CN117795083A - γδT细胞的工程化及其组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过用病毒载体(例如，具有β逆转录病毒假型和逆转录病毒科病毒载体骨架的病毒载体)转导来工程化γδT细胞(例如，vδ1T细胞和vδ2T细胞)的方法。进一步提供了工程化的γδT细胞的组合物及其使用方法。
Description
背景技术
对癌症T细胞免疫疗法日益增长的关注集中在工程化的T细胞作为治疗部分的明显能力上。伽马德尔塔T细胞(γδT细胞)代表在其表面上表达独特、定义性γδT细胞受体(TCR)的T细胞的子集。此TCR由一个伽马(γ)和一个德尔塔(δ)链组成。人γδT细胞可广泛地分类为一种或两种类型：外周血液驻留γδT细胞和非造血组织驻留γδT细胞。大多数血液驻留γδT细胞表达Vδ2TCR，而此现象在组织驻留γδT细胞之中不太常见，后者更频繁地使用Vδ1和/或其他Vδ链。
相对于αβT细胞，缺少用于高效转导γδT细胞以表达所需转基因的方法。因此，在此领域中需要用于转导γδT细胞以产生足够品质和数量的γδT细胞群以用作疗法，例如用作过继性T细胞疗法的改进方法。
发明内容
在一个方面，本发明的特征在于通过用具有β逆转录病毒假型和逆转录病毒科病毒载体骨架的病毒载体转导γδT细胞群来产生工程化的γδT细胞群的方法。β逆转录病毒假型可以是狒狒内源性病毒(BaEV)。β逆转录病毒假型可以是RD114。
在一些实施方案中，逆转录病毒科病毒载体骨架是逆转录病毒载体骨架(例如，慢病毒骨架、γ逆转录病毒骨架，或α逆转录病毒骨架)。
工程化的γδT细胞可以是Vδ1T细胞。工程化的γδT细胞可以是Vδ2T细胞。工程化的γδT细胞可以是非Vδ1/Vδ2T细胞。
在一些实施方案中，病毒载体包括转基因。转基因可编码细胞表面受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))和/或细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子)。在一些实施方案中，转基因编码IL-15(例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。在一些实施方案中，病毒载体包括第一转基因和第二转基因。在一些实施方案中，第一转基因编码CAR并且第二转基因编码装甲蛋白(例如，细胞因子，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。
在一些实施方案中，CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑色素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、g9d2，或其组合。
在另一个方面，本发明的特征在于产生工程化的γδT细胞群的方法。所述方法包括提供起始γδT细胞群以及在不存在病毒载体的情况下，培养起始γδT细胞群持续第一培养期以产生启动的(primed)γδT细胞群。所述方法还可包括在有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的启动的γδT细胞的量的具有β逆转录病毒假型的病毒载体存在下，培养启动的γδT细胞群持续第二培养期，由此产生工程化的γδT细胞群。
在一些实施方案中，病毒载体的量有效转导至少20％的启动的γδT细胞。
在一些实施方案中，第一培养期为1天或更长时间(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，1-3天、3-5天、5-7天、7-10天，或更长时间)。在一些实施方案中，第一培养期为2天或更长时间(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，1-3天、3-5天、5-7天、7-10天，或更长时间)。在一些实施方案中，第一培养期为5天或更长时间(例如，5天、6天、7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，5-7天、7-10天，或更长时间)。在一些实施方案中，第一培养期为7天或更长时间(例如，7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，7-10天，或更长时间)。
在一些实施方案中，第二培养期为2天或更长时间(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或更长时间，例如，2-4天、4-7天、7-10天、10-14天，或更长时间)。在一些实施方案中，第二培养期为7天或更长时间(例如，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或更长时间，例如，7-10天、10-14天，或更长时间)。
在一些实施方案中，启动的γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。在一些实施方案中，启动的γδT细胞群缺少VSV-G进入受体(例如，LDL受体)的功能性表达。
在一些实施方案中，病毒载体以不大于10(例如，不大于5，例如，约1至约5)的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。
在另一个方面，本发明的特征在于通过以下方式产生工程化的γδT细胞群的方法：提供起始γδT细胞群；以及在IL-15和有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的起始γδT细胞群的量的具有β逆转录病毒假型的病毒载体存在下，培养起始γδT细胞群来，由此产生工程化的γδT细胞群。
在一些实施方案中，起始γδT细胞群缺少ASCT-1和/或ASCT-2的表达。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。起始γδT细胞群可缺少VSV-G进入受体(例如，LDL受体)的功能性表达。
在一些实施方案中，病毒载体以不大于10(例如，不大于5，例如，约1至约5)的MOI与起始γδT细胞群一起培养。
在一些实施方案中，病毒载体具有β逆转录病毒假型BaEV或RD114。
在一些实施方案中，病毒载体包括逆转录病毒科病毒载体骨架。逆转录病毒科病毒载体骨架可以是逆转录病毒载体骨架(例如，慢病毒骨架、γ逆转录病毒骨架，或α逆转录病毒骨架)。
工程化的γδT细胞可以是Vδ1T细胞。工程化的γδT细胞可以是Vδ2T细胞。工程化的γδT细胞可以是非Vδ1/Vδ2T细胞。
在一些实施方案中，病毒载体包括转基因。转基因可编码细胞表面受体，例如，嵌合抗原受体(CAR)和/或细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子)。在一些实施方案中，转基因编码IL-15(例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。在一些实施方案中，病毒载体包括第一转基因和第二转基因。在一些实施方案中，第一转基因编码CAR并且第二转基因编码装甲蛋白(例如，细胞因子，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。
在一些实施方案中，CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2，或其组合。
在另一个方面，本发明的特征在于通过用病毒载体转导γδT细胞群来产生表达CAR的γδT细胞群的方法，所述病毒载体包括编码CAR的转基因；β逆转录病毒假型；和逆转录病毒科病毒载体骨架。
在另一个方面，本发明的特征在于通过用病毒载体转导γδT细胞群来产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群的方法，所述载体包括编码CAR的第一转基因；编码装甲蛋白的第二转基因；β逆转录病毒假型；和逆转录病毒科病毒载体骨架。在一些实施方案中，装甲蛋白是细胞因子(例如，膜结合细胞因子或分泌细胞因子(例如，膜结合IL-15或分泌IL-15)。
在一些实施方案中，β逆转录病毒假型是BaEV。在其他实施方案中，β逆转录病毒假型是RD114。
在一些实施方案中，病毒载体包括逆转录病毒科病毒载体骨架。逆转录病毒科病毒载体骨架可以是逆转录病毒载体骨架(例如，慢病毒骨架、γ逆转录病毒骨架，或α逆转录病毒骨架)。
γδT细胞可以是Vδ1T细胞。γδT细胞可以是Vδ2T细胞。γδT细胞可以是非Vδ1/Vδ2T细胞。
在另一个方面，本发明的特征在于通过以下方式产生表达CAR的γδT细胞群的方法：提供起始γδT细胞群以及在不存在病毒载体的情况下，培养起始γδT细胞群持续第一培养期以产生启动的γδT细胞群。所述方法还可包括在具有β逆转录病毒假型和编码CAR的转基因的病毒载体存在下，培养启动的γδT细胞群持续第二培养期，其中病毒载体的量有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的启动的γδT细胞，由此产生表达CAR的γδT细胞群。
在另一个方面，本发明的特征在于通过以下方式产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群的方法：提供起始γδT细胞群以及在不存在病毒载体的情况下，培养起始γδT细胞群持续第一培养期以产生启动的γδT细胞群。所述方法还可包括在具有β逆转录病毒假型、编码CAR的第一转基因，和编码装甲蛋白的第二转基因的病毒载体存在下，培养启动的γδT细胞群持续第二培养期，其中病毒载体的量有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的启动的γδT细胞，由此产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群。在一些实施方案中，转基因编码IL-15(例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。在一些实施方案中，病毒载体包括第一转基因和第二转基因。在一些实施方案中，第一转基因编码CAR并且第二转基因编码装甲蛋白(例如，细胞因子，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。
在一些实施方案中，病毒载体的量有效转导至少20％的启动的γδT细胞。
在一些实施方案中，第一培养期为1天或更长时间(例如，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，1-3天、3-5天、5-7天、7-10天，或更长时间)。在一些实施方案中，第一培养期为2天或更长时间(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，1-3天、3-5天、5-7天、7-10天，或更长时间)。在一些实施方案中，第一培养期为5天或更长时间(例如，5天、6天、7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，5-7天、7-10天，或更长时间)。在一些实施方案中，第一培养期为7天或更长时间(例如，7天、8天、9天、10天，或更长时间，例如，7-10天，或更长时间)。
在一些实施方案中，第二培养期为2天或更长时间(例如，2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或更长时间，例如，2-4天、4-7天、7-10天、10-14天，或更长时间)。在一些实施方案中，第二培养期为7天或更长时间(例如，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或更长时间，例如，7-10天、10-14天，或更长时间)。
在一些实施方案中，启动的γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。在一些实施方案中，启动的γδT细胞群缺少VSV-G进入受体(例如，LDL受体)的功能性表达。在一些实施方案中，大于95％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于96％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于97％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于98％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于99％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。
在一些实施方案中，病毒载体以不大于10(例如，不大于5，例如，约1至约5)的MOI与启动的γδT细胞一起培养。
在另一个方面，本发明的特征在于通过以下方式产生表达CAR的γδT细胞群的方法：提供起始γδT细胞群；以及在IL-15和具有β逆转录病毒假型和编码CAR的转基因的病毒载体存在下，培养起始γδT细胞群，其中病毒载体的量有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的起始γδT细胞群，由此产生表达CAR的工程化的γδT细胞群。
在另一个方面，本发明的特征在于通过以下方式产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群的方法：提供起始γδT细胞群；以及在IL-15和具有β逆转录病毒假型、编码CAR的第一转基因，和编码装甲蛋白的第二转基因的病毒载体存在下，培养起始γδT细胞群，其中病毒载体的量有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的起始γδT细胞群，由此产生表达CAR和装甲蛋白的工程化的γδT细胞群。在一些实施方案中，装甲蛋白是细胞因子，例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15。
在一些实施方案中，起始γδT细胞群缺少ASCT-1和/或ASCT-2的表达。工程化的γδT细胞群可表达ASCT-1和/或ASCT-2。起始γδT细胞群可缺少VSV-G进入受体(例如，LDL受体)的功能性表达。在一些实施方案中，大于95％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于96％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于97％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于98％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。在一些实施方案中，大于99％的启动的γδT细胞群缺少足够水平的VSV-G进入受体表达(例如，LDL受体)来介导可检测的VSV-G进入(例如，如通过基于BlaM-Vpr的测定所测量)。
在一些实施方案中，病毒载体以不大于10(例如，不大于5，例如，约1至约5)的MOI与起始γδT细胞群一起培养。
在一些实施方案中，β逆转录病毒假型是BaEV或RD114。
在一些实施方案中，病毒载体包括逆转录病毒科病毒载体骨架。逆转录病毒科病毒载体骨架可以是逆转录病毒载体骨架(例如，慢病毒骨架、γ逆转录病毒骨架，或α逆转录病毒骨架)。
工程化的γδT细胞可以是Vδ1T细胞。工程化的γδT细胞可以是Vδ2T细胞。工程化的γδT细胞可以是非Vδ1/Vδ2T细胞。
在一些实施方案中，CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2，或其组合。
在另一个方面，本发明的特征在于通过如本文所述的方法产生的工程化的γδT细胞群。
在一些实施方案中，至少10％(例如，至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的群体表达CAR。在一些实施方案中，至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的工程化的γδT细胞群表达CAR。在一些实施方案中，至少10％(例如，至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的工程化的γδT细胞群表达装甲蛋白，例如，细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。在一些实施方案中，至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的工程化的γδT细胞群表达装甲蛋白，例如，细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。在一些实施方案中，至少10％(例如，至少11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的工程化的γδT细胞群表达CAR和装甲蛋白，例如，细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。在一些实施方案中，至少50％(例如，至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的工程化的γδT细胞群表达CAR和装甲蛋白，例如，细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。
在另一个方面，本发明的特征在于通过如本文所述的方法产生的表达CAR的γδT细胞群。
在另一个方面，本发明的特征在于通过如本文所述的方法产生的表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群。在一些实施方案中，装甲蛋白是细胞因子(例如，分泌细胞因子或膜结合细胞因子(例如，IL-15，例如，分泌IL-15或膜结合IL-15)。
应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含方面和实施方案”、“由方面和实施方案组成”和“基本上由方面和实施方案组成”。除非另外指出，否则如本文所用的单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数个参考物。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知晓的相应值的常见误差范围。在本文中提及“约”值或参数包括(并且描述)关于所述值或参数本身的实施方案。在一些情况下，“约”涵盖相对于指定值的+20％，在一些情况下+10％，在一些情况下+5％，在一些情况下+1％，或在一些情况下+0.1％的变化，因为此类变化对于进行所公开的方法而言是适当的。
如本文使用，术语“工程化的γδT细胞”是指表达转基因(即，被转导至工程化的γδT细胞或其亲本细胞中的基因)的γδT细胞。
如本文使用，术语“启动的γδT细胞”是指受培养条件影响的起始群(例如，内源性γδT细胞群)。在一些情况下，相对于其经历培养条件之前的未启动的对应物，启动的γδT细胞具有不同功能病毒进入受体概况。在一些实施方案中，启动的γδT细胞群是扩增的γδT细胞群。
如本文使用，“扩增的γδ细胞群”是指包括γδT细胞的造血细胞群，所述细胞以诱导γδ细胞扩增，即，增加γδ细胞数量的条件和持续时间来培养。同样地，如本文使用，“扩增的Vδ1T细胞群”是指包括Vδ1T细胞的造血细胞群，所述细胞以诱导Vδ1T细胞扩增，即，增加Vδ1细胞数量的条件和持续时间来培养。类似地，如本文使用，“扩增的Vδ2T细胞群”是指包括Vδ2T细胞的造血细胞群，所述细胞以诱导Vδ2T细胞扩增，即，增加Vδ2细胞数量的条件和持续时间来培养。
如本文使用，γδT细胞“群”是指三个或更多个γδT细胞(例如，至少10、至少102、至少103、至少104、至少105、至少106、至少107、至少108、至少109、至少1010、至少1011、至少1012，或至少1013)个γδT细胞(例如，工程化的γδT细胞)的组。特定细胞类型的群体(例如，内源性γδT细胞群、启动的γδT细胞群，或工程化的γδT细胞群)是指所述类型的细胞而并非更广泛群体内的不同类型的细胞。例如，如果108个T细胞的起始群的10％的细胞是γδT细胞，则起始γδT细胞群为107个。
如本文使用，“装甲蛋白”是指由转基因编码的蛋白，所述转基因在由γδT细胞(例如，表达CAR的γδT细胞)表达时，例如通过旁分泌信号传导(例如，细胞因子信号传导)来增加γδT细胞针对靶细胞的持续或增加的免疫原性，以改善例如细胞持久性、细胞活力、活化和其他所需特征。装甲蛋白可以是膜结合蛋白或可溶性蛋白。例如，装甲蛋白包括膜结合蛋白，诸如膜结合受体(例如，αβTCR、天然细胞毒性受体(例如，NKp30、NKp44或NKp46)、细胞因子受体(例如，IL-12受体)和/或趋化因子受体(例如，CCR2受体)和/或膜结合配体或细胞因子(例如，膜结合IL-15、膜结合IL-7、膜结合CD40L、膜结合4-1BB、膜结合4-1BBL、膜结合CCL19)。另外地或可选地，装甲蛋白可以是可溶性蛋白，诸如可溶性配体或细胞因子(例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL和/或可溶性CCL19)。在一些实施方案中，装甲蛋白不是抗原特异性的。
如本文使用，“IL-15”是指充当一种或多种IL-15受体(IL-15R)亚基的激动剂的天然或重组IL-15或其变体(例如，其突变体、突变蛋白、类似物、亚基、受体复合物、片段、同工型和拟肽)。如同IL-2，IL-15是可支持IL-2依赖性细胞系CTLL-2的增殖的已知T细胞生长因子。IL-15首先由Grabstein等人(Science 264.5161:965-969,1994)报导为114个氨基酸的成熟蛋白。如本文所用，术语“IL-15”意指天然或重组IL-15和突变蛋白、类似物、其亚基，或其复合物(例如，受体复合物，例如，寿司肽，如PCT公布号WO 2007/046006中所述)，并且其各自可刺激CTLL-2细胞的增殖。在CTLL-2增殖测定中，用成熟形式的IL-15的重组表达前体和同框融合物转染的细胞的上清液可诱导CTLL-2细胞增殖。
人IL-15可根据Grabstein等人(Science 264.5161:965-969,1994)描述的程序或常规程序诸如聚合酶链反应(PCR)来获得。人IL-15cDNA在1993年2月19日寄存于并且被指定登录号69245。
人IL-15的氨基酸序列(基因ID 3600)在登录定位符NP000576.1GI：10835153(同工型1)和NP_751915.1GI：26787986(同工型2)下发现于Genbank中。鼠(小家鼠(Musmusculus))IL-15氨基酸序列(基因ID 16168)在登录定位符NP_001241676.1GI：363000984下发现于Genbank中。
IL-15还可以指衍生自各种哺乳动物物种，包括例如人、猿、牛、猪、马和鼠的IL-15。如本文所提及，IL-15“突变蛋白”或“变体”是基本上与天然哺乳动物IL-15的序列同源，但是由于氨基酸缺失、插入或取代而具有不同于天然哺乳动物IL-15多肽的氨基酸序列的多肽。变体可包含保守取代序列，意味着给定氨基酸残基通过具有类似生理化学特征的残基来替换。保守取代的实例包括一个脂族残基取代另一个脂族残基，诸如Ile、Val、Leu或Ala彼此取代，或一个极性残基取代另一个极性残基，诸如在Lys与Arg；Glu与Asp；或Gln与Asn之间的取代。其他此类保守取代，例如，具有类似疏水性特征的整个区域的取代，是众所周知的。天然存在的IL-15变体也由本发明涵盖。此类变体的实例是由替代mRNA剪接事件或IL-15蛋白的蛋白水解裂解所产生的蛋白质，其中IL-15结合特性得以保留。mRNA的替代剪接可产生截短但具有生物活性的IL-15蛋白。可归因于蛋白水解的变化包括例如，由于蛋白水解从IL-15蛋白中去除一个或多个末端氨基酸(通常1-10个氨基酸)所导致的在不同类型宿主细胞中表达后的N或C末端中的差异。在一些实施方案中，蛋白质的末端可例如用化学基团诸如聚乙二醇来修饰以改变其物理特性(Yang等人Cancer76:687-694,1995)。在一些实施方案中，蛋白质的末端或内部可用额外氨基酸来修饰(Clark-Lewis等人PNAS 90:3574-3577,1993)。
如本文所用，“非造血细胞”包括基质细胞和上皮细胞。基质细胞是任何器官的非造血结缔组织细胞并且支持所述器官的实质细胞的功能。基质细胞的实例包括成纤维细胞、周细胞、间充质细胞、角质形成细胞、内皮细胞和非血液学肿瘤细胞。上皮细胞是装衬在整个身体中的血管和器官的腔体和表面的非造血细胞。它们通常在形状上是鳞状、柱状或立方体样并且可被排列成单个细胞层，或两个或更多个细胞层。
如本文所用，“非造血组织驻留γδT细胞”、“非造血组织衍生”，和“非造血组织-天然γδT细胞”是指在组织外植时，存在于非造血组织中的γδT细胞。非造血组织驻留γδT细胞可获自任何合适人或非人动物非造血组织。非造血组织是除了血液或骨髓以外的组织。在一些实施方案中，γδT细胞不获自诸如血液或滑液的生物流体的特定类型的样品。此类合适人或非人动物非造血组织的实例包括皮肤或其一部分(例如，真皮或表皮)，胃肠道(例如，胃肠上皮、结肠、小肠、胃、阑尾、盲肠或直肠)、乳腺组织、肺(优选地其中组织不通过支气管肺泡灌洗来获得)、前列腺、肝和胰腺。在一些实施方案中，非造血组织驻留γδT细胞可衍生自淋巴组织，诸如胸腺、脾或扁桃体。γδT细胞也可驻留于人癌症组织，例如，乳腺和前列腺中。在一些实施方案中，γδT细胞不获自人癌症组织。非造血组织样品可通过标准技术例如，通过外植(例如，活检)来获得。非造血组织驻留γδT细胞包括例如Vδ1T细胞、双阴性(DN)T细胞、Vδ2T细胞、Vδ3T细胞和Vδ5T细胞。
如本文所用，短语“以有效……的量”是指诱导可检测结果(例如，相对于其起始群，具有统计上显著增加数量的细胞的数量，例如，p<0.05)的量。
如本文所用，“扩增的γδ细胞群”是指包括γδT细胞的造血细胞群，所述细胞以诱导γδ细胞扩增，即，增加γδ细胞数量的条件和持续时间来培养。同样地，如本文所用，“扩增的Vδ1T细胞群”是指包括Vδ1T细胞的造血细胞群，所述细胞以诱导Vδ1T细胞扩增，即，增加Vδ1细胞数量的条件和持续时间来培养。类似地，如本文所用，“扩增的Vδ2T细胞群”是指包括Vδ2T细胞的造血细胞群，所述细胞以诱导Vδ2T细胞扩增，即，增加Vδ2细胞数量的条件和持续时间来培养
术语“标志物”在本文中是指DNA、RNA、蛋白质、碳水化合物、糖脂，或基于细胞的分子标志物，其在患者样品中的表达或存在可通过标准方法(或本文所公开的方法)来检测。
“表达”所关注标志物的细胞或细胞群是如下细胞或细胞群，其中编码蛋白质的mRNA或蛋白质本身(包括其片段)被确定为存在于细胞或群体中。标志物的表达可通过各种手段来检测。例如，在一些实施方案中，标志物的表达是指细胞上的标志物的表面密度。例如用作流式细胞术的读出的平均荧光强度(MFI)代表细胞群上的标志物的密度。本领域的技术人员将理解MFI值取决于染色参数(例如，浓度、持续时间和温度)和荧光染料组成。然而，在适当对照的情形中考虑时，MFI可以是定量的。例如，如果在相当条件下染色，标志物的抗体的MFI显著高于相同细胞群上的适当同种型对照抗体的MFI，则可认为细胞群表达所述标志物。另外地或可选地，根据常规流式细胞术分析方法(例如，通过根据同种型或“荧光减一”(FMO)对照来设定门)，使用正性和负性门，可在逐个细胞的基础上认为细胞群表达标志物。通过此度量，如果检测到的对标志物阳性的细胞的数量显著高于背景(例如，通过对同种型对照进行门控)，可认为群体“表达”标志物。
如本文所用，“VSV-G进入受体的功能性表达”是指足以在至少5％的靶细胞群中介导可检测的VSV-G进入的VSV-G进入受体表达水平，如通过基于β内酰胺酶-Vpr(BlaM-VpR)的测定所测量。参见例如Cavrois等人Nat Biotechnol.11:1151-1154,2002。相反地，在“缺少VSV-G进入受体的功能性表达”的细胞群中，大于95％的细胞群缺少足以介导可检测的VSV-G进入的VSV-G进入受体表达水平，如通过基于BlaM-VpR的测定所测量。
如本文所用，当群体的表达以阳性细胞的百分比来陈述并且所述百分比与参考群体的阳性细胞的对应百分比进行比较时，百分比差异是各相应群体的亲本群体的百分比。例如，如果标志物在群体A的10％的细胞上表达并且相同标志物在群体B的1％的细胞上表达，则认为群体A的标志物阳性细胞频率比群体B大9％(即，10％-1％，而不是10％÷1％)。当频率乘以亲本群体中的细胞数量时，计算细胞绝对数量的差。在以上给出的实例中，如果在群体A中有100个细胞并且在群体B中有10个细胞，则相对于群体B，群体A具有100倍细胞数量，即，(10％x 100)÷(1％x 10)。
标志物的表达水平可以是核酸表达水平(例如，DNA表达水平或RNA表达水平，例如，mRNA表达水平)。可使用确定核酸表达水平的任何合适方法。在一些实施方案中，核酸表达水平使用qPCR、rtPCR、RNA-seq、多重qPCR或RT-qPCR、微阵列分析、基因表达系列分析(SAGE)、技术、原位杂交(例如，FISH)，或其组合来确定。
如本文所用，细胞的“参考群体”是指对应于所关注细胞的细胞群，相对于所述群体来测量所关注细胞的表型。例如，非造血组织衍生的γδ细胞的分离群体上标志物的表达水平可与造血组织衍生的γδT细胞(例如，血液驻留γδ细胞，例如，衍生自相同供体或不同供体的血液驻留γδ细胞)或在不同条件下(例如，在实质性TCR活化存在下、在外源性TCR活化剂(例如，抗CD3)存在下，或在与基质细胞(例如，成纤维细胞)实质性接触中)扩增的非造血组织衍生的γδT细胞上相同标志物的表达水平进行比较。群体还可与较早状态下的自身进行比较。例如，参考群体可以是在其扩增之前的分离细胞群体。在此情况下，扩增的群体与其在扩增步骤之前的自身组成进行比较，即，在此情况下，其过去组成是参考群体。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或可选地“CAR”是指重组多肽构建体，其包括胞外抗原结合结构域、跨膜结构域，和任选地传播对细胞进行活化的活化信号和/或共刺激信号的胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括CAR融合蛋白的N末端的任选的前导序列。
附图说明
图1A和图1B是显示出广泛趋向性VSV-G假型慢病毒载体不能转导Vδ1γδT细胞的图表。代表性点图示出了在扩增培养第7天，使用各种感染复数，用VSV-G(图1A)或BaEV(图1B)假型GFP编码慢病毒载体转导的γδT细胞。转导效率在转导后72小时通过FACS分析来确定。UTD，未转导的对照；MOI，感染复数；NVP，奈韦拉平(nevirapine，RT抑制剂)。
图2A和图2B是显示出用VSV-G假型CAR编码慢病毒载体转导Vδ1γδT细胞导致假转导的图表。图2A示出了在存在或不存在奈韦拉平的情况下，用VSV-G假型CAR编码慢病毒载体以MOI＝1转导之后4(顶部行)或8(底部行)天，CAR+ve Vδ1γδT细胞的代表性点图。图2B是显示出在存在或不存在奈韦拉平的情况下，用VSV-G假型CAR编码慢病毒载体以各种MOI(MOI＝5-0.1)转导之后4(黑色条)或8(点线条)天，CAR+ve Vδ1γδT细胞的百分比的图表。UTD，未转导的对照；MOI，感染复数；CAR，嵌合抗原受体；NVP，奈韦拉平。
图3A和图3B是显示出细胞因子启动是BaEV假型慢病毒载体的Vδ1γδT细胞转导的主要决定因素的图表。图3A是显示出用GFP编码BaEV假型慢病毒载体以MOI＝1转导的GFP+ve Vδ1细胞在转导后三天的百分比的条形图。细胞在开始培养(第0天)或在扩增阶段的第7天、第10天、第14天和第15天进行转导。图3B示出了在扩增培养的第14天进行转导的细胞的代表性点图。UTD，未转导的对照；MOI，感染复数；GFP，绿色荧光蛋白；NVP，奈韦拉平。
图4A和图4B是显示出Vδ1γδT细胞的转导效率与感染复数(MOI)相关的图表。图4A示出了用CAR编码BaEV假型慢病毒载体以不同MOI转导之后3天，CAR+ve Vδ1细胞的百分比。细胞在扩增的第10天进行转导。图4B示出了展示出以MOI＝5转导的CAR+ve细胞的代表性点图。UTD，未转导的对照；MOI，感染复数；CAR，嵌合抗原受体；NVP，奈韦拉平。
图5A和图5B是显示出BaEV假型慢病毒载体转导Vδ1和非Vδ1(Vδ2、Vδ3)γδT细胞的图表。点图示出了表达CAR(图5A)和GFP(图5B)的Vδ1和非Vδ1(Vδ2、Vδ3)γδT细胞。细胞用BaEV假型载体(MOI＝5)转导并且转导效率在转导后三天通过对泛-γδT细胞进行门控，随后对Vδ1细胞进行门控来确定。
图6是显示出用BaEV假型慢病毒载体转导Vδ1γδT细胞可通过重复转导来进一步增强的一组图表。Vδ1细胞在第10天(1次命中)或连续两天(2次命中：第10天和第11天)用BaEV假型CAR编码慢病毒载体以MOI＝1来转导。CAR+ve细胞的百分比在转导之后72小时确定。
图7是显示出在载体融合素(vectofusin)存在下的转导与在纤维连接蛋白(retronectin)存在下一样高效的图表。Vδ1细胞在纤维连接蛋白(左)或载体融合素(右)存在下以各种MOI和各种频率(一次或两次命中)来转导。在扩增第10天转导细胞并且FACS分析在转导后三天进行。
图8是显示出Vδ1细胞可用RD114假型病毒载体来转导的一组图表。Vδ1细胞用BaEV假型CAR编码慢病毒或RD114假型γ逆转录病毒载体以MOI＝1来转导。点图示出了转导之后三天的表达CAR的Vδ1细胞。
具体实施方式
本发明提供了通过用病毒载体(例如，具有β逆转录病毒假型和逆转录病毒科病毒载体骨架的病毒载体)转导来工程化γδT细胞(例如，vδ1T细胞和vδ2T细胞)的方法。进一步提供了工程化的γδT细胞的组合物及其使用方法。
本发明部分地基于γδT细胞可用β逆转录病毒假型病毒载体转导至高水平的意外发现。相对于其他淋巴细胞类型，γδT细胞不允许逆转录病毒转导，例如，使用VSV-G假型病毒载体。VSV-G载体容易地转导αβT细胞以及NK细胞，所述细胞是γδT细胞的最接近的细胞类型。因此，不预期β逆转录病毒假型病毒载体能够转导γδT细胞。此外，本发明还基于在病毒载体存在下的γδT细胞的最佳培养条件和持续时间的发现，以便用载体转导群体γδT细胞。本文所述的转导方法允许高效转导γδT细胞以便产生表达所需转基因的工程化的γδT细胞群。
转导方法
在一个方面，本发明提供了一种通过用包括β逆转录病毒假型和逆转录病毒科(例如，逆转录病毒)载体骨架的病毒载体转导γδT细胞(例如，Vδ1T细胞、Vδ2T细胞和/或非Vδ1/Vδ2T细胞)群来产生工程化的γδT细胞群的方法。逆转录病毒载体骨架可以是例如慢病毒骨架、γ逆转录病毒骨架或α逆转录病毒骨架。β逆转录病毒假型可以是例如BaEV或RD114。在一些实施方案中，β逆转录病毒假型是BaEV。在一些实施方案中，β逆转录病毒假型是RD114。
在另一个方面，本发明提供了一种产生工程化的γδT细胞群的方法，所述方法通过提供起始γδT细胞群，在不存在病毒载体的情况下将γδT细胞启动，以及在有效转导至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)的启动的γδT细胞的量的病毒载体存在下，培养启动的γδT细胞群来进行。在一些实施方案中，在有效转导至少5％的启动的γδT细胞的量的病毒载体存在下，培养启动的γδT细胞群。在一些实施方案中，在有效转导至少20％的启动的γδT细胞的量的病毒载体存在下，培养启动的γδT细胞群。
启动的γδT细胞可通过在不存在病毒载体的情况下，培养起始γδT细胞群来获得。例如，起始γδT细胞群可培养至少1小时(例如，至少2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或更长时间，例如，约1小时至约14天、约6小时至约14天、约1天至约14天、约2天至约14天、约5天至约14天、约7天至约14天、约5天至约10天、约5天至约7天，或约7天至约10天)的第一培养期。当例如在不存在病毒载体的情况下培养细胞之后，获得启动的γδT细胞时，启动的γδT细胞可进一步培养至少1天(例如，至少2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天，或更长时间，例如，约1天至约14天、约2天至约14天、约5天至约14天、约7天至约14天、约5天至约10天、约5天至约7天，或约7天至约10天)的第二培养期。第二培养期可为约1天至约14天(例如，约3天至约14天、约3天至约12天、约4天至约1天、约5天至约10天，或约5天至约7天)。
在一些实施方案中，病毒载体以不大于约10，例如，不大于约9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5或0.25的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约5的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约4的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约3的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约2的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约1的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约0.5的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以不大于约0.25的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。在一些实施方案中，病毒载体以约0.25至约10(例如，约0.5至约10、约1至约10，或约1至约5)的感染复数(MOI)与启动的γδT细胞一起培养。
在一些实施方案中，γδT细胞的转导包括使用转导增强剂来增强转导效率。合适转导增强剂包括例如载体融合素、精子和/或纤维连接蛋白。所述方法可包括在培养期间，使γδT细胞与转导增强剂接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使细胞与奈韦拉平接触。在一些实施方案中，γδT细胞的转导包括用IL-15来补充培养基，所述IL-15可增加β逆转录病毒假型病毒载体的病毒进入受体ASCT-2的γδT细胞表达。
旋转接种
在本公开的一些实施方案中，γδT细胞可例如通过离心来旋转，同时与病毒载体(例如，与一种或多种本文所述的额外剂组合)一起培养。此“旋转接种”过程可在例如约200x g至约2,000x g的向心力下发生。向心力可为例如约300x g至约1,200x g(例如，约300x g、400x g、500x g、600x g、700x g、800x g、900x g、1,000x g、1,100x g或1,200x g，或更大)。在一些实施方案中，γδT细胞旋转约10分钟至约3小时(例如，约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、65分钟、70分钟、75分钟、80分钟、85分钟、90分钟、95分钟、100分钟、105分钟、110分钟、115分钟、120分钟、125分钟、130分钟、135分钟、140分钟、145分钟、150分钟、155分钟、160分钟、165分钟、170分钟、175分钟、180分钟，或更大)。在一些实施方案中，γδT细胞在室温下，诸如在约25℃的温度下旋转。
涉及旋转接种步骤的示例性转导方案描述于例如Millington等人PLoS One 4:e6461,2009；Guo等人Journal of Virology 85:9824-9833,2011；O’Doherty等人Journalof Virology 74:10074-10080,2000；和Federico等人,Lentiviral Vectors andExosomes as Gene and Protein Delivery Tools,Methods in Molecular Biology1448,第4章,2016中，所述文献各自的公开内容以引用方式并入本文。
病毒载体
本文所述的组合物和方法包括使用β逆转录病毒假型病毒载体来高效转导γδT细胞。病毒基因组提供可用于将外源基因高效递送至哺乳动物细胞中的载体的丰富来源。病毒基因组是用于基因递送的特别有用的载体，因为包含于此类基因组内的多核苷酸通常通过普通或特殊转导掺入哺乳动物细胞的细胞核基因组中。这些过程作为天然病毒复制循环的一部分而发生并且不需要添加蛋白质或试剂以便诱导基因整合。可以是β逆转录病毒假型的病毒载体的实例包括逆转录病毒(例如，逆转录病毒科病毒载体)。逆转录病毒的实例是：禽类白血病-肉瘤、禽类C型病毒、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、致癌逆转录病毒、HTLV-BLV组、慢病毒、α逆转录病毒、β逆转录病毒、γ逆转录病毒、泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,Virology,第三版(Lippincott-Raven,Philadelphia,(1996)))。其他实例是鼠白血病病毒(MLV)、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽类白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源性病毒(BaEV)、长臂猿白血病病毒、Mason Pfizer猴病毒、猿免疫缺陷病毒、猿肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。用于本发明方法的可用β逆转录病毒来假型化的载体的其他实例描述于例如McVey等人(美国专利号5,801,030)中，其教示以引用方式并入本文。
逆转录病毒载体
在一些情况下，用于本文所述的方法和组合物的病毒载体是逆转录病毒载体。可用于本文所述的方法和组合物的一种类型的逆转录病毒载体是慢病毒载体。慢病毒载体(LV)，逆转录病毒的子集，以高效率转导广泛范围的分裂和非分裂细胞类型，从而赋予转基因稳定、长期的表达。包装和转导LV的优化策略的概述提供于Delenda,The Journal ofGene Medicine 6:S125,2004中，其公开内容以引用方式并入本文。
使用基于慢病毒的基因转移技术依赖于体外产生带有高度缺失病毒基因组的重组慢病毒颗粒，所关注转基因容纳在所述基因组中。具体而言，重组慢病毒通过在允许细胞系中反式共表达以下各项来回收：(1)包装构建体，即，表达Gag-Pol前体连同Rev(可选地反式表达)的载体；(2)表达通常异源性质的包膜蛋白的载体；和(3)转移载体，其由病毒cDNA组成，所述cDNA失去所有开放阅读框，但是保留复制、衣壳化和表达所需要的序列，待表达的序列插入其中。
用于本文所述的方法和组合物的LV可包括5'-长末端重复(LTR)、HIV信号序列、HIV Psi信号5'-剪接位点(SD)、δ-GAG元件、Rev响应元件(RRE)、3'-剪接位点(SA)、延长因子(EF)1-α启动子和3'-自身失活性LTR(SIN-LTR)中的一种或多种。慢病毒载体任选地包括中心聚嘌呤区(cPPT)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，如US 6,136,597中所述，其关于WPRE的公开内容以引用方式并入本文。慢病毒载体还可包括pHR'骨架，其可包括例如如以下所提供。
Lu等人,Journal of Gene Medicine 6:963,2004中描述的Lentigen LV可用于表达DNA分子和/或转导细胞。用于本文所述的方法和组合物的LV可以是5'-长末端重复(LTR)、HIV信号序列、HIV Psi信号5'-剪接位点(SD)、δ-GAG元件、Rev响应元件(RRE)、3'-剪接位点(SA)、延长因子(EF)1-α启动子和3'-自身失活性LTR(SIN-LTR)。本领域的技术人员容易显而易知任选地这些区域中的一个或多个被执行相似功能的另一个区域取代。
增强子元件可用于增加修饰的DNA分子的表达或增加慢病毒整合效率。用于本文所述的方法和组合物的LV可包括nef序列。用于本文所述的方法和组合物的LV可包括增强载体整合的cPPT序列。cPPT充当(+)-链DNA合成的第二来源并且在其天然HIV基因组的中间引入部分链重叠。在转移载体骨架中引入cPPT序列强烈增加细胞核运输和整合至靶细胞的DNA中的基因组的总量。用于本文所述的方法和组合物的LV可包括土拨鼠转录后调控元件(WPRE)。WPRE通过促进转录物的细胞核输出和/或通过增加新生转录物的多腺苷酸化效率，由此增加细胞中mRNA的总量，从而在转录水平下起作用。在体外和体内，将WPRE添加至LV导致从多个不同启动子的转基因表达水平的实质性改善。用于本文所述的方法和组合物的LV可包括cPPT序列和WPRE序列。载体还可包括允许从单一启动子表达多个多肽的IRES序列。
除了IRES序列以外，其他允许表达多个多肽的元件也是有用的。用于本文所述的方法和组合物的载体可包括允许表达多于一个多肽的多个启动子。用于本文所述的方法和组合物的载体可包括允许表达多于一个多肽的蛋白裂解位点。允许表达多于一个多肽的蛋白裂解位点的实例描述于Klump等人Gene Ther.；8:811,2001，Osborn等人,MolecularTherapy 12:569,2005，Szymczak和Vignali,Expert Opin Biol Ther.5:627,2005，和Szymczak等人,Nat Biotechnol.22:589,2004中，所述文献关于允许表达多于一个多肽的蛋白裂解位点的公开内容以引用方式并入本文。本领域的技术人员容易显而易知将来鉴定的其他允许表达多个多肽的元件是有用的并且可用于适合于与本文所述的组合物和方法一起使用的载体中。
其他可与本文所述的组合物和方法结合使用的逆转录病毒载体(例如，逆转录病毒骨架)包括γ逆转录病毒载体。示例性γ逆转录病毒载体是或衍生自鸡融合病毒、猫白血病病毒、finkel-biskis-jinkins鼠肉瘤病毒、gardner-arnstein猫肉瘤病毒、长臂猿白血病病毒、豚鼠c型致癌病毒、hardy-zuckerman猫肉瘤病毒、harvey鼠肉瘤病毒、kirsten鼠肉瘤病毒、koala逆转录病毒、moloney鼠肉瘤病毒、鼠白血病病毒、猪c型致癌病毒、网状内皮增生病毒、snyder-theilen猫肉瘤病毒、trager鸭脾坏死病毒、毒蛇逆转录病毒和绒毛猴肉瘤病毒。
在某些实施方案中，病毒载体骨架衍生自慢病毒(LV)。在某些实施方案中，病毒载体骨架衍生自第三代自身失活(SIN)慢病毒载体(LV)(例如，HIV、SIV，或EIAV)。在某些实施方案中，病毒载体骨架衍生自不是自身失活性的LV(例如)。
其他可与本文所述的组合物和方法结合使用的逆转录病毒载体(例如，逆转录病毒骨架)包括α逆转录病毒载体。示例性α逆转录病毒载体是或衍生自禽类癌米尔希尔(millhill)病毒2、禽类白血病病毒、禽类成髓细胞瘤病毒、禽类骨髓细胞瘤病毒29、禽类肉瘤病毒ct10、藤波(fujinami)肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒、ur2肉瘤病毒和y73肉瘤病毒。
β逆转录病毒假型
与本文所述的组合物和方法结合使用的病毒载体包括β逆转录病毒假型包膜基因。β逆转录病毒包膜基因可来自典型的B型或D型β逆转录病毒。β逆转录病毒假型可衍生自任何合适β逆转录病毒。β逆转录病毒包括例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、地方性鼻肿瘤病毒1型和2型(ENT-1和ENT-2)、猿逆转录病毒1型、2型(SRV-1和SRV-2)和3型、jaagsiekte绵羊逆转录病毒(JSRV)、松鼠猴逆转录病毒(SMRV)、帚尾袋貂(Trichosurus Vulpecula)内源性D型逆转录病毒(TvERV-D)、小家鼠D型逆转录病毒(MusD)、猿内源性逆转录病毒(SERV)、Mason-Pfizer猴病毒MPMV。在一些实施方案中，β逆转录病毒包膜基因来自非β逆转录病毒载体。这些病毒通过重组和跨物种传播潜在地获得β逆转录病毒假型。合适实例包括BaEV、猫逆转录病毒RD114、辛诺柏(sin nombre)病毒(SNV)和网状内皮增生病毒(REV)。可与本文所述的组合物和方法结合使用的包膜基因包括来自在Baillie等人,J.Virol.78:5784-5798,2004中描述的病毒的那些包膜基因，其公开内容特此以引用方式整体并入本文。
γδT细胞
伽马德尔塔T细胞(γδT细胞)代表在其表面上表达独特、定义性γδT细胞受体(TCR)的T细胞的子集。此TCR由一个伽马(γ)和一个德尔塔(δ)链组成。人γδT细胞可广泛地分类为一种或两种类型：外周血液驻留γδT细胞和非造血组织驻留γδT细胞。大多数血液驻留γδT细胞表达Vδ2TCR，而此现象在组织驻留γδT细胞之中不太常见，后者更频繁地使用Vδ1和/或其他Vδ链。本发明提供了用如本文所述的编码所需转基因的病毒载体转导的γδT细胞。
在一些实施方案中，用作本发明描述的工程化的γδT细胞的来源的合适γδT细胞包括Vδ1细胞、Vδ2细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞和Vδ8细胞。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞群衍生自Vδ1细胞或Vδ2细胞群。在一些情况下，工程化的γδT细胞群衍生自非Vδ1/Vδ2T细胞群。在一些情况下，工程化的γδT细胞群衍生自混合Vδ1细胞和Vδ2细胞群。
本文所述的γδT细胞(例如，内源性γδT细胞或启动的γδT细胞)可缺少水疱性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)进入受体(例如，LDL)。γδT细胞(例如，内源性γδT细胞或启动的γδT细胞)可表达ASCT-1和/或ASCT-2。ASCT-1和/或ASCT-2的表达可允许用β逆转录病毒假型载体(例如，BaEV和RD114)进行的转导。VSV-G的表达的缺少可防止用VSV-G假型载体进行的转导。
在一个方面，本发明提供了一种工程化以表达一种或多种转基因的γδT细胞群，所述转基因可编码膜结合蛋白(例如，细胞表面受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)，αβTCR，天然细胞毒性受体(例如，NKp30、NKp44，或NKp46)、细胞因子受体(例如，IL-12受体)、趋化因子受体(例如，CCR2受体)和/或膜结合配体或细胞因子(例如，膜结合IL-15、膜结合IL-7、膜结合CD40L、膜结合4-1BB、膜结合4-1BBL、膜结合CCL19)、可溶性蛋白(例如，可溶性配体或细胞因子，例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL和/或可溶性CCL19)、可选择标志物(例如，报告基因)，或自杀基因。在一些情况下，本发明提供了一种工程化以表达CAR和一种或多种额外转基因编码的蛋白质(例如，装甲蛋白)的γδT细胞群。在一些实施方案中，一种或多种转基因是密码子优化的。
在一些实施方案中，γδT细胞用编码转基因的病毒载体来转导。在一些实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体是慢病毒载体。在一些此类实施方案中，细胞可稳定表达转基因。在一些实施方案中，细胞可瞬时表达转基因。
在一个方面，本发明的特征在于工程化的γδT细胞的细胞群(例如，分离的细胞群)(例如，至少10、102、103、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012或1013个细胞)，其中细胞群的至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)是表达转基因(例如，CAR和/或一种或多种额外蛋白质)的工程化的γδT细胞。
收获和扩增γδT细胞的方法
本发明的工程化的γδT细胞可衍生自任何合适自体或同种异体γδT细胞或其群体。在一些实施方案中，用作本发明描述的工程化的γδT细胞的来源的合适γδT细胞包括Vδ1细胞、Vδ2细胞、Vδ3细胞、Vδ5细胞和Vδ8细胞。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞群衍生自Vδ1细胞或Vδ2细胞群。
例如，本文提供了用于分离和扩增来自非造血组织诸如皮肤或肠道的Vδ1细胞的方法。在其他实施方案中，合适γδT细胞可衍生自血液(例如，外周血液)。分离和扩增来自血液的Vδ1细胞的方法包括例如在美国专利号9,499,788和国际专利公布号WO 2016/198480中描述的那些方法，所述专利各自以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，合适γδT细胞可衍生自肿瘤组织(例如，肿瘤浸润γδT细胞)。可选地，可被工程化以表达转基因的合适γδT细胞可根据以下描述的方法衍生自非造血组织。
分离和扩增来自血液的γδT细胞
在一些实施方案中，本发明的工程化的γδT细胞衍生自受试者的血液(例如，外周血液)。例如，工程化的γδT细胞可衍生自血液衍生的Vδ2细胞或血液衍生的Vδ1细胞。
在一些实施方案中，外周血液单核细胞(PBMC)可根据本领域已知的任何合适方法从受试者获得。PBMC可在IL-2存在下，在氨基双膦酸盐(例如，唑来膦酸)、合成磷酸抗原(例如，溴醇焦磷酸；BrHPP)、2M3B1PP或2-甲基-3-丁烯基-1-焦磷酸存在下培养一至两周以产生富集的Vδ2细胞群。可选地，固定的抗TCRγδ(例如，泛TCRγδ)可在IL-2存在下，诱导来自PBMC群的Vδ2细胞的优先扩增，例如持续大约14天。在一些实施方案中，来自PBMC的Vδ2细胞的优先扩增可在IL-2和IL-4存在下，在培养固定的抗CD3抗体(例如，OKT3)后实现。在一些实施方案中，在可溶性抗CD3、IL-2，和IL-4中传代培养之前，将前述培养物保持约七天。可选地，人工抗原呈递细胞可用于促进γδT细胞诸如Vδ2细胞的优先扩增。例如，在受照射的aAPC、IL-2和/或IL-21存在下培养的PBMC衍生的γδT细胞可扩增以产生γδT细胞群，其包括较高比例的Vδ2细胞、中等比例的Vδ1细胞和一些双阴性细胞。在前述方法的一些实施方案中，PBMC可进行预富集或后富集(例如，通过用TCRγδ特异性剂来正性选择或TCRαβ特异性剂的负性选择)。扩增γδT细胞诸如Vδ2细胞的此类方法和其他合适方法通过Deniger等人,Frontiers in Immunology 5,636:1-10,2014来详细描述，所述文献以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，Vδ1T细胞可被工程化以表达转基因(例如，异源靶向构建体)。可使用获得Vδ1T细胞群的任何合适方法。例如，以引用方式整体并入本文的Almeida等人(Clinical Cancer Research,22,23；5795-5805,2016)提供了获得可被工程化以表达本文所述的异源靶向构建体的Vδ1T细胞群的合适方法。例如，在一些实施方案中，PBMC使用磁珠分选来预富集，可产生大于90％γδT细胞。这些细胞可在透气生物反应袋中，在一种或多种因子(例如，TCR激动剂、辅助受体激动剂和/或细胞因子，例如IL-4、IL-15和/或IFN-γ)存在下培养多达21天或更长时间。此方法的变化形式和获得Vδ1T细胞的其他方法适合作为本发明的一部分。例如，血液衍生的Vδ1T细胞能够可选地使用例如在美国专利号9,499,788和国际专利公布号WO 2016/198480中描述的方法来获得，所述文献各自以引用方式整体并入本文。
分离和扩增来自非造血组织的非造血组织驻留γδT细胞
如下所述获得的非造血组织驻留γδT细胞可以是本文所述的转基因的合适媒介物，因为其可表现出良好的肿瘤渗透和保留能力。用于分离和扩增非造血组织驻留γδT细胞的更详细方法可发现于例如PCT公布号WO 2020/095058、WO 2020/095059、WO 2017/072367，和GB申请号2006989.4中，所述专利各自以引用方式整体并入本文。
非造血组织驻留γδT细胞(例如，皮肤衍生的γδT细胞和/或非Vδ2T细胞，例如，Vδ1T细胞和/或DN T细胞)可分离自任何人或非人动物非造血组织，所述组织可从患者取出以获得适合于根据本发明的方法进行工程化的细胞。在一些实施方案中，衍生和扩增γδT细胞的非造血组织是皮肤(例如，人皮肤)，其可通过本领域已知的方法来获得。在一些实施方案中，皮肤通过穿刺活检来获得。可选地，分离和扩增本文提供的γδT细胞的方法可应用于胃肠道(例如，结肠)、乳腺、肺、前列腺、肝、脾和胰腺。γδT细胞还可驻留于人癌症组织，例如，乳腺或前列腺的肿瘤中。在一些实施方案中，γδT细胞可来自人癌症组织(例如，实体肿瘤组织)。在其他实施方案中，γδT细胞可来自除了人癌症组织以外的非造血组织(例如，没有大量肿瘤细胞的组织)。例如，γδT细胞可来自与附近或相邻癌症组织分开的皮肤(例如，健康皮肤)区域。
在血液中占优势的γδT细胞主要是Vδ2T细胞，而在非造血组织中占优势的γδT细胞主要是Vδ1T细胞，以致于Vδ1T细胞占非造血组织驻留γδT细胞群的约70％-80％。然而，一些Vδ2T细胞还存在于非造血组织例如肠道中，其中所述细胞可占γδT细胞的约10％-20％。驻留于非造血组织中的一些γδT细胞既不表达Vδ1，也不表达Vδ2TCR，并且将其命名为双阴性(DN)γδT细胞。这些DNγδT细胞可能主要是Vδ3表达T细胞，并且少数是Vδ5表达T细胞。因此，通常驻留于非造血组织中并通过本发明的方法来扩增的γδT细胞优选地是非Vδ2T细胞，例如，Vδ1T细胞，并且包含较少量的DNγδT细胞。
在一些实施方案中，关键步骤是例如在培养几天或几周之后，将非造血组织驻留T细胞(例如，在混合淋巴细胞群体内，所述群体可例如包括αβ细胞、自然杀手(NK)细胞、B细胞，以及γδ2和非γδ2T细胞)与从其中获得T细胞的组织的非造血细胞(例如，基质细胞，尤其成纤维细胞)人为地分离开来。这允许在之后几天和几周中，非造血组织衍生的Vδ1T细胞和DNγδT细胞的优先和快速扩增。
通常，非造血组织驻留γδT细胞能够在去除与基质细胞(例如，皮肤成纤维细胞)的物理接触后自发扩增。因此，如上所述的基于支架的培养方法可用于诱导此种分离，从而导致γδT细胞去抑制以触发扩增。因此，在一些实施方案中，在扩增步骤期间，不存在实质性TCR途径活化(例如，在培养物中不包括外源性TCR途径活化剂)。此外，本发明提供了扩增非造血组织驻留γδT细胞的方法，其中所述方法不涉及与饲养细胞、肿瘤细胞和/或抗原呈递细胞接触。
扩增方案涉及在支持高效γδT细胞扩增的生物因子的有效混合物存在下，培养非造血组织驻留γδT细胞。在一个实施方案中，扩增γδT细胞的方法包括提供从非造血组织获得的γδT细胞群(例如，分离的非造血组织衍生的γδT细胞群，例如，根据本文所述的方法分离的群)以及在IL-2和IL-15，以及任选地IL-1β、IL-4和/或IL-21存在下，培养γδT细胞。这些细胞因子或其类似物可以有效产生扩增的γδT细胞群的量与细胞培养一定的持续时间(例如，至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天、至少10天、至少11天、至少12天、至少13天、至少14天、至少21天、至少28天，或更长时间，例如，5天至40天、7天至35天、14天至28天，或约21天)。
适合用于启动和/或扩增γδT细胞的许多基础培养基是可用的，诸如完全培养基，OPTMIZERTM、AIM-V、Iscoves培养基以及RPMI-1640(Life Technologies)和TEXMACSTM(Miltenyi Biotec)。培养基可补充有其他培养基因子，诸如血清、血清蛋白和选择性剂诸如抗生素。例如，在一些实施方案中，培养基包括RPMI-1640，其含有2mM谷氨酰胺、10％FBS、10mM HEPES，pH 7.2、1％青霉素-链霉素、丙酮酸钠(1mM；Life Technologies)、非必需氨基酸(例如，100μMGly、Ala、Asn、Asp、Glu、Pro和Ser；1X MEM非必需氨基酸LifeTechnologies)，和10μl/Lβ-巯基乙醇。便利地，细胞在37℃下，在含有5％ CO2的加湿气氛中，在合适培养基中培养。
γδT细胞可如本文描述在任何合适系统中培养，包括搅拌罐发酵罐、气升式发酵罐、滚瓶、培养袋或培养皿和其他生物反应器，诸如中空纤维生物反应器。此类系统的用途是本领域众所周知的。培养淋巴细胞的一般方法和技术是本领域众所周知的。
本文所述的方法可包括多于一个选择步骤，例如，多于一个耗竭步骤。通过负性选择来富集T细胞群可例如使用针对负性选择细胞所独有的表面标志物的抗体的组合来完成。一种方法是经由负性磁性免疫粘附的细胞分选和/或选择或流式细胞术，其使用针对存在于负性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。
转基因
本发明的工程化的γδT细胞被工程化以表达所需转基因。工程化以表达转基因的γδT细胞适合用于癌症治疗(例如，免疫疗法)。本文所述的病毒载体编码转基因，所述转基因然后在转导的γδT细胞中稳定或瞬时表达。可与本文所述的组合物和方法结合使用的转基因包括嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑色素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、g9d2，或其组合。
在一些情况下，待通过本发明的工程化的γδT细胞来表达的转基因包括可选择标志物(例如，报告基因)或自杀基因。例如，缺少胞内信号传导结构域的截短的表皮生长因子受体(EGFR)可用作转基因，所述转基因用于在发生例如毒性时使用抗EGFR单克隆抗体来进行体内耗竭。类似地，CD20可用作转基因，用于使用抗CD20单克隆抗体来进行体内耗竭。另一种示例性转基因是促进施用的工程化的γδT细胞的药物介导的控制的自杀基因。在发生不良事件时，通过使用自杀基因，修饰的细胞可从患者体内耗竭。在一个实例中，药物结合结构域融合至胱天蛋白酶9促细胞凋亡分子。在一些情况下，转基因是胞嘧啶脱氨酶。在一些情况下，转基因是胸苷激酶。
另外地或可选地，通过本发明的工程化的γδT细胞来表达的转基因编码膜结合蛋白，诸如膜结合受体(例如，αβTCR、天然细胞毒性受体(例如，NKp30、NKp44或NKp46)、细胞因子受体(例如，IL-12受体)和/或趋化因子受体(例如，CCR2受体)和/或膜结合配体或细胞因子(例如，膜结合IL-15、膜结合IL-7、膜结合CD40L、膜结合4-1BB、膜结合4-1BBL、膜结合CCL19)。膜结合配体和细胞因子包括天然膜结合配体和细胞因子(例如，反式呈递的IL-15和4-1BBL)和合成膜结合构型(例如，人工融合至跨膜蛋白的配体)。另外地或可选地，待通过本发明的工程化的γδT细胞来表达的转基因编码可溶性蛋白，诸如可溶性配体或细胞因子(例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL和/或可溶性CCL19)。
在一些情况下，具有编码CAR的转基因的工程化的γδT细胞可用有助于免疫原性的额外转基因来装甲。此类装甲CAR T细胞表达装甲蛋白，诸如本文所述的膜结合或可溶性蛋白中的任一种。例如，装甲蛋白包括膜结合蛋白，诸如膜结合受体(例如，αβTCR、天然细胞毒性受体(例如，NKp30、NKp44或NKp46)、细胞因子受体(例如，IL-12受体)和/或趋化因子受体(例如，CCR2受体)和/或膜结合配体或细胞因子(例如，膜结合IL-15、膜结合IL-7、膜结合CD40L、膜结合4-1BB、膜结合4-1BBL、膜结合CCL19)。另外地或可选地，待通过本发明的工程化的γδCAR T细胞来表达的装甲蛋白包括可溶性蛋白，诸如可溶性配体或细胞因子(例如，可溶性IL-15、可溶性IL-7、可溶性IL-12、可溶性CD40L、可溶性4-1BBL和/或可溶性CCL19)。
在一些实施方案中，本发明的工程化的γδT细胞被工程化以表达一种或多种转基因(例如，本文所述的任一转基因中的一种或多种)，用于装甲γδT细胞(例如，呈装甲CAR T细胞形式，如Yeku和Brentjens Biochem.Soc.Trans.2016,15:44,2,412-418所描述，其以引用方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，转基因是密码子优化的。
在一些实施方案中，工程化的γδT细胞(例如，Vδ1或Vδ2细胞)群的至少3％(例如，至少4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)表达转基因，例如，CAR或其他膜结合或可溶性蛋白。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞(例如，Vδ1或Vδ2细胞)群的至少10％(例如，至少10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)表达转基因，例如，CAR或其他膜结合或可溶性蛋白。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞(例如，Vδ1或Vδ2细胞)群的至少50％(例如，至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或基本上全部)表达转基因，例如，CAR或其他膜结合或可溶性蛋白。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞(例如，Vδ1或Vδ2细胞)群的3％-95％(例如，5％-95％、10％-95％、20％-95％、25％-95％或50％-95％)表达转基因，例如，CAR或其他膜结合或可溶性蛋白。在一些实施方案中，工程化的γδT细胞(例如，Vδ1或Vδ2细胞)群的3％-90％(例如，5％-90％、10％-90％、20％-90％、25％-90％或50％-90％)表达转基因，例如，CAR或其他膜结合或可溶性蛋白。
实施例
材料和方法
逆转录病毒载体产生和滴定
慢病毒载体通过使用第三代自身失活性载体平台来瞬时转染HEK293细胞而产生，所述平台由基因组(GFP或抗CD19嵌合抗原受体)、gag/pol、逆转录酶(rev)和包膜(VSV-G、BaEV)编码质粒组成。
γ逆转录病毒载体通过用鼠白血病病毒基因组质粒(GFP或抗CD19嵌合抗原受体)来瞬时转染FLYRD18细胞而产生。载体在转染后48小时收获，通过0.45um孔径聚醚砜(PES)过滤器过滤并使用低速离心(在4℃下，6,000g)来浓缩。
载体滴度通过在聚凝胺(8ug/mL)存在下，用浓缩载体材料的连续稀释液来转导人宫颈癌细胞系(HeLa)而确定。转导效率在转导后三天使用BD FACS Lyric流式细胞仪来确定。感染滴度(TU/mL)使用下式来计算：TU/mL＝((转导的细胞的数量)x载体稀释度x(％转导效率/100))/载体体积(mL)。
流式细胞术
免疫表型分型使用BD FACS Lyric流式细胞仪来执行。细胞使用PerCP-Vio700抗TCRα/β(Miltenyi)、APC抗TCRγ/δ(Miltenyi)和VioBlue抗TCR Vδ1(Miltenyi)抗体，针对表面标志物的表达来分析。活细胞使用eFluor 780可固定活性染料来检测。CAR19表达使用FITC标记的人CD19蛋白(AcroBiosystems)来检测。
γδT细胞分离和扩增
Vδ1γδT细胞富集的产物(GDX012)使用基于Almeida等人Clin.Cancer Res.22:5795-804,2016的修改方案来产生。简言之，αβ耗竭的外周血液单核细胞使用补充有2.5％自体血浆和Glutamax(ThermoFisher)的无血清培养基(CTS OpTmizer,Thermo Fisher)来扩增。分离细胞在重组IL-4[rIL4](100ng/mL)、重组干扰素-γ[rIFNγ](70ng/mL)、重组IL-21[rIL21](7ng/mL)、重组IL-1β[rIL1β](15ng/mL，和可溶性OKT-3抗CD3单克隆抗体(70ng/mL)存在下生长。细胞在37℃和5％ CO2下，在加湿孵育器中孵育。定期用含有重组IL-15[rIL15](70ng/mL)、IFNγ(30ng/mL)，和OKT3(1mg/mL)的新鲜培养基喂养扩增细胞。
逆转录病毒转导
扩增γδT细胞用逆转录病毒载体以定义的感染复数(MOI)来转导。MOI是指在转导期间每个细胞所添加的感染颗粒的数量(通过流式细胞术来测量)。γδT细胞(1E+06/mL)在纤维连接蛋白涂布(20μg/mL)的非组织培养物处理的24孔板中或在载体融合素(1μg/mL)存在下在24孔板中进行转导。病毒载体在补充有细胞因子、OKT-3和2.5％自体血浆(如上述)的CTS OpTmizer培养基中稀释。γδT细胞和载体原液在37℃下以1,000x g旋转接种2小时。转导效率在转导后三天之后，每隔一定间隔使用流式细胞术来确定。在某些实验中，为了抑制逆转录酶活性，培养基补充有10μM最终浓度的奈韦拉平(NVP)，一种非核苷逆转录酶抑制剂。
实施例1.广泛趋向性VSV-G假型慢病毒载体不能转导γδT细胞
GFP编码慢病毒载体分别用水疱性口炎病毒G(VSV-G)或狒狒内源性病毒(BaEV)包膜来假型化。扩增的γδT细胞(由Vδ1、Vδ2和非Vδ1/Vδ2细胞组成)用浓缩病毒载体原液以定义的感染复数(MOI)来转导。转导效率在转导后三天使用流式细胞术来确定。
流式细胞术分析显示VSV-G假型慢病毒载体即使在高MOI(MOI 50及以上，图1A)下也未能转导γδT细胞。相反，用BaEV包膜的慢病毒载体进行的转导即使在低感染复数下也产生高转导效率(图1B)。用逆转录酶抑制剂NVP预处理γδT细胞消除了GFP表达，指示GFP表达是Vδ1细胞中成功转导和GFP表达的结果。
实施例2.用VSV-G假型CAR编码慢病毒载体转导Vδ1γδT细胞导致假转导
为了确定CAR表达是否是载体整合或假转导的结果，在存在或不存在奈韦拉平(NVP)的情况下，用嵌合抗原受体编码慢病毒载体来转导Vδ1γδT细胞。奈韦拉平是通过抑制病毒RNA逆转录成cDNA来阻断病毒转导的逆转录酶抑制剂。因此，在奈韦拉平存在下，孵育暴露于慢病毒载体的细胞应减少转基因表达。当在奈韦拉平存在下进行用BaEV假型载体的转导时，CAR表达完全消除，证明CAR表达不由假转导产生(图4B和图6)。相反，在用VSV-G假型慢病毒载体转导的细胞中，用奈韦拉平处理Vδ1细胞不消除CAR表达。此结果证明VSV-G假型载体不能够转导Vδ1细胞，并且转基因(CAR)表达是假转导的结果。假转导通过在转导之后的延长时间段内(转导后4和8天)监测CAR表达来进一步确认。通过FACS分析监测载体处理的细胞显示，CAR表达随着时间推移而逐渐丧失(图2A)。此现象也在存在或不存在NVP的情况下，在各种感染复数下得以证明(图2B)。总之，结果表明VSV-G假型慢病毒载体不能进入γδT细胞。
实施例3.细胞因子启动是BaEV假型慢病毒载体的Vδ1γδT细胞转导的主要决定因素
为了研究BaEV转导效率是否取决于γδT细胞扩增期间细胞因子启动的长度，在细胞扩增过程期间的不同时间点转导Vδ1细胞。细胞在开始培养(第0天)或在扩增阶段的第7天、第10天、第14天和第15天以MOI＝1进行转导。转导后三天，转导的细胞通过流式细胞术来分析GFP表达。转导效率在细胞扩增阶段期间逐渐增加并且在第15天达到最高转导水平(图3A)。用NVP处理细胞证明GFP表达是成功载体整合的结果(图3B)。总之，结果表明初始“细胞因子启动"阶段是通过BaEV假型慢病毒载体的成功Vδ1转导必不可少的。
实施例4.Vδ1γδT细胞的转导效率与感染复数(MOI)相关
为了研究BaEV转导效率是否取决于病毒载体剂量(MOI)，用递增量的BaEV包膜假型抗CD19嵌合抗原受体(CAR)编码慢病毒载体来转导Vδ1γδT细胞。转导后三天，细胞通过流式细胞术来分析CAR表达。增加MOI显著增加转导的Vδ1细胞的比例(图4A)。在存在或不存在NVP的情况下以MOI＝5进行的CAR转导的代表性点图示于图4B中。
实施例5.BaEV假型慢病毒载体转导Vδ1和非Vδ1(Vδ2、Vδ3)γδT细胞
为了测试BaEV假型载体是否专门转导Vδ1细胞或也可转导其他γδT细胞亚型，在泛-γδ和Vδ1细胞群内确定转导效率。将γδT细胞扩增并且在扩增第10天用GFP或CAR编码BaEV包膜的慢病毒载体以MOI＝1来转导。使用泛-γδ和Vδ1特异性抗体的FACS分析显示BaEV包膜的载体转导Vδ1和非Vδ1(Vδ2、Vδ3和其他)γδT细胞(图5)。
实施例6.用BaEV假型慢病毒载体转导Vδ1γδT细胞可通过重复转导来进一步增强
进行研究来确定连续转导是否可进一步增强扩增的Vδ1γδT细胞中CAR的表达。为此目的，Vδ1细胞以MOI＝1转导一次(第10天)或两次(第10天和第11天)。三天后，将细胞收集并通过FACS来分析。流式细胞术分析显示Vδ1细胞可用单一载体命中来高效地转导，此效应可通过连续两天的双重转导来进一步增强(图6)。
实施例7.在载体融合素存在下的转导与在纤维连接蛋白存在下一样高效
为了测试转导增强剂的选择是否对Vδ1转导效率具有任何影响，评估了两种广泛地使用的转导增强剂(纤维连接蛋白和载体融合素)。在细胞扩增的第10天，Vδ1细胞在纤维连接蛋白或载体融合素存在下以各种MOI来转导并且转导效率在转导后三天确定。FACS分析显示载体融合素与纤维连接蛋白一样高效地增加逆转录病毒基因转移(图7)。
实施例8.Vδ1细胞可用RD114假型病毒载体来转导
为了测试Vδ1γδT细胞是否可通过其他β逆转录病毒病毒包膜假型载体来转导，还用RD114包膜假型γ逆转录病毒载体转导Vδ1γδT细胞。细胞如前述进行扩增并且在扩增的第10天以MOI＝1来转导。FACS分析显示与BaEV假型慢病毒载体类似，RD114包膜的γ逆转录病毒载体能够以高效率来转导Vδ1γδT细胞(图8)。
其他实施方案
本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度犹如每个独立公布或专利申请均具体地且单独地被指示为以引用方式并入一样。
虽然本发明结合其特定实施方案来描述，但是应理解其能够进一步修改并且本申请意图涵盖通常遵循本发明的原则并且包括与本公开的此类背离的本发明的任何变化、用途或调适，所述背离在本发明涉及的领域内的已知或惯常实践内并且可应用于以上阐明，并在权利要求范围内遵循的必需特征。
其他实施方案在权利要求内。
Claims (119)
1.一种产生工程化的γδT细胞群的方法，所述方法包括用包含β逆转录病毒假型和逆转录病毒科病毒载体骨架的病毒载体来转导γδT细胞群。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是狒狒内源性病毒(BaEV)。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是RD114。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述逆转录病毒科病毒载体骨架是逆转录病毒载体骨架。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是慢病毒骨架。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是γ逆转录病毒骨架。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是α逆转录病毒骨架。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是Vδ1T细胞。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是Vδ2T细胞。
10.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是非Vδ1/Vδ2T细胞。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含转基因。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述转基因编码细胞表面受体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞表面受体是嵌合抗原受体(CAR)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、滑膜肉瘤X断点2(SSX2)、黑色素瘤抗原(MAGE)、由T细胞识别的黑色素瘤抗原1(MART-1)、gp100、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、g9d2，或其组合。
15.如权利要求11至14中任一项所述的方法，其中所述转基因编码细胞因子。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞因子是分泌的。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合的。
18.如权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15。
19.一种产生工程化的γδT细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供起始γδT细胞群；
(ii)在不存在病毒载体的情况下，培养所述起始γδT细胞群持续第一培养期以产生启动的γδT细胞群；以及
(iii)在有效转导至少3％的所述启动的γδT细胞的量的包含β逆转录病毒假型的病毒载体存在下，培养所述启动的γδT细胞群持续第二培养期，由此产生所述工程化的γδT细胞群。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一培养期为1天或更长时间。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述第一培养期为2天或更长时间。
22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述第二培养期为2天或更长时间。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述第二培养期为3天或更长时间。
24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述启动的γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。
25.如权利要求19至24中任一项所述的方法，其中所述启动的γδT细胞群缺少VSV-G进入受体的功能性表达。
26.如权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述病毒载体的量有效转导至少20％的所述启动的γδT细胞。
27.如权利要求19至26中任一项所述的方法，其中所述病毒载体以不大于10的感染复数(MOI)与所述启动的γδT细胞一起培养。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述MOI不大于5。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述MOI为1至5。
30.一种产生工程化的γδT细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供起始γδT细胞群；以及
(ii)在IL-15和有效转导至少3％的所述起始γδT细胞群的量的包含β逆转录病毒假型的病毒载体存在下，培养所述起始γδT细胞群，由此产生所述工程化的γδT细胞群。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述起始γδT细胞群缺少ASCT-1或ASCT-2的表达。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述起始γδT细胞群缺少ASCT-1和ASCT-2的表达。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中所述起始γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述起始γδT细胞群缺少VSV-G进入受体的表达。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述VSV-G进入受体是LDL受体。
36.如权利要求30至35中任一项所述的方法，其中所述病毒载体以不大于10的MOI与所述起始γδT细胞群一起培养。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述MOI为1至10。
38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述MOI不大于5。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述MOI为1至5。
40.如权利要求19至39中任一项所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是BaEV。
41.如权利要求19至39中任一项所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是RD114。
42.如权利要求19至41中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒科病毒载体骨架。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述逆转录病毒科病毒载体骨架是逆转录病毒载体骨架。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是慢病毒骨架。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是γ逆转录病毒骨架。
46.如权利要求43所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是α逆转录病毒骨架。
47.如权利要求19至46中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是Vδ1T细胞。
48.如权利要求19至46中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是Vδ2T细胞。
49.如权利要求19至46中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是非Vδ1/Vδ2T细胞。
50.如权利要求19至49中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含转基因。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述转基因编码细胞表面受体。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述细胞表面受体是CAR。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2，或其组合。
54.如权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述转基因编码细胞因子。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述细胞因子是分泌的。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合的。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15。
58.一种产生表达CAR的γδT细胞群的方法，所述方法包括用病毒载体来转导γδT细胞群，所述病毒载体包含：
(i)编码所述CAR的转基因；
(ii)β逆转录病毒假型；和
(iii)逆转录病毒科病毒载体骨架。
59.一种产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群的方法，所述方法包括用病毒载体来转导γδT细胞群，所述病毒载体包含：
(i)编码所述CAR的第一转基因；
(ii)编码所述装甲蛋白的第二转基因；
(iii)β逆转录病毒假型；和
(iv)逆转录病毒科病毒载体骨架。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述装甲蛋白是细胞因子。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述细胞因子是分泌的。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合的。
63.如权利要求60至62中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15。
64.如权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是BaEV。
65.如权利要求58至63中任一项所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是RD114。
66.如权利要求58至65中任一项所述的方法，其中所述逆转录病毒科病毒载体骨架是逆转录病毒载体骨架。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是慢病毒骨架。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是γ逆转录病毒骨架。
69.如权利要求66所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是α逆转录病毒骨架。
70.如权利要求58至69中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞是Vδ1T细胞。
71.如权利要求58至69中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞是Vδ2T细胞。
72.如权利要求58至69中任一项所述的方法，其中所述γδT细胞是非Vδ1/Vδ2T细胞。
73.一种产生表达CAR的γδT细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供起始γδT细胞群；
(ii)在不存在病毒载体的情况下，培养所述起始γδT细胞群持续第一培养期以产生启动的γδT细胞群；以及
(iii)在包含β逆转录病毒假型和编码所述CAR的转基因的病毒载体存在下，培养所述启动的γδT细胞群持续第二培养期，其中所述病毒载体的量有效转导至少3％的所述启动的γδT细胞，由此产生表达所述CAR的所述γδT细胞群。
74.一种产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供起始γδT细胞群；
(ii)在不存在病毒载体的情况下，培养所述起始γδT细胞群持续第一培养期以产生启动的γδT细胞群；以及
(iii)在包含β逆转录病毒假型、编码所述CAR的第一转基因，和编码所述装甲蛋白的第二转基因的病毒载体存在下，培养所述启动的γδT细胞群持续第二培养期，其中所述病毒载体的量有效转导至少3％的所述启动的γδT细胞，由此产生表达所述CAR和所述装甲蛋白的所述γδT细胞群。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述装甲蛋白是细胞因子。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述细胞因子是分泌的。
77.如权利要求75所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合的。
78.如权利要求74至77中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15。
79.如权利要求73至78中任一项所述的方法，其中所述第一培养期为7天或更长时间。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述第一培养期为10天或更长时间。
81.如权利要求73至80中任一项所述的方法，其中所述第二培养期为7天或更长时间。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述第二培养期为14天或更长时间。
83.如权利要求73至82中任一项所述的方法，其中所述启动的γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。
84.如权利要求78至83中任一项所述的方法，其中所述启动的γδT细胞群缺少VSV-G进入受体的功能性表达。
85.如权利要求73至84中任一项所述的方法，其中所述病毒载体的量有效转导至少20％的所述启动的γδT细胞。
86.如权利要求73至85中任一项所述的方法，其中所述病毒载体以不大于10的MOI与所述启动的γδT细胞一起培养。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述MOI不大于5。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述MOI为1至5。
89.一种产生表达CAR的γδT细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供起始γδT细胞群；以及
(ii)在IL-15和包含β逆转录病毒假型和编码所述CAR的转基因的病毒载体存在下，培养所述起始γδT细胞群，其中所述病毒载体的量有效转导至少3％的所述起始γδT细胞群，由此产生表达所述CAR的工程化的γδT细胞群。
90.一种产生表达CAR和装甲蛋白的γδT细胞群的方法，所述方法包括：
(i)提供起始γδT细胞群；以及
(ii)在IL-15和包含β逆转录病毒假型、编码所述CAR的第一转基因，和编码所述装甲蛋白的第二转基因的病毒载体存在下，培养所述起始γδT细胞群，其中所述病毒载体的量有效转导至少3％的所述起始γδT细胞群，由此产生表达所述CAR和所述装甲蛋白的工程化的γδT细胞群。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述装甲蛋白是细胞因子。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述细胞因子是分泌的。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述细胞因子是膜结合的。
94.如权利要求91至93中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15。
95.如权利要求89至94中任一项所述的方法，其中所述起始γδT细胞群缺少ASCT-1或ASCT-2的表达。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述起始γδT细胞群缺少ASCT-1或ASCT-2的表达。
97.如权利要求89至96所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞群表达ASCT-1和/或ASCT-2。
98.如权利要求89至97中任一项所述的方法，其中所述起始γδT细胞群缺少VSV-G进入受体的功能性表达。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述VSV-G进入受体是LDL受体。
100.如权利要求89至99中任一项所述的方法，其中所述病毒载体以不大于10的MOI与所述起始γδT细胞群一起培养。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述MOI不大于5。
102.如权利要求101所述的方法，其中所述MOI为1至5。
103.如权利要求73至102中任一项所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是BaEV。
104.如权利要求73至102中任一项所述的方法，其中所述β逆转录病毒假型是RD114。
105.如权利要求73至104中任一项所述的方法，其中所述病毒载体包含逆转录病毒科病毒载体骨架。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述逆转录病毒科病毒载体骨架是逆转录病毒载体骨架。
107.如权利要求106所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是慢病毒骨架。
108.如权利要求106所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是γ逆转录病毒骨架。
109.如权利要求106所述的方法，其中所述逆转录病毒载体骨架是α逆转录病毒骨架。
110.如权利要求73至109中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是Vδ1T细胞。
111.如权利要求73至109中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是Vδ2T细胞。
112.如权利要求73至109中任一项所述的方法，其中所述工程化的γδT细胞是非Vδ1/Vδ2T细胞。
113.如权利要求58至112中任一项所述的方法，其中所述CAR靶向CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gpl20、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-llRα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、组合HER2-HER3、组合HER1-HER2、NY-ESO-1、SSX2、MAGE、MART-1、gp100、PSA、PSMA、PSCA、g9d2，或其组合。
114.一种工程化的γδT细胞群，其通过如权利要求1至57中任一项所述的方法来产生。
115.如权利要求114所述的工程化的γδT细胞群，其中至少10％的所述群体表达CAR。
116.如权利要求115所述的工程化的γδT细胞群，其中至少10％的所述群体表达CAR和装甲蛋白。
117.如权利要求115或116所述的工程化的γδT细胞群，其中至少50％的所述群体表达所述CAR。
118.如权利要求115至117中任一项所述的工程化的γδT细胞群，其中至少50％的所述群体表达所述CAR和所述装甲蛋白。
119.一种表达CAR的γδT细胞群，其通过如权利要求58至113中任一项所述的方法来产生。
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