HUT62912A

HUT62912A - Process for producing antisense inhibitors of hiv virus

Info

Publication number: HUT62912A
Application number: HU923538A
Authority: HU
Inventors: David J Ecker
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-05-11
Filing date: 1991-04-22
Publication date: 1993-06-28
Also published as: JPH06500005A; NO924258D0; EP0527916A4; FI925103A; US5166195A; EP0527916A1; BR9106440A; WO1991018004A1; JPH0832242B2; ATE181960T1; AU651593B2; DE69131422D1; AU7882691A; DE69131422T2; US5591600A; KR0149680B1; CA2082631A1; HU9203538D0; FI925103A0; NO924258L

Description

A találmány tárgyát gyógyhatású anyagok képezik, különös tekintettel a humán immunhiányos tüneteket okozó vírus (HÍV) által okozott fertőzések kezelésére. A találmány tárgyát olyan oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok tervezése, szintézise és alkalmazása képezi, amelyek gátolják a HÍV és egyéb retrovírusok aktivitását.

A találmány szerinti anyagokkal és módszerekkel a HÍV RNS aktivitását befolyásolni lehet. A találmány általában az antiszensz vegyületek területére vonatkozik, azaz olyan vegyületekre, amelyek képesek egy RNS nukleotid szekvenciájával specifikusan hibridizálódni. Az előnyös megvalósítási módok szerint a találmány olyan módszerekre vonatkozik, amelyekkel a betegség terápiás kezelését el lehet érni, és szabályozni lehet a gének expresszióját kísérleti rendszerekben.

Az jól ismert, hogy a test állapotát emlősökben, főleg a fertőző betegség állapotában, fehérjék befolyásolják. Az ilyen fehérjék, akár közvetlenül hatva, akár enzimatikus funkciójukon keresztül, nagymértékben hozzájárulnak emberek és állatok számos betegségéhez. A klasszikus gyógyhatású anyagok általában az ilyen fehérjékkel való kölcsönhatásra koncentrálnak, azzal az erőfeszítéssel, hogy befolyásolják betegséget okozó vagy betegséget fokozó funkciójukat. Újabban azonban olyan kísérleteket is tettek, hogy ezeknek a fehérjéknek a termelődését befolyásolják, olyan molekulákkal való kölcsönhatások révén, amelyek a szintézisüket irányítják, azaz az intracelluláris RNS-sel való kölcsönhatás révén. A fehérjék termelődésének befolyásolásától azt remélték, hogy olyan terápiás hatásokat kapnak, amelyek maximális hatással és

minimális mellékhatásokkal rendelkeznek. Ezeknek a terápiás megközelítéseknek általában az a célja, hogy befolyásolja, vagy más módon modulálja a nem kívánt fehérje képződéséhez vezető gén expresszióját.

Egy bizonyos mértékig elfogadott módszer a specifikus gén expressziójának gátlására az antiszensz” megközelítés, ahol egy specifikus, megcélzott hírvivő RNS, mRNS szekvenciával komplementer oligonukleotid analógokat használnak. Számos kutató írt le ilyen kísérleteket. Ide tartozó összefoglaló például C.A. Stein and J.S. Cohen, Cancer Research, 48, 2659-2668 (1988); J. Walder, Genes and Development, 2., 502-504 (1988); C.J. MarcusSekura, Analytical Biochemistry, 172, 289-205 (1988); G. Zon, Journal of Protein Chemistry, 6, 131-145 (1987); G.Zon, Pharmaceutical Research, 5, 539-549 (1988); A.R. Van dér Krol,

J.N. Mól and A.R. Stuitje, BioTechniques, 6, 958-973 (1988); és D.S. Loose-Mitchell, TIPS, 9, 45-47 (1988). Mindegyik említett összefoglalóban megtalálható az általános antiszensz elméletre és az előző technikákra vonatkozó háttér információ.

Korábban számos kutató tett kísérletet arra, hogy különböző antiszensz megközelítések útján gátolja a HIV-et. Zamecnik és munkatársai foszfodiészter oligonukleotidokat használtak, a reverz transzkriptáz primer helye ellen, valamint a donor/akceptor hely illesztése ellen irányítva [P.C. Zamecnij, J. Goodchild, Y. Taguchi, P.S. Sárin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83., 4143 (1986)]. Goodchild és munkatársai a transzláció iniciációjának helye ellen, a cap hely ellen, a poliadenilezési szignál ellen, az 5' ismétlődő régió ellen, valamint a gag és pol gének közötti hely ellen irányított foszfodiészter vegyületeket készítettek [J. Goodchild, S.Agrawal, M.P. Civeira, P.S. Sárin, D.Sun, P.C. Zamecnik, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 5507 (1988)]. A Goodchild vizsgálatban a legnagyobb aktivitást akkor érték el, ha a poliadenilezési szignál ellen irányították a molekulákat. Agrawal és munkatársai kiterjesztették Goodchild és munkatársai vizsgálatait, oly módon hogy kémiailag módosított oligonukleotid analógokat használtak, amelyeket a cap és a donor/akceptor hely illesztése ellen irányítottak [S. Agrawal, J. Goodchild, M.P. Civeira, A.H. Thornton, P.S. Sárin, P.C Zamecnik, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 7079 (1988)]. Ezeknek egy része átfedett a HÍV TAR régiójával, de nem mutatott komoly hatást. Ezt az oligonukleotid analógot arra sem tervezték, hogy a HÍV TAR régiójával lépjen kölcsönhatásba. Agrawal és munkatársai oligonukleotid analógokat használtak, amelyeket a donor/akceptor hely illesztése ellen irányítottak a HÍV fertőzés leküzdése céljából, a fertőzés korai stádiumában levő sejtekben és a krónikusan fertőzött sejtekben [S.Agrawal, T. Ikeuchi, D.Sun, P.S. Sárin, A.Konopka, J. Maizei, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, £6, 7790 (1989)].

Sárin és munkatársai is használtak kémiailag módosított oligonukleotid analógokat, a cap és a donor/akceptor illesztés helye ellen irányítva [P.S. Sárin, S.Agrawal, M.P. Civeira, J. Goodchild, T. Ikeuchi, P.C. Zamecnik, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85 7448 (1988)]. Zaia és munkatársai szintén használtak oligonukleotid analógot a HÍV gátlására, amely egy akceptor illesztési hely ellen irányult • · ·

- 5 [J.A. Zaia, J.J. Rossi, G.J. Murakawa, P.A. Spallone, D.A. Stephens, B.E. Káplán, Journal of Virology, 62, 3914 (1988)], Matsukura és munkatársai olyan oligonukleotid analógokat szintetizáltak, amelyek a rév gén mRNS-ének transzlációs iniciációs pontja ellen irányultak [M.Matsukura, K.Shinozuka, G.Zon et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 7706 (1987); R.L. Letsinger, G.R. Zhang, D.K. Sun, T. Ikeuchi, P.S. Sárin, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 86 6553 (1989)]. Móri és munkatársai egy másik oligonukleotid analógot használtak ugyanazon régió ellen irányítva, mint amely ellen Matsukura irányította az oligonukleotidját [K.Mori, C. Boiziau, C. Cazeneva et al., Nucleic Acids Research, 17 8207 (1989)]. Shibara és munkatársai egy akceptor illesztési hely ellen, valamint a reverz transzkriptáz primer kötő helye ellen irányított oligonukleotid analógokat használtak [S.Shibara, S. Mukai, H.Morisava, H. Nakashima, S. Kobayashi, N. Yamamoto, Nucleic Acids Research, 17, 239 (1989)]. Letsinger és munkatársai olyan oligonukleotid analógokat szintetizáltak és teszteltek, amelyek konjugált koleszterolt tartalmaztak és egy illesztési hely ellen irányították [K. Móri, C. Boiziau, C. Cazenave et al., Nucleic Acids Research, 17, 8207 (1989)]. Stevenson és Iversen polilizint konjugáltak olyan oligonukleotid analógokhoz, amelyeket egy donor illesztési helye és a tat gén első exonjának 5' vége ellen irányítottak [M.Stevenson, P.L. Iversen,

J.Génsebészet. Virol., 70, 2673 (1989)]. Buck és munkatársai nemrégiben leírták a HÍV mRNS és DNS ellen irányozott foszfátmetilezett DNS oligonukleotidokat [H.M. Buck, L.H. Koole. M.H.P.

• · · ·· ···« · , • · ·

- 6 van Gendersen, L. Smith, J.L.M.C. Green, S. Jurriaans and G. Goudsmit. Science, 248, 208-212 (1990).

Ezek a korai kísérletek a HÍV megcélzására főleg az oligonukleotid analógban alkalmazott kémiai módosítások természetére koncentráltak. Jóllehet mindegyik publikációban leírták, hogy valamelyes sikert értek el a vírus egyik-másik funkciójának gátlásában, mégsem találtak egy általános terápiás sémát a HÍV és más retrovírusok megcélzására. Ennek megfelelően létezik, és még a továbbiakban is létezni fog egy állandó igény az olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok tervezésére és szintetizálására, amelyek alkalmasak a hatásos, terápiás antiszensz kezelésre.

Ezt a hosszú ideje fennálló igényt nem sikerült kielégíteni a korábbi, a HÍV és más retrovírusok illetve egyéb vírusok oligonukleotid terápiájára irányuló munkákkal. Mások nem tudtak olyan cél-helyeket azonosítani, amelyeken az antiszensz oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok terápiásán hatásosak, egy ésszerű felhasználási ráta mellett.

A találmány tárgya kezelési eljárást nyújtani humán megbetegedésekre, főleg a humán immunhiányos tünetegyüttest okozó vírus és más humán retrovírusok ellen.

A találmány tárgya továbbá olyan molekulák, főleg oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok előállítása, amelyek elrontják a mRNS szerkezetét.

A jelen találmány tárgya továbbá a gének expressziójának megváltoztatása a sejtekben.

A találmány tárgya továbbá az RNS-ek másodlagos szerkezetének befolyásolása, oligonukleotidok vagy • · · • · «

• · • · • · · « •·♦· ···· oligonukleotid analógok segítségével.

A jelen találmánynak ezek, és egyéb tárgyai a leírásból lesznek nyilvánvalók.

A korábbi kísérletekben, amelyek a HÍV ellen irányított antiszensz molekulákra irányultak, a munka arra irányult, hogy néhány különösen fontos fehérje szintézisét gátolják, amelyekről azt gondolták, hogy létfontosságúak a fertőzés sikere szempontjából. A jelen találmány során ugyanezt a célt (vírus gén expresszió gátlása) sikerült elérni, de nagyobb, terápiás szempontból szignifikáns aktivitást kaptunk, oly módon hogy a HIV-en vagy más retrovírus RNS-en levő bizonyos helyek ellen irányítottuk az antiszensz molekulákat. A jelen találmányban olyan RNS szerkezeteket találtunk célpontoknak, amelyeknek fontos biológiai szerepük van. Azt meghatároztuk, hogy ezeknek az RNS szerkezeteknek a megcélzása az oligonukleotidokkal és oligonukleotid analógokkal a kulcs a hatásos antiszensz terápiához.

Mostanában fedezték fel, hogy azok a vegyületek, amelyek specifikusan kötődnek a tat RNS szerkezethez és megzavarják a tat transz-inaktivációt, a HÍV fertőzésben terápiás hatású anyagként szerepelhetnek. Szándékunk szerint az összes HÍV törzs a jelen találmány oltalmi körébe tartozik. Jóllehet a különböző HÍV törzsekben különböző tat szekvenciák fordulhatnak elő, a jelen találmány alkalmazható a HÍV különböző törzseire, azáltal hogy módosítjuk az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg szekvenciáját, hogy komplementálja különböző törzsek szerkezetét, a jelen találmány kitanításai alapján.

A jelen találmányban gének expressziójának

- 8 befolyásolására alkalmas módszert írunk le. A megcélzott RNS-t, vagy azt a sejtet, amely ezt tartalmazza, olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely az RNS-nek legalább egy részével lép kölcsönhatásba. A gén általában olyan gén, amelyről feltételezik, hogy egy szervezetben megbetegedett állapotot képes létrehozni, tipikusan vírus vagy retrovírus gén, jóllehet más fertőző szervezet is megtámadható így, és így olyan terápiás módszerek kidolgozásához vezethet, amely során kóros állapotokat kezelünk úgy, hogy oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat adunk be olyan állatoknak, amelyekről feltételezzük, hogy vírus vagy retrovírus fertőzésben szenvednek.

Mostanában fedezték fel, hogy olyan oligonukleotidok és oligonukleotid analógok tervezhetők, főleg retrovírusok, például HÍV ellen, amelyek hatékonyan elnyomják a fertőzést. A HIV-re számos olyan szekvenciát találtak, amelyek hatékonyak, és a szakterületen jártas szakember könnyen talál másokat. Ezek a szekvenciák az első, gyakorlatban is hatásos antiszensz szekvenciák, amelyekről igazolták, hogy a HÍV tat régióját gátolják, és így HÍV ellenes gyógyszerek kidolgozásához vezethetnek. Tehát a jelen találmány tárgyai olyan oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, amelyek a HÍV tat mRNS-ének legalább egy részéhez képesek kapcsolódni. Ezeknek az oligonukleotidoknak illetve oligonukleotid analógoknak a szekvenciája az alábbi lehet:

GGCTCCATTTCTTGCTCTC,

CCATTTCTTGCTCTCCTCTGT,

GCTATGTCGACACCCAATTC,

CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG,

CGGGTCCCCTCGGGATTGGG és

CACCTTCTTCTTCTATTCCT.

Előnyös, ha az oligonukleotidok ás oligonukleotid analógok legalább hat egymás melletti alegységet tartalmaznak ebből a szekvenciából, előnyösebb ha tizet, és még előnyösebb, ha legalább 15-öt tartalmaz. Néhány megvalósítási módnál előnyös, ha az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg lényegében megfelel egy adott szekvenciának. Ez azt jelenti, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg tartalmazza a szekvencia minden alegységét, illetve hatásos helyettesítését. Tehát az olyan helyettesítés, mint az U T helyet, és a hasonlók, megtehetők a vad típusú szekvenciákban. Emellett természetesen más kémiai módosítások is tehetők az oligonukleotidok szerkezetében, anélkül, hogy a találmány oltalmi körétől eltérnénk.

A szekvencia részek bárhova eshetnek az adott szekvencián ahhoz, hogy valószínűleg hatással rendelkezzenek. Az oligonukleotidokat és analógjaikat, például az előnyös foszforotioát analógokat gyógyászatilag elfogadható hordozóban alkalmazhatjuk.

A gének, különösen a tat gén expressziójának módosítására szolgáló módszereket is felfedeztünk. Az ilyen gátlás alkalmazható a gyógyászatban, diagnosztizálásban vagy kutatásban. Tehát a feltehetően a tat gén expressziójával jellemzett betegségben, főleg AIDS-ben szenvedő állatok kezelésére szolgáló módszereket fedeztünk fel, ami abban áll, hogy az állatot a találmány szerinti oligonukleotidokkal vagy • · ·

- 10 oligonukleotid analógokkal hozzuk érintkezésbe.

Az az előnyös, ha az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg képes az RNS résznek legalább hat alegységével képes kötést kialakítani. Sokkal előnyösebb, ha a kötést 8-50 egység alakítja ki, és legelőnyösebb ha a kötést 10-20 alegység alakítja ki.

Az előnyös megvalósítási módok szerint, az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg képes duplex szerkezetet kialakítani az RNS résszel. Jóllehet a kölcsönhatás mechanizmusa nem teljesen ismert, az lehetséges, hogy a gén expresszióját számos különböző módokon befolyásolja.

Az előnyös megvalósítási módok szerint, az az RNS rész, amelyet elrontunk, legalább részben a HÍV tat mRNS-t tartalmazza. A találmány szerinti oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok önmagukban is újnak tekintendők. Tehát azok az oligonukleotidok képezik a találmány tárgyát,amelyek képesek kölcsönhatásba lépni a tat RNS-sel. Tehát azokat az állatokat, amelyek feltételezhetően a betegségben szenvednek, a tat RNS-hez kapcsolódni képes oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe. Pontosabban, a jelen találmány szerinti kezelés hatásos a HÍV fertőzések kezelésére emlősökben, pontosabban emberekben.

Az 1. ábrán a HIV-1 lineáris tat mRNS szekvenciáját láthatjuk.

A 2. ábrán egy sor, a találmány szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg aktivitását láthatjuk, sejttenyészetben vizsgálva a TAR/tat transzaktiválást.

····

- 11 ··· ····

Felfedeztük, hogy lehetséges a HÍV tat RNS aktivitását szabályozni a sejtekben, a tat mRNS-hez kapcsolódni képes oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat juttatva be a sejtekbe. Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok a mRNS normális funkciójával interféráinak, és ezek a módszerek használhatók betegségek, különösen HÍV kezelésére.

A jelen találmány szövegösszefüggésében az oligonukleotid jelentése különböző, egymáshoz kapcsolt, természetes bázisokból és ciklofuranozil csoportokból álló nukleotid egység, amelyet természetes foszfodiészter kötések tartanak össze. Ez a szakkifejezés vonatkozik a természetes molekulákra illetve a szintetikus molekulákra is, amelyek a természetben előforduló alegységekből jöttek létre.

Az oligonukleotid analóg szakkifejezés a jelen találmány szövegkörnyezetében olyan egységekre vonatkozik, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan működnek, de amelyekben olyan részek is vannak, amelyek nem fordulnak elő a természetben. így például az oligonukleotid analógokban lehetnek megváltoztatott cukor egységek vagy cukrok közötti kötések. Példa lehet ezekre a foszforotioát és más kéntartalmú kötés, amelyeknek használata a szakterületen jártas szakember számára ismert. Tartalmazhatnak ezen kívül megváltoztatott bázis egységeket illetve más módosításokat, amelyek a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak.

Bizonyos előnyös megvalósítási módok szerint az oligonukleotidoknak legalább néhány foszfodiészter kötését olyan szerkezetekkel helyettesítjük, amelyek működésükkel javítják a molekulának azt a képességét, hogy a sejtnek abba a régiójába hatoljon be, ahol a módosítandó aktivitású RNS található. Előnyös, ha az ilyen kötés ként tartalmaz. Jelenleg előnyösnek tartják, ha az ilyen helyettesítések foszforotioát kötéseket tartalmaznak. Más kötés lehet az alkil-foszfotioát kötés, Nalkil-foszforamidit kötés, foszforoditioát kötés, alkilfoszf onát kötés, valamint a rövid szénláncú alkil vagy cikloalkil szerkezetek is hasznosak lehetnek. Más előnyös megvalósítási módokkal összhangban a foszfodiészter kötéseket olyan szerkezetekkel helyettesítjük, amelyek lényegében sem nem ionosak, sem nem királisak. A szakterületen jártas szakember számára egyszerű olyan kötéseket kiválasztani, amelyek a jelen találmány gyakorlatában alkalmazhatók.

A jelen találmány néhány megvalósítási módja szerint általában előnyös, ha a kapcsoló cukor egységekben a 2' pozíciót az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg legalább néhány alegységében helyettesítjük. A 2' szubsztituensek lehetnek például 0H-, SH-, F-, -OCH3-, OCN-, OCH_nCH₃-csoportok, ahol is N értéke 1 és 20 között változik. Néhány megvalósítási mód szerint más, hasonló tulajdonságokkal rendelkező szubsztituensek is használhatók.

Az oligonukleotid analógok közé tartozhatnak olyanok is, amelyek legalább néhány módosított bázist tartalmaznak. Azaz olyan purinok és pirimidinek is használhatók, amelyek nem találhatók meg a természetes anyagban. Hasonlóképpen, a nukleotid alegység ciklofuranóz részén is végrehajthatók változtatások, egészen addig, amíg a jelen találmány lényegi részéhez ragaszkodunk.

Az ilyen analógokat legjobban azzal lehet leírni, hogy • · · · • ·

- 13 működés szempontjából felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (illetve a természetes anyagok mintájára szintetizált oligonukleotidokkal), de amelyekben a természetes szerkezetektől egy vagy több helyen eltérés van. A jelen találmányban minden ilyen analógot használhatunk, ameddig hatásosan működnek abból a szempontból, hogy a tat RNS kiválasztott részeihez kötődik.

A jelen találmány szerinti oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok előnyösen 3-100 alegységből állnak. Előnyös, ha ezek az oligonukleotidok illetve oligonukleotid analógok legalább 6 alegységet tartalmaznak, de 8-50 alegység még előnyösebb, és legelőnyösebb, ha 10-20 alegységet tartalmaznak. Az nyilvánvaló, hogy alegység alatt egy bázis és cukor kombinációt értünk, amelyek megfelelő módon kötődnek a szomszédos alegységekhez, foszfodiészter vagy egyéb kötésen keresztül.

A jelen találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok felhasználhatók a diagnosztikában, terápiában, valamint kutatási reagensként és kitben. A gyógyászati alkalmazás során az oligonukleotidot vagy oligonukleotid analógot beadjuk egy állatnak, különösen embernek, főleg olyannak, aki vírus vagy retrovírus fertőzésben, például AIDS-ben szenved.

Általában előnyös, ha a terápiás hatású anyagot belsőleg alkalmazzuk, azaz szájon át, intravénásán vagy intramuszkulárisan. A beadás más formái is hasznosak lehetnek, például a transzdermális, topikális vagy intraléziós. A kúpokba való bedolgozás is hasznos lehet. A jelen találmány szerinti oligonukleotidok és oligonukleotid analógok alkalmazása a megelőzésben is hasznos lehet. Néhány megvalósítási mód szerint a győgyászatilag elfogadható hordozók alkalmazása is előnyös

A jelen találmány szerint az nyilvánvaló, hogy a kötődik” szakkifejezésnek, mivel az egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg és egy RNS rész közötti kölcsönhatásra vonatkozik, számos, rokon jelentése lehet. Tehát a jelen találmány vonatkozik arra az esetre, amikor egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg legalább egy alrészhez kötődik, és ezáltal egy RNS résszel másodlagos szerkezetet hoz létre. Az nyilvánvaló, hogy az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg az RNS résznek legalább egy alcsoportjához fog kötődni a WatsonCrick szabályok szerint, és így lokálisan egy heteroduplexet képez az RNS alrész és az oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg között. Erről a heteroduplex képződésről az a vélemény, hogy az RNS rész másodlagos szerkezetének megváltozását eredményezi.Ennek a hatásnak a pontos mechanizmusa és eredménye nem ismert pontosan, mégis az a vélemény, hogy az RNS rész normál másodlagos szerkezete lassan megváltozik azáltal, hogy az oligonukleotid az RNS rész egy vagy több alcsoportjához kötődik. Mivel az új heteroduplex elektronikus és szférikus tényezői eltérnek a természetben előforduló RNS-től, ezáltal megzavarja annak a funkciónak a hatékonyságát és természetét, amelynek során az RNS-ről fehérje keletkezik. A keletkező defektív fehérje, illetve a fehérje hiánya úgy jelentkezik, hogy az RNS-t kódoló gén expressziója megváltozott.

Röviden, bármely kölcsönhatásról vagy kapcsolódásról oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg és egy másodlagos

szerkezettel rendelkező RNS között úgy gondolják, hogy képes lehet arra, hogy az RNS funkcióját megzavarja, és így befolyásolja annak a génnek az expresszióját, amely az RNS-t kódolja. OLyan tat RNS célpontokat találtunk, amelyek a HÍV aktivitásának nagymértékű lecsökkenését okozzák, ha a célpontnak megfelelő oligonukleotidokat vagy oligonukleotid analógokat adunk be a fertőzött sejtekbe.

Míg nagyszámú különböző oligonukleotidról és oligonukleotid analógról gondoljuk, hogy a jelen találmány gyakorlatában hasznos lehet, előnyösnek tartjuk, ha olyan oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat tervezünk, amelyek legalább hat helyen kapcsolódnak egy másodlagos szerkezettel rendelkező RNS részhez. Más előnyös megvalósítási módokkal összhangban előnyösnek tartjuk azokat az oligonukleotidokat, amelyek 6-30, vagy előnyösen még több, 10-20 alegységgel lépnek kölcsönhatásba. Amint azt a fentiekben tárgyaltuk, jelenleg az a véleményünk, hogy a HÍV tat eleme egy kiváló célpontja a jelen találmány alkalmazásának. Ennek megfelelően azoknak az oligonukleotidoknak vagy oligonukleotid analógoknak a készítését tartjuk előnyösnek, amelyek a HÍV tat régiójának egy vagy több alrészéhez kötődnek.

A jelen találmány tárgyait képezik a gyógyhatású hatóanyagok is. Tehát a jelen találmány szerinti oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok beadása gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagban, igen hasznos lehet. Ez különösen igaz az AIDS kezelésére.

Általában az az előnyös, ha azoknak a betegeknek,

- 16 akikről feltételezzük, hogy az előzőkben említett betegségekben szenvednek, annyit adunk be az oligonukleotidból vagy az oligonukleotid analógból, természetes formájában vagy hordozóban elkeverve, megfelelő kezelési terv szerint, hogy az illető betegség tüneteit csökkentse. Az a szakterületen jártas szakember számára köteles tudás, hogy az ilyen kezelésekhez az optimális dózist és adagolási rendet meghatározza.

A HÍV genomon egy bonyolultan összefüggő kontroll elem csoport határozza meg, hogy a vírus replikálódik-e vagy nyugalmi állapotban marad. A HÍV genomban azonosított kilenc gén közül csak három tartozik a maghoz és a burokhoz [W.A. Haséitiné, Fehérje. Wong-Staal, Scientific American, 52 (1988 október)]. A többi hat gén a virális fehérjék termelődésének szabályozásában vesznek részt. A szabályozó gének úgy működnek, hogy olyan fehérjéket termelnek, amelyek kölcsönhatásba lépnek egy másik, arra alkalmas elemmel, valahol másutt a genomon. A legfontosabb szabályozó gén, amely a replikáció kirobbanásáért felelős, a tat (transz-aktivátor) gén. Az 1. ábrán látható a HÍV tat régiójának cDNS szekvenciája. A tat gén terméke, a tat fehérje úgy működik, hogy kölcsönhatásba lép egy rövid szekvencia résszel, amelyet TAR (transz-hatású reagáló elem) néven ismerünk. A TAR szekvencia a virális hosszú terminális ismétlődő szakaszokban (LTR-ek) van kódolva, és ezért minden egyes HÍV génről készült mRNS-ben megtalálható.

A tat fehérje expressziójának az az eredménye, hogy más HÍV géneknek körülbelül ezerszeresre nő az expressziója, beleértve a tat gént magát is. Ennek az autoregulációs visszacsatoló szabályozásnak a következtében, valamint annak

következtében, hogy a TAR szekvencia minden egyes HÍV transzkriptumban megtalálható, hatalmas mennyiségű virális génexpresszió indul be, amikor a tat gén aktiválódik. A tat gén és a TAR elem közötti kölcsönhatás ezért rendkívül lényeges a HÍV életciklusa szempontjából, és ennek a kölcsönhatásnak a specifikus lerombolása nagyon valószínű hogy megszakítja a vírus szaporodását.

A TAR tartalmú géneknek a tat fehérje általi transzaktiválását újabban alaposan tanulmányozták [Phillip, A. Sharp, Róbert, A. Marciniak, Cell, 59 229 (1989)]. Jóllehet még sokmindent nem ismerünk, két fontos dolog tisztázódott: az, hogy a tat megnöveli a TAR-tartalmú gének expresszióját, oly módon hogy mind a virális mRNS mennyiségét, mind a transzláció hatékonyságát megnöveli, és a TAR egy RNS struktúraként működik, nem pedig DNS struktúraként.

A szokatlan következtetés, hogy a tat megnöveli a TAR-t tartalmazó gének expresszióját, és ezt úgy teszi, hogy az RNS-en levő TAR elemekkel lép kölcsönhatásba, számos megfigyelésből következik [Phillip, A. Sharp, Róbert, A. Marciniak, Cell, 59 229 (1989)]. A transz-aktiválás eléréséhez arra van szükség, hogy a TAR elem közvetlenül a transzkripció iniciációs helye után helyezkedjen el. Emellett még a TAR orientáció függő: ha fordított orientációval építjük be, akkor nem működik.

A legerősebb bizonyítékok arra, hogy a tat kölcsönhatásba lép a TAR-ral mint egy RNS szerkezettel, mutagenézis kísérletekből származnak. A TAR elem vizsgálatára tett erőfeszítéseket az a megfigyelés serkentette, hogy a HIV-1ből származó tat fehérje képes volt transz-aktiválni a HIV-2 TAR • · · · régióját tartalmazó vektorokat. A HIV-2 egy különböző vírustörzs, bár nagyon kis primer homológia van a törzsek TAR régiójában [S.Feng, E.C. Holland, Natúré, 334. 165 (1988)]. Ha azonban a HIV-1 és HIV-2 törzsekből származó TAR szekvenciákat olyan számítógépes programmal elemezzük, amely az RNS másodlagos szerkezetére képes következtetni, akkor kiderül, hogy a helyes TAR RNS szerkezet nélkülözhetetlen a tat transz-aktiváláshoz. Jóllehet a szárak összetétele és hossza különböző volt, mind a négy hurok tartalmazta az IA. és IB. ábrákon látható CUGGG pentanukleotidot. A mutagenezis kísérletekből kiderült, hogy a minden egyes, a hurkot alkotó nukleotid esszenciális a tat-tal való transz-aktiváláshoz, de a szárban a báziscserék bizonyos mértékig tolerálhatok, mindaddig, amíg a szár szerkezet megmarad [S.Feng, E.C. Holland, Natúré, 334 165 (1988)].

A további bizonyítékot arra, hogy a TAR szerkezet RNSként működik, olyan kísérletekből kaptuk, amelyekben a szárhurok szerkezetet határoló szekvenciákat megváltoztatták, versengő másodlagos szerkezeteket hozva létre az RNSendonukleáz, amelyek sokkal stabilabbak voltak mint a természetes TAR szár-hurok szerkezet [B. Berkhout, Cell, 59 273 (1989)]. Ezt úgy hajtották végre, hogy további olyan szekvenciákat juttattak be a TAR-t tartalmazó RNS-be, amelyek antiszensz természetűek voltak a szár-hurok szerkezet 5' oldalára. A módosított TAR szerkezet transz-aktiválása elveszett, jelezve, hogy a TAR szekvenciák egyedül nem elegendőek a transz-aktiváláshoz, hanem ezek a szekvenciák fel kell hogy vegyék a helyes térbeli szerkezetet ahhoz, hogy aktívak legyenek. Ez azt is sugallja, hogy a TAR szár-hurok ···· · ········ · » • · · · · · · szekvenciával szemben antiszensz tulajdonságokkal rendelkező szekvenciák képesek elrontani a természetes RNS szerkezetet.

A TAR szár-hurok szerkezetére közvetlen biokémiai bizonyítékot is szereztek. A TAR RNS-t in vitro enzimátikusan megszintetizálták, és olyan enzimekkel vizsgálták, amelyek szelektíven hasítják az egyszálú RNS szerkezeteket, de nem hasítják a duplex szerkezeteket. Az enzim hasítási mintázat eredményei összhangban vannak a számítógéppel modellezett RNS másodlagos szerkezettel [B. Berkhout, Cell, 59., 273 (1989) ] .

Összefoglalva, erős, és közvetlen bizonyíték van arra, hogy a HÍV tat fehérjéje felelős a nagymértékű virális génexpresszióért, ez úgy jön létre, hogy a TAR szekvenciával lép kölcsönhatásbam amely mindegyik HÍV mRNS transzkriptumban megtalálható, hogy a HÍV TAR szekvenciája RNS szerkezetként működik, és a helyes TAR RNS szerkezet lényeges a tat transzaktiváláshoz .

A TAR és tat funkciót oly módon tanulmányozták, hogy a géneket eltávolították a HÍV genomból, majd izoláltan tanulmányozták őket sejtvonalakban. Vektorokat készítettek, hogy vizsgálják a tat fehérje és a TAR elem közötti kölcsönhatást, a tat gén az SV40 promoterről expresszálódik. A TAR régió egy másik plazmidról expresszálódik, amely egy könnyen vizsgálható riporter génhez kötődik, a méhlepény alkalikus foszfatáz génjéhez (PAP) [P. Henthorn, P. Zervos, M. Raducha, H. Harris, T. Kadesch, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6342 (1988)]. A sejttenyészet modellben mért enzimaktivitásról kimutatták, hogy értéke a TAR régió esszenciális elemeinek jelenlététől, valamint a tat fehérje jelenlététől függ [P.Sharp, R. Marciniak, Cell, 59, 229 (1989);

S. Feng, E.C. Holland, Natúré, 334, 165 (1988); Michael, Fehérje.Laspia, Andrew, P. Rice, Michael, B. Mathews, Cell, 59, 283 (1989) ; J.A. Garcia, D. Harrich, E. Soultanakis, F. Wu, R. Mitsuyasu, R.B. Gaynor, EMBO J., 8, 765 (1989); B. Berkhut, Cell, 89, 273 (1989)]. A vektorrendszer végeredményben rekonstruálja a tat által közvetített TAR transz-aktiválás eseményeit, ami a HIV-vel fertőzött sejtekben játszódik le.

A TAT/TAR transz-aktiválást kényelmesen vizsgálhatjuk oly módon hogy a humán placenta alkalikus foszfatáz génjét (PAP) a HIV-1 LTR szekvencia szabályozása alá helyezzük, amely fokozó, promoter és tar elemeket tartalmaz. Egy, a HIV-1 LTR-t tartalmazó plazmid, a pHIVCAT-0 [S. Feng, E.C. Holland, Natúré, 334, 165 (1988)] tartalmazza a teljes HÍV U3-at és R-t, egészen a +78-as pozícióig (ez egy Hindin hasítási hely). Ennek a plazmidnak HindlII Is AatlI restrikciós enzimek kombinációjával való emésztése felszabadítja a CAT kazettát az SV40 szekvenciákkal együtt, amelyek az RNS processzálásáért felelősek. Egy második plazmid, a pSV2Apap tartalmazza a PAP kazettát eukarióta processzáló szignállal együtt, az SV40 promoter transzkripciós szabályozása alatt [P. Henthron, P. Zervos, M. Raducha, H. Harris, T. Kadesch, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6342 (1988)]. A PAP kazettát és processzáló szekvenciákat HindlII és AatlI restrikciós enzimekkel emésztve hasítjuk ki. Egy új plazmidot készítünk így, a pHIVPAP-ot, azáltal, hogy a pHIVCAT-O-ból származó HIV-1 LTR szekvenciát tartalmazó HindlII/AatlI fragmentet a pSV2Apap plazmidból származó HindlII/AatlI PAP ···· · ···· ···· · · • · · · · · · kazettával ligáijuk.

Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok aktivitásának ellenőrzéséhez a pcDEBtat és pHIVPAP plazmidokat együtt transzfektáljuk HeLa sejtekbe kalcium-foszfát kicsapással. Az oligonukleotidok és oligonukleotid analógok hatását az alábbiak szerint határozzuk meg. A transzfekció előtti napon a HeLa sejteket 1:8 arányban elosztjuk hatlukas lemezekre. Minden egyes lemezen 1 Mg pHIVPAP és 12 Mg pcDEBtat plazmidot precipitálunk 500 μΐ HBS-ben, 32 μΐ CaC12-vel. A CaPŰ4 csapadékot egyformán elosztjuk a hat luk között. Az oligonukleotidokat és oligonukleotid analógokat hasonló módon csapjuk ki, és az ábrákon jelzett koncentrációban adjuk a lukakhoz (a lukakban 1,5 ml táptalaj van). A csapadékot 20 percig hagyjuk érintkezni a sejtekkel, majd komplett táptalajt adunk hozzá, további 4 óra hosszat inkubáljuk. A sejteket ezután 10%-os glicerin HBS-ben készült oldatával sokkoljuk.

óra elteltével a sejteket kinyertük, és fehérje valamint PAP mérést végeztünk Henthorn és munkatársai leírása szerint [P.Henthorn, P.Zervos, M.Raducha, H.Harris, T.Kadesch, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 6342 (1988)], az alábbi módosítások alkalmazásával. A sejteket 0,5 ml TBS-ben gyűjtöttük össze, és ebből 0,1 ml-t használtunk a fehérjeméréshez. A sejtszuszpenziók megmaradt 0,4 ml-ét ülepítjük, majd 50 μΐ TBS-ben szuszpendáljuk. Az endogén foszfatázokat inaktiváljuk, oly módon hogy a sejteket 30 percig 65°C-on tartjuk. A hőstabil humán placenta alkalikus foszfatázt 0,5 ml (5 mmol/1) PNPP-nek sejtszuszpenzióhoz való hozzáadásával vizsgáljuk, majd 37°C-on inkubáljuk. Az aktivitást 30 percenként !

···· ··· · • · határozzuk meg, a reakcióelegyből 150 μΐ-es alikvot részeket használva, majd az abszorbanciát 405 nm-en mérjük, egy Titertek Multiscan MCC\340 ELISA leolvasóval. A PAP aktivitást az összfehérjére vonatkoztatjuk minden egyes lukban. A fehérje koncentrációját BioRad fehérje reagenssel határozzuk meg, mikoris a kinyert sejteknek az 1/5-ét 0,1 μΐ TBS-ben szuszpendáljuk, majd 30 μΐ BioRad fehérjereagenshez adjuk, 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, és az abszorbanciát 595 nm-en mérjük, Titertek lemezleolvasót alkalmazva.

A sejteket az alábbi, foszforotioát gerinccel rendelkező oligonukleotid analógokkal kezeljük:

#	5' 3 '
461	GGCTCCATTTCTTGCTCTCC
462	CATTTCTTGCTCTCCTCTGT
463	GCTATGTCGACACCCAATTC
464	CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG
465	CGGGTCCCCTCGGGATTGGG
466	CACCTTCTTCTTCTATTCCT
kontroll	TGGCATCGAT GCTCA

Az adatokat a 2. ábrán grafikusan mutatjuk be. A PAP aktivitás lényeges csökkenését, ami a HÍV LTR-ről való génexpresszió közvetlen mértéke, a 461, 462, 463, 464 és 465-ös kódszámú oligonukleotid analógokkal értük el. A 466-os és a kontroll oligonukleotidok, amelyeket nem arra terveztünk, hogy komplementer legyen a tat mRNS-sel, nem mutattak jelentős aktivitást ebben a vizsgálatban. A kontroll oligonukleotid ás a

- 23 466-os kódszámú vegyület 1 μπιοΐ/l-es dózisánál megfigyelt j látszólagos PAP aktivitás növekedés valószínűleg a hordozó hatásának a következménye, amivel az oligonukleotidok megkönnyítették a plazmidok felvételét a transzfekció időpontjában. Ez a hatás jelen lehet az aktív oligonukleotidokkal végzett kísérletekben is, de ezeknek a vegyületeknek a specifikus gátló hatása elnyomta.

Claims

1. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az alábbi nukleotid szekvenciák bármelyikének megfelelő, legalább hat egymás után következő alegységből áll:

5' 3'

GGCTCCATTTCTTGCTCTCC

CATTTCTTGCTCTCCTCTGT

GCTATGTCGACACCCAATTC

CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG

CGGGTCCCCTCGGGATTGGG

CACCTTCTTCTTCTATTCCT

2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább tíz, egymás után következő alegységből áll.

3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább tizenöt, egymás után következő alegységből áll.

4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy lényegében az egyik említett szekvenciának felel meg.

5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban van.

6. Oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy a HÍV tat mRNS-nek legalább egy részéhez képes kötődni.

7. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 6

I alegységből áll.

8. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 8-15 alegységből áll.

9. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 8-50 alegységből áll.

10. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy körülbelül 10-20 alegységből áll.

11. A 6. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett résszel heteroduplexet képes létrehozni.

12. Eljárás egy feltételezhetően a HÍV tat génjének expressziójával jellemzett betegségben szenvedő állat kezelésére, azzal jellemezve, hogy az említett állatot egy olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely legalább 6 egymás után következő alegységet tartalmaz, amelyeknek sorrendje bármely alábbi szekvenciának megfelel:

5' 3 '

GGCTCCATTTCTTGCTCTCC

CATTTCTTGCTCTCCTCTGT

GCTATGTCGACACCCAATTC

CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG

CGGGTCCCCTCGGGATTGGG

CACCTTCTTCTTCTATTCCT

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg legalább 10 egymás után következő alegységet tartalmaz.

14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg legalább 15 egymás után következő alegységet tartalmaz.

15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg lényegében megfelel a fenti szekvenciák közül az egyiknek.

16. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg egy gyógyászatilag elfogadható hordozóban van.

17. Eljárás egy feltételezhetően a HÍV tat génjének expressziójával jellemzett betegségben szenvedő állat kezelésére, azzal jellemezve, hogy az említett állatot egy olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely a HÍV tat mRNS-nek legalább egy részével képes kapcsolódni.

18. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 6 alegységből áll.

19. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 15 alegységből áll.

20. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy legalább 8-50 alegységből áll.

21. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid vagy ···« · ···« ···· · · • · ·· · * · oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy körülbelül 10-20 alegységből áll.

22. A 17. igénypont szerinti oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, azzal jellemezve, hogy az említett résszel heteroduplexet képes létrehozni.

23. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg egy gyógyászatileg elfogadható hordozóban van.

24. Eljárás egy feltételezhetően HÍV fertőzésben szenvedő állat kezelésére, azzal jellemezve, hogy az említett állatot egy olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely a HÍV tat mRNS-nek legalább egy részével képes kapcsolódni.

25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett állat egy ember.

26. Eljárás a HÍV tat génje expressziójának modulálására, azzal jellemezve, hogy a HIV-vel fertőzött sejteket vagy állatot olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely legalább 6 egymás után következő alegységet tartalmaz, amelyek sorrendje megfelel bármelyik alábbi szekvenciának:

5' 3 '

GGCTCCATTTCTTGCTCTCC

CATTTCTTGCTCTCCTCTGT

GCTATGTCGACACCCAATTC

CCGCCCCTCGCCTCTTGCCG

CGGGTCCCCTCGGGATTGGG

CACCTTCTTCTTCTATTCCT

27. Eljárás a HÍV tat génje expressziójának

Λ

J modulálására, azzal jellemezve, hogy a HIV-vel fertőzött sejteket vagy állatot olyan oligonukleotiddal vagy oligonukleotid analóggal hozzuk érintkezésbe, amely képes a HÍV tat mRNS-nek legalább egy részéhez kötődni.

A meghatalmazott:

KÖZZÉTÉTELE

PÉLDÁNY

62912

GAUCUGAGCC

Ρ92 03538

1. ábra

1 GGGUCUCUCU GGUUAGACCA 51 AGGGAACCCA CUGCUUAAGC 101 UAGUGUGUGC CCGUCUGUUG 151 CCCUUUUAGU CAGUGUGGAA 201 CUGAAAGCGA AAGGGAAACC 251 UGAAGCGCCC GCACGGCAAG 301 GACAUAGCAG AAUAGGCGUU 351 AGUAGAUCCU AGACUAGAGC 401 CUGCUUGUAC CAAUUGCUAU 451 UGUUUCAUAA CAAAAGCCUU 501 ACAGCGACGA AGACCUCCUC 551 CAAAGCAACC CACCUCCCAA 601 UAGAAGAAGA AGGUGGAGAG 651 AACGGAUCCU UAGCACUUAU 701 CAGCUACCAC CGCUUGAGAG 751 AACUUCUGGG ACGCAGGGGG 801 CUACAGUAUU GGAGUCAGGA 351 UGCCACAGCU AUAGCAGUAG 901 UACAAGGAGC UUAUAGAGCU 951 GGCUUGGAAA GGAUUUUGCU 1001 GUGUGGUUGG AUGGCCUGCU 1051 GCAGCAGAUG GGGUGGGAGC 1101 AAUCACAAGU AGCAACACAG 1151 AAGCACAAGA GGAGGAGGAG 1201 UUAAGACCAA UGACUUACAA 1251 AGAAAAGGGG GGACUGGAAG

CUCAAUAAAG

UGUGACUCUG

AAUCUCUAGC

AGGCGAGGGG

ACUCGACAGA

CCUGGAAGCA

UGUAAAAAGU

AGGCAUCUCC

AAGGCAGUCA

AGAGACAGAG

CUGGGACGAU

ACUUACUCUU

UGGGAAGCCC

GCUAAAGAAU

CUGAGGGGAC

AUUCGCCACA

AUAAGAUGGG

GUAAGGGAAA

AGCAUCUCGA

GUGGGUUUUC

GGCAGCUGUA

GGCUAAUUCA

AGAGCUCUCU

UGGGAGCUCU

CUUGCCUUGA

GUAACUAGAG

AGUGGCGCCC

CGACGCAGGA

CGGCGACUGA

GGAGAGCAAG

UCCAGGAAGU

GUUGCUUUCA

UAUGGCAGGA

GACUCAUCAA

UCCCGAGGGG ACCCGACAGG

CUGGCUAACU

GUGCUUCAAG

AUCCCUCAGA

GAACAGGGAC

CUCGGCUUGC

AUUGGGUGUC

AAAUGGAGCC

CAGCCUAAAA

UUGCCAAGUU

AGAAGCGGAG

GUUUCUCUAU

CCCGAAGGAA

ACAGAÜCCAU UCGAUUAGUG

CUGCGGAGCC

GAUUGUAACG

UCAAAUAUUG

AGUGCUGUUA

AGAUAGGGUU

UACCUAGAAG

UGGCAAGUGG

GAAUGAGACG

GACCUAGAAA

CAGCUAACAA UGCUGAÜUGU

CAGUCACACC

GAUCUUAGCC

CUCCCAACGA

UGUGCCUCUU

AGGAUUGUGG

GUGGAAUCUC

GCUUGCUCAA

AUAGAAGUAG

AAUAAGACAG

UCAAAAAGUA

AGCUGAGCCA

AACAUGGAGC

GCCUGGCUAG

UCAGGUACCU

ACUUUUUAAA

AGACAAGAUA

DANUBIA

Szabadalmi és Védje; Γ I 29.

• · ·

2/3

UCCUUGAUCU GUGGAUCUAC CACACACAAG GCUACUUCCC UGAUUAGCAG AACUACACAC CAGGGCCAGG GAUCAGAUAU CCACUGACCU UUGGAUGGUG CUACAAGCUA GUACCAGUUG AGCCAGAGAA GUUAGAAGAA GCCAACAAAG GAGAGAACAC CAGCUUGUUA CACCCUGUGA GCCUGCAUGG AAUGGAUGAC CCGGAGAGAG AAGUGUUAGA GUGGAGGUUU GACAGCCGCC UAGCAUUUCA UCACAUGGCC CGAGAGCUGC AUCCGGAGUA CUUCAAGAAC UGCÜGACAUC GAGCUUGCUA CAAGGGACUU UCCGCUGGGG ACUUUCCAGG GAGGCGUGGC CUGGGCGGGA CUGGGGAGUG GCGAGCCCUC AGAUCCUGCA UAUAAGCAGC UGCUUUUUGC CUGUACUGGG UCUCUCUGGU UAGACCAGAU CUGAGCCUGG GAGCUCUCUG GCUAACUAAG GAACCCACUG CUUAAGCCUC AAUAAAGCUU GCCUUGAGUG CUGUCAAAAA AAAAAAAAAA AAA ábra

Standard Deviáció 0 uM - 0.29

DANUSI*-—__ (Szabadalmi és Védjegytoda Kft

V *· W’· i