビナーゼもまた、シスまたはトランスのいずれかで細胞に供給されるのが 好ましい。好ましくは、この方法に用いられるベクター（直鎖状または環状のし ずれか）はまた、ベクター上のどこにでも（図３Ｂ）、第一および第二組換え部 位間のoriを含む領域に（図３Ｃ）、または第一および第二組換え部位間の領域 以外の領域に（図３Ｄ）位置することができるコード配列（ＣＳ）を含む。好ま しくは、該ベクターはさらにベクター上のどこにでも位置する１つ以上のＩＴＲ を含むことができ（図３Ｅ）、および／または１つ以上のパッセンジャー遺伝子 （ＰＧ；図３Ｆ）を含むことができる。 プロモーターが起点を含む第一および第二組換え部位の間に位置する場合、同 方向組換え法は、組換えが起こることによって、コード配列を下向きに調節する （図３Ｇ）、上向きに調節する（図３Ｈ）、あるいは第一コード配列（ＣＳ）を 上向きに且つ第二コード配列（ＳＣＳ；図３１）を下向きに同時調節するのに用 いることができる。タンパク質の生産を最適にするために、１つ以上のスプライ ス供与（ＳＤ）および／またはスプライス受容（ＳＡ）部位をベクター中に組み 込むことができる（図３Ｊ）。 組換えが起こることによってもたらされる遺伝子発現調節は、同様に、第一お よび第二組換え部位間のoriを含む領域以外の領域に位置するプロモーターを有 するベクターを使用することにより、達成することができる。このようなベクタ ーは、組換えが起こることによって、コード配列を上向きに調節する（図３Ｋ） 、または第一コード配列を上向きに且つ第二コード配列を下向きに同時調節する （図３Ｌ）のに用いることができる。同方向組換え法はまた、第二プロモーター （ＳＰ）を使用することにより、組換えが起こることによって、第一および第二 コード配列を同時に上向きに調節するのに用いることができる（図３Ｍ）。さら に、第三のコード配列を、第一プロモーターと第一組換え部位の間でベクターに 挿入することができる（図３Ｎ）。特に第三コード配列が第一プロモーターと同 じ向きに配向する場合（図３Ｎ）、組換えが起こることによってジシストロニッ クメッセージを創ることができる（例えば、内部リボソーム導入部位もベクター 中に適切に位置する場合）。第三コード配列が第一プロモーターと反対の向きに 配向する場合（図３Ｎ）、組換えが起こることによって第三コード配列は下向き に調節されるのに対し、第一コード配列は上向きに調節される（例えば、最も好 ましくは、スプライス供与体および受容体部位がベクター中に適当に位置する場 合）。 特に、同方向組換え法は、Ｒｅｐタンパク質を細胞に供給するための簡便な方 法を提供する。例えば、そこでＲｅｐ遺伝子が最初サイレントで、組換えが起こ ることによって上向きに調節される（図３Ｏ）。ここでは、他の態様においてと 同様に、ベクターはさらに、１つ以上のＩＴＲを、ベクター上のどこにでも（図 ３Ｏ）、組換え部位間のoriを含む領域に（図３Ｐ）、またはoriを含む領域の外 側に（図３Ｑ）組み込むことができる。 同方向組換え法はまた、第一および第二組換え部位の間に複製起点を含まない ベクターを使用しても行うことができる（図３Ｒ）。この方法はまた、任意で、 Ｒｅｐを、組換えが起こることによって形成される小環上に存在するパッセンジ ャー遺伝子またはコード配列のいずれかとして、細胞に送達することができる（ 図３Ｓ）。このようなベクターはさらに、組換えが起こることによって上向きに 調節される別のコード配列を含むことができる（図３Ｔ）。oriを含むベクター を使用するのと同様、複製起点を欠くベクターは、組換えが起こることによって 、第一コード配列を上向きに且つ第二コード配列を下向きに同時調節する（図３ Ｖ）、および第一および第二コード配列の両方を上向きに調節する（図３Ｗ）の に用いることができる。この態様はまた、先に記載したように、第三コード配列 の使用（図３Ｘ）を伴って適用することができる。本発明によれば、いずれのコ ード配列（すなわち、第一、第二または第三）および／またはパッセンジャー遺 伝子もＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗原、Ｅ１およびＥ２ コード配列をコードすることができる。この方法のさらなるバリエーションは当 業者にとって明白であろう。 ｂ．アンチパラレル組換え法 アンチパラレル組換え法は、好ましくは、ファージＰ１ Ｃｒｅ／Ｌｏｘ系、 酵母Ｆｌｐ／Ｆｒｔ系、または他の適当な組換え系のような、適当な組換え系に よりもたらされる部位特異的組換えに依拠しているという点で、同方向組換え法 のそれと類似している。しかしながら、同方向組換え法とは対照的に、アンチパ ラレル組換え法は、同じＤＮＡ分子上にアンチパラレルの配向で位置する第一お よび第二組換え部位を有するベクターを含む。この互い違いの組換え部位の配置 は、リコンビナーゼの適用によって、エピソームを切り出す代わりに介在配列の 反転を導く。アンチパラレル組換え法は、例えば、組換えを通して、１つのコー ド配列を上向きもしくは下向きに調節するか、または１つのコード配列を上向き に且つ別のコード配列を下向きに同時調節することによって遺伝子発現を調節す るのに用いることができる。 このような道筋に従えば、細胞内での部位特異的組換えをもたらすアンチパラ レル組換え法は、（ａ）ベクターが細胞によって内部に取り込まれるように、該 ベクターを該細胞に接触させること、（ここで該ベクターは、（ｉ）アンチパラ レルに配向した第一および第二組換え部位の間に位置するプロモーターであり、 且つ第一組換え部位から該プロモーターを通過して第二組換え部位の方向での転 写を指示すべく配向するように、第二組換え部位に隣接するプロモーター、およ び（ii）該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域以外の領域に 位置し、第一組換え部位から該プロモーターを通過して第二組換え部位への方向 とは反対方向に転写されるべく配向するように、第一組換え部位に隣接し、且つ いずれのプロモーターにも機能的に結合していないコード配列を含む）、および （ｂ）該細胞に、ベクターの第一および第二組換え部位間での組換えをもたらす 部位特異的リコンビナーゼを供給することを含む。第一組換え部位と該コード配 列の間に位置するコード配列、プロモーター、および転写終結部位がないことが 好ましい。 この方法は、好ましくは、プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の 領域以外の領域に位置し、第二組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能 的に結合した第二コード配列をさらに含む。該プロモーターと第二コード配列の 間に位置するコード配列、プロモーター、および転写終結部位がないことが最も 好ましい。 さらに、アンチパラレル組換え法はまた、別のコード配列を上向きに調節する ことなく単独のコード配列を下向きに調節するのに用いることができる。この方 法は、（ａ）ベクターが細胞によって内部に取り込まれるように、該ベクターを 該細胞に接触させること、（ここで該ベクターは、（ｉ）アンチパラレルに配向 した第一および第二組換え部位の間に位置するプロモーターであり、且つ第一組 換え部位から該プロモーターを通過して第二組換え部位への方向での転写を指示 すべく配向するように、第二組換え部位に隣接するプロモーター、および（ii） 該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域以外の領域に位置し、 且つ該プロモーターに機能的に結合するように第二組換え部位に隣接するコード 配列を含む）、および（ｂ）該細胞に、ベクターの第一および第二組換え部位間 での組換えをもたらす部位特異的リコンビナーゼを供給することを含む。組換え の後、該プロモーターと該コード配列の間に介在するコード配列、プロモーター 、および転写終結部位がないことが最も好ましい。 また、好ましくは、コード配列の上向きおよび／または下向きの調節に用いら れるいかなるベクターも、先に記載したように、さらにパッセンジャー遺伝子お よび／またはＲｅｐ、ＥＢＮＡ−１、ＣｒｅまたはＦｌｐ遺伝子のいずれかのコ ード配列を含んでもよい。同方向組換え法についてと同様、いかなるコード配列 （例えば、第一、第二または他のコード配列）および／またはパッセンジャー遺 伝子も、ＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗原、Ｅ１またはＥ ２コード配列を含むことができる。 さらに、組換え後のタンパク質生産を最適にするために、別個のコード配列を 同時に上向きおよび下向きに調節するのに用いられるベクターは、好ましくは（ ａ）プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域を含めた領域以外の 領域中の第一組換え部位とコード配列の間に位置するスプライス受容部位、（ｂ ）プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域中の該プロモーターと 第二組換え部位の間に位置するスプライス供与部位、および（ｃ）プロモーター を含む第一および第二組換え部位間の領域を含めた領域以外の領域中の第二組換 え部位と第二コード配列の間に位置するスプライス受容部位を含む。 図４はアンチパラレル組換え法と連携して使用するための好ましいベクターを 示す。図４に示されるように、アンチパラレル組換えベクターは、第一コード配 列（ＦＣＳ）が、第一組換え部位（ＦＲＳ）から第二組換え部位（ＳＲＳ）への 方向とは反対方向に転写されるべく配向するように、第一組換え部位（ＦＲＳ） に隣接するＦＣＳを含む。ＦＣＳはいずれの上流プロモーターにも機能的に結合 していないので、転写されない。第二コード配列（ＳＣＳ）は第二組換え部位（ ＳＲＳ）に隣接して位置し、第一組換え部位（ＦＲＳ）から第二組換え部位（Ｓ ＲＳ）の方向に転写されるように配向される。 例えば、組換えが起こることによって１つのコード配列の発現は上向きに調節 されるが、別のコード配列が下向きに調節されない場合には、ＳＣＳは必ずしも 存在する必要はない。しかしながら、ＳＣＳが存在すると、それは第一および第 二組換え部位（ＦＲＳおよびＳＲＳ）間に位置するプロモーター（Ｐ）に機能的 に結合しているので、少なくとも最初は転写される。同様に、例えば、組換えが 起こることによって１つのコード配列の発現は下向きに調節されるが、別のコー ド配列が上向きに調節されない場合には、ＦＣＳは必ずしも存在する必要はない 。しかしながら、ＦＣＳが存在すると、ＰをＦＣＳの上流に置く組換えの後にそ れは転写される。 したがって、このベクターを含む細胞へのリコンビナーゼの適用の前には、Ｓ ＣＳは転写されるが、ＦＣＳは転写されない。リコンビナーゼを適用した後、組 換えが起こるとＰはＦＣＳの上流に置かれ、ＦＣＳは転写されるがＳＣＳは転写 されない。ＦＣＳとＦＲＳの間およびＳＣＳとＳＲＳの間に位置するコード配列 、さらなるプロモーターおよび転写終結部位がないことが好ましい。 さらに、遺伝子発現とタンパク質生産を最大にするために、スプライス受容体 部位（ＳＡ）をＦＣＳとＦＲＳの間およびＳＣＳとＳＲＳの間に置くことができ る。さらに、スプライス供与体部位（ＳＤ）をＰとＳＲＳの間に置くことができ る。さらに、ポリアデニレーション部位をＦＣＳおよびＳＣＳ配列のコード領域 の後に挿入することができる。 このような組換え方法では、好ましくは、ＳＣＳはリコンビナーゼのコード配 列をコードすることができ、ＦＣＳは、好ましくはＲｅｐのコード配列またはＥ ＢＮＡ−１のコード配列をコードすることができる。図４に示されるアンチパラ レル組換えベクターおよびその変異体は、同様に、他の遺伝子、例えば発生的に 調節される遺伝子のような正しい一時的発現を必要とする遺伝子、または有毒も しくは有害なタンパク質をコードする遺伝子のように、その発現が厳密に制御さ れなければならない遺伝子に用いることができる。 さらに、アンチパラレル組換え法に従えば、コード配列（例えば、Ｒｅｐ、Ｅ ＢＮＡ−１またはリコンビナーゼ用コード配列を組換え部位の間に置き、１つ以 上のプロモーターを組換え部位の外側に置くことによって、該コード配列を上向 きおよび／または下向きに調節することもできる。上向きの調節を可能にする一 態様において、この方法は、（ａ）ベクターが細胞によって内部に取り込まれる ように、該ベクターを該細胞に接触させること、［ここで該ベクターは、（ｉ） アンチパラレルに配向した第一および第二組換え部位の間に位置するコード配列 であり、且つ第一組換え部位から該コード配列を通過して第二組換え部位への方 向とは反対方向に転写されるべく配向するように、第二組換え部位に隣接するコ ード配列（ここで該コード配列はいずれのプロモーターにも機能的に結合してい ない）、および（ii）該コード配列を含む第一および第二組換え部位間の領域以 外の領域に位置し、第一組換え部位から該コード配列を通過して第二組換え部位 の方向での転写を指示すべく配向するように、第一組換え部位に隣接するプロモ ーターを含む］、および（ｂ）該細胞に、ベクターの第一および第二組換え部位 間での組換えをもたらす部位特異的リコンビナーゼを供給することを含む。 別個のコード配列の上向きおよび下向きの同時調節を可能にするために、該ベ クターは、好ましくは、コード配列を含む第一および第二組換え部位間の領域に 位置し、第一組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に結合した第二 コード配列をさらに含む。 さらに、単独のコード配列の下向きの調節を提供する別の態様において、この 方法は、（ａ）ベクターが細胞によって内部に取り込まれるように、該ベクター を該細胞に接触させること、［ここで該ベクターは、（ｉ）アンチパラレルに配 向した第一および第二組換え部位の間に位置するコード配列であり、且つ第一組 換え部位から該コード配列を通過して第二組換え部位への方向に転写されるべく 配向するように、第一組換え部位に隣接するコード配列、および（ii）第一組換 え部位から該コード配列を通過して第二組換え部位への方向での転写を指示すべ く配向するように、第一組換え部位に隣接し且つ該コード配列を含む第一および 第二組換え部位間の領域以外の領域に位置するプロモーターを含む（ここで該コ ード配列は該プロモーターに機能的に結合している）］、および（ｂ）該細胞に 、ベクターの第一および第二組換え部位間での組換えをもたらす部位特異的リコ ンビナーゼを供給することを含む。 好ましくは、これらのベクターはさらに１つ以上のパッセンジャー遺伝子を含 む。プロモーターと組換え部位の間、また、コード配列もしくは第二コード配列 と組換え部位との間に位置するコード配列、プロモーターおよび転写終結部位が ないことが最も好ましい。さらに、遺伝子発現およびコードされるタンパク質の 生産を最大にするために、先に記載したように、スプライス部位（すなわち、ス プライス受容体部位およびスプライス供与体部位）およびポリアデニレーション 部位を、これらの方法に用いられるベクターに組み込むことができる。 アンチパラレル組換え法のこれらの態様のいくつかを図５Ａ〜５Ｇに示す。詳 細には、アンチパラレルの組換え部位（ＦＲＳおよびＳＲＳ）を含むベクターが 細胞に供給される本発明の方法を示している。好ましくはリコンビナーゼもシス またはトランスのいずれかで該細胞に供給される。この方法に用いられるベクタ ー（直鎖状または環状のいずれか）はまた、好ましくはコード配列（ＣＳ）を含 む。プロモーターが第一および第二組換え部位の間に位置する場合、アンチパラ レル組換え法は、組換えが起こることによって、コード配列を上向きに調節する （図５Ａ）、下向きに調節する（図５Ｂ）、または第一コード配列（ＣＳ）を上 向きに且つ第二コード配列（ＳＣＳ；図５Ｃ）を下向きに同時調節するのに用い ることができる。タンパク質生産を最適にするために、１つ以上のスプライス供 与体（ＳＤ）および／またはスプライス受容体（ＳＡ）部位をベクターに組み込 むことができる（図５Ｄ）。 組換えが起こることによってもたらされる遺伝子発現調節は、同様に、第一お よび第二組換え部位の間のoriを含む領域以外の領域に位置するプロモーターを 有するベクターを使用して達成することができる（例えば、直鎖状の基質が用い られた場合）。このようなベクターは、組換えが起こることによって、コード配 列を上向きに調節する（図５Ｅ）、下向きに調節する（図５Ｆ）、または第一コ ード配列を上向きに且つ第二コード配列を下向きに同時調節する（図５Ｇ）のに 用いることができる。本発明によれば、ベクター中に存在するいかなるコード配 列（すなわち、第一、第二または他のいかなるコード配列）および／またはいか なるパッセンジャー遺伝子も、ＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージ Ｔ抗原、Ｅ１またはＥ２コード配列をコードすることができる。この方法のさら なるバリエーションは、当業者にとって明白であろう。新規ベクター 本発明の方法に関して上述したように、本発明において使用することができる 様々なベクターがあるが、本発明はまた、本発明の同方向およびアンチパラレル 組換え法に特に有用な、ある特定の新規ベクターを提供する。 本発明のベクターは、同じ向きまたはアンチパラレルの配向で位置する第一お よび第二組換え部位を含む。第一および第二組換え部位は、細胞によって内部に 取り込まれ、適当なリコンビナーゼと接触した後、該ベクターの第一および第二 組換え部位の間で組換えが起こるような、いかなる適当な組換え部位であっても よい。 本発明におけるすべてのベクター上に位置する組換え部位、リコンビナーゼ、 コード配列、組換え部位間の領域、プロモーター、パッセンジャー遺伝子等に関 し、このようなエレメントは先に記載したとおりであり、独立に、もしくは結合 して、カセットの一部として存在し得る。本発明において、「カセット」とは、 単に核酸配列のサブクローニングおよび回収（例えば、１つ以上の制限部位）、 あるいは特定の核酸配列の発現（例えば、ポリアデニレーション部位またはスプ ライス部位）を容易にする機能を有する特定の塩基配列である。 ベクターの特定および／または選択は当業者に公知の様々なアプローチを用い て達成することができる。例えば、特定の遺伝子またはコード配列を含むベクタ ーは、ハイブリダイゼーション、いわゆる「マーカー」遺伝子機能の有無、およ び特定の挿入配列の発現により同定することができる。第一のアプローチにおい ては、ベクター中に挿入された外来配列の存在は、挿入された核酸配列に相同な 配列を含むプローブを用いて、ハイブリダイゼーションによって検出することが できる（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって）。第二のア プローチにおいては、組換えベクター／宿主系は、ベクター中へのそれら機能を コードする特定の遺伝子の挿入によって引き起こされる抗生物質に対する耐性、 チミジンキナーゼ活性等のような、ある特定のマーカー遺伝子の機能の有無に基 づいて同定および選択することができる。第三のアプローチにおいては、ベクタ ーは、挿入された核酸配列により発現した外来遺伝子産物を測定することによっ て同定することができる。このようなアッセイは、遺伝子産物の物理的、免疫学 的または機能的特徴に基づいて行うことができる。 同方向およびアンチパラレル組換え法に特に有用な本発明のベクターについて 以下に記載する。 ａ．同方向組換えベクター 一態様において、本発明の同方向組換えベクターは、（ａ）同方向の配向で位 置する第一および第二組換え部位、（ｂ）第一および第二組換え部位の間に位置 する複製起点、（ｃ）該起点を含む第一および第二組換え部位間の領域中のコー ド配列であり、且つ第一組換え部位から該コード配列を通過して先にある第二組 換え部位への方向に転写されるべく配向するように、第一組換え部位に隣接する コード配列（ここで該コード配列はいずれのプロモーターにも機能的に結合して いない）、および（ｄ）該起点を含む第一および第二組換え部位間に位置するプ ロモーターであり、且つ第一組換え部位から該プロモーターを通過して先にある 第二組換え部位への方向での転写を指示すべく配向するように、第二組換え部位 に隣接するプロモーターを含む。第一組換え部位と該コード配列の間に位置する コード配列、プロモーターおよび転写終結部位がないことが好ましい。 さらに、該ベクターは、好ましくは、該起点を含む第一および第二組換え部位 間の領域以外の領域に位置し、第二組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに 機能的に結合した第二コード配列をさらに含む。該プロモーターと第二組換え部 位の間に位置するコード配列、プロモーターおよび転写終結部位がないことが最 も好ましい。該ベクターは、さらに付加的なコード配列、例えば、先に記載した ような第三コード配列を含むことができる。 遺伝子発現およびタンパク質生産を最適にするために、該ベクターは、好まし くはさらに、（ａ）起点を含む第一および第二組換え部位間の領域中の第二組換 え部位とコード配列の間に位置するスプライス受容部位、（ｂ）起点を含む第一 および第二組換え部位間の領域中のプロモーターと第二組換え部位の間に位置す るスプライス供与部位、および（ｃ）起点を含む第一および第二組換え部位間の 領域を含む領域以外の領域中の第二組換え部位と第二コード配列の間に位置する スプライス受容部位を含む。このようなベクターは、エピソームを形成する組換 えが起こることにより、第一コード配列が上向きに調節され且つ第二コード配列 が下向きに調節されるエピソームを供給することによって、遺伝子発現を調節す る手段を提供する。 さらに別の態様においては、本発明の同方向組換えベクターは、（ａ）同方向 の配向で位置する第一および第二組換え部位、（ｂ）第一および第二組換え部位 の間に位置する複製起点、（ｃ）該起点を含む第一および第二組換え部位間の領 域に位置するプロモーターであり、第一組換え部位から該プロモーターを通過し て先にある第二組換え部位への方向での転写を指示すべく配向するように、第二 組換え部位に隣接するプロモーター、および（ｄ）該起点を含む第一および第二 組換え部位間の領域以外の領域に位置し、該プロモーターに機能的に結合するよ うに第二組換え部位に隣接するコード配列を含む。 同方向組換えベクター内の組換え部位は、本発明の方法に関して上述したよう に、いかなる適当な組換え部位であってもよい。好ましくは、同方向組換えベク ター内の組換え部位はＬｏｘ部位であり、その場合、同方向組換えベクターは、 さらにＣｒｅのコード配列を第一Ｌｏｘ部位の上流または第二Ｌｏｘ部位の下流 のいずれかに含む。あるいは同方向組換えベクター内の組換え部位はＦｒｔ部位 であり、その場合、同方向組換えベクターは、さらにＦｌｐのコード配列を第一 Ｆｒｔ部位の上流または第二Ｆｒｔ部位の下流のいずれかに含む。 複製起点は先に記載した通りであり、好ましくはＥＢＶのoriＰ配列、ポリオ ーマウイルスまたはパピローマウイルスの複製起点、あるいは他のいかなる複製 起点も含む。これらの（および他の）複製起点の使用には、細胞の複製を可能に するか促進するさらなるタンパク質を細胞に供給することが好ましい。ある意味 では「細胞複製タンパク質」と考えられるこれらのさらなるタンパク質は、好ま しくは、ＥＢＮＡ−１、ラージＴ抗原、Ｅ１およびＥ２タンパク質からなる群よ り選択される。 コード配列はいかなる適当なコード配列でもよい。好ましくは、第一コード配 列は、本発明の方法に関して記載したようにＥＢＮＡ−１またはＲｅｐコード配 列である。しかしながら、第一コード配列（および第二コード配列または他のい かなるコード配列）はＦｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗原、Ｅ１および／またはＥ２ コード配列も好ましく含むことができる。このようなベクターは、エピソームを 形成する組換えが起こることによりコード配列が調節されるエピソームを供給す ることによって遺伝子発現を調節する手段を提供する。 好ましくは、該ベクターはさらに、好ましくはコード配列とプロモーターの間 に位置するパッセンジャー遺伝子を含む。本発明の方法において記載したように 、リポーター遺伝子あるいは、最も好ましくは治療遺伝子のような、いかなる適 当なパッセンジャー遺伝子も使用することができる。さらに、本発明は先に記載 し、添付の図面に示されたようなさらなるベクターを提供する。 ｂ．アンチパラレル組換えベクター 本発明のアンチパラレル組換えベクターは、（ａ）アンチパラレルに配向した 第一および第二組換え部位の間に位置するプロモーターであり、且つ第一組換え 部位から該プロモーターを通過して先にある第二組換え部位への方向での転写を 指示すべく配向するように、第二組換え部位に隣接するプロモーター、および（ ｂ）該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域以外の領域に位置 し、且つ第一組換え部位から該プロモーターを通過して先にある第二組換え部位 への方向の反対方向に転写されるべく配向するように、第一組換え部位に隣接す るコード配列（ここで該コード配列はいずれのプロモーターにも機能的に結合し ていない）を含むベクターである。 好ましくは、該ベクターは、該プロモーターを含む第一および第二組換え部位 間の領域以外の領域に位置し、第二組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに 機能的に結合した第二コード配列をさらに含む。第一組換え部位と第一コード配 列の間、該プロモーターと第コード配列の間に位置するコード配列、プロモータ ーおよび転写終結部位がないことが最も好ましい。 さらに、別の態様において、本発明は、（ａ）アンチパラレルに配向した第一 および第二組換え部位の間に位置するプロモーターであり、且つ第一組換え部位 から該プロモーターを通過して先にある第二組換え部位への方向での転写を指示 すべく配向するように、第二組換え部位に隣接するプロモーター、および（ｂ） 該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域以外の領域に位置し、 且つ該プロモーターに機能的に結合するように、第二組換え部位に隣接するコー ド配列を含むベクターを提供する。 遺伝子発現およびタンパク質生産を最適にするために、アンチパラレル組換え ベクターは、（ａ）該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域を 含む領域以外の領域中の第一組換え部位と該コード配列の間に位置するスプライ ス受容部位、（ｂ）該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域中 の該プロモーターと第二組換え部位の間に位置するスプライス供与部位、および （ｃ）該プロモーターを含む第一および第二組換え部位間の領域を含む領域以外 の領域中の第二組換え部位と第二コード配列の間に位置するスプライス受容部位 をさらに含む。 さらに、本発明は、（ａ）アンチパラレルに配向した第一および第二組換え部 位の間に位置するコード配列であり、且つ第一組換え部位から該コード配列を通 過して先にある第二組換え部位への方向と反対方向に転写されるべく配向するよ うに、第二組換え部位に隣接するコード配列（ここで該コード配列はいずれのプ ロモーターにも機能的に結合していない）、および（ｂ）該コード配列を含む第 一および第二組換え部位間の領域以外の領域に位置し、且つ第一組換え部位から 該コード配列を通過して第二組換え部位への方向での転写を指示すべく配向する ように、第一組換え部位に隣接するプロモーターを含むアンチパラレル組換えベ クターを提供する。 好ましくは、該ベクターは、該コード配列を含む第一および第二組換え部位間 の領域に位置し、第一組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に結合 した第二コード配列をさらに含む。好ましくは、該ベクターはまた、先に記載し たように、他のコード配列（例えば、第三コード配列および／または他のコード 配列）を含む。 さらに、別の態様において、該ベクターは、（ａ）アンチパラレルに配向した 第一および第二組換え部位の間に位置するコード配列であり、且つ第一組換え部 位から該コード配列を通過して先にある第二組換え部位への方向に転写されるべ く配向するように、第一組換え部位に隣接するコード配列、および（ｂ）第一組 換え部位から該コード配列を通過して第二組換え部位への方向での転写を指示す べく配向するように、第一組換え部位に隣接し、且つ該コード配列を含む第一お よび第二組換え部位間の領域以外の領域に位置するプロモーター（ここで該コー ド配列は該プロモーターに機能的に結合している）を含む。 好ましくは、該ベクターはさらにパッセンジャー遺伝子を含んでもよい。該プ ロモーターと該組換え部位、また、該コード配列もしくは第二コード配列と該組 換え部位の間に位置するコード配列、プロモーターおよび転写終結部位がないこ とが最も好ましい。さらに、遺伝子発現およびコードされるタンパク質の生産を 最大にするために、先に記載したように、スプライス部位（すなわち、スプライ ス受容体部位およびスプライス供与体部位）およびポリアデニレーション部位を 、これらの方法に用いられるベクター中に組み込むことができる。 本発明のこのようなベクターは、リコンビナーゼによって駆動される組換えが 起こる結果としてエピソームを生成せずに、遺伝子発現を調節する手段を提供す る。先に記載され、添付の図面に示されたさらなるベクターもまた、本発明によ り提供される。他の一般的に考慮すべき事柄 本発明の方法において、細胞に対する本発明の種々の面の提供の点から見ると 、ベクターは宿主細胞、好ましくは真核の宿主細胞に導入される。真核宿主細胞 はインビトロおよびインビボで存在できる。本発明によれば、本発明のベクター を細胞に「接触させること」は、それによってベクターが細胞内に導入されるい かなる手段によってもよい。好ましくは、ウイルスの細胞に侵入する自然の能力 （例えば、アデノウイルスがレセプターを介したエンドサイトーシスにより細胞 に侵入する能力）を用いて、ウイルスベクターが感染により導入されるだろう。 しかしながら、ウイルスおよびプラスミドベクターは、他のいかなる適当な手段 、例えば、トランスフェクション、リン酸カルシウムを介した形質転換、マイク ロインジェクション、エレクトロポーレーション、浸透圧ショック等によっても 導入することができる。同様に、本発明の好ましい態様においては、インビボで のベクターの導入が企図される。したがって、本発明の方法はまた、ここに説明 する方法またはいずれかの標準の方法によるインビボでのベクターの導入を企図 する。 また、本発明の方法によれば、「細胞に部位特異的リコンビナーゼを供給する 」ことは、ベクターにコードされたリコンビナーゼを供給すること、またはタン パク質の形態でリコンビナーゼを供給することを包含する。タンパク質の導入は 細胞へのタンパク質の導入に適当ないかなる手段、例えば、インビトロの送達に ついてはマイクロインジェクションおよびアデノウイルスを介した取り込み、お よびインビボの送達については注射や点滴またはここに記載されるようなさらな る手段、並びに当業者に公知の標準的導入手段によっても達成することができる 。 インビボで行う場合、いかなる器官または組織または構成細胞もベクターまた はタンパク質の送達の標的とすることができる。好ましくは、用いられる器官／ 組織／細胞は、循環器系（すなわち、心臓、血管または血液）、呼吸器系（すな わち、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支、細気管支、肺）、消化器系（すなわち、 口、咽頭、食道、胃、腸、唾液腺、膵臓、肝臓、胆嚢）、泌尿器系（すなわち、 腎臓、尿管、膀胱、尿道）、神経系（すなわち、脳および脊椎、および眼のよう な特殊な感覚器官）および皮膚系（すなわち、皮膚）のものである。いっそう好 ましくは、ターゲッティングされる細胞は、心臓、血管、肺、肝臓、胆嚢、膀胱 、および眼細胞からなる群より選択される。 これらの態様に関し、１つ以上のベクターがここに記載される方法において使 用される場合、またはＣｒｅやＦｒｔのようなリコンビナーゼがタンパク質の形 態で外部から投与される場合、細胞と本発明の種々の成分との接触は、いかなる 順序で起こっても、あるいは同時に起こってもよい。好ましくは接触は同時に起 こるだろう。好ましい態様において、本発明の成分ベクターを、細胞への接触の 前に一緒に混合し、予備保温することができる。多数のベクターを投与すべき場 合、好ましくは、細胞に別のベクターを接触させる前後６週間内に、第一のベク ターを細胞に接触させる。いっそう好ましくは、細胞に別のベクターを接触させ る前後２週間内に、第一のベクターを細胞に接触させる。ベクターをＣｒｅまた はＦｒｔのようなリコンビナーゼと組み合わせて投与すべき場合、好ましくは、 ベクターを細胞に接触させる前後１２時間内に、該タンパク質を細胞に接触させ る。いっそう好ましくは、ベクターを細胞に接触させる前後１２時間内に、該タ ンパク質を細胞に接触させる。 本発明の組成物（すなわち、本発明のベクターおよび／またはリコンビナーゼ を含有する組成物）は、適当な医薬上許容される担体または希釈剤とともに医薬 組成物に製造することができ、適切には、各々の投与経路について通常の方法で 、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤およ びエアロゾルのような固形、半固形、液状、ガス状の形態に製剤化することがで きる。該組成物が、標的の器官、組織または細胞に到達するまでに放出され、吸 収されるのを防ぐために、すなわち、該組成物の定時の放出を確実にするために 、当該分野で知られている手段を利用することができる。本発明の組成物の効力 が失われない医薬上許容される形態を用いるべきである。医薬の剤形において、 該組成物は、他の医薬上有効な化合物と組み合わせる他、単独でまたは他の医薬 上有効な化合物と適当に結合させて用いることができる。 したがって、本発明の医薬組成物は、種々の経路によって動物体内の種々の部 位に送達され特定の効果を達成することができる。局所または全身への送達は、 体腔への製剤の外用もしくは滴下を含む投与、エアロゾルの吸入もしくは噴射、 または筋肉内、静脈内、腹膜、皮下、内皮および局所投与を含む非経口投与によ り達成することができる。 本発明の組成物は、単位投与量形態で提供することができる。ここで、各投与 量単位、例えば、茶匙一杯量、錠剤、液剤または坐剤は、予め決められた量の該 組成物を単独で、または他の有効な薬剤と適当に組み合わせて含む。ここで使用 する「単位投与量形態」という語は、ヒトおよび動物の対象にとって単位投与量 としてふさわしい、物理的には別個の単位であり、各単位は、所望の効果を生じ るのに十分な量と計算される、予め決められた量の本発明の組成物を、単独また は他の有効な薬剤と組み合わせて、適切には、医薬上許容される希釈剤、担体、 またはビヒクルを結合して含む。本発明の新規な単位投与量の詳細は、達成すべ き効果および特定の宿主における該医薬組成物に付随する薬動力学に依存する。 したがって、本発明はまた、本発明の組成物を、前記のいずれかの投与経路ま たは当業者に知られ且つ特定の適用にとって適当な代替の経路を用いて投与する ことを含む、宿主内での安定な遺伝子発現を得るか、あるいは宿主内での遺伝子 発現を調節する方法を提供する。該組成物の「有効量」は、宿主内で所望の効果 を生じる程度であり、それは当業者に公知のいくつかの終点を用いてモニターす ることができる。例えば、１つの所望の効果は宿主細胞への核酸の効果的な導入 であろう。このような導入は、治療効果（例えば、治療されるべき疾患または症 候群に付随するある症状の緩和）に基づいて、あるいはさらに、導入された遺伝 子もしくはコード配列または宿主内でのその発現を実証することによって（例え ば、宿主細胞内の核酸を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応、ノーザンまたは サザンハイブリダイゼーション、または転写アッセイを用いて、あるいは導入さ れた核酸によってコードされる、またはこのような導入によりレベルや機能に強 い影響を受けた、タンパク質もしくはポリペプチドを検出するためのイムノブロ ットアッセイ、抗体を介した検出、または特殊化されたアッセイを用いて）モニ ターすることができるだろう。後記実施例に記載される１つの特殊化されたアッ セイとしては、β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現アッセイが挙げられる。 記載された方法が決してすべてではなく、特定の適用に合ったさらなる方法は 、当業者には明白であろう。さらに、該組成物の有効量は、先に記載したように 、組換え反応の適当なアッセイを通してさらに概算することができる。 一般に、本発明のベクターの効果的な導入を確実にするには、所定の投与経路 を考慮した上で接触させるおおよその細胞数に基づけば、接触させる細胞あたり 約１〜約５，０００コピーのベクターを用いることが好ましく、各細胞に約１〜 約３００ｐｆｕ入ることがいっそう好ましい。しかしながら、これは単なる一般 的な目安に過ぎず、特定の適用において許可されるように、インビトロまたはイ ンビボのいずれでも、より高いまたはより低い量の成分の使用を決して妨げるも のではない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、該組成物が他の医薬組 成物と組み合わせて投与されるかどうかによって、あるいは薬物動態、薬物性向 および代謝における個体間差によって変動し得る。同様に、インビトロでの適用 においては、利用される細胞種やベクターを導入する手段によって、量は変動し 得る。当業者は、必要に応じて、特別な状況のいかなる必要な調整も容易に行う ことができる。実施例 以下の実施例に本発明をより詳細に説明するが、当然のことながら、その範囲 を何ら限定して解釈されるべきものではない。 実施例１ 図１Ａ〜１Ｃに述べるように、本実施例は、細胞内での部位特異的組換えのた めの、且つエピソームを作製するために使用され得る方法ならびにベクターにつ いて記載するものである。特に、本実施例は、組換え事象による、エピソームの 送達や遺伝子転写の上向き制御の方法を説明するものである。 株やプラスミドの作製、ゲル電気泳動、プラスミドの単離を含むＤＮＡ操作、 ＤＮＡクローニングやシークエンシング、サザンブロットアッセイ等の当業者に 公知の標準的な分子および、遺伝子的技術は、標準的な実験手引き書に詳細に記 載されているようにして行った（例えば、Maniatisら，Molecular Cloning:A La boratory Manual ，第２版(Cold Spring Harbor，NY，1992)；Ausubelら，Curren t Protocols in Molecular Biology ，(1987)）。分子操作に用いられる制限酵素 や他の酵素は市販元から入手し（例えば、Boehringer Mannheim，Inc.,インディ アナポリス，インディアナ;New England Biolabs，ベバリー，マサチューセッツ ；Bethesda Research Laboratories，ベセスダ，メリーランド等）、製造者の推 奨に従って用いた。形質転換されたヒト胎児腎細胞株２９３の細胞（American Type Culture Collection ＣＲＬ １５７３）は、以前に記載したように、 標準的な無菌の培養用試薬、培地および技術を用いて培養し、維持した（Erzeru mら，Nucleic Acids Research，21，1607-1612(1993)）。トランスフェクトされ た細胞の選択には適宜ピューロマイシンを用いた。 図１Ａ〜１Ｃに述べるように、本発明の方法を試験し、確認するために幾つか のプラスミドを作製した。これらのプラスミドは、ＦＣＳとしてＥＢＮＡ−１コ ード配列を含むｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ（図６に図示）を含む 。プラスミドｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕは図７に描写 され、ＦＣＳとしてβ−グルクロニダーゼコード配列を含む。ｐＥＯＢｓｐＬｘ −Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘおよびｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇ ｌｕの両方のプラスミドともにＬｏｘ部位（同方向に）を組換え部位として含み 、そしてＣＭＶプロモーターを遺伝子発現の上向き制御の為のプロモーターとし て含んでいる。ほとんどの組織培養細胞において比較的高レベルの構成的遺伝子 発現を生じさせることが可能である（Boshartら，Cell，41，521-530(1985)）の でＣＭＶプロモーターを用いた。同様に、ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶ ＬｘおよびｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕの両方のプラス ミドともＲＳＶプロモーターの制御下にピューロマイシンコード配列を含んでい る。ＣＭＶプロモーターおよびのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの制御下にフ ァージＰ１Ｃｒｅコード配列を配置しているＣｒｅ−発現プラスミドｐＡｄＣＭ Ｖ Ｃｒｅが図８に描写されている。 プラスミドｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘをインビトロゲンのｐＲ ＥＰ４ベクター（インビトロゲン，サンディジエゴ，カリフォルニア）より作製 した。ｐＲＥＰ４をHPa1およびBsmIで制限化し、そしてベクター内の特異MluI部 位を修飾した後で制限部位MluI、PvuIIおよびKPnIを有するオリゴクレオチドを 導入した。ＲＳＶプロモーターの制御下にあるピューロマイシン遺伝子およびウ シ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化シグナルを有するカセットをMluI/Pvu II ＤＮＡ断片にクローン化しベクターバックボーンとした。ポリリンカーおよ びＳＶ４０ポリアデニル化配列が続くスプライスシグナルを有するＣＭＶプロモ ーターを当該ベクターバックボーンのPvuII/KpnI部位に導入した。Ｌｏｘ部位を ＣＭＶ発現カセットのイントロンに導入した。ＥＢＮＡ−１コード配列の上流の 配列を合成スプライス受容部位およびＬｏｘ部位を付加することにより修飾した 。スプライス受容部位は、ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ内でＥＢＮ Ａ−１に近位している。 プラスミドｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕは、ｐＥＯＢ ｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘからＥＢＮＡ−１のコード配列をβ−グルクロ ニダーゼコード配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルで置き換えることに よって得られる。結果として生じるＥＢＮＡ−１コード配列の欠失は開始コドン からＥＢＮＡ−1BsgI部位にまで及ぶ。 プラスミドｐＡｄＣＭＶＣｒｅは、ＣＭＶプロモーター、Ｃｒｅコード配列お よびＡｄ５配列１−３５５および３３３３−５７８８が両側にあるＳＶ４０ポリ アデニル化部位を含む発現カセットを有している。当然のことながら、組換えに 用いられる配列の精密な範囲は、特定の所望の組換え産物に応じて変わりうる（ 例えば約１から約１００ｂｐまで）。Ｅ１欠失ウイルスを作製するためにｐＡｄ ＣＭＶＣｒｅプラスミドをＡｄで組換えることができる（Rosenfeldら,(1991), 上述；Rosenfeldら,(1992),上述参照）。 ＲＳＶ／ピューロマイシンカセットによって与えられるピューロマイシン耐性 での選別によるｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕを含む細胞 を選別する能力を調べるために、ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−β ｇｌｕのＥＢＮＡ−１を発現している２９３細胞（２９３−ＥＢＮＡ；InVitrog en,サンディジエゴ，カリフォルニア）へのＣａＰＯ4を介したトランスフェクシ ョンを行った。トランスフェクションに続いて、細胞を約０．５ｍｇ／ｍｌの濃 度のピューロマイシン存在下で維持した。生き残った細胞集団は、ＲＳＶ／ピュ ーロマイシンカセット由来のピューロマイシン発現のためにピューロマイシン耐 性であった。 ２９３細胞にトランスに与えられるＣｒｅ遺伝子によって産生されるＣｒｅリ コンビナーゼが、ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕ内に存在 するＬｏｘ部位間の組換えを行って、エピソームを作製し、エピソーム内でＣＭ Ｖプロモータの制御下にβ−グルクロニダーゼコード配列を配置することができ るかどうかを決定するために、ｐＡｄＣＭＶＣｒｅを用いてあるいは用いずに、 ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕの２９３細胞へのＣａＰＯ4 を介したトランスフェクション（Grahamら，J ．Gen．Virol.，36，59-72(1977) ）を行った。４８時間後、該細胞を処理しβ−グルクロニダーゼ活性を市販のキ ットを用いて製造者の推奨に従って測定した（Tropix Inc.，ベッドフォルド， ＭＡ）。得られた結果を表２に示す。 表２に示すように、β−グルクロニダーゼのレベルはｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕ ｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕとｐＡｄＣＭＶＣｒｅとの両方を含んでいる細胞に おいて最も高い。ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕおよびｐ ＡｄＣＭＶＣｒｅが両方とも存在しない場合は（すなわち、プラスミドなしの状 態）、２９３細胞において低い基礎的なレベルの活性は観察されるものの、β− グルクロニダーゼレベルは殆ど検出されない。対照的に、ｐＡｄＣＭＶＣｒｅの 非存在下で、ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕを含有する細 胞においてはより高いレベルのβ−グルクロニダーゼが観察される。 その後、ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕ内の組換え部位 が同方向の配向ではなくアンチパラレルな配向にあることがわかった。つまり、 表面上観察されたβ−グルクロニダーゼ活性は、組換え事象によってレポーター 遺伝子の上流に配置された隠れたプロモーターの存在によるものであった。しか しながら、これらの結果は、本発明の方法がアンチパラレル組換えベクターを得 る為にも使用され得ることを確認するものである。 実施例２ 図１Ａ〜１Ｃに示すように、本実施例は、細胞内での部位特異的組換えのため のベクターであり、且つエピソームを作製するために使用され得るベクターにつ いて記載するものである。より詳しくは、本実施例は直鎖状のＡｄベクターにつ いて述べる。 本発明の方法は、当該ベクターの修飾と先の実施例に記載のアプローチを通し て、ウイルスエピソーム送達ベクター、特にＡｄエピソーム送達ベクターについ ても同様に使用され得るものである。すなわち、そのようなウイルスベクター内 での、OriＰもしくは哺乳類細胞内で機能することが可能な同様の複製起点の機 能性を、構成的にＥＢＮＡ−１を発現している細胞株（Reismanら，上述）へｐ ＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕをトランスフェクトすること により確かめることができる。ピューロマイシンに対して耐性の細胞は選択され 、増幅され得る。エピソームとしてのプラスミドの維持を確認するために、サザ ンブロット解析を行うことができる。ＥＢＮＡ−１の機能性を同様に確認するこ とができる。 Ａｄベクターを作製するために、ＥＢＮＡ−１およびβ−グルクロニダーゼを もとにしたプラスミドを両方ともシャトルベクターに移しｐＡｄＣＭＶＣｒｅと 同様に、構築した。基本的には、該シャトルベクターは、片方の側はＡｄ５由来 のレフト３５５ｂｐによって、もう一方の側はＡｄ５由来の３３３３−５７８８ 残基により取り囲まれているBclIおよびBamHI制限部位が両側にあるスタッファ ー断片を含んでいる。該スタッファー断片を、プラスミドｐＡｄＥＲ−Ｐｕｒｏ を生成するｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ由来の両Ｌｏｘ部位を保有 するBglII-BamHI制限断片で置き換えた。同様にして、該スタッファー断片を、 ｐＥＯＢｓｐＬｘ−Ｐｕｒｏ−ＣＭＶＬｘ−βｇｌｕ由来の両Ｌｏｘ部位を保有 するBglII−BamHI制限断片で置き換えることができる。そして、これらのプラス ミドの内の一方を、以前に記載されたような相同的組換えによってＡｄ５に基づ くベクターを作製するために使用することができる（例えば、Rosenfeldら，(19 91)，上述；Rosenfeldら，(1992)，上述）。 実施例３ 本実施例は、細胞内での部位特異的組換えを行うために使用され得るさらなる ベクターを記載するものである。特に、本実施例はＣｒｅリコンビナーゼを供給 するために使用され得るベクターの典型的な実施例を記載すものである。 ベクター、特に図１Ａ〜１Ｃに描写されているベクターの構築を容易にするた めに、Ｃｒｅ遺伝子を別のＡｄにサブクローニングした。ＡＴＣＣから得られた Ｐ１をＣｒｅリコンビナーゼコード配列の源として用い、該遺伝子のより得やす い源を供給するために、ＰＣＲを用いてｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔTM(Stratagene,ラ ホラ，ＣＡ)にクローニングした。Ｃｒｅ遺伝子をシャトルベクターに移入 し、ＣＭＶプロモーターの制御下に置き、ついでＳＶ４０ポリアデニル化シグナ ルを置いて、図９に描写されるようなベクターｐＡｄＣＭＶＣｒｅＲＳＶＯｒｆ ６を作製した。Ｃｒｅ遺伝子がアデノウイルスゲノムのＥ１領域と置きかわって いるＡｄベクターＡｄＣＭＶＣｒｅ６を作製する為に（以前に記載の方法で）シ ャトルベクターを用いた。 ＡｄＣＭＶＣｒｅ６の産生はＰＣＲによって、また実施例１に記載の機能的ア ッセイにより確認された。すなわち、ＡｄＣＭＶＣｒｅ６−指向性組換えのサザ ンブロット解析は、２９３をもとにした細胞株８３５およびヒト肺癌腫細胞株Ａ ５４９の双方において被検プラスミドを用いて確認された。同様にして、本実施 例および先の実施例の種々の構築物で使用したプロモーター、スプライス供与、 およびスプライス受容部位の機能を確認した。特に、プラスミドｐＥＯＢｇｌｕ ｇｌを作製するために、β−グルクロニダーゼを図１Ａの第１コード配列の位置 に配置した。ｐＥＯＢｇｌｕｇｌのＣｒｅ発現プラスミドとのコトランスフェク ションは結果として３−ｌｏｇ以上のβ−グルクロニダーゼの誘導をもたらした 。 これらの結果はこのベクターにおけるＣｒｅリコンビナーゼの機能性を確認す るものであり、且つさらに、そのあとのベクター構築に使用されるベースベクタ ー要素の機能性を確認するものである。 実施例４ 本実施例は、細胞内での部位特異的組換えをもたらすために用いられるさらな るベクターを記載するものである。特に、本実施例はポリオーマ複製起点を含み 、例えばランナウエイ複製を得るために使用され得るベクターを記載するもので ある。 先の実施例で記載されているような標準的なクローニング技術を用いてポリオ ーマウイルス起点を含むベクターを構築した。ＥＢＶおよびポリオーマウイルス システムの、種々のベクターに含まれ、且つ複製に要求される構成要素（特に複 製起点）の機能性をDpnIアッセイを用いて確認した。このアッセイの基本は、 E．coli内で産生されたプラスミドがメチル化され、DpnIによる制限に対して感 受性であることである。対照的に、もしプラスミドが哺乳類細胞で複製すれば、 それはヘミメチル化されるか、または全くメチル化されず、DpnI制限に対して耐 性にする。 ＥＢＶ構成要素の機能性を確かめるために、同質遺伝子の構築物ｐＫＳＥＢＮ ＡＯｒｉＰ（ＮＲ）（図１０に描写）およびｐＫＳＥＢＮＡ（ＮＳ）（図１１に 描写）を調べた。これらのプラスミドは、遺伝子の５’に直接位置するOriＰの 存在下（即ちプラスミドｐＫＳＥＢＮＡＯｒｉＰ（ＮＲ））あるいは非存在下（ 即ちプラスミドｐＫＳＥＢＮＡ（ＮＳ））で、それ自体のウイルスプロモーター の制御下にＥＢＮＡ−１を含んでいる。ｐＫＳＥＢＮＡＯｒｉ（ＮＲ）内の0ri Ｐ起点はNcoIからEco RV（すなわちＥＢＶ位置８０３３−８９９５）を欠失し、 結果として９６２ｂＰの欠失が生じる。該プラスミドを２９３由来の細胞にトラ ンスフェクトし、５日後に収穫した。該細胞のペレットをＨｉｒｔの抽出に付し （Hirt，J ．Mol．Biol．26，365-369(1967)）、DpnIアッセイを行った。OriＰを 含むプラスミドのみが複製することがわかった。 同様にして、プラスミドｐＡｄＣＬｘＰｙＴａｇＯｒｉ（図１２に描写）をＮ ＩＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。このプラスミドはポリオーマウイルス ラージＴ抗原コード配列をＣＭＶプロモーターの制御下に有し、且つＴ抗原コー ド配列に隣り合っているポリアデニル化シグナル配列の３’のすぐ横にポリオー マウイルス起点を含んでいる。Ｔ抗原を除いてはこれらの要素を有する同様のプ ラスミドが、Ｔ抗原を細胞に与えた場合に複製することがわかった。つまりこれ らの結果はｐＫＳＥＢＮＡＯｒｉＰ（ＮＲ）内に存在するＥＢＶ構成要素と同様 に、当該ベクター内に存在するポリオーマウイルス構成要素が、当該要素が存在 するプラスミドに対し自律的複製の付与を可能にすることを確認している。 該ポリオーマウイルス構成要素の機能の確認後、ｐＡｄＣＬｘＰｙＴａｇＯｒ ｉに存在するカセットをＡｄＥ１欠失シャトルベクターｐＡＤＥＰｒＲＬｒ（図 １３に描写）に移した。このプラスミドは、Ｔ抗原コード配列を含む第１コード 配列（ＦＣＳ）およびポリオーマウイルス複製起点であるオペレーターをもち、 本質的には図１Ａに描写されているものである。当該プラスミドのプロモーター （Ｐ）はＲＳＶプロモーターであり、且つ第２コード配列（ＳＣＳ）はルシフェ ラーゼレポーター遺伝子を含む。ルシフェラーゼ転写単位の活性を確かめた。さ らに、当該プラスミドのＣｒｅ発現カセットとのトランスフェクションは結果と して該シャトルベクターの部位特異的組み換えを生じた。すなわち、これらの結 果はベクターの種々の構成要素の機能性を確認するものである。 該結果は、本発明によれば、細胞内での部位特異的組換えを行うために使うた めに、他のベクターを構築し、使用することができるということを確認するもの である。特に、該結果はポリオーマウイルス複製起点を含むベクターが構築され 、例えばランナウェイ複製に使用され得ることを確認するものである。 実施例５ 本実施例は、細胞内での部位特異的組換えを行うのに用いるさらなるベクター を記載するものである。特に、本実施例は、ウシパピローマウイルス複製起点を 含み、且つ多様な宿主内で多数のコピー数を得るために使用され得るベクターを 記載するものである。 さきの実施例に記載したのと同様の技術が、ウシパピローマウイルス複製起点 を含むベクターの構築に用いられた。特に、図１４に描写される、ベクターｐＣ ＧＥ１Ｅ２ｏｒｉを構築した。このベクターは、ＣＭＶプロモーターの制御下に ウシパピローマウイルスＥ１およびＥ２遺伝子とともにディシストロニックな発 現カセットを有する。発現カセットの３’のすぐ横に、ベクターがウシパピロー マウイルスゲノムのヌクレオチド７３５１−５７にわたるウシパピローマウイル ス複製起点を含む。ウシパピローマウイルス起点を保有する別の構築物が、Ｅ１ およびＥ２の存在下で安定に維持されることが前に報告された。このことはｐＣ ＧＥ１Ｅ２ｏｒｉベクターの複製能力を支持するものである。 ここで述べられた特許、特許出願、および刊行物を含めた全ての引例は、引用 によりそっくりそのままここに組み込まれるものである。 本発明は好適な具体例を強調して記載したものであるが、好適な具体例の変更 がなされ、且つ使用され得ること、および本発明がここで詳細に記載された以外 の方法で実行され得ることは当業者には明白であろう。本発明はそのような変更 や代替の実施の包含を意図するものである。従って、本発明は添付の請求の範囲 によって定義される該発明の精神および範囲内に包含される全ての変更を含むも のである。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成９年１１月１４日（１９９７．１１．１４） 【補正内容】 請求の範囲 １．（ｉ）同方向の配向にある第１組換え部位および第２組換え部位、および （ii）１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲ を含むベクター。 ２．（ｉ）同方向の配向にある第１組換え部位および第２組換え部位、 （ii）該第１および第２組換え部位の間に位置する複製起点および／または１以 上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲ、 （iii）１以上のプロモーター、および （iv）１以上のコード配列 を含むベクターであって、 該１以上のプロモーターの各々および該１以上のコード配列の各々は、該第１お よび第２の組換え部位の片方若しくは両方が１以上のプロモーターおよび／また は１以上のコード配列に隣接するように、当該第１または第２組換え部位に隣接 し、そして組換えが起こると、１以上のコード配列の上向き制御および／または １以上のコード配列の下向き制御がもたらされる。 ３．（ｉ）（ａ）（もし当該ベクターが起点を含むものであれば該起点を含む） 該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、（ｂ）該第２組換え部位に 隣接し、且つ（ｃ）該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組換 え部位への方向で転写を指示すべく配向するプロモーター、および （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し 、該第１組換え部位に隣接し、該第１組換え部位から該プロモーターを通過して 該第２組換え部位への方向で転写されるべく配向し、且つ該プロモーターに機能 的に連結されていないコード配列 をさらに含むものである請求の範囲１記載のベクター、または含むものである請 求の範囲２記載のベクター。 ４．（ｉ）（ａ）（もし当該ベクターが起点を含むものであれば当該起点を含む ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、（ｂ）該第２組換え部位 に隣接し、且つ（ｃ）該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組 換え部位への方向で転写を指示すべく配向するプロモーター、および （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域 内に位置し、該第２組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に連結さ れているコード配列 をさらに含むものである請求の範囲１記載のベクター、または含むものである請 求の範囲２記載のベクター。 ５．（ｉ）（ａ）（もし当該ベクターが起点を含むものであれば当該起点を含む ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、（ｂ）該第１組換え部位 に隣接し、且つ（ｃ）該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組 換え部位への方向で転写を指示すべく配向するプロモーター、および （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域 内に位置し、該第２組換え部位に隣接し、該第１組換え部位から該プロモーター を通過して該第２組換え部位への方向で転写されるべく配向し、且つ該プロモー ターに機能的に連結されていないコード配列 をさらに含むものである請求の範囲１記載のベクター、または含むものである請 求の範囲２記載のベクター。 ６．（ｉ）（ａ）（もし当該ベクターが起点を含むものであれば当該起点を含む ）該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置し、（ｂ）該第１ 組換え部位に隣接し、且つ（ｃ）該第１組換え部位から該プロモーターを通過し て該第２組換え部位への方向で転写を指示すべく配向するプロモーター、および （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し 、該第１組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に連結されているコ ード配列 をさらに含むものである請求の範囲１記載のベクター、または含むものである請 求の範囲２記載のベクター。 ７．同方向に配向する第１組換え部位および第２組換え部位の間に（ｉ）第１コ ード配列（該第１組換え部位から該第１コード配列を通過して該第２組換え部位 への方向で転写されるべく該第１コード配列が配向するように該第１組換え部位 に隣接し、且つプロモーターに機能的に連結されていない）および（ii）プロモ ーター（該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組換え部位への 方向で転写を指示すべく該プロモーターが配向するように該第２組換え部位に隣 接している）が位置しているベクター。 ８．該ベクターがさらに、該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部位 の間の領域以外の領域に位置し、且つ該プロモーターに機能的に連結されている ように該第２組換え部位に隣接している第２コード配列を含むものである請求の 範囲７記載のベクター。 ９．該ベクターがさらに （ｉ）該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に存在 するように、該第１組換え部位と該第１コード配列との間に位置している該スプ ライス受容部位、および （ii）該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に存在 するように、該プロモーターと該第２組換え部位との間に位置している該スプラ イス供与部位、および （iii）該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の 領 域内に存在するように、該第２組換え部位と第２コード配列との間に位置してい るスプライス受容部位、 を含むものである請求の範囲８記載のベクター。 １０．該ベクターがさらに （ｉ）第２コード配列（該第１コード配列と該プロモーターとを含む該第１およ び第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置し、該第１組換え部位から該第 １コード配列を通過して該第２組換え部位への方向で転写されるべく該第２コー ド配列が配向するように該第１組換え部位に隣接し、且つプロモーターに機能的 に連結されていない）、および （ii）第２プロモーター（該第１コード配列と該プロモーターとを含む該第１お よび第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置し、且つ該第１組換え部位か ら該第１コード配列を通過して該第２組換え部位への方向とは反対の方向で転写 を指示すべく該第２プロモーターが配向するように該第２組換え部位に隣接して いる）を含むものである請求の範囲７記載のベクター。 １１．（ｉ）その間に、該第１組換え部位に隣接し、且つ該第１組換え部位から 第１コード配列を通過して該第２組換え部位への方向で転写されるべく配向して いる該第１コード配列が位置している、同方向の配向にある第１組換え部位およ び第２組換え部位、 （ii）該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領 域内に位置し、且つ該第１コード配列に機能的に連結されるように該第１組換え 部位に隣接しているプロモーター、および （iii）該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の 領域内に位置し、該第１組換え部位から該第１コード配列を通過して該第２組換 え部位への方向で転写されるべく配向するように該第２組換え部位に隣接してい る第２コード配列 を含むベクター。 １２．アンチパラレルな配向に第１組換え部位および第２組換え部位を含み、且 つ１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むベクター。 １３．さらに１以上のプロモーターおよび１以上のコード配列を含む請求の範囲 １２記載のベクターであって、 該１以上のプロモーターの各々および該１以上のコード配列の各々は、該第１お よび第２の組換え部位の片方若しくは両方が１以上のプロモーターおよび／また は１以上のコード配列に隣接するように、当該第１または第２の組換え部位に隣 接し、組換えが起こると時には、１以上のコード配列の上向き制御および／また は１以上のコード配列の下向き制御がもたらされる。 １４．該ベクターが、 （ｉ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、該第２組換え部位に 隣接し、且つ第１組換え部位からプロモーターを通過して該第２組換え部位への 方向で転写を指示すべく方向付けられているプロモーター、 （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域 内に位置し、該第１組換え部位に隣接し、該第１組換え部位から該プロモーター を通過して該第２組換え部位への方向で転写されるべく配向し、且つプロモータ ーに機能的に連結されていないコード配列“ａ”、または該プロモーターを含む 該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置し、該第２組換え部 位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に連結されているコード配列“ｂ”の どちらか一方 を含むものである請求の範囲１３記載のベクター。 １５．該ベクターが、 （ｉ）該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置し、該第１組 換え部位に隣接し、且つプロモーターから該第１組換え部位を通過して該第２組 換え部位への方向で転写を指示すべく配向している該プロモーター、 （ii）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、該第１組換え部位に 隣接し、且つ該プロモーターに機能的に連結されているコード配列“ａ”、また は該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、該第２組換え部位に隣接 し、該第１組換え部位からコード配列“ｂ”を通過して該第２組換え部位への方 向とは反対の方向で転写されるべく配向し、且つ該プロモーターも機能的に連結 されていないコード配列“ｂ”のどちらか一方 を含むものである請求の範囲１３記載のベクター。 １６．（ｉ）その間に、該第２組換え部位に隣接し、且つ該第１組換え部位から 該プロモーターを通過して該第２組換え部位への方向で転写を指示すべく配向し ているプロモーターが位置している、アンチパラレルな配向にある第１組換え部 位および第２組換え部位、 （ii）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置 し、該第１組換え部位に隣接し、且つプロモーターに機能的に連結されていない 第１コード配列、および （iii）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位 置し、該第２組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに機能的に連結されてい る第２コード配列 を含むベクター。 １７．（ｉ）その間に、該第２組換え部位に隣接し、且つ該第１組換え部位から 第１コード配列を通過して該第２組換え部位への方向とは反対の方向で転写され るべく配向している該第１コード配列が位置している、アンチパラレルな配向に ある第１組換え部位および第２組換え部位、および該第１組換え部位に隣接し、 且つ該第１組換え部位から第２コード配列を通過して該第２組換え部位への方向 で転写されるべく配向している該第２コード配列、および （ii）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置 し、該第１組換え部位に隣接し、且つ該第２コード配列に機能的に連結されてい るプロモーター を含むベクター。 １８．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲７〜１１、１６、および１７のいずれかに記載のベクター。 １９．該ベクターがさらに、該第１コード配列を含む該第１および第２組換え部 位の間の領域内に位置する複製起点を含むものである請求の範囲７〜１１記載の ベクター。 ２０．該ベクターがさらに、パッセンジャー遺伝子を含むものである請求の範囲 １〜１９記載のベクター。 ２１．該コード配列、第１コード配列、第２コード配列またはパッセンジャー遺 伝子が外因性ホルモンには結合し得るが、天然のホルモンには結合できないホル モンレセプターのリガンド結合ドメインをコードする配列を含むものである請求 の範囲２〜１１および１３〜２０のいずれかに記載のベクター。 ２２．該コード配列、第１コード配列、第２コード配列またはパッセンジャー遺 伝子が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコードする配列を含むものである 請求の範囲２〜１１および１３〜２１のいずれかに記載のベクター。 ２３．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、 （ｉ）同方向の配向にある第１組換え部位および第２組換え部位、および （ii）該第１および第２組換え部位の間に位置する啼乳類細胞で機能的な複製起 点、および／または１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲ を含むベクターに接触させること（ここで、該ベクターは該細胞によって内部に 取り込まれる）および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 ２４．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲２記載のベクターが内部に取り込まれるように 、該細胞を該ベクターに接触させること（そして、もし当該ベクターが複製起点 を有するものであれば、該起点は啼乳類細胞で機能的である）、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 ２５．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲３または５記載のベクターが内部に取り込まれ るように、該細胞を該ベクターに接触させること（そして、もし当該ベクターが 複製起点を有するものであれば、該起点は哺乳類細胞で機能的である）、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含み、組換えが起こると、該コード配列が該プロモーターに機能的に連結され る方法。 ２６．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲４または６記載のベクターが内部に取り込まれ るように、該細胞を該ベクターに接触させること（そして、もし当該ベクターが 複製起点を有するものであれば、該起点は哺乳類細胞で機能的である）、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含み、組換えが起こると、該コード配列が該プロモーターに機能的に連結され ない方法。 ２７．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を請求の範囲７記載のベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含み、組換えが起こると、該第１コード配列が該プロモーターに機能的に連結 される方法。 ２８．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を請求の範囲８記載のベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含み、組換えが起こると、該第２コード配列が該プロモーターに機能的に連結 されない方法。 ２９．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を請求の範囲９記載のベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 ３０．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を請求の範囲１０記載のベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること（組換えが起こると、該第１コー ド配列が該第１プロモーターに機能的に連結され、且つ該第２コード配列は該第 ２プロモーターに機能的に連結される） を含む方法。 ３１．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を請求の範囲１１記載のベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること（組換えが起こると、該第１コー ド配列が該プロモーターに機能的に連結されず、且つ該第２コード配列が該プロ モーターに機能的に連結される） を含む方法。 ３２．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲１２または１３記載のベクターが内部に取り込 まれるように、該細胞を該ベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 ３３．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲１４記載のベクターが内部に取り込まれるよう に、該細胞を該ベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること（組換えが起こると、該コード配 列“ａ”が該プロモータに機能的に連結されるか、またはコード配列“ｂ”が該 プロモーターに機能的に連結されないかのどちらかである） を含む方法。 ３４．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲１５記載のベクターが内部に取り込まれるよう に、該細胞を該ベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること（組換えが起こると、該コード配 列“ａ”が該プロモータに機能的に連結されないか、またはコード配列“ｂ”が 該プロモーターに機能的に連結されるかのどちらかである） を含む方法。 ３５．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲１６または１７記載のベクターが内部に取り込 まれるように、該細胞を該ベクターに接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること（組換えが起こると、該プロモー ターに機能的に連結されていたコード配列が該プロモータに機能的に連結されず 、且つ該プロモーターに機能的に連結されていなかったコード配列が該プロモー タに機能的に連結される） を含む方法。 ３６．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞によって請求の範囲１８〜２２記載のいずれかのベクターが内部に 取り込まれるように、該細胞を該ベクターに接触させること（そして、もし当該 ベクターが複製起点を有するものであれば、該起点は哺乳類細胞で機能的である ）、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、哺乳類細胞で機能的な複製起点を同方向に位置する第１および 第２組換え部位の間に含むベクターに、該ベクターが該細胞によって内部に取り 込まれるように接触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 ２．該ベクターがさらにコード配列を含むものである請求の範囲１記載の方法。 ３．（ａ）コード配列が、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 内に位置し、且つ該第１組換え部位から該コード配列を通過して該第２組換え部 位への方向で転写されるべく該コード配列が配向するように該第１組換え部位に 隣接し、 （ｂ）該コード配列はいかなるプロモーターとも機能的に連結されておらず、 （ｃ）プロモーターが、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内 に位置し、且つ該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組換え部 位への方向で転写を指示すべく該プロモーターが配向するように該第２組換え部 位に隣接している請求の範囲２記載の方法。 ４．（ａ）プロモーターが、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領 域内に位置し、且つ該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組換 え部位への方向で転写を指示すべく該プロモーターが配向するように該第２組換 え部位に隣接し、 （ｂ）該コード配列が、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以 外の領域に位置し、且つ該コード配列が該プロモーターに機能的に連結されるよ うに該第２組換え部位に隣接している請求の範囲２記載の方法。 ５．該ベクターがさらに、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 以外の領域内に位置し、且つ該第２組換え部位に隣接し、且つ該プロモーターに 機能的に連結されている第２コード配列を含むものである請求の範囲３記載の方 法。 ６．該ベクターがさらに、 （ａ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内の、該第１組換え 部位と該コード配列との間に位置しているスプライス受容部位、 （ｂ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内の、該プロモータ ーと該第２組換え部位との間に位置しているスプライス供与部位、および （ｃ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域を含む領域以外の領 域内にある、該第２組換え部位と該第２コード配列との間に位置しているスプラ イス受容部位 を含むものである請求の範囲５記載の方法。 ７．該ベクターがさらに、 （ａ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置 するプロモーターであって、該プロモーターから該第１組換え部位を通過して該 第２組換え部位への方向で転写を指示すべく配向するように該第１組換え部位に 隣接しているプロモーター、および （ｂ）該起点を含む該第１および該第２組換え部位の間の領域以外の領域に位置 し、且つ該第２組換え部位に隣接しているコード配列 を含むものである請求の範囲１記載の方法。 ８．該ベクターがさらに、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 内に位置し、且つ該第１組換え部位から第２コード配列を通過して該第２組換え 部位への方向で転写されるべく該第２コード配列が配向するように該第１組換え 部位に隣接している第２コード配列を含むものである請求の範囲７記載の方法。 ９．該ベクターがさらに、 （ａ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、且つ該 第１組換え部位から第２コード配列を通過して該第２組換え部位への方向とは反 対の方向に転写されるべく配向するように該第２組換え部位に隣接しており、且 ついかなるプロモーターとも機能的に連結されていない第２コード配列）、およ び （ｂ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置する第２プ ロモーターであって、且つ該第１組換え部位から第２プロモーターを通過して該 第２組換え部位への方向とは反対の方向に転写を指示すべく配向するように、該 第１組換え部位に隣接している第２プロモーター を含むものである請求の範囲７記載の方法。 １０．該ベクターがさらに、第３コード配列を含み、該第３コード配列は、 （ａ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置 し、且つ該プロモーターと該第１組換え部位の間に存在し、 （ｂ）該第１組換え部位から該第２プロモーターを通過して該第２組換え部位へ の方向とは反対の方向に転写されるべく配向するように該第１組換え部位に隣接 し、且つ、 （ｃ）該第２プロモーターに機能的に連結されている 請求の範囲９記載の方法。 １１．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、 （ｉ）アンチパラレルな配向にある第１および第２組換え部位の間に位置し、 且つ該第１組換え部位からプロモーターを通過して該第２組換え部位への方向 で転写を指示すべく配向する該第２組換え部位に隣接しているプロモーター、 および （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領 域内に位置し、且つ該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組 換え部位への方向とは反対の方向で転写されるべく配向するように該第１組換 え部位に隣接しており、いかなるプロモーターとも機能的に連結されていない コード配列 を含むベクターに、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれるように、接 触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 １２．該ベクターがさらに、該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位 の間の領域以外の領域内に位置し、且つ該第２組換え部位に隣接しており、且つ 該プロモーターに機能的に連結されている第２コード配列を含むものである請求 の範囲１１記載の方法。 １３．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、 （ｉ）アンチパラレルな配向にある第１および第２組換え部位の間に位置し、 且つ該第１組換え部位からプロモーターを通過して該第２組換え部位への方向で 転写を指示すべく配向するように該第２組換え部位に隣接しているプロモーター 、および （ii）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領 域内に位置し、且つ該プロモーターに機能的に連結されるように該第２組換え 部位に隣接しているコード配列 を含むベクターに、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれるように、接 触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 １４．該ベクターがさらに、 （ａ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域を含む領域 以外の領域内の、該第１組換え部位と該コード配列との間に位置しているスプラ イス受容部位、 （ｂ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域内の、該プ ロモーターと該第２組換え部位との間に位置しているスプライス供与部位、およ び （ｃ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域を含む領域 以外の領域内の、該第２組換え部位と該第２コード配列との間に位置しているス プライス受容部位、 を含むものである請求の範囲１３記載の方法。 １５．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、 （ｉ）アンチパラレルな配向にある第１および第２組換え部位の間に位置し、 且つ該第１組換え部位からコード配列を通過して該第２組換え部位への方向と は反対方向で転写されるべく配向するように該第２組換え部位に隣接しており 、且ついかなるプロモーターとも機能的に連結されていないコード配列、およ び （ii）該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域 内に位置し、且つ該第１組換え部位から該コード配列を通過して該第２組換え 部位への方向で転写を指示すべく配向するように該第１組換え部位に隣接して いるプロモーター を含むベクターに、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれるように、接 触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 １６．該ベクターがさらに、該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の 間の領域内に位置し、且つ該第１組換え部位に隣接しており、該プロモーターに 機能的に連結されている第２コード配列を含むものである請求の範囲１５記載の 方法。 １７．細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、 （ｉ）アンチパラレルな配向にある第１および第２組換え部位の間に位置し、 且つ該第１組換え部位からコード配列を通過して該第２組換え部位への方向で 転写されるべく配向するように該第１組換え部位に隣接している該コード配列 、および （ii）該第１組換え部位から該コード配列を通過して該第２組換え部位への方 向で転写を指示すべく配向するように、該第１組換え部位に隣接し、且つ該コ ード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置し ており該コード配列が機能的に連結されているプロモーター を含むベクターに、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれるように、接 触させること、および （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 １８．Ｒｅｐタンパク質を細胞に付与するための方法であって、 （ａ）該細胞を、同方向に位置する第１および第２組換え部位の間に位置するＲ ｅｐコード配列を含むベクターに、該ベクターが該細胞に内部に取り込まれるよ うに、接触させ、そして （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 １９．（ａ）該ベクターがさらに、該第１組換え部位からコード配列を通過して 該第２組換え部位への方向で転写されるべく配向するように該第１組換え部位に 隣接しているコード配列を含み、 （ｂ）該コード配列はいかなるプロモーターとも機能的に連結されておらず、 （ｃ）プロモーターが、該コード配列を含む該第１および該第２組換え部位の間 の領域内に位置し、且つ該第１組換え部位から該コード配列を通過して該第２組 換え部位への方向で転写を指示すべく配向するように該第２組換え部位に隣接し ている 請求の範囲１８記載の方法。 ２０．真核細胞内での部位特異的組換えをもたらす方法であって、 （ａ）該細胞を、同方向に位置する第１および第２組換え部位を含むベクターに 、該ベクターが該細胞によって内部に取り込まれるように、接触させること、お よび （ｂ）該細胞に、該ベクターの該第１および第２組換え部位間での組換えをもた らす部位特異的リコンビナーゼを供給すること を含む方法。 ２１．該ベクターがさらに、 （ａ）プロモーターから該第１組換え部位を通って該第２組換え部位への方向で 転写を指示すべく配向するように該第１組換え部位に隣接しているプロモーター 、および （ｂ）該第２組換え部位に隣接しているコード配列、 を含むものである請求の範囲２０記載の方法。 ２２．該ベクターがさらに、該第１組換え部位から第２コード配列を通過して該 第２組換え部位への方向で転写されるべく配向するように該第１組換え部位に隣 接している該第２コード配列を含むものである請求の範囲２１記載の方法。 ２３．該ベクターがさらに、 （ａ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、且つ該第１組換え部 位から該第２コード配列を通過して該第２組換え部位への方向とは反対の方向に 転写されるべく配向するように該第２組換え部位に隣接しており、いかなるプロ モーターとも機能的に連結されていない第２コーディング配列、および （ｂ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、且つ該第１組換え部 位から該第２プロモーターを通過して該第２組換え部位への方向とは反対の方向 に転写を指示すべく配向するように該第１組換え部位に隣接している第２プロモ ーター を含むものである請求の範囲２１記載の方法。 ２４．該ベクターがさらに、 （ａ）該第２プロモーターと第２コード配列とを含む該第１および第２組換え部 位の間の領域以外の領域内に位置し、且つ該プロモーターと該第１組換え部位の 間に存在し、 （ｂ）該第１組換え部位から該第２プロモーターを通過して該第２組換え部位へ の方向とは反対の方向に転写されるべく配向するように該第１組換え部位に隣接 し、そして、 （ｃ）該第２プロモーターに機能的に連結されている 第３コード配列を含むものである請求の範囲２３記載の方法。 ２５．（ａ）同方向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１および第２組換え部位の間に位置する複製起点、 （ｃ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内にあり、且つ該第 １組換え部位から該コード配列を通過して該第２組換え部位への方向で転写され るべく配向するように該第１組換え部位に隣接しており、且ついかなるプロモー ターとも機能的に連結されていないコード配列、および （ｄ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、且つ該 第１組換え部位からプロモーターを通過して該第２組換え部位への方向で転写を 指示すべく配向するように該第２組換え部位に隣接しているプロモーターを含む ベクター。 ２６．該ベクターがさらに、該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領 域以外の領域内に位置し、且つ該第２組換え部位に隣接しており、該プロモータ ーに機能的に連結している第２コード配列を含むものである請求の範囲２５記載 のベクター。 ２７．さらに （ａ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内の、該第１組換え 部位と該コード配列との間に位置しているスプライス受容部位、および （ｂ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内の、該プロモータ ーと該第２組換え部位との間に位置しているスプライス供与部位、および （ｃ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域を含む領域以外の領 域内の、該第２組換え部位と該第２コード配列との間に位置しているスプライス 受容部位、 を含む請求の範囲２６記載のベクター。 ２８．（ａ）同方向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１および第２組換え部位の間に位置する複製起点、 （ｃ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、該第１ 組換え部位からプロモーターを通過して該第２組換え部位への方向で転写を指示 すべく配向するように該第２組換え部位に隣接しているプロモーター、および、 （ｄ）該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内に位置 し、且つ該プロモーターに機能的に連結されるように該第２組換え部位に隣接し ているコード配列 を含むベクター。 ２９．（ａ）同方向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１若しくは第２組換え部位に隣接している１以上のプロモーター、お よび （ｃ）該第１若しくは第２組換え部位に隣接している１以上のコード配列を含む ベクター。 ３０．（ａ）同方向に位置する第１および第２組換え部位、および （ｂ）該第１および第２組換え部位の間に位置する哺乳類細胞で機能的な複製起 点 を含むベクター。 ３１．該ベクターがさらに、該第１若しくは第２組換え部位に隣接している１以 上のプロモーターを含むものである請求の範囲３０記載のベクター。 ３２．該ベクターがさらに、該第１若しくは第２組換え部位に隣接している１以 上のコード配列を含むものである請求の範囲３０記載のベクター。 ３３．（ａ）アンチパラレルな配向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１および第２組換え部位の間に位置し、且つ該第１組換え部位からプ ロモーターを通過して該第２組換え部位への方向で転写を指示すべく配向するよ うに該第２組換え部位に隣接しているプロモーター、および （ｃ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域 内に位置し、且つ該第１組換え部位から該プロモーターを通過して該第２組換え 部位への方向とは反対の方向で転写されるべく配向するように該第１組換え部位 に隣接しており、いかなるプロモーターとも機能的に連結されていないコード配 列 を含むベクター。 ３４．さらに、該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以 外の領域内に位置し、且つ該第２組換え部位に隣接しており、該プロモーターに 機能的に連結されている第２コード配列を含む請求の範囲３３記載のベクター。 ３５．該ベクターがさらに、 （ａ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域を含む領域 以外の領域内の、該第１組換え部位と該コード配列との間に位置するスプライス 受容部位、 （ｂ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域内の、該プ ロモーターと該第２組換え部位との間に位置するスプライス供与部位、および （ｃ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域を含む領域 以外の領域内の、該第２組換え部位と該第２コード配列との間に位置するスプラ イス受容部位、 を含むものである請求の範囲３４記載のベクター。 ３６．（ａ）アンチパラレルな配向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１および第２組換え部位の間に位置し、且つ該第１組換え部位からプ ロモーターを通過して該第２組換え部位への方向で転写を指示すべく配向するよ うに該第２組換え部位に隣接しているプロモーター、および （ｃ）該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域 内に位置し、且つ該プロモーターに機能的に連結されるように該第２組換え部位 に隣接しているコード配列 を含むベクター。 ３７．（ａ）アンチパラレルな配向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、且つ該第１組換え部 位からコード配列を通過して該第２組換え部位への方向とは反対の方向で転写さ れるべく配向するように該第２組換え部位に隣接しており、いかなるプロモータ ーとも機能的に連結されていない該コード配列、および （ｃ）該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間の領域以外の領域内 に位置し、且つ該第１組換え部位から該コード配列を通過して該第２組換え部位 への方向で転写を指示すべく配向するように該第１組換え部位に隣接しているプ ロモーター を含むベクター。 ３８．該ベクターが、さらに該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の 間の領域内に位置し、且つ第１組換え部位に隣接し、該プロモーターに機能的に 連結されている第２コード配列を含むものである請求の範囲３７記載のベクター 。 ３９．（ａ）アンチパラレルな配向に位置する第１および第２組換え部位、 （ｂ）該第１および第２組換え部位の間の領域内に位置し、且つ該第１組換え部 位から該コード配列を通過して該第２組換え部位への方向で転写されるべく配向 するように該第１組換え部位に隣接しているコード配列、および （ｃ）該第１組換え部位から該コード配列を通過して該第２組換え部位への方向 で転写を指示すべく配向するように、該第１組換え部位に隣接し、且つ該第１お よび第２組換え部位の間のコード配列を含む領域以外の領域内に位置しており、 該プロモーターに機能的に連結されているプロモーター を含むベクター。 ４０．該リコンビナーゼがＣｒｅを含むものである請求の範囲１〜２４のいずれ かに記載の方法。 ４１．該第１および第２組換え部位がＬｏｘ部位を含むものである請求の範囲１ 〜２４のいずれかに記載の方法。 ４２．該ベクターがさらにパッセンジャー遺伝子を含むものである請求の範囲１ 〜２４のいずれかに記載の方法。 ４３．該パッセンジャー遺伝子が、ＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラ ージＴ抗原、Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請 求の範囲４２記載の方法。 ４４．該起点がポリオーマウイルス由来のものである請求の範囲１〜１０のいず れかに記載の方法。 ４５．該起点がパピローマウイルス由来のものである請求の範囲１〜１０のいず れかに記載の方法。 ４６．該起点がエプスタイン−バールウイルス由来のものである請求の範囲１〜 １０のいずれかに記載の方法。 ４７．該起点がoriＰ起点を含むものである請求の範囲４６記載の方法。 ４８．該方法が該細胞に細胞複製タンパク質をシスあるいはトランスに付与する ことを含むものである請求の範囲１〜１０のいずれかに記載の方法。 ４９．該細胞複製タンパク質が、ＥＢＮＡ−１、ラージＴ抗原、Ｅ１およびＥ２ タンパク質からなる群より選択されるものである請求の範囲４８記載の方法。 ５０．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲１〜１０のいずれかに記載の方法。 ５１．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲１１〜１４のいずれかに記載の方法。 ５２．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲１５〜１９のいずれかに記載の方法。 ５３．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲２０〜２１のいずれかに記載の方法。 ５４．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲２２〜２４のいずれかに記載の方法。 ５５．該１以上のＩＴＲが該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 内に位置するものである請求の範囲５０記載の方法。 ５６．該１以上のＩＴＲが該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の 間の領域内に位置するものである請求の範囲５１記載の方法。 ５７．該１以上のＩＴＲが該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間 の領域内に位置するものである請求の範囲５２記載の方法。 ５８．該１以上のＩＴＲが該第２コード配列を含む該第１および第２組換え部位 の間の領域内に位置するものである請求の範囲５４記載の方法。 ５９．該１以上のＩＴＲが該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 以外の領域内に位置するものである請求の範囲５０記載の方法。 ６０．該１以上のＩＴＲが該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の 間の領域以外の領域内に位置するものである請求の範囲５１記載の方法。 ６１．該１以上のＩＴＲが該第１および該コード配列を含む第２組換え部位の間 の領域以外の領域内に位置するものである請求の範囲５２記載の方法。 ６２．該１以上のＩＴＲが該第２コード配列を含む該第１および第２組換え部位 の間の領域以外の領域内に位置するものである請求の範囲５４記載の方法。 ６３．該コード配列がＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗原、 Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請求の範囲２〜 １９および２１〜２４のいずれかに記載の方法。 ６４．該第２コード配列がＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗 原、Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請求の範囲 ５、６、８〜１０、１３、１４、１６、および２２〜２４のいずれかに記載の方 法。 ６５．該第３コード配列がＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗 原、Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請求の範囲 １０または２４記載の方法。 ６６．該コード配列が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホルモンには結 合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードしている配列を 含むものである請求の範囲２〜１９および２１〜２４のいずれかに記載の方法。 ６７．該第２コード配列が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホルモンに は結合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードしている配 列を含むものである請求の範囲５、６、８〜１０、１３、１４、１６、および２ ２〜２４のいずれかに記載の方法。 ６８．該第３コード配列が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホルモンに は結合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードしている配 列を含むものである請求の範囲１０または２４記載の方法。 ６９．該パッセンジャー遺伝子が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホル モンには結合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードして いる配列を含むものである請求の範囲４２記載の方法。 ７０．該コード配列が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコードする配列を 含むものである請求の範囲２〜１９および２１〜２４および６６のいずれかに記 載の方法。 ７１．該第２コード配列が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコードする配 列を含むものである請求の範囲５、６、８〜１０、１３、１４、１６、２２〜２ ４および６７のいずれかに記載の方法。 ７２．該第３コード配列が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコードする配 列を含むものである請求の範囲１０、２４および６８のいずれかに記載の方法。 ７３．該パッセンジャー遺伝子が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコード する配列を含むものである請求の範囲４２または６９記載の方法。 ７４．該第１および第２組換え部位がＬｏｘ部位を含むものである請求の範囲２ ５〜２９のいずれかに記載のベクター。 ７５．該ベクターがさらにパッセンジャー遺伝子を含むものである請求の範囲２ ５〜２９のいずれかに記載のベクター。 ７６．該パッセンジャー遺伝子が、ＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラ ージＴ抗原、Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請 求の範囲７５記載のベクター。 ７７．該起点がポリオーマウイルス由来のものである請求の範囲２５〜２８のい ずれかに記載のベクター。 ７８．該起点がパピローマウイルス由来のものである請求の範囲２５〜２８のい ずれかに記載のベクター。 ７９．該起点がエプスタイン−バールウイルス由来のものである請求の範囲２５ 〜２８のいずれかに記載のベクター。 ８０．該起点がoriＰ起点を含むものである請求の範囲７９記載のベクター。 ８１．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲２９〜３１のいずれかに記載のベクター。 ８２．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲２５〜２８および３２のいずれかに記載のベクター。 ８３．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲３３〜３６のいずれかに記載のベクター。 ８４．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲３７または３９記載のベクター。 ８５．該ベクターがさらに１以上のアデノ随伴ウイルスＩＴＲを含むものである 請求の範囲３８記載のベクター。 ８６．該１以上のＩＴＲが該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 内に位置するものである請求の範囲８２記載のベクター。 ８７．該１以上のＩＴＲが該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の 間の領域内に位置するものである請求の範囲８３記載のベクター。 ８８．該１以上のＩＴＲが該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間 の領域内に位置するものである請求の範囲８４記載のベクター。 ８９．該１以上のＩＴＲが該第２コード配列を含む該第１および第２組換え部位 の間の領域内に位置するものである請求の範囲８５記載のベクター。 ９０．該１以上のＩＴＲが該起点を含む該第１および第２組換え部位の間の領域 以外の領域内に位置するものである請求の範囲８２記載のベクター。 ９１．該１以上のＩＴＲが該プロモーターを含む該第１および第２組換え部位の 間の領域以外の領域内に位置するものである請求の範囲８３記載のベクター。 ９２．該１以上のＩＴＲが該コード配列を含む該第１および第２組換え部位の間 の領域以外の領域内に位置するものである請求の範囲８４記載のベクター。 ９３．該１以上のＩＴＲが該第２コード配列を含む該第１および第２組換え部位 の間の領域以外の領域内に位置するものである請求の範囲８５記載のベクター。 ９４．該コード配列がＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗原、 Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請求の範囲２５ 〜２９、３１、および３３〜３９のいずれかに記載のベクター。 ９５．該第２コード配列がＥＢＮＡ−１、Ｒｅｐ、Ｆｌｐ、Ｃｒｅ、ラージＴ抗 原、Ｅ１およびＥ２コード配列からなる群より選択されるものである請求の範囲 ２６、２７、３４、３５、および３８のいずれかに記載のベクター。 ９６．該コード配列が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホルモンには結 合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードしている配列を 含むものである請求の範囲２５〜２９、３１、および３３〜３９のいずれかに記 載のベクター。 ９７．該第２コード配列が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホルモンに は結合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードしている配 列を含むものである請求の範囲２６、２７、３４、３５、および３８のいずれか に記載のベクター。 ９８．該パッセンジャー遺伝子が、外因性ホルモンとは結合し得るが天然のホル モンには結合できないホルモンレセプターのリガンド結合ドメインをコードして いる配列を含むものである請求の範囲７５記載のベクター。 ９９．該コード配列が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコードする配列を 含むものである請求の範囲２５〜２９、３１、３３〜３９、および９６のいずれ かに記載のベクター。 １００．該第２コード配列が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコードする 配列を含むものである請求の範囲２６、２７、３４、３５、３８、および９７の いずれかに記載のベクター。 １０１．該パッセンジャー遺伝子が、１以上の、グリシン−アラニン反復をコー ドする配列を含むものである請求の範囲７５または９８記載のベクター。
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