KR101662734B1 - 스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법 - Google Patents

스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101662734B1
KR101662734B1 KR1020120126220A KR20120126220A KR101662734B1 KR 101662734 B1 KR101662734 B1 KR 101662734B1 KR 1020120126220 A KR1020120126220 A KR 1020120126220A KR 20120126220 A KR20120126220 A KR 20120126220A KR 101662734 B1 KR101662734 B1 KR 101662734B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sperm
streptolysin
ismgt
treated
egfp
Prior art date
Application number
KR1020120126220A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140059606A (ko
Inventor
장규태
심보웅
김상현
김선욱
김영현
김지수
송봉석
윤승빈
이상래
정강진
차재진
최선아
허재원
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020120126220A priority Critical patent/KR101662734B1/ko
Publication of KR20140059606A publication Critical patent/KR20140059606A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101662734B1 publication Critical patent/KR101662734B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 인간을 제외한 형질전환 동물의 개선된 제조 방법 및 개선된 정자 매개 유전자 이식 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 외래 유전자가 정자 내로 효과적으로 전달 (internalization) 될 수 있어, 배반포 단계에서의 할구 자살율이 개선되며 형질전환 동물의 효율적 생산이 가능하다.

Description

스트렙토라이신 Ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법 {Method for Enhancing Production of Transgenic Animal by Treatment of Streptolysin O}
본 발명은 형질전환 동물의 생산성을 향상시키기 위한 것으로, 더욱 자세하게는 정자에 스트렙토라이신 O를 처리하여 정자의 세포막에 가역성 천공을 형성시켜 외래 DNA의 도입을 용이하게 함으로써 배반포까지의 배발달율 및 형질전환 효율을 향상시키기 위한 방법에 관한 것이다.
형질전환 동물은 인간 질병의 유전자 기능의 해명 및 이해를 포함하여 광범위한 분야에 사용되는바 중요하다. 이러한 형질전환 동물을 효율적으로 생산하기 위한 다양한 시도가 이루어지고 있는데, 예를 들면 전핵주입법 (pronuclear injection), 바이러스 주입법, 체세포 핵이식 (somatic cell nuclear transfer [Gordon JW, Ruddle FH. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science 1981; 214:1244-1246; Lois C, Hong EJ, Pease S, Brown EJ, Baltimore D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science 2002; 295:868-872; Cibelli JB, Stice SL, Golueke PJ, Kane JJ, Jerry J,Blackwell C, Ponce de Leon FA, Robl JM. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280:1256-1258 ; Hofmann A, Kessler B, Ewerling S, Weppert M, Vogg B, Ludwig H, Stojkovic M, Boelhauve M, Brem G, Wolf E, PfeiferA. Efficient transgenesis in farm animals by lentiviral vectors. EMBO Rep 2003; 4:1054-1060]) 등과 같은, 형질전환방법의 개발이 시도되고 있다. 그러나 종래의 형질전환 방법에는 몇 가지 단점이 있는데, 종 제한적이고 그 효율성이 높지 않다는 것이다 [Nakanishi T, Kuroiwa A, Yamada S, Isotani A, Yamashita A, Tairaka A, Hayashi T, Takagi T, Ikawa M, Matsuda Y, Okabe M. FISH analysis of 142 EGFP transgene integration sites into the mouse genome. Genomics 2002; 80:564-574; Robl JM, Wang Z, Kasinathan P, Kuroiwa Y. Transgenic animal production and animal biotechnology. Theriogenology 2007; 67:127-133].
외래 DNA를 배아 세포에 도입하여 유전자가 도입된 포유류를 얻는 여러 가지 방법들이 발표되어 있는데, 그 중에서도 1989년, 정자가 체외수정 (in vitro fertilization)을 하는 동안 DNA를 전달하는 운반체로 사용될 수 있다고 보고되었는데 [Lavitrano M, Camaioni A, Fazio VM, Dolci S, Farace MG, Spadafora C. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 1989; 57:717-723.], 이후 이는 정자-매개 유전자 전달 (Sperm-mediated gene transfer, 이하 ‘SMGT'로 약칭함) 방법으로 알려졌다. SMGT의 실행 가능성 및 효율성과 관련하여, 이들의 불확실성에도 불구하고, 상기 기술이 형질전환 배아 및 동물을 생산하는데 있어서 효율적 방법이라고 기술하고 있는 보고가 다수 있으며 [Brackett BG, Baranska W, Sawicki W, Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization. Proc Natl Acad Sci U S A 1971; 68:353-357; Smith K, Spadafora C. Sperm-mediated gene transfer: applications and implications. Bioessays 2005; 27:551-562], SMGT 방법의 효율성 및 재현 가능성을 개선하고자 하는 시도가 있어왔다.
SMGT의 효율성은 정자를 이용하여 수정된 접합자 (zygote)를 생산하는데 사용되는 난세포질 내 정자 주입법 (intracytoplasmic sperm injection, 이후 ‘ICSI’로 약칭함) 기술과 함께 개선되어 왔는데 [Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science 1999; 284:1180-1183], 그 예로 막이 파열된 정자는 막 구조가 온전한 정자에 비하여 외래 DNA를 용이하게 받아들일 수 있다는 사실에 기반하여, 정자 세포막의 투과성을 증가시키기 위하여, 동결-해동, 동결-건조, 트리톤 X-100 처리 등의 방법이 시도된 예가 있으나 이러한 방법에 의할 경우, 사용된 난자의 수에 대비하여 형질전환 동물의 생산 효율이 낮다는 문제점이 있다 [Perry AC, Wakayama T, Kishikawa H, Kasai T, Okabe M, Toyoda Y, Yanagimachi R. Mammalian transgenesis by intracytoplasmic sperm injection. Science 1999; 284:1180-1183; Moreira PN, Giraldo P, Cozar P, Pozueta J, Jimenez A, Montoliu L, Gutierrez-Adan A. Efficient generation of transgenic mice with intact yeast artificial chromosomes by intracytoplasmic sperm injection. Biol Reprod 2004; 71:1943-1947; Osada T, Toyoda A, Moisyadi S, Akutsu H, Hattori M, Sakaki Y, Yanagimachi R. Production of inbred and hybrid transgenic mice carrying large (> 200 kb) foreign DNA fragments by intracytoplasmic sperm injection. Mol Reprod Dev 2005; 72:329-335]. 정자에 트리톤 X-100을 처리하거나, 정자를 동결-해동하는 경우 정자 자체의 DNA 손상이 야기되고, iSMGT에 의해 형질전환된 배아도 손상되어 배아의 배반포 단계에서의 세포 자살율도 증가하기 때문이다 [Yanagimachi R. Intracytoplasmic injection of spermatozoa and spermatogenic cells: its biology and applications in humans and animals. Reprod Biomed Online 2005; 10:247-288; Szczygiel MA, Moisyadi S, Ward WS. Expression of foreign DNA is associated with paternal chromosome degradation in intracytoplasmic sperm injection-mediated transgenesis in the mouse. Biol Reprod 2003; 68:1903-1910]. 따라서, 최근 연구들은 배아의 발달 단계 동안에 해로운 영향을 미치지 않을 수 있는 ICSI 방법을 개발하는 것에 초점을 두고 있다 [Li C, Mizutani E, Ono T, Wakayama T. Anefficient method for generating transgenic mice using NaOH-treated spermatozoa. Biol Reprod 2010; 82:331-340.].
한편, 스트렙토라이신 O (Streptolysin O; SLO)는 몇몇 그람 양성 박테리아에서 생성되는 세포융해 독소로서 [Duncan JL, Schlegel R. Effect of streptolysin O on erythrocyte membranes, liposomes, and lipid dispersions. A protein-cholesterol interaction. J Cell Biol 1975; 67:160-174.], 이는 동물 세포의 세포질 막 내의 콜레스테롤에 결합하여 [Palmer M, Harris R, Freytag C, Kehoe M, Tranum-Jensen J, Bhakdi S. Assembly mechanism of the oligomeric streptolysin O pore: the early membrane lesion is lined by a free edge of the lipid membrane and is extended gradually during oligomerization. EMBO J 1998; 17:1598-1605.] 세포막에 가역적 천공을 유도하는 것으로 알려져 있다 [Giles RV, Spiller DG, Grzybowski J, Clark RE, Nicklin P, Tidd DM. Selecting optimal oligonucleotide composition for maximal antisense effect following streptolysin O-mediated delivery into human leukaemia cells. Nucleic Acids Res 1998; 26:1567-1575.]. 따라서, 이러한 스트렙토라이신 O의 세포막 천공 능력을 활용하면 외래 분자들, 예컨대 단백질, DNA, RNA 등과 같은 원하는 물질들을 세포 내부로 도입시킬 수 있다 [Hakelien AM, Landsverk HB, Robl JM, Skalhegg BS, Collas P. Reprogramming fibroblasts to express T-cell functions using cell extracts. Nat Biotechnol 2002; 20:460-466; Walev I, Bhakdi SC, Hofmann F, Djonder N, Valeva A, Aktories K, Bhakdi S. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98:3185-3190; Brito JL, Davies FE, Gonzalez D, Morgan GJ. Streptolysin-O reversible permeabilisation is an effective method to transfect siRNAs into myeloma cells. J Immunol methods 2008; 333:147-155]. 정자의 경우에 있어서는 첨체반응을 포함하는 메커니즘을 연구하기 위한 모델 시스템을 제공하기 위해 첨체 내용물을 방출시키는데 이러한 스트렙토라이신 O가 사용된 바 있다 [Yunes R, Michaut M, Tomes C, Mayorga LS. Rab3A triggers the acrosome reaction in permeabilized human spermatozoa. Biol Reprod 2000; 62:1084-1089; Diaz A, Dominguez L, Fornes MW, Burgos MH, Mayorga LS. Acrosome content release in streptolysin O permeabilized mouse spermatozoa. Andrologia 1996; 28:21-26]. 그러나 포유동물 정자를 매개한 유전자 이식에 의한 형질전환율을 높이기 위한 용도로서 스트렙토라이신 O가 사용된 바는 없었다.
본 발명자들은 처음으로, 스트렙토라이신 O를 처리한 정자를 사용한 정자 매개 유전자 이식 방법에 의하는 경우 형질전환 동물의 생산성을 상당히 증가시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은, 스트렙토라이신 O를 처리한 정자를 사용함으로써 통상적인 정자 매개 유전자 이식 방법 (SMGT)이 가지는 문제점을 해소하고 배반포까지의 배 발달율 및 형질전환 동물의 생산성을 향상시키기 위한 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (A) 정자를 스트렙토라이신 O를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; (B) 상기 배양된 정자를 외래 DNA와 함께 공동 배양하는 단계; 및 (C) 상기 배양된 정자를 분리된 난자의 세포질 내로 주입하는 단계를 포함하는 정자 매개 유전자 이식방법을 제공한다.
본 발명은 또한, (A) 정자를 스트렙토라이신 O를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; (B) 상기 배양된 정자를 외래 DNA와 함께 공동 배양하는 단계; (C) 상기 배양된 정자를 분리된 난자의 세포질 내로 주입하여 수정란을 제조하는 단계; 및 (D) 상기 수정란을 생명체로 발생시키는 단계를 포함하는 인간을 제외한 형질전환 동물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 정자 내로 외래 유전자가 효과적으로 전달 (internalization) 될 수 있으며, 배반포 단계에서의 할구 자살율이 개선되므로 형질전환 동물의 효율적 생산이 가능하다. 따라서, 상기 생산되는 형질전환 동물을 이용한 생의학적 연구에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 정자 매개 유전자 이식방법의 과정을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2의 A는 스트렙토라이신 O를 처리한 정자 (SLO)와 스트렙토라이신 O를 처리하지 않은 정자 (Fresh)를 Cy-3가 부착된 DNA　(붉은 색)로 배양한 후 형광 강도를 비교한 것이다 (BF: Bright field, Scale bar= 20 μm). 도 2의 B는 스트렙토라이신 O로 처리한 정자 (SLO)와 스트렙토라이신 O를 처리하지 않은 정자(Fresh)를 pCAG-EGFP 벡터와 함께 배양한 후, iSMGT 방법으로 생성한 형질전환된 배반포를 나타낸 것이다 (Scale bar = 100 μm).
도 3은 iSMGT-SLO (스트렙토라이신 O로 처리한 정자를 사용하여 ICSI 방법으로 SMGT를 수행) 및 iSMGT-FT (동결-해동시킨 정자를 사용하여 ICSI 방법으로 SMGT를 수행) 방법에 의하여 형질전환된 배아의 생산율 및 정자-DNA 결합 친화도를 비교한 것이다. 도 3의 A는 동결-해동시킨 정자 (FT)와 스트렙토라이신 O를 처리한 정자 (SLO)를 Cy-3가 부착된 DNA (붉은색)와 각각 배양한 후, 이들의 형광 강도를 비교하여 나타낸 것이다. (BF: Bright field, Scale bar = 20 μm). 도 3의 B는 형광 강도의 농도를 그래프로 나타낸 것이다 (평균 ± 표준 오차) (S.E.; n = 3, *P < 0.05). 도 3의 C는 동결-해동시킨 정자 (FT)와 SLO로 처리한 정자 (SLO)를 pCAG-EGFP 벡터와 각각 배양한 후, iSMGT로 형질전환된 배반포 (검은색 별표, 녹색)를 제조한 것을 나타낸 것이다.
도 4는 iSMGT-SLO 방법으로 제조된 F0 자손들의 유전자형을 분석한 것이다. 26마리의 F0 신생아의 꼬리 생검으로부터 게놈 DNA (genomic DNA)을 추출하고, pCAG-EGFP 전이 유전자의 검출을 위한 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. 야생형 BDF1 게놈 DNA (WT-BDF1, 레인 1)와 pCAG-EGFP 벡터 (레인 2)는 각각 음성 대조군 및 양성 대조군으로 사용하였다. PP1A 유전자는 내부 마커 (internal marker)로 사용하였다.
도 5는 본 발명에 따른 iSMGT 방법에 의해 형질전환된 배아를 생산하는데 있어서의 적절한 스트렙토라이신 O 처리 조건을 확인한 것이다. 도 5의 A는 iSMGT 방법에 의해 형질전환된 배반포 (검은색 별)를 생산하는데 있어서의 스트렙토라이신 O (SLO)의 농도 및 처리 시간에 따른 효과를 나타낸 것이고, 도 5의 B는 iSMGT 방법에 의해 형질전환된 배반포 (검은색 별)를 생산하는데 있어서의 DNA 농도에 따른 효과를 나타낸 것이다 (Scale bar = 100 μm).
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, (A) 정자를 스트렙토라이신 O를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; (B) 상기 배양된 정자를 외래 DNA와 함께 공동 배양하는 단계; 및 (C) 상기 배양된 정자를 분리된 난자의 세포질 내로 주입하는 단계를 포함하는 정자 매개 유전자 이식 방법을 제공한다.
본 발명에서 “정자 매개 유전자 이식 방법 (sperm-mediated gene-transfer; SMGT)"은 정자를 매개로 하여 배아 게놈 (genome) 내로 외래 DNA를 이식하는 방법을 의미하는 것으로, 본 발명의 실시예에서는 ICSI (intracytoplasmic sperm injection) 방법에 의하여 SMGT를 수행하여 정자를 난세포질 내로 주입하였다.
종래에는 정자에 외래 유전자를 도입하기 위하여, 정자에 트리톤 X-100 또는 알칼리 (alkali)를 처리하거나 정자를 동결-해동시키는 방법이 사용되었다. 그러나 상기 방법에 의하면, 정자 자체와 발달 중인 배아 모두에 DNA 손상이 야기될 수 있으며 배반포 시기까지 발생 동안 수정란의 세포 자살율이 높다는 문제점으로 인하여, 사용된 난자의 수에 대비하여 형질전환된 동물의 생산 효율은 3% 미만이었다. 이에, 정자에 알칼리 (alkali)를 처리하는 방법이 제시된 바 있으나, 알칼리로 정자를 처리한 경우에는 난세포질 내로 정자가 주입된 후, 배아 발생을 위해서는 별도의 인위적인 활성화 자극을 배아에 가할 것이 요구된다는 문제점이 있다. 본 발명은, 스트렙토라이신 O를 정자에 처리하여 정자의 세포막에 가역성 천공을 유도함으로써 외래 DNA가 효과적으로 정자에 도입 될 수 있으며 정자의 세포막 이외의 다른 부분과 배아에 대한 손상이 없으므로 배아 발생 단계에서의 세포 자살율도 상당히 개선시킬 수 있다. 또한, 배아 발생을 위하여 인위적인 활성을 가하는 것이 요구되지도 않으므로 종래의 정자 매개 유전자 이식 방법에 비하여 간단하다는 장점이 있다. 따라서 본 발명은 개선된 정자 매개 유전자 이식 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 의하면 정자를 난자에 이식하기 전, 스트렙토라이신 O가 함유되어 있고, Ca2+ 및 Mg2+는 포함하지 않는 (Ca2+-free 및 Ma2+-free) HBSS (Hank's balanced salt solution) 배지에서 정자를 배양하여 정자의 세포막에 천공을 시킴으로써 외래 유전자가 정자 두부에 용이하게 도입될 수 있도록 한다. 이때, 사용되는 스트렙토라이신 O의 농도는 1~10 U/mL이고, 배양 시간은 15~30분인 것이 바람직하다 (실시예 10 참조). 또한, 너무 높은 온도에서 긴 시간동안 배양하면 세포막에 큰 구멍들이 너무 많이 생성되어 정자가 생존할 수 없게 되므로 적절한 온도에서 배양하는 것이 좋다. 스트렙토라이신 O의 농도가 너무 낮을 경우에는 세포 자체의 보호기능에 의해 정자의 플라스마 막에 적당한 구멍이 생성되지 않을 우려가 있다. 이때 배지로는 Ca2+ 및 Mg2+를 포함하지 않는 배지를 사용하여 정자들끼리의 접착을 막아 세포막 면적을 넓게 하여 사용하는 것이 효율적이다. 실시예에서는 HBSS 배지를 사용하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, RPMI나 DMEM 또는 Ham's F12 등 다양한 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에 의하면, 정자는 포유동물로부터 수득할 수 있으며, 바람직하게는 마우스로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 성체 수컷 마우스의 부고환으로부터 정자를 수집하여 사용하였다.
상기와 같이, 스트렙토라이신 O를 처리한 정자를 외래 DNA와 함께 공동 배양시, 외래 DNA가 정자 내로 성공적으로 도입되므로 외래 DNA와 함께 공동 배양된 정자를 난자의 세포질 내로 주입하면, 배아 게놈 내로 외래 DNA를 효과적으로 전달할 수 있으므로 종래의 정자 매개 유전자 이식 방법에 의하는 경우보다 수정율, 형질전환율 및 자손 생산량을 개선시킬 수 있다 (비교 실시예 1, 비교 실시예 2 참조). 본 발명의 실시예에서는 외래 DNA가 스트렙토라이신 O를 처리한 정자에 성공적으로 이식되었음을 확인하기 위하여 Cy-3가 부착된 DNA 또는 pCAG-EGFP 벡터를 스트렙토라이신 O로 처리한 정자와 공동 배양한 후, 형광의 강도를 관찰하는 실험을 수행하였다 (실시예 9, 도 2 참조).
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, (A) 정자를 스트렙토라이신 O를 포함하는 배지에서 배양하는 단계; (B) 상기 배양된 정자를 외래 DNA와 함께 공동 배양하는 단계; (C) 상기 배양된 정자를 분리된 난자의 세포질 내로 주입하여 수정란을 제조하는 단계; 및 (D) 상기 수정란을 생명체로 발생시키는 단계를 포함하는 인간을 제외한 형질전환 동물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 의하면, 외래 DNA와 함께 공동 배양된 정자는 ICSI 방법으로 난자의 난세포질 내로 주입될 수 있다. ICSI는 정자를 난세포질 내로 인위적으로 주입하는 방법으로, 본 발명의 실시예에서는 통상적인 ICSI 방법으로 정자를 난세포질 내로 주입하였다.
본 발명에 따라 제작된 수정란을 발생시켜 배반포 단계에서의 할구 자살율을 관찰한 결과, 종래의 정자 매개 유전자 이식 방법인 동결-해동 방법에 의하여 외래 DNA가 도입된 경우에 비하여 할구 자살율이 상당히 개선되었음을 알 수 있었으며 (표 5 참조), 또한 형질전환된 동물의 생산률도 상당히 개선됨을 알 수 있었다 (표 6 참조).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 한편, 별도로 기재하지 않으면, 실시예에 기재된 화합물과 시약은 SigmaAldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로부터 구입한 것을 사용한 것이다.
실시예
실험 디자인
성체 수컷 마우스의 부고환으로부터 정자를 수집하고, 동결-해동 (종래 방법) 또는 스트렙토라이신 O (SLO) 처리 (본 발명)를 실시한다. 아무것도 처리하지 않은 정자 (대조군), 동결-해동시킨 정자, 그리고 스트렙토라이신 O를 처리한 정자를 각각 EGFP 벡터와 함께 공동배양하고, 성숙한 난자의 세포질 내로 상기의 정자들을 ICSI 방법으로 각각 도입한다. 스트렙토라이신 O 처리를 위한 적절한 조건을 결정하기 위하여, 다양한 스트렙토라이신 O 농도, 서로 다른 시간 간격으로 정자를 사전 처리하고, 다양한 농도의 EGFP 벡터와 함께 배양한다. ICSI 과정을 완료한 후, 배반포 시기까지 배아를 배양시켜 분석에 사용하거나, 2-세포기 시기의 배아를 위임신 대리모 (pseudopregnant foster mothers)의 난관 내로 이식하여 형질전환된 자손을 생산한다. 형질전환의 효율성은 EGFP를 발현하는 배반포 및 자손의 수를 분석함으로써 판단한다.
실시예 1: EGFP 발현 벡터 및 Cy -3가 부착된 DNA 의 제조
pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Basingstoke, UK)로부터 EGFP 코딩영역을 잘라내고 pCAGGS 벡터의 EcoRI 부위에 삽입하여 pCAG-EGFP 벡터를 제조하였다. 제한지도작성 (restriction mapping) 및 DNA 시퀀싱으로 pCAG-EGFP 벡터를 확인하였다. SalI/HindIII 제한효소를 이용하여 pCAG-EGFP 벡터로부터 삽입된 DNA를 절단하였고, 이를 정제하여 5 ng/μL의 stock 농도로 희석하였다.
형광체가 결합된 DNA를 제조하기 위하여, Cy-3가 부착된 프라이머를 Bioneer Company (Daejeon, Korea)에서 구입하고, pCAG-EGFP 벡터의 546 bp 단편을 증폭시키는데 사용하였다. 94℃에서 30초, 62°C에서 30초, 72°C에서 30초를 40 cycle로 PCR을 수행하고, 겔 전기영동으로 단일 밴드를 확인한 뒤 사용 전까지 -20℃에서 저장하였고, 상기 PCR 산물을 GeneClean Turbo kit (MP Biomedicals, Solon, OH, USA)로 정제하였다. Cy-3가 부착된 DNA 단편의 정제를 위하여 사용한 프라이머는 다음과 같다:
5'-ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC-3',
5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG-3'.
실시예 2: 생식세포의 수집
정자를 수집하기 위하여, B6D2F1 (C57BL/6 female × DBA2 male F1 hybrid; Koatech, Pyeongtaek, Korea) 수컷 마우스의 꼬리 부고환을 외과적으로 분리하고, 혈액과 지방 조직은 안과용 가위 (Iris scissor)를 사용하여 제거하였다. 상기 부고환을 HEPES-buffered CZB (H-CZB)로 옮긴 후 [Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52:709-720], 23-게이지 바늘로 구멍을 뚫고, 많은 양의 정자가 방출되도록 핀셋으로 압박하였다. 정자 부유액 100 μL를 H-CZB에 옮겨 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. MII 난자를 준비하기 위하여, B6D2F1 암컷 마우스의 복강 내에 7.5 IU의 임마혈청성선자극호르몬 (pregnant mare serum gonadotropin) (PMSG; Folligon, Intervet, Boxmeer, Holland)과 인간 융모성 성선자극호르몬 (human chorionic gonadotropin) (hCG; Chorulon, Intervet, Boxmeer, Holland)을 48시간 간격을 두고 주입하여 과배란을 유기시키고, 난구-난자 복합체 (cumulus-oocyte complexes)를 hCG 주사후 12-14시에 난관으로부터 외과적으로 분리하였다. H-CZB 내에서 300 U/mL 히알루로니다아제를 처리하여 난구세포를 제거한 후, MII 난자는 KSOM (potassium-modified simplex-optimized medium) 내에서 37℃, 5% CO2 대기에서 사용 전까지 배양하였다. 이러한 모든 동물 절차는 실험동물사용관리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee)와 한국생명공학연구원 (Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)의 가이드라인에 따라 수행하였다.
실시예 3: 스트렙토라이신 O의 처리
스트렙토라이신 O (SLO)를 정자에 처리하기 위하여, 먼저 부고환에서 얻은 정자를 Ca2+및 Mg2+를 함유하지 않은 Hank’s balanced salt solution (HBSS; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에서 세척하고, 0~10 U/mL 스트렙토라이신 O 및 0~2 ng/μL 외래 DNA와 함께 15분 또는 30분 동안 37℃에서 공동 배양하였다. 사용된 스트렙토라이신 O는 동결건조된 분말을 사용하였다. 스트렙토라이신 O를 차갑게 증류한 물에서 25,000 U/mL까지 용해시킨 후, Ca2 +및 Mg2 +를 함유하지 않은 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS, Invitrogen) 로 250 U/ml로 희석하였고, 5 mM 디티오트레이톨 (dithiolthriotol)로 2시간 동안 37℃에서 활성화하였으며, 사용 전까지 -20℃에서 소량으로 분주하여 저장하였다 [Clark RE, Grzybowski J, Broughton CM, Pender NT, Spiller DG, Brammer CG, Giles RV, Tidd DM. Clinical use of streptolysin-O to facilitate antisense oligodeoxyribonucleotide delivery for purging autografts in chronic myeloid leukaemia. Bone Marrow Transpl 1999; 23:1303-1308].
동결-해동 처리를 위해 H-CZB 내의 15 μL의 정자 현탁액을 1.8 mL 용량의 cryotube (Thermo Fisher Scientific Inc., Roskilde, Denmark)로 옮긴 후, 액체 질소 내에 1-2 시간 동안 담궜다. 동결된 정자는 실온에서 해동시키고 3분 동안 4℃에서 1 ng/μL의 외래 DNA와 공동 배양하였다.
실시예 4: ICSI 수행 및 배아 이식
ICSI는 종래의 연구보고에 따라 수행하였다 [Kimura Y, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biol Reprod 1995; 52:709-720]. 간략하게 설명하면, 2 μL의 정자 용액을 10% (w/v)의 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA)을 함유하는 10 μL의 H-CZB와 혼합하였다. 여러 번의 Piezo pulses로 정자 두부를 꼬리로부터 분리하고 실온에서 주입 피펫 (내부 지름, 7 μm)에 적재하였다. 그 후, 강한 Piezo pulses를 사용하여 난자의 투명대를 천공시킨 후, 낮은 Piezo pulses를 사용하여 난자의 세포막을 천공시킴으로써 정자 두부를 난세포질 내로 주입하였다. 정자가 주입된 난자들을 15분간 H-CZB내에서 배양하여 회복시킨 후, 5% CO2 및 37℃ 조건하에서 발달시켰다.
실시예 5: TUNEL 분석법 수행
TUNEL 분석법 (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-digoxygenin nick end-labelling assay)을 In situ Cell-Death Detection Kit (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 수행하였다. 배반포는 체외배양 (in vitro culture) 4일 후 회수하였고, 3 mg/mL의 폴리비닐알코올을 함유하는 PBS (phosphate-buffered saline; Invitrogen) 내에서 4번 세척한 후, 3.7% (w/v)의 파라포름알데하이드를 포함하는 PBS에서 밤새 4℃에서 고정시켰다. 고정된 배아는 0.5% (v/v) 트리톤 X를 함유하는 PBS 내에서, 60분간 실온에서 투과성을 증진시켰다. 비특이적 결합 방지를 위해 10 mg/mL의 소혈청 알부민을 함유하는 PBS로 4 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 배아를 PBS-PVA 내에서 4번 세척하였고, 37℃에서 1시간 동안 형광물질이 결합된 dUTP와 TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase)로 염색하였다. TUNEL 반응에 대한 양성 대조군으로는, 37°C에서 10분간 1,000 U/mL의 DNA 분해효소 (deoxyribonuclease) 내에서 배양한 뒤, TUNEL 염색을 수행한 배아군을 사용하였다. 음성 대조군으로는, TdT가 없는 조건에서 형광물질이 부착된 dUTP와 반응시킨 배아군을 사용하였다. 그 후, 상기 배아들을 PBS-PVA를 이용하여 4번 세척하고, 1.5 μg/mL의 DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole; Vector Laboratories, Burlington, ON, Canada)를 함유하는 mounting solution을 이용하여 슬라이드 위에 탑재하였다. DAPI로 염색된 또는 TUNEL-양성 핵들을 형광현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 하에서 관찰하였다. 처리군당 대략 4개의 배반포에 대하여 TUNEL 분석을 수행하였다.
실시예 6: EGFP 형광 탐지
깨끗한 유리 슬라이드 위에서 발생중인 ICSI된 배아를 옮기고 커버슬립으로 덮었다. 표본의 EGFP 형광을 관찰하고 형광 현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)으로 사진을 촬영하였다.
실시예 7: 유전형 분석
태어난 산자의 꼬리 생검으로부터 상업적으로 구입 가능한 DNA 추출 키트 (GeneAll, Seoul, Korea)를 제조자가 제시하는 프로토콜에 따라 사용하여 게놈 DNA (Genomic DNA)를 추출하였다. 정제된 DNA 샘플은 사용 전까지 -20℃에 저장하였다.
pCAG-EGFP 형질전환 유전자 탐지를 위한 PCR 조건은 다음과 같다:
94℃에서 30초, 62°C에서 30초, 72℃에서 30초를 30 cycle.
또한, 내부 대조군 (internal control)으로서 PP1A에 대한 PCR 반응, 94℃에서 30 초, 54℃에서 30초, 그리고 72℃ 에서 30초로 28 cycle을 수행하였다. 상기 유전형 분석을 위한 프라이머는 다음과 같다.
EGFP 형질전환 유전자 탐지를 위한 프라이머 :
5'-ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC-3',
5'-TGC TCA GGT AGT GGT TGT CG-3'
내부 대조군으로서의 PP1A 유전자 탐지를 위한 프라이머 :
5'-CGC GTC TCC TTC GAG CTG TTT G-3',
5'-TGT AAA GTC ACC ACC CTG GCA CAT-3'
실시예 8: 통계적 분석
모든 실험은 최소 3번 반복하였고, 상기 데이터는 분산 분석을 수행하였다 (ANOVA), 그 후 SigmaStat software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 던컨의 다중검정 (Duncan’s multiple range test)을 수행하였다. 0.05 미만인 P값은 통계적 유의도를 나타낸 것으로 보았다.
실시예 9:　 SLO 처리한 정자는 iSMGT 에 의한 형질전환 배아의 생산율을 향상시킴
스트렙토라이신 O 처리에 의하여 정자 내로 외래 DNA가 도입되었는지 확인하기 위하여, 부고환으로부터 추출한 정자를 1 ng/μL의 Cy-3가 부착된 DNA와 5 U/mL의 스트렙토라이신 O의 존재 (처리군) 또는 부재 (대조군)하에서 30분 동안 배양한 뒤, 형광 현미경으로 관찰하였다. 정자 두부 부분에서 강하게 형광이 관찰되었고, 대조군에 비하여 스트렙토라이신 O로 처리된 정자의 경우 형광의 강도가 확연히 높았다 (도 2의 A).
추가로, iSMGT 방법으로 형질전환된 배아를 생산함에 있어서의 스트렙토라이신 O의 영향을 알아보기 위하여, 스트렙토라이신 O로 처리한 정자와 스트렙토라이신 O로 처리하지 않은 정자 (대조군)를 1 ng/μL의 pCAG-EGFP 벡터와 공동 배양한 뒤 각각 MII 난자의 세포질 내로 주입하여 배반포 단계로 발생시켰고, 형광 현미경으로 관찰하여 EGFP-발현 배아의 수를 기록하였다. Cy-3가 부탁된 DNA와 정자를 공동 배양한 실험의 결과와 동일하게, EGFP-양성 상실배 또는 배반포의 수는 스트렙토라이신 O를 처리한 정자를 사용하여 iSMGT (iSMGT-SLO)를 수행한 경우가 대조군에 비하여 확연하게 증가하였음을 관찰할 수 있었다 (도 2의 B). 상기 결과는, 스트렙토라이신 O로 처리된 정자를 이용하는 경우 외래 DNA가 배아 내로 성공적으로 전달됨을 나타내는 것이다.
실시예 10 : iSMGT 형질전환 배아의 효과적인 생산을 위하여 적절한 스트렙토라이신 O 처리 조건의 확인
적절한 스트렙토라이신 O 처리 조건을 확인하기 위하여, 부고환 정자를 다양한 농도의 스트렙토라이신 O로 15분 또는 30분간, 1 ng/μL의 pCAG-EGFP의 존재 하에서 처리한 뒤, iSMGT를 수행하여 배반포 단계로 배양하고, 형광 현미경으로 EGFP의 발현을 관찰하였다. 관찰 결과, 사용된 난자의 수에 대한 EGFP-양성 배반포의 비율은 5 U/mL의 스트렙토라이신 O를 처리한 군에서 현저히 높았다 (표 1의 컬럼7, 보충 도 S1A). 또한, 5 U/mL의 스트렙토라이신 O를 15분간 처리한 군에 비하여 30분 동안 처리한 군의 경우, 사용된 난자에 대한 EGFP-양성 배반포의 수가 약간 높았다 (표 2, 컬럼 7, 그리고 보충 도 S1A). 또한, 1 ng/μL의 pCAG-EGFP을 사용하는 경우, 배반포 발생률의 감소를 제외하고는 (표 3, 컬럼 5), EGFP를 발현하는 배반포의 수가 크게 증가하였다 (표 3, 컬럼 7, 보충 도 1B). 따라서, 이러한 결과에 기초하여, 정자 처리 조건을 30분 동안 5 U/mL의 스트렙토라이신 O로 전처리하고 1 ng/μ의 pCAG-EGFP와 공동 배양하는 것으로 설정하였다.
Figure 112012091963779-pat00001
Figure 112012091963779-pat00002
Figure 112012091963779-pat00003
비교 실험
비교 실시예 1 : 종래 방법 (iSMGT-FT)과 본 발명 (iSMGT-SLO)의 비교
종래의 정자 매개 유전자 이식 방법에서는 주로 동결-해동시킨 정자가 사용되었다. 본 실험에서는, 동결-해동시킨 정자와 SLO를 처리한 정자에 Cy-3가 부착된 DNA가 결합된 수, 그리고 형광 강도를 측정하여 대조군 (아무것도 처리하지 않은 정자)과 비교하였다. 그 결과, 동결-해동시킨 정자와 SLO을 처리한 정자를 사용한 경우, 대조군에 비하여 형광 강도가 증가하였음을 확인할 수 있었다. (도 3의 A, 도 3의 B). SLO를 처리한 정자를 사용하여 ICSI를 수행 (iSMGT-SLO)한 경우와 동결-해동시킨 정자를 사용하여 ICSI를 수행 (iSMGT-FT)한 경우의 형질전환율을 비교하기 위하여, SLO를 처리한 정자와 동결-해동시킨 정자를 각각 pCAG-EGFP 벡터와 배양하고 MII 난자의 난세포질에 각각 주입하여 배반포 단계까지 발생시켰다. 그 결과, iSMGT-FT 방법에 비하여 iSMGT-SLO 방법에 의한 경우 배반포 발생률이 상당히 증가하였음을 확인할 수 있었다 (표 4). 또한, iSMGT-FT 방법에 비하여 iSMGT-SLO 방법에 의할 경우 배반포 단계에서의 할구 자살율도 상당히 개선된다는 것을 확인할 수 있었다 (표 5).
더욱이, 사용된 난자 수에 대한 EGFP를 발현하는 배반포의 수는, iSMGT-FT 방법에 비하여 iSMGT-SLO 방법에 의할 경우 더 많음을 알 수 있었다 (표 4, 도 3의 C 참조).
Figure 112012091963779-pat00004
Figure 112012091963779-pat00005
비교 실시예 2: iSMGT 에 의한 형질전환 마우스 생산에 있어서의 스트렙토라이신 O 처리 효과
형질전환된 자손을 생산하기 위하여 iSMGT 방법으로 생산된 2-세포기의 배아를 위임신 (pseudopregnant)한 암컷의 난관에 이식하였다. iSMGT-FT 방법 (동결-융해 처리된 정자를 이용한 iSMGT 방법)에 비하여, iSMGT-SLO 방법 (스트렙토라이신 O 처리된 정자를 이용한 iSMGT 방법)에 의할 경우, 임신한 양모와 자손의 수가 우수하다는 것을 확인할 수 있었다 (표 6). 더욱이, 유전형 분석은 사용된 난자의 수에 대비하여 형질전환된 자손의 수가 iSMGT-FT 방법보다 iSMGT-SLO 방법에 의할 경우 더 많음을 확인할 수 있었다 (표 7, 도 4).
형질전환 유전자의 생식선 (germ-line)으로의 이행을 확인하기 위하여, 형질전환된 1세대 자손들을 야생형 파트너와 교배를 시키고, 태어난 2세대 신생자의 꼬리 생검을 pCAG-EGFP 검출 프라이머를 사용하여 유전형 분석을 실시하였다. iSMGT-FT 방법에 의해 생산된 2마리의 형질전환 1세대 산자들의 경우 단 1마리에서만 형질전환 유전자의 생식선 이행이 관찰되었으나, iSMGT-SLO 방법에 의한 경우에는 모든 형질전환 1세대 산자들이 모두 형질전환 유전자를 다음 세대로 전달하였음을 확인할 수 있었다 (표 7 참조).
Figure 112012091963779-pat00006
Figure 112012091963779-pat00007
상기 실험에 의하여 알 수 있는바와 같이, 본 발명자들은 스트렙토라이신 O로 처리한 정자를 사용한 iSMGT 방법에 의하면 형질전환된 동물을 높은 효율로 생산할 수 있음을 확인하였다. 또한, iSMGT 방법에 의해 생성된 배아는 인위적인 활성 없이도 배아의 발생이 가능하며 높은 효율로 배반포 단계로 발생하는바, 본 발명의 iSMGT-SLO 방법에 의하면 형질전환 동물의 효율적 생산이 가능하다는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용을 상세히 기술하였는바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. (A) 정자를 5~10 U/mL 농도의 스트렙토라이신 O를 포함하고, Ca2+ 및 Mg2+는 포함하지 않는 배지에서 배양하는 단계; (B) 상기 배양된 정자를 외래 DNA와 함께 공동 배양하는 단계; (C) 상기 배양된 정자를 분리된 난자의 세포질 내로 주입하여 수정란을 제조하는 단계; 및 (D) 상기 수정란을 생명체로 발생시키는 단계를 포함하는 인간을 제외한 형질전환 포유동물의 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 (A) 단계의 배지는 스트렙토라이신 O를 포함하고, Ca2+ 및 Mg2+는 포함하지 않는 HBSS 배지인 것을 특징으로 하는 형질전환 포유동물의 제조 방법.
  9. 삭제
  10. 제7항에 있어서, 상기 (A) 단계에서의 배양 시간은 15~30분인 것을 특징으로 하는 형질전환 포유동물의 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 제7항에 있어서, 상기 정자는 마우스로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 형질전환 포유동물의 제조 방법.
KR1020120126220A 2012-11-08 2012-11-08 스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법 KR101662734B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120126220A KR101662734B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120126220A KR101662734B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140059606A KR20140059606A (ko) 2014-05-16
KR101662734B1 true KR101662734B1 (ko) 2016-10-06

Family

ID=50889385

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120126220A KR101662734B1 (ko) 2012-11-08 2012-11-08 스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101662734B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101705759B1 (ko) * 2014-11-03 2017-02-10 한국생명공학연구원 디지토닌을 이용한 정자의 형질전환 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002051997A1 (en) * 2000-12-22 2002-07-04 Aurox Llc Methods for cloning mammals using reprogrammed donor chromatin or donor cells
RU2384059C2 (ru) * 2002-11-08 2010-03-20 Киова Хакко Кирин Ко., Лтд. Трансгенные копытные животные, имеющие пониженную активность прионного белка, и их применения

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOLOGY OF REPRODUCTION. 1999, vol. 60, pp. 683-690.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140059606A (ko) 2014-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Honaramooz et al. Adeno‐associated virus (AAV)‐mediated transduction of male germ line stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation
RU2425880C2 (ru) Способ получения трансгенных мышей
KR20180091821A (ko) 유전적 상보성에 의한 인간화 car t-세포 및 혈소판의 조작방법
Pittoggi et al. Generation of biologically active retro‐genes upon interaction of mouse spermatozoa with exogenous DNA
JP2020043864A (ja) 幹細胞を用いた異種間胚胞キメラ動物の作製法
US7598082B1 (en) Process of mammalian cell reprogramming through production of a heterokaryon
CA3179710A1 (en) Methods for improving the health of porcine species by targeted inactivation of cd163
US20090298168A1 (en) Method of genetically altering and producing allergy free cats
Sim et al. Efficient production of transgenic mice by intracytoplasmic injection of streptolysin‐O‐treated spermatozoa
KR101662734B1 (ko) 스트렙토라이신 ｏ의 처리에 의한 형질전환 동물의 생산성 향상 방법
Cho et al. Development potential of transgenic somatic cell nuclear transfer embryos according to various factors of donor cell
Hwang et al. Production of transgenic pigs using a pGFAP-CreERT2/EGFPLoxP inducible system for central nervous system disease models
Chan et al. Sperm-mediated gene transfer
US10626417B2 (en) Method of genetically altering and producing allergy free cats
JP5374389B2 (ja) 霊長類動物の初期胚への外来遺伝子導入法及び該導入法を含むトランスジェニック霊長類動物を作出する方法
KR101705759B1 (ko) 디지토닌을 이용한 정자의 형질전환 방법
US20230220331A1 (en) Temporary treatment medium, treatment kit, embryogenesis arrest inhibitor, embryogenesis arrest inhibitory method, developmental engineering product preparation method, transplantation method, therapeutic method, and developmental engineering product
BAĞIŞ et al. Application of green fluorescent protein as a marker for selection of transgenic mouse embryos before implantation
Forsyth et al. 330 UTILIZING PRE-IMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS AND OPU-IVP-ET TO GENERATE MULTIPLE PROGENY OF PREDETERMINED GENOTYPE FROM CLONED TRANSGENIC HEIFERS
AU771102B2 (en) Cell reprogramming
Gupta et al. Transgenic animals and plants
KR100837415B1 (ko) 돼지 난자를 이용한 이종 간 형질전환 방법
JP2016529916A (ja) 蛍光タンパク質に特異的なｔ細胞受容体を有する遺伝子導入動物の作製方法
Shim et al. Effects of sperm membrane disruption and electrical activation of oocytes on in vitro development and transgenesis of porcine embryos produced by intracytoplasmic sperm injection
Hirabayashi Technical development for production of gene-modified laboratory rats

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right