MXPA03005624A

MXPA03005624A - Metodos para clonar mamiferos usando cromatina reprogramada del donador o celulas donadoras.

Info

Publication number: MXPA03005624A
Application number: MXPA03005624A
Authority: MX
Inventors: Kasinathan P
Original assignee: Vaurox Llc
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2004-12-03
Also published as: EP1356035B1; JP4420604B2; CN100448991C; JP2004516835A; US7253334B2; US20030046722A1; NZ525607A; KR20030082555A; ATE502106T1; CA2427322C; AU2002232858B2; EP1356035A1; WO2002051997A1; HK1066028A1; CN1498269A; KR100832943B1; DE60144248D1; CA2427322A1; US20060212952A1; EP1356035A4

Abstract

La invencion provee metodos para clonar mamiferos, que permiten que los cromosomas del donador o las celulas del donador sean reprogramadas antes de insercion a un oocito enucleado. La invencion tambien incorpora metodos de insertar cromosomas o nucleos en celulas receptoras.

Description

MÉTODOS PARA CLONAR MAMÍFEROS USANDO CROMATINA REPROGRAMADA DEL DONADOR O CÉLULAS DONADORAS Antecedentes de la Invención En general, la invención proporciona métodos mejorados para clonar mamíferos, y métodos para insertar cromosomas, núcleos, o masas de cromatina en las células receptoras. La clonación de mamíferos permite la producción de múltiples mamíferos con un contenido de ADN idéntico. El material genético del donador utilizado para generar estos mamíferos se puede seleccionar o diseñar de tal manera que los mamíferos clonados tengan propiedades deseables, tales como una mayor resistencia a las enfermedades. Desafortunadamente, la eficiencia de la clonación de mamíferos utilizando células somáticas donadoras, generalmente es baja, dando como resultado que solamente aproximadamente el 1 al 2 por ciento de los embriones del trasplante nuclear se desarrollen hasta término (Polejaeva y colaboradores, Nature 407 : 86-90 , 2000). Un problema significativo con la clonación es la pérdida de embarazos a término medio a tardío, y la baja viabilidad de la progenie. Por consiguiente, se necesitan métodos para eficientes para clonar mamíferos . Estos métodos mejorados pueden reducir el costo y tiempo requeridos para generar una progenie viable múltiple.

Compendio de la Invención, El propósito de la presente invención es proporcionar métodos mejorados para clonar mamíferos. En particular, estos métodos involucran la condensación de un núcleo del donador en una masa de cromatina para permitir la liberación de los componentes nucleares, tales como los factores de transcripción que pueden promover la transcripción de los genes que sean indeseables para el desarrollo del embrión del trasplante nuclear, en una progenie viable. En un método relacionado, se incuba una célula permeabilizada con un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) para permitir la adición o remoción de factores de la célula, y luego se libera la membrana de plasma de la célula permeabilizada para encerrar los factores deseados y restablecer la integridad de la membrana de la célula. Si se desea, se pueden repetir los pasos de cualquiera de estos métodos una o más veces, o se pueden llevar a cabo diferentes métodos de reprogramación en secuencia para incrementar el grado de reprogramación, dando como resultado una mayor viabilidad de los fetos clonados . La invención también proporciona métodos para generar embriones quiméricos en los que algo o todo el tejido placentario es a partir de una fuente genética, o la mayor parte del tejido fetal es a partir de otra fuente genética. Estos embriones quiméricos pueden tener anormalidades placentarias, y por lo tanto, pueden tener un mayor índice de sobrevivencia. En adición, se ha desarrollado un método novedoso para la inserción de la masa de cromatina o de un núcleo en el oocito receptor, que implica el uso de compuestos fusigénicos . De conformidad con lo anterior, en un primer aspecto, la invención proporciona un método para clonar un mamífero. Este método involucra: (a) incubar un núcleo de donador que tenga menos de cuatro pares de cromosomas homólogos (es decir, que tengan menos de dos pares de cromátidos completos) bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina sin ocasionar la réplica del ADN, (b) insertar la masa de cromatina en un oocito enucleado, formando de esta manera un oocito de transferencia nuclear, y (c) transferir el oocito e transferencia nuclear o un embrión formado a partir del oocito de transferencia nuclear al útero de un mamífero anfitrión, bajo condiciones que permitan que el oocito de transferencia nuclear o el embrión se desarrolle hasta un feto. En una modalidad preferida, el núcleo del donador se incuba con un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) bajo condiciones que permitan que se agreguen o se remuevan los componentes nucleares o citoplásmi-cos, tales como factores de transcripción, proteínas represoras, o proteínas de remodelación de cromatina, del núcleo o de la masa de cromatina resultante. De preferencia, el núcleo del donador se pone en contacto con una o más de las siguientes condiciones, que permiten la formación de una masa de cromatina: un extracto mitótico en la presencia o en ausencia de un anti-cuerpo anti-NuMA, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína. En otras modalidades preferidas, el oocito reconstituido o el embrión resultante expresa lamina A, lamina C, o la proteína NuMA en un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un oocito de control o un embrión de control con el mismo número de células y de la misma especie . En un aspecto relacionado, la invención proporciona otro método para clonar un mamífero. Este método involucra la, incubación de una célula permeabilizada con un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) bajo condiciones que permitan la remoción de un factor (por ejemplo, un componente nuclear o citoplásmico, tal como un factor de transcripción) a partir de un núcleo, una masa de cromatina, o un cromosoma de la célula permeabilizada, o la adición de un factor al núcleo, a la masa de cromatina, o al cromosoma, formando de esta manera una célula reprogramada. La célula reprogramada se inserta en un oocito enucleado, y el oocito resultante o un embrión formado a partir del oocito, se transfiere al útero de un mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que se desarrolle el oocito o el embrión hasta un feto. En las modalidades preferidas, la célula permeabilizada se pone en contacto con una o más de las siguientes condiciones que permiten la formación de una masa de cromatina: un extracto mitótico en la presencia o en ausencia de un anti-cuerpo anti-NuMA, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína. En todavía otra modalidad preferida, la célula permeabilizada se incuba con un medio de reprogramación de interfase (por ejemplo, un extracto celular de interfase) . En todavía otra modalidad preferida, el núcleo de la célula permeabilizada permanece enlazado a la membrana, y los cromosomas del núcleo no se condensan durante la incubación con este medio de reprogramación de interfase . En algunas modalidades, la incubación de la célula permeabilizada en el medio de reprogramación no ocasiona la réplica del ADN, o solamente ocasiona la réplica del ADN en menos del 50, 40, 30, 20, 10, o 5 por ciento de las células. En otras modalidades, la incubación de-la célula permeabilizada en el medio de reprogramación ocasiona la réplica del ADN en cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células. En diferentes modalidades, la célula permeabilizada se forma mediante la incubación de una célula intacta con un detergente, tal como digitonina, o una toxina bacteriana, tal como Estreptolisina O. En todavía otra modalidad preferida, la célula reprogramada se incuba bajo condiciones que permitan que la membrana de la célula reprogramada vuelva a sellar antes de insertarse en el oocito. En otras modalidades preferidas, el oocito reconstituido o el embrión resultante expresa lamina A, lamina C, o la proteína NuMA en un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un oocito de control o un embrión de control con el mismo número de células y de la misma especie. La invención también proporciona métodos para clonar un mamífero, que involucran el uso de células a partir de dos embriones diferentes. Por ejemplo, las células de un embrión de transferencia nuclear (por ejemplo, un embrión formado mediante la inserción de una célula, núcleo, o masa de cromatina en un oocito enucleado) se pueden combinar con las células de un embrión fertilizado in vitro, que se presente naturalmente, o partenogenéticamente activado. De preferencia, la mayoría de las células y su progenie a partir del embrión de transferencia nuclear se incorporan en el tejido fetal del embrión quimérico resultante. Cuando menos algunas de las células y su progenie a partir del segundo embrión de preferencia se incorporan en el tejido placentario, y promueven la viabilidad del embrión quimérico resultante. De conformidad con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona un método para clonar un mamífero, que involucra insertar una célula, núcleo, o masa de cromatina en un oocito enucleado, formando de esta manera un primer embrión. Una o más células del primer embrión se ponen en contacto con una o más células de un segundo embrión fertilizado in vitro, que se presente naturalmente, o partenogenéticamente activado, formando un tercer embrión. El tercer embrión se transfiere al útero de un mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que se desarrolle el tercer embrión hasta un feto. En una modalidad, cuando menos uno del primer embrión y el segundo embrión es un embrión de compactación . En otra modalidad, el primer embrión y el segundo embrión están en diferentes etapas celulares. El primer embrión y la célula donadora utilizada para producir el segundo embrión, pueden ser de la misma especie o de diferentes géneros o especies. De preferencia, cuando menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células en el trofectoderma o en el tejido placentario del feto, se derivan a partir del segundo embrión, o cuando menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células en la masa celular interna o en el tejido fetal del feto, se derivan a partir del primer embrión. En otras modalidades preferidas, el primer embrión o el tercer embrión expresan lamina A, lamina C, o la proteína NuMA en un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un embrión de control con el mismo número de células y de la misma especie . En un aspecto relacionado, la invención proporciona otro método para clonar un mamífero. Este método involucra poner en contacto un núcleo de donador con un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina, e insertar la masa de cromatina en un oocito enucleado, formando de esta manera un primer embrión. Una o más células del primer embrión se ponen en contacto con una o más células de un segundo embrión fertilizado in vitro, que se presente naturalmente, o parteno-genéticamente activado, formando un tercer embrión. El tercer embrión se transfiere al útero de un mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que se desarrolle el tercer embrión hasta un feto. En una modalidad preferida, la masa de cromatina se forma poniendo en contacto un núcleo del donador que tenga menos que cuatro pares de cromosomas homólogos con un medio de reprogramación bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina sin ocasionar la réplica del ADN. De preferencia, el núcleo del donador se pone en contacto con una o más de las siguientes condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina: un extracto mitótico en la presencia o en ausencia de un anticuerpo anti-NuMA, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína. En diferentes modalidades, tanto el primer embrión como el segundo embrión son embriones de compactación; tanto el primer embrión como el segundo embrión son embriones de pre-compactación, o uno de los embriones es un embrión de compactación y el otro embrión es un embrión de pre-compactación. El primer embrión y el segundo embrión pueden estar en diferentes etapas celulares o en la misma etapa celular. El primer embrión y el núcleo del donador utilizado para producir el segundo embrión, pueden ser de la misma especie o de diferentes géneros o especies. De preferencia, cuando menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células en el trofectoderma o en el tejido placentario del feto se derivan a partir del segundo embrión, o cuando menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células en la masa celular interna o en el tejido fetal del feto, se derivan a partir del primer embrión. En otras modalidades preferidas, el primer embrión o el tercer embrión expresan lamina A, lamina C, o la proteína NuMA en un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un embrión de control con el mismo número de células y de la misma especie. En otro aspecto relacionado, la invención proporciona todavía otro método para clonar un mamífero. Este método involucra incubar una célula permea ilizada en un medio de reprogramación (por ejemplo, extracto celular) bajo condiciones que permitan la remoción de un factor a partir de un núcleo, una masa de cromatina, o un cromosoma de la célula permeabilizada, o la adición de un factor a partir de un medio de reprogramación al núcleo, a la masa de cromatina, o al cromosoma, formando de esta manera una célula reprogramada . La célula reprogramada se inserta en un oocito enucleado, formando de esta manera un primer embrión. Una o más células del primer embrión se ponen en contacto con una o más células de un segundo embrión fertilizado in vitro, que se presente naturalmente, o partenogenéticamente activado, formando un tercer embrión. El tercer embrión se transfiere al útero de un mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que se desarrolle el tercer embrión hasta un feto. En una modalidad preferida, la célula permeabilizada se incuba con un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) bajo condiciones que permitan que se agreguen o se remuevan los componentes nucleares o citoplásmicos, tales como los factores de transcripción, del núcleo o de la masa de cromatina resultante. En otras modalidades preferidas, la célula permeabilizada se pone en contacto con una o más de las siguientes condiciones que permiten la formación de una masa de cromatina: un extracto mitótico en la presencia o en ausencia de un anti-cuerpo anti-NuMA, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína. En todavía otra modalidad preferida, la célula permeabilizada se incuba con un medio de reprogramación de interfase (por ejemplo, un extracto celular de interfase) . En todavía otra modalidad preferida, el núcleo de la célula permeabilizada permanece enlazado a la membrana, y los cromosomas del núcleo no se condensan durante la incubación con este medio de reprogramación de interfase. En algunas modalidades, la incubación de la célula permeabilizada en el medio de reprogramación no ocasiona la réplica del ADN, o solamente ocasiona la réplica del ADN en menos del 50, 40, 30, 20, 10, o 5 por ciento de las células. En otras modalidades, la incubación de la célula permeabilizada en el medio de reprogramación ocasiona la réplica del ADN en cuando menos el 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células. En diferentes modalidades, la célula permeabilizada se forma mediante la incubación de una célula intacta con un detergente, tal como digitonina, o una toxina bacteriana, tal como Estreptolisina 0. En todavía otra modalidad preferida, la célula reprogramada se incuba bajo condiciones que permitan que la membrana de la célula reprogramada vuelva a sellar antes de insertarse en el oocito. En diferentes modalidades, tanto el primer embrión como el segundo embrión son embriones de compacta-ción; tanto el primer embrión como el segundo embrión son embriones de pre-compactación, o uno de los embriones es un embrión de compactación y el otro embrión es un embrión de pre-compactación. El primer embrión y el segundo embrión pueden estar en diferentes etapas celulares o en la misma etapa celular. El primer embrión y la célula donadora utilizada para producir el segundo embrión, pueden ser de la misma especie o de diferentes géneros o especies. De preferencia, cuando menos el 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células en el trofectoderma o en el tejido placentario del feto, se derivan a partir del segundo embrión, o cuando menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, o 100 por ciento de las células en la masa celular interna o en el tejido fetal del feto, se derivan a partir del primer embrión. En otras modalidades preferidas, el primer embrión o el tercer embrión expresan lamina A, lamina C, o la proteína NuMA en un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un embrión de control con el mismo número de células y de la misma especie. En las modalidades preferidas de cualquiera de los métodos anteriores para clonar un mamífero utilizando células de dos embriones, parte o toda la zona pellucida del primer embrión o del segundo embrión se remueve antes de que se contacten las células de cada embrión. En una modalidad, las células de los primero y segundo embriones se ponen en contacto al colocarse adyacentes unas a otras en solución o en un soporte sólido. En otra modalidad, se utilizan técnicas convencionales para inyectar las células del primer embrión en el segundo embrión. Las células se pueden inyectar en cualquier región del segundo embrión, tal como la periferia del embrión entre la zona pellucida y el embrión mismo. Los embriones que se presentan naturalmente de ejemplo incluyen los embriones que se remueven de una manera quirúrgica o no quirúrgica de un mamífero preñado (por ejemplo, un bovino) utilizando métodos convencionales. Los embriones fertilizados in vitro de ejemplo incluyen los embriones de inyección de esperma intra-citoplásmica generados utilizando métodos convencionales . También se contempla que se puedan combinar células de más de dos embriones (por ejemplo, células de 3, 4, 5, 6, o más embriones) para formar un embrión quimérico para la generación de un mamífero clonado. En las modalidades preferidas de cualquiera de los aspectos anteriores, el medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) se modifica mediante el enriquecimiento o el agotamiento de un factor, tal como una metiltransferasa de ADN, desacetilasa de histona, histona, protamina, lamina nuclear, factor de transcripción, activador o represor. En otras modalidades preferidas, el nivel de expresión de la proteína NuMA o A AP95 en el oocito o en el embrión quimérico, es cuando menos 2, 5, 10, o 20 veces mayor en el núcleo que en el citoplasma. En todavía otras modalidades, cuando menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 por ciento de la proteína AKAP95 en el oocito o en el embrión quimérico se extrae con una solución de Tritón X-100 al 0.1 por ciento, 1 mg/ml de ADNsa I, y NaCl ya sea en 100 mM o bien en 300 mM. De preferencia, la masa de cromatina se purifica a partir del medio de reprogramación (por ejemplo, extracto) antes de insertarse en el oocito enucleado. En otra modalidad preferida, la inserción de la masa de cromatina en el oocito enucleado implica poner en contacto la masa de cromatina y el oocito con un compuesto fusigénico bajo condiciones que permitan que entre la masa de cromatina en el oocito. En todavía otra modalidad preferida, el feto se desarrolla hasta una progenie viable. De preferencia, cuando menos el 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, o 90 por ciento de los oocitos de transferencia nuclear o de los embriones se desarrollan hasta una progenie viable. En este método, el oocito que contiene la masa de cromatina o la célula reprogramada se puede cultivar bajo condiciones que permitan la división celular, y una de las células resultantes se puede volver a clonar una o más veces . El núcleo del donador, la masa de cromatina del donador, o la célula donadora, y el oocito utilizado en el método, pueden ser de la misma especie, o pueden ser de diferentes especies o géneros. El mamífero puede ser un ser humano o un mamífero no humano, y el oocito puede estar fertilizado o no fertilizado. De preferencia, el núcleo del donador, la masa de cromatina, o la célula permeabilizada son de una célula en fase GL o G0. En adición, el ADN genómico del embrión clonado, del feto, o del mamífero, de preferencia es sustancialmente idéntico a aquél de la célula donadora. También se contempla que la masa de cromatina o la célula reprogramada se puede insertar en un embrión para la producción de un embrión quimérico, un feto, o un mamífero que contengan una mezcla de células con ADN sustancialmente idéntico a aquél de la masa de cromatina o de la célula reprogramada, y células con ADN sustancialmente idéntico a aquél de las células que se presenten naturalmente en el embrión. También se contempla que se puede utilizar un oocito nucleado en los métodos de la invención . El medio de reprogramación utilizado en cualquiera de los aspectos de la invención puede o no contener nucleótidos exógenos . En otras modalidades preferidas, una masa de cromatina en un medio de reprogramación, o formada en una célula permeabi-lizada, se pone en contacto con un vector que tenga un ácido nucleico que codifique un gen de interés bajo condiciones que permitan la integración aleatoria o la recombinación homologa entre el ácido nucleico en el vector y el ácido nucleico correspondiente en el genoma de la masa de cromatina, dando como resultado la alteración del genoma de la masa de cromatina. Debido a la falta de una membrana de plasma intacta, y a la falta de una membrana nuclear, una masa de cromatina en una célula permeabilizada o en solución puede ser más fácil de modificar genéticamente que una célula que se presente naturalmente . Los ejemplos de las células que se pueden utilizar para generar extractos de reprogramación incluyen células de tallo embriónico y células de tallo de adulto de cerebro, sangre, médula ósea, páncreas, hígado, piel, o cualquier otro órgano o tejido. Otros extractos celulares de reprogramación de ejemplo incluyen extractos de oocitos (por ejemplo, extractos de oocitos bovinos o de erizo de mar) , y extractos celulares de germen masculino (por ejemplo, extractos de espermatogonia, espermatocitos, espermátidas, o de esperma a partir de vertebrados, invertebrados, o de mamíferos tales como bovinos) . La célula donadora o permeabilizada puede estar no inmortalizada, o puede estar naturalmente, espontáneamente, o genéticamente inmortalizada. La célula donadora, la célula permeabilizada, la célula receptora, o el citoplasto, pueden ser de una fuente de cualquier edad, tal como un embrión, feto, joven, o mamífero adulto. Las células de fuentes más jóvenes pueden haber adquirido menos mutaciones espontáneas, y pueden tener un lapso de vida más largo después de insertarse en un oocito. La invención también proporciona métodos para insertar cromosomas, masas de cromatina, o núcleos en las células receptoras . Estos métodos son útiles para transferir el material genético del donador a un oocito receptor para la clonación de un mamífero. Estos métodos también se pueden utilizar para reemplazar el material genético de una célula, con aquél de otra célula.

De conformidad con este aspecto de la invención, se proporciona una técnica para insertar cromosomas o una masa de cromatina en una célula receptora, la cual implica poner en contacto los cromosomas o la masa de cromatina y la célula con un compuesto fusigénico bajo condiciones que permitan que entren los cromosomas o la masa de cromatina en la célula receptora. En una modalidad preferida, los cromosomas o la masa de cromatina se incuban con el compuesto fusigénico antes de ponerse en contacto con la célula receptora. Los cromosomas o la masa de cromatina pueden estar condensados o no condensados, y los cromosomas o la masa de cromatina y la célula receptora pueden ser de la misma especie, o pueden ser de diferentes especies o géneros. En otra modalidad preferida, la célula receptora es un oocito fertilizado o no fertilizado. De preferencia, la célula receptora o los cromosomas son a partir de un mamífero humano o no humano. En diferentes modalidades, la célula receptora es una célula de adulto, fetal, o embriónica. En una modalidad preferida particular, todos los cromosomas de una célula donadora se insertan en la célula receptora. De preferencia, la célula donadora es haploide (contenido de ADN de n) , diploide (2n) , o tetraploide (4n) , y la célula receptora es hipodiploide (contenido de ADN menor que 2n) , aploide, o enucleada. En otra modalidad, los cromosomas son a partir de más de una célula donadora, tales como dos células aploides. En todavía otra modalidad preferida, los cromosomas se obtienen poniendo en contacto un núcleo donador que tenga menos de cuatro pares de cromosomas homólogos con un extracto mitótico, un detergente y/o sal, o una cinasa de proteína, bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina sin ocasionar la réplica del ADN. Los compuestos fusigénicos preferidos incluyen polietilenglicol (PEG) , y lípxdos, tales como Lipofectin®, Lipofectamin®, DOTA®, {metilsul-fato de N- [1- (2 , 3-dioleoiloxi) propil] -?,?,?-trimetilamonio; C43He3N0BS}, DOSPA® {trifluoroacetato de 2 , 3 -dioleiloxi-N- [2-esperminacarboxamido) etil] -N,N-dimetil-l-propanaminio} , y DOPE® (dioleoil-fosfatidiletanolamina) . Otros lípidos preferidos incluyen lípidos catiónicos neutros y monovalentes o multivalen-tes, tales como aquéllos que contienen grupos de amonio cuaternario. Los lípidos preferidos adicionales tienen una fracción de colesterol tal como la que se forma a partir de la reacción del grupo hidroxilo en el colesterol con un grupo en el lípido. Todavía otros lípidos preferidos tienen un ácido graso saturado o insaturado que de preferencia contiene entre 5 y 10, entre 10 y 15, entre 15 y 20, o entre 20 y 30 átomos de carbono, inclusive. Estos lípidos se pueden sintetizar utilizando técnicas de síntesis química convencionales, se pueden obtener a partir de fuentes que se presentan naturalmente, o se pueden adquirir en una fuente comercialmente disponible (Summers y colaboradores, Biophys J. 71(6) :3199-206, 1996/ Nabekura y colaboradores, Pharm Res. 13 (7) :1069-72 , 1996; Walter y colaboradores , Biophys J. 66(2 PT 1) :366-376, 1994; Yang y colaboradores, Biosci. Rep . 13 (3) .143-157, 1993; Walter y Siegel, Biochemistry, 6:32 (13) :3271-3281, 1993) . Otros compuestos fusigénicos preferidos son los fosfolípidos, tales como las fracciones de vesícula de membrana a partir de huevos de erizo de mar o de cualquier otra fuente (Collas y Poccia, J. of Cell Science 109, 1275-1283, 1996) . De preferencia, el contacto de los cromosomas con la fracción de vesícula de membrana no da como resultado que los cromosomas sean encapsulados por una membrana intacta. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para insertar un núcleo en una célula receptora, el cual incluye poner en contacto el núcleo y la célula con un compuesto fusigénico bajo condiciones que permitan que entre el núcleo a la célula receptora. El compuesto fusigénico es un lípido, o no es un polímero consistente en monómeros idénticos. De preferencia, el núcleo se incuba con el compuesto fusigénico antes de ponerse en contacto con la célula receptora. En diferentes modalidades, el núcleo y la célula receptora son de la misma especie, o son de diferentes especies o de diferentes géneros. De preferencia, el núcleo es aploide, diploide, o tetraploide, y la célula receptora es hipodiploide, aploide, o enucleada. En una modalidad preferida, la célula receptora es un oocito fertilizado o no fertilizado. De preferencia, la célula receptora o el núcleo es de un mamífero humano o no humano. En otras modalidades, la célula receptora es una célula de adulto, fetal, o embriónica. Los compuestos fusigénicos preferidos son lípidos, tales como Lipofectin®, Lipofectamin®, DOTAP®, DOSPA®, y DOPE®. Otros lípidos preferidos incluyen lípidos neutros y lípidos catiónicos monovalentes o multivalentes , tales como aquéllos que contienen grupos de amonio cuaternario. Los lípidos preferidos adicionales tienen una fracción de colesterol o un ácido graso saturado o insaturado que de preferencia contiene entre 5 y 10, entre 10 y 15, entre 15 y 20, o entre 20 y 30 átomos de carbono, inclusive. Otros compuestos fusogénicos preferidos son fosfolípidos, tales como fracciones de vesícula de membrana a partir de huevos de erizo de mar o de cualquier otra fuente (Collas y Poccia, supra) . De preferencia, el contacto de un núcleo con la fracción de vesícula de membrana no da como resultado que el núcleo sea encapsulado por una membrana intacta. En las modalidades preferidas de diferentes aspectos de la invención, el núcleo o los cromosomas son de una célula de adulto, fetal, o embriónica. El núcleo o los cromosomas se pueden obtener también a partir de cualquiera de las siguientes células donadoras preferidas, o se pueden insertar en cualquiera de las siguientes células receptoras preferidas. Los ejemplos de las células preferidas incluyen las células diferenciadas, tales como células epiteliales, células neurales, células epidérmicas, queratinocitos, células hematopoyéticas, melanocitos, condroci-tos, linfocitos B, linfocitos T, eritrocitos, macrófagos, monocitos, fibroblastos, y células de músculo; y las células no diferenciadas, tales como células embriónicas (por ejemplo, células de tallo y células germinales emb iónicas) . En otra modalidad preferida, la célula es a partir del sistema reproductor hembra, tal como una glándula mamaria, cúmulo de ovario, granulosa, o célula oviductal. Otras células preferidas incluyen células fetales y células placentarias . Las células preferidas también incluyen aquéllas de cualquier órgano, tales como de vejiga, cerebro, esófago, tubo de falopio, corazón, intestinos, vesícula, riñón, hígado, pulmón, ovarios, páncreas, próstata, médula espinal, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, tráquea, uréter, uretra, y útero. Los mamíferos no humanos preferidos incluyen a los miembros del género Bos . Los ejemplos de otros mamíferos preferidos incluyen vacas, ovejas, ovejas de cuerno grande, cabras, búfalos, antílopes, bueyes, caballos, burros, muías, venados, renos, caribú, búfalo acuático, camellos, llama, alpaca, conejos, cerdos, ratones, ratas, conejillos de indias, hámsters, y primates tales como monos. En todavía otra modalidad preferida, el núcleo, la célula permeabilizada, o los cromosomas son a partir de una célula o mamífero transgénico, o contienen una mutación que no se encuentre en la célula donadora o que no se encuentre en una célula que se presente naturalmente. Los núcleos donadores y células donadoras transgénicos preferidos codifican proteínas que confieren una mejor resistencia a la enfermedad o a los parásitos en el mamífero clonado. De una manera alternativa, los núcleos donadores o las células donadoras se pueden diseñar de tal manera que el mamífero clonado produzca un producto recombinante, tal como la producción de una proteina humana en la orina, sangre, o leche de un bovino. Por ejemplo, las proteínas se pueden expresar en la orina del ganado mediante la inserción de una secuencia de polinucleótidos que codifique una proteína humana bajo el control de un promotor de uroplaquina. Los ejemplos de las proteínas terapéuticas que se pueden producir en la leche de los bovinos clonados incluyen anti-cuerpos monoclonales humanos y factores de coagulación humanos, tales como cualquiera de los factores I a XIII (Voet y Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, Nueva York, 1990) . Estas proteínas heterologas se pueden expresar bajo el control de un promotor de prolactina o cualquier otro promotor adecuado para la expresión en la leche de un bovino. Para la producción de anticuerpos humanos en la leche, sangre, u otros fluidos de mamíferos clonados, se pueden utilizar los métodos convencionales para inactivar o "eliminar" los genes endógenos para las cadenas pesada o ligera del anti-cuerpo, de tal manera que un núcleo donador ya no codifique los anti-cuerpos funcionales, y para insertar los genes que codifiquen las cadenas pesada y ligera de las IgA, IgD, IgE, IgG, o IgM humanas en el genoma del núcleo donador. Las proteínas recombinantes de estos u otros tejidos o fluidos se pueden purificar utilizando métodos de purificación convencionales (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, supra) . También se contempla que se pueden utilizar células, tejidos, u órganos de un embrión, feto, o mamífero adulto producidos utilizando los métodos de la invención, como una fuente de material para aplicaciones médicas, tales como el tratamiento o la prevención de enfermedades en seres humanos . Por ejemplo, se pueden desarrollar células, tejidos, u órganos in vitro a partir de un embrión clonado, y luego se transfieren a un mamífero (por ejemplo, un ser humano) , se remueven de un mamífero clonado, y se transfieren a otro mamífero de una especie diferente, o se remueven de un mamífero clonado y se transfieren a otro mamífero de la misma especie. Por ejemplo, el tejido neuronal de un mamífero clonado se puede injertar en un área apropiada en el sistema nervioso humano para tratar, prevenir, o estabilizar una enfermedad neurológica, tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, o ALS; o una lesión de la médula espinal. En particular, las células neuronales en degeneración o dañadas pueden ser reemplazadas por las células correspondientes de un mamífero clonado. Este método de trasplante también se puede utilizar para tratar, prevenir, o estabilizar las enfermedades auto-inmunes, incluyendo, pero no limitándose a, diabetes mellitus dependiente de insulina, artritis reumatoide, pemfigus vulgaris, esclerosis múltiple, y miastenia gravis. En estos procedimientos, las células que sean atacadas por el propio sistema inmune del receptor, pueden ser reemplazadas por células trasplantadas. Los mamíferos clonados también se pueden utilizar como una fuente de cartílago, médula ósea, o cualquier otro tejido u órgano. Para la producción de un mamífero clonado como una fuente de material de trasplante donador, el núcleo donador o la célula donadora utilizados para generar el mamífero clonado, de preferencia se modifican para codificar una proteína heterologa de HC Clase I que tenga una secuencia de aminoácidos sustancial-mente idéntica a la secuencia de una proteína de MHC Clase I encontrada en el mamífero receptor al que se administrará el material donador. De una manera alternativa, el núcleo donador codifica una proteína heterologa de MHC Clase I que tenga una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la secuencia de una proteína de MHC Clase I encontrada en otro mamífero del mismo género o especie que el mamífero receptor. Estas células, tejidos, u órganos donadores de mamíferos clonados que expresan proteínas heterólogas de MHC tienen menos probabilidades de provocar una respuesta inmune adversa cuando se administren al mamífero receptor. Otro material de trasplante donador preferido se obtiene a partir de un mamífero clonado que haya sido generado utilizando un núcleo donador o una célula donadora que haya sido modificada para expresar una proteína heterologa que inhiba la senda de complemento del mamífero receptor, tal como el inhibidor de complemento humano CD59 o el regulador de complemento humano de factor de aceleración de decaimiento (h-DAF) (ver, por ejemplo, Ramírez y colaboradores, Transplantation 15:989-998, 2000/ Costa y colaboradores, Xenotransplantation 6:6-16, 1999).

En todavía otra modalidad preferida, el núcleo donador o la célula donadora tiene una mutación que reduce o elimina la expresión o la actividad de una galactosiltransferasa, tal como alfa (1, 3 ) -galactosiltrans erasa (Tearle y colaboradores, Transplantation 61:13-19, 1996; Sandrin, Immunol . Rev. 141:169-190, 1994; Costa y colaboradores, Xenotransplantation 6:6-16, 1999) . Esta enzima modifica las moléculas de la superficie celular con un carbohidrato que provoca una respuesta inmune adversa cuando se administran a seres humanos las células que expresen este epítopo de galactosa, alfa (1, 3) -galactosa. Por consiguiente, el material de trasplante donador que tenga un nivel más bajo de expresión de este epítopo, puede tener una incidencia más baja de rechazo por parte del mamífero receptor. Como se utiliza en la presente, "masa de cromatina" significa más de un cromosoma no encerrado por una membrana. De preferencia, la masa de cromatina contiene todos los cromosomas de una célula. Se puede formar una masa de cromatina artificialmente inducida que contenga cromosomas condensados, mediante la exposición de un núcleo a un medio de reprogramación mitótico (por ejemplo, un extracto mitótico) como se describe en la presente. De una manera alternativa, se puede generar una masa de cromatina artificialmente inducida que contenga cromosomas descondensados o parcialmente condensados, mediante la exposición de un núcleo a uno de los siguientes, como se describen en la presente: un extracto mitótico que contenga un anti-cuerpo anti-NuMA, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína. Una masa de cromatina puede contener cromosomas separados que no se toquen físicamente unos a otros, o puede contener dos o más cromosomas que estén en contacto físico . Si se desea, el nivel de condensación de cromosomas se puede determinar utilizando métodos convencionales, mediante la medición de la intensidad del teñido con un tinte de ADN, DAPI . A medida que se condensan los cromosomas, se incrementa la intensidad de este teñido. Por consiguiente, la intensidad de teñido de los cromosomas se puede comparar con la intensidad de teñido para los cromosomas descondensados en la interfase (designados como 0 por ciento condensados) , y los cromosomas máximamente condensados en la mitosis (designados como 100 por ciento condensados) . Basándose en esta comparación, se puede determinar el porcentaje de máxima condensación. Las masas de cromatina condensadas preferidas están cuando menos el 50, 60, 70, 80, 90, o 100 por ciento condensadas. Las masas de cromatina descondensadas o parcialmente condensadas preferidas están menos del 50, 40, 30, 20, o 10 por ciento condensadas. "Núcleo" significa un organelo enlazado con membrana que contiene la mayor parte o todo el ADN de una célula. El ADN está empacado en los cromosomas en una forma descondensada . De preferencia, la membrana que encapsula al ADN incluye una o dos bicapas de lípido, o tiene nucleoporinas .

"Núcleo que tiene menos de 4 conjuntos de cromosomas homólogos" significa un núcleo que tiene un contenido de ADN menor a 4n, en donde "n" es el número de cromosomas que se encuentran en el conjunto de cromosomas aploides normales de un mamífero de un género o especie particular. Este núcleo no tiene cuatro copias de cada gen o locus genético. De preferencia, el núcleo es diploide, y por lo tanto, tiene dos conjuntos de cromosomas homólogos, pero tiene menos de dos pares completos de cromátidas . "Pronúcleo" significa un núcleo aploide que resulta de la meiosis o de un pronúcleo de transferencia nuclear. El pronúcleo hembra es el núcleo del oocito o huevo antes de la fusión con el pronúcleo macho. El pronúcleo macho es el núcleo del esperma después de que ha entrado al oocito o huevo en la fertilización, pero antes de la fusión con el pronúcleo hembra. Un pronúcleo de transferencia nuclear es un pronúcleo (por ejemplo, un pronúcleo diploide) que se forma después de la introducción de una célula, núcleo, o masa de cromatina donadora en un oocito. El pronúcleo de transferencia nuclear tiene menos de cuatro juegos de cromosomas homólogos. "Célula donadora" significa una célula a partir de la cual se deriva un núcleo o una masa de cromatina, o una célula permeabilizada . "Permeabilización" significa la formación de poros en la membrana de plasma, o la remoción parcial o completa de la raembrana de plasma. "Medio de reprogramación" significa una solución que permite remover un factor de una célula, núcleo, masa de cromatina, o cromosoma, o permite agregar un factor a partir de la solución a la célula, núcleo, masa de cromatina, o cromosoma. De preferencia, la adición o remoción de un factor incrementa o reduce el nivel de expresión de un ARNm o de una protexna en la célula, masa de cromatina, o núcleo donadores, o en una célula que contenga la masa de cromatina o núcleo reprogramados . En otra modalidad, la incubación de una célula permeabilizada, masa de cromatina, o núcleo en el medio de reprogramación, altera un fenotipo de la célula permeabilizada, o una célula que contenga a la masa de cromatina o núcleo reprogramados, en relación con el fenotipo de la célula donadora. En todavía otra modalidad, la incubación de una célula permeabilizada, masa de cromatina, o núcleo en el medio de reprogramación hace que la célula permeabilizada o que una célula que contenga la masa de cromatina o el núcleo reprogramados, gane o pierda una actividad en relación con la célula donadora. Los medios de reprogramación de ejemplo incluyen soluciones, tales como reguladores, que no contengan moléculas biológicas, tales como proteínas o ácidos nucleicos. Estas soluciones son útiles para remover uno o más factores de un núcleo, masa de cromatina, o cromosoma. Otros medios de reprogramación preferidos son extractos, tales como extractos celulares a partir de núcleos celulares, citoplasma celular, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de los extractos celulares incluyen los extractos de oocitos (por ejemplo, oocitos de mamífero, vertebrado, o invertebrado) , células germinales masculinas (células germinales de mamífero, vertebrado, o invertebrado, tales como espermatogonia, espermatocito, espermá-tida, o esperma) , y células de tallo (por ejemplo, células de tallo de adulto o embriónico) . Todavía otros medios de reprogramación son soluciones o extractos a las que se hayan agregado uno o más factores que se presenten naturalmente o recombinantes (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, tales como metiltransfera-sas de ADN, desacetilasas de histona, histonas, protaminas, laminas nucleares, factores de transcripción, activadores, represores, proteínas de remodelación de cromatina, factores de crecimiento, interleucinas, citocinas, u otras hormonas) , o extractos a partir de los cuales se hayan removido uno o más factores . Todavía otros medios de reprogramación incluyen soluciones de detergente (por ejemplo, del 0.01 por ciento al 0.1 por ciento, del 0.1 por ciento al 0.5 por ciento, o del 0.5 por ciento al 2 por ciento de detergente iónico o no iónico, tal como uno o más de los siguientes detergentes: SDS, Tritón X-100, Tritón X-114, CHAPS, desoxicolato de Na, n-octil-glucósido, Nonidet P40, IGEPAL, Tween 20, Tween 40, o Tween 80), sal (por ejemplo, NaCl o KCl ~0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, o 2 M) , poliamina (por ejemplo, espermina, espermidina, protamina, o poli-L-lisina ~1 µ?, 10 µ?, 100 µ , 1 mM, o 10 p??) , una cinasa de proteína (por ejemplo, cinasa dependiente de ciclina 1, cinasa C de proteína, cinasa A de proteína, cinasa de MAP, cinasa dependiente de calcio/calmodulina, cinasa de caseína CK1, o cinasa de caseína CK2) , y/o un inhibidor de fosfatasa (por ejemplo, ~10 µ?, 100 µ , 1 mM, 10 mM, 50 mM, 100 mM de uno o más de los siguientes inhibidores: ortovanadato de Na, pirofosfato de Na, fluoruro de Na, NIPPl, inhibidor 2, PNUTS, SDS22 , AKAP1 9 , o ácido ocadaico) . En algunas modalidades, el medio de reprogramación contiene un anti-cuerpo anti-NuMA. Si se desea, se pueden utilizar medios de reprogramación múltiples de una manera simultánea o en secuencia, para reprogramar una célula, núcleo, o masa de cromatina donadores . "Medio de reprogramación de interfase" significa un medio (por ejemplo, un extracto celular de interfase) que induce la descondensación de cromatina y la formación de la envoltura nuclear . "Medio de reprogramación mitótico" significa un medio (por ejemplo, un extracto celular mitótico) que induce la condensación de cromatina y el rompimiento de la envoltura nuclear. "Célula reprogramada" significa una célula que se ha expuesto a un medio de reprogramación. De preferencia, cuando menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, o más moléculas de ARNm o de proteína se expresan en la célula reprogr mada, las cuales no se expresan en la célula donadora o permeabilizada. En otra modalidad preferida, el número de moléculas de ARNm o de proteina que se expresan en la célula reprogramada, pero que no se expresan en la célula donadora o permeabilizada, es entre 1 y 5, entre 5 y 10, entre 10 y 25, entre 25 y 50, entre 50 y 75, entre 75 y 100, entre 100 y 150, entre 150 y 200, o entre 200 y 300, inclusive. De preferencia, se expresan cuando menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, o más moléculas de ARNm o de proteína en la célula donadora o permeabilizada, que no se expresan en la célula reprogramada. En todavía otra modalidad preferida, el número de moléculas de ARNm o de proteína que se expresa en la célula donadora o permeabilizada, pero que no se expresan en la célula reprogramada, es entre 1 y 5, entre 5 y 10, entre 10 y 25, entre 25 y 50, entre 50 y 75, entre 75 y 100, entre 100 y 150, entre 150 y 200, o entre 200 y 300, inclusive. En todavía otra modalidad preferida, estas moléculas de ARNm o de proteína se expresan tanto en la célula donadora (es decir, la célula donadora o permeabilizada de partida) como en la célula reprogramada, pero los niveles de expresión en estas células difieren por cuando menos 2, 5, 10, o 20 veces, medidos utilizando ensayos convencionales (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 2000) . "Adición de un factor" significa el enlace de un factor a la cromatina, a un cromosoma, o a un componente de la envoltura nuclear, tal como la membrana nuclear o la matriz nuclear. De una manera alternativa, el factor se importa hacia adentro del núcleo, de tal manera que es enlazado o encapsulado por la envoltura nuclear. De preferencia, la cantidad de factor que se enlaza a un cromosoma, o que se localiza en el núcleo, se incrementa por cuando menos el 25, 50, 75, 100, 200, o 500 por ciento . "Remoción de un factor" significa la disociación de un factor de la cromatina, de un cromosoma, o de un componente de la envoltura nuclear, tal como la membrana nuclear o la matriz nuclear. De una manera alternativa, el factor se exporta hacia afuera del núcleo, de tal manera que ya no es enlazado o encapsulado por la envoltura nuclear. De preferencia, la cantidad de factor que se enlaza a un cromosoma o que se localiza en el núcleo se reduce por cuando menos el 25, 50, 75, 100, 200, o 500 por ciento. "Enriquecimiento o agotamiento de un factor" significa la adición o remoción de un factor que se presenta naturalmente o recombinante por cuando menos el 20, 40, 60, 80, o 100 por ciento de la cantidad del factor originalmente presente en un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) . De una manera alternativa, se puede agregar un factor que se presente naturalmente o recombinante que no esté naturalmente presente en el medio de reprogramación. Los factores preferidos incluyen proteínas, tales como metiltransferasas de ADN, desacetilasas de histona, histonas, protaminas, laminas nucleares, factores de transcripción, activadores, y represores; vesículas de membrana, y organelos. En una modalidad preferida, el factor se purifica antes de agregarse al medio de reprogramación, como se describe más adelante. Alternativamente, se puede utilizar uno de los métodos de purificación descritos más adelante para remover un factor indeseado del medio de reprogramación . "Purificado" significa separado de otros componentes que lo acompañan naturalmente. Típicamente, un factor es sustancialmente puro cuando está cuando menos el 50 por ciento en peso libre de proteínas, anti-cuerpos, y moléculas orgánicas que se presenten naturalmente con las que esté naturalmente asociado. De preferencia, el factor es cuando menos el 75 por ciento, más preferiblemente cuando menos el 90 por ciento, y de una manera muy preferible cuando menos el 99 por ciento en peso puro. Un factor sustancialmente puro se puede obtener mediante síntesis química, separación del factor de las fuentes naturales, o producción del factor en una célula anfitriona recombinante que no produzca naturalmente el factor. Las proteínas, vesículas, y organelos pueden ser purificados por un experto en la materia utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas por Ausubel y colaboradores (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 2000) . El factor de preferencia es cuando menos 2, 5, o 10 veces más puro que el material de partida, medido utilizando electroforesis en gel de poliacrilami-da, cromatografía en columna, densidad óptica, análisis de cromatografía de líquidos de alto rendimiento, o análisis Western (Ausubel y colaboradores, supra) . Los métodos de purificación preferidos incluyen inmunoprecipitación, cromatografía en columna tal como cromatografía por inmunoafinidad, purificación por inmunoafinidad con perlas magnéticas, y colocación en bandeja con un anti-cuerpo enlazado con placa. "Re-clonado" significa utilizado en una segunda ronda de clonación. En particular, una célula de un embrión, feto, o adulto generado a partir de los métodos de la invención, se puede incubar en un medio de reprogramación mitótico (por ejemplo, un extracto celular mitótico) para formar una masa de cromatina para insertarse en un oocito enucleado, como se describe anteriormente. De una manera alternativa, la célula se puede permeabilizar, incubar en un medio de reprogramación, e insertar en un oocito enucleado, como se describe anteriormente. La realización de dos o más rondas de clonación puede dar como resultado una reprogramación adicional de la masa de cromatina donadora o de la célula donadora, incrementando de esta manera la oportunidad de generar una progenie viable después de la última ronda de clonación. "Progenie viable" significa un mamífero que sobre vive ex útero. De preferencia, el mamífero está vivo durante cuando menos un segundo, un minuto, una hora, un día, una semana, un mes, seis meses, o un año desde el momento en que sale del anfitrión materno. El mamífero no requiere del sistema circulatorio de un ambiente in útero para sobrevivir. "Oocito de transferencia nuclear" u "oocito de trasplante nuclear" significa un oocito en donde se inserta o se fusiona una célula, núcleo, o masa de cromatina donadores. Un embrión formado a partir del oocito es referido como un embrión de "transferencia nuclear" o de "trasplante nuclear". "Embrión" o "embriónico" significa una masa celular en desarrollo que no se ha implantado en la membrana uterina de un anfitrión materno. Por consiguiente, el término "embrión" se puede referir a un oocito fertilizado; un oocito que contenga una masa de cromatina, núcleo, o célula reprogramada donadores; una masa celular en desarrollo en la etapa de preblastocito; o cualquier otra masa celular en desarrollo que esté en una etapa de desarrollo antes de implantarse en la membrana uterina de un anfitrión materno, y antes de la formación de un reborde genital. Un embrión puede representar múltiples etapas de desarrollo celular. Por ejemplo, un embrión de una célula puede ser referido como un cigoto; una masa sólida esférica de células resultante de un embrión disociado, puede ser referida como una mórula, y un embrión que tenga un blastocele puede ser referido como un blastocito. Una "célula embriónica" es una célula aislada de, o contenida en, un embrión. "Células derivadas de un embrión" significan las células que resultan de la división celular de las células en el embrió . "Embrión quimérico" significa un embrión formado a partir de células de dos o más embriones . El feto resultante o la progenie puede tener células que se deriven solamente de uno de los embriones iniciales, o células derivadas de más de uno de los embriones iniciales. Si se desea, el porcentaje de células de cada embrión se incorpora en el tejido placentario y en el tejido fetal, y se puede determinar utilizando análisis FISH estándar, o análisis de un tinte de membrana agregado a un embrión. "Embrión de pre-compactación" significa un embrión antes de la compactación. Un embrión de pre-compactación no expresa esencialmente E-cadherina sobre la superficie de sus blastómeros . Los embriones de pre-compactación preferidos expresan cuando menos 3, 5, 10, 20, 30, o 40 veces menos E-cadherina que un embrión completamente compactado de la misma especie, o no expresan E-cadherina. "Embrión de compactación" significa un embrión que sufre compactación o en seguida de la compactación. Los blastómeros de un embrión de compactación expresan E-cadherina sobre su superficie. Esta expresión de E-cadherina puede medirse utilizando métodos convencionales con un anti-cuerpo anti-E-cadherina. La E-cadherina incrementa la adherencia entre los blastómeros. Los embriones de compactación preferidos incluyen los embriones en donde está terminado el proceso de compactación. Otros embriones de compactación preferidos expresan cuando menos 3, 5, 10, 20, 30, o 40 veces más E-cadherina que un embrión de la pre-compactación de la misma especie. "Feto" significa una masa celular en desarrollo que se ha implantado en la membrana uterina de un anfitrión materno . Un feto puede tener rasgos de definición, tales como un reborde genital, que sea fácilmente identificado por una persona de una experiencia ordinaria en la técnica. Una "célula fetal" es cualquier célula aislada de, o contenida en, un feto. "Partenogénesis" o "activación parteno-genética" significa el desarrollo de un oocito o huevo sin fusión de su núcleo con un pronúcleo masculino para formar un cigoto. Por ejemplo, se puede inducir a un oocito a dividirse sin fertilización. "Zona pellucida" significa una capa no celular translúcida y elástica que rodea al oocito o al huevo de muchos mamíferos . "Trofectoderma" significa la capa más externa de células que rodean al blastocele durante la etapa de blastocito del desarrollo embriónico del mamífero. El trofectoderma da lugar a la mayor parte o a todo el tejido placentario después del desarrollo adicional. "Masa celular interna" significa las células rodeadas por el trofectoderma. Las células de la masa celular interna dan lugar a la mayor parte de los tejidos fetales después de un desarrollo adicional . "ARNm o proteína específica para un tipo de célula" significa un ARNm o una proteína que se expresa en un tipo de célula en un nivel que es cuando menos 10, 20, 50, 75, o 100 veces mayor que el nivel de expresión en todos los demás tipos de células. De preferencia, el ARNm o la proteína solamente se expresa en un tipo de célula. "Mutación" significa una alteración en una secuencia de ácido nucleico que se presenta naturalmente o de referencia, tal como una inserción, supresión, mutación de cambio de marco, mutación silenciosa, mutación sin sentido, o mutación en mal sentido. De preferencia, la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácido nucleico tiene cuando menos una alteración de aminoácido a partir de una secuencia que se presente naturalmente. Los ejemplos de las técnicas de ADN recombinante para alterar la secuencia genómica de una célula, embrión, feto, o mamífero, incluyen insertar una secuencia de ADN a partir de otro organismo (por ejemplo, un ser humano) en el genoma, suprimir una o más secuencias de ADN, e introducir una o más mutaciones de bases (por ejemplo, mutaciones dirigidas al sitio o aleatorias) en la secuencia de ADN objetiva. Los ejemplos de los métodos para producir estas modificaciones incluyen inserción retroviral, técnicas de cromosoma artificial, inserción de genes, inserción aleatoria con promotores específicos del tejido, recombinación homologa, dirección genética, elementos transposicionables, y cualquier otro método para introducir ADN extraño. Todas estas técnicas son bien conocidas por los expertos en el campo de la biología molecular (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, supra) . Las masas de cromatina, los cromosomas, y los núcleos de las células transgénicas que contienen ADN modificado o células transgénicas donadoras, se pueden utilizar en los métodos de la invención. "Inmortalizado" significa capaz de sufrir cuando menos el 25, 50, 75, 90, o 95 por ciento más de divisiones celulares que una célula de control que se presente naturalmente del mismo tipo de célula, género, y especie que la célula inmortalizada o que la célula donadora a partir de la cual se derivó la célula inmortalizada. De preferencia, una célula inmortalizada es capaz de sufrir cuando menos 2, 5, 10, o 20 veces más divisiones celulares que la célula de control. De una manera más preferible, la célula inmortalizada es capaz de sufrir un número ilimitado de divisiones celulares. Los ejemplos de las células inmortalizadas incluyen las células que adquieren naturalmente una mutación in vivo o in vitro, que altera su proceso regulador del crecimiento normal. Todavía otras células inmortalizadas preferidas incluyen las células que se han modificado genéticamente para expresar un oncogén, tal como ras, Myc, abl, bcl2, o neu, o que se han infectado con un virus de ADN o ARN transformante, tal como el virus Epstein Barr, o el virus SV40 (Kumar y colaboradores, Immunol. Lett. 65:153-159, 1999; night y colaboradores, Proc.

Natl. Acad. Sci . USA 85 :3130-3134, 1988; Shammah y colaboradores, J. Immunol. Met ods 160-19-25, 1993; Gustafsson y Hinkula, Hum. Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994; Kataoka y colaboradores, Differentiation 62:201-211, 1997; Chatelut y colaboradores, Scand. J. Immunol. 48:659-666, 1998). Las células también se pueden modificar genéticamente para expresar el gen de telomerasa (Roques y colaboradores, Cáncer Res. 61:8405-8507, 2001). "No inmortalizado" significa no inmortalizado como se describe anteriormente . "Compuesto fusigénico" significa un compuesto que aumenta la probabilidad de que se inserte una masa de cromatina o un núcleo en una célula receptora cuando se localice adyacente a la célula. Por ejemplo, el compuesto fusigénico puede aumentar la afinidad de una masa de cromatina o de un núcleo por la membrana de plasma de una célula. El compuesto fusigénico también puede promover la unión de la membrana nuclear de un núcleo con la membrana de plasma de una célula. "Sustancialmente idéntico" significa que tiene una secuencia que es cuando menos el 60, 70, 80, 90, o 100 por ciento idéntica a otra secuencia. La identidad de secuencias normalmente se mide utilizando un software de análisis de secuencias con los parámetros por omisión especificados en el mismo (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705, Estados Unidos) . Este programa de software empareja las secuencias similares asignando" grados de homología a diferentes sustituciones, supresiones, y otras modificaciones . La presente invención proporciona un número de ventajas relacionadas con la clonación de mamíferos y la transferencia de material genómico a las células receptoras. Por ejemplo, los métodos pueden dar como resultado un porcentaje más alto de progenie viable, incrementando el número de mamíferos que se puedan utilizar para aplicaciones agrícolas o médicas. Comparándose con la micro-inyección, el método descrito en la presente para la transferencia de cromosomas, masas de cromatina, o núcleos hacia adentro de las células, denominado lipofusión, es un medio más gentil y más simple para introducir material genético en las células, debido a que no requiere de la alteración física de las estructuras celulares, o de la experiencia técnica necesaria para recoger un núcleo o una masa de cromatina utilizando una micro-pipeta e inyectarlo en una célula. El presente método también puede ser más seguro que los métodos de fusión que involucran virus o componentes virales. Además, se cree que la lipofusión provoca un daño fisiológico mínimo, en su caso, para la célula receptora, y por consiguiente, es benéfica sobre la electrofusión, la cual provoca eventos de señalización adentro de las células fusionadas, que pueden perjudicar el progreso del ciclo celular o el desarrollo del embrión clonado. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones . Breve Descripción de los Dibujos El archivo de la solicitud contiene dibujos ejecutados en color (Figuras 3, 6A-6C, 8A, y 8B) . Las Figuras 1A y IB ilustran la inmunodetección de proteínas de envoltura nuclear y de matriz nuclear en embriones de preimplantación bovinos . La Figura 1A es una imagen de embriones bovinos fertilizados in vitro en la etapa pronuclear y de ocho células, examinados utilizando los mismos anti-cuerpos . Las flechas de la Figura 1A hacia anti-MuMA y anti-AKAP95 marcan el pronúcleo femenino de los embriones en la etapa pronuclear. Los insertos de la Figura 1A son imágenes de ADN marcado con 0.1 microgramos/ml de Hoechst 33342 (barras, 20 mieras) . La Figura IB es el análisis de inmuno-manchado de fibroblastos bovinos (filas superiores) y embriones en la etapa pronuclear (filas inferiores) . Los marcadores de peso molecular se muestran en kDa a la derecha de la Figura IB. La Figura 2 ilustra la dinámica de la envoltura nuclear, NuMA, y AKAP95 , durante la condensación de cromatina prematura y el ensamble pronuclear en embriones de trasplante nuclear. La Figura 2 es una imagen de fibroblastos donadores bovinos (célula donadora) , embriones de trasplante nuclear en la etapa de condensación de cromatina prematura (3 horas después de la fusión) , embriones de trasplante nuclear en la etapa pronu-clear (19 horas después de la fusión) , y embriones de la etapa pronuclear partenogenéticos activados como se describe en la presente. El desensamble del núcleo donador y el ensamble de los nuevos pronúcleos se monitorearon en la etapa de condensación de cromatina prematura 3 horas después de la inyección "hpi" ("PCC"), y 7 horas después de la inyección ("NT PN"), utilizando anti-cuerpos anti-lamina B, laminas A/C, NuMA, y AKAP95. Los pronúcleos femeninos formados después de la activación partenoge-nética de los oocitos Mil con SrCl2 10 mM, también se analizaron 5 horas después de iniciar el tratamiento de activación ("Part. PN") . Las laminas A/C se ensamblaron en los pronúcleos de embriones de trasplante nuclear en la etapa pronuclear bovina. El ADN se contra-tiñó con 0.1 microgramos/ml de Hoechst 33342. TRITC se refiere a la marca con anti-cuerpos secundarios conjugados con TRITC (barras, 20 mieras) . La Figura 3 es una gráfica que demuestra que AKAP95 está más fuertemente anclado en los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear, comparándose con los embriones partenogenéticos. Esta gráfica muestra el porcentaje relativo de lamina B no extraída, A AP95, y marca de ADN en los pronúcleos de los partenotes, los embriones de trasplante nuclear, y los núcleos donadores somáticos después de la extracción in situ con Tritón X-100 al 0.1 por ciento y 1 mg/ml de ADNsa I, junto con NaCl 100 o 300 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente, antes de la fijación con paraformaldehído al 3 por ciento. La localización de las laminas tipo B (rojas) y de AKAP95 (verde) se examinó mediante inmunofluorescencia doble. Se cuantificó la intensidad de la marca de fluorescencia en cada canal - rojo (lamina B) , azul (ADN) , y verde (AKAP95) -. El valor de referencia (100 por ciento no extraído) representa las cantidades relativas de teñido de laminas tipo B, ADN, y ????95 en los embriones o en las células permeabilizadas con Tritón X-100 al 0.1 por ciento solamente antes de la fijación. Se examinaron aproximadamente 30 embriones en cada grupo. La Figura 4 demuestra que las laminas A/C se transcriben de novo sobre la reconstitución pronuclear en los embriones de trasplante nuclear. La Figura 4 es una imagen de embriones de trasplante nuclear pronucleares bovinos producidos mediante fusión de fibroblastos y activación de oocitos con ya sea ionomicina 5 µ? durante 4 minutos seguida por 10 microgramos/ml de cicloheximida/2.5 microgramos/-ml de citocalasina D durante 4 horas ( 1 , -) , ionomicina/cicloheximida/ citocalasina D como en (b1), seguidas por 9 horas adicionales de cultivo con 10 microgramos/ml de cicloheximida (b 1 ' , CHX) , o incubación como en (b') junto con 1 microgramo/ml de actinomicina D durante todo el tratamiento de activación (b11'). Se utilizaron anti-cuerpos anti-lamina B (policlonal de conejo) y anti-laminas A/C (mAb) sobre las mismas preparaciones . Los insertos son imágenes de la marca de ADN con 0.1 microgramos/ml de Hoechst 33342 (barras, 20 mieras) .

La Figura 5 es una gráfica de la condensación del cromosoma y del rompimiento de la envoltura nuclear en extracto citoplásmico mitótico (M-S15) , extracto citosólico mitótico (M-S200) , y extracto de oocitos ( II-S15) (n=300-400 núcleos examinados en 3-5 réplicas) . Las Figuras 6A-6C son juegos de imágenes del análisis de inmunofluorescencia de núcleos de fibroblastos bovinos de entrada purificados (Figura 6A) y cromatina condensada producida en extracto citosólico mitótico (Figura 6B) y en extracto de oocitos (Figura 6C) . Se examinaron los marcadores nucleares indicados. El ADN se contra- iñó con yoduro de propidio (rojo) (barras, 10 mieras) . La Figura 7 es un juego de imágenes el análisis de inmunofluorescencia de la cromatina condensada obtenida en oocitos en seguida de los métodos convencionales de trasplante nuclear (NT) o inyección nuclear (NI) , y en seguida de la inyección de masas de cromatina en los oocitos (CT) utilizando los métodos de la presente invención. Ambas laminas detectables B y A/C parecen ser solubilizadas (barra, 10 mieras) . Las Figuras 8A y 8B son juegos de imágenes del análisis de inmunofluorescencia de pronúcleos resultantes de la transferencia de cromatina, trasplante nuclear, o inyección nuclear. Los embriones se fijaron a las 19 horas después del trasplante nuclear, de la inyección nuclear, o de la transferencia de cromatina, y se marcaron. También se examinaron los pronúcleos partenogenéticos de control (Part.). La Figura 8A muestra el análisis de las laminas A/C y B. La Figura 8B muestra el análisis de AKAP95 y Nu A. Las laminas A/C (marca verde) solamente aparecen en los pronúcleos de trasplante nuclear y de inyección nuclear (barras, 30 mieras) . Descripción Detallada Hemos desarrollado un método novedoso para clonar mamíferos, el cual involucra remodelar el material genético donador antes de insertarse en el oocito receptor. La remodelación se refiere a cualquier cambio morfológico que mejore el desarrollo del oocito de trasplante nuclear resultante sobre aquél derivado a partir de la transferencia de células enteras o bien de núcleos intactos hacia adentro de un oocito receptor. La reprogramación se logra mediante la incubación de un núcleo donador en un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto mitótico, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína) , dando como resultado la disolución de la envoltura nuclear y posiblemente la condensación de cromatina. Este rompimiento de la envoltura nuclear y condensación de cromatina permite la liberación de las proteínas reguladoras de transcripción que se unieron a los cromosomas, y que de otra manera promoverían la transcripción de genes indeseables para el desarrollo del oocito, del embrión, o del feto. Se pueden remover proteínas reguladoras adicionales mediante la purificación de la masa de cromatina antes de transferirla a un oocito receptor. De una manera alternativa, se pueden inmunoagotar las proteínas reguladoras específicas que se liberen de los cromosomas, o se pueden remover de otra manera del medio reprogramado (por ejemplo, un extracto celular) , para impedir que se vuelvan a enlazar a los cromosomas. Después de la transferencia nuclear, las nuevas proteínas del citoplasma del oocito se pueden enlazara los cromosomas durante la descondensación de la cromatina y la formación de la envoltura nuclear en el oocito . Estas proteínas promueven la transcripción de genes que permiten que el oocito se desarrolle hasta una progenie viable. Este método de clonación con transferencia de cromatina produjo embriones con patrones de expresión de proteína que se parecían más estrechamente a los embriones fertilizados in vitro que los embriones clonados producidos utilizando los métodos tradicionales de clonación. Como se ilustra en los Ejemplos 1 y 4, los embriones de transferencia de cromatina expresaron mucho menos proteína lamina A/C que los embriones de transferencia nuclear tradicionales. Las laminas A/C son componentes específicos somáticos de la lamina nuclear que se expresan naturalmente en las células diferenciadas, pero que no se expresan en los embriones . Debido a la interacción reportada de las laminas con los factores de transcripción, las proteínas de cromatina, y el ADN, es probable que la expresión de las laminas A/C en los embriones de transferencia nuclear tradicionales, promueva la expresión de proteínas específicas para las células somáticas que son indeseables para el desarrollo del embrión. Por consiguiente, los embriones de transferencia de cromatina de la presente invención pueden expresar menos proteínas específicas de células somáticas indeseables que los embriones de transferencia nuclear tradicionales. Adicionalmente, los embriones de transferencia de cromatina tuvieron patrones de expresión para NuMA, un componente principal de la matriz nuclear que está implicado en la regulación de la transcripción, que se parecían más estrechamente a los embriones fertilizados in vitro, que los embriones de trasplante nuclear tradicionales . Este resultado también indica que los embriones de transferencia de cromatina se reprograman de una manera más eficiente que los embriones e trasplante nuclear tradicionales . Se desarrolló otro método de clonación que implica reprogramar una célula permeabilizada, mediante su incubación en un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular) , para permitir la adición o la remoción de factores de la célula. De preferencia se vuelve a sellar la membrana de plasma de la célula permeabilizada para encerrar los factores deseados y restablecer la integridad de la membrana de la célula. Luego se transfiere la célula reprogramada hacia adentro de un oocito receptor para la producción de un mamífero clonado. Este método de clonación se ha utilizado para producir fetos que han sobrevivido pasando el día 60. Los resultados preliminares indican que la sobrevivencia fetal entre el día 40 y el día 60 es más alta para los fetos formados utilizando este método (7/10; 70 por ciento) que para los fetos de transferencia nuclear convencionales (8/16; 50 por ciento) . La invención también proporciona métodos para generar embriones quiméricos en los que la mayor parte del tejido placentario es a partir de una fuente genética, y la mayor parte del tejido fetal es a partir de otra fuente genética. Estos embriones quiméricos pueden tener menos anormalidades placenta-rias, y por lo tanto, pueden tener un mayor índice de sobrevivencia. En estos métodos, las células de un embrión fertilizado in vitro o que se presente naturalmente, se ponen en contacto con las células de un embrión producido utilizando los métodos de transferencia nuclear tradicionales, o bien cualquiera de los métodos de clonación novedosos descritos en la presente . Por ejemplo, las células de un embrión fertilizado in vitro se pueden inyectar en la periferia de un embrión de transferencia nuclear (por ejemplo, entre la zona pellucida y el embrión mismo) . Este método se utilizó para producir embriones quiméricos que tuvieron un índice de sobrevivencia del 77 por ciento en el día 40, comparándose con un índice de sobrevivencia del 25 por ciento para los embriones de transferencia nuclear de control . En un método alternativo, las células de un embrión de pre-compactación, fertilizado in vitro, o que se presente naturalmente, se incuban con células de un embrión de transferencia nuclear de pre-compactación bajo condiciones que permitan que las células de cada embrión se reorganicen para producir un solo embrión quimérico (Wells y Powell, Cloning 2:9-22, 2000). En ambos métodos, las células del embrión fertilizado in vitro o del embrión que se presenta naturalmente, de preferencia se incorporan en la placenta, y las células del método de transferencia nuclear de preferencia se incorporan en el tejido fetal. La invención también proporciona un método novedoso, denotado como lipofusión, para insertar un núcleo o cromosomas en células . Este método implica incubar el núcleo o los cromosomas y la célula receptora con un compuesto fusigénico que permita que se transfiera el núcleo o los cromosomas hacia adentro del citoplasma de la célula. Este método se puede aplicar en general a núcleos y cromosomas de todos los tipos de células, y a células receptoras de todos los tipos de células . Estos métodos se describen adicionalmente más adelante. Se observa que cualquiera de los métodos descritos más adelante también se puede llevar a cabo con medios de reprogramación diferentes de los extractos celulares. Por ejemplo, se puede formar un medio de reprogramación mediante la adición de uno o más factores que se presenten naturalmente o recombinantes (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, tales como metiltransfera-sas de ADN, desacetilasas de histona, histonas, protaminas, laminas nucleares, factores de transcripción, activadores, represores, proteínas de remodelación de cromatina, factores de crecimiento, interleucinas, citosinas, u otras hormonas) a una solución, tal como un regulador. De preferencia, uno o más de los factores son específicos para los oocitos o para las células de tallo, tales como las células de tallo embriónico. Ejemplo 1: Evidencia de las Deficiencias de la Reprogramación Nuclear en los Embriones de Trasplante Nuclear Bovinos Tradicionales Distribución de la envoltura nuclear, la matriz nuclear, y los componentes de interfase de cromatina-matriz durante el desarrollo de la pre-implantación bovina Para determinar la distribución de la envoltura nuclear (laminas tipo B y tipo A/C) , de la matriz nuclear (NuMA) , y de los componentes de interfase de cromatina-matriz (A AP95) en los embriones de pre-implantación, se produjeron embriones bovinos mediante fertilización in vi tro (IVP) , y se examinaron mediante análisis de inmuno-fluorescencia. La fertilización bovina in vitro se realizó como se describió anteriormente (Collas y colaboradores, Mol. eprod. Devel. 34:212-223, 1993). Dicho de una manera breve, el esperma bovino congelado-descongelado de un solo toro se puso en capas encima de un gradiente de Percoll del 45 al 90 por ciento, y se centrifugó durante 30 minutos a 700 x g. Se determinó la concentración de esperma en el gránulo, y el esperma se diluyó de tal manera que la concentración final en la fertilización fuera de 106 espermas/ml. A las 22 horas después de la maduración, los oocitos se lavaron tres veces en TL HEPES, y se colocaron en 480 microlitros del medio de fertilización. Se agregaron 20 microlitros de suspensión de esperraa a 10s esper-mas/ml para 50 oocitos. Los embriones se pusieron en cultivo en placas de cultivo de tejido de cuatro pozos conteniendo una mono-capa de fibroblastos fetales de ratón en 0.5 mi de medio de cultivo embrionario cubiertos con 0.3 mi de aceite mineral probado en el embrión (Sigma) . Se colocaron entre 25 y 50 embriones en cada pozo, y se incubaron a 38.5°C en una atmósfera de aire con C02 al 5 por ciento. Los índices de fertilización fueron mayores al 90 por ciento, determinados mediante desarrollo pronuclear . Para el análisis de inmunofluorescencia de estos embriones bovinos fertilizados in vi tro, los anti-cuerpos anti-lamina B humana se obtuvieron del Dr. Jean-Claude Courvalin, C RS, París, Francia. Los anti-cuerpos monoclonales anti-laminas A/C se adquirieron en Santa-Cruz Biotechnology, y los anticuerpos anti-NuMA se obtuvieron en Transduction Laboratories. Los anti-cuerpos policlonales de conejo purificados por afinidad anti-AKAP95 de rata se obtuvieron en Upstate Biotechnologies . Los embriones bovinos fertilizados in vitxo se establecieron sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina, se fijaron con para ormaldehído al 3 por ciento durante 15 minutos, y se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.1 por ciento durante 15 minutos (Collas y colaboradores, J. Cell Biol . 135:1715-1725, 1996) . Las proteínas se bloquearon con albúmina de suero bovino al 2 por ciento en suero regulado con fosfato/Tween 20 al 0.01 por ciento (PBST) durante 15 minutos. Los anti-cuerpos primarios (anti-AKAP95, anti-lamina B, anti-LBR, anti-NuMA, y anti-laminas A/C) , y los anti-cuerpos secundarios, se incubaron cada uno durante 30 minutos, y se utilizaron en una dilución de 1:100 en PBST-BSA. El ADN se contra-tiñó con 0.1 microgramos/ml de Hoechst 33342 incorporado en el medio de montaje antiempañante . Las muestras se montaron sobre portaobjetos, y los cubreobjetos se sellaron con barniz de uñ s. Las observaciones de inmunofluores-cencia se hicieron en un microscopio de epifluorescencia Olympus BX60, y se tomaron fotografías con una cámara JVC CCD y el software AnalySIS. Las imágenes se procesaron utilizando el software Aldus Photostyler. La cuantificación relativa de las señales de fluorescencia se llevó a cabo utilizando el programa de cuantificación AnalySIS. Los datos se expresaron como intensidades de fluorescencia relativas medias. El análisis de inmunofluorescencia de los embriones bovinos mostró que se detectaban laminas tipo B en la periferia nuclear (Figura 1A) . Sin embargo, no se detectaron laminas A/C en la etapa pronuclear o de ocho células. Este fracaso para detectar las laminas A/C en estas tempranas etapas celulares, es el esperado para un marcador de células diferenciadas (Guilli y colaboradores, EMBO J. 6:3795-3799, 1987). La proteína estructural de matriz nuclear, NuMA, se detectó en todas las etapas que se examinaron (Figura 1A) . Sin embargo, en los embriones en la etapa pronuclear bovinos, la marca de NuMA se restringió al pronúcleo femenino (FPN) , el más pequeño de ambos pronúcleos (flechas de la Figura 1A) . ????95, que recientemente se caracterizo en embriones tempranos de ratón (Bomar y colaboradores, manuscrito presentado en 2002) , y que se detectó utilizando anticuerpos anti-AKAP95 de rata purificados por afinidad, también se restringió al pronúcleo femenino (Figura 1A) . No obstante, se observó una distribución intranuclear de AKAP95 en los núcleos de todos los blastómeros en las subsecuentes etapas de desarrollo (Figura 1A) . La especificidad de la marca de inmunofluorescencia se verificó mediante análisis de mancha Western de los fibroblastos fetales primarios bovinos y de los embriones fertilizados in vitro en la etapa pronuclear (Figura IB) . Para este análisis, las proteínas se resolvieron mediante SDS-PAGE al 10 por ciento a 40 mA por gel . Las proteínas se transfirieron electroforáticamente a una membrana de nitrocelulosa en regulador de transferencia (Tris-HCl 25 mM, pH de 8.3, glicina 192 mM, metanol al 20 por ciento, y SDS al 0.1 por ciento) a 100 V durante 1 hora. Las membranas se lavaron durante 10 minutos con suero regulado con Tris (TBS; es decir, NaCl 140 mM, KC1 2.7 mM, y Tris-HCl 25 mM a un pH de 8.0), se bloquearon durante 1 hora con TBST (TBS con T een 20 al 0.05 por ciento) conteniendo leche al 5 por ciento, y se incubaron durante 1.5 horas con los siguientes anti-cuerpos primarios: anti-AKAP95 (dilución de 1:250), anti-lamina B (1:1000), anti-LBR (1:500), anti-NuMA (1:500), y anti-laminas A/C (1:500) . Las manchas se lavaron dos veces durante 10 minutos en TBST, y se incubaron durante 1 hora con anti-cuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) . Las manchas se lavaron dos veces durante 10 minutos en TBS, y se relevaron utilizando quimiluminiscencia mejorada (ECL, Amersham) . Todas las proteínas se detectaron en su Mr aparente esperado: 68 kDa (laminas tipo B) , 70 y 60 kDa (laminas A y C, respectivamente) , ~180 kDa (NuMA) , y 95 kDa (AKAP95) . En total, estos resultados indican que los embriones bovinos de preimplan-tación expresan proteínas estructurales nucleares que se pueden detectar con anti-cuerpos de reacción cruzada. Notoriamente, las laminas A/C no son inmunológicamente detectadas en los embriones de preimplantación bovinos. Debido a que las laminas A/C se expresan en las células somáticas (Figura IB) , constituyen potencialmente los marcadores moleculares para la reprogramación nuclear en los embriones de trasplante nuclear . Dinámicas de envoltura nuclear, NuMA, y AKAP95 en embriones bovinos de trasplante nuclear Se examinó la dinámica de las estructuras de envoltura nuclear y de matriz nuclear durante el procedimiento de trasplante nuclear tradicional en bovinos. Estas estructuras se investigaron utilizando anti-cuerpos para las laminas A/C y B, NuMA, y AKAP95, respectivamente. Para determinar la dinámica de estos marcadores durante la remodelación nuclear, se produjeron embriones de trasplante nuclear bovinos utilizando fibroblastos fetales primarios, los cuales se aislaron como se describe anteriormente, como las células donadoras (Kasinathan y colaboradores, Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001). Brevemente, las células se cosecharon a partir de fetos bovinos mediante tripsinización, utilizando tripsina al 0.08 por ciento y EDTA al 0.02 por ciento en PBS (tripsina-EDTA) . Las células se sembraron en un matraz de cultivo T75 (Corning) en a-MEM (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento (FBS; Hyclone) , 0.15 gramos/ml de glutamina (Sigma) , ß-mercaptoetanol al 0.003 por ciento (Gibco), y un antibiótico-antimicótico (Gibco) . En el día 3 después de la siembra, las células se cosecharon con tripsina-EDTA, y se congelaron en a-?? /DMSO. Las células Gl se aislaron como se describió anteriormente (Kasinathan y colaboradores, Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001) . Dicho de una manera breve, 24 horas antes del aislamiento, se aplicaron 5.0 x 105 células en un matraz T75 conteniendo 10 mi de ME /FBS. Al día siguiente, las placas se lavaron con PBS, el medio de cultivo fue reemplazado durante 1 a 2 horas, y las placas se agitaron durante 30 a 60 segundos en un Vórtex a velocidad media. El medio se removió, se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos, y el granulo se volvió a suspender en 250 microlitros de MEM/FBS. Los dobletes celulares unidos por un puente citoplásmico se seleccionaron utilizando una micro-pipeta, y se utilizaron para la transferencia nuclear. La transferencia nuclear bovina se llevó a cabo como se describe anteriormente (Kasinathan y colaboradores, Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001) . Los oocitos madurados in vitxo se enuclearon de 18 a 20 horas después de la maduración. Después de transferir las células donadoras Gl al espacio perivitelino, se fusionaron utilizando un solo impulso eléctrico de 2.4 kV/cm durante 20 micro-segundos (Electrocell Manipulator 200, Genetronics) . A las 28-30 horas después de la maduración (es decir, de 28 a 30 horas después de que se colocaron los oocitos en el medio de maduración, después de recolectarse de los ovarios, y cuando menos 2 horas después de la fusión con las células donadoras) , los oocitos reconstruidos y los controles partenogenéticos se activaron con un ionóforo de calcio (5 u ) durante 4 minutos (Cal Biochem) , seguido por 10 microgramos de cicloheximida y 2.5 microgramos de citocalasina D (Sigma) en un medio ACM (NaCl 100 mM, KC1 3 mM, CaCl2 127 mM, NaHC03 25 mM, lactato de sodio 1 mM, piruvato 0.4 mM, L-glutamina 1 mM, 3 mg/ml de albúmina de suero bovino, aminoácidos de BME al 1 por ciento, y aminoácidos no esenciales de MEM al 1 por ciento) , durante 5 horas (Liu y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998) . Después de la activación, los embriones de trasplante nuclear o los huevos de los oocitos se lavaron cinco veces y se co-cultivaron con fibroblastos fetales de ratón a 38.5°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento. Los embriones reconstituidos se activaron utilizando métodos convencionales, y 3 horas después de la fusión, los embriones en la etapa de condensación de cromatina prematura (PCC) se fijaron con paraformaldehído, y se analizaron mediante inmunofluorescencia, utilizando anti-cuerpos para laminas A/C, lamina B, NuMA, y AKAP95 (Figura 2, PCC) . Además, los grupos de embriones de trasplante nuclear que se dejaron progresar hasta la etapa pronuclear (PN) (es decir, embriones bovinos 15 horas después de la fusión) se analizaron de una manera similar (Figura 2, trasplante nuclear-PN) . Como controles, también se examinaron los oocitos partenogenéticos activados como se describe en la presente, en la etapa pronuclear (Figura 2, Part. PN) . Como se esperaba, las células donadoras somáticas (fibroblastos fetales bovinos, Figura 2) expresaron todos los marcadores con una distribución anticipada de la literatura. En la etapa de condensación de cromatina prematura, se evidenciaron masas de cromosomas condensadas distintas mediante teñido del ADN con Hoechst 33342. No se detectaron laminas A/C y B sobre o cerca de los cromosomas condensados (Figura 2, PCC) , presumiblemente como un resultado de su dispersión en el citoplasma del huevo. Se detectó algo de NuMA marcado; este NuMA presumiblemente estaba asociado con los polos de huso que mantenían los cromosomas condensados. En contraste, AKAP95 estuvo asociado con los cromosomas condensados (PCC) . Este resultado recuerda la marca con AKAP95 en las células humanas mitóticas (Collas y colaboradores, J. Cell. Biol. 147:1167-1180, 1999; Steen y colaboradores, J. Cell. Biol. 150:1251-1262, 2000). En la etapa pronuclear, se detectaron todos los marcadores. Las laminas A/C estuvieron presentes en la envoltura pronuclear (Figura 2, trasplante nuclear-PN) . Esto contrastó con su ausencia de la envoltura de los pronúcleos de los partenotes de control (Figura 2) , y de la envoltura de los pronúcleos fertilizados (Figura 1A) . La lamina B se detectó en los pronúcleos de trasplante nuclear, así como en los pronúcleos de control. De la misma manera, NuMA y AKAP95 decoraron el interior nuclear, excepto por los nucléolos. La marca con NuMA fue consistentemente más brillante en los pronúcleos de trasplante nuclear que en los pronúcleos partenogenéticos de control (compare el trasplante nuclear PN y Part . PN, Figura 2) . Colectivamente, estas observaciones indican que los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear se parecen a los marcadores nucleares somáticos de las laminas A y C, y exhiben un fuerte teñido de NuMA. Anclaje diferencial de AKAP95 en pronúcleos de embriones partenogenéticos y embriones de trasplante nuclear La proteína de anclaje de cinasa-A, A AP95, es una proteína nuclear implicada en la condensación de cromosomas mitótica. Para utilizarse como otro marcador molecular que afecte a la reprogramación de los núcleos somáticos después del trasplante nuclear, se caracterizaron las propiedades de anclaje intranuclear de AKAP95 en embriones en la etapa pronuclear de trasplante nuclear bovino formados a partir de fibroblastos fetales. También se examinó el anclaje de AKAP95 en los pronúcleos de embriones partenogenéticos y en los núcleos de células donadoras somáticas . El anclaje intranuclear de ? ??95 en embriones pronucleares se examinó in situ mediante extracción de embriones con Tritón X-100 al 0.1 por ciento, 1 mg/ml de ADNsa I, y NaCl ya sea en 100 o en 300 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente. Como se observó anteriormente, los pronúcleos masculinos no alojaron nada de AKAP95. En contraste, una cantidad significativa de AKAP95 y de ADN fue resistente a la ADNsa I y al NaCl 300 mM en los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear, y en los núcleos donadores en bovinos (Figura 3) . Las laminas tipo B no fueron extraídas por la ADNsa I y por el NaCl 300 mM en los pronúcleos de partenotes o de trasplante nuclear (Figura 3) , sugiriendo que las alteraciones en las distribuciones de A AP95 y del ADN no resultaban de los cambios grandes en la arquitectura nuclear. Estos datos indican que, como en los núcleos somáticos, A AP95 está más estrechamente anclado a las estructuras intranu-cleares en los pronúcleos de trasplante nuclear que en los pronúcleos partenogenéticos en los bovinos. Todavía queda por determinar si esta asociación impone limitaciones sobre la organización del ADN o sobre los resultados de la organización alterada del genoma en los embriones de trasplante nuclear. Debido a que el ADN resistente a la ADNsa I es de transcripción silenciosa, la remodelación incompleta del anclaje de A AP95 después del trasplante nuclear posiblemente perjudique la expresión de genes importantes para el desarrollo.

Mala regulación de transcripción de laminas A/C en embriones bovinos de trasplante nuclear Una observación sorprendente fue que las laminas A/C se reensamblan en la periferia de los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear bovinos, mientras que este marcador específico de células somáticas está ausente de los pronúcleos fertilizados in vitro y partenogenéticos . Por consiguiente, investigamos si el reensamble de las laminas A/C resultaba de (i) la redirección de las laminas somáticas desensambladas en la etapa de condensación de cromatina prematura (Figura 2) , (ii) la traducción y ensamble de laminas a partir de un grupo de ARNm de lamina A/C materno, o (iii) la transcripción de novo del gen de lamina A somática (L NA) en los pronúcleos de trasplante nuclear. Para distinguir entre estas posibilidades, se produjeron embriones de trasplante nuclear bovinos ya sea mediante el procedimiento de trasplante nuclear "tradicional" como se describe en la presente, mediante el trasplante nuclear seguido por activación de los embriones reconstituidos con el inhibidor de síntesis de proteína cicloheximida (CHX) , o mediante el trasplante nuclear seguido por activación en la presencia del inhibidor de polimerasa II (PolII) de ARN, actinomicina D (ActD) para inhibir la transcripción de novo. Para cultivar los embriones de trasplante nuclear bovinos en cicloheximida, los oocitos se activaron después de la transferencia nuclear como se describe anteriormente, excepto que los oocitos se incubaron durante 14 horas en cicloheximida (CHX) . A las 14 horas después de la activación, los oocitos se lavaron cinco veces, y se colocaron en un medio de cultivo ACM conteniendo 15 microgra-mos/ml de Hoechst 33342 (Sigma) durante 1 hora. Después de la incubación, se observó el desarrollo pronuclear mediante microscopio de epifluorescencia. Luego se fijaron los embriones pronucleares en paraformaldehído al 3 por ciento en suero regulado con fosfato, se lavaron, y se montaron sobre portaobjetos. Para cultivar los oocitos de trasplante nuclear bovinos en actinomicina D, los oocitos se activaron después de la transferencia nuclear como se describe anteriormente, excepto que se agregaron 5 microgramos/ml de actinomicina D (ActD) al paso de incubación con cicloheximida. Después de 5 horas, los huevos se lavaron cinco veces, y se colocaron en un medio de cultivo ACM conteniendo 5 microgramos/ml de actinomicina D. A las 14 horas después de la activación, los huevos se lavaron cinco veces, y se colocaron en un medio de cultivo ACM conteniendo 15 microgramos/ml de Hoechst 33342 (Sigma) durante 1 hora. Después de la incubación, se observó el desarrollo pronuclear, mediante microscopio de epi luorescencia . Los embriones en la etapa pronuclear se fijaron en paraformaldehído al 3 por ciento en suero regulado con fosfato, se lavaron, y se montaron sobre portaob etos . El ensamble de lamina B alrededor de los pronúcleos de trasplante nuclear no fue afectado por la inhibición de la síntesis de proteína o de ARN. Este resultado indica que la lamina B se reensambló a partir de ya sea un grupo somático previamente desensamblado, y/o a partir de un grupo grande de lamina B en el citoplasma del oocito. Las laminas A/C, que se detectaron en los pronúcleos de trasplante nuclear (Figura 2) , estuvieron ausentes de los núcleos reformados después de la activación con cicloheximida. Este resultado indica que el ensamble de las laminas A/C requiere de la síntesis de proteína de novo, y que estas laminas no son redirigidas a partir de un grupo somático desensamblado llevado hacia adentro del oocito mediante inyección de núcleo donador o de fusión celular. Adicionalmente, las laminas A/C no se reensamblan cuando se reactivan los embriones en la presencia de actinomicina D. Este resultado indica que el reensamble de las laminas A/C en los pronúcleos de trasplante nuclear resulta de la transcripción de novo del gen LMNA en el pronúcleo reconstituido. El NuMA, que se detectó en los pronúcleos de trasplante nuclear, no se reensambló en los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear activados con cicloheximida, pero se detecta ligeramente en los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear tratados con actinomicina D. Este descubrimiento sugiere mucho que el reensamble de NuMA en los pronúcleos de trasplante nuclear requiere que se presente la traducción de novo, cuando menos en parte, a partir de un grupo de ARNm de NuMA materno. La observación consistente de que la marca anti-NuMA es más débil en los pronúcleos de los embriones de trasplante nuclear tratados con actinomicina D, comparándose con los embriones de trasplante nuclear no tratados de control (compare b' y b'1' en la Figura 4) , sugiere que parte del ensamble de NuMA en los pronúcleos de trasplante nuclear resulta de la transcripción de novo del gen NuMA en la etapa pronuclear. Colectivamente, estos resultados indican que el gen LMNA no se desactiva después de la remodelación nuclear después del trasplante nuclear. De una manera similar, el gen NuMA aparentemente permanece activo en los embriones de trasplante nuclear pronucleares . Es posible que tenga lugar una inactivación transitoria de estos genes durante la condensación de cromatina prematura, como es anticipado por la naturaleza altamente condensada de la cromatina (Figura 2) . Estos resultados ilustran claramente la reprogramación nuclear incompleta en los embriones de trasplante nuclear producidos bajo las condiciones descritas en la presente. Como se describió anteriormente para AKAP95, proponemos que la persistencia de las laminas A/C en los pronúcleos de trasplante nuclear afecta a la expresión genética, tal como la expresión de los genes importantes para el desarrollo. Las interacciones previamente reportadas de las laminas A y C con las proteínas de cromatina y el ADN, y la asociación de estas laminas con los factores de transcripción, también apoyan esta hipótesis.

Ejemplo 2: Uso de Masas de Cromatina Donadora Reprogramada para Clonar Mamíferos. Para superar el problema de la reprogramación incompleta en los embriones de transferencia nuclear tradicionales, que se demostró en el Ejemplo 1, se desarrollaron nuevos métodos para reprogramar de una manera más eficiente la cromatina donadora antes de la transferencia nuclear. Estos métodos involucran incubar un núcleo a partir de una célula donadora en un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto celular), que dé como resultado la disolución de la envoltura nuclear, y posiblemente la condensación de cromatina. Este rompimiento de la envoltura nuclear y condensación de cromatina permite la liberación de las proteínas reguladoras de transcripción que estaban unidas a los cromosomas, y que de otra manera promoverían la transcripción de los genes indeseables para el desarrollo del oocito, del embrión, o del feto. Adicionalmente, las proteínas reguladoras a partir del medio de reprogramación pueden enlazarse a la masa de cromatina, y pueden promover la transcripción de genes deseables para el desarrollo. Preparación a granel de núcleos donadores para utilizarse en clonación Se pueden aislar tantos como varios millones de núcleos a partir de poblaciones celulares sincronizadas o no sincronizadas en cultivo. Las poblaciones celulares se pueden sincronizar de una manera natural o química. De preferencia, cuando menos el 40 , 60 , 80 , 90 , o 100 por ciento de las células de una población, se detienen en la fase G0 o G1. Para realizar esto, las células se pueden incubar, por ejemplo, en suero bajo, tal como suero al 5 por ciento, al 2 por ciento, o al 0 por ciento, durante 1 , 2 , 3 , o más días, para incrementar el porcentaje de células en la fase G0 . Para sincronizar las células en Gl 7 las células se pueden cultivar hasta la confluencia como células unidas, y luego se pueden incubar con 0 . 5 - 1 microgramo/ml de nocodazol (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) durante 17 a 20 horas, como se describió anteriormente (ver, por ejemplo. Collas y colaboradores, J. Cell Biol. 147 : 1167 - 1180 , 1999 , y las referencias en el mismo) . Los matraces que contienen las células unidas se agitan vigorosamente dando repetidamente pequeños golpecitos a los matraces con una mano, dando como resultado la separación de las células mitóticas y los dobletes en fase Gx . Los dobletes en fase Gj, son pares de células alargadas al final del proceso de división que todavía están conectadas por un puente delgado. Los dobletes en fase Gx separados se pueden aislar del medio basándose en esta estructura de doblete característica. Los dobletes en fase G1 pueden permanecer unidos o pueden dividirse en dos células separadas después de su aislamiento. Las células sincronizadas o no sincronizadas se cosechan en suero regulado con fosfato (PBS) utilizando procedimientos convencionales, y se llevan a cabo varios pasos de lavado para transferir las células desde su medio original hasta un regulador hipotónico (HEPES 10 mM, pH de 7.5, MgCl2 2 mM, KC1 25 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 M, leupeptina 10 µ?, pepstatina A 10 µ?, inhibidor de tripsina de semilla de soya 10 µ?, y PMSF 100 uM) . Por ejemplo, las células se pueden lavar con 50 mi de suero regulado con fosfato, y se granulan mediante centrifugación a 500 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante del suero regulado con fosfato se decanta, y las células granuladas se vuelven a suspender en 50 mi de suero regulado con fosfato, y se centrifugan como se describió anteriormente. Después de esta centrifugación, las células granuladas se vuelven a suspender en 20 a 50 volúmenes de regulador hipotónico helado, y se centrifugan a 500 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante nuevamente se desecha, y se agregan aproximadamente 20 volúmenes de regulador hipotónico al granulo celular. Las células se vuelven a suspender cuidadosamente en este regulador, y se incuban sobre hielo durante cuando menos 1 hora, dando como resultado el hinchamiento gradual de las células . Para permitir el aislamiento de los núcleos a partir de las células, las células se lisan utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, se pueden transferir de 2 a 5 mi de la suspensión celular a un homogeneizador de vidrio, y se homogeneizan en Dounce utilizando de 10 a 20 recorridos iniciales de un pistilo de ajuste estrecho. De una manera alternativa, la suspensión celular se homogeneiza utilizando una mezcladora motorizada (por ejemplo, Ultraturrax) . Si se desea, la lisis celular se puede monitorear utilizando el microscopio de contraste de fases con una amplificación de 40 veces. Durante esta homogeneización, los núcleos deben permanecer intactos, y la mayoría o de preferencia todos los componentes citoplásmicos originalmente unidos, tales como vesículas, organelos, y proteínas, deben liberarse de los núcleos. Si es necesario, se pueden agregar de 1 a 20 microgramos/ml de los inhibidores citoesquelético, citocalasina B o citocalasina D, al regulador hipotónico anteriormente mencionado, para facilitar este proceso. La homogeneización se continúa tanto como sea necesario para lisar las células y liberar los componentes citoplásmicos de los núcleos. Para algunos tipos de células, se pueden requerir tantos como 100, 150, o más recorridos del pistilo. Luego se transfiere el lisado a un tubo cónico de 15 mi sobre hielo, y se repite el procedimiento de lisis celular con el resto de la suspensión de células hinchadas. Se agrega sacarosa a partir de una solución de suministro 2M hecha en regulador hipotónico al lisado celular (por ejemplo, se agrega 1/8 de volumen de solución de suministro 2M al lisado) , dando como resultado una concentración final de sacarosa de 250 mM) . Esta solución se mezcla mediante inversión, y los núcleos se granulan mediante centrifugación a 400 x g en un rotor oscilatorio durante 10 a 40 minutos a 4°C. Luego se desecha el sobrenadante, y los núcleos granulados se vuelven a suspender en 10 a 20 volúmenes de regulador nuclear (HEPES 10 mM, pH de 7.5, MgCl2 2 mM, sacarosa 250 mM, C1 25 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 µ?, leupeptina 10 µ?, pepstatina A 10 µ , inhibidor de tripsina de semilla de soya 10 µ , y PMSF 100 µ?) . Los núcleos se sedimentan y se vuelven a suspender en 1-2 volúmenes de regulador nuclear, como se describió anteriormente. Los núcleos recién aislados se pueden utilizar inmediatamente para la reprogramación in vítxo y la transferencia nuclear como se describe más adelante, o se pueden almacenar para su uso posterior. Para el almacenamiento, los núcleos se diluyen en el regulador nuclear hasta una concentración de aproximadamente 105/ml. Se agrega glicerol (2.4 volúmenes de glicerol al 100 por ciento), y se mezcla bien con la pipeta. La suspensión se pone en alícuotas de volúmenes de 100 a 500 microlitros en tubos de 1.5 mi sobre hielo, se congela inmediatamente en un baño de metanol-hielo seco, y se almacena a -80°C. Antes de usarse, las alícuotas de los núcleos se descongelan sobre hielo o a temperatura ambiente. Se agrega un volumen de regulador nuclear helado, y la solución se centrifuga a 1000 x g durante 15 minutos en un rotor oscilatorio. Los núcleos granulados se vuelven a suspender en 100-500 microlitros de regulador nuclear, y se centrifugan como se describió anteriormente. Luego los núcleos granulados se vuelven a suspender en un volumen mínimo de regulador nuclear, y se almacenan sobre hielo hasta su uso. Preparación de extracto mitótico o del medio para utilizarse en la reprogramación del material genético donador Para la preparación de un extracto mitótico, una línea celular somática (por ejemplo, fibroblastos) se sincroniza en mitosis mediante incubación en 0.1-1 microgramo/ml de nocodazol durante 17 a 20 horas (por ejemplo, Collas y colaboradores, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999, y las referencias en el mismo), y las células mitóticas se separan mediante agitación vigorosa, como se describió anteriormente. Los dobletes en fase Gi separados se pueden desechar, o se puede dejar que permanezcan con las células mitóticas, las cuales constituyen la mayoría de las células separadas (normalmente cuando menos el 80 por ciento) . Las células separadas cosechadas se centrifugan a 500 x g durante 10 minutos, en un tubo cónico de 10 mi a 4°C. Se agrupan varios gránulos celulares, se vuelven a suspender en un volumen total de 50 mi de suero regulado con fosfato frío, y se centrifugan a 500 x g durante 10 minutos a 4°C. Se repite este paso de lavado con suero regulado con fosfato . El gránulo celular se vuelve a suspender en aproximadamente 20 volúmenes de regulador de lisis celular helado (HEPES 20 mM, pH de 8.2, MgCl2 5 mM, EDTA 10 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 µ?, leupeptina 10 µ?, pepstatina A 10 µ?, inhibidor de tripsina de semilla de soya 10 µ?, PMSF 100 µ?, y opcionalmente 20 microgramos/ml de citocalasina B) , y las células se sedimentan mediante centrifugación a 800 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se desecha, y el gránulo celular se vuelve a suspender cuidadosamente en no más de un volumen de regulador de lisis celular. Las células se incuban sobre hielo durante 1 hora para permitir el hinchamiento de las células . Las células se lisan ya sea mediante sonicación utilizando un sonicador de punta, u homogeneización Dounce, utilizando mortero y pistilo de vidrio. La lisis celular se realiza hasta que se lisen cuando menos el 90 por ciento de las células y de los núcleos, lo cual se puede evaluar utilizando el microscopio de contraste de fases. El tiempo de sonicación requerido para la lisis de cuando menos el 90 por ciento de las células y núcleos puede variar dependiendo del tipo de célula utilizada para preparar el extracto. El lisado celular se coloca en un tubo centrífugo de 1.5 mi, y se centrifuga de 10,000 a 15,000 x g durante 15 minutos a 4°C, utilizando un centrífugo de mesa. Los tubos se remueven del centrífugo y se colocan inmediatamente sobre hielo. El sobrenadante se recolecta cuidadosamente utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros, y se reúne el sobrenadante de varios tubos y se coloca sobre hielo. Este sobrenadante es el extracto "citoplásmico mitótico" o "MS15". Este extracto celular se puede poner en alícuotas en volúmenes de 50 microlitros o de 10 microlitros de extracto por tubo sobre hielo, dependiendo de si se utilizará el método regular o el micro-método para la generación de las masas de cromatina. Los extractos inmediatamente se congelan instantáneamente sobre nitrógeno líquido, y se almacenan a -80 °C hasta su uso. De una manera alternativa, el extracto celular se coloca en un tubo ultracentrífugo sobre hielo (por ejemplo, adaptado con un rotor S 55 Ti; Beckman) . Si es necesario, el tubo se recubre con aceite mineral hasta la parte superior. El extracto se centrifuga a 200,000 x g durante 3 horas a 4°C para sedimentar las vesículas de membrana contenidas en el extracto MS15. Al final de la centrifugación, se desecha el aceite. El sobrenadante se recolecta cuidadosamente, se agrupa si es necesario, y se coloca en un tubo frío de 1.5 mi sobre hielo. Este sobrenadante es referido como el extracto " S200" o "citosólico mitótico" . El extracto se pone en alícuotas y se congela como se describe para el extracto S15. Si se desea, el extracto se puede enriquecer con factores nucleares adicionales. Por ejemplo, los núcleos se pueden purificar a partir de las células del tipo de célula a partir del cual se derive el extracto de reprogramación, o a partir de células de cualquier otro tipo de célula, y se lisan mediante sonicación como se describió anteriormente . Los factores nucleares se extraen mediante una incubación de 10 a 60 minutos en regulador nuclear conteniendo NaCl o KCl en una concentración de 0.15-800 mM con agitación. El lisado se centrifuga para sedimentar los componentes no extraíbles. El sobrenadante que contiene los factores extraídos de interés se dializa para determinar el NaCl o el KCl. El extracto nuclear dializado se pone en alícuotas y se almacena congelado. Este extracto nuclear se agrega en diferentes concentraciones al extracto celular entero descrito anteriormente, antes de agregar los núcleos para la reprogramación.

También se pueden preparar extractos mitóticos a partir de células germinales, tales como oocitos o células germinales masculinas. Por ejemplo, los oocitos en la metafase II que se detengan naturalmente en esta etapa se pueden cosechar, lavar, y lisar como se describió anteriormente para la generación de un extracto de oocitos . Para preparar un extracto de células germinales masculinas, las células germinales se aislan de los testículos obtenidos del matadero, moliendo el órgano y mediante centrifugación diferencial de las células cosechadas sobre un gradiente de sacarosa o percoll. Las células germinales se separan de las células somáticas (Leydig y Sertoli) , se lavan mediante suspensión y sedimentación en suero regulado con fosfato. Luego las células se lavan una vez en regulador de lisis celular helado, como se describió anteriormente, y se lisan mediante sonicación. El lisado se aclara mediante centrifugación a 15,000 x g durante 15 minutos a 4°C, y el sobrenadante (es decir, el extracto celular germinal) se pone en alícuotas y se congela instantáneamente en nitrógeno líquido. Como una alternativa a un extracto celular, también se puede formar un medio de reprogramación agregando uno o más factores que se presenten naturalmente o recombinantes (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas tales como metiltransfera-sas de ADN, desacetilasas de histonas, histonas, protaminas, laminas nucleares, factores de transcripción, activadores, represores, proteínas de remodelación de cromatina, factorses de crecimiento, interleucinas , citosinas, u otras hormonas) a una solución, tal como un regulador. De preferencia, uno o más de los factores son específicos para los oocitos o para las células de tallo. Formación de masas de cromatina condensada mediante exposición de los núcleos a un extracto o medio mitótico Una alícuota del extracto MS15 o MS200, o el medio mitótico, se descongela sobre hielo. Se agrega un sistema generador de ATP (0.6 microlitros) a 20 microlitros de extracto o medio, y se mezclan mediante vórtice. Para la preparación del sistema generador de ATP, se mezclan proporciones iguales de suministro de ATP 100 mM, fosfato de creatina 1M, y 2.5 mg/ml de soluciones de suministro de cinasa de creatina (lOOx) hechas en H20, y se almacenan sobre hielo hasta su uso. Después de la adición del sistema de generación de ATP al extracto, las concentraciones finales son ATP 1 mM, fosfato de creatina 10 mM, y 25 microgramos/ml de cinasa de creatina. La suspensión de núcleos se agrega al extracto o al medio en una concentración de 1 microlitro de núcleos por 10 microlitros de extracto o medio, se mezclan bien con pipeta, y se incuban en un baño de agua a 30°C, 33 °C, 35°C, 37°C, o 39°C. El tubo que contiene la mezcla se golpea suavemente a intervalos regulares para impedir que los cromosomas formen grumos en el fondo del tubo. El rompimiento de la envoltura nuclear y la condensación de cromosomas se monitorean a intervalos regulares, tales como cada 15 minutos, bajo un microscopio. Cuando se ha roto la envoltura nuclear y han empezado a condensarse los cromosomas, se inicia el procedimiento para recuperar las masas de cromatina a partir del extracto o del medio. Formación de masas de cromatina descondensadas mediante exposición de los núcleos a un extracto o medio mitótico y a anticuerpos anti-NuMA De una manera alternativa, se pueden formar masas de cromatina que no estén condensadas o que solamente estén parcialmente condensadas, llevando a cabo el procedimiento anterior después de precargar los núcleos aislados con un anticuerpo para la proteína de matriz nuclear MuMA (Steen y colaboradores, J. Cell Biol. 149, 531-536, 2000). Este procedimiento permite remover los componentes nucleares de la cromatina mediante la disolución de la membrana nuclear que rodea a los núcleos donadores; sin embargo, el paso de condensación es inhibido por la adición del anti-cuerpo anti-NuMA. El prevenir la condensación de cromosomas puede reducir el riesgo de rompimiento o pérdida de cromosomas, mientras que se incuban los cromosomas en el extracto mitótico. Para este procedimiento, los núcleos celulares purificados (2000 núcleos/microlitro) se permeabilizan en 500 microlitros de regulador nuclear conteniendo 0.75 microgramos/ml de lisolecitina durante 15 minutos a temperatura ambiente. El exceso de lisolecitina se apaga mediante la adición de 1 mi de albúmina de suero bovino al 3 por ciento hecha en regulador nuclear, e incubando durante 5 minutos sobre hielo. Luego se sedimentan los núcleos y se lavan una vez en regulador nuclear. Los núcleos se vuelven a suspender en 2000 núcleos/microlitro en 100 microlitros de regulador nuclear conteniendo un anti-cuerpo anti-NuMA (dilución de 1:40; Transduction Laboratories) . Después de una incubación de 1 hora sobre hielo con agitación suave, los núcleos se sedimentan a 500 x g a través de sacarosa 1 M durante 20 minutos. Luego los núcleos se vuelven a suspender en regulador nuclear, y se agregan a un extracto o medio mitótico conteniendo un sistema regenerador de ATP, como se describe en la sección anterior. OpcionaIntente, el anti-cuerpo anti-NuMA se puede agregar al extracto o al medio para prevenir adicionalmente la condensación de cromosomas . Formación de masas de cromatina descondensadas mediante exposición de los núcleos a una solución de detergente y/o sal, o a una solución de cinasa de proteína También se pueden formar masas de cromatina que no estén condensadas, o que estén sólo parcialmente condensadas, mediante exposición a un detergente o a cinasa de proteína. El detergente se puede utilizar para solubilizar los componentes nucleares que no estén enlazados o que estén flojamente enlazados a los cromosomas en el núcleo, dando como resultado la remoción de la envoltura nuclear. Para este procedimiento, se incuban núcleos de células purificados (2,000-10,000 núcleos/ml) en regulador nuclear complementado con un detergente, tal como Tritón X-100 del 0.1 por ciento al 0.5 por ciento o NP-40. Para facilitar la remoción de la envoltura nuclear, se puede agregar sal adicional, tal como NaCl, al regulador, en una concentración de aproximadamente 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75, o 1 M. Después de una incubación de 30 a 60 minutos sobre hielo con ligera agitación, los núcleos se sedimentan mediante centrifugación a 1,000 x g en un rotor oscilatorio durante 10 a 30 minutos, dependiendo del volumen total . Los núcleos granulados se vuelven a suspender en 0.5 a 1 mi de regulador nuclear, y se sedimentan como se describió anteriormente. Este procedimiento de lavado se repite dos veces para asegurar una remoción completa del detergente y de la sal extra. De una manera alternativa, la envoltura nuclear se puede remover utilizando cinasas de proteína recombinantes o que se presenten naturalmente, solas o en combinación. De preferencia, las cinasas de proteína se purifican utilizando procedimientos convencionales, o se obtienen en una forma purificada en las fuentes comerciales . Estas cinasas pueden fosforilar los componentes de la membrana nuclear, la matriz nuclear, o la cromatina, dando como resultado la remoción de la envoltura nuclear (ver, por ejemplo, Collas y Courvalin, Trends Cell Biol. 10: 5-8, 2000). Las cinasas preferidas incluyen cinasa 1 dependiente de ciclina (CD 1) , cinasa C de proteína (PKC) , cinasa A de proteína (PKA) , cinasa de MAP, cinasa dependiente de calcio/calmodulina (CamKII) , y cinasa de caseína CK1, o cinasa de caseína CK2. Para este método, se incuban aproximadamente 20,000 núcleos purificados en 20 microlitros de regulador de fosforilación a temperatura ambiente en un tubo centrífugo de 1.5 mi. Un regulador de fosforilación preferido para CDK1 (Upstate Biotech-nology) contiene NaCl 200 mM, Tris-HCl 50 mM (pH de 7.2 a 7.6), MgS0410 mM, ß-glicerofosfato 80 mM, EGTA 5 mM, ATP 100 µ?, y DTT 1 mM. Para P C, un regulador preferido contiene NaCl 200 mM, Tris-HCl 50 mM (pH de 7.2 a 7.6), MgS04 10 mM, CaCl3 100 µ?, 40 microgramos/ml de fosfatidilserina, diacilglicerol 20 uM, ATP 100 µ?, y DTT 1 mM. Si se utilizan tanto PKC como CDK1 de una manera simultánea, se utiliza el regulador de fosforilación de CDK1 complementado con 40 microgramos/ml de fosfatidilserina, y diacilglicerol 20 µ?. Un regulador de fosforilación preferido para PKA incluye NaCl 200 mM, MgS0410 mM, Tris 10 mM, Ph de 7.0, EDTA 1 mM, y ATP 100 µ?. Para la cinasa de AP, se puede utilizar el regulador de fosforilación de PKA complementado con CaCl2 10 mM, y DTT 1 mM. Para CamKII, se utiliza el regulador de PKA complementado con DTT 1 mM, o bien un estuche de ensayo de Cinasa Cam de Upstate Biotechnology (Venema y colaboradores, J. Biol. Chem. 272:28187-90, 1997). La reacción de fosforilación se inicia mediante la adición de una cinasa de proteína hasta una cantidad final de 25 a 100 nanogramos . La reacción se incuba a temperatura ambiente durante hasta 1 hora. El rompimiento de la envoltura nuclear se puede monitorear mediante el microscopio durante esta incubación, tal como a intervalos de 15 minutos . Después del rompimiento de la envoltura nuclear, los núcleos se lavan tres veces, como se describió anteriormente para la remoción de la solución de detergente . Recuperación de las masas de cromatina a partir del medio, extracto, solución de detergente y/o sal, o solución de cinasa de proteína El extracto o la solución que contiene las masas de cromatina condensadas, parcialmente condensadas, o no condensa-das, se coloca bajo un volumen igual de una solución de sacarosa 1 hecha en regulador nuclear. Las masas de cromatina se sedimentan mediante centrifugación a 1,000 x g durante 10 a 30 minutos, dependiendo del volumen de muestra, en un rotor oscilatorio a 4°C. El sobrenadante se desecha, y las masas de cromatina granuladas se vuelven a suspender cuidadosamente con pipeta en 0.1 a 1.0 mi de regulador nuclear o de regulador de lipofusión (NaCl 150 mM, aprotinina 10 µ?, leupeptina 10 µ?, pepstatina A 10 µ?, inhibidor de tripsina de semilla de soya 10 µ?, y PMSF 100 µ?, ya sea en HEPES 20 mM alrededor de un pH de 7.0 o de un pH de 7.5,. o bien en MES 20 mM alrededor de un pH de 6.2), y se centrifugan a 1,000 x g durante 10 a 30 minutos. El sobrenadante se desecha, y las masas de cromatina granuladas se vuelven a suspender en regulador nuclear o en regulador de lipofusión, y se almacenan sobre hielo hasta usarse. Cada masa de cromatina se transfiere a una gota de 20 microlitros de medio regulado con HEPES bajo aceite en un plato de micro-manipulación. Se inserta una masa de cromatina en cada oocito enucleado, como se describe más adelante. Micro-método para la preparación de masas de cromatina Se coloca una gota de 10 a 20 microlitros de extracto MS15 o MS200 o del medio mitótico que contenga un sistema generador de ATP, una solución de detergente y/o sal, o una solución de cinasa de proteína, como se describió anteriormente, en una caja de Petri. Luego se agrega una gota de 50 microlitros de dobletes celulares en fase Gx aislados, o células en fase G0 en medio de cultivo, una gota de "lisis" separada de 50 microlitros de medio regulado con HEPES o con bicarbonato conteniendo Tritón X-100 al 0.1 por ciento o NP-40 para utilizarse para facilitar la lisis celular, y una gota de 50 microlitros de medio de inyección de oocito. Cada una de estas gotas se cubre con aceite mineral equilibrado con C02. También se agrega una "gota de lavado" de 50 microlitros de medio de cultivo a la caja de Petri, para utilizarse en el lavado de las células o núcleos lisados . Las células se transfieren a la gota de lisis utilizando una micro-pipeta. Las membranas celulares se lisan en la pipeta mediante suaves aspiraciones repetidas . Cuando se lisa la célula, el lisado se expulsa suavemente hacia la gota de lavado, e inmediatamente se reaspira el núcleo para remover el detergen-te. Opcionalmente, los núcleos se pueden permeabilizar e incubar con anti-cuerpos anti-NuMA antes de agregarse al extracto o medio mitótico. Luego se expulsa el núcleo hacia la gota de MS15, S200, o medio, solución de detergente y/o sal, o solución de cinasa de proteína. El rompimiento nuclear y la condensación de cromosomas se monitorea como se describió anteriormente. Una vez que se ha roto la envoltura nuclear, y si se utilizó un extracto mitótico sin anti-cuerpos anti-NuMA, los cromosomas han empezado a condensarse, se aisla una sola masa de cromatina intacta con una micro-pipeta, y se transfiere a un oocito receptor enucleado, como se describe en seguida. Enucleación de oocitos De preferencia, el oocito receptor es un oocito en la etapa de la metafase II. En esta etapa, el oocito puede estar activado, o puede ya estar suficientemente activado para tratar la masa de cromatina introducida como lo hace un esperma fertilizador. Para la enucleación del oocito, se remueve o se inactiva parte, o de preferencia todo el ADN del oocito. Esta destrucción o remoción del ADN en el oocito receptor impide que el material genético del oocito contribuya al crecimiento y desarrollo del mamífero clonado. Un método para destruir el pronúcleo del oocito es la exposición a luz ultravioleta (Gurdon, en Methods in Cell Biology, Xenopus Laevis: -Practical Uses in cell and Molecular Biology, ay y Peng, editores, Academic Press, California, volumen 36: páginas 299-309, 1991). De una manera alternativa, el pronúcleo del oocito se puede remover quirúrgicamente mediante cualquier técnica convencional (ver, por ejemplo, McGrath y Solter, Science 220:1300-1319, 1983). En un posible método, se coloca una aguja en el oocito, y se aspira el núcleo hacia adentro del espacio interno de la aguja. Luego se puede remover la aguja del oocito sin romper la membrana de plasma (patentes US 4,994,384 y 5,057,420). Lipofusión para la inserción de masas de cromatina en los oocitos La cromatina se puede introducir en los oocitos receptores mediante lipofusión, como se describe más adelante, o mediante técnicas convencionales de micro-inyección o electrofu-sión (ver, por ejemplo, patentes US 4,994,384 y 5,945,577). También se puede utilizar el siguiente método de lipofusión en otras aplicaciones para insertar cromosomas en otras células receptoras . Las masas de cromatina se aislan a partir del extracto mitótico, de la solución de detergente y/o sal, o de la solución de cinasa de proteína, mediante centrifugación, y luego se lavan con regulador de lipofusión, como se describe anteriormente. Las masas de cromatina pueden estar almacenadas en un regulador de lipofusión helado hasta que se usen. De una manera alternativa, las masas de cromatina se ponen en alícuotas, se congelan en nitrógeno líquido y en un baño de metanol-hielo seco, y se almacenan congeladas a -80 °C. La solución de lipofusión se prepara mezclando uno o más reactivos fusigénicos con el regulador de lipofusión en proporciones respectivas que van desde 5:1 hasta 1:10, aproximadamente. Los reactivos fusigénicos consisten en, pero no se limitan a, polietilenglicol (PEG) , y compuestos lipofílieos, tales como Lipofectin®, Lipofectamin®, DOTAP®, DOSPA®, DOPE®, y fracciones de vesícula de membrana. Por ejemplo, se puede utilizar un lípido catiónico, tal como DOTAP®, en una concentración de aproximadamente 0.1 a 30 microgramos/ml en regulador de lipofusión. Alternativa, se puede utilizar una formulación de liposoma consistente en una mezcla de un lípido catiónico y un lípido neutro, tal como DOPE®. Las masas de cromatina, ya sea recién preparadas o congeladas y descongeladas, se mezclan con la solución de lipofusión, para permitir el recubrimiento de las masas de cromatina con el compuesto. La incubación tiene lugar a una temperatura de 20°C a 30°C durante un período de aproximadamente 10 a 30 minutos. Se colocan micro-gotas conteniendo las masas de cromatina en la solución de lipofusión, bajo aceite mineral equilibrado con C02. También se prepara una gota que contenga los oocitos receptores enucleados. Las masas de cromatina recubiertas con el reactivo de lipofusión se recogen en una micro-pipeta, y se insertan en el espacio perivitelino, entre el citoplasma del oocito y la zona pellucida. La masa de cromatina se coloca en seguida de la membrana del oocito, para asegurar el contacto con el oocito. Los complejos de masa de cromatina-oocito se mantienen a una temperatura de 20°C a 30°C, y la fusión se monitorea bajo el microscopio. Una vez que se ha presentado la fusión, los oocitos reconstituidos se activan como se describe más adelante. Activación, cultivo, y trasplante de oocitos reconstituidos Para prevenir la extrusión del cuerpo polar y la pérdida de cromosomas, el oocito se puede activar en la presencia de citocalasina B, o se puede agregar citocalasina B inmediatamente después de la activación (Wakayama y colaboradores, PNAS 96:14984-14989, 1999; Wakayama y colaboradores, Nature Genetics 24:108-109, 2000). Se puede utilizar un medio eléctrico o no eléctrico para activar los oocitos reconstituidos. Las técnicas eléctricas para activar células son bien conocidas en la materia (ver, por ejemplo, patentes US 4,994,384 y 5,057,420) . Los medios no eléctricos para activar células pueden incluir cualquier método conocido en este campo que incremente la probabilidad de la división celular. Los ejemplos de los medios no eléctricos para activar un oocito incluyen incubar el oocito en la presencia de etanol; trifosfato de inositol; ionóforo de Ca++, y un inhibidor de cinasa de proteína; un inhibidor de la síntesis de proteína; ésteres de forgol; tapsigargina, o cualquier componente de esperma. Otros métodos no eléctricos para la activación incluyen someter al oocito a choque frío o tensión mecánica. De una manera alternativa, de 1 a 3 horas después de la transferencia nuclear, los oocitos se pueden incubar durante aproximadamente 6 horas en un medio que contenga Sr2+ para activarlos, y citocalasina B para prevenir la citocinesis y la extrusión del cuerpo polar (Wakayama y colaboradores, PNAS 96:14984-14989, 1999; Wakayama y colaboradores, Nature Genetics 24:108-109, 2000) . Dependiendo del tipo de mamífero clonado, la duración preferida de activación puede variar. Por ejemplo, en los animales domésticos, tales como ganado, el período de activación de los oocitos generalmente es de aproximadamente 16 a 52 horas, o de preferencia de aproximadamente 28 a 42 horas. Después de la activación, el oocito se coloca en el medio de cultivo durante una cantidad de tiempo apropiada para permitir el desarrollo del embrión resultante. En la etapa de dos células, o en una etapa posterior, el embrión se transfiere a una hembra receptora nutridora para desarrollarse hasta término. Para las especies bovinas, los embriones normalmente se cultivan hasta la etapa del blastocito (por ejemplo, durante aproximadamente 6 a 8 días) antes de transferirse a las anfitrionas maternas. Para otros animales clonados, un experto en la materia puede conocer una duración apropiada para el cultivo in vitro, o se puede determinar mediante experimentación de rutina. Los métodos para implantar embriones en el útero de un mamífero también son bien conocidos en este campo. De preferencia, la etapa de desarrollo del embrión está correlacionada con el ciclo del estro del mamífero anfitrión. Una vez que se coloca el embrión en el útero del mamífero, el embrión puede desarrollarse hasta término. De una manera alternativa, se permite que el embrión se desarrolle en el útero hasta un tiempo selecciona-do, y luego se remueve el embrión (o el feto) utilizando métodos quirúrgicos convencionales, para determinar su salud y viabilidad. Los embriones de una especie se pueden colocar en el ambiente uterino de un animal de otra especie. Por ejemplo, se pueden desarrollar embriones bovinos en los oviductos de ovejas (Stice y Keefer, Biology of Reproduction 48: 715-719, 1993). Se puede utilizar cualquier relación de especies cruzadas entre el embrión y el útero en los métodos de la invención. Lipofusión de núcleos con oocitos u otras células receptoras La solución de lipofusión se prepara mezclando uno o más reactivos fusigénicos con el regulador de lipofusión en proporciones respectivas que van desde aproximadamente 5:1 hasta 1:10, como se describe anteriormente. Los núcleos, ya sea recién preparados o congelados y descongelados como se describió anteriormente, se mezclan con la solución de lipofusión, para permitir el recubrimiento de los núcleos con el compuesto. La incubación tiene lugar a una temperatura de 20°C a 30°C durante un período de aproximadamente 10 a 30 minutos. Se colocan micro-gotas conteniendo núcleos en la solución de lipofusión bajo aceite mineral equilibrado con C02. También se prepara una gota que contenga la célula receptora, de preferencia una célula enucleada. Las células receptoras enucleadas se preparan mediante la remoción física de los cromosomas o del núcleo mediante micro-manipulación, O dañando el material genético mediante su exposición a luz ultravioleta, como se describió anteriormente.

Para insertarse en los oocitos, los núcleos recubiertos con el reactivo de lipofusión se recogen en una micro-pipeta, y se insertan en el espacio perivitelino, entre el citoplasma del oocito y la zona pellucida. Para insertarse en otras células receptoras, los núcleos recubiertos de preferencia se colocan en seguida de la membrana celular para asegurar el contacto con la célula. Los complejos de núcleo-célula se mantienen a una temperatura de 20°C a 30°C, y la fusión se monitorea utilizando un microscopio. Una vez que se ha presentado la fusión, los oocitos reconstituidos se activan como se describió anteriormente . Ejemplo 3: Uso de Células Permeabilizadas Reprogramadas para Clonar Mamíferos Las células también se pueden reprogramar sin requerir del aislamiento de los núcleos o de las masas de cromatina a partir de las células. En este método, las células se permeabili-zan y luego se incuban en un medio de reprogramación de interfase o mitótico bajo condiciones que permitan el intercambio de factores entre el medio (por ejemplo, un extracto celular) y las células. Si se utiliza un medio de interfase, los núcleos de las células permanecen enlazados con la membrana; si se utiliza un medio mitótico, se puede presentar la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de cromatina. Después de que se reprograman los núcleos mediante incubación en este medio, de preferencia se libera la membrana de plasma, formando una célula repragramada intacta que contiene los factores deseados a partir del medio. Si se desea, el medio se puede enriquecer con factores nucleares adicionales, como se describe en el Ejemplo 2. Luego las células reprogramadas se fusionan con los oocitos receptores, y los embriones formados a partir de los oocitos reconstituidos se insertan en los mamíferos receptores maternos para la generación de mamíferos clonados . Permeabilización de células Las células que se pueden reprogramar utilizando este procedimiento incluyen células no sincronizadas, y células sincronizadas en la fase G0/ Glf S, G2, o M, o una combinación de estas fases . Las células se permeabilizan utilizando cualquier procedimiento convencional, tal como permeabilización con digitonina o Estreptolisina 0. Dicho de una manera breve, las células se cosechan utilizando procedimientos convencionales, y se lavan con suero regulado con fosfato. Para la permeabilización con digitonina, las células se vuelven a suspender en el medio de cultivo que contenga digitonina, en una concentración de aproximadamente el 0.001 al 0.1 por ciento, y se incuban sobre hielo durante 10 minutos. Para la permeabilización con Estreptolisina 0, las células se incuban en una solución de Estreptolisina 0 (ver, por ejemplo, aghazachi y colaboradores, PASEB J. 11:765-74, 1997, y las referencias en el mismo) durante aproximadamente 15, 30, o 60 minutos a temperatura ambiente. Después de cualquier incubación, las células se lavan mediante centrifuga-ción a 400 x g durante 10 minutos. Este paso de lavado se repite dos veces mediante resuspensión y sedimentación en suero regulado con fosfato. Las células se mantienen en suero regulado con fosfato a temperatura ambiente hasta su uso. De preferencia, las células permeabilizadas se agregan inmediatamente al medio de interfase o mitótico para la reprogramación, como se describe en seguida. Preparación del medio de reprogramación Para preparar un extracto de reprogramación de interfase, las células cultivadas en interfase se cosechan utilizando métodos convencionales, y se lavan mediante centrifugación a 500 x g durante 10 minutos en un tubo cónico de 10 mi a 4°C. El sobrenadante se desecha, y el gránulo celular se vuelve a suspender en un volumen total de 50 mi de suero regulado con fosfato frío. Las células se centrifugan a 500 x g durante 10 minutos a 4°C. Este paso de lavado se repite, y el gránulo celular se vuelve a suspender en aproximadamente 20 volúmenes de regulador de lisis celular de interfase helado (HEPES 20 mM, pH de 8.2, MgCl25 mM, DTT 1 mM, aprotinina 10 µ?, leupeptina 10 µ?, pepstatina A 10 uM, inhibidor de tripsina de semilla de soya 10 µ?, PMSF 100 µ?, y opcionalmente 20 microgramos/ml de citocalasi-na B) . Las células se sedimentan mediante centrifugación a 800 x g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se desecha, y el gránulo celular se vuelve a suspender cuidadosamente en no más de un volumen de regulador de lisis celular de interfase. Las células se incuban sobre hielo durante 1 hora para permitir el hinchamiento de las células. Las células se lisan mediante sonicación utilizando un sonicador de punta, o mediante homoge-neización Dounce utilizando un mortero y pistilo de vidrio. La lisis celular se realiza hasta que se lisen cuando menos el 90 por ciento de las células y núcleos, lo cual se puede evaluar utilizando un microscopio de contraste de fases. El tiempo de sonicación requerido para lisar cuando menos el 90 por ciento de las células y núcleos puede variar dependiendo del tipo de célula utilizada para preparar el extracto. El lisado celular se coloca en un tubo centrífugo de 1.5 mi, y se centrifuga de 10,000 a 15,000 x g durante 15 minutos a 4°C, utilizando un centrífugo de mesa. Los tubos se remueven del centrífugo, y se colocan inmediatamente sobre hielo. El sobrenadante se recolecta cuidadosamente utilizando una punta de pipeta de 200 microlitros, y el sobrenadante de varios tubos se agrupa y se coloca sobre hielo. Este sobrenadante es el extracto "citoplásmico de interfase" o "IS15". Este extracto celular se puede poner en alícuotas en volúmenes de 20 microlitros de extracto por tubo sobre hielo, e inmediatamente se congela de manera instantánea sobre nitrógeno líquido, y se almacena a -80°C hasta su uso. De una manera alternativa, el extracto celular se coloca en un tubo ultracentrífugo sobre hielo (por ejemplo, adaptado para un rotor SW55 Ti; Beckman) . Si es necesario, el tubo se recubre con aceite mineral hasta la parte superior. El extracto se centrifuga a 200,000 x g durante 3 horas a 4°C, para sedimentar las vesículas de membrana contenidas en el extracto IS15. Al final de la centrifugación, se desecha el aceite. El sobrenadante se recolecta cuidadosamente, se agrupa si es necesario, y se coloca en un tubo de 1.5 mi frío sobre hielo. Este sobrenadante es referido como extracto "IS100" o "citosólico de interfase" . El extracto se pone en alícuotas, y se congela como se describe para el extracto IS15. Si se desea, el extracto se puede enriquecer con factores nucleares adicionales. Por ejemplo, los núcleos se pueden purificar a partir de células del tipo de célula del que se derive el extracto de reprogramación, o a partir de células de cualquier otro tipo de célula, y se lisan mediante sonicación como se describió anteriormente. Los factores nucleares se extraen mediante una incubación de 10 a 60 minutos en regulador nuclear conteniendo NaCl o KCl en una concentración de 0.15 a 800 mM con agitación. El lisado se centrifuga para sedimentar los componentes no extraíbles. El sobrenadante que contiene los factores extraídos de interés, se dializa para eliminar el NaCl o el KCl . El extracto nuclear dialisado se pone en alícuotas y se almacena congelado. Este extracto nuclear se agrega en diferentes concentraciones al extracto celular entero descrito anteriormente, antes de agregar las células para la reprogramación. Los extractos de interfase también se pueden preparar a partir de células germinales, tales como oocitos o células germinales masculinas. Por ejemplo, los oocitos se activan como se describe anteriormente, y se cultivan durante 5 horas para permitir que entren en la interfase. Luego se tratan los oocitos como se describe en el Ejemplo 2 para los extractos de oocitos en metafase II, excepto que se omite el EDTA del regulador de lisis. Los extractos celulares germinales masculinos se pueden preparar como se describe en el Ejemplo 2. Como una alternativa a un extracto celular, también se puede formar un medio de reprogramación mediante la adición de uno o más factores que se presenten naturalmente o recombinantes (por ejemplo, ácidos nucleicos o proteínas, tales como metil-transferasas de ???, desacetilasas de histona, histonas, protaminas, laminas nucleares, factores de transcripción, activadores, represores, proteínas de remodelación de cromatina, factores de crecimiento, interleucinas , citocinas, u otras hormonas) a una solución, tal como un regulador. De preferencia, uno o más de los factores son específicos para los oocitos o las células de tallo. Reprogramación de células en un medio Las células permeabilizadas se suspenden en un medio de reprogramación de interfase descrito anteriormente, o en uno de los medios de reprogramación mitóticos descritos en el Ejemplo 2, en una concentración de aproximadamente 100 a 1,000 célu-las/microlitro. Se agregan el sistema generador de ATP y el GTP al extracto como se describe anteriormente, y la reacción se incuba a 30-37°C durante hasta 2 horas para promover la translocación de factores desde el extracto hacia adentro de la célula, y la recuperación nuclear activa o el enlace de los factores con los cromosomas. Las células reprogramadas se centrifugan a 800 x g, se lavan mediante resuspensión, y se centrifugan a 400 x g en suero regulado con fosfato. Las células se vuelven a suspender en el medio de cultivo conteniendo suero fetal de becerro al 20-30 por ciento (FCS) , RPMI16 0 conteniendo CaCl2 2 mM (agregado a partir de un suministro 1M en H20) , o en un medio a-MEM conteniendo CaCl2 2 mM, y se incuban durante 1 a 3 horas a 37°C en una incubadora de cultivo celular regular, para permitir el resellado de la membrana celular. Luego las células se lavan en un medio de cultivo tibio regular (FCS al 10 por ciento) , y se cultivan adicionalmente utilizando condiciones de cultivo convencionales. Método alternativo para reprogramar las células permeabilizadas en los cubreobjetos en lugar de hacerlo en solución De una manera alternativa, las células se pueden permeabilizar mientras están colocadas sobre cubreobjetos, para minimizar la manipulación de las células, y para eliminar la centrifugación de las células, maximizando de esta manera la viabilidad de las células. Las células (por ejemplo, fibroblastos) se cultivan sobre cubreobjetos recubiertos de 16 milímetros recubiertos con poli-L-lisina en RPMI1640 hasta 50,000-100,000 células/cubreobjeto en placas de 12 pozos. Las células se permeabilizan en 200 nanogramos/ml de Estreptolisina 0 en Solución de Sal Equilibrada de Hanks Exenta de Ca2+ (Gibco-BRL) durante 50 minutos a 37°C en una atmósfera regular. Si se desea, se puede medir el porcentaje de células que se permeabilicen bajo estas condiciones, basándose en la recuperación de yoduro de propidio. Se aspira la estreptolisina O; los cubreobjetos se cubren con 80-100 microlitros de medio de reprogramación; y las células se incuban durante 30 minutos a 1 hora a 37°C en una atmósfera de C02. El medio de reprogramación de preferencia contiene al sistema generador de ATP, y 1 iü de cada uno de ATP, CTP, GTP, y UTP. Para volver a sellar las membranas de plasma, se agrega medio a-ME conteniendo CaCl2 2 mM, medio conteniendo suero fetal de becerro al 20-30 por ciento, o RPMI1640 conteniendo CaCl2 2 M a los pozos, y las células se incuban durante 2 horas a 37 °C. Efecto de diferentes tratamientos con estreptolisina O sobre el porcentaje de células permeabilizadas v reselladas Para evaluar el porcentaje de células permeabilizadas y reselladas, se llevaron a cabo titulaciones de dosis y tiempo de incubación con Estreptolisina O (Tabla 1) . La permeabilización de las células se evaluó por la recuperación de 0.1 microgra-mos/ml del yoduro de propidio de teñido de ADN al final del tratamiento con Estreptolisina O. El resellado se evaluó de una manera similar al final del tratamiento de resellado, en un grupo separado de células.

Tabla 1. Permeábilización y resellado de fibroblastos bovinos tratados con Estreptolisina 0 (SLO) Permeábilización Resellado ng/ral SLO N % permeabilizadas N % reselladas +/- +/- sd sd 0 563 1 +/- 2.8 560 89.9 +/- 4.9 100 404 48.6 +/- 4.2 810 86.1 +/- 8.3 200 548 79.2 +/- 1.4 478 84.9 +/- 1.5 500 495 88.7 +/- 1.6 526 87.6 +/- 0.5 1000 425 84.9 +/- 0.7 544 86.4 +/- 1.4 2000 315 96.6 +/- 2.2 425 10.7 +/- 1 4000 200 99 +/- 1.4 200 11.2 +/- 5.3 Evaluación de viabilidad de fibroblastos bovinos permeabilizados con el tratamiento con Estreptolisina O, y expuestos al extracto mitótico Se realizó un análisis TUNEL para evaluar la apoptosis en células permeabilizadas con 0 o 500 nanogramos/ml de Estreptolisina O y reselladas, o en células permeabilizadas con Estreptolisina O, expuestas al extracto mitótico durante 30 o 60 minutos, y reselladas . Las células positivas para TUNEL son las células que sufren apoptosis (es decir, muerte celular) . Los datos muestran que la Estreptolisina O misma no induce la apoptosis (Tabla 2) . La exposición de las células tratadas con Estreptolisina O al extracto mitótico durante 60 minutos, pero no durante 30 minutos, induce un incremento del 10 por ciento en el índice apoptótico, basándose en el análisis TUNEL (Tabla 2) . Basándose en estos datos, una incubación de 30 minutos de las células donadoras en el extracto es más preferible que una incubación de 60 minutos. Mediante análisis de inmuno-fluorescencia de las células, se demostró que las incubaciones de 30 minutos inducen el rompimiento de la envoltura nuclear en la mayoría de los núcleos examinados (aproximadamente 90 por ciento, n>100) . Adicionalmente, los núcleos purificados incubados en el extracto y lavados en regulador N o TL-HEPES y sacarosa, como se describe en el Ejemplo 4 para el método de transferencia de cromatina, no sufren apoptosis (2/34 y 3/47 positivos para TUNEL, respectivamente) . Tabla 2. Análisis TUNEL de fibroblastos bovinos tratados con Estreptolisina O, y con Istreptolisina 0 más extracto ng/ml SLO N % Pos. TUNEL +/- sd 0-células introdu- 400 7.7 +/- 1.7 cidas 0 800 6.5 +/- 0.17 500 892 7.3 +/- 3.41 0 + extracto 30' 400 5.5 +/- 1.12 500 + extracto 30' 400 8.2 +/- 1.1 0 + extracto 60' 784 6.5 +/- 4.0 500 + extracto 60' 691 16.9 +/- 1.9 El método de permeabilización seleccionado para estos métodos de clonación fue de 500 nanogramos/ml de SLO durante 30 minutos a 38 °C. El método de resellado seleccionado para formar una membrana intacta rodeando a las células reprogramadas, fue una incubación de 2 horas en un medio a-MEM conteniendo CaCl2 2 mM.

Formación, activación, cultivo, y trasplante de oocitos reconstituidos Las células reprogramadas se insertan en, o se fusionan con, los oocitos receptores utilizando técnicas convencionales de micro-inyección o electrofusión (ver, por ejemplo, las patentes US 4,994,384 y 5,945,577). Por ejemplo, las células se pueden colocar en seguida de los oocitos en el medio celular estándar en la presencia o en ausencia de sacarosa (por ejemplo, sacarosa al 2.5 por ciento) , y las células se pueden extraer hacia una pipeta de inyección. Luego la pipeta se aspira unas cuantas veces para lisar las células y remover los componentes citoplásmicos del núcleo, el cual luego se inyecta en el oocito. Entonces los oocitos reconstituidos se activan, se cultivan, y se trasplantan en mamíferos receptores maternos utilizando métodos convencionales, tales como los descritos en el Ejemplo 2, para producir mamíferos clonados. Ejemplo 4: Evidencia de una Reprogramación Nuclear más Completa Utilizando Dos Procedimientos de Clonación Novedosos: Transferencia de Cromatina (CT) y Transferencia de Estreptolisina 0 (SLOT) Como se ilustra en el Ejemplo 1, se presenta una remodelación y reprogramación nucleares incompletas en los embriones en etapa pronuclear de trasplante nuclear tradicionales. Este descubrimiento se demostró mediante el ensamble de laminas A/C en la envoltura nuclear de embriones de trasplante nuclear pronucleares, y un exceso de marca de inmunofluorescencia de NuMA. Se logró una reprogramación nuclear más completa utilizando el método de transferencia de masa de cromatina descrito en el Ejemplo 2, y el método de permeabilización y reprogramación celular (también referida como SLOT) descrito en el Ejemplo 3. Evaluación del rompimiento nuclear in vi tro de núcleos de fibroblastos bovinos incubados en un extracto mitótico, y caracterización de las masas de cromatina resultantes Los extractos preparados a partir de fibroblastos bovinos mitóticos consistentemente soportaron el rompimiento de aproximadamente el 80 por ciento de núcleos de fibroblastos purificados introducidos (Figura 5) . Un extracto de oocitos en metafase II (es decir, un extracto de oocitos detenidos naturalmente en la metafase II antes de la fertilización) también soportó con éxito el rompimiento nuclear (75 por ciento de los núcleos dentro de 30 minutos) . Se examinaron los núcleos de interfase introducidos (Figura 6A) , las masas de cromatina obtenidas de los núcleos incubados en un extracto mitótico MS15 (Figura 6B) , y las masas de cromatina obtenidas de los núcleos incubados en un extracto de oocitos (Figura 6C) para determinar la expresión de los siguientes marcadores : receptor de lamina B (LBR) , una proteína integral de la membrana nuclear interna (marcador de membrana) ; lamina B, un componente ubicuito de la lamina nuclear; laminas A/C, un componente especifico de células somáticas de la lamina nuclear, presente solamente en las células diferenciadas, y ausente en los embriones; NuMA, un componente principal de la matriz nuclear; AKAP95, una proteína de anclaje de PKA del núcleo; y ADN. Ambos extractos MS15 citosólico somático y MS15 de oocitos indujeron la solubilización de lamina B, laminas A/C, LBR, y NuMA en aproximadamente el 100 por ciento de las unidades de cromatina examinadas (Figuras 6B y 6C) . Como se esperaba, AKAP95 permaneció asociado con los cromosomas, como se observó anteriormente en las células humanas mitóticas (Collas y colaboradores, J. Cell Biol. 147:1167-1180, 1999). Este resultado también se describió en el Ejemplo 1 para los embriones de trasplante nuclear bovinos en la etapa de condensación de cromatina prematura. Tanto el extracto mitótico como el extracto de oocitos parecieron ser tan eficientes como los oocitos intactos en la promoción de la solubilización de la envoltura nuclear, independientemente del método utilizado, es decir, trasplante nuclear tradicional, inyección nuclear (NI) , o transferencia de cromatina (Figura 7) . Comparación de embriones pronucleares producidos mediante transferencia de cromatina y pronúcleos a partir de embriones de trasplante nuclear y de inyección nuclear Para generar embriones de transferencia de cromatina, se enuclearon oocitos madurados in vi tro de aproximadamente 18 a 20 horas después de la maduración. Los núcleos de los fibroblastos fetales bovinos de interfase se incubaron en un extracto mitótico MS15 que se preparó a partir de células fetales bovinas como se describe en la presente . Las masas de cromatina se aislaron a partir del extracto después de que había ocurrido la ruptura de la envoltura nuclear y antes de que se terminara la condensación de cromatina. En particular, las masas de cromatina se aislaron cuando la cromatina estaba aproximadamente 50-60 por ciento condensada, comparándose con el nivel de condensación de los cromosomas en la interfase (designados como 0 por ciento condensados) , y el máximo nivel de condensación de los cromosomas en la mitosis (designados como 100 por ciento condensados) . En esta etapa, los cromosomas individuales en la masa de cromatina no se podían distinguir, y las orillas de la masa de cromatina tenían una forma irregular. Las masas de cromatina que se habían aislado del extracto mitótico se colocaron en una micro-gota de TL HEPES con sacarosa al 2.5 por ciento, junto con los oocitos enucleados . La sacarosa se agregó al regulador para minimizar el daño a los oocitos por el siguiente procedimiento de inyección. Las masas de cromatina se inyectaron en los oocitos utilizando una pipeta de micro-inyección biselada, utilizando un Piezo-Perforador Burleigh (Fishers, NY) (frecuencia de 2 Hz durante 75 micro-segundos a una amplitud de 70 V) . Típicamente, se llevaron a cabo múltiples impulsos, tales como 2, 3, 4, o 5 impulsos, de tal manera que la aguja penetrara suficientemente en el oocito para la inyección. Después de la inyección, los oocitos se lavaron en diluciones en serie de TL HEPES en sacarosa para minimizar el choque osmótico. A las 28-30 horas después de la maduración (es decir, de 28 a 30 horas después de que se pusieron los oocitos en el medio de maduración después de recolectarse de los ovarios, que también es cuando menos 2 horas después de la inyección de las masas de cromatina) , los oocitos reconstruidos y los controles para el desarrollo partenogenético se activaron con el ionóforo de calcio (5 µ?) durante 4 minutos (Cal Biochem, San Diego, California, Estados Unidos) , y en 10 microgramos/ml de cicloheximida y 2.5 microgra-mos/ml de citocalasina D (Sigma) en un medio de cultivo ACM [NaCl 100 mM, KC1 3 mM, CaCl2 0.27 mM, NaHC03 25 mM, lactato de sodio 1 mM, piruvato 0.4 mM, L-glutamina 1 mM, 3 mg/ml de BSA (exenta de ácido graso) , aminoácidos de BME al 1 por ciento, y aminoácidos no esenciales de MEM al 1 por ciento (Sigma)], durante 2 horas, como se describió anteriormente (Liu y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998). Después de la activación, los huevos se lavaron cinco veces, y se pusieron en cultivo en placas de cultivo de tejido de cuatro pozos conteniendo fibroblastos fetales de ratón y 0.5 mi de medio de cultivo de embriones cubiertos con 0.3 mi de aceite mineral probado en embriones (Sigma) . Se colocaron entre 25 y 50 embriones en cada pozo, y se incubaron a 38.5°C en una atmósfera de aire con C02 al 5 por ciento. Si se desea, se puede agregar calcio (por ejemplo, aproximadamente 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 3.5, 5 mM, o más de CaCl2) al medio de cultivo durante aproximadamente 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, o más horas, para promover el resellado del oocito después de la inyección. Los oocitos resellados posiblemente tengan mayores índices de sobrevivencia, debido a la capa intacta que rodea a los oocitos cuando se implantan en el mamífero receptor utilizando los métodos convencionales descritos en la presente . Los embriones de inyección nuclear se formaron como se describe anteriormente para los embriones de transferencia de cromatina, excepto que se inyectaron núcleos de fibroblastos fetales bovinos de interfase que no se habían incubado en un extracto, en los oocitos, en lugar de las masas de cromatina. Se generaron embriones de trasplante nuclear utilizando los métodos convencionales descritos en el Ejemplo 1. Los pronúcleos de trasplante nuclear, de inyección nuclear, y de transferencia de cromatina reensamblan la lamina B (Figura 8A, marca roja) y el AKAP95 (Figura 8B, marca roja) como se anticipó. Los pronúcleos de trasplante nuclear y de inyección nuclear también reensamblan las laminas A/C, un componente específico de células somáticas (Figura 8A, marca verde) , de una manera consistente con los resultados reportados anteriormente para los embriones de trasplante nuclear. Sin embargo, los pronúcleos de transferencia de cromatina y los pronúcleos de partenotes de control no reensamblan las laminas A/C (Figura 8A) . Los pronúcleos de trasplante nuclear también contienen NuMA (marca verde) , a diferente de la mayoría de los pronúcleos de transferencia de cromatina o de partenotes (Figura 8B, marca verde) . Una proporción de los núcleos de partenotes y de los núcleos de transferencia de cromatina ensamblan un nivel muy bajo de NuMA, como se reportó anteriormente. El desensamble in vitro de núcleos, seguido por transferencia de cromatina, da como resultado pronúcleos que son morfológicamente similares a los pronúcleos de partenotes de control. En contraste, los pronúcleos de trasplante nuclear y de inyección nuclear alojan componentes específicos de células somáticas (laminas A/C y extensa marca de NuMA) . Este resultado indica una remodelación nuclear incompleta después de los procedimientos tradicionales de trasplante nuclear o de inyección nuclear. Como se describió anteriormente, las laminas A/C detectadas en los pronúcleos de trasplante nuclear y de inyección nuclear se originan a partir de las laminas transcritas de novo en la etapa pronuclear. Debido a que las laminas nucleares y posiblemente NuMA están implicadas en la regulación de transcripción y en la enfermedad en seres humanos, la persistencia de laminas A/C en los pronúcleos de trasplante nuclear convencionales podría indicar una reprogramación funcional inapropiada. Concluimos que el desensamble nuclear in vitro y la transferencia de cromatina produce más pronúcleos normales que el trasplante nuclear o la inyección nuclear tradicionales . Eficiencia de la clonación utilizando masas de cromatina reprogramadas o células permeabilizadas como fuente de donador Como se describe en el Ejemplo 3, se desarrolló un procedimiento de clonación novedoso denotado como "SLOT", que involucra la permeabilización inducida por Estreptolisina 0 (SLO) de fibroblastos bovinos fetales primarios, la exposición de las células permeabilizadas a un medio de reprogramación (por ejemplo, un extracto mitótico) durante 30 minutos, el resellado de los fibroblastos con calcio 2 m en cultivo, y la transferencia de la cromatina hacia adentro de los oocitos utilizando métodos de fusión celular convencionales . Para este método de clonación, un frasco de Estreptolisina 0 (Sigma S-5265; 25,000 unidades almacenadas en una forma de polvo de almacenamiento a 4°C) , se disolvió en 400 microlitros de H20, y se mezclaron bien. Todo el contenido se transfirió a un tubo cónico de 15 mi, y luego se agregaron 3.6 mi de H20, y se mezclaron mediante vórtice. Las alícuotas de 10 microlitros se congelaron a -20°C en una concentración de suministro de 0.062 unidades/microlitro . Las células (aproximadamente 100,000) se suspendieron en 100 microlitros de HBSS (Gibco BRL, Cat. No. 14170-120) a temperatura ambiente. Estas células fueron confluentes, y por lo tanto, de aproximadamente el 80 al 85 por ciento de las células estaban en la fase y la mayoría de las otras células estaban en la fase S. Se agregó la solución de suministro de Estreptolisina 0 (5 microlitros) (es decir, 500 nanogramos/ml o 0.3 unidades/microlitro de concentración final) , y la mezcla se incubó a 38 °C durante 25 minutos en un baño de agua. El tubo se golpeó suavemente dos a tres veces durante la incubación para asegurar que las células permanecieran en suspensión. Se agregó suero regulado con fosfato a temperatura ambiente (200 microli-tros) , y se mezcló bien con la pipeta. Las células se centrifugaron a 5,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente en un centrífugo de mesa. Todo el sobrenadante se desechó. En esta etapa, el granulo es pequeño y puede no ser claramente visible. Se agregó el extracto mitótico que contenía el sistema generador de ATP (40 microlitros, "MS15") , y se mezcló bien. El extracto se preparó durante la centrifugación de las células descongelando un frasco de 40 microlitros de extracto, y agregando 1.2 microlitros de sistema generador de ATP, mezclando bien, e incubando a temperatura ambiente. Este extracto mitótico fue el mismo extracto utilizado para la generación de las masas de cromatina en la sección anterior. La mezcla se incubó a 38 °C en un baño de agua durante 30 minutos, y el tubo se golpeó suavemente ocasionalmente. Se agregó un medio de resellado a temperatura ambiente (R , 500 microlitros) (medio CÍ- EM completo [Bio-Whittaker] complementado con CaCl2 hasta 2 mM desde un suministro de 1 M) . El tubo se dejó abierto y se incubó en una incubadora de C02 durante 2 horas golpeando ocasionalmente el tubo para asegurar que las células permanecieran en suspensión. Las células se centrifugaron a 5,000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente en un centrífugo de mesa. El granulo celular se volvió a suspender en 100 microlitros de TL HEPES a temperatura ambiente (Bio-W ittaker, Cat. No. 04-616F) , y se agregaron otros 900 microlitros de TL HEPES. La transferencia nuclear se realizó utilizando procedimientos convencionales- Los oocitos se activaron y se transfirieron a los mamíferos receptores como se describe en la sección anterior para la transferencia de cromatina . El desarrollo de los embriones formados utilizando este método SLOT y el método de transferencia de cromatina de la presente invención, se resume en la Tabla 3. El desarrollo hasta la etapa del blastocito fue ligeramente más baja para los embriones de SLOT, comparándose con los embriones de transferencia nuclear convencionales. Las diferencias entre el desarrollo de SLOT y de transferencia nuclear en la etapa de blastocito podría deberse al efecto de utilizar un mayor porcentaje de células en la fase G1 del ciclo celular para la transferencia nuclear que para SLOT. El índice de sobrevivencia fue más bajo para los embriones de transferencia de cromatina, lo cual se espera para un procedimiento invasivo. Los índices de embarazo fueron comparables para los embriones de transferencia nuclear y SLOT a los 40 días de gestación (Tabla 3) . La sobrevivencia a partir de los 40 días de embarazo hasta los 60 días tendió a ser más alta para los embriones SLOT que para los embriones de transferencia nuclear producidos utilizando métodos convencionales . Tabla 3. Desarrollo de Clones de Embriones Bovinos Producidos Mediante Transferencia de Cromatina (CT) , Trasplante Nuclear, y SLOT.

No. Trans- No. Sobre- No. Etapa No. Diso- No. Blas- No. de Emba- ferido vivió ( ) FN (%) ciados (%) tocitos razoa en el {%) día 40 (%) CT 1503 736 (49) 355 (23.5) 81 (S.3) 3 0 SLOT 18B4 1802 (97) ND 575 [30.5) 156 (8.3) 24/65 (37) nuclear 1821 1682 (92) ND 764 (41.9) 235 (12.9) 39/103 (36) trasplante No . Sobrevivieron 40-60 días/total (%) CT ND SLOT 7/10 (70) nuclear 8/16 (50) trasplante Como se observo anteriormente, el índice de sobrevivencia para los embriones de transferencia de cromatina se puede incrementar mediante la incubación de los oocitos reconstituidos en calcio durante unas cuantas horas, para permitir que los oocitos se resellen antes de insertarse en los mamíferos receptores . También se pueden incrementar los índices de sobrevivencia para los embriones SLOT reduciendo la cantidad de tiempo entre cuando se sacan las células del cultivo, y cuando se fusionan con los oocitos. Por ejemplo, se puede reducir el tiempo para la incubación en Estreptolisina 0, la incubación en el medio de reprogramación, y/o la incubación en el medio de resellado. En particular, se puede reducir la incubación en el medio de resellado hasta aproximadamente 1 hora o menos. Este tratamiento de resellado reducido se puede llevar a cabo en la presencia de calcio 2 mM, como se describe anteriormente, o en la presencia de una concentración más alta de calcio (per ejemplo, calcio en aproximadamente 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, o 6.0 mM) para incrementar el índice de resellado. Mediante la reducción de la cantidad de tiempo que se traten las células antes de fusionarse con los oocitos, las células tienen menos probabilidades de entrar a la fase S e iniciar la réplica del ADN, lo cual reduce el índice de sobrevivencia del oocito reconstituido. Ejemplo 5: Métodos para la Generación de Mamíferos Quiméricos Se piensa que muchos abortos espontáneos que se presentan utilizando los métodos tradicionales para clonar mamíferos, resultan de las anormalidades placentarias , en lugar de hacerlo de los problemas con el feto. Por consiguiente, se han desarrollado métodos para producir embriones quiméricos con tejido placentario primordialmente de un origen (por ejemplo, un embrión fertilizado in vi tro, que se presente naturalmente, o partenogenéticamente activado), y tejido fetal primordialmente a partir de otro origen (por ejemplo, un embrión de transferencia nuclear) . Los embriones quiméricos con tej ido placentario derivado primordialmente a partir de células de embriones fertilizados in vi tro, que se presentan naturalmente, o partenogenéticamente activados, pueden parecerse más al tejido placenta-rio que se presenta naturalmente, y pueden dar como resultado una mayor producción de progenie viable. De preferencia, la mayoría de las células de la progenie se derivan a partir de células del embrión de transferencia nuclear, y por lo tanto, tienen un genoma que es sustancialmente idéntico a aquél de la célula donadora utilizada para generar el embrión de transferencia nuclear. En uno de estos métodos, se inyectan células de un embrión fertilizado in vitro, en la periferia de un embrión de compactación (por ejemplo, entre la zona pellucida y el embrión mismo) , que se produjo utilizando los métodos de transferencia nuclear tradicionales, o cualquiera de los métodos de clonación novedosos descritos en la presente. En un método alternativo, se incuban células a partir de un embrión fertilizado in vitro de pre-compactación, con células a partir de un embrión de pre-compactación producido utilizando uno de los métodos de clonación de la presente invención (por ejemplo, utilizando una masa de cromatina reprogramada o una célula permeabilizada como la fuente del donador) bajo condiciones que permitan que las células de cada embrión se reorganicen para producir un solo embrión quimérico (Wells y Powell, Cloning 2:9-22, 2000). En ambos métodos, las células del embrión fertilizado in vitro se incorporan preferencialmente en la placenta, y las células del método de transferencia nuclear se incorporan preferencialmente en el tejido fetal. Estos métodos se describen adicionalmente más adelante . Aislamiento de fibroblastos G-, Para el aislamiento de fibroblastos GL como células donadoras para producir embriones de transferencia nuclear, se utilizó el método de "agitación" previamente descrito (Kasinathan y colaboradores, Nature Biotech. 19:1176-1178, 2001). Brevemente, 24 horas antes del aislamiento, se aplicaron 5.0 x 105 células sobre placas de cultivo de tejido de 100 milímetros conteniendo 10 mi de a-MEM más FCS. Al día siguiente, las placas se lavaron con suero regulado con fosfato, y el medio fue reemplazado durante 1 a 2 horas antes del aislamiento. Luego se agitaron las placas durante 30 a 60 segundos sobre un Vórtex-Genie 2 (Fisher Scientific, Houston, Texas, Estados Unidos, velocidad media) . El medio se removió, se centrifugó a 500 x g durante 5 minutos, y el gránulo se volvió a suspender en 250 microlitros de MEM más FCS. Esta suspensión celular consistió en dobletes celulares recién divididos unidos por un puente citoplásmico, algunas células individuales, y células en metafase o en anafase. Los dobletes celular unidos por un puente citoplásmico se utilizaron como células donadoras para la transferencia nuclear. Trasplante nuclear, activación, y cultivo de embrión El procedimiento de transferencia nuclear utilizando los fibroblastos Gx aislados se realizó esencialmente como se describió en lo anterior (Cibelli y colaboradores, Nature Biotech. 16 (7) :642-646, 1998; Kasinathan y colaboradores, Biol.

Reprod. 64 (5) : 1487-1493, 2000) . Los oocitos madurados in vitro se enuclearon de aproximadamente 18 a 20 horas después de la maduración, y se confirmó la remoción de cromosomas mediante marca con bis-bencimida (Hoechst 33342, Sigma) bajo luz ultravioleta. Estos acoplamientos de células donadoras con citoplastos se fusionaron utilizando un solo impulso eléctrico de 2.4 kv/cm durante 20 micro-segundos (Electrocell manipulator 200, Genetro-nics, San Diego, California, Estados Unidos) . A las 30 horas después de la maduración, los oocitos reconstruidos y los controles se activaron con ionóforo de calcio (5 µ?) durante 4 minutos (Cal Biochem, San Diego, CA) , y con 10 microgramos de cicloheximida y 2.5 microgramos de citocalasina D (Sigma) en un medio de cultivo ACM (NaCl 100 mM, KC1 3 raM, CaCl2 0.27 mM, NaHC03 25 mM, lactato de sodio 1 mM, piruvato 0.4 mM, L-glutamina 1 mM, 3 mg/ml de albúmina de suero bovino (exenta de ácido graso) , aminoácidos de ??? al 1 por ciento, y aminoácidos no esenciales de MEM al 1 por ciento todos de Sigma) durante 6 horas como se describe anteriormente (Liu y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998; Presicce y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 38:380-385, 1994). Después de la activación, los huevos se lavaron en un medio de cultivo de embriones de hámster regulado con HEPES (HECM-HEPES, NaCl 114 mM, KC1 3.2 mM, CaCl2 2 mM, lactato de sodio 10 mM, piruvato de sodio 0.1 mM, NaHC03 2 mM, HEPES 10 mM, y aminoácidos de BME al 1 por ciento, Sigma) cinco veces, y se colocaron en cultivo en placas de cultivo de tejido de cuatro pozos conteniendo fibroblastos fetales de ratón y 0.5 mi de medio de cultivo de embriones cubiertos con 0.2 mi de aceite mineral probado en embriones (Sigma) . Se colocaron de 25 a 50 embriones en cada pozo, y se incubaron a 38.5°C en una atmósfera de C02 al 5 por ciento en aire. En el día 4, se agregó FCS al 10 por ciento al medio de cultivo. En los días 7 y 8, se registró el desarrollo hasta la etapa de blastocito. Fertilización bocina in vitro La fertilización in vitro se realizó como se describe anteriormente para producir embriones bovinos fertilizados in vitro (Collas y colaboradores, Mol. Reprod. Dev. 34:224-231, 1993) . Se preparó un gradiente de Percoll isotónico del 45 por ciento y del 90 por ciento con suministro TL de esperma (Parrish y colaboradores, Theriogenology 24:537-549, 1985). El esperma bovino congelado-descongelado a partir de un solo toro se puso en capas encima del gradiente, y se centrifugó durante 30 minutos a 700 x g (2,000 rpm utilizando un radio de la punta de 16.18 centímetros) . Se determinó la concentración de esperma en el granulo, y el esperma se diluyó en TL de esperma (suministro TL de esperma, piruvato 1 mM, 6 mg/ml de albúmina de suero bovino, y PS al 1 por ciento) , de tal manera que la concentración final en la fertilización fue de 106 espermas/ml. A las 22 horas después de la maduración, los oocitos se lavaron tres veces en TL HEPES, y se colocaron en 480 microlitros de TL de fertilización (Bavister y colaboradores, Biol. Reprod. 28:235-247, 1983) en pozos Nunc conteniendo 6 mg/ml de albúmina de suero bovino, piruvato 0.2 m , penicilamina 20 µ?, hipotaurina 10 uM, epinefe-rina 1 mM (Leibfried y colaboradores, J. Reprod. Fértil. 66:87-93, 1982), y 0.004 microgramos/ml de heparina. Se agregaron 20 microlitros de esperma para generar una concentración final de 10s espermas/ml para 50 oocitos. Las condiciones de cultivo fueron iguales a las descritas anteriormente para la transferencia nuclear. Los índices de fertilización fueron mayores al 90 por ciento, basándose en el desarrollo pronuclear. Embriones quiméricos de transferencia nuclear Los embriones fertilizados in vi tro en la etapa de 8 células (6-12 blastorneros) se cosecharon a aproximadamente las 96 horas después de la fertilización, antes de la compactación. La zona pellucida se removió con proteasa (3 mi/mi en TL-HEPES) . La disolución de la zona se monitoreó cuidadosamente utilizando un microscopio de disección. Cuando la zona pareció primeramente disolverse (aproximadamente 2 minutos) , los embriones se removieron y se lavaron en TL-HEPES, y se transfirieron a cajas de Petri de 30 milímetros conteniendo solución de sal equilibrada de Hank, y se incubaron a 37.5°C durante 30 minutos. Los blastómeros de estos embriones de pre-compactación se transfirieron a micro-gotas (50 microlitros) de TL-HEPES bajo aceite mineral en una caja de Petri de 100 mm. Se seleccionaron los embriones de transferencia nuclear en el día 4 en la etapa de 8 a 16 células, y se transfirieron a las mismas micro-gotas que contenían los blastómeros . Estos embriones de transferencia nuclear incluyeron tanto los embriones de pre-compactación (por ejemplo, embriones en la etapa de 8 células) como los embriones de compactación (por ejemplo, embriones en la etapa de 16 células) . Entonces se transfirieron de 4 a 6 blastómeros hacia adentro de los embriones de transferencia nuclear con la micro-pipeta biselada (diámetro de 35 mieras) utilizando técnicas de micro-manipulación convencionales . Después de transferir los blastómeros, los embriones se cultivaron como se describió para los embriones de transferencia nuclear. En los días 7 y 8, se evaluó el desarrollo hasta blastocitos de los embriones quiméricos. Los blastocitos también se analizaron para determinar la presencia del tinte de membrana Dil, que se agregó a las células a partir de los embriones fertilizados in vitro antes de inyectarse en el embrión de transferencia nuclear. Las células se marcaron en el día 4, y se observaron en el día 7. Este tinte se mantiene durante unas cuantas divisiones celulares en la progenie de las células originalmente teñidas, permitiendo que se analice el embrión quimérico después de unas cuantas divisiones celulares . Basándose en este análisis, las células del embrión fertilizado in vitro se incorporaron en el embrión quimérico. Si se desea, se puede llevar a cabo la hibridación de fluorescencia in si tu (FISH) con una sonda específica para un ácido nucleico ya sea en el embrión fertilizado in vitro o en el embrión de transferencia nuclear, - inutilizando métodos convencionales (ver, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, páginas 14.7.1-14.7.12, 1995) . Este análisis FISH se puede utilizar para determinar la distribución de las células derivadas de cada embrión en el embrión quimérico (por ejemplo, para determinar qué porcentaje de las células se incorpora en la masa celular interna, y que porcentaje se incorpora en el trofectoderma) mientras se cultivan in vitro y en el feto o en la progenie generada del embrión. De una manera alternativa, se puede agregar un gen reportero, tal como proteína fluorescente verde, a las células de uno de los embriones, y se puede utilizar para monitorear la incorporación de las células en la placenta y en diferentes tejidos fetales del embrión quimérico . Transferencia del embrión Los días 7 y 8, los blastocitos de transferencia nuclear de grado 1 y 2, derivados a partir de los embriones de transferencia nuclear y de los embriones de transferencia nuclear quiméricos, se transfirieron a receptores sincronizados en los días 6 y . Los receptores se sincronizaron utilizando una sola inyección de Lutalyse (Pharmacia & Upjohn, Kalamazoo, Michigan, Estados Unidos), seguida por detección del estro. Los receptores se examinaron en los días 30 y 60 después de la transferencia del embrión mediante ultrasonografía, para determinar la presencia del concepto, y después cada 30 días mediante palpación rectal hasta los 240 días. Los resultados de embarazo en el día 40 para los embriones quiméricos y para los embriones de control producidos mediante la fusión de un fibroblasto bovino transgéni-co con un oocito, se comparan en la Tabla 4. Estos resultados indican que sobrevivió un mayor número de embriones quiméricos hasta el día 40. Tabla 4. Transferencias de Embriones y Embarazos Implante Transferencias nucleaTransferencias nucleares de control res quiméricas No . de Embarazo Número de Embarazo receptores al día 40 receptores al día 40 Primero 2 1 2 1 Segundo 6 1 4 3 Total 8 2 (25%) 6 4 (67%) Métodos alternativos para la producción de embriones quiméricos Se pueden utilizar métodos convencionales para modificar el método anterior para producir embriones quiméricos . Por ejemplo, se puede aislar quirúrgicamente un embrión que se presente naturalmente a partir de un mamífero (por ejemplo, un bovino) , o se puede activar partenogenéticamente un oocito utilizando técnicas convencionales, y se puede utilizar en lugar del embrión fertilizado in vitro. Si se desea, se pueden inyectar menos células a partir de los embriones fertilizados in vitro, que se presenten naturalmente, o partenogenéticamente activados (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, o 5 células) en el embrión de transferencia nuclear, para reducir el porcentaje de las células inyectadas, y para que su progenie llegue a incorporarse en el tejido fetal. De una manera alternativa, se pueden inyectar más células (por ejemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o más células) para incrementar el porcentaje de las células inyectadas y su progenie que se incorpore en el tejido placentario. Más aún, se pueden utilizar células de embriones en otras etapas celulares . Por ejemplo, se pueden inyectar embriones fertilizados in vitxo, que se presenten naturalmente, o partenogenéticamente activados en la etapa de 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 células o posterior, en los embriones de transferencia nuclear que estén en la etapa de 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 células o posterior. Las células inyectadas y los embriones de transferencia nuclear pueden estar en la misma etapa celular, o en diferentes etapas celulares. En una modalidad, el embrión fertilizado in vitro, que se presenta naturalmente, o partenogenéticamente activado tiene una ploidez incrementada (por ejemplo, un contenido de ADN de 4n) en relación con el embrión de transferencia nuclear, lo cual inclina adicionalmente a las células inyectadas hacia el trofectoderma (es decir, la capa más externa de células del embrión que forma primordialmente el tejido placentario) . Si se desea, toda o parte de la zona pellucida se puede mantener rodeando a las células inyectadas, en lugar de removerse antes de la inyección. En otros métodos alternativos, se incuban células de un embrión fertilizado in vi tro, que se presente naturalmente, o partenote de pre-compactación o de compactación, con células de un embrión de transferencia nuclear de pre-compactación, bajo condiciones que permitan que las células de cada embrión se reorganicen para producir un solo embrión quimérico (Wells y Powell, Cloning 2:9-22, 2000). Se espera que las células del embrión fertilizado in vitro, que se presente naturalmente, o partenote, contribuyan primordialmente al trofectoderma, y eventualmente al tejido placentario, y se espera que las células del embrión de transferencia nuclear contribuyan primordialmente a la masa celular interna y eventualmente al tejido fetal. Las células de ambos embriones pueden estar en la misma etapa celular o en diferentes etapas celulares, y se pueden combinar los mismos o diferentes números de células de cada embrión para formar el embrión acumulado. Otras Modalidades A partir de la descripción anterior, será aparente que se pueden hacer variaciones y modificaciones a la invención descrita en la presente, para adaptarla a diferentes usos y condiciones. Estas modalidades están también dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones . Todas las publicaciones mencionadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente como referencia hasta el mismo grado como si cada publicación o solicitud de patente independiente fuera específicamente e individualmente indicada como incorporada como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método de clonar un mamífero no humano, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) incubar una célula permeabilizada en un medio de reprogramación, bajo condiciones que permitan la remoción de un factor de un núcleo, masa de cromatina, o cromosoma de dicha célula permeabilizada o la adición de un factor de dicho medio de reprogramación a dicho núcleo, masa de cromatina, o cromosoma, con ello formando una célula reprogramada; (b) insertar dicha célula reprogramada en un oocito nucleado o enucleado, con ello formando un oocito de transferencia nuclear; y (c) transferir dicho oocito de transferencia nuclear o un embrión formado de dicho oocito de transferencia nuclear al útero de un mamífero anfitrión, bajo condiciones que permitan a dicho oocito de transferencia nuclear o dicho embrión desarrollarse en un feto.
2. El método de la reivindicación 1, donde dicho medio de reprogramación es un extracto celular.
3. El método de la reivindicación 1, donde el núcleo de dicha célula permeabilizada permanece ligado a la membrana y la cromatina en dicho núcleo no se condensa durante incubación en dicho medio de reprogramación.
4. El método de la reivindicación 1, donde se forma una masa de cromatina a partir de la incubación de dicha célula - Impermeabilizada en dicho medio de reprogramación.
5. El método de la reivindicación 1, donde dicha célula reprogramada es incubada bajo condiciones que permitan resellar a la membrana de dicha célula reprogramada.
6. El método de la reivindicación 1, donde dicha célula reprogramada es purificada a partir de dicho medio de reprogramación antes de inserción a dicho oocito de transferencia nuclear .
7. El método de la reivindicación 1, donde dicho feto se desarrolla en progenie viable.
8. El método de la reivindicación 1, donde dicho oocito de transferencia nuclear del paso (b) es cultivado bajo condiciones que permitan división celular- y una de las células resultantes es re-clonada una o mas veces.
9. El método de la reivindicación 1, donde dicha célula permeabilizada y dicho oocito de transferencia nuclear son de la misma especie .
10. El método de la reivindicación 1, donde dicho mamífero no humano es una vaca, una oveja, un conejo, un cerdo, un ratón, una rata, una cabra, o un búfalo.
11. El método de la reivindicación 10, donde dicho mamífero no humano es una vaca.
12. El método de la reivindicación 1, donde dicha célula permeabilizada es un fibroblasto, una célula epitelial, una célula neural, una célula epidermal, un queratinocito, una célula hematopoyética, un melanocito, un condrocito, un linfocito B, un linfocito T, un eritrocito, un macrófago, un monocito, una célula de músculo, una célula de tallo embriónica, una célula germinal embriónica, una célula fetal, una célula de placenta, o una célula embriónica.
13. El método de la reivindicación 1, donde dicha célula permeabilizada es una célula del sistema reproductivo femenino .
14. El método de la reivindicación 13, donde dicha célula permeabilizada es una célula de glándula mamaria, de cúmulo de ovario, grandulosa u oviductal .
15. El método de la reivindicación 1, donde dicho oocito de transferencia nuclear del paso (b) expresa lamina A, lamina C, o la proteina NuMA a un nivel que es menor de cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un oocito de control de la misma especie.
16. Un método de clonar un mamífero no humano, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) poner en contacto un núcleo de donador que tiene menos de cuatro conjuntos de cromosomas homólogos con un medio de reprogramación, bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina sin ocasionar replicación de ADN; (b) insertar dicha masa de cromatina en un oocito, con ello formando un oocito de transferencia nuclear; y (c) transferir dicho oocito de transferencia nuclear o un embrión formado a partir de dicho oocito de transferencia nuclear al útero de una mamífero anfitrión, bajo condiciones que permitan que dicho oocito de transferencia nuclear o dicho embrión se desarrolle en un feto.
17. El método de la reivindicación 16, donde el medio de reprogramación es un extracto mitótico, una solución de detergente y sal, una solución de detergente, una solución e sal, o una solución de cinasa de proteína.
18. El método de la reivindicación 16, donde dicha masa de cromatina del paso (a) es purificada a partir de dicho extracto antes de la inserción al oocito de transferencia nuclear .
19. El método de la reivindicación 16, donde dicho feto se desarrolla en progenie viable.
20. El método de la reivindicación 16, donde dicho oocito de transferencia nuclear del paso (b) es cultivado bajo condiciones que permitan la división celular y una de las células resultantes es re-clonada una o mas veces.
21. El método de la reivindicación 16, donde dicho núcleo de donador y dicho oocito de transferencia nuclear son de la misma especie.
22. El método de la reivindicación 16, donde dicho mamífero no humano es una vaca, una oveja, un conejo, un cerdo, un ratón, una rata, una cabra, o un búfalo.
23. El método de la reivindicación 22, donde dicho mamífero no humano es una vaca.
24. El método de la reivindicación 16, donde dicho núcleo de donador es diploide.
25. El método de la reivindicación 16, donde dicho núcleo de donador es un fibroblasto, una célula epitelial, una célula neural, una célula epidermal, un queratinocito, una célula nematopoyética, un melanocito, un condrocito, un linfocito B, un linfocito T, un eritrocito, un macrófago, un monocito, una célula de músculo, una célula de tallo embriónica, una célula germinal embriónica, una célula fetal, una célula de placenta, o una célula embriónica.
26. El método de la reivindicación 16, donde dicho núcleo de donador es de una célula del sistema reproductivo femenino .
27. El método de la reivindicación 26, donde dicha célula del sistema reproductivo femenino es una célula de glándula mamaria, de cúmulo de ovario, grandulosa u oviductal .
28. El método de la reivindicación 16, donde dicho oocito del paso (b) expresa lamina A, lamina C o la proteína NuMA a un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un oocito de control de la misma especie .
29. Un método de clonar un mamífero no humano, dicho método comprendiendo los pasos de : (a) insertar una célula, un núcleo, o una masa de cromatina en un oocito, con ello formando un primer embrión; (b) poner en contacto una o mas células de dicho primer embrión con una o mas células de un segundo embrión, con ello formando un tercer embrión; donde dicho segundo embrión es un embrión fertilizado in vitro, un embrión que ocurre naturalmente, o un embrión activado parteno-genéticamente, y donde al menos uno de dichos primer embrión y segundo embrión es un embrión de compactación; y (c) transferir dicho tercer embrión al útero de una mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que dicho tercer embrión se desarrolle en un feto.
30. Un método de clonar un mamífero no humano, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) insertar una célula, un núcleo o una masa de cromatina en un oocito, con ello formando un primer embrión; (b) poner en contacto una o mas células de dicho primer embrión con una o mas células de un segundo embrión, con ello formando un tercer embrión;' donde dicho segundo embrión es un embrión fertilizado in vitro, un embrión que ocurre naturalmente, o un embrión parteno-genéticamente activado, y donde dichos primer embrión y segundo embrión están en diferentes etapas celulares; y (c) transferir dicho tercer embrión al útero de un mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que dicho tercer embrión se desarrolle en un feto.
31. Un método de clonar un mamífero no humano, dicho método comprendiendo los pasos de: (a) poner en contacto un núcleo de donador con un medio de reprogramación, bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina; (b) insertar dicha masa de cromatina en un oocito, con ello formando un primer embrión; (c) poner en contacto una o mas células de dicho primer embrión con una o mas células de un segundo embrión, con ello formando un tercer embrión; donde dicho segundo embrión es un embrión fertilizado in vitro, un embrión que ocurre naturalmente, o un embrión activado parteno-genéticamente; y (d) transferir dicho tercer embrión al útero de un mamífero anfitrión bajo condiciones que permitan que dicho tercer embrión se desarrolle en un feto.
32. El método de la reivindicación 31, donde el paso (a) implica poner en contacto un núcleo de donador que tiene menos de cuatro conjuntos de cromosomas homólogos con un medio de reprogramación, bajo condiciones que permitan la formación de una masa de cromatina sin ocasionar replicación de ADN.
33. Un método de clonar un mamífero no humano, dicho método comprendiendo los pasos de : (a) incubar una célula permeabilizada en un medio de reprogramación, bajo condiciones que permitan la remoción de un factor de un núcleo, una masa de cromatina, o cromosoma de dicha célula permeabilizada o la adición de un factor de dicho medio de reprogramación a dicho núcleo, una masa de cromatina, o cromosoma, con ello formando una célula reprogramada; (b) insertar dicha célula reprogramada en un oocito, con ello formando un primer embrión; (c) poner en contacto una o mas células de dicho primer embrión con una o mas células de un segundo embrión, con ello formando un tercer embrión, donde dicho segundo embrión es un embrión fertilizado in vitro, embrión que ocurre naturalmente, o embrión activado parteno-genéticamente; y (d) transferir dicho tercer embrión al útero de un mamífero anfitrión, bajo condiciones que permitan a dicho tercer embrión desarrollarse en un feto.
34. El método de la reivindicación 33, donde dicha célula reprogramada es incubada bajo condiciones que permitan que re-selle la membrana de dicha célula reprogramada.
35. El método de la reivindicación 31 o 33, donde dicho medio de reprogramación es un extracto celular.
36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 31 o 33, donde dicho feto se desarrolla en progenie viable.
37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 y 33, donde al menos 10% de las células en la placenta de dicho feto son derivadas de dicho segundo embrión.
38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 y 33, donde al menos 50% de las células en el tejido fetal de dicho feto son derivadas de dicho primer embrión.
39. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 y 33, donde dicho mamífero no humano es una vaca, una oveja, un conejo, un cerdo, un ratón, una rata, una cabra, o un búfalo .
40. El método de la reivindicación 39, donde dicho mamífero no humano es una vaca.
41. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 y 33, donde dicho tercer embrión expresa lamina A, lamina C, o la proteína NuMA a un nivel que es menor que cinco veces mayor que el nivel correspondiente expresado por un oocito de control de la misma especie.
42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 29-31 y 33, donde dichas células de dicho segundo embrión son inyectadas en dicho primer embrión entre la zona pellucida y las células embriónicas .