KR100832943B1 - 재구성된 공여체 염색질 또는 공여체 세포를 이용한 포유류의 클로닝방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공여체 염색체 또는 공여체 세포가, 탈핵된 난모 세포에 삽입되기 이전에 재구성될 수 있도록 하는 포유 동물을 클로닝하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 수용체 세포에 염색체 또는 세포핵을 삽입하는 방법을 특징으로 하고 있다.

클로닝, 배아세포, 난모 세포, 염색질 치환, 핵 치환, 핵 주입, 라민A, 라민B, 라민C, NuMA, AKAP95

Description

재구성된 공여체 염색질 또는 공여체 세포를 이용한 포유류의 클로닝방법{METHOD FOR CLONING MAMMALS USING REPROGRAMMED DONOR CHROMATIN OR DONOR CELLS}

일반적으로, 본 발명의 특징은 포유류를 클로닝하는 방법 및 수용체 세포에 염색체, 핵 또는 염색질을 삽입하는 방법을 개량시키는데 있다.

포유류의 클로닝은 동일한 DNA 함량을 갖는 다수의 포유류를 생산하는 것을 가능하게 한다. 이러한 포유류를 생산해내는데 사용되는 공여체 유전 물질은 병에 대한 증가된 저항력과 같은 이상적인 특징을 갖는 것이 선택되거나 그런 것으로 가공된 것일 수 있다. 불행하게도 공여체 체세포를 이용한 포유류의 클로닝 효율은 대체로 낮기 때문에, 핵이식 배아의 단지 약1-2%만이 만삭에 이르기까지 발생하는 결과를 낫는다(polejaeva et tal., Nature 407:86-90, 2000). 클로닝에 있어서 심각한 문제는 임신 기간 중기에서 말기까지의 손실과 태어난 개체의 낮은 생존율이다.

본 발명의 목적은 포유류를 클로닝하는 증진된 방법을 제공하는데 있다. 보다 상세하게는, 공여체 세포핵이 염색질로 응축할 때, 핵이식 수정란이 살아있는 개체로 발생하는데 있어서 부적절한 유전자의 전사를 촉진시킬 수 있는 전사 인자 (transcripton factor)와 같은 핵 요소를 방출하도록 하는 것을 포함한다. 관련된 방법에서, 침투된 세포(permeabilized cell)는 재구성 배지(reprgrammed medium)에서 배양되어 세포로부터 어떤 요소를 첨가하거나 제거되고 나서 침투된 세포의 세포막을 다시 붙임으로써 이상적인 요소들을 포함시키고 세포의 본래 막을 유지하는 것이 가능하게 된다. 이상적이라면, 이러한 방법의 어떠한 단계가 1회 또는 그 이상 반복될 수 있거나 재구성 정도를 증가시키기 위해 다른 재구성된 방법들이 연속적으로 수행될 수 있고, 그 결과 클론된 태아의 생존율이 높아지게 된다. 본 발명은 또한 하나의 유전적 근원으로부터 비롯된 태반 조직의 일부 또는 전부 및 다른 유전적 근원에서 비롯된 태아 조직의 대다수에서 키메릭 배아를 발생시키는 방법을 제공한다. 이러한 키메릭 배아들은 아마도 낮은 태반 기형을 갖고 따라서 증가된 생존율을 나타낼 것이다. 또한 염색질 혹은 핵을 융합 화합물을 포함하는 수용체 난모세포에 삽입하는 것을 발전시키는 새로운 방법을 제공한다.

따라서, 첫번째 측면에서, 본 발명은 포유류를 클로닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (1) DNA 복제를 유발하지 않고 염색질 매스(chromatin mass)를 형성하도록 하는 환경하에서 4세트(set) 미만의 상동 염색체(즉, 2쌍(pair) 미만의 완전한 염색분체)를 갖는 공여체 세포핵을 배양하고,(2) 염색질 매스를 핵을 제거한 난모세포에 삽입하여 새로운 핵 치환 난모세포를 형성하고 (3) 핵치환 난모세포 또는 핵치환 난모세포로부터 형성된 배아를 태아로 발생시킬 수 있는 환경하에서 핵치환 난모세포 또는 핵치환 난모세포로부터 형성된 배아를 숙주 포유동물의 자궁으로 옮기는(transfer) 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 공여체 세포핵은 전사 인자, 억제 단백질, 또는 염색질 리모델링 단백질과 같은 핵 또는 세포질의 구성 성분들이 핵 또는 결과인 염색질 매스에 첨가되거나 제거될 수 있는 환경하에서 재구성 배지(예를 들면, 세포 추출물)에서 배양된다. 바람직하게는 공여체 세포핵은 염색질 매스의 형성을 가능케 하는 환경하에서 안티MuMA항체, 계면 활성제(detergent) 및/또는 염 용액, 또는 단백질 카이네이즈(kinase) 용액 중 하나 이상과 접촉하고 있다. 다른 바람직한 구현예에서 재구성된 난모 세포 또는 그 결과인 배아는 라민A, 라민C, 또는 NuMA단백질을 동일한 수의 동일한 종으로부터 얻어진 대조군 난모 세포 또는 배아의 대응 수준보다 5배(fold) 미만으로 큰 수준으로 발현한다.

관련된 측면에서, 포유류를 클로닝하는 다른 방법을 제공한다. 이 방법은 핵 염색질 매스, 또는 침투된 세포의 염색체들로부터 요소(즉, 전사 인자와 같은 핵 또는 세포질 요소)들이 제거 혹은 추가되어 재구성된 세포를 만들 수 있는 환경에서 재구성 배지(예를 들면, 세포 추출물)에서 침투된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 재구성된 세포는 핵이 제거된 난모 세포에 삽입되고, 그 결과인 난모 세포 또는 이로부터 형성된 배아는 난모 세포 또는 배아를 태아로 발생시킬 수 있는 환경하에서 숙주 포유동물의 자궁으로 옮겨진다. 바람직한 구현예에서, 침투된 세포는 염색질 매스의 형성을 가능케 하는 환경하에서 안티MuMA항체, 계면 활성제 및/또는 염 용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액 중 하나 이상과 접촉하고 있다. 또 다른 구현예에서, 침투된 세포는 간기 재구성 배지(즉, 간기 세포 추출물)에서 배양된다. 그 밖의 다른 구현예에서 침투된 세포의 핵은 막으로 싸인 채 남아 있고, 그 핵의 염색체는 이 간기 재구성 배지에서 배양되는 동안 응축되지 않는다. 어떤 구현예에서, 재구성 배지에서의 침투된 세포의 배양은 DNA복제를 유발하지 않고, 단지 세포의 50, 40, 30, 20, 10 또는 5%이하에서만 DNA복제를 일으킨다. 다른 구현예에서는 재구성 배지에서의 침투된 세포의 배양은 최소한 60, 70, 80, 90, 95 혹은 100%의 세포에서 DNA복제를 유발한다. 다양한 구현예에서, 침투된 세포는 원래의 세포를 디지토닌과 같은 계면 활성제, 또는 스트렙토라이신O(Streptolysin O)와 같은 박테리얼 톡신(bacterial toxin)과 함께 배양함으로써 형성된다. 다른 바람직한 구현예에서 재구성된 세포는 난모 세포로 삽입되기 이전에 재구성된 세포의 막이 리실링(resealing)할 수 있는 환경하에서 배양된다. 다른 구현예에서 재구성된 난모세포 혹은 그 결과물인 배아는 라민A, 라민C, 또는 NuMA단백질을 동일한 수의 동일한 종으로부터 얻어진 대조군 난모세포 또는 배아에 의해 발현되는 대응 수준보다 5배 미만으로 큰 수준으로 발현한다.

본 발명은 두개의 다른 배아로부터 나온 세포의 사용을 포함하는 포유 동물을 클로닝하는 방법을 제공한다. 예를 들면, 핵치환 배아(즉, 세포,핵, 또는 염색질 매스를 핵이 제거된 난모세포에 넣은 것)로부터 나온 세포들이 시험관 내에서 수정된, 자연 발생된, 또는 처녀생식 가능하도록 활성된 난모 세포로부터 나온 세포들과 결합될 수 있다. 바람직하게는 세포의 대다수 및 핵치환 난모 세포로부터 나온 세포들이 키메릭 배아의 결과인 태아의 조직에 포함되어 진다. 바람직하게는 최소한 세포의 일부 및 제2 배아로부터 나온 세포들이 태반 조직으로 포함되어지고 그 결과 키메릭 배아의 생존을 증진시킨다.

따라서, 그런 한 측면에서, 본 발명은 세포, 세포핵, 또는 염색질 매스를 핵이 제거된 난모세포에 삽입하여 제1 배아를 형성하는 것을 포함하는 포유 동물의 클로닝 방법을 특징으로 한다. 제1 배아로부터 나온 하나 이상의 세포는 시험관 내에서 수정된, 자연발생된, 또는 처녀생식 가능하도록 활성된 제2 배아로부터 나온 세포들과 결합하여 제3 배아를 형성한다. 제3 배아는 제3 배아가 태아로 발생할 수 있는 환경하에서 숙주 포유 동물의 자궁으로 옮겨진다. 한 구현예에서, 최소한 하나의 제1 배아 및 제2 배아는 응축 배아이다. 다른 구현예에서 제1 배아 및 제2 배아는 다른 세포 발생 단계에 있다. 제1 배아 및 제2 배아를 생산하기 위해 사용된 공여체 세포는 동일한 종 또는 다른 속 또는 종으로부터 온 것일 수 있다. 바람직하게는 태아의 영양외배엽 또는 태반 조직 세포의 최소한 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%가 제2 배아로부터 유도되거나 혹은 태아의 세포내 매스 (inner cell mass) 혹은 태반 조직의 최소한 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%의 세포는 제1 배아에서 유래된 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 제1 배아 또는 제3 배아는 라민A, 라민C, 또는 NuMA단백질을 동일한 수의 동일한 종으로부터 얻어진 대조군 난모 세포 또는 배아에 의해 발현되는 대응 수준보다 5배 미만으로 큰 수준으로 발현한다.

관련된 측면에서, 본 발명은 포유 동물을 클로닝하는 또다른 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 염색질 매스의 형성, 및 그 염색질 매스를 핵이 제거된 난모 세포에 삽입하는 것이 가능한 환경하에서, 재구성 배지에서 공여체 세포핵을 접촉시키고 제1 배아를 형성하는 것을 포함한다. 제1 배아로부터 나온 하나 이상의 세포는 시험관 내에서 수정된, 자연발생된, 또는 처녀생식 가능하도록 활성된 제2 배아로부터 나온 세포들과 결합하여 제3 배아를 형성한다. 제3 배아는 제3 배아가 태아로 발생할 수 있는 환경하에서 숙주 포유 동물의 자궁으로 옮겨진다. 한 바람직한 구현예에서 염색질 매스는 4세트 미만의 상동 염색체를 갖는 핵을 DNA복제 없이 염색질 매스를 형성시킬 수 있는 환경하에서 재구성 배지와 접촉시킴으로써 형성된다. 바람직하게는 공여체 세포핵이 염색질 매스의 형성을 가능케 하는 환경하에서 안티MuMA항체, 계면 활성제 및/또는 염 용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액 중 하나 이상과 접촉하고 있다. 다양한 구현예에서 제1 배아 및 제2 배아는 응축 배아이고; 전응축(precompaction) 배아이고 혹은 이 중 하나는 응축 배아이고 다른 하나는 전응축 배아이다. 제2 배아를 형성하는 제1 배아 및 공여체 세포핵은 다른 세포단계 혹은 같은 단계에 있다. 제2 배아를 형성하는 제1 배아 및 공여체 세포핵은 동일한 종으로부터 온 것이거나 다른 속 또는 종일 수도 있다. 바람직하게는 태아의 영양외배엽 또는 태반 조직 세포의 최소한 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%가 제2 배아로부터 유도되거나 혹은 태아의 세포내 매스 혹은 태반 조직의 최소한 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%의 세포는 제1 배아에서 유래된 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 제1 배아 또는 제3 배아는 라민A, 라민C, 또는 NuMA단백질을 동일한 수의 동일한 종으로부터 얻어진 대조군 난모 세포 또는 배아에 의해 발현되는 대응 수준보다 5배 미만으로 큰 수준으로 발현한다.

다른 관련된 측면에서, 본 발명은 포유 동물을 클로닝하는 다른 방법을 제공한다. 이 방법은 핵 염색질 매스, 또는 침투된 세포의 염색체들로부터 요소(즉, 전사 인자와 같은 핵 또는 세포질 요소)들이 제거 혹은 추가되어 재구성된 세포를 만들 수 있는 환경에서, 재구성 배지(예를 들면, 세포 추출물)에서 침투된 세포를 배양하는 것을 포함한다. 재구성된 세포는 핵이 제거된 배아에 삽입되고, 따라서 재구성된 세포가 형성된다. 제1 배아의 하나 이상의 세포는 시험관 내에서 수정된, 자연발생된, 또는 처녀생식 가능하도록 활성된 제2 배아로부터 나온 세포들과 결합하여 제3 배아를 형성한다. 제3 배아는 제3 배아가 태아로 발생할 수 있는 환경하에서 숙주 포유 동물의 자궁으로 옮겨진다. 한 바람직한 구현예에서 침투되 세포는 전사 인자와 같은 핵 또는 세포질 요소들이 세포핵 또는 그 결과물인 염색질 매스에 첨가 또는 제거될 수 있는 환경하에서 재구성 배지에서 배양된다. 다른 바람직한 구현예에서, 침투된 세포는 염색질 매스의 형성을 가능케 하는 환경: 즉, 안티MuMA항체, 계면 활성제 및/또는 염 용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액이 있거나 없는 상태의 유사 분열 추출물 중 하나 이상과 접촉하고 있다. 또 다른 구현예에서, 침투된 세포는 간기 재구성 배지(즉, 간기 세포 추출물)에서 배양된다. 그 밖의 다른 구현예에서 침투된 세포의 핵은 막으로 싸인 채 남아 있고, 그 핵의 염색체는 이 간기 재구성 배지에서 배양되는 동안 응축되지 않는다. 어떤 구현예에서, 재구성 배지에서의 침투된 세포의 배양은 DNA복제를 유발하지 않고, 단지 세포의 50, 40, 30, 20, 10 또는 5%이하에서만 DNA복제를 일으킨다. 다른 구현예에서는 재구성 배지에서의 침투된 세포의 배양은 최소한 60, 70, 80, 90, 95 혹은 100%의 세포에서 DNA복제를 유발한다. 다양한 구현예에서, 침투된 세포는 원래의 세포를 디지토닌과 같은 계면 활성제, 또는 스트렙토라이신O와 같은 박테리얼 톡신과 함께 배양함으로써 형성된다. 다른 바람직한 구현예에서 재구성된 세포는 재구성된 세포의 막이 난모 세포로 들어가기 이전에 리실링이 가능한 환경하에서 배양된다. 다양한 구현예에서 제1 배아 및 제2 배아는 응축 배아이고; 전응축 배아이고 혹은 이 중 하나는 응축 배아이고 다른 하나는 전응축 배아이다. 제1 배아 및 제2 배아를 형성하는 공여체 세포핵은 다른 세포 발생 단계 혹은 같은 단계에서 온 것일 수 있다. 제2 배아를 형성하는 제1 배아 및 공여체 세포핵은 동일한 종으로부터 온 것이거나 다른 속 또는 종일 수도 있다. 바람직하게는 태아의 영양외배엽 또는 태반 조직 세포의 최소한 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%가 제2 배아로부터 유도되거나 혹은 태아의 세포내 매스 혹은 태반 조직의 최소한 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100%의 세포는 제1 배아에서 유래된 것이다. 다른 바람직한 구현예에서, 제1 배아 또는 제3 배아는 라민A, 라민C, 또는 NuMA단백질을 동일한 수의 동일한 종으로부터 얻어진 대조군 난모 세포 또는 배아에 의해 발현되는 대응 수준보다 5배 미만으로 큰 수준으로 발현한다.

두 난모 세포로부터 유래한 세포를 사용하여 포유 동물을 클로닝하는 상기의 방법 중 어느 바람직한 구현예에서 제1 또는 제2 배아의 투명대의 부분 또는 전부는 각 배아로부터 나온 세포와 접촉하기 이전에 제거된다. 한 구현예에서, 제1 및 제2 배아로부터 유래한 세포들은 용액 또는 고체 지지대에서 서로 나란히 위치시킴으로써 접촉되어 진다. 다른 바람직한 구현예에서 제1 배아로부터 나온 세포를 제2 배아로 주입하기 위해 표준화된 기술이 사용된다. 세포들은 투명대와 수정란 자체 사이의 공간인 배아 주위(periphery)와 같은 제2 배아의 어느 위치에도 주입될 수 있다. 자연 발생된 배아의 예에는 표준화된 기술을 이용하여 임신한 포유 동물(예를 들면, 소)로부터 수술적 또는 비수술적으로 제거된 배아도 포함된다. 시험관 내에서 수정된 배아의 예에는 표준 기술을 이용하여 세포질내 정자 주입 (intra-cytoplasmic sperm injection)에 의한 배아를 포함한다. 또한 클론된 포유 동물의 생산을 위해 둘 이상의 배아(예를 들면 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 배아)로부터 나온 세포들이 결합하여 키메릭 배아를 형성시킬 수 있음을 예측할 수 있다.

상기 양상의 바람직한 구현예에서 재구성 배지는 DNA 메틸트랜스퍼레이즈, 히스톤 디아세틸레이즈, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성 인자, 또는 억제자와 같은 요소의 양을 풍부하게 또는 결핍되게 하여 변형된다. 다른 바람직한 구현예에서 난모 세포 또는 키메릭 배아의 NuMA 또는 AKAP95 단백질의 발현 수준은 세포질에서보다 핵에서 최소한 2배, 5배, 10배, 혹은 20배 크다. 또다른 구현예에서, 난모 세포 또는 키메릭 배아에서의 AKAP95단백질의 최소한 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100%가 0.1% 트리톤X-100, 1mg/ml DNaseⅠ,및 100mM 또는 300mM NaCl 용액으로 추출되어 진다. 바람직하게는 염색질 매스는 핵이 제거된 난모 세포로의 삽입 이전에 재구성 배지로 정제된다. 다른 바람직한 구현예에서 핵이 제거된 난모 세포로의 염색질 매스의 삽입은 염색질 매스가 난모 세포로 들어갈 수있는 환경하에서 염색질 매스 및 난모 세포와 융합 화합물의 접촉을 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서, 태아가 살아 있는 개체로 발생한다. 바람직하게는 최소한 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%의 핵치환 난모 세포 또는 배아가 살아있는 개체로 발생한다. 이 방법에서, 염색질 매스를 포함하는 난모 세포 혹은 재구성된 세포는 세포 분열과 그 결과물 세포가 1회 이상 다시 클로닝될 수 있는 환경하에서 배양될 수 있다. 이 방법에 사용된 공여체 세포핵, 공여체 염색질 매스, 또는 공여체 세포 및 난모 세포는 동일한 종에서 유래한 것일 수도 있고, 다른 종이나 속에서 온 것일 수도 있다. 포유 동물은 인간 또는 인간을 제외한 포유 동물이고 난모 세포는 수정된 것일 수도 그렇지 않을 수도 있다. 바람직하게는 공여체 세포핵, 염색질 매스, 침투된 세포는 G₁ 또는 G₀ 단계 세포에선 온 것이다. 또한 클론된 배아, 태아, 포유류의 게놈 DNA는 바람직하게는 실질적으로 공여체 세포의 그것과 동일하다. 실질적으로 염색질 매스 또는 재구성된 세포 및 배아에서 자연 발생된 게놈 DNA와 실질적으로 동일한 것을 갖는 세포와 동일한 DNA를 포함하는 키메릭 배아, 태아, 포유 동물의 생산을 위해 염색질 매스 또는 재구성된 세포가 배아에 삽입되어 지는 것을 예측할 수 있을 것이다. 또한 핵을 갖는 난모세포가 본 발명의 방법에 사용될 수 있음이 예측될 수 있다.

본 발명의 어떤 측면에 사용되는 재구성 배지는 외부에서 유래된 핵산을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 다른 구현예에서 재구성 배지 또는 침투된 세포내에서 형성된 염색질 매스는 벡터의 핵산과 염색질 매스의 게놈의 대응 핵산 사이에 무작위적 삽입 또는 상동적인 재조합이 가능하여 염색질 매스의 게놈의 변화를 가져올 수 있는 환경하에서, 관심의 대상인 유전자를 인코딩하는 핵산을 갖는 벡터와 접촉하게 된다. 본래의 원형질막 및 핵막이 없기 때문에, 침투된 세포 또는 용액에서의 염색질 매스는 자연 발생된 세포보다 쉽게 변형이 가능하다. 재구성된 추출물의 생산을 위해 사용될 수 있는 세포의 예에는 배아 줄기 세포 및 뇌, 혈액, 골수, 췌장, 간, 피부, 또는 다른 기관 및 조직에서 나온 성체 줄기 세포(adult stem cell)를 포함한다. 재구성된 다른 세포 추출물의 예에는 난모세포 추출물(예를 들면, 소 또는 성게 난모세포 추출물) 및 수컷의 생식 세포 추출물(예를 들면, 척추 동물, 무척추동물 또는 포유 동물의 정원 세포, 제1 정모 세포, 제2 정모 세포 또는 정자 추출물)등이 포함된다. 공여체 또는 침투된 세포는 비불멸성 또는 자연 발생적, 자발적, 유전적으로 불멸성일 수 있다. 공여체 세포, 침투된 세포, 수용체 세포, 또는 세포질은 배아, 태아, 어린 또는 성숙한 포유 동물과 같이 어느 세대에서도 얻어질 수 있다. 어린 포유 동물로부터 나온 세포들은 적은 자발적 돌연변이를 갖게 되고, 난모 세포로 삽입된 후에 더 긴 생존 기간을 가질 수도 있다.

본 발명은 또한 염색체, 염색질 매스, 또는 핵을 수용체 세포에 삽입하는 방법을 제공한다. 이러한 방법들은 공여체의 유전 물질을 포유 동물의 클로닝을 위한 수용체 난모 세포로 옮기는 방법을 제공한다. 또한 한 세포의 유전 물질을 다른 세포의 그것으로 대체하는 방법을 제공한다.

본 발명의 이러한 측면에 따르면, 염색체 또는 염색질 매스를 염색체 또는 염색질 매스가 수용체 세포로 들어갈 수 있는 환경하에서, 융합 화합물과 접촉하는 것을 포함하는 염색체 또는 염색질 매스 및 세포를 수용체 세포에 삽입하는 기술을 제공할 수 있다. 한 바람직한 구현예에서 수용체와의 접촉에 앞서 염색체 또는 염색질 매스를 융합 화합물과 접촉시키면서 배양한다. 염색체 또는 염색질 매스가 응축되거나 응축되지 않고, 염색체나 염색질 매스 및 수용체 세포는 동일한 종 또는 다른 종이나 속일 수 있다. 다른 바람직한 구현예에서, 수용체 세포는 수정되거나 수정되지 않은 난모 세포일 수 있다. 바람직하게는 수용체 세포 또는 염색체는 인간 또는 인간을 제외한 포유 동물로부터 유래된 것일 수 있다. 다양한 구현예에서, 수용체 세포는 성숙, 태아 또는 배아 세포이다. 한 상세한 바람직한 구현예에서, 공여체 세포의 모든 염색체는 수용체 세포에 삽입된다. 바람직하게는 공여체 세포가 하플로이드(n의 DNA함량), 디플로이드(2n), 또는 테트라플로이드(4n)일 수 있고, 수용체 세포는 하이포플로이드(2n미만의 DNA함량), 하플로이드 또는 핵이 제거된 세포이다. 다른 구현예에서, 염색체는 두개의 하플로이드 세포처럼 한 공여체 이상으로부터 유래된 것이다. 또다른 바람직한 구현예에서, 염색체는 DNA복제 유발 없이 염색질 매스의 형성을 가능하게 하는 환경하에서 4세트 미만의 상동 염색체를 가지는 공여체의 핵과 유사 분열 추출물, 계면 활성제 및/또는 염, 또는 단백질 카이네이즈를 접촉시킴으로써 얻어진다. 바람직한 융합 화합물은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 및 리포펙틴^®(Lipofectin^®), 리포펙타민^®(Lipofectamin^®), 도탭^®(DOTAP^®){N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트; C₄₃H₈₃NO₈S}, 도스파^®(DOSPA^®){2,3-디올레오일옥시-N-[2(스퍼미네카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미니움 트리퓨오로아세테이트},및 도페^®(DOPE^®)(디올레오일포스파티딜에탄올아민)과 같은 리피드를 포함한다. 다른 바람직한 리피드는 사차 암모늄 그룹을 포함하는 중성 및 일가(一價)의 또는 다가(多價)의 양이온성 리피드를 포함한다. 추가적인 바람직한 리피드는 콜레스테롤의 하이드록시 그룹과 리피드의 그룹이 반응하여 형성된 것과 같이 콜레스테롤 부분을 갖는다. 그밖의 다른 리피드는 바람직하게는 5-10, 10-15, 15-20, 20-30개,그 이상의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 지방산을 갖는다. 이러한 리피드는 표준 화학 기술에 의해 합성되거나 자연 발생된 근원에서 획득되거나 또는 상업적 원천(Summers 등의 Biophys J. 71(6):3199-206페이지, 1996년; Nabekura등의 Pharm Res 13(7):1069-72페이지,1996년; Walter등의 Biophy J. 66(2Pt1);366-376,1994년; Yang등의 Biosci Rep.13(3):143-157,1993년; Walter 및 Siegel,Biochemistry. 6:32(13):3271-3281,1993년)에서 구입된 것일 수 있다. 다른 바람직한 융합 화합물은 성게알 또는 다른 원천에서 나온 막운반조각(membrane vehicle fragment)과 같은 인지질이다. 바람직하게는 염색체와 막운반조각의 접촉은 본래의 막에 의해 쌓여 있는 염색체로 결론지어지지는 않는다.

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관련된 측면에서, 본 발명은 세포핵이 수용체 세포로 들어갈 수 있는 환경하에서 세포핵과 세포 및 융합 화합물을 접촉시켜 세포핵을 수용체 세포로 삽입하는 방법을 제공한다. 융합 화합물은 리피드 또는 동일한 모노머로 구성된 고분자는 아니다. 바람직하게는 세포핵은 수용체 세포와 접촉시키기 전에 융합 화합물과 배양한다. 다양한 구현예에서, 세포핵 및 수용체는 동일한 종 또는 속에서 선택된 것일 수 있따. 바람직하게는 세포핵의 하플로이드, 디플로이드이며 수용체 세포는 하이포디플로이드, 하플로이드 또는 핵이 제거된 것을 포함하다. 다른 바람직한 구현예에서 수용체 세포는 인간 또는 인간을 제외한 것에서 유래되었다. 바람직한 융합 화합물은 리포펙틴^®, 리포펙타민^®, 도탭^®, 도스파^® 및 도페^®를 포함한다. 다른 바람직한 리피드는 중성 리피드 및 사차 암모늄과 같은 일가 또는 다가의 양이온 리피드를 포함한다. 추가적인 바람직한 리피드는 콜레스테롤의 하이드록시 그룹과 리피드의 그룹이 반응하여 형성된 것과 같이 콜레스테롤 부분을 갖는다. 그밖의 다른 리피드는 바람직하게는 5-10, 10-15, 15-20, 20-30개,그 이상의 탄소 원자를 포함하는 포화 또는 불포화 지방산을 갖는다. 이러한 리피드는 표준 화학 기술에 의해 합성되거나 자연 발생된 근원에서 획득되거나 또는 상업적 원천(Collas 및 Poccia, surp)에서 구입된 것일 수 있다. 다른 바람직한 융합 화합물은 성게알 또는 다른 원천에서 나온 막운반조각(membrane vehicle fragment)과 같은 인지질이다. 바람직하게는 염색체와 막운반조각의 접촉은 본래의 막에 의해 쌓여 있는 염색체로 결론지어지지는 않는다.

본 발명의 바람직한 다른 구현예에서, 세포핵 또는 염색체는 성인, 태아, 또는 배아 세포에서 유래된 것이다. 바람직한 세포의 예에는 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각막 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골 세포, B림프구, T림프구, 적혈구, 마크로파지, 모노싸이트, 혈소판 및 근육 세포와 같은 분화된 세포; 및 배아 세포(예를 들면, 줄기 세포 및 배아 생식 세포)와 같은 미분화된 세포를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 세포는 유선(mammary gland), 난자(ovarin cumulus),자성과립(granulosa), 또는 난관 세포(oviductal cell)와 같은 여성 생식 기관으로부터 유래된 세포를 포함한다. 바람직한 세포는 방광, 뇌, 식도, 팔로피오관, 심장, 소장, 담낭, 신장, 간, 페, 난소, 췌장, 전립선, 척수, 비장, 위, 정소, 흉선, 갑상선, 호흡관, 수뇨관, 요도, 자궁과 같은 기관에서 유래된 세포를 포함한다. 바람직한 인간을 제외한 포유 동물은 보스 속(genus Bos.)의 구성원들을 포함한다. 다른 바람직한 포유 동물의 예에는 황소, 양, 큰 뿔양, 염소, 버팔로(buffalo), 영양, 수소, 말, 당나귀, 노새, 사슴, 엘크, 순록, 물소(water buffalo), 낙타, 라마,알파카, 집토끼, 돼지, 마이스(mice), 백쥐, 기니 피그, 햄스터 및 원숭이와 같은 영장류를 포함한다. 또다른 바람직한 구현예에서 세포핵, 침투된 세포, 또는 염색체는 형질전환 세포 또는 포유 동물로부터 나온 것이고, 공여체 세포에는 포함되지 않거나 자연 발생된 세포에는 포함되지않는 돌연변이를 포함한다.

바람직한 형질전환 공여체 세포핵 및 공여체 세포는 클론된 포유 동물의 질병 또는 기생충에 대한 증진된 저항력을 제공하는 단백질은 인코딩한다. 대신에 공여체 세포핵 또는 세포는 클로된 포유 동물이 소변, 혈액, 또는 우유와 같은 재조합 인간 단백질을 생산하도록 조작될 수 있다. 예를 들면, 유로플라킨 프로모터(uroplakin promoter)의 조절하에서 인간 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 삽입함으로써 소의 소변에서 단백질이 발현될 수 있도록 할 수 있다. 클론된 소의 우유에서 만들어지도록 된 치료용 단백질의 예에는 인간의 단일 클론 항체 및 factorⅠ에서ⅩⅢ(Voet and Voet, Biochemistry, John Wiely&Sons, New York, 1990년)까지의 인간의 혈액 응고 인자를 포함한다. 이러한 이종 단백질은 프로락틴 프로모터 또는 우유의 발현에 적합한 다른 어떤 프로모터의 조절하에서 발현될 수 있을 것이다. 우유, 혈액 또는 클론된 포유 동물의 다른 유체에서 인간의 항체를 생산하기 위해, 항체의 헤비 체인 및 라이트 체인의 내생성 유전자를 불활성화하거나 녹아웃(knockout)하여 기능성 항체가 더이상 공여체 세포핵에 의해 인코딩되지 않도록 하고, 인간의 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM항체의 헤비 및 라이트 체인을 인코딩하는 유전자를 삽입하는데 표준화된 기술이 사용된다. 이러한 또는 다른 조직 또는 유체로부터 나온 단백질은 표준화된 정제 기술을 이용하여 정제될 수 있다. (예를 들면, Ausubel etal.,surpa에 나타난다.)

본 발명의 방법을 이용하여 배아, 태아, 또는 성체 포유 동물로부터 나온 세포, 조직, 또는 기관은 인간의 질병의 치료 또는 억제와 같은 의학적 응용을 위한 물질의 원료로 사용될 수도 있을 것이다. 예를 들면, 세포, 조직, 또는 기관이 클론된 배아로부터 시험관에서 발생된 후, 포유 동물로 옮겨지고, 클론된 포유 동물로부터 제거되고 다른 종의 다른 포유 동물로 옮겨지거나 또는 클론된 포유 동물로부터 제거되고 동일한 종의 다른 포유 동물로 옮겨진다. 예를 들면 클론된 포유 동물로부터 나온 신경 조직은 알츠하이머, 파킨스씨병, 헌팅턴 무도병 또는 ALS; 또는 척수 손상과 같은 신경 질환을 치료, 예방, 안정시키기 위해 인간의 신경계의 적절한 위치에 이식될 수도 있다. 보다 상세하게는 신경 세포의 퇴화 또는 손상은 클론된 포유 동물로부터 나온 대응 세포로 대체될 수 있을 것이다. 이러한 이식 방법은 또한 인슐린 의존성 당뇨병(insulin dependent diabetes mellitus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 천포창(pemphigus), 다중 경화증(multiple sclerosis), 및 근실조증(myasthenia gravis)와 같은 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 자가면역성 질환을 치료, 예방, 또는 안정화하는데 사용될 수도 있다. 이러한 질병에서, 수용체의 자가 면역 시스템에 의해 공격 받은 세포들은 이식된 세포들에 의해 대체될 것이다. 클론된 포유 동물은 연골, 골수 또는 다른 조직이나 기관의 공급원으로 사용될 수 있을 것이다.

공여체 이식 물질의 공급원으로서의 클로된 포유 동물의 생산을 위해, 클론된 포유 동물의 생산에 사용되는 공여체 세포핵 또는 공여체 세포는 바람직하게는 공여체 물질이 투입될 수용체 포유 동물에서 발견되는 MHC ClassⅠ단백질 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 이종의 MHC ClassⅠ단백질을 인코딩하도록 변경된다. 대신 공여체 세포핵은 수용체 포유 동물과 동일한 종 또는 속의 다른 포유 동물에서 발견되는 MHC ClassⅠ단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 이종 MHC ClassⅠ단백질을 인코딩한다. 이러한 이종 MHC 단백질을 나타내는 공여체 세포, 조직, 또는 기관은 수용체 포유 동물에 역면역 반응을 덜 유도하게 된다. 다른 바람직한 공여체 이식 물질은 인간의 보체 조절 붕괴 가속 인자(h-DAF)와 같은 수용체 포유 동물의 보체 경로를 저해하는 이종 단백질을 나타내도록 수정된 공여체 세포핵 또는 세포를 사용하여 만들어진 클론된 포유 동물로부터 얻어진다(예를 들면, Ramirez등의 Transplantation 15:989-998페이지,2000년; Costa 등의 Xenotransplantation 6:6-16,1999년). 또다른 바람직한 구현예에서, 공여체 세포핵 또는 공여체 세포는 알파(1,3)-갈락토실트랜스퍼레이즈(Tearle et al., Transplantation 61:13-19,1996년; Sandrin,Immunol.Rev. 141:169-190, 1994년; Costa et al.,Xenotransplantation 6:6-16,1999년). 이 효소는 이 갈락토오즈 알파(1,3)-갈락토오즈 에피톱을 나타내는 세포가 인간에게 투여되었을 때, 역면역반응을 유발하는 탄수화물을 갖는 세포 표면 단백질을 변형시킨다. 따라서, 이 에피톱의 발현 레벨이 낮은 공여체 이식 물질은 수용체에 의해 보다 낮은 거부 반응 빈도를 갖게될 수도 있다.

상기의 "염색질 매스(chromatin mass)"는 막에 둘러싸이지 않은 하나 이상의 염색체를 의미한다. 바람직하게는, 염색질 매스는 세포의 모든 염색체를 포함한다. 응축된 염색체를 갖는 인위적으로 유도된 염색질 매스는 여기에 기술된 것과 같은 세포 분열 재구성 배지(즉, 유사 분열 추출물)에 세포핵을 노출시킴으로써 형성될 수도 있다. 이와는 달리 응축되지 않거나 부분적으로 응축된 염색체를 포함하는 인공적으로 유도된 염색질 매스는 세포핵을 여기에 기술된 것: 항Nu-MA 항체, 계면 활성제 및/ 또는 염용액, 또는 단백질 카이네이저 용액 중 하나에 세포핵을 노출시킴으로써 생성될 수 있다. 염색질 매스는 물리적으로 서롤 접촉하지 않은 분리된 염색체 또는 물리적으로 접촉하고 있는 둘이상의 염색체를 포함할 수 있다.

바람직하다면, 염색체 응축의 수준은 DNA염색(DAPI)을 통해 염색 밀도를 측정함으로써 표준화된 방법에 의해 결정될 수 있다. 따라서, 염색체의 염색 밀도는 간기에 응축되지 않은 염색체의 밀도(0%로 지정) 및 세포 분열시에 최대한 응축된 염색체의 밀도(100%로 지정)와 비교되어질 수 있다. 이러한 비교에 기초하여, 최대 응축 백분율이 결정될 수 있다. 바람직하게 응축된 염색질 매스는 최소한 50, 60, 70, 80, 90 또는 100%로 응축되어 있다. 바람직하게 응축된 또는 부분적으로 응축된 염색질 매스는 50, 40, 30, 20, 또는 10%이하로 응축되어 있다.

"세포핵(nucleus)"은 세포의 거의 또는 모든 DNA를 포함하고 있는 막으로 둘러싸여 있는 세포내 기관을 의미한다. DNA는 염색체 안에 응축된 형태로 패키지되어 (packaged) 있다. 바람직하게는 DNA를 캡슐화하고 있는 막은 하나 또는 둘의 지질 이중막을 포함하거나 또는 뉴클레오포린(nucleoporin)을 갖는다.

"4세트 미만의 상동 염색체를 갖는 세포핵(nucleus that less than four sets of homologous chromosomes)"은 4n이하의 DNA함량을 갖는 세포핵을 의미하며, 여기서 "n"은 어떤 속이나 종의 포유 동물의 보통의 반수체 (haploid) 염색체 세트에서 발견되는 염색체의 수를 의미한다. 그런 염색체는 각 유전자 또는 유전적 로커스(genetic locus)를 네 카피(copy)를 갖지 않는다. 바람직하게는 세포핵은 이배체(diploid)이고 따라서 두 세트의 상동 염색체를 갖지만 완벽한 염색 분체는 두 쌍이하이다.

"전핵(pronucleus)"는 감수 분열 또는 핵 전이 전핵의 결과로 얻어진 반수체 핵을 의미한다. 자성(雌性) 전핵은 웅성(雄性) 전핵과 접합하기 이전의 난모 세포 또는 난자의 핵이다. 웅성(雄性) 전핵은 수정과정에서 난모 세포나 난자에 들어갔으나 자성(雌性) 전핵과 결합하기 전의 정자의 핵이다. 핵 전이 전핵(nuclear transfer pronucleous)은 공여체 세포, 세포핵 또는 염색질 매스가 난모 세포로 도입된 후에 형성된 전핵(예를 들면 이배체 전핵)이다. 핵 전이 전핵은 4세트 미만의 상동 염색체를 갖는다.

"공여체 세포(donor cell)"는 핵 또는 염색질 매스가 유도된 세포 또는 세포 침투된 세포를 의미한다.

"침투화(permeabilization)"란 세포막(plasma memberane)에 구멍이 형성되거나 세포막의 일부 또는 전부가 제거된 것을 의미한다.

"재구성 배지(reprogramming media)"는 세포, 세포핵, 염색질 매스 또는 염색체로부터 어떤 인자를 제거하거나 용액으로부터 세포, 세포핵, 염색질 매스, 또는 염색체에 어떤 인자를 첨가하는 것이 가능한 용액을 의미한다. 바람직하게는 어떤 인자의 첨가 또는 제거는 공여체 세포, 염색질 매스 또는 세포핵 또는 재구성된 염색질 매스 또는 세포핵을 포함하는 세포에서의 mRNA 또는 단백질의 발현을 증감시킨다. 다른 구현예에서, 재구성 배지에서의 침투된 세포, 염색질 매스, 또는 세포핵의 배양은 침투된 세포 또는 재구성된 염색질 매스를 포함하는 세포 또는 세포핵이 공여체 세포에 대응되는 활성을 얻거나 잃도록 한다.

재구성 배지의 예에는 완충액과 같이 단백질이나 핵산과 같은 생물학적 분자를 포함하지 않는 용액도 포함된다. 이런 용액은 세포핵, 염색질 매스, 또는 염색체로부터 하나 이상의 인자를 제거하는데 유용하다. 다른 바람직한 재구성 배지는 세포핵, 세포질, 또는 이들의 조합으로부터 나온 세포 추출물과 같은 추출물이다. 세포 추출물의 예에는 난모 세포(예를 들면 포유 동물, 척추 동물 또는 무척추 동물의 난모 세포), 수컷 생식 세포(포유 동물, 척추 동물 또는 무척추 동물의 정원 세포, 제1 정모 세포, 제2 정모 세포와 같은 생식 세포) 및 줄기 세포(예를 들면, 성인 또는 배아 세포)로부터 나온 추출물을 포함한다. 그러나 다른 재구성 배지는 하나 이상의 자연 발생 또는 재조합 인자(예를 들면,DNA 메틸트랜스퍼레이즈, 히스톤 디아세틸레이즈, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성 인자, 억제자, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 싸이토킨, 또는 다른 호르몬들)와 같은 재조합 인자가 첨가된 용액 또는 추출물이거나 또는 하나 이상의 인자가 제거된 추출물이다. 그러나 다른 재구성 배지는 계면 활성 용액(예를 들면, SDS, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, CHAPS, 나트륨-데옥시콜레이트, n-옥틸 글루코시드, Nonidet P40, IGEPAL, 트윈20, 트윈40, 또는 트윈 80과 같은 하나 이상의 0.01%-0.1%, 0.1%-0.5%, 0.5%-2%의 이온성 또는 비이온성 계면 활성제),염(예를 들면 ~0.1,0.25,0.5,0.75,1,1.5,또는 2M의 NaCl 또는 KCl), 폴리아민(예를 들면,~1μM,10μM,100μM,1mM 또는 10mM의 스퍼민,스퍼미딘,푸로타민, 또는 폴리-L-리신), 단백질 카이네이즈(예를 들면, 사이클린 의존성 카이네이즈1, 단백질 카이네이즈C, 단백질 카이네이즈A, MAP카이네이즈, 칼슘/칼모듈린-의존성 카이네이즈, CK1카제인 카이네이즈, 또는 CK2 카제인 카이네이즈) 및 /또는 포스파테이즈 저해제(예를 들면,이하의 저해제 중 하나 이상의 ~1μM, 10μM, 100μM, 1mM, 10mM, 50mM, 100mM 용액 :Na-오르쏘바나데이트(Na-orthovanadate), Na-파이로포스페이트(Na-pyrophosphate), 플루오라이드(fluoride), NIPP1, 저해제2, PNUTS, SDS22, AKAP149 또는 오카다익산 (ocadaic acid)). 어떤 구현예에서, 재구성 배지는 항-NuMA항체를 포함한다. 이상적으로는 복합(multiple) 재구성 배지가 동시에 또는 연속적으로 공여체 세포, 세포핵 또는 염색질 매스를 재구성하기 위해 사용될 수도 있다.

"간기 재구성 배지(interphase reprogramming media)"는 염색질을 응축되지 않도록 하고, 핵막 형성을 유도하는 배지(예를 들면, 간기 세포 추출물)를 의미한다.

"유사 분열 재구성 배지(mitotic reprogramming media)"는 염색질 응축 및 핵막 파괴를 유도하는 배지(예를 들면, 유사 분열 세포 추출물)를 의미한다.

"재구성된 세포(reprogrammed cell)"는 재구성 배지에 노출된 세포를 의미한다. 바람직하게는 공여체 또는 침투된 세포에서는 발현되지 않던 최소한 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 또는 그 이상의 mRNA 또는 단백질 분자 재구성된 세포에서 발현된다. 다른 바람직한 구현예에서, 공여체 세포 또는 침투된 세포에서는 발현되지만 재구성된 세포에서 발현되지 않는 mRNA 또는 단백질 분자의 수가 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-75, 75-100, 100-150, 150-200 또는 200-300이다. 또다른 구현에에서, 이러한 mRNA 또는 단백질 분자가 공여체 세포(즉, 공여체 또는 침투된 세포) 및 재구성된 세포에서는 발현하나, 이러한 세포에서의 그 발현 수준이 표준 분석(예를 들면, Ausubel등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiely& Sons, New York, 2000)을 사용하여 측정할 때, 최소한 2, 5, 10 또는 20배의 편차를 나타낸다.

"인자의 첨가(addition of a factor)"란 염색질, 염색체, 또는 세포핵 막이나 세포핵 매트릭스와 같은 세포핵 막의 요소에 대한 인자의 결합을 의미한다. 이와는 달리, 인자가 세포핵으로 운반되어 결합하거나 세포핵 막에 의해 둘러싸인다. 바람직하게는 염색체에 결합하거나 세포핵에 존재하는 인자의 양이 최소한 25, 50, 75,100, 200, 또는 500% 까지 증가한다.

"인자의 제거(removal of factor)"는 염색질, 염색체, 또는 세포핵 막이나 세포핵 매트릭스와 같은 세포핵 막의 요소로부터의 인자의 해리를 의미한다. 이와는 달리, 세포핵으로부터의 인자가 내보내지고 더이상 세포핵 막에 의해 둘러싸이거나 캡슐화되지 않은 것을 의미한다. 바람직하게는 염색체에 결합하거나 세포핵에 존재하는 인자의 양이 최소한 25, 50, 75,100, 200, 또는 500% 까지 감소한다.

"인자의 풍부 또는 결핍(enrichment or depletion of a factor)"은 자연 발생 또는 재조합 인자를 재구성 배지에 본래 존재하던 양의 최소한 20, 40, 60, 80 또는 100% 양만큼 첨가 또는 제거하는 것을 의미한다. 이와는 달리, 본래적으로 재구성 배지에 존재하지 않는 자연 발생된 또는 재구성된 인자를 더할 수도 있다. 바람직한 인자에는 DNA 메틸트랜스퍼레이즈, 히스톤 디아세틸레이즈, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성 인자, 억제자;막 운반자 및 세포 소기관과 같은 단백질을 포함한다. 어떤 바람직한 구현예에서, 하기와 같이 인자는 재구성 배지에 첨가되기 이전에 정제된다. 이와는 달리, 하기에 기술할 정제 방법 중 하나는 재구성 배지로부터 바람직하지 않은 인자를 제거하는데 사용될 수도 있다.

"정제된(purified)"은 원래부터 그것과 동반하는 다른 요소들로부터 분리해내는 것을 의미한다. 전형적으로 인자가 원래 결합하고 있던 단백질, 항체, 및 자연 발생적인 유기 분자들로부터 떨어져 최소한 50%의 무게가 되었을 때, 인자가 실질적으로 순수하다고 할 수 있다. 실질적으로 순수한 인자는 화학 합성, 자연적 원천으로부터 인자의 분리, 또는 본래는 그 인자를 생산하지 않는 재조합 숙주 세포로뷰터의 인자의 생산하는 것을 통하여 얻어질 수 있다. 단백질, 운반제 및 세포내 소기관들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련된 기술자들에 의해 Ausubel등에 기술된 것과 같은 표준화된 방법(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiely& Sons, New York, 2000년)으로 정제될 수 있다. 바람직하게는 인자가 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동, 컬럼 크로마토그래피, 광학 밀도, HPLC 분석, 또는 웨스턴 블러팅 분석(Ausubel 등 ,supra)을 이용하여 분석할 때, 순수한 초기 물질의 최소한 2, 5 또는 10배이다. 정제의 바람직한 방법에는 면역 적정(immunoprecipitation), 면역친화성 크로마토그래피와 같은 컬럼 크로마토그래피, 자기 비드 면역친화성 정제법 (magnetic bead immunoaffinity purification), 및 플레이트 결합 항체를 이용한 팬닝(panning with a plate-bound antibody)가 포함된다.

"재클론된(recloned)"은 제 2회차의 클로닝을 의미한다. 보다 상세하게는 배아 세포, 태아, 또는 본 발명의 방법에 의해 생성된 성인으로부터 나온 세포가 유사 분열 재구성 배지(예를 들면, 유사 분열 세포 추출물)에서 배양되어 상기에 기술한 바와 같이 탈핵 난모 세포에 삽입하기 위한 염색질 매스를 형성한다. 이와는 달리, 세포는 재구성 배지에서 침투되고, 배양될 수 있고, 상기한 바와 같이 탈핵 난모 세포로 삽입될 수 있다. 2회 이상의 클로닝의 수행은 공여체 염색질 매스 또는 공여체 세포의 추가적인 재구성을 낳는데, 그 결과 최종회의 클로닝 이후에 생존하는 자손들이 발생될 확률이 증가한다.

"생존한 자손(viable offspring)"은 자궁외에서 살아남은 포유 동물을 의미한다. 바람직하게는 이 포유 동물이 모체로부터 나온 이후 최소한 1초, 1분, 1시간, 1일, 1주, 1개월, 6 개월, 또는 1년을 살아야 한다. 이 포유 동물은 생존을 위해 자궁내 환경의 순환계를 요구하지 않는다.

"핵치환 난모 세포(nuclear transfer oocyte)"는 공여체 세포, 세포핵, 또는 염색질 매스가 삽입되거나 융합된 난모 세포를 의미한다. 난모 세포로부터 형성된 배아는 "핵치환" 또는 "핵이식"배아로 언급할 수 있을 것이다.

"배아(embryo)" 또는 "배아의(embryonic)"는 모체의 자궁 내막에 착상되지 않은 세포 매스를 의미한다. 따라서 배아는 수정된 난모 세포; 공여체 염색질 매스, 세포핵, 또는 재구성된 세포를 포함하는 난모 세포; 예비 미분화배아세포 단계(pre-blastocyst stage)의 발생중인 세포 매스; 또는 생식 융기를 형성하기에 앞서서 모체 자궁 내막에 착상하기 이전의 발생 단계에 있는 어떠한 발생중인 세포 매스를 포함할 수 있을 것이다. 배아는 세포 발생 단계의 다수의 단계를 나타낸다. 예를 들면, 한 배아 세포는 접합체(zygote)로 언급될 수 있고; 분열된 배아 세포에 의한 고체 구형 세포의 매스는 상실배로 언급되기도 하며 난할강을 갖고 있는 배아 세포는 낭배로 언급되기도 한다. "배의 세포(embryonic cell)"는 배아 세포로부터 분리되거나 또는 그에 포함되는 세포이다.

"배아로부터 유도된 세포(cells derived from an embryo)"는 배아의 세포 분열로부터 나온 세포를 의미한다.

"키메릭 배아(chimeric embryo)"는 둘 이상의 배아로부터 나온 세포로 형성된 배아를 의미한다. 그 결과인 태아 또는 자손들은 단지 하나의 초기 배아로부터 유도된 한 세포 또는 하나 이상의 초기 배아로부터 유도된 세포를 갖는다. 이상적이라면,태반 조직 및 태아 조직에 포함된 각 배아로부터 나온 세포의 비율은 표준 FISH분석 또는 한 배아에 첨가되었던 막 염색 분석(analysis of a membrane dye)을 함으로써 결정될 수 있다.

"전응축 배아(precompaction embryo)"는 응축되기 이전의 배아를 의미한다. 전응축배아는 그것의 할구 표면에 필수적으로 이-카데린(E-cadherin)을 발현하지 않는다. 바람직한 전응축 배아는 동일한 종의완전히 응축 배아와 비교하여 최소한 3, 5, 10, 20, 30 또는 40배 적은 이-카데린(E-cadherin)을 나타내거나 또는 발현하지 않는다.

"응축 배아(compaction embryo)" 는 응축이 진행중이거나 진행될 배아를 의미한다. 응축 배아의 할구는 그 표면에 이-카데린(E-cadherin)을 발현시킨다. 이 이-카데린(E-cadherin)의 발현은 항이-카데린(E-cadherin) 항체를 이용한 표준화된 방법에 의해 측정될 수 있다. 이-카데린(E-cadherin)은 할구 사이의 응집을 증가시킨다. 바람직한 구현예에서 배아는 응축이 완결된 배아를 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서 응축 배아는 동일한 종의전응축 배아와 비교하여 최소한 3, 5, 10, 20, 30, 또는 40배 이상의 이-카데린(E-cadherin) 발현한다.

"태아(fetus)"는 모체의 자궁 내막에 착상한 발생중인 세포 매스를 의미한다. 태아는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 쉽게 확인할 수 있는 생식 돌기와 같은 명확한 특징을 가질 수 있다. "태아 세포(fetal cell)"는 태아로부터 분리된또는 이에 포함된 어떤 세포이다.

"처녀 생식(parthenogenesis)" 또는 "처녀 생식 활성(parthenogenetic activation)"은 웅성(雄性) 생식핵과의 융합하여 수정란을 생산하는 과정없이 난모 세포 또는 난자가 발생하는 것을 의미한다. 예를 들면, 난모 세포는 수정없이 분열이 유도될 수 있다.

"투명대(zona pellucida)"는 많은 포유 동물의 난모 세포 또는 난자를 둘러싸고 있는 투명하고, 탄력 있으며, 비세포성 층을 의미한다.

"포배(trophectoderm)"는 포유류의 배아 발생 과정의 분화 과정 중에 난할강을 둘러싸고 있는 최외각 세포층을 의미한다. 포배는 이후의 발생 과정에서 대부분 또는 모든 태반 조직이 융기하도록 한다.

"세포내 매스(inner cell mass)"는 포배에 의해 둘러싸인 세포를 의미한다. 세포내 매스는 이후의 발생 과정에서 태아 조직의 대부분을 융기하도록 한다.

"한 세포 타입에 특이적인 mRNA 또는 단백질(mRNA or protein specific for one cell type)"이란 다른 모든 세포 타입에서 발현되는 것보다 최소한 10, 20, 50, 75, 또는 100배의 수준으로 그 타입의 세포에서 발현되는 mRNA 또는 단백질을 의미한다.

"돌연변이(mutation)"란 삽입, 결실, 프레임 쉬프트 돌연변이, 침묵 돌연변이, 잠재 돌연변이, 또는 미스센스 돌연변이(missense mutation)와 같은 자연 발생적 변화 또는 기준 핵산 서열의 변화를 의미한다. 바람직하게는 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열은 자연 발생된 서열로부터 최소한 하나 이상의 아미노산의 변화를 갖는다. 세포, 배아, 태아 또는 포유 동물의 게놈(genome) 서열의 변화를 유발하기 위한 DNA재조합 기술의 예에는 다른 개체(예를 들면, 사람)로부터 나온 게놈 서열을 삽입, 하나 이상의 DNA를 결실, 및 표적 DNA서열의 하나 이상의 염기 돌연변이(예를 들면, 위치 지정(site-directed) 또는 무작위 돌연변이)를 도입하는 방법을 포함한다. 이러한 변형을 유발하는 방법의 예에는 레트로바이럴 삽입 (retroviral insertion), 인공 염색체 기술(artificial chromosome technique), 유전자 삽입, 조직 특이적 프로모터에 의한 무작위 삽입, 상동적 재조합(homolgous recombination), 유전자 타겟팅(gene targeing), 트랜스포져블 엘리먼트 (transposable element), 및 외래 DNA를 도입하기 위한 어떠한 기술이라도 포함된다. 이러한 기술 모두는 분자 생물학(Ausubel등, 상기 참조)분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 변형된 DNA 또는 공여체 형질 전환 세포를 포함한 형질 전환 세포로부터 나온 염색질 매스, 염색체, 및 핵은 본 발명의 방법에 사용된다.

"불멸성(immortalized)"은 불멸의 세포와 같은 속, 종의 세포 타입 또는 그 불멸의 세포가 유도된 공여체 세포보다 최소한 25, 50, 75, 90, 또는 95% 이상의 세포 분열이 진행될 수 있는 것을 의미한다. 바람직하게는 불멸의 세포는 동일한 세포 타입의 자연 발생된 대조 세포보다 최소한 2, 5, 10, 또는 20배 이상의 세포 분열을 진행할 수 있는 것이다. 보다 바람직하게는 불멸의 세포는 무한번의 세포 분열을 진행할 수 있는 세포를 포함한다. 불멸의 세포의 예에는 일반적인 성장 조절 과정을 변형시키는, 자연적으로 생체내 또는 시험관내에서 얻어진 돌연변이가 포함된다. 또다른 바람직한 불멸 세포는 ras, myc, abl, bcl2 또는 neu와 같이 유전적으로 변형되어 종양 형성 유전자(oncogene) 또는 엡스타인 바아 바이러스 (Epstein Barr virus) 또는 SV40 바이러스(Kumar등의 Immunol.Lett. 65:153-159, 1999년; Knight등의 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:3130-3134, 1988; Shammah 등의 J.Immunol. Methods 160-19-35, 1993년; Gustafsson 및 Hinkula, Hum.의 Antibodies Hybridomas 5:98-104, 1994년; Kataoka 등의 Differentiation 62:201-211, 1997년; Chatelut 등의 Scand.J. Immunol. 48:659-666, 1998년)와 같은 DNA 또는 RNA 바이러스에 의해 형질 도입된 세포를 포함한다. 또한 세포들은 유전적으로 변형되어 텔로머레이즈 유전자(Roques등의 Cancer Res. 61:8405-8507, 2001년)를 발현시킨다.

"비불멸성(non-immortalized)"은 상기 기술한 바와 같이 불멸하지 않는 것을 의미한다.

"융합 화합물(fusigenic compound)"은 수용체 세포 옆에 위치할 때, 수용체

세포로 염색질 매스 또는 세포핵이 삽입되어질 가능성을 증가시키는 화합물을 의미한다. 예를 들면, 융합 화합물은 세포의 세포질 막에 대한 염색질 매스 또는 세포핵의 친화력을 증가시킬 수도 있다. 융합 화합물은 세포핵의 핵막과 세포의 세포질막의 결합을 증진시킬 수 있다.

"실질적으로 동일(substantially identical)"하다는 것은 다른 서열의 그것과 최소한 60, 70, 80, 90, 또는 100%가 동일한 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 서열 동일성은 전형적으로 디폴트 파라미터(default parameter)를 갖는 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정되어진다(예를 들면, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 University Avennue, Madison, WI 53705).이 소프트웨어 프로그램은 다양한 치환, 결실, 및 다른 변형에 대한 상동성(homology)의 정도를 조사하여 유사한 서열을 매칭(matching)시킨다.

본 발명은 포유 동물의 클로닝과 수용체 세포에 게놈 물질의 전이와 관련한 다양한 장점을 제공한다. 예를 들면, 이 방법은 생존 자손들의 비율을 높여서, 농업 또는 의학적 응용에 사용될 수 있는 포유 동물의 수를 증가시킨다. 마이크로인젝션과 비교하여, 라이포퓨젼(lipofusion)이라고 불리는 염색체, 염색질 매스, 세포핵은 세포로 전이시키는 방법은 세포 구조의 물리적인 분열과 마이크로 피펫을 사용하여 세포핵 또는 염색질 매스를 꺼내어 세포에 주입하는 숙련된 기술을 요하지 않기 때문에 유전 물질을 세포에 도입하는 단순하고도 좋은 방법이다. 본 발명의 방법은 또한 바이러스나 바이럴 컴포넌트(viral component)를 포함하는 융합 방법보다 안전할 수 있다. 나아가, 라이포퓨젼은 수용체 세포에 가능한 최소의 생리학적 손상을 유도하고 따라서 세포 주기의 진행 또는 클론된 배아의 발생 과정을 손상시킬 수 있는 융합된 세포내에서의 신호 전달 현상을 유발하는 전기 융합의 경우보다 이점을 갖게 된다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백하게 될 것이다.

[도면의 간단한 설명]

본 출원 화일은 컬러로 제작된 도면을 포함한다. (Fig.3, 6A-6C, 8A,및 8B)

도1A 및 도1B는 소의 착상전 배아의 핵막 및 핵 매트릭스 단백질의 면역 검출을 도시하고 있다. 도1A는 전핵 및 8세포기 단계에서의 동일한 항체를 이용하여 시험관내에서 수정된 소의 배아의 도면이다. 도1A에서 항-NuMA 및 항-AKAP95러 라벨링된 전핵 단계 배아의 자성(雌性) 전핵을 화살표로 표시하였다. 도1A의 삽입 도면은 0.1μg/ml의 Hoechst33342(bars,20μm)로 라벨링된 DNA의 도면이다. 도1B는 소 혈청(윗 줄) 및 전핵 단계의 배아(아랫 줄)의 면역블럿팅 분석 결과이다. 분자량 마커는 도1B의 오른쪽에 kDa로 나타난다.

도2는 미성숙 염색질 응축 및 핵 이식된 배아의 전핵 어젬블리 중에 핵 막, NuMA 및 AKAP95의 역학 관계를 도시한다. 도2는 소 공여체 혈소판, 전핵 단계(융합 후 19시간) 및 여기서 기술한 활성화된 처녀 생식의 전핵 단계의 핵이식 배아의 도면이다. 공여체 세포핵의 디스어젬블리 미성숙 염색질 응축 단계에서의 새로운 전핵의 어젬블리는 "hpi"("PCC")주입 후 3시간 후 및 항-라민B, 라민A/C, NuMA, 및 AKAP95 항체를 이용한 주입("NTPN")후 7시간 후의 단계에서 모니터링하였다. 또한 MⅡ난모 세포의 10mM의 SrCl₂ 를 이용한 처녀 생식이 활성화 후에 형성된 자성(雌性)전핵은 활성화 처리("Parth. PN")시작후 5시간 이후에 분석되었다. 라민 A/C는 소 전핵 단계 핵치환 배아의 전핵에 어젬블리되었다. DNA는 0.1μg/ml의 Hoechst 33342로 카운터스테이닝(counterstaining)되었다. TRITC는 TRITC-콘쥬게이티드 2차 항체(bars,20μm)로 라벨링된 것을 언급한다.

도3은 AKAP95가 처녀 생식 배아에서보다 전핵 이식 배아에 대해 훨씬 더 강하게 고정되는 것을 도시하는 그래프이다. 이 그래프는 3%의 파라포름알데하이드로 고정한 후, 100 또는 300mM의 NaCl과 함께 0.1% 트리톤 X-100 및 1mg/ml DNAseⅠ으로 30분간 추출한 후에 처녀 생식 전핵, 핵 치환 배아, 및 체세포 공여체 세포핵의 미추출된 라민B, AKAP95, 및 DNA 라벨링의 상대적인 비율을 보여주고 있다. 라민B(적색) 및 AKAP95(녹색)의 위치는 이중 면역형광에 의해 조사되었다. 각 채널-적색(라민B), 청색(DNA), 녹색(AKAP95)의 형광 라벨링 밀도는 측정되었다. 기준값(100% 비추출)은 단지 고정 전에 0.1% 트리톤 X-100으로 침투된 배아 또는 세포의 B타입 라민, DNA, 및 AKAP95 스테이닝의 상대적인 양을 표현한다. 거의 30개의 배아가 각 그룹에서 조사되었다.

도4는 핵 치환 배아의 전핵 재구성의 시작부터의 라민 A/C가 묘사되어 있다. 도4는 혈소판 융합 및 4분 동안의 5μM 이노마이신 처리, 10μg/ml 사이클로헥사마이드/4시간 동안의 2.5μg/ml 싸이토칼라진 D(cytochalasin D)의 처리(b',-), 이노마이신/사이클로헥시미드/싸이토칼라진D(b')의 처리, 전체 활성 처리(b''')중의 추가적인 9시간의 10μg/ml 사이클로헥시미드 처리(b'',CHX) 또는 1μg/ml의 액티노마이신 D와 함께 (b')에서의 배양하는 것으로 이루어진 난모 세포의 활성에 의해 생산된 소 전핵 치환 배아의 도면이다. 항-라민B(래빗 다클론성) 및 항-라민 A/C(mAb) 항체가 동일한 과정에 사용되었다. 삽입된 도면은 0.1μg/ml의 Hoechst 33342(bars, 20μm)로 라벨링된 DNA도면이다.

도5는 유사분열 세포질 추출물(M-S15), 유사 분열 사이토졸 추출물(M-S200) 및 난모 세포 추출물(MⅡ-S15)(3-5 복제에서, n=300-400의 염색분체)에서의 염색체 응축 및 세포막 붕괴의 그래프이다.

도6A-6C는 정제된 소 혈소판 염색분체(도6A) 및 유사 분열 사이토졸 추출물에서 생산된 응축된 염색질(도6B) 및 난모 세포 추출물(도6C)의 면역 형광 분석 도의 세트이다.

도7은 전통적인 핵치환(NT) 또는 핵 주입(NI) 방법 및 본 발명의 방법을 이용한 난모 세포로 염색질 매스를 주입하는 방법(CT)으로부터 얻어진 응축된 염색질의 면역형광 분석도의 세트이다. 검출 가능한 라민B 및 A/C는 용해가능한 것으로 나타난다(bar, 10μm).

도8A 및 8B는 염색질 치환, 핵치환, 또는 핵 주입에 따른 전핵의 면역형광 분석도의 세트이다. 배아는 핵치환, 핵주입, 또는 염색질 치환 및 라벨링 후 19시간 이후에 고정된다. 대조군 처녀생식 활성 전핵(Part.) 또한 조사되었다. 도 8A는 라민 A/C 및 B의 분석을 보여준다. 도8B는 AKAP 95 및 NuMA의 분석을 나타낸다. 라민A/C(녹색 라벨)은 단지 핵치환 및 핵주입 전핵(bars, 30μm)에서만 나타난다.

본 발명자들은 수용체 난모 세포에 삽입하기 이전에 공여체 유전 물질을 개조하는 것을 포함하는 포유 동물을 클로닝하는 신규한 방법을 발전시켰다. 개조는 그 결과인 핵치환 난모 세포를, 세포 전체 또는 본래의 세포핵을 난모 세포에 치환 한 것으로부터 유도된 것을 넘어서서 그 이상의 발생을 증진시키는 어떤 형태적 변화와 관련된다. 재구성은 재구성 배지(예를 들면, 유사 분열 추출물, 계면 활성제 및/또는 염 용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액)에서 공여체 세포핵을 배양시켜 핵막의 분해 및 가능한 염색질 응축을 일으킴으로써 달성된다. 이런 핵막의 분해 및 염색질 응축은 염색체에 부착되어 있는 전사 조절 단백질의 방출을 가능하게 하는데, 부착되지 않은 경우 난모 세포, 배아, 또는 태아의 발생 과정에서 바람직하지 않다. 그 밖의 조절 인자는 염색질 매스가 수용체 난모 세포에 들어가기 이전에 이를 정제함으로써 제거된다. 이와는 달리, 염색체로부터 방출된 특정 조절 단백질은 염색체에 다시 결합하지 않도록 하기 위해 면역학적으로 제거되거나 재구성 배지(예를 들면, 세포 추출물)로부터 제거될 수도 있을 것이다. 핵치환 이후, 난모 세포 세포질로부터 나온 새로운 단백질은 난모 세포에서의 염색질 응축 및 핵막 형성시기 동안 염색체에 결합할 수도 있다. 이러한 단백질은 난모 세포를 살아 있는 자손으로 발생시킬 수 있는 유전자의 발현을 증진시킨다.

이 염색질 치환 클로닝 방법은 전통적인 클로닝 방법을 이용하여 생산된 클론 배아에서보다 시험관 내에서 수정된 배아와 보다 흡사한 단백질 발현 패턴을 갖는 배아를 생산한다. 실시예1 및 4에서 설시한 바와 같이 염색질 치환 배아는 전통적인 핵치환 배아에 비해 훨씬 작은 라민A/C 단백질을 발현시킨다. 라민A/C는 분화된 세포들로부터 자연 발생되나, 배아에서는 발생되지 않는 핵 라미나의 체세포 특이적 요소(somatic-specific component)이다. 전사 인자, 염색질 단백질 및 DNA와 라민 사이의 보고된 상호 작용때문에, 전통적인 핵 치환 배아에서의 라민A/C의 발현은 배아 발생에 바람직하지 않은 체세포의 특이적인 단백질의 발현을 증진시킨다. 따라서, 본 발명의 염색질 치환 배아는 전통적인 핵치환 배아의 경우보다 바람직하지 않은 체세포 특이적 요소를 덜 발현시킬 수 있다. 또한 염색질 치환 배아 는 전사 조절에 관련된 핵 매트릭스의 주된 요소인 NuMA의 발현에 있어서 전통적인 핵이식 배아에서보다, 시험관에서 수정된 배아의 경우에 보다 근접한 패턴을 갖는다. 이 결과는 또한 염색질 치환 배아가 전통적인 핵치환 배아보다 보다 효율적으로 재구성되는 것을 의미하기도 한다.

다른 클로닝 방법은 침투된 세포를 재구성 배지에서 배양하여 세포에 특정 요소를 첨가하거나 제거하여 침투된 세포를 재구성하는 것을 포함하는 방법을 발전시켰다. 침투된 세포의 세포질 막은 바람직하게는 바람직한 요소들은 들러싸고 막의 본래 모습을 복원하기 위해 다시 붙게 된다. 그 후, 클론된 포유 동물의 생산 을 위해 재구성된 세포는 수용체 난모 세포에 치환된다. 이 클로닝 방법은 60일을 생존한 태아를 생산하였다. 예비 결과는 40-60일의 태아 생존율이 전통적 핵치환에 의한 방법(8/16; 50%)의 경우보다 이 방법을 이용하여 생산된 태아(7/10;70%)의 경우가 높다는 것을 의미한다.

본 발명은 대다수의 태반 조직이 하나의 출처로부터 나오고 태아 조직은 다른 출처에서 나온 키메릭 배아를 생성하는 방법을 제공한다. 이러한 키메릭 배아는 적은 태반 이상을 갖고 증가된 생존율을 갖게 될 수 있다. 그러한 한 방법에서, 시험관에서 수정된 세포 또는 자연 발생된 배아는 전통적인 핵치환 방법으로 생산된 또는 여기 기술된 신규한 클로닝 방법으로 생산된 배아로부터 나온 세포와 접촉한다. 예를 들면, 시험관에서 수정된 배아로부터 나온 세포는 핵치환 배아의 막주위(periphery,예를 들면 투명대와 그 배아의 사이)에 주입될 수 있다. 다른 방법에서는, 시험관에서 수정된 또는 자연 발생한 배아의 전응축과정의 세포는 각 배아로부터 나온 세포가 하나의 키메릭 배아를 생산하도록 재구성되도록 하는 환경하에서 전응축 핵치환 세포로부터 나온 세포와 함꼐 배양된다(Wells 및 Powell, Cloning 2:9-22, 2000년). 두 방법에서, 시험관에서 수정된 자연 발생된 배아로부터 나온 세포는 바람직하게는 태반으로 들어가고, 핵치환 방법에서 나온 세포는 바람직하게는 태아 조직으로 들어간다.

본 발명은 또한 세포에 세포핵 또는 염색체를 삽입하기 위한 상기한 라이포퓨젼(lipofusion)이란 신규한 방법적 특징을 나타낸다. 이 방법은 핵 또는 염색체를 핵 또는 염색체가 세포의 세포질로 옮겨갈 수 있도록 하는 융합 화합물 (fusigenic compound)과 함께 배양하는 것을 포함한다. 이 방법은 일반적으로 모든 타입의 세포로부터 나온 핵 또는 염색체 및 모든 종류의 수용체 세포에 적용될 수 있다.

이 방법은 이하에 보다 자세히 기술한다. 이하에 기술한 어떤 방법은 세포 추출물 이외의 다른 재구성 배지로도 수행 가능하다. 예를 들면, 재구성 배지는 하나 이상의 자연 발생된 또는 재조합 인자(예를 들면, DNA 메틸트랜스퍼레이즈, 히스톤 디아세틸레이즈, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성 인자, 억제자, 염색질 재구성 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 사이토카인 또는 다른 호르몬들과 같은 핵산 또는 단백질)를 완충액과 같은 용액에 첨가함으로써 형성된다. 바람직하게는 하나 이상의 인자는 배아 줄기 세포와 같은 난모 세포 또는 체세포에 특이적이다.

실시예1: 전통적인 소의 핵치환 배아에서의 핵 재구성의 결핍의 증거

착상 전 단계에서의 핵막, 핵 매트릭스, 및 염색질-매트릭스 계면 요소(chromatin-matrix interface component)의 분포(distribution)

착상 전 단계에서의 핵막(B형 및 A/C형 라민), 핵 매트릭스(NuMA), 핵-매트릭스 계면 요소(AKAP95)의 분포를 결정하기 위해 소배아는 시험관 내에서 수정되고 면역형광법에 의해 분석되었다. 시험관내에서의 수정은 앞에서 기술한 바와 같이 수행된다(Collas등의 Mol.Reprod. Devel. 34:212-223, 1993년). 간단히, 한 숫소의 해동된 정자를 45-90% Percoll 농도 구배에서 상층을 이루도록 하고 30분간 700 X g에서 원심 분리시킨다. 펠렛에서 정자의 농도는 결정되었고, 최종 수정 농도가 10⁶sperm/ml가 되도록 희석시킨다. 후기 성숙단계(post maturation) 22시간 시점에, 난모 세포는 TL HEPES에서 3회 워싱되고, 480μl의 수정 배지에 놓아 둔다. 20μl의 정자 현탁액을 50개의 난모 세포를 위한 10⁶sperm/ml에 첨가한다. 0.3ml의 배아 시험 미네랄 오일(시그마)로 덮인 0.5ml의 배아 배지에 마우스의 태아 섬유아세포의 단층을 포함하는 4-웰 조직 배양 플레이트에 배아 세포들을 둔다. 25에서 50사이의 배아들이 각 웰에 들어가고 5% CO₂가 포함된 대기하에서 38.5℃에서 배양된다. 수정율은 전핵 발생 과정에 의해 결정된 것처럼 90%이상이다.

이러한 시험관내 수정된 소의 배아는 면역형광 분석을 위해서, 항-인간라민B 항체를 Dr.Jean-Claude Courvalin, CNRS, Paris, France로부터 얻을 수 있다. 항-인간라민A/C단일 클론 항체는 Santa-Cruz Biotechnology로부터 구입할 수 있고, 항-NuMA항체는 Transduction Laboratory로부터 얻을 수 있다. 항-랫AKAP95 친화성 -정제 래빗 단일 클론 항체는 Upstate Biotechnologies를 통해 얻을 수 있다. 시험관내 수정된 소 배아는 폴리-L-리신이 코팅된 유리 커버슬립 위에 고정시키고, 15분간 3%의 파라포름알데하이드로 고정한 뒤, 15분간 0.1%의 트리톤 X-100으로 침투시킨다(Collas 등의 J.Cell Biol. 135:1715-1725, 1996년). 단백질은 15분간 PBS/0.01% 트윈 20(PBST)속에서 2%의 BSA에 의해 블럭된다. 1차 항체(항-AKAP95, 항-라민B, 항-LBR, 항-NuMA,및 항-라민A/C)및 2차 항체는 각각 30분 동안 배양되고, PBST-BSA속에서 1:100으로 희석되어 사용된다. DNA는 안티페이드(antifade)축 적 배지에 포함된 0.1μg/ml Hoecht 33342로 카운터스테이닝(counterstaining)한다. 시료들은 슬라이드 상에 있고 커버슬립을 손톱 광택제로 밀봉한다. 면역 형광 관찰은 올림푸스BX60 형광 방출 현미경으로 이루어 지고, JVC CCD카메라 및 AnalySIS소프트웨어로 사진 촬영되었다. 이미지는 Aldus Photostyler 소프트웨어에 의해 처리되었다. 형광 시그널의 상대적인 정량화는 AnalySIS 정량화 프로그램을 사용하여 수행된다.

소 배아의 면역형광 분석은 핵 막주위(nuclear periphery)에서 B타입 라민으로 검출된다(도 1A). 그러나, 라민 A/C는 전핵 또는 8세포기 단계에서는 검출되지 않는다. 이러한 초기 단계에서의 라민 A/C검출의 실패는 분화된 세포의 확인을 위한 마커(maker)로서 기대된다(Guilli등의 EMBO J. 6:3795-3799, 1987년). 핵 매트릭스구조 단백질인 NuMA는 시험된(도 1A) 모든 단계에서 검출된다. 그러나, 소 전핵 단계 배아에서, NuMA 라벨링은 두 전핵의 최소인 자성(雌性) 전핵 (FPN)으로 제한된다. 최근 초기 마우스 배아에서 특징지워지고, 친화력-정제된 항-랫AKAP95항체를 이용하여 검출된 AKAP95 또한 자성(雌性) 전핵으로 제한된다(도 1A). 그럼에도 불구하고, AKAP 95의 내핵 분포는 이후의 발생 단계의 모든 할구의 세포핵에서 관측된다(도 1A).

면역형광 라벨링의 특이성은 소의 1차 태아의 섬유아세포 및 시험관에서 수정된 배아의 전핵 단계의 웨스턴 블럿 분석에 의해 입증되었다(도 1B). 이 분석을 위해 단백질은 40mA/gel에서 10% SDS-PAGE에 의해 용해되었다. 단백질은 1시간 동안 100V에서 이동 버퍼(transfer buffer, 25mM 트리스HCl, pH8.3, 192mM글리신, 20%메탄올 및 0.1%SDS)속에서 나이트로셀룰로오스상에서 전기영동으로 이동되었다. 멤브레인은 트리스-버퍼 살린(TBS;즉, pH8에서 140mM NaCl, 2.7mM KCl, 및 25mM 트리스-HCl)에 의해 10분간 워싱되고, TBST(0.05%트윈20을 갖는 TBS)에 의해 1시간 블럭되며, 이후의 1차 항체: 항-AKAP95(1:250희석), 항-라민B(1:1000), 항-LBR (1:500), 항-NuMA(1:500), 항-라민 A/C(1:500)와 함께 1.5시간 배양된다. 블럿은 TBST에서 10분간 2회 워싱되고 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체에와 함께 1시간 배양된다. 블럿은 TBS에서 10분간 2회 배양되고 향상된 케미루미네슨스 (chemiluminescence, ECL, Amersham)를 사용하여 발생되어 진다.

모든 단백질은 예상한 대로 명백한 M_r:68kDa(B형 라민), 70 및 60kDa(순서대로, A 및 C형 라민),~180kDa(NuMA), 및 95kDa(AKAP 95)에서 검출된다. 대체로, 이러한 결과는 착상전의 소 배아가 교차 항체 반응(cross-reacting antibodies)으로 검출될 수 있는 핵 구조 단백질을 발현한다는 것을 의미한다. 명료하게, 라민A/C는 착상전의 소 배아에서는 면역학적으로 검출되지 않는다. 라민 A/C는 체세포(도 1B)에서 발현되기 때문에, 핵치환 배아에서 핵재구성을 위한 분자 마커가 될 수 있다.

핵치환 소 배아에서의 핵막, NuMA 및 AKAP95의 역학

소의 전통적인 핵치환 동안 핵막 및 핵 매트릭스의 역학은 시험되었다. 이러한 구조는 라민 A/C 및 B, NuMA 및 AKAP95에 대한 항체를 각각 사용함으로써 조 사되어 진다. 핵 개조동안 이러한 마커의 역학을 결정하기 위해, 공여체 세포로서 앞서 설명한 바와 같이 분리된 소 핵치환 배아가 1차 태아 섬유아세포를 이용하여 생산된다(Kasinathan등의 Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001년). 간단히, 0.08%의 트립신 및 PBS에서의 0.02%의 EDTA(트립신-EDTA)를 이용한 트립신화에 의해 세포들이 소의 태아로부터 생산된다. 세포들은 10%의 소 태아 세럼 (FBS;Hyclone), 0.15g/ml글루타민(Sigma), 0.003%β-메카토에탄올(Gibco)및 항균-항진균제(Gibco)에 의해 보충된 α-MEM(Gibco)에서의 T75배지 플라스크(Corning)에 접종된다. 접종 3일 후에, 트립신-EDTA로 세포들을 회수하고 α-MEM/DMSO에 동결시킨다. G1세포는 상기 설명한대로 분리시킨다(Kasinathan등의 Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001년). 간단히, 분리 24시간 전에, 5.0X10⁵의 세포가 10ml의 MEM/FBS를 포함하고 있는 T75 플라스크에 도말한다. 다음날, 플레이트를 PBS로 워싱하고, 컬쳐 배지를 1-2시간 동안 교체한 후, 30-60초 동안 중간 속도에서 볼텍스에서 플레이트를 쉐이킹(shaking)한다. 배지 제거 후, 5분간 500Xg에서 원심분리하고, 250μl의 MEM/FBS에서 재현탁한다. 세포질 가교에 의해 붙은 세포 더블릿 (cell doublet)은 마이크로피펫을 이용하여 선택되고 핵치환에 이용된다.

소 핵치환은 앞서 기술한대로 수행된다(Kasinathan등의 Biol. Reprod. 64:1487-1493, 2001년). 시험관내 에서 성숙한 난모 세포는 성숙 18-20시간 후 탈핵된다. G1공여체 세포를 난황 주위로 전이한 후에, 20ms의 2.4KV/cm의 1회 전기 충격을 이용하여 이들을 융합시킨다(Electrocell Manipulator 200, Genetronics). 후기 성숙의 28-30시간 이후에 재구성된 난모 세포 및 처녀 생식 대조군은 칼슘 이노포어(5μl)에 의해 4분간(Cal Biochem) 활성화되고, 이어서 10μg의 사이클로헥사아마이드 및 2.5μg 사이토칼라진D(Sigma)에 의해 ACM배지(100mM Nacl, 3mM KCl, 0.27mM CaCl₂, 25mM NaHCO_3, 1mM 소디움락테이트, 0.4mM 파이루베이트, 1mM L-글루타민, 3mg/ml BSA, 1%BME 아미노산 및 1% MEM 불필수 아미노산 )내에서 5시간동안 활성화된다(Liu등의 Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998년). 활성화 후, 핵 치환 배아 또는 난자는 5회 워싱되고, 마우스 태아 섬유아세포와 5% CO₂ 대기하에서 38.5℃에서 함께 배양된다.

재구성된 배아는 표준화된 방법에 의해 활성화되고, 3시간 동안 후기 융합 후, 파라 포름알데하이드에 의해 고정된 후, 라민 A/C, 라민B, NuMA 및 AKAP95에 대한 항체를 사용하여 면역형광법에 의해 미성숙 염색질 응축 단계의 배아를 분석한다(도 2, PCC). 나아가, 전핵 단계(PN stage, 즉 소배아 융합 후 15시간)로 갈 수 있게 된 핵이식 배아의 군은 비슷하게 분석된다(도 2, 핵치환 PN). 대조군으로서, 상기 기술한 활성화된 처녀 생식 난모 세포 또한 전핵 단계에서 분석되었다(도 2, Parth. PN).

예상한 것처럼, 체세포 공여체(소 태아 섬유아세포, 도 2)는 문헌으로부터 예상한 모든 분포의 마커를 발현한다. 미성숙 염색질 응축 단계에서, 구별되는 응축된 염색체 매스는 Hoechst33342에 의한 DNA염색에 의해 명백해 진다. 라민A/C 및 B는 응축된 염색체상에서 또는 근처에서 검출되지 않는데(도2.PCC), 아마도 난 자 세포질의 분산의 결과일 것이다. 일부 라벨링된 NuMA가 검출되는데; 이 NuMA는 아마 응축된 염색체를 유지하는 방추사 극과 관련있는 것이다. 이 결과는 체세포 분열하는 사람 세포에서의 AKAP 95 라벨링을 생각나게 한다(Collas 등의 J. Cell Biol.147:1167-1180, 1999년; Steen등의 J.Cell Biol. 150:1251-1262, 2000년). 전핵 단계에서는 모든 마커가 검출된다. 라민 A/C는 전핵막에 존재한다(도 2,핵치환-PN). 이것은 대조군인 처녀 생식 전핵의 막에서 라민 A/C가 검출되지 않는 것과 대조된다(도 2). 라민 B는 대조군 전핵에서처럼 핵이식 전핵에서도 검출된다. 이와 유사하게 NuMA 및 AKAP 95는 핵양체를 제외한 핵내부에 나타난다. NuMA라벨링은 시종일관 대조군 처녀 생식 전핵에서보다 핵이식 전핵에서 지속적으로 밝게 관찰된다(핵치환 PN 및 처녀 생식 PN을 대조, 도 2). 집합적으로, 이러한 관측은 핵이식 배아의 전핵이 체세포 핵 마커 라민 A 및 C와 유사하고 강한 NuMA스테이닝을 남긴다.

처녀 생식 배아 및 핵 이식 배아의 전핵에서의 AKAP95의 차별적 부착(differential anchoring)

A-카이네즈 부착 단백질 AKAP 95는 체세포 분열 염색체 응축에 포함된 핵 단백질이다. 핵 이식 후, 체세포 핵의 재구성에 영향을 주는 다른 분자 마커의 사용을 위해 태아 섬유아세포로부터 형성된 소의 핵이식 전핵 단계 배아에서 AKAP 95의 내핵 부착(anchoring) 성질이 특징지워 진다. 처녀 생식 배아 및 공여체 체세포로부터 나온 전핵에서 AKAP 95의 부착 또한 분석되었다. 전핵 배아에서의 AKAP 95의 내핵에서의 부착은 배아 세포를 상온에서 30분간 0.1% 트리톤 X-100, 1mg/ml DNAseⅠ, 및 100 또는 300mM NaCl를 이용하여 본래 위치에서 추출함으로써 분석된다. 상기 기술한 것처럼, 웅성(雄性) 전핵은 어떤 AKAP 95의 부착 장소도 되지 않는다. 대조적으로 상당량의 AKAP 95 및 DNA는 핵이식 배아의 전핵 및 소의 공여체 세포핵에서 DNAse Ⅰ및 300mM NaCl에 대하여 저항력을 갖는다(도 3). B형 라민은 처녀 생식 세포 또는 핵이식 세포의 전핵에서 DNAseⅠ및 300mM NaCl 에 의해 추출되는데, AKAP 95및 DNA 분포는 핵 구조의 큰 변화때문이다. 이러한 결과는 체세포 전핵에서 보듯이, AKAP 95가 소의 처녀 생식 전핵에서보다 핵이식 전핵에서 더 강하게 부착되는 핵내 구조(intra structure)를 가짐을 의미한다. 이러한 상호 결합이 DNA구조에 압박을 가하는지 또는 핵이식 배아에서의 변형된 게놈 구조의 변형때문인지는 결정되어야 할 것으로 남아 있다. DNAseⅠ-내성 DNA는 전사적으로 (transcriptionally) 반응이 일어나지 않기 때문에 핵이식 이후의 불완전하게 개조된 AKAP 95의 부착이 발생학적으로 중요한 유전자의 발현에 손상을 주기 쉽다.

핵이식 소배아에서의 라민A/C의 전사상의 잘못된 조절

체세포-특이적 마커가 시험관내에서 수정된 경우 및 처녀 생식 배아에 없음에도 불구하고, 라민A/C가 소의 핵이식 배아 전핵의 막주위를 리어젬블리 (reassembly)한다는 것은 놀라운 관찰이다. 따라서, 본 발명자는 라민 A/C의 리어젬블리가 (1)미성숙 염색질 응축 단계(도2)에서의 분해된 체세포 라민의 재표적화 (re-targeting)때문인지 (2) 모세포 라민A/C mRNA 풀(pool)에서 나온 라민의 번역 및 어젬블리때문인지 또는 (3) 핵이식 전핵의 체세포 라민A 유전자의 새로운 전사때문인지를 조사하였다.

이러한 가능성들을 구별해내기 위해, 소 핵이식 배아는 여기 기술된 "전통적" 핵이식 방법, 단백질 합성 저해제인 사이클로헥사미드(CHX)로 재구성한 배아의 활성이 따르는 핵이식, 또는 RNA합성 효소Ⅱ(PolⅡ)의 저해제인 액티노마이신D(Act D)가 새로운 전사를 저해하도록 하는 환경하에서 활성이 따르는 방법 중 하나에 의해 생산된다. 소 핵이식 배아를 사이클로헥사미드에서 배양하기 위해, 난모 세포는 14시간 동안 사이클로헥사미드(CHX)에서 배양하는 것을 제외하고는 상기 기술한 방법과 동일한 방법으로 핵치환 이후에 난모 세포를 활성화한다. 활성 14시간 후, 난모 세포를 5회 워싱하고, 1시간 동안 15μg/ml Hoechst33342(Sigma)를 포함하는 ACM배지에 둔다. 배양 후에, 전핵 발생 단계는 에피플로레슨스(epifluorescence)현미경으로 관찰된다. 전핵 배아는 PBS속에서 3%파라포름알데하이드에 의해 고정되고, 워싱한 후, 슬라이드에 도말한다. 액티노마이신D(ActD)에서 소의 핵이식 난모 세포를 배양하기 위해서는 사이클로헥사미드 배양 단계에서 5μg/ml 액티노마이신D(ActD)를 첨가하는 것을 제외하고는 상기한 방법과 동일한 방법에 의해 난모 세포가 활성화된다. 5시간 후에, 난자는 5회 워싱되고, 5μg/ml 액티노마이신D (ActD)를 포함하는 ACM배지에 둔다. 활성 14시간 후, 난모 세포를 5회 워싱하고, 1시간 동안 15μg/ml Hoechst33342(Sigma)를 포함하는 ACM배지에 둔다. 배양 후에, 전핵 발생 단계는 에피플로레슨스(epifluorescence)현미경으로 관찰된다. 전핵 배아는 PBS속에서 3% 파라포름알데하이드에 의해 고정되고, 워싱한 후, 슬라이드에 도말한다.

핵이식 전핵 둘레의 라민B의 어젬블리는 단백질이나 RNA합성 저해에 의해 영향을 받지 않는다. 이러한 결과는 라민B가 앞서 분해된 체세포 풀(pool)로부터 및/또는 난모 세포의 세포질에서 라민B의 큰 풀(large pool)로부터 리어젬블리되었음을 의미한다. 핵이식 전핵(도2)에서 검출된 라민A/C는 사이클로헥사미드에 의한 활성이후 재형성된 전핵에는 존재하지 않는다. 라민A/C 어젬블리는 새로운 단백질 합성을 요구하고, 이러한 라민은 분해된 공여체 세포핵주입 또는 세포 융합에 의해 체세포 풀로부터 만들어진 난모 세포로부터 재표적화되어 진 것이 아니다. 나아가, 라민 A/C는 배아 세포가 액티노마신D의 존재하에서 활성화되었을 때, 리어젬블리되지 않는다. 이 결과는 핵이식 전핵세포에서의 라민A/C의 리어젬블리가 재구성된 전핵에서 LMNA유전자의 새로운 전사로부터 비롯된 것임을 의미한다. 핵이식 전핵에서 검출된 NuMA는 사이틀로헥사미드에 의해 활성화된 핵이식된 배아의 전핵에서는 리어젬블리되지 않지만 액티노마이신 D가 처리된 핵이식 배아의 전핵에서는 희미하게 검출된다. 이러한 발견은 핵이식 배아의 전핵에서의 NuMA의 리어젬블리는 모체 NuMA의 mRNA의 풀로부터 최소한 부분적으로 새로운 번역이 일어남을 강하게 제시한다. 지속적인 관찰의 결과, 항-NuMA 라벨링이 대조군인 미처리된 핵이식 배아에 비해 액티노마이신 D처리된 핵이식 배아에서 약하게 나타나는데, 이는 핵이식 배아의 전핵에서의 NuMA 어젬블리의 일부가 전핵 단계에서의 NuMA유전자의 새로운 전사때문이라는 것을 제시한다. 집합적으로, 이러한 결과는 LMNA유전자가 핵이식 이후의 핵개조에서 턴 오프(turn-off)되지 않음을 의미한다. 유사하게, NuMA유전자는 명백하게 핵이식 배아의 전핵에서 활성이 있는 것으로 남아 있다. 고도로 응축된 염색질(도2)의 성질로부터 예견한 바와 같이, 미성숙 염색질의 응축시기 동안 이러한 유전자의 순간적인 불활성화가 일어나는 것 같다. 이러한 결과는 분명하게 여기 기술된 환경하에서 생산된 핵이식 배아의 불완전한 핵재구성을 묘사한다. AKAP95에서 검토한 바와 같이, 본 발명자들은 핵이식 배아에서의 라민A/C의 영속이 발생학적으로 중요한 유전자와 같은 유전자 발현에 영향을 미침을 제안한다. 또한 앞서 보고한 라민 A 및 C와 염색질 단백질 및 DNA의 상호 작용과 이러한 라민들과 전사 인자 사이의 관련성은 이러한 가설을 지지한다.

실시예 2: 클론된 포유 동물에 대한 재구성된 공여체 염색질 매스의 사용

실시예1에 설시된 전통적인 핵치환 배아에서 불완전한 재구성의 문제를 극복하기 위해, 핵치환 이전에 공여체 염색질을 효율적으로 재구성하는 새로운 방법이 개발되었다. 이러한 방법은 핵막을 용해시키고, 염색질 응축을 가능하게 하는 재구성 배지(예를 들면, 세포 추출물)에서, 공여체 세포로부터 나온 핵을 배양하는 것을 포함한다. 이 핵막의 붕괴와 염색질 응축은 염색체에 부착되어 있고, 그렇지 아니할 경우 난모 세포, 배아, 또는 태아 발생 과정에서 바람직하지 못한 유전자의 전사를 증진시키는 전사 조절 단백질을 방출한다. 추가적으로, 재구성 배지로부터 나온 조절 단백질은 염색질에 결합하고 발생 과정에 바람직한 유전자의 전사를 증진시킬 수도 있다.

클로닝에 사용될 공여체 세포핵의 대량 준비

배지의 싱크로나이즈드 또는 언싱크로나이즈드(synchronized or unsynchronized) 세포 집단으로부터 수백만 개의 핵이 분리될 수 있다. 세포 집단은 자연적으로 또는 화학적으로 싱크로나이즈드 될 수 있다. 바람직하게는, 최소 한 한 집단의 40, 60, 80, 90 또는 100%의 세포가 G₀ 또는 G₁단계에 있다. 이를 달성하기 위해 세포는 낮은 혈청 농도, 예를 들면 5%, 2% 또는 0% 혈청에서 배양될 수 있는데, G₀단계의 세포들의 퍼센트를 높이기 위해, 1일, 2일, 3일 또는 그 이상의 시간 동안 배양될 수 있다. G₁단계의 싱크로나이즈를 위해 부착된 세포들의 상태와 같이 콘플루언스(confluence)로 자랄 수 있고 그리고 나서 0.5-1μg/ml의 노코다졸(nocodazole, Sigma Chemicals, St.Louis, MO)에서 17-20시간 동안 상기한 대로 배양된다(예를 들면, Collas등의 J.Cell Biol.147:1167-1180, 1999년 및 여기 포함된 참고문헌). 부착된 세포들을 포함하는 플라스크는 한 손으로 반복하여 탭핑(tapping)함으로써 격렬하게 섞이게 되고, 그 결과 유사 분열의 세포 및 G₁단계의 더블릿(doublet)으로부터의 분리를 가져온다. G₁단계의 더블릿(doublet)은 여전히 가는 브릿지에 의해 연결된 세포 분열의 끝과정에서 연장된 세포들의 쌍이다. 분리된 G₁단계의 더블릿(doublet)은 이 특징적인 더블릿 구조에 기초한 배지로부터 분리된다. 이 G₁단계의 더블릿(doublet)은 부착된 채 남아 있거나, 또는 분리 후에 두 개의 별개의 세포로 나누어 질 수 있다.

싱크로나이즈드 또는 비싱크로나이즈드 세포들은 표준화된 방법을 이용하여,

PBS에서 배양되고, 세포를 본래의 배양액으로부터 저장 완충액(10mM HEPES, 또는 pH7.5mM MgCl₂, 25mM KCl, 1mM DTT, 10μM 아프로티닌, 10μM의 류페틴, 10μM의 펩스타틴A, 10μM의 콩 트립신 저해제,및 100μM PMSF)으로 옮기기 위해 수차례 워싱한다. 예를 들면, 세포는 50ml의 PBS로 워싱될 수 있고, 10분간 4℃에서 500 X g로 원심분리한다. PBS상층액은 떠내고, 펠렛화된 세포만 상기와 같이 50ml의 PBS에 재현탁하고, 원심분리한다. 이 원심분리 후, 펠렛이 된 세포는 20-50배의 얼음으로 냉각한 저장액에 재현탁하고, 10분간 4℃에서 500 X g로 원심분리한다. 상층액은 다시 제거하고 약 20배의 저장액을 펠렛에 첨가한다. 세포들을 조심스럽게 이 완충액에 재현탁하고 최소한 1시간 얼음에서 배양하면 점차적으로 세포가 팽창된다.

세포로부터 핵을 분리해내기 위해, 세포들은 표준 방법에 의해 용해된다. 예를 들면 2-5ml의 세포 현탁액은 유리 균일화 기구로 옮겨지고 초기 10-20회의 타이트 핏팅 막자질을 이용하여 다운스(Dounce)균질화한다. 이와는 달리, 세포 현탁액은 모터 믹서(예를 들면, Ultraturrax)를 이용하여 균질화하고, 단백질은 핵으로부터 제거된다. 바람직하게는 세포 용균은 40배율에서 상역전 대조 현미경을 이용하여 모니터링 될 수 있다. 이 균질화 동안 핵은 본래대로 남아 있고, 대부분 또는 모든 초기에 부착되어 있던 비히클, 소기관들, 및 단백질과 같은 세포질 요소들이 핵으로부터 제거된다. 만약 필요하다면, 1-20 μg/ml의 사이토스켈렉탈 (cytoskeletal) 저해제, 사이토칼라진 B또는 D는 완충액에서 이 과정을 수월하게 하는 앞서 언급한 저장액에 첨가한다. 균질화는 세포를 용균화할 정도로만 계속하고, 세포질 요소들은 핵으로부터 방출되어 진다. 어떠한 세포 종류에 대해서는 100, 150 또는 그 이상의 스트로크가 필요할 수 있다. 이 용균체는 그리고 나서 얼음상의 15ml의 콜로니 튜브로 옮겨지고, 팽창된 세포의 현탁액의 잔여물은 용 균 절차를 반복한다. 완충액의 2M 스톡 용액으로부터 만들어진 수우크로오스는 세포 용균물(즉, 2M스톡 용액의 1/8부피가 용균물에 첨가)에 첨가되고, 그 결과, 최종 농도 250mM의 슈크로오스 농도가 된다. 이 용액은 인버젼(inversion)에 의해 섞이고, 핵은 4℃에서 10-40분간 스윙 아웃 로토(swing out rotor)에서 400 X g에서 원심분리하여 펠렛으로 만든다. 그리고 나서 상층액은 제거되고, 펠렛화된 핵은 10-20배의 핵 완충액(10mM HEPES, 또는 pH7.5mM MgCl₂, 25mM KCl, 1mM DTT, 10μM 아프로티닌, 10μM의 류페틴, 10μM의 펩스타틴A, 10μM의 콩 트립신 저해제,및 100μM PMSF)에 재현탁된다. 핵은 침전화되고 상기와 같이 핵 완충액의 1-2부피에서 재현탁된다. 신선하게 분리된 핵은 즉시 하기할 바와 같이 시험관내 재구성 및 핵치환에 사용될 수도 있고, 나중에 사용하기 위해 저장될 수도 있다. 저장을 위해서는 핵을 핵 완충액을 희석하여 10⁶/ml가 되도록 한다. 글리세롤(2.4배의 100% 글리세롤)이 더해지고 부드러운 피펫팅에 의해 잘 섞인다. 현탁액은 얼음상에서 1.5ml튜브에 100-500μm부피로 배분되고, 메탄올-드라이 아이스 욕조(bath)에서 즉시 냉동되고 -80℃에서 저장된다. 사용에 앞서, 핵의 배분량은 얼음상에서 또는 상온에서 해동된다. 얼음 냉각된 핵 완충액 1부피가 더해지고, 스윙 아웃 로토에서 15분간 1000Xg에서 용액이 원심분리된다. 펠렛화된 핵은 100-500μl의 핵 완충액에서 재현탁되고 상기와 같이 원심분리된다. 펠렛화된 핵은 핵 완충액의 최소 부피에서 재현탁되고, 사용시까지 얼음상에서 저장된다.

유사분열 추출물 또는 공여체 유전 물질의 재구성에 사용될 배지의 준비

유사 분열 추출물의 준비를 위해, 체세포(예를 들면, 섬유아세포)를 0.5-1μg/ml의 노코다졸에서 17-20시간 동안 배양하여 유사 분열에서 싱크로나이즈시키고(Collas등의 J. Cell Biol.147:1167-1180, 1999년 및 이들의 참조문헌) 유사 분열 세포는 상기한 바와 같이 격렬하게 흔들어서 쉐이킹한다. 분리된 G₁단계 더블릿은 떠내어지거나 또는 분리된 세포의 대다수(전형적으로 80%)를 이루는 유사 분열 세포와 함께 남겨둔다. 거두어들인 분리된 세포를 10ml코니칼 튜브에서 4℃로 500 X g에서 10분간 원심분리한다. 몇 세포 펠렛이 풀되면(pooled), 전체 부피가 50ml인 차가운 PBS에서 재현탁한다. PBS 세척 단계를 반복한다. 세포 펠렛은 약 20배의 얼음 냉각 세포 용균 완충액(20mM HEPES, 또는 pH8.2, 5mM MgCl₂, 10mM EDTA, 1mM DTT, 10μM 아프로티닌, 10μM의 류페틴, 10μM의 펩스타틴A, 10μM의 콩 트립신 저해제, 및 100μM PMSF 및 선택적으로 20μg/ml 사이토칼라진B)에 재현탁하고, 10분간 4℃에서 800Xg에서 원심분리하여 침전시킨다. 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 조심스럽게 단지 1부피의 세포 용균 완충액에서 재현탁시킨다. 세포 팽창이 일어나도록 세포들은 얼음에서 1시간 동안 배양된다. 세포들은 팁 소니케이터를 사용하여 소니케이션되거나 유리 막자 및 사발을 이용하여 다운스 호모나이제이션될 수 있다. 세포 용균은 최소한 90%의 세포 및 세포핵이 용균될 때까지 수행되는데 이는 상역전 현미경에 의해 판단될 것이다. 최소 90%의 세포 및 세포핵을 용균하는데 필요한 소니케이션 시간은 추출물을 준비하는데 사용된 세포 유형에 따라 다양할 수 있다.

세포 용균물은 1.5ml 원심분리 튜브에 담아서 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 10000-15000Xg에서 15분간 4℃에서 원심분리한다. 튜브는 원심분리기에서 제거된 즉시 얼음 위에 둔다. 상층액을 200μl의 피펫 팁을 이용하여 조심스럽게 수집하고, 몇몇의 튜브로부터 나온 상층액은 풀(pool)되고 얼음위에 둔다. 이 상층액은 "유사 분열 세포질(mitotic plasmic)" 또는 "MS15"추출물이다. 이 세포 추출물은 염색질 매스를 얻기 위해 통상의 방법이 사용될지 또는 미세 방법(micromethod)이 사용될지에 따라 얼음위에 있는 튜브에 50μl 또는 10μl의 부피가 배분된다. 추출물은 액체 질소를 이용하여 즉시 동결시키고, 사용시까지 -80℃에서 보관한다. 이와는 달리 세포 추출물은 얼음에서 초원심분리 튜브에 둔다(즉, SW55 Ti로토를 위해 고정; Beckman). 만약 필요하다면, 미네랄 오일을 튜브에 발라 둘 수 있다. 이 상층액은 "MS200" 또는 "유사분열 사이토졸릭(mitotic cytosolic)"추출물이다. 추출물은 M15에서와 마찬가지로 분배되고 냉동된다.

바람직하다면, 추출물은 추가적인 핵 인자들에 의해 보강될 수 있다. 예를 들면, 세포핵은 재구성 추출물이 유도된 세포형의 세포로부터 추출되거나 다른 어떤 세포형 및 상기한 소니케이션에 의해 용균된 세포로부터 정제된 것일 수 있다. 핵 인자는 아지테이션(agitation)하에서 0.15 ~ 800mM의 NaCl 또는 KCl을 포함하는 핵 완충액에서 10-60분간 추출된다. 용균물은 원심분리하여 추출되지 않은 요소들을 침전시킨다. 관심의 대상인 추출된 인자를 포함하는 상층액은 NaCl 또는 KCl을 제거하기 위해 투석된다. 투석된 핵 추출물은 배분되고 냉동 저장된다. 이 핵 추출물은 재구성을 위한 핵에 첨가하기에 앞서서 상기한 바와 같이 전체 세포 추출물 에 다양한 농도로 첨가된다.

또한 유사 분열 추출물은 난모 세포 또는 웅성(雄性) 생식 세포와 같은 생식 세포로부터 얻을 수도 있다. 예를 들면, 자연적으로 이 단계에 진입한 메타페이즈Ⅱ의 난모 세포는 상기와 같은 난모 세포 추출물의 생성을 위해 수확되고, 워싱되고, 용균될 수 있다. 웅성(雄性) 생식 세포 추출물을 준비하기 위해, 생식 세포는 도살장에서 얻어진 정소로부터 분리하여 작게 자르고, 이로부터 얻어진 세포를 수크로오즈 또는 페르콜 경사(percoll gradient)에서 차별적으로 원심분리함으로써 분리되어 진다. 생식 세포는 체세포(Leydig 및 Sertoli)로부터 분리되어 현탁에 의해 워싱되고, PBS에 침전될 수 있다. 그리고 나서 이 세포들은 상기한 얼음 냉각한 세포 용균 완충액에서 워싱되고 소니케이션에 의해 용균된다. 용균물은 15분간 4℃에서 15000 X g로 원심분리하여 정제하고 상층액(예를 들면,생식 세포 추출물)은 배분하여 액체 질소를 이용하여 순간 동결된다.

이 세포 추출물을 대체하기 위한 것으로 재구성 배지는 하나 이상의 자연 발생 또는 재조합 인자(예를 들면,DNA 메틸트랜스퍼레이즈, 히스톤 디아세틸레이즈, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성 인자, 억제자, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 싸이토킨, 또는 다른 호르몬들과 같은 핵산이나 단백질)를 완충액과 같은 용액에 더함으로써 형성될 수 있다. 바람직하게는 하나 이상의 인자가 난모 세포 또는 생식 세포에 특이적이다.

세포핵을 유사 분열 추출물 또는 배지에 노출시킴으로써 응축된 염색질 매스를 형성하는 방법

배분된 MS15 또는 MS200 추출물 또는 유사 분열 배지는 얼음상에서 해동된다. ATP-발생 시스템(ATP-generating system, 0.6μl)이 20μl의 추출물 또는 배지에 첨가되고, 볼텍싱에 의해 섞인다. ATP-발생 시스템을 얻기 위해서는 동일 함량의 100mM ATP스톡, 1M크레아틴 인산염, 및 H₂O에서 만들어진 2.5mg/ml크레아틴 카이네이즈 스톡 용액(100X)을 섞고, 사용시까지 얼음에서 저장한다. 추출에 ATP발생 시스템을 더한 후에, 최종 농도는 1mM ATP, 10mM크레아틴 인산염, 및 25mg/ml/크레아틴 카이네이즈가 된다. 세포핵 현탁액을 10μl의 추출물 또는 배지당 1μl세포핵 농도인 추출물이나 배지에 첨가하고, 피펫팅으로 섞은 후, 30, 33, 35, 37 또는 39℃ 물 욕조(water bath)에서 배양한다. 혼합물이 들어 있는 튜브는 일정 간격으로 부드럽게 탭핑하여 튜브 바닥에 염색체가 응어리지는 것을 방지한다. 핵 막 붕괴와 염색체 응축은 매 15분과 같은 일정 간격으로, 현미경하에서 조사된다. 핵막 붕괴 및 염색체 응축이 시작되면 추출물 또는 배지로부터의 염색질 매스의 회수 과정이 시작된다.

세포핵을 유사 분열 추출물 또는 배지 및 항-NuMA항체에 노출시킴으로써 응축된 염색질 매스의 형성하는 방법

이와는 달리, 응축되지 않은 또는 부분적으로 응축된 염색질 매스는 분리된 세포핵을 핵 매트릭스 단백질 NuMA에 대한 항체(Steen등의 J.Cell Biol. 149,531-536, 2000년)와 함께 예비 로딩(pre-loading)한 뒤에 상기 절차를 수행함으로써 형성된다. 이 절차는 공여체 세포핵을 둘러싸고 있는 핵 막을 용해시킴으로써 염색질로부터 세포핵 요소를 제거하는 것을 가능하게 한다; 그러나, 응축 단계는 항-NuMA항체를 첨가함으로써 저해된다. 염색체 응축의 저해는 염색체가 유사 분열 추출물에서 배양되는 동안 일어날 수 있는 염색체의 파괴와 손실의 위험을 감소시킬 수 있을 것이다.

이러한 절차를 위해, 정제된 세포핵(2000세포핵/μl)은 상온에서 15분간 0.75μg/ml의 라이소레시틴(lysolecitin)을 포함하는 500μl의 세포핵 완충액에서 침투된다. 초과량의 라이소레시틴(lysolecitin)은 핵 완충액에서 만들어진 1ml의 3%BSA를 첨가하고 5분간 얼음에서 배양함으로써 급냉(quenching)한다. 그리고 나서 핵은 침전되고 핵 완충액에 1회 워싱된다. 핵은 항-NuMA항체 (1:40희석;Transiduction Laboratories)를 포함하는 100μl의 완충액에서 2000세포핵/μl농도로 재현탁된다. 완만한 아지테이션을 동반하면서 얼음에서 1시간 배양한 후에, 세포핵은 20분간 1M의 수크로오즈를 통해 500Xg로 침전시킨다. 그리고 나서 세포핵은 핵 완충액에 재현탁되고, 상기와 같이 유사 분열 추출물 또는 ATP 발생 시스템을 갖는 배지에 더해진다. 선택적으로, 항-NuMA항체가 염색체 응축을 더욱 방지하기 위해 상기 추출물이나 배지에 첨가될 수 있다.

세포핵을 계면 활성제 및/또는 염용액 또는 단백질 카이네이즈 용액에 노출시킴으로써 응축된 염색질 매스를 형성하는 방법

응축되지 않거나 단지 부분적으로만 응축된 염색질 매스는 계면 활성제나 단백질 카이네이즈에 노출시킴으로써 형성될 수 있다. 계면 활성제는 세포핵의 염색체에 결합하지 않거나 약하게 결합하고 있는 핵 요소들을 용해시키는데 사용되어 핵 막을 제거한다. 이 절차를 위해 정제된 세포핵(2000-10000세포핵/μl)은 0.1%-0.5%의 트리톤X-100 또는 NP-40과 같은 계면 활성제로 보충된 핵 완충액내에서 배양된다. 핵 막의 제거를 위해 NaCl과 같은 염이 거의 0.1, 0.15, 0.25, 0.5, 0.75, 또는 1M의 농도로 완충액에 첨가될 수 있다. 가볍게 흔들면서 얼음 위에서 10-30분간 배양한 후에, 전체 부피에 따라 스윙 아웃 로토에서 10-30분간 1000 X g로 원심 분리하여 침전시킨다. 펠렛이 된 세포핵은 0.5-1ml핵 완충액에서 재현탁되고, 상기와 같이 침전된다. 이 워싱 절차는 완전한 계면 활성제와 그 밖의 염의 제거를 보장하기 위해 2회 반복된다.

이와는 달리, 세포핵 막은 재조합 또는 자연 발생된 단백질 카이네이즈를 단 독 또는 복합으로 사용하여 제거될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 카이네이즈가 표준화된 절차를 이용하여 제거되거나 상업적인 경로로 정제된 형태로 얻을 수 있다. 이러한 카이네이즈들은 핵 막, 핵 매트릭스, 또는 염색질과 같은 핵의 요소를 인산화할 수도 있는데, 그 결과 핵 막이 제거된다(예를 들어, Collas 및 Courvalin의 Trends Cell Biol. 10:5-8, 2000년). 바람직한 카이네이즈는 사이클린 의존성 카이네이즈Ⅰ(CDKⅠ), 단백질 카이네이즈C(PKC), 단백질 카이네이즈A(PKA), MAP카이네이즈, 칼슘/칼모듈린-의존성 카이네이즈(CamKⅡ), 및 CKⅠ카세인 카이네이즈 또는 CK2 카세인 카이네이즈를 포함한다. 이 방법에 의하면, 거의 20000개의 정제된 세포핵은 상온에서 1.5ml의 원심분리 튜브에서 20μl의 인산화 완충액에서 배양된다. 바람직한 CDKⅠ을 위한 인산화 완충액은 200mM NaCl, 50mM트리스-HCl(pH7.2-7.6), 10mM MgSO₄, 80mM β-글리세로포스페이트, 5mM의 EGTA, 100μM의 ATP, 및 1mM의 DTT를 포함한다. 만약 PKC 및 CDK1을 동시에 사용한다면, CDK1인산화 완충액은 40μg/ml포스파티딜세린 및 20μM디아실글리세롤이 사용된다. PKA에 대한 바람직한 인산화 완충액은 200mM NaCl, 10mM MgSO₄, 10mM트리스, pH 7.0, 1mM EDTA, 및 10mM의 CaCl₂, 및 100μM의 ATP를 포함한다. MAP카이네이즈의 경우는, 10mM CaCl₂, 및 1mM의 DTT가 보충된 PKA 인산화 완충액이 사용될 수 있다. CamKⅡ의 경우는, 1mM의 DTT가 보충된 PKA 완충액 또는 Upstate Biotechnology(Venema 등의 J. Biol. Chem 272:28187-90, 1997년)로부터의 Cam 카이네이즈 분석 키트가 사용될 수 있다.
인산화 반응은 단백질 카이네이즈를 25-100ng의 최종량을 첨가하여 개시된다. 반응은 상온에서 1시간까지 배양된다. 매 15분과 같은 배양하는 동안 현미경을 통해 핵 막 붕괴가 관찰될 수 있다. 핵 막 붕괴 이후에, 핵을 3회 워싱하여 상술한 바와 같이 계면 활성제 용액을 제거한다.
배지, 추출물, 계면 활성제 및/또는 염용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액으로부터 염색질 매스의 회수
응축되거나, 부분적으로 응축되거나, 또는 응축되지 않은 염색질 매스를 포함하는 추출물 또는 용액을 핵 완충액에서 만들어진 1M 수크로오즈 용액의 부피와 동일한 부피에 넣는다. 염색질 매스를 샘플 부피에 따라 4℃의 스윙 아웃 로토에서 10-30분간 1000 X g로 원심 분리하여 침전시킨다. 상층액을 제거하고, 펠렛된 염색질을 피펫팅하여 0.1-1.0ml의 핵 완충액 또는 라이포퓨젼 완충액(150mM NaCl, 10μM 아프로티닌, 10μM의 류페틴, 10μM의 펩스타틴A, 10μM의 콩 트립신 저해제, 및 100μM PMSF, 및 pH7.0 또는 pH7.5 근처의 20mM HEPES 또는 pH6.2 근처의 20mM MES에서의 100μM의PMSF)에 조심스럽게 재현탁하고, 10-30분간 100Xg에서 원심분리한다. 상층액을 제거하고, 펠렛된 염색질 매스를 핵 완충액 또는 라이포퓨젼 완충액에서 재현탁하고 사용시까지 얼음상에서 저장한다. 각각의 염색질 매스는 미세조작 접시(micromanipulation dish)의 오일하에서 HEPES-완충된 배지의 20μl로 옮겨진다. 하나의 염색질 매스는 후술하는 바와 같이, 각각의 탈핵된 난모 세포에 삽입된다.
염색질 매스 준비를 위한 미세 방법
ATP발생 시스템(generating system), 계면 활성제 및/또는 염 용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액을 포함하는 10-20μl의 MS15 또는 MS200 추출물 또는 유사분열 배지를 페트리 접시에 넣는다. 그리고 나서, 배양 배지에 있는 50μl의 분리된 G1 단계 세포 더블릿 또는 G0 단계 세포, 세포 용균의 촉진을 위해 0.1%트리톤X-100 또는 NP-40을 포함하는 HEPES- 또는 바이카보네이트(bicarbonate)-완충된 배지의 50μl "용균', 및 50μl의 난모 세포 주입 배지를 첨가한다. 이러한 각 첨가제들은 CO₂로 평형화된 미네랄 오일로 도포된다. 또한 배양 배지의 50μl의 "워시 드롭(wash drop)"은 용균화된 세포 또는 세포핵을 워싱하는데 사용될 페트리 접시에 첨가되어야 한다.

세포들은 마이크로피펫을 사용하여 용균액(lysis drop)으로 옮겨진다. 세포막은 가벼운 반복 흡출에 의해 피펫에서 용해된다. 세포가 용균될 때, 용균체는 선택적으로 워시 드롭으로 부드럽게 들어가고, 계면 활성제를 제거하기 위해 세포핵은 즉시 재아스피레이션된다. 선택적으로 세포핵은 침투되고 유사 분열 추출물 또는 배지에 첨가되기 이전에 항-NuMA항체와 함께 배양된다. 그리고 나서 세포핵은 MS15, MS200 또는 배지, 계면 활성제 및/또는 염용액, 또는 단백질 카이네이즈 용액으로 들어가게 된다. 핵 붕괴 및 염색질 응축은 상기와 같이 모니터링된다. 일단 핵막이 붕괴되고, 항-NuMA항체가 없이 유사분열 추출물이 사용되면, 염색질은 응축을 시작하고, 하기하는 바와 같이, 하나의 본래 염색질 매스가 마이크로피펫으로 분리되며 탈핵된 수용체 난모 세포에 옮겨진다.

난모 세포의 탈핵

바람직하게는, 수용체 난모 세포는 메타페이즈Ⅱ의 난모 세포이다. 이 단계에서, 난모 세포는 활성화되거나 정자와 수정할 때처럼 이미 염색질 매스가 도입될 수 있을 정도로 충분히 활성화되어 있다. 난모 세포의 탈핵을 위해, 부분 또는 바람직하게는 난모 세포의 모든 DNA가 제거되거나 불활성화되어 있다. 이 수용체 난모 세포의 DNA의 제거 또는 파괴는 난모 세포의 유전 물질이 클론된 포유 동물의 성장 및 발생에 공헌하는 것을 방해한다. 난모 세포의 전핵을 파괴하는 한 방법은 자외선에 노출시키는 것이다(Gurdon, in Methods in Cell Biology, Xenopus Laevis:-Practical Uses in cell and Molecular Biology, Kay and Peng, eds, Academic Press, 캘리포니아, 36권:299-309페이지, 1991년). 이와는 달리 난모 세포의 전핵은 어떤 표준화된 기술을 이용하여 수술적으로 제거될 수 있다(예를 들면, McGrath 및 Solter, Science 220: 1300-1319페이지, 1983년). 한 가능한 방법은 바늘을 난모 세포로 삽입하여 핵을 바늘 내의 공간으로 흡입해내는 것이다. 그리고 나서 바늘은 세포질 막을 해하지 않고 난모 세포로부터 제거되어야 한다(미국 특허 4,994,384 및 5, 057,420).

염색질을 난모 세포에 삽입하기 위한 라이포퓨젼(lipofusion)

염색질 매스는 하기할 바와 같이 라이포퓨젼이나 표준화된 마이크로인젝션 또는 전기 융합(electrofusion) 기술(미국 특허 4,994,384 및 5,945,577)에 의해 수용체 난모 세포로 들어갈 수 있다. 또한 이하의 라이포퓨젼 기술은 염색체를 다른 수용체 세포에 넣기 위한 다른 응용에도 사용될 수 있다.

염색질 매스는 원심 분리에 의해 유사분열 추출물, 계면 활성제, 및/또는 염 용액 또는 단백질 카이네이즈 용액로부터 분리되고 나서 상기와 같은 라이포퓨젼 완충액으로 워싱된다. 염색질 매스는 사용시까지 얼음 냉각된 라이포퓨젼 완충액에 저장될 수 있다. 다시 말하면, 염색질 매스는 배분되어서, 액체 질소 또는 메탄올 건조 얼음 욕조에서 동결되고, -80℃에서 냉동 보존된다. 라이포퓨젼 용액은 하나 이상의 융합 시약을 라이포퓨젼 완충액과 거의 5:1 에서 1:10까지의 범위에서 혼합하여 제조될 수 있다. 융합 용액은 이에 한정되지 않고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 리포펙틴^®, 리포펙타민^®, 도탭^®, 도스파^® 및 도페^®,및 막 소포체 단편(membrane vesicle fractions)과 같은 리포필릭한 화합물로 구성된다. 예를 들면, 도탭^®과 같은 카티오닉 리피드가 라이포퓨젼 완충액에서 거의 0.1-30μg/ml농도로 사용될 수 있다. 이와는 다르게, 카티오닉 리피드 및 중성 리피드의 혼합물로 구성된 도페^®와 같은 라이포좀 조성물이 사용될 수 있다.

새로이 준비되거나 동결 및 해동하여 준비된 염색질 매스는 화합물로 염색질 매스를 코팅하는 것을 가능하게 하는 라이포퓨젼 용액과 혼합된다. 배양은 거의 10-30분간 20-30℃의 온도에서 진행된다. 라이포퓨젼 용액 안에서 염색질 매스를 포함하는 마이크로드롭은 CO₂로 평형화된 미네랄 오일하에 놓여진다. 탈핵 수용체 난모 세포를 포함하는 드롭 또한 준비된다. 라이포퓨젼 시약으로 코팅된 염색질 매스는 마이크로피펫으로 뽑아 내져 난모 세포의 세포질과 투명대 사이의 공간인 페리비틀린 공간(perivitellin space)으로 삽입된다. 염색질 매스는 난모 세포와 의 접촉을 보장하기 위해 난모 세포의 세포질 옆에 위치하게 된다. 염색질 매스 복합체는 20-30℃의 상온에서 유지되고 융합은 현미경하에서 모니터링된다. 일단 융합이 일어나면, 재구성된 난모 세포는 하기와 같이 활성화된다.

재구성된 난모 세포의 활성화, 배양, 및 핵이식

극체의 밀어냄(extrusion)과 염색질 매스의 손실을 방지하기 위해, 난모 세포는 사이토칼라진B의 존재하에서 활성화되거나 사이토칼라진B가 활성 즉시 첨가될 수 있다(Wakayama등의 PNAS96:14984-14989,1999년; Wakayama등의 Nature Genetics 24:108-109, 2000년). 난모 세포를 활성화하는데는 전기 또는 비전기적 수단이 사용될 수 있다. 세포 활성을 위한 전기적 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들면, 미국 특허 4,994,383 및 5,057,420). 세포 활성을 위한 비전기적 수단은 세포 분열 확률을 높이는 것으로 당업자들에게 알려져 있다. 세포 활성을 위한 비전기적 수단의 예에는 에탄올;이노시톨 트리포스페이트; Ca⁺⁺이노포어 및 단백질 카이네이즈 저해제; 단백질 합성 저해제; 포볼 에스터; 댑시가진 (thapsigargin), 또는 정자의 다른 요소의 존재하에서 배양하는 것을 포함한다. 활성을 위한 다른 비전기적 수단은 난모 세포에 냉각 쇼크나 기계적 스트레스를 주는 것을 포함한다. 이와는 달리, 핵 치환 후 1-3시간 이후에, 난모 세포는 세포를 활성화하기 위해 Sr²⁺가 포함된 배지에서 그리고 세포 역학 및 극체의 밀어냄을 방지하기 위해 난모 세포 및 사이토칼라진B에서 거의 6시간 배양될 수 있다 (Wakayama등의 PNAS96:14984-14989,1999년; Wakayama등의 Nature Genetics 24:108- 109, 2000년).

활성화 이후, 난모 세포는 그 결과물인 배아의 발생을 가능하게 하는 충분한 양의 배양 배지에 놓여 진다. 2세포기 또는 그 후기 단계에서 배아가 말기까지 발생을 종료할 수 있도록 보육자 수용체 모체로 옮겨진다. 소의 경우, 전형적으로 배아는 모체 숙주로 옮겨지기 이전에 배반포 단계(예를 들면, 거의 6-8일)까지 배양된다. 다른 클론된 동물의 경우, 시험관 내에서의 적절한 시간은 본 발명 분야의 당업자에게 알려져 있거나 일상의 실험에 의해 결정될 수 있다.

배아를 모체의 자궁에 착상시키는 방법 또한 본 발명의 당업자에게 알려져 있다. 바람직하게는, 배아의 발생 단계는 숙주 동물의 성주기 사이클에 관련이 있다. 일단 배아가 포유 동물의 자궁에 착상하면, 배아는 말기까지 발생한다. 이와는 달리, 배아는 선택된 시간까지 자궁안에서 발생을 하고, 그리고 난 뒤 그것의 건강 상태 및 생육력을 결정하기 위해 일반적인 외과적 방법을 이용하여 제거된다. 어떤 종으로부터 나온 배아가 다른 종의 동물의 자궁 환경에 놓여질 수도 있다. 예를 들면, 소 배아는 양의 난관에서 발생할 수도 있다(Stice 및 Keefer, Biology of Reproduction 48:715-719, 1993년). 배아 및 자궁 사이의 어떠한 종간 교차 (cross-spieces relationshop)는 본 발명의 방법에 사용된다.

난모 세포 또는 다른 수용체 세포들을 이용한 세포핵의 라이포퓨젼

라이포퓨젼 용액은 하나 이상의 융합 시약을 라이포퓨젼 완충액과 거의 5:1 에서 1:10까지의 범위에서 혼합하여 제조될 수 있다. 새로이 준비되거나 동결 및 해동하여 준비된 염색질 매스는 화합물로 염색질 매스를 코팅하는 것을 가능하게 하는 라이포퓨젼 용액과 혼합된다. 배양은 거의 10-30분간 20-30℃의 온도에서 진행된다. 라이포퓨젼 용액 안에서 염색질 매스를 포함하는 마이크로드롭은 CO₂로 평형화된 미네랄 오일하에 놓여진다. 탈핵 수용체 난모 세포를 포함하는 드롭 또한 준비된다. 상기와 같이, 물리적으로 마이크로매니퓰레이션 (micromanipulation)에 의해 염색체 또는 세포핵을 제거하거나 자외선에 노출시켜 유전 물질에 손상을 가함으로써 탈핵된 수용체 세포를 준비한다. 난모 세포로의 주입을 위해서는 바람직하게는 코팅된 세포핵이 세포와의 접촉을 보장하기 위해 세포막 옆에 위치하게 된다. 세포핵-세포 복합체는 20-30℃에서 유지되고, 현미경하에서 융합은 모니터링된다. 일단 융합이 일어나면, 재구성된 난모 세포는 상기와 같이 활성화된다.

실시예3: 포유 동물을 클론하기 위한 재구성된 침투된 세포의 이용

세포로부터 세포핵 또는 염색질 매스를 분리하지 않고도 세포들이 재구성될 수 있다. 이 방법에서, 세포는 침투된 후, 배지(예를 들면, 세포 추출물)와 세포간의 인자들의 교환이 가능한 환경하에서 간기 또는 유사 분열 배지에서 배양되어 진다. 만약 간기 배지가 사용된다면, 세포의 핵은 막에 둘러싸인 상태로 남고; 유사 분열 배지가 사용되면 핵막 파괴 및 염색질 응축이 일어날 수 있다. 이 배지에서 배양하여 세포핵이 재구성된 뒤, 바람직하게 세포질 막은 방출되고, 배지로부터 바람직한 인자들을 포함하는 본래의 재구성된 세포를 형성한다. 바람직하다면, 배지는 실시예2에서와 같은 추가적인 핵 인자들로 보충된다. 그리고 나서 재구성된 세포는 수용체 난모 세포와 융합하고, 재구성된 난모 세포로부터 만들어진 배아는 클론된 포유 동물 세대를 위해 모체 수용체 포유 동물로 삽입된다.

세포의 침투

이러한 절차를 이용한 세포들은 비싱크로나이즈된 세포 및 G₀,G₁, S, G₂, 또는 M기 또는 이러한 상의 조합에서 싱크로나이즈된 세포를 포함한다. 디지토닌 (digitonin) 또는 스트렙토라이신O를 이용한 침투와 같이 어떤 표준화된 절차를 이용하여 세포들은 침투된다. 간단히, 표준 절차에 의해 세포들은 수거되고 PBS로 워싱된다. 디지토닌 침투를 위해서는 세포들은 거의 0.001-0.1%의 농도에서의 디지토닌을 포함하는 배지에서 재현탁되고, 10분간 얼음에서 배양된다. 스트렙토라이신D를 이용한 침투에서는 상온에서 15분, 30분, 또는 60분간 세포들이 스트렙토라이신O 용액에서 배양된다(예를 들면, Maghazachi 등의 FASEB J. 11:765-74, 1997년 및 이들의 참고문헌 참조). 어떤 배양 후에도 세포는 10분간 400 X g에서 원심분리하여 워싱한다. 이 워싱 단계는 PBS에서 재현탁 및 침전하여 2회 반복한다. 사용시까지 세포들은 상온에서 PBS에 보관한다. 바람직하게는 침투된 세포는 하기할 바와 같이, 재구성을 위해 간기 또는 유사분열 배지에 첨가된다.

재구성 배지의 준비

간기 재구성 추출물을 준비하기 위해 간기 배양된 세포를 표준 방법으로 수거하고 4℃에서 10ml코니칼 튜브에서 10분간 500Xg로 원심분리하여 워싱한다. 상층액을 제거하고, 세포 펠렛은 전체 부피 50ml인 냉각된 PBS에서 재현탁한다. 세 포들은 4℃에서 10분간 500 X g에서 원심분리한다. 이 워싱 단계는 반복되고, 세포 펠렛은 거의 20배 부피의 얼음 냉각된 간기 세포 용균 완충액(20mM HEPES, 또는 pH8.2, 5mM MgCl₂, 1mM DTT, 10μM 아프로티닌, 10μM의 류페틴, 10μM의 펩스타틴A, 10μM의 콩 트립신 저해제,및 100μM PMSF, 선택적으로 20μg/ml)에서 재현탁된다. 세포들은 4℃에서 10분간 800 X g로 원심 분리하여 침전시킨다. 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 간기 세포 용균 완충액의 1부피 이상에서 조심스럽게 재현탁한다. 1시간 동안 얼음에서 세포를 배양하여 세포의 팽창이 가능하도록 한다. 세포들은 팁 소니케이터를 사용하여 소니케이션되거나 유리 막자 및 사발을 이용하여 다운스 호모나이제이션될 수 있다. 세포 용균은 최소한 90%의 세포 및 세포핵이 용균될 때까지 수행되는데 이는 상역전 현미경에 의해 판단될 것이다. 최소 90%의 세포 및 세포핵을 용균하는데 필요한 소니케이션 시간은 추출물을 준비하는데 사용된 세포 유형에 따라 다양할 수 있다.

세포 용균물은 1.5ml 원심분리 튜브에 담아서 테이블 탑 원심 분리기를 리룔하여 10000-15000 X g에서 15분간 4℃에서 원심분리한다. 튜브는 원심분리기에서 제거된 즉시 얼음 위에 둔다. 상층액은 200μl의 피펫 팁을 이용하여 조심스럽게 수집하고, 몇몇의 튜브로부터 나온 상층액은 풀(pool)되고 얼음위에 둔다. 이 상층액은 "간기 세포질" 또는 "IS15"추출물이다. 이 세포 추출물은 얼음상에서 튜브마다 20μl 부피로 배분되고, 액체 질소상에서 순간 냉동되고 -80℃에서 사용시까지 저장된다. 달리 말하면, 세포 추출물은 얼음상에서 초원심분리튜브에 둔다(예 를 들면, SW55 Ti 로토를 위해 고정됨; Beckman). 만약 필요하면, 튜브는 상층에 미네랄 오일로 덮는다. 추출물은 4℃에서 3시간 동안 200,000Xg로 원심분리하여 IS15추출물을 포함한 막 소포체를 침전시킨다. 원심 분리의 끝에 오일을 제거한다. 상층액을 조심스럽게 수집하여, 필요하다면 합하고, 얼음에서 냉각된 1.5ml튜브에 놓아둔다. 이 상층액은 "IS200" 또는 "간기 사이토졸릭"추출물로 부를 수 있다. 추출물은 배분되고 IS15에서 설시한 것처럼 냉동된다.

바람직하다면, 추가적인 핵 인자에 의해 추출물은 보충된다. 예를 들면, 핵은 재구성 추출물이 유도된 세포형의 세포들로부터 또는 어떤 세포형의 세포로부터 정제되고, 상기와 같이 소니케이션에 의해 용균된다. 핵 인자는 아지테이션 하에서 0.15-800mM 농도의 NaCl 또는 KCl을 포함하는 핵 완충액에서 10-60분간 추출된다. 용균물은 추출되지 않는 요소들을 침전시키기 위해 원심분리된다. 관심의 대상이 되는 추출 인자들을 포함하는 상층액은 NaCl 또는 KCl을 제거하기 위해 투석된다. 투석된 핵 추출물은 배분되고 냉동 보관된다. 이 핵 추출물은 다양한 농도로 재구성을 위해 세포에 더해지기에 앞서, 상기한 것처럼 전체 세포 추출물에 더해진다.

간기 추출물은 난모 세포나 웅성(雄性) 생식 세포와 같은 생식 세포로부터 준비될 수도 있다. 예를 들면, 난모 세포는 상기한 바처럼 활성화되고, 간기에 진입하도록 하기 위해 5시간 동안 배양한다. 그리고 나서 난모 세포는 용균 완충액으로부터 EDTA가 생략되는 것을 제외하면 실시예2에서 메타페이즈Ⅱ의 난모 세포 추출물에서 나타난 것처럼 처리된다. 웅성(雄性) 생식 세포는 실시예2에서처럼 준 비될 수 있다.

세포 추출물의 대체물로서 재구성 배지를 하나 이상의 자연 발생 또는 재조합 인자(DNA 메틸트랜스퍼레이즈, 히스톤 디아세틸레이즈, 히스톤, 프로타민, 핵 라민, 전사 인자, 활성 인자, 억제자, 염색질 리모델링 단백질, 성장 인자, 인터류킨, 싸이토킨, 또는 다른 호르몬들과 같은 핵산이나 단백질)를 완충액과 같은 용액에 첨가함으로써 형성될 수도 있다. 바람직하게는 하나 이상의 인자는 난모 세포 또는 줄기 세포에 하나 이상의 인자는 특이적이다.

배지에서의 세포의 재구성

침투된 세포는 상기한 간기 재구성 배지 또는 100-1000세포/μl농도에서 실시예2에 나타난 유사분열 재구성 배지 중 하나에서 재현탁된다. ATP발생 시스템 및 GTP는 상기한 것과 같은 추출물에 첨가되고 추출물로부터 인자들이 세포로 들어가서 활성 있는 세포핵 업테이크(uptake) 또는 인자의 염색체 결합을 증진시키기 위해 30-37℃에서 2시간까지 반응을 진행시킨다. 재구성된 세포는 800Xg에서 원심분리되고, 재현탁에 의해 워싱되며, PBS에서 400Xg에서 원심분리된다. 세포는 20-30%의 태아 송아지 세럼(FCS), 2mM CaCl₂를 포함하는 RPMI1640, 또는 2mM CaCl₂를 포함하는 MEM배지에서 재현탁되고, 세포막의 리실링(resealing)을 위해 정규의 세포 배양기에서 37℃에서 1-3시간 동안 배양된다. 그리고 나서, 세포들은 따뜻한 일반 배지(10%FCS)로 워싱되고 표준화된 배양 환경을 이용하여 더 배양된다.

용액 대신 커버슬립(coverslip)상에서 침투된 세포를 재구성 하는 대체 방법

이와는 달리, 세포의 핸들링을 최소화하고 세포의 원심분리를 없애기 위해 커버슬립에 놓아두면서 침투시킬 수 있는데 그 결과 세포의 생존율이 최대가 된다. 세포(예를 들면, 섬유아세포)는 RPMI1640에서 16mm-폴리 -L-라이신-코팅된 커버슬립에서 12-웰 플레이트내에서 50,000-100,000세포/커버슬립이 되도록 자라게 한다. 세포들은 정규압에서 37℃, 50분간 Ca⁺⁺이 없는 행크스 밸런스드 염용액(Gibco-BRL)내에서 200ng/ml 스트렙토라이신O에서 침투되어진다. 바람직하다면, 이 환경하에서 침투된 세포의 비율이 프로피디움(propidium) 요오드화물에 기초하여 측정될 수 있다. 스트렙토라이신O가 흡출되는 단계; 커버슬립을 80-100μl의 재구성 배지로 덮는 단계;및 세포를 CO₂대기하에서 37℃에서 30분에서 1시간 배양하는 단계이다. 바람직하게는 재구성 배지가 ATP발생 시스템 및 각 ATP, CTP, GTP 및 UTP 1mM를 포함한다. 세포질막을 리실링(resealing)하기 위해 세포는 20-30%의 태아 송아지 세럼(FCS), 2mM CaCl₂를 포함하는 RPMI1640, 또는 2mM CaCl₂를 포함하는 α-MEM배지가 웰에 첨가되고, 세포는 37℃에서 2시간 동안 배양된다.

세포의 침투 및 리실링(sealing)에 대한 다양한 스트렙토라이신D의 처리의 효과

침투되고 리실링되는 세포의 비율을 측정하기 위해 스트렙토라이신O 배양의 도스 및 시간 적정이 수행되었다(표1). 세포의 침투는 스트렙토라이신O 처리 끝부분에 0.1μg/ml의 DNA 염색 프로피디움 인산화물의 흡수를 통해 평가된다. 리실링은 이와 유사하게 분리된 집단의 세포에서 리실링 처리의 끝에 평가된다.

	침투(permeabilization)		리실링(resealing)
ng/ml SLO	N	%침투+/-sd	N	%리실드+/-sd
0	563	1+/-2.8	560	89.9+/-4.9
100	404	48.6+/-4.2	810	86.1+/-8.3
200	548	79.2+/-1.4	478	84.9+/-1.5
500	495	88.7+/-1.6	526	87.6+/-0.5
1000	425	84.9+/-0.7	544	86.4+/-1.4
2000	315	96.6+/-2.2	425	10.7+/-1
4000	200	99+/-1.4	200	11.2+/-5.3

<스트렙토라이신O(SLO)-처리된 송아지 섬유아세포의 침투 및 리실링>

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스트렙토라이신O에 의해 침투되고 유사 분열 추출물에 노출된 소의 섬유아세포의 생육력 평가

0 또는 500ng/ml의 스트렙토라이신O에 의해 침투되고 리실링된 세포 또는 스트렙토라이신O에 의해 침투되고, 유사분열 추출물에 30 또는 60분간 노출된 뒤 리실링된 세포의 어팝토시스(apoptosis)를 평가하기 위해 튜넬(TUNEL) 분석이 실시되었다. 튜넬 양성 세포는 어팝토시스(세포 죽음)가 진행중인 세포이다. 그 결과, 스트렙토라이신O 자체는 어팝토시스를 유도하지 않는 것으로 보여진다(표 2). 스트렙토라이신O 처리 후 유사분열 세포 추출물에 60분간 노출된 세포는, 30분의 경우와는 달리, 튜넬 분석에 따르면 10%정도의 어팝토시스 증가를 유도한다. 이러한 결과에 기초하여, 추출물내에서 공여체 세포를 30분간 배양하는 것은 60분의 경우보다 바람직하다. 30분의 배양은 면역형광 분석법에 의해 세포를 분석할 경우, 시험된 세포핵의 대다수(~90%, n>100)에서 핵막 파괴를 유발하는 것으로 보여진다.

추가적으로, 추출물에서 배양되어 정제되고 염색질 치환 방법을 위해 실시예4에 기술한 것처럼 완충액 N 또는 TL-HEPES 세포핵 및 수크로오즈에서 워싱된 세포는 어팝토시스를 진행하지 않는다(순서대로, 2/34 및 3/47 튜넬 양성).

ng/ml SLO	N	%TUNEL pos.+/-sd
0 - 투입 세포	400	7.7+/-1.7
0	800	6.5+/-0.17
500	892	7.3+/-3.41
0 + 추출물 30'	400	5.5+/-1.12
500 + 추출물 30'	400	8.2+/- 1.1
0 + 추출물 60'	784	6.5+/-4.0
500 + 추출물 60'	691	16.9+/-1.9

<스트렙토라이신O 및 스트렙토라이신O와 추출 처리된 소 섬유아세포의 튜넬 분석>

이 클로닝 방법을 위해 선택된 침투법은 38℃에서 30분간 500ng/ml SLO에서 하는 것이다. 이 재구성된 세포를 둘러싸고 있는 본래 막을 형성하기 위한 리실링 방법은 2mM CaCl₂를 포함하는 α-MEM배지에서 2시간 동안 배양하는 것이다.

재구성된 난모 세포의 형성, 활성화, 배양 및 이식

재구성된 세포는 표준화된 기술 또는 전기 융합 기술을 이용하여 수용체 난모 세포에 삽입하거나 융합된다(예를 들면, 미국 특허 4,944,384 alc 5,945,577). 예를 들면, 세포들은 표준 세포 배지에서 수크로오즈 존재 또는 비존재하에서 난모 세포의 옆에 놓여질 수도 있고, 주입 피펫(injection pipeette)으로 끌려들어갈 수도 있다. 그리고 나서 피펫은 세포를 용균하기 위해 수회 흡출되고, 난모 세포로 주입될 세포핵으로부터 세포질 요소를 제거한다. 그 뒤 재구성된 난모 세포는 활성화되고, 배양되고, 클론된 포유 동물을 생산하기 위해 실시예2 설시된 것과 같은 방법으로 모체 수용체 포유 동물로 이식된다.

실시예4: 두개의 신규한 클로닝 방법을 이용한 보다 완벽한 핵 재구성의 증거: 염색질 치환(CT) 및 스트렙토라이신O - 치환(SLOT)

실시예1에 도시된 것처럼, 전통적인 핵이식 전핵 단계 배아에서는 불완전한 핵 개조 및 재구성이 일어난다. 이러한 발견은 전핵 핵이식 배아의 핵막에서의 라민 A/C의 어젬블리 및 NuMA 면역 형광 라벨링에 의해 뒷받침된다. 보다 완전한 핵 재구성은 실시예2에 나타나는 염색질 매스 치환 방법 및 실시예3에 나타나는 세포 침투 및 재구성 방법(SLOT와 같은 것도 언급)을 이용하여 달성된다.

유사 분열 추출물에서의 배양된 소 섬유아세포의 시험관내 핵 파괴의 평가 및 그 결과물인 염색질의 특성화

소의 섬유아세포의 유사분열로부터 얻어진 추출물은 지속적으로 투입된 정제 섬유아세포 세포핵의 ~80%까지를 파괴한다(도5.). 메타페이즈Ⅱ 난모 세포(즉, 수정에 앞서 자연적으로 메타페이즈Ⅱ에 들어간 난모 세포)로부터 나온 추출물 또한 성공적으로 핵파괴를 지지한다(30분안에 75%의 세포핵).

투입 간기 세포핵(도6A), MS15 유사 분열 추출물(도6B)에서 배양된 세포핵으로부터 획득된 염색질 매스, 및 난모 세포 추출물에서 배양된 세포핵으로부터 나온 염색질 매스(도6C)는 다음 마커들: 라민B 수용체(LBR), 내핵막의 막간 단백질(막 마커); 라민 B, 세포핵 라미나에 편재하는 요소; 라민 A/C, 분화된 세포에만 있고 배아에는 없는 핵 라미나의 체세포-특이적 요소; NuMA핵 매트릭스의 주된 요소; AKAP95, 세포핵의 PKA-부착 단백질; 및 DNA 의 발현을 위해 조사되어진다. 체세포 사이토졸릭 MS15 및 난모 세포 MS15추출물은 조사된 염색질 단위의 ~100%에서의 라 민 B, 라민 A/C, LBR, 및 NuMA의 용해를 유도했다(도6B 및 6C). 기대한 바와 같이, AKAP95는 앞서서 인간 체세포(Collas등의 J.Cell Biol. 147:1167-1180,1999년)에서 관찰한 바와 같이 염색체와 상호 작용을 하고 있다. 이 결과는 또한 미성숙 염색질 응축 단계에서 소 핵이식 배아에 대한 실시예1에서도 나타난다. 유사 분열 추출물 및 난모 세포 추출물 모두, 전통적인 핵이식, 핵주입(NI), 또는 염색질 치환(도 7)등의 사용된 방법을 불문하고 본래의 난모 세포에서만큼 핵막의 용해가 효율적으로 증진되는 것으로 나타났다(도 7).

염색질 치환에 의한 전핵 배아 및 핵이식에 의한 전핵 및 핵주입에 의한 배아의 비교

핵치환 배아의 염색질 치환을 발생시키기 위해, 시험관내에서 성숙 후 약18-20시간 후에 성숙한 난모 세포의 핵을 제거한다. 간기 소 태아 섬유아세포로부터 나온 세포핵을 여기서 기술된 소 태아 세포로부터 만들어진 MS15 유사 분열 추출물내에서 배양한다. 핵막 파괴가 일어나고 염색질 응축이 완결되기 이전에 추출물로부터 염색질 매스를 분리해낸다. 상세하게는, 염색질이 간기의 염색체 응축(0%로 지정) 및 유사 분열에서의 염색체 최대 수준의 응축(100%로 지정)의 50-60%정도 응축되었을 때, 분리해낸다. 이 단계에서, 염색질 매스의 각각의 염색체는 구별되지 않고 염색질 매스의 가장자리는 불규칙한 모양을 갖는다. 유사 분열 추출물로부터 분리된 염색질 매스는 탈핵된 난모 세포와 함께 2.5%의 수크로오즈를 포함하는 TL HEPES의 마이크로드롭에 놓아둔다. 실질적인 주입 과정으로부터 난모 세포에 가해지는 손상을 최소화하기 위해 완충액에 수크로오즈가 더해진다. 염색질 매스는 Burleigh Pizeo Drill(Fishers, NY)으로 경사진 마이크로인젝션 피펫을 사용함으로써 난모 세포로 주입된다(70V 폭에서 75ms동안 주기 2Hz). 2, 3, 4, 또는 5펄스와 같은 전형적인 다중 펄스가 수행되는데 그 결과 난모 세포로의 주입을 위해 바늘이 충분히 침투된다. 주입 후에, 난모 세포는 삼투 쇼크를 최소화하기 위해, 수크로오즈 안에서 TL HEPES의 시리얼 다일루션에서 워싱된다. 후기 성숙(post maturation, 난모 세포가 난소에서 수집되어 성숙 배지에 들어간지 28-30시간 후, 또한 염색질 매스를 주입한지 최소한 2시간 후) 28-30시간 후에, 재구성된 난모 세포 및 처녀 생식에 의해 발생한 대조군은 4분간(Cal Biochem, San Diego, CA) 칼슘 이노포어(5μM)에 의해 활성되고, 이미 설명한 바와 같이( Liu등의 Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998년) ACM배양 배지[100mM NaCl, 3mM KCl, 0.27mM CaCl₂, 25mM NaHCO₃, 1mM 소디움 락테이트, 0.4mM 파이루베이트, 1mM L-글루타민, 3mg/ml BSA(지방산 없음), 1% BME 아미노산, 및 1% MEM 비필수 아미노산(Sigma)]에서 10μg/ml의 사이클로헥사미드 및 2.5μg/ml의 사이토칼라진D(Sigma)에 의해 활성화된다. 각 웰에 25-50개의 배아를 넣고, 5%의 CO₂대기안에서 38.5℃에서 배양한다. 바람직하다면, 칼슘(예를 들면, ~0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 3.5, 5mM, 또는 그 이상의 CaCl₂)이 주입 후의 난모 세포의 리실링을 위해 ~0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 또는 그 이상의 시간 동안 첨가될 수 있다. 리실링된 난모 세포는 상기와 같은 표준화된 기술을 이용하여 수용체 난모 세포에 이식되었을 때 난모 세포를 둘러싸고 있는 본래의 층 때문에 생존력이 증가될 수 있다.

추출물에서 배양되었던 간기 소 섬유아세포를 제외하고는 염색질 치환 배아를 위한 상기한 핵 주입 배아는 염색질 대신에 난모 세포에 주입된다. 핵이식 배아는 실시예1의 고전적인 방법에 의해 생산된다.

핵 치환, 핵 주입 및 염색질 치환에 의한 전핵은 예상한 바와 같이 라민B(도 8A, 붉은 라벨) 및 AKAP95(도 8B, 붉은 라벨)를 리어젬블한다. 핵 이식 및 핵 주입 전핵 또한 체세포 특이적 요소(도 8A, 녹색 라벨), 상기 핵이식 배아에서 기록된 결과와 일치하게 라민A/C, 체세포 특이적 요소(도 8A, 녹색 라벨)를 리어젬블한다. 그러나, 염색질 치환 전핵 및 대조군 처녀 생식 전핵은 라민 A/C(도 8A)를 리어젬블리하지 않는다. 핵 이식 전핵은 또한 대부분의 염색질 치환 또는 처녀 생식 전핵과는 달리 NuMA(녹색 라벨)을 포함한다(도 8B, 녹색 라벨). 처녀 생식핵 및 염색질 치환핵의 일부는 상기한 것처럼 낮은 수준으로 NuMA를 어젬블한다.

염색질 치환에 따른 시험관내 디스어젬블리는 대조군인 처녀 생식 전핵과 형태적으로 유사한 전핵을 나타낸다. 이와 반대로, 핵 이식 및 핵 주입 전핵은 체세포-특이적 요소(라민 A/C 및 광범위한 라벨링)를 포함한다. 이 결과는 고전적인 핵 이식 또는 핵 주입 이후 불완전한 핵 재구성이 일어남을 지시한다. 상기한 바와 같이, 핵이식 및 핵주입 전핵에서 검출된 라민A/C는 전핵단계에서 새로이 전사된 라민으로부터 발생한 것이다. 핵 라민 및 가능한 NuMA는 전사 조절 및 인간의 질병에 관여하기 때문에 전통적 핵이식 전핵에서 라민 A/C의 존재는 부적절한 기능적 재구성을 지시한다고 할 수 있다. 본 발명자는 시험관내 핵의 디어젬블리 및 염색질 치환이 전통적인 핵이식 또는 핵 주입보다는 보다 정상적인 전핵을 생산한 다는 것을 결론지었다.

재구성 공여체 공급원으로서 염색질 매스 또는 침투된 세포를 이용한 클로닝 효율

실시예3에 나타난 바와 같이, 스트렙토라이신 O-유도에 의한 1차 소 태아의 섬유아세포의 침투, 침투된 세포의 재구성 배지(예를 들면, 유사 분열 추출물)에서의 30분간의 배양, 배지에서의 2mM의 칼슘을 이용한 섬유아세포의 리실링, 및 표준화된 세포 융합 기술을 이용한 난모 세포의 염색질의 치환을 포함하는 "SLOT"으로 나타내어지는 신규한 클로닝 절차가 개발되었다.

이 클로닝 방법에서, 스트렙토라이신O의 바이알(Sigma S-5265; 4℃에서 분말 형태로 25,000단위가 저장됨)은 400μl H₂O에 용해된 뒤 잘 섞인다. 모든 내용물은 15ml코니칼 튜브로 옮겨진 뒤, 3.6ml H₂O가 첨가되고 볼텍싱에 의해 혼합된다. 10μl로 배분하여 스톡 농도 0.062U/μl로 -20℃로 동결 보관한다. 세포들은(~100,000) 100μHBSS(Gibco BRL, cat. No.14170-120)에서 현탁된다. 이 세포들은 콘플루언트(confluent)를 형성하고, 따라서 ~80-85%의 세포가 G1단계에 있으며, 다른 세포들의 대다수는 S단계에 있다. 스트렙토라이신O 스톡 용액(5μl)(즉, 500ng/ml 또는 0.3U/μl 최종 농도)이 첨가되고, 혼합액은 38℃에서 25분간 물 욕조에서 배양된다. 배양하는 동안 세포가 현탁된 상태를 유지하도록 하기 위해 튜브를 부드럽게 2-3회 탭핑한다. 상온 PBS(200μl)가 첨가되고 부드러운 피펫팅으로 잘 혼합한다. 세포들은 탁상용 원심분리기에서 상온에서 5분간 5,000rpm에서 원심분리된다. 모든 상층액은 제거된다. 이 단계에서, 펠렛은 작아서 육안으로 명확하지 않을 수 있다. ATP발생 시스템(40μl, "MS15''을 갖는 유사 분열 추출물이 첨가되고 잘 혼합된다. 원심분리를 하는 동안 40μl 추출물의 바이알 하나를 해동하여 추출물을 준비하고, 1.2μl의 ATP발생 시스템을 첨가한 뒤, 잘 혼합하여 상온에서 배양한다. 이 유사 분열 추출물은 상기 구획에서 염색질 매스를 생성시킬 때 사용된 것과 동일한 추출물이다. 이 혼합물은 30분간 물 욕조에서 38℃에서 배양하고, 때때로 그 튜브를 부드럽게 탭핑한다. 상온의 리실링 배지(RM, 500μl)(CaCl₂를 2mM에서 1M스톡까지 보충한 완전 α-MEM[Bio-Whittaker]배지)를 첨가한다. 튜브를 열어 놓은 채, 세포들이 현탁 상태를 유지하도록 때때로 탭핑하면서 2시간 동안 CO₂배양기에서 배양한다. 세포들은 탁상용 원심 분리기로 5,000rpm에서 상온에서 5분간 원심분리된다. 세포 펠렛은 상온의 TL HEPES( Bio-Whittaker, cat. No.04-616F)에서 재현탁되고, 다른 900μl TL HEPES가 첨가된다. 표준 절차를 이용하여 핵 치환이 수행된다. 앞 구획에서 설명한 것처럼 염색질 치환을 위해 난모 세포는 활성화되고 수용체 포유 동물로 옮겨진다.

이 SLOT방법을 이용하여 형성된 배아의 발생 및 본 발명의 염색질 치환은 표3에 요약되어 있다. 배반포 단계로의 발생은 전통적인 핵치환 배아에 비교하여 SLOT배아에서 약간 느리다. 배반포 단계에서의 SLOT 및 핵치환의 차이는 SLOT의 경우보다 핵치환의 경우에 세포주기의 G₁단계에서 더 많은 확률의 세포를 사용하는 효과때문일 수 있다. 생존율은 침습성 절차(invasive procedure)에서 예상된 것처럼, 염색질 치환 배아에서 더 낮다.

임신 40일째의 핵치환 배아 및 SLOT 배아의 임신율은 거의 비슷하다(표 3).임신 40일에서 60일 사이의 생존은 전통적인 방법에 의해 생산된 핵치환 배아보다 SLOT배아에서 더 높다.

	치환된 수	생존한 수(%)	전핵 단계의 수(%)	분할세포수 (No.Cleaved)(%)	배반포단계의 수(%)	임신 40일째 수(%)	40-60생존/전체(%)
CT	1503	736(49)	355(23.5)	81(5.3)	3	0	ND
SLOT	1884	1802(97)	ND	575(30.5)	156(8.3)	24/65(37)	7/10(70)
세포핵이식	1821	1682(92)	ND	764(41.9)	235(12.9)	39/103(36)	8/16(50)

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< 염색질 치환(CT), 핵 이식, 및 SLOT-생산 소 배아 클론의 발생>

상기한 바와 같이, 염색질 치환 배아의 생존율은 수용체 포유 동물에 삽입되기 이전에 재구성 난모 세포가 리실링할 수 있도록 몇시간 동안 칼슘에서 배양될 수 있다. SLOT배아의 생존율은 세포들이 배지로부터 꺼내질 때와 난모 세포와 융합할 때까지의 시간을 감소시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 스트렙토라이신O에서의 배양, 재구성 배지에서의 배양, 및/또는 리실링배지에서의 배양의 시간 길이는 감소될 수 있다. 상세하게는, 리실링 배지에서의 배양은 거의 한 시간 또는 그 이하로 감소될 수 있다. 이 감소된 리실링 처리는 상기한 것처럼 2mM칼슘 존재하에서 또는 리실링 확률을 높이기 위해 보다 높은 농도의 칼슘(예를 들면, ~2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 또는 6.0mM 칼슘)의 존재하에서 수행될 수도 있다. 난모 세포와의 융합 이전에, 세포 처리 시간을 단축함으로써, 세포들이 S단계로 덜 진입하게 되고 재구성 난모 세포의 생존율을 감소시키는 DNA복제가 시작되기 어렵게 된다.

실시예5: 키메릭 포유 동물의 생성 방법

포유 동물을 클로닝하는 전통적인 방법을 이용한 경우에 일어나는 많은 자발적인 유산은, 태아 자체의 문제보다는 태반의 이상에 기인한 것으로 생각된다. 따라서, 거의 한 기원으로부터 나온 태반 조직(예를 들면, 시험관내 수정, 자연 발생 또는 처녀 생식 활성 배아)과 주로 다른 기원(예를 들면, 핵 치환 배아)으로부터 나온 태반 조직을 이용한 키메릭 배아를 생산하는 방법이 발전되었다. 시험관내 수정, 자연 발생, 처녀 생식에 의한 활성에서 나온 세포로부터 주로 유도된 태반 조직을 갖는 키메릭 배아는 자연 발생 태반 조직과 더 비슷할 수 있고, 그 결과 살아 있는 자손의 생산을 증가시킨다. 바람직하게는, 자손 세포들의 대다수는 핵치환 배아로부터 나온 세포에서 유도되었고, 따라서 실질적으로 핵치환 태아를 생성하기 위해 사용된 공여체 세포의 게놈과 동일하게 된다.

그러한 한 방법에서, 시험관내 수정된 배아의 세포들은 전통적인 핵치환 방법 및 여기 기술된 신규한 방법을 이용하여 생산된 응축 배아의 막간(periphery)으로 주입된다. 대체될 수 있는 방법에서, 시험관내 수정된 배아의 전응축 단계의 세포들은 각 배아로부터 나온 세포들이 단일 키메릭 배아의 생산을 인식할 수 있는 환경하에서 본 발명의 클로닝 방법 중 하나(예를 들면, 염색질의 재구성 또는 공여체 세포로서 침투된 세포)를 이용하여 생산된 전응축 배아로부터 나온 세포와 함께 배양된다(Wells 및 Powell, Cloning 2:9-22, 2000년). 두 방법에서, 시험관내 수정된 배아로부터 나온 세포들은 우선적으로 태반 조직으로 들어가고, 핵치환 방 법에 의해 나온 세포들은 태아 조직으로 들어간다. 이러한 방법들은 이하에서 기술한다.

G1섬유아세포의 분리

핵치환 배아를 생산하기 위한 공여체 세포로서의 G1섬유아세포의 분리를 위해, 상기 묘사한 "쉐이크 오프(shake off)"방법이 사용된다(Kasinathan 등의 Nature biotech, 19:1176-1178, 2001년). 간단히 말해, 분리 24시간 전에, 5.0X10⁵개의 세포들이 10ml의 α-MEM+FCS를 포함하는 100mm조직 배양 플레이트에 도말된다. 다음날, 플레이트는 PBS로 워싱되고, 배양 배지는 분리 전에 1-2시간 동안 교체된다. 그리고 나서 플레이트를 Vortex-Genie2(Fishier Scientific, Houston, TX, medium speed)에서 30-60초간 흔들어 준다. 배지가 제거되고, 500Xg로 5분간 스핀한 후, 250μl의 α-MEM+FCS에 재현탁한다. 새로 분열한 세포 더블릿으로 구성된 이 세포 현탁액은 세포질 다리(cytoplasmic bridge), 일부 단일 세포 및 메타페이즈 및 아나페이즈 세포에 의해 부착되어 있다. 세포질 다리에 의해 부착되어 있는 세포 더블릿은 핵 치환을 위한 공여체 세포로 사용되어 진다.

핵이식, 활성, 및 배아 세포의 배양

분리된 G1 섬유아세포를 이용한 핵 치환 절차는 상기한 것과 같이 필수적으로 수행된다(Cibelli등의 Nature Biotech. 16(7):642-646,1998년; Kasinathan등의 Biol. Reprod. 64(5):1487-1593, 2000년). 시험관내 성숙한 난모 세포는 성숙 약18-20시간 이후 탈핵되고, 염색체 제거는 UV광선 하에서 비스벤자마이드(Hoechst 33342, Sigma) 라벨링에 의해 확인된다. 이러한 세포질 공여체 세포 커플릿(couplet)은 20ms동안의 2.4kV/cm 단일 전기 펄스(Eleectrocell manipulator 200, Genetronics, San Diego, CA)를 이용하여 융합된다. 성숙 이후 30시간이 지난 시점에 재구성 난모 세포 및 대조군은 4분간 칼슘 이노포어(5μM)에 의해 활성화(Cal Biochem, San Diego, CA)되고, 이미 설명한 바와 같이( Liu등의 Mol. Reprod. Dev. 49:298-307, 1998년; Presicce등의 Mol.Reprod. Den.38:380-385, 1994년) 6시간 동안 ACM배양 배지[100mM NaCl, 3mM KCl, 0.27mM CaCl₂, 25mM NaHCO₃, 1mM 소디움 락테이트, 0.4mM 파이루베이트, 1mM L-글루타민, 3mg/ml BSA(지방산 없음), 1% BME 아미노산, 및 1% MEM 비필수 아미노산(Sigma)]에서 10μg/ml의 사이클로헥사미드 및 2.5μg/ml의 사이토칼라진D(Sigma)에 의해 활성화된다. 활성화 후에, 난자들은 HEPES로 완충된 햄스터 배아의 배양 배지(HECM-HEPES, 114mM NaCl, 3.2mM KCl, 2mM CaCl₂, 10mM 소디움 락테이트, 0.1mM 소디움 파이루베이트, 2mM NaHCO₃, 10mM HEPES, 및 1%BME 아미노산;Sigma)로 5회 워싱하고 마우스 배아 섬유아세포 및 0.2ml의 배아 시험 미네랄 오일로 덮인 0.5ml의 배아 배양 배지를 포함하는 4웰 조직 배양 플레이트에 둔다. 25-50배아들이 각 웰에 놓여지고, 38.5℃에서 5% CO₂대기에서 배양한다. 4일째, 10% FCS가 배양 배지에 첨가된다. 7일 및 8일째, 배반포 단계로의 발생이 기록되었다.

소의 시험관내 수정

소의 시험관내 수정된 배아를 생산하기 위해, 앞서 기술한 시험관내 수정이 수행되었다(Collas등의 Mol,Reprod. Dev. 34:224-231, 1993년). 45% 및 90%의 스펌 TL스톡을 갖는 이소토닉 페르콜 경사가 준비된다(Parrish등의 Theriogenology 24:537-549, 1985년). 단일 소로부터 나온 동결-해동 소 정자는 경사의 상층에 놓여지고 30분간 700 X g(6.37인치 팁 직경을 사용한 2000rpm)에서 원심분리된다. 펠렛에서 정자의 농도는 결정되고, 수정의 최종 농도가 10⁶sperm/ml가 되는 것과 같은 스펌TL(스펌 TL스톡, 1mM파이루베이트, 6mg/ml BSA, 및 1%PS)로 희석한다. 후기 성숙 22시간에 난모 세포는 TL HEPES로 3회 워싱되고, 6mg/ml BSA, 0.2mM 파이루베이트, 20uM 페니실라민, 10uM 하이포타우린, 1mM 에피네피린(Leibfried등의 J. Reprod. Fertil. 66:87-93, 1982년) 및 0.004ug/ml의 헤파린을 포함하는 Nunc 웰에서 480ul의 수정 TL에 넣어 둔다. 최종 농도 10⁶sperm/m를 50개의 난모 세포에 주입하기 위해 정자 20ml가 첨가된다. 배양 환경은 상기 핵 치환의 경우와 동일하다. 수정율은 전핵 발생 단계와 비교하여 90%이상이다.

키메릭 핵치환 배아

8세포기에서 시험관내 수정된 배아(6-12배반포들)는 응축에 앞서 거의 수정 96시간에 수확된다. 투명대는 프로티에즈(protease, TL- HEPES에서 3mg/ml)로 제거된다. 투명대의 용해는 해부 현미경을 이용하여 조심스럽게 모니터링된다. 투명대가 최초로 분해되는 것으로 나타나는 때(~20분), 배아는 제거되고, TL-HEPES로 워싱된 후 행크 밸런스드 염용액을 포함하는 30mm 페트리 디쉬에 옮겨져서, 30분간 37.5℃로 배양된다. 이러한 전응축 배아로부터 나온 배반포들은 100mm 페트리디쉬안에서 미네랄 오일하에서 TL-HEPES의 50μl마이크로드롭으로 옮겨진다. 8-16세포기 4일째의 핵치환 배아들이 선택되고, 배반포를 포함하는 동일한 마이크로드롭으로 옮겨진다. 이 핵치환 배아는 전응축 배아(8세포기) 및 응축 배아(16세포기)를 포함한다. 그리고 나서 4-6배반포들이 표준 마이크로매니퓰레이션 기술을 이용하여 빗면 마이크로 피펫(직경 35μm)으로 핵치환 배아로 옮긴다. 배반포를 옮긴 후에, 기술한 바와 같이 배아들은 핵치환 배아를 형성하기 위해 배양한다.

7일 및 8일째, 키메릭 배아의 배반포로의 발생이 평가된다. 또한 배반포는 핵치환 배아로 주입되기 이전에 시험관내 수정된 배아로부터 나온 세포에 첨가되는 막 염색약 DiⅠ의 존재하에서 분석된다. 세포들은 4일째 라벨링되고 7일째 관찰된다. 이 염료는 최초에 염색된 세포들의 자손이 몇회 세포 분열하는 동안에도 유지가 되므로, 몇회의 세포 분열뒤에도 키메릭 배아가 분석되어질 수 있도록 한다. 이 분석에 기초하여, 시험관내 수정된 배아로부터 나온 세포들은 키메릭 배아로 삽입된다. 바람직하다면, 표준화된 방법(예를 들면, Ausubel등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, New York, 14.7.1-14.7.12페이지, 1995년)으로 시험관내 수정 배아 또는 핵치환 배아에 특이적인 탐침(probe)으로 형광 원위치 혼성화(fluorescence in situ hybridization, FISH)가 수행될 수 있다. 이 FISH분석은 시험관내에서 또는 배아로부터 나온 자손들내에서 배양되는 동안 키메릭 배아(예를 들면, 몇 퍼센트의 세포들이 세포내 매스에 포함되는지 및 몇 퍼센트가 포배벽 초기 외층(trophectoderm)에 포함되는지)에서 각 배아로부터 유도된 세 포의 분포를 결정하는데 사용될 수 있다. 이와는 달리, 녹색 형광 단백질과 같은 탐색 유전자(reporter gene)가 배아로부터 나온 세포에 첨가되고 태반 및 다양한 키메릭 배아의 태아 조직으로 포함되는 것을 모니터링하는데 사용될 수 있다.

배아 치환

7일 및 8일째, 핵치환 배아 및 키메릭 핵치환 배아로부터 나온 그레이드1 및 2의 핵치환 배반포는 6일 및 7일째 싱크로나이즈된 수용체 어린 암소(heifer)로 옮겨진다. 수용체는 Lutalyse(Parmacia&Upjohn, Kalamazoo, MI)의 단일 주입을 이용하여 싱크로나이즈시키고 에스트러스(estrus)를 검출한다. 수용체는 배아 전이 30일 및 60일째 수태산물(conceptus)의 존재에 대한 초음파 홀로그래피에 의해, 30일 이후는 직장 촉진(rectal palpatiom)에 의해 조사된다. 키메릭 배아 및 형질전환 소 섬유아세포와 난모 세포의 융합에 의해 생산된 대조군 배아의 임신 40일째 결과는 표4에 비교되어 있다. 이러한 결과는 40일째까지 더 많은 수의 키메릭 배아가 생존함을 나타낸다.

이식	대조군 핵치환체		키메릭 핵 치환체
	수용체의 수	40일째 수태	수용체의 수	40일째 수태
첫번째	2	1	2	1
두번째	6	1	4	3
전체	8	2(25%)	6	4(67%)

<배아 전이 및 수태>

키메릭 배아의 생산을 위한 대체 방법

상기 키메릭 배아를 생산하는 방법의 변형을 위해 표준화된 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 자연 발생된 배아가 외과적으로 포유 동물(예를 들면, 소)로 부터 분리되거나 난모 세포는 표준 기술을 이용하여 처녀생식적으로 활성화되고 시험관내 수정된 배아 대신에 사용될 수 있다. 바람직하다면, 태아 조직으로 포함되는 주입된 세포 및 이들의 자손의 비율을 줄이기 위해 시험관내 수정, 자연 발생, 또는 처녀 생식으로 활성화된 배아(예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5세포)로부터 나온 몇 세포들이 핵치환 배아로 주입될 수 있다. 이와는 달리, 더많은 세포(예를 들면, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 그 이상의 세포)가 태아 조직으로 포함되어 버리는 주입된 세포 및 이들의 자손의 비율을 증가시키기 위해 주입될 수 있다. 나아가, 다른 세포 단계의 배아로부터 나온 세포들이 사용될 수도 있다. 예를 들면, 시험관내 수정, 자연 발생, 또는 처녀 생식으로 활성화된 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 또는 그 이후 단계의 배아들이 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512 또는 그 이후 단계의 핵치환 배아에 주입될 수도 있다. 주입된 세포 및 핵치환 배아는 같은 세포 단계 또는 다른 단계일 수 있다. 한 구현예에서, 시험관내 수정, 자연 발생, 또는 처녀 생식으로 활성화된 배아는 핵치환 배아에 비해, 나아가 포배벽 초기 외층(즉, 우선적으로 태반 조직을 형성하는 배아의 세포 외각)에 비스듬히 주입된 경우와도 비교하여 플로이디(ploidy, 예를 들면, 4n의 DNA함량)를 증가시킨다. 바람직하다면, 투명대의 전부 또는 일부는 주입 전에 제거된 경우보다 주입된 세포의 주위를 둘러싼 채로 있을 수 있다.

다른 바람직한 방법에서, 각 배아로부터 나온 세포들이 단일 키메릭 배아를 생산하는 것을 인식할 수 있도록 하는 환경하에서 시험관내 수정, 자연 발생, 또는 처녀 생식 배아로부터 나온 세포들이 전응축 또는 응축으로부터 나온 세포들과 함 께 배양된다(Wells 및 Powell, Cloning 2:9-22, 2000년). 시험관내 수정, 자연 발생, 또는 처녀 생식 배아로부터 나온 세포들이 우선적으로 포배벽 초기 외층에, 결과적으로는 태반 조직에 분포하고, 핵치환 배아로부터 나온 세포들은 우선적으로 세포내 매스 및 최종적으로 태아 조직에 분포하는 것이 기대된다. 두 배아로부터 나온 세포들은 동일 단계에 있거나 다른 단계에 있을 수 있고, 각 배아로부터 나온 동일 또는 다른 수의 세포들은 결합하여 배아 집합체를 형성할 수도 있다.

그밖의 구현예들

전술한 구현예로부터, 여기 기술된 발명들을 다양한 용도 및 환경에서 사용할 수 있도록 다양화 및 변형이 될 수 있음은 자명하다. 또한 그러한 구현예는 이하의 청구항의 범위안에 있다.

이 명세서에 언급된 모든 간행물들은, 각 독립 간행물 또는 독립 특허가 특별하고 개별적으로 참고 문헌으로 포함된 것으로 나타나 것처럼, 동일한 범주로 참고 문헌에 의해 여기 포함된다.

Claims (42)

1. (a) 침투된 세포를 상기 침투된 세포의 염색질 응축 및 핵막 파괴를 허용하는 재구성 배지 내에서 인큐베이션하여 재구성 비인간 포유동물 세포(reprogrammed non-human mammalian cell)를 형성하는 단계로서, 여기서 상기 침투된 세포는 그의 세포막 또는 일부 세포막 상에 구멍을 갖는 비인간 세포이고, 상기 재구성 배지는 유사분열 세포의 추출물인 단계;

   (b) 상기 재구성된 세포를 핵을 지니거나 탈핵된 비인간 난모 세포에 삽입하여 핵 치환 난모 세포를 형성하는 단계; 및

   (c) 상기 비인간 핵치환 난모 세포 또는 상기 핵치환 난모 세포로부터 형성된 배아를 상기 핵치환 난모 세포 또는 상기 배아가 태아로 발생할 수 있는 환경 하에서 비인간 숙주 포유동물의 자궁 내로 전이(transfer)하는 단계를 포함하는 비인간 포유동물을 클로닝하는 방법.
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4. 제 1항의 방법에 있어서, 염색질 매스는 상기 재구성 배지 안에서 상기 침투된 세포를 배양한 것으로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 재구성된 세포는 상기 재구성된 세포의 막(membrane)이 리실링(resealing)이 가능한 환경에서 배양된 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 재구성된 세포는 상기 핵치환 난모 세포로 삽입되기 이전에 상기 재구성 배지로부터 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 태아는 살아있는 자손으로 발생(develop)하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1항의 방법에 있어서, (b)단계로부터 나온 상기 핵치환 난모세포는 세포 분열 가능한 환경하에서 배양되고, 그 결과로 생산된 세포들 중 하나가 1회 이상 재클로닝될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 침투된 세포 및 상기 핵치환 난모 세포는 동일한 종으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유 동물은 젖소(cow), 양(sheep), 집토끼(rabbit), 돼지(pig), 마우스(mouse), 백쥐(rat), 또는 버팔로 (buffalo)인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 10항의 방법에 있어서, 상기 인간을 제외한 포유 동물은 젖소인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 침투된 세포는 섬유아세포, 상피 세포, 신경 세포, 표피 세포, 각막 세포, 조혈 세포, 멜라닌 세포, 연골 세포, B림프구, T림프구, 적혈구, 마크로파지, 모노싸이트, 근육 세포, 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 태아 세포, 태반 세포 또는 배아 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1항의 방법에 있어서, 상기 침투된 세포는 암컷의 생식계의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13항의 방법에 있어서, 상기 침투된 세포는 유선(mammary gland), 난자(ovarin cumulus), 자성과립(granulosa), 또는 난관 세포(oviductal cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1항의 방법에 있어서, (b) 단계로부터 수득된 상기 핵치환 난모 세포는 라민 A, 라민 C 또는 NuMA (nuclear mitotic Apparatus protein) 단백질을, 동일한 종의 대조군 난모 세포에 의해 발현되는 대응 수준 보다 5배 미만으로 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
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