JP2800848B2 - Ｒｎａ二次構造への干渉による遺伝子発現の調節 - Google Patents
Ｒｎａ二次構造への干渉による遺伝子発現の調節Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は治療学の分野、特にヒト免疫不全ウイルス
（HIV）感染の処置に関する。本発明はHIVおよび他のレ
トロウイルスの活性を阻害するオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体の設計、合成および応用に
関する。
（HIV）感染の処置に関する。本発明はHIVおよび他のレ
トロウイルスの活性を阻害するオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体の設計、合成および応用に
関する。
本発明はHIV RNAの活性を調節する物質および方法に
関している。本発明は一般的にはRNAのヌクレオチド配
列に特異的にハイブリダイズできる“アンチセンス”化
合物の分野に関している。好適な実施態様に従うと、本
発明は疾患の治療的処置を達成し、実験系においての遺
伝子発現を制御する方法を対象とする。
関している。本発明は一般的にはRNAのヌクレオチド配
列に特異的にハイブリダイズできる“アンチセンス”化
合物の分野に関している。好適な実施態様に従うと、本
発明は疾患の治療的処置を達成し、実験系においての遺
伝子発現を制御する方法を対象とする。
感染性疾病状態を含む哺乳類においての身体状態のほ
とんどは蛋白質により影響されることは良く知られてい
る。直接作用するにせよまたはその酵素的機能を通して
作用するにせよそのような蛋白質は大部分動物およびヒ
トの多くの疾患の一因となっている。古典的治療学は一
般にそのような蛋白質との相互作用に焦点をあて、それ
らの疾患発生または疾患増幅機能を和らげる努力をして
きた。しかしながら最近それらの合成を指示する分子、
分子内RNA、との相互作用によりそのような蛋白質の実
際の産生を調節する試みがなされてきた。蛋白質の生産
を阻止することによる、最大の効果で最小の副作用を示
す治療結果が達成されることが望まれている。そのよう
な治療法の一般的な目的は望ましくない蛋白質形成を妨
害するまたはさもなくばそれらを導く遺伝子発現を調節
することである。
とんどは蛋白質により影響されることは良く知られてい
る。直接作用するにせよまたはその酵素的機能を通して
作用するにせよそのような蛋白質は大部分動物およびヒ
トの多くの疾患の一因となっている。古典的治療学は一
般にそのような蛋白質との相互作用に焦点をあて、それ
らの疾患発生または疾患増幅機能を和らげる努力をして
きた。しかしながら最近それらの合成を指示する分子、
分子内RNA、との相互作用によりそのような蛋白質の実
際の産生を調節する試みがなされてきた。蛋白質の生産
を阻止することによる、最大の効果で最小の副作用を示
す治療結果が達成されることが望まれている。そのよう
な治療法の一般的な目的は望ましくない蛋白質形成を妨
害するまたはさもなくばそれらを導く遺伝子発現を調節
することである。
ある程度応用されてきた特異的遺伝子発現を阻害する
ための一つの方法は“アンチセンス”法であり、これに
は特定の標的、メッセンジャーRNA、mRNA配列に相補的
なオリゴヌクレオチド類似体が使用される。そのような
試みは多くの研究者により報告されている。適切な総説
として、C.A.Stein ＆ J.S.Cohen,Cencer Research,48
巻,pp.2659−2668（1988）;J.Walder,Gene ＆ Developm
ent,2巻,pp502−504（1988）;C.J.Marcus−Sekura,Ana
l.Biochemistry,172巻,289−295（1988）;G.Zon,Journa
l of Protein Chemistry,6巻,pp131−145（1987）;G.Zo
n,Pharmaceutical Research,５巻,PP539−549（1988）;
A.R.Vander Krol,J.N.Mol,＆ A.R.Stuitje,BioTechniqu
es,６巻,pp958−973（1988）およびD.S.LooseMitchell,
TIPS,9巻,pp45−47（1988）が挙げられる。これらの各
々は一般的アンチセンス説および従来の技術に関しての
基礎的情報を提供している。
ための一つの方法は“アンチセンス”法であり、これに
は特定の標的、メッセンジャーRNA、mRNA配列に相補的
なオリゴヌクレオチド類似体が使用される。そのような
試みは多くの研究者により報告されている。適切な総説
として、C.A.Stein ＆ J.S.Cohen,Cencer Research,48
巻,pp.2659−2668（1988）;J.Walder,Gene ＆ Developm
ent,2巻,pp502−504（1988）;C.J.Marcus−Sekura,Ana
l.Biochemistry,172巻,289−295（1988）;G.Zon,Journa
l of Protein Chemistry,6巻,pp131−145（1987）;G.Zo
n,Pharmaceutical Research,５巻,PP539−549（1988）;
A.R.Vander Krol,J.N.Mol,＆ A.R.Stuitje,BioTechniqu
es,６巻,pp958−973（1988）およびD.S.LooseMitchell,
TIPS,9巻,pp45−47（1988）が挙げられる。これらの各
々は一般的アンチセンス説および従来の技術に関しての
基礎的情報を提供している。
種々のアンチセンス法によりHIVを阻止しようとする
試みが多くの研究者によりなされてきた。Zamecnikおよ
び共同研究者は逆転写酵素プライマー部位およびスプラ
イスドナー／アクセプター部位を標的とするホスホジエ
ステル オリゴヌクレオチドを使用した、P.C.Zamecni
k,J.Goodchild,Y.Taguchi,P.S.Sarin,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 83,4143（1986）。Goodchildおよび共同研究者
は翻訳の開始部位、キャップ部位、ポリアデニル化信
号、５′反復領域およびgagおよびpol遺伝子間の部位を
標的としたホスホジエステル化合物を作製した。J.Good
child,S.Agrawal,M.P.Civeira,P.S.Sarin,D.Sun,P.C.Za
mecuik,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,5507（1988）。G
oodchildの研究において、最大の活性はポリアデニル化
信号を標的化することにより達成された。Agrawalおよ
び共同研究者はキャップおよびスプライス ドナー／ア
クセプター部位をも標的とする化学修飾オリゴヌクレオ
チド類似体を使用することによりGoodchildの研究を発
展させた。S.Agrawal,J.Goodchild,M.P.Civeira,A.H.Th
oruton,P.S.Sarin,P.C.Zamecnik,Proc.Natl.Acad.Sci,U
SA85,7079（1988）。これらの一つの一部はHIV TAR領域
の一部と重なっていたが、模範的効果を持ってはいなか
った。このオリゴヌクレオチド類似体のどれもHIV TAR
領域を妨害するようには設計されていなかった。Agrawa
lおよび共同研究者は初期感染および慢性感染細胞にお
いてのHIV感染を阻害するために、スプライス ドナー
／アクセプター部位を標的とするオリゴヌクレオチド類
似体を使用した。S.Agrawal,T.Ikeuchi,D.Sun,P.S.Sari
n,A.Konopka,I.Maizel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,779
0（1989）。
試みが多くの研究者によりなされてきた。Zamecnikおよ
び共同研究者は逆転写酵素プライマー部位およびスプラ
イスドナー／アクセプター部位を標的とするホスホジエ
ステル オリゴヌクレオチドを使用した、P.C.Zamecni
k,J.Goodchild,Y.Taguchi,P.S.Sarin,Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 83,4143（1986）。Goodchildおよび共同研究者
は翻訳の開始部位、キャップ部位、ポリアデニル化信
号、５′反復領域およびgagおよびpol遺伝子間の部位を
標的としたホスホジエステル化合物を作製した。J.Good
child,S.Agrawal,M.P.Civeira,P.S.Sarin,D.Sun,P.C.Za
mecuik,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,5507（1988）。G
oodchildの研究において、最大の活性はポリアデニル化
信号を標的化することにより達成された。Agrawalおよ
び共同研究者はキャップおよびスプライス ドナー／ア
クセプター部位をも標的とする化学修飾オリゴヌクレオ
チド類似体を使用することによりGoodchildの研究を発
展させた。S.Agrawal,J.Goodchild,M.P.Civeira,A.H.Th
oruton,P.S.Sarin,P.C.Zamecnik,Proc.Natl.Acad.Sci,U
SA85,7079（1988）。これらの一つの一部はHIV TAR領域
の一部と重なっていたが、模範的効果を持ってはいなか
った。このオリゴヌクレオチド類似体のどれもHIV TAR
領域を妨害するようには設計されていなかった。Agrawa
lおよび共同研究者は初期感染および慢性感染細胞にお
いてのHIV感染を阻害するために、スプライス ドナー
／アクセプター部位を標的とするオリゴヌクレオチド類
似体を使用した。S.Agrawal,T.Ikeuchi,D.Sun,P.S.Sari
n,A.Konopka,I.Maizel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,779
0（1989）。
Sarinおよび共同研究者はまたはキャップおよびスプ
ライスドナー／アクセプター部位を標的とするオリゴヌ
クレオチド類似体を使用した。P.S.Sarin,S.Agrawal,M.
P.Civeira,J.Goodchild,T.Ikeuchi,P.C.Zamecnik,Proc.
Natl.Acad.Sci,U.S.A. 85,7448（1988）。Zaiaおよび共
同研究者はHIV阻害のためにスプライス アクセプター
部位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を使用し
た。J.A.Zaia,J.J.Rossi,G.J.Murakawa,P.A.Spallone,
D.A.Stephens,B.E.Kaplan,J.Virol,62,3914（1988）。M
atsukuraおよび共同研究者rev遺伝子mRNAの翻訳開始部
位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を合成した。
M.Matsukura,K.Shinozuka,G.Zon,et al,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84,7706（1987）;R.L.Letsinger,G.R.Zhang,
D.K.Sun,T.Ikeuchi,P.S.Sarin,Proc.Natl.Acad．Sci.US
A 86,6553（1989）。Moriおよび共同研究者はMatsukura
と同じ領域を標的とする異なったオリゴヌクレオチド類
似体を使用した。K.Mori,C.Boiziau,C.Cazenave et a
l.,Nucleic Acids Res.17,8207（1989）。Shibaharaお
よび共同研究者はスプライス アクセプター部位並びに
逆転写酵素プライマー結合部位を標的とするオリゴヌク
レオチド類似体を使用した。S.Shibahara,S.Mukai,H.Mo
risawa,H.Nakashima,S.Kobayashi,N.Yamamoto,Nucl.Aci
ds,Res.17,239（1989）。Letsingerおよび共同研究者は
スプライス部位を標的とするコレステロールと複合させ
たオリゴヌクレオチド類似体を合成し試験した。K.Mor
i,C.Boiziau,C.Cazenave,et al,Nucleic Acids Res,17,
8207（1989）。StevensonおよびIversenはスプライスド
ナーおよびtat遺伝子の最初のエクソンの５′末端を標
的としたオリゴヌクレオチド類似体にポリリジンを結合
させた。M.Stevenson,P.L.Iversen,J.Gen.Virol.70,267
3（1989）。
ライスドナー／アクセプター部位を標的とするオリゴヌ
クレオチド類似体を使用した。P.S.Sarin,S.Agrawal,M.
P.Civeira,J.Goodchild,T.Ikeuchi,P.C.Zamecnik,Proc.
Natl.Acad.Sci,U.S.A. 85,7448（1988）。Zaiaおよび共
同研究者はHIV阻害のためにスプライス アクセプター
部位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を使用し
た。J.A.Zaia,J.J.Rossi,G.J.Murakawa,P.A.Spallone,
D.A.Stephens,B.E.Kaplan,J.Virol,62,3914（1988）。M
atsukuraおよび共同研究者rev遺伝子mRNAの翻訳開始部
位を標的とするオリゴヌクレオチド類似体を合成した。
M.Matsukura,K.Shinozuka,G.Zon,et al,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84,7706（1987）;R.L.Letsinger,G.R.Zhang,
D.K.Sun,T.Ikeuchi,P.S.Sarin,Proc.Natl.Acad．Sci.US
A 86,6553（1989）。Moriおよび共同研究者はMatsukura
と同じ領域を標的とする異なったオリゴヌクレオチド類
似体を使用した。K.Mori,C.Boiziau,C.Cazenave et a
l.,Nucleic Acids Res.17,8207（1989）。Shibaharaお
よび共同研究者はスプライス アクセプター部位並びに
逆転写酵素プライマー結合部位を標的とするオリゴヌク
レオチド類似体を使用した。S.Shibahara,S.Mukai,H.Mo
risawa,H.Nakashima,S.Kobayashi,N.Yamamoto,Nucl.Aci
ds,Res.17,239（1989）。Letsingerおよび共同研究者は
スプライス部位を標的とするコレステロールと複合させ
たオリゴヌクレオチド類似体を合成し試験した。K.Mor
i,C.Boiziau,C.Cazenave,et al,Nucleic Acids Res,17,
8207（1989）。StevensonおよびIversenはスプライスド
ナーおよびtat遺伝子の最初のエクソンの５′末端を標
的としたオリゴヌクレオチド類似体にポリリジンを結合
させた。M.Stevenson,P.L.Iversen,J.Gen.Virol.70,267
3（1989）。
HIVを標的とするこれらの従来の試みはオリゴヌクレ
オチド類似体中に使用された化学修飾の性質に主として
焦点をあてていた。前記の報文の各々はウイルスのある
種の機能の阻害にはある程度成功したと報告しているが
HIVおよび他のレトロウイルスを標的とする一般的治療
設計は見い出されていない。従って有効な治療的アンチ
センスの使用が可能なオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド類似体の設計に対する長い間望まれてきた
要求があって、いまだ続いている。
オチド類似体中に使用された化学修飾の性質に主として
焦点をあてていた。前記の報文の各々はウイルスのある
種の機能の阻害にはある程度成功したと報告しているが
HIVおよび他のレトロウイルスを標的とする一般的治療
設計は見い出されていない。従って有効な治療的アンチ
センスの使用が可能なオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド類似体の設計に対する長い間望まれてきた
要求があって、いまだ続いている。
この長い間の要望はHIVおよび他のレトロウイルスお
よびウイルスに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
療法の分野での従来の技術では満足されていない。他の
ものはアンチセンス オリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体が合理的割合の使用で治療的に有効
である標的部位の同定に失敗している。
よびウイルスに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド
療法の分野での従来の技術では満足されていない。他の
ものはアンチセンス オリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体が合理的割合の使用で治療的に有効
である標的部位の同定に失敗している。
ヒト疾患（特にヒト免疫不全ウイルスおよびヒトレト
ロウイルス）の療法を提供するのが本発明の主たる目的
である。
ロウイルス）の療法を提供するのが本発明の主たる目的
である。
分子、特にmRNAの構造を乱すオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体を提供するのが本発明の別
の目的である。
びオリゴヌクレオチド類似体を提供するのが本発明の別
の目的である。
本発明また別の目的は細胞における遺伝子発現を調節
することである。
することである。
さらに別の目的はRNAの二次構造とオリゴヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド類似体との相互作用を通し
てその構造を妨げることである。
ドまたはオリゴヌクレオチド類似体との相互作用を通し
てその構造を妨げることである。
別の目的は乱されたRNA二次構造の形成によりそのよ
うな干渉を達成することである。
うな干渉を達成することである。
別の目的はヌクレオチド トリプレックスの形成によ
りそのような干渉を達成することである。
りそのような干渉を達成することである。
本発明のこれらおよび他の目的は本明細書を検討する
ことにより明らかにされるであろう。
ことにより明らかにされるであろう。
HIVおよび他のレトロウイルス、ウイルスおよび他の
感染物に対するアンチセンス オリゴヌクレオチドを標
的とする新規の模範例が発見された。HIVを標的とする
アンチセンスの従来の試みは感染の成立に必須と考えら
れているある種の特定のウイルス蛋白質の合成の阻害に
焦点をあててきた。本発明においては同じ到達点（ウイ
ルス遺伝子発現の阻害）が達成され、HIVまたは他のレ
トロウイルスRNA上の特定の部位を標的とすることによ
りより大きな治療上の著しい活性が得られる。本発明に
おいては、重要な生物学的機能を持つ標的RNA構造が鍵
となる標的部位であることが観察された。それらはその
構造構成の程度で妨害を受ける。これらのRNA構造を標
的とすることがオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体によるアンチセンス療法を達成する鍵であ
ることが決定されている。
感染物に対するアンチセンス オリゴヌクレオチドを標
的とする新規の模範例が発見された。HIVを標的とする
アンチセンスの従来の試みは感染の成立に必須と考えら
れているある種の特定のウイルス蛋白質の合成の阻害に
焦点をあててきた。本発明においては同じ到達点（ウイ
ルス遺伝子発現の阻害）が達成され、HIVまたは他のレ
トロウイルスRNA上の特定の部位を標的とすることによ
りより大きな治療上の著しい活性が得られる。本発明に
おいては、重要な生物学的機能を持つ標的RNA構造が鍵
となる標的部位であることが観察された。それらはその
構造構成の程度で妨害を受ける。これらのRNA構造を標
的とすることがオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体によるアンチセンス療法を達成する鍵であ
ることが決定されている。
本発明に従うと、遺伝子の発現を調節する方法が提供
される。これらは、二次構造を形成する副部分を持つ、
遺伝子によりコードされたRNAの一部を選択しまたは同
定することを含んでいる。RANまたはそれを含む細胞を
次に少くともRNAの副部分の一つに結合できるオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させ
る。遺伝子の発現の阻害を達成するためにRNAの二次構
造を崩壊できるように設計されているオリゴヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチド類似体が好適である。遺伝
子は一般的に生物体内で疾病造体を起こすと信じられて
いるものであり、典型的にはウイルスまたはレトロウイ
ルスであり、他の感染性生物体もまたそのようにして攻
撃できる。
される。これらは、二次構造を形成する副部分を持つ、
遺伝子によりコードされたRNAの一部を選択しまたは同
定することを含んでいる。RANまたはそれを含む細胞を
次に少くともRNAの副部分の一つに結合できるオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と接触させ
る。遺伝子の発現の阻害を達成するためにRNAの二次構
造を崩壊できるように設計されているオリゴヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチド類似体が好適である。遺伝
子は一般的に生物体内で疾病造体を起こすと信じられて
いるものであり、典型的にはウイルスまたはレトロウイ
ルスであり、他の感染性生物体もまたそのようにして攻
撃できる。
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
はRNAの一部の少くとも約６つのサブユニットと結合で
きるものが好適である。８から50ユニットと結合できる
ものがより好適であり、約10から約20のサブユニットが
さらにより好適である。
はRNAの一部の少くとも約６つのサブユニットと結合で
きるものが好適である。８から50ユニットと結合できる
ものがより好適であり、約10から約20のサブユニットが
さらにより好適である。
好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド類似体はRNAの一部とデュープレッ
クス構造を形成することができる。もしくは、ある種の
好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド類似体はRNAの選択された部分とトリ
プレックス構造を形成できる。相互作用の機構または確
かになっていないが、多くの方法により遺伝子発現の調
節に影響を与えることが可能である。
オリゴヌクレオチド類似体はRNAの一部とデュープレッ
クス構造を形成することができる。もしくは、ある種の
好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド類似体はRNAの選択された部分とトリ
プレックス構造を形成できる。相互作用の機構または確
かになっていないが、多くの方法により遺伝子発現の調
節に影響を与えることが可能である。
好適な実施態様に従うと、干渉を受けるRNA部分は少
くともHIVのTAR要素の一部を含んでいる。他の好適な実
施態様ではオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド類似体とHIVのCAR要素またはHIVのgag−pol要素との
相互作用を導く。
くともHIVのTAR要素の一部を含んでいる。他の好適な実
施態様ではオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチ
ド類似体とHIVのCAR要素またはHIVのgag−pol要素との
相互作用を導く。
本発明に従ったオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体はそれら自体新規なものであると信じら
れる。従って、二次構造を形成できるRNAの一部と相互
作用のできるオリゴヌクレオチドが包含されている。二
次構造を持つRNAをコードしている遺伝子の発現により
特徴付けられる疾病を持つと疑われる動物の処置方法も
また提供されるであろうことも意図されている。それ
故、疾病過程に関係しているRNAの二次構造に結合でき
るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
と疾病を持つと疑われる動物を接触させる。特に本発明
は哺乳類（特にヒト）におけるHIV感染の処置に有効で
あると信じられる。それ故、HIVのTAR,CARまたはgag−p
ol要素に相互作用するように設計されたオリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド類似体が動物、特ヒト免
疫不全ウイルスに感染されていると疑われているヒトに
投与される。
レオチド類似体はそれら自体新規なものであると信じら
れる。従って、二次構造を形成できるRNAの一部と相互
作用のできるオリゴヌクレオチドが包含されている。二
次構造を持つRNAをコードしている遺伝子の発現により
特徴付けられる疾病を持つと疑われる動物の処置方法も
また提供されるであろうことも意図されている。それ
故、疾病過程に関係しているRNAの二次構造に結合でき
るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
と疾病を持つと疑われる動物を接触させる。特に本発明
は哺乳類（特にヒト）におけるHIV感染の処置に有効で
あると信じられる。それ故、HIVのTAR,CARまたはgag−p
ol要素に相互作用するように設計されたオリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド類似体が動物、特ヒト免
疫不全ウイルスに感染されていると疑われているヒトに
投与される。
他のウイルスの宿主、レトロウイルスおよび他の感染
性疾病も本発明に従った治療に適すると信じられる。
性疾病も本発明に従った治療に適すると信じられる。
図1Aは直線状HIV−1 TAR要素配列を示している。下線
部分はRNAがヘアピン構造に折りたたまれた場合に予想
されるループおよびバルジを暗示している。図1BはHIV
−1 TAR要素のコンピューターにより予測される二次構
造を示している。
部分はRNAがヘアピン構造に折りたたまれた場合に予想
されるループおよびバルジを暗示している。図1BはHIV
−1 TAR要素のコンピューターにより予測される二次構
造を示している。
図２はTAR/tatトランス活性化に関する細胞培養アッ
セイにおける一連のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド類似体の活性を示している。
セイにおける一連のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌ
クレオチド類似体の活性を示している。
図３はTAR/tatトランス活性化に関する細胞培養アッ
セイにおけるオリゴヌクレオチドホスホロチオエート94
Sの活性を示している。
セイにおけるオリゴヌクレオチドホスホロチオエート94
Sの活性を示している。
図４は低用量投与計画でのTAR/tatトランス活性化に
関する細胞培養アッセイにおけるオリゴヌクレオチド
ホスホロチオエート94Sおよび95Sの活性を示している。
関する細胞培養アッセイにおけるオリゴヌクレオチド
ホスホロチオエート94Sおよび95Sの活性を示している。
図５はヌクレオチド7357−7627に対応するHIV−1 CAR
RNA配列の部分直線構造を示している。
RNA配列の部分直線構造を示している。
図６は、HIV−1 CAR要素のコンピューター予測二次構
造を示している。
造を示している。
図７はgag−polフレームシフト領域のコンピューター
予測二次構造およびフレーム シフト化の阻害の可能な
機構である。
予測二次構造およびフレーム シフト化の阻害の可能な
機構である。
図８はgag−polフレームシフト化に対するアンチセン
ス オリゴヌクレオチド干渉を示している。
ス オリゴヌクレオチド干渉を示している。
図９はヌクレオチド トリプレックス形成によるgag
−polフレームシフト化に対する可能な干渉様式を示し
ている。
−polフレームシフト化に対する可能な干渉様式を示し
ている。
RNAの生物学的機能はその構造により媒介される。mRN
Aは一般的にはリボヌクレオチドの配列内に蛋白合成を
指示するための情報を含んでいる直線状分子と考えられ
ている。最近、mRNA中にその機能に重要である多数の二
次および三次構造が明らかにされた。I.Tinoco,Jr,P.W.
Davis,C.C.Hardin,J.D.Puglisi,G.T.Walker,Cold Sprin
g Harb.Symp.Quant.Biol.52、135（1987）。RNA中の二
次構造要素は主として同じRNA分子内の異なった領域間
のワトソン−クリック型相互作用により形成される。重
要な二次構造要素には分子内二重鎖領域、ヘアピンルー
プ、デュープレックス、RNA中のバルジおよび内部ルー
プが含まれる。三次構造要素は二次構造要素が互いにま
たは一本鎖領域と接触してより複雑な三次元構造を産み
出すことにより形成される。
Aは一般的にはリボヌクレオチドの配列内に蛋白合成を
指示するための情報を含んでいる直線状分子と考えられ
ている。最近、mRNA中にその機能に重要である多数の二
次および三次構造が明らかにされた。I.Tinoco,Jr,P.W.
Davis,C.C.Hardin,J.D.Puglisi,G.T.Walker,Cold Sprin
g Harb.Symp.Quant.Biol.52、135（1987）。RNA中の二
次構造要素は主として同じRNA分子内の異なった領域間
のワトソン−クリック型相互作用により形成される。重
要な二次構造要素には分子内二重鎖領域、ヘアピンルー
プ、デュープレックス、RNA中のバルジおよび内部ルー
プが含まれる。三次構造要素は二次構造要素が互いにま
たは一本鎖領域と接触してより複雑な三次元構造を産み
出すことにより形成される。
RANの正確な三次元構造についてはほとんど知られて
いない。しかしながら、最近の多くの研究努力では、一
本鎖、二次および三次構造を含むRNA構造は直線配列で
蛋白質を作る情報を単にコードしているだけでなく重要
な生物学的機能を持っていることを示している。これら
の関係のいくつかは下記の報文に議論されている:I.Tin
oco,Jr.,P.W.Davis,C.C.Hardin,J.D.Puglisi,G.T.Walke
r,Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52,135（1987）;
O.Resnekov,M.Kessler,Y.Aloni,J.Biol.Chem.,264,9953
（1989）;C.Tuerk,P.Gauss,C.Thermes.et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A,85,1364（1988）；およびD.E.Larso
n,B.H.Sells.Mol.Cell.Biochem,74,5（1987）。RNAにお
ける正確な構造情報はないという事実にもかかわらず、
多くの研究者は多数のRNAデュープレックス構造の結合
エネルギーを測定し、RNAの二次構造を予想するのに使
用できる法則の組を導き出した。J.A.Jaeger,D.H.Turne
r,M.Zuker,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,7706（1989）;
D.H.Turner,N.Sugimoto,Aunu.Rev.Biophys.Chem.17,167
（1988）。実験データと連結させてこれらの法則は重要
な生物学的機能を持つRNA構造要素の同定に有用であ
る。
いない。しかしながら、最近の多くの研究努力では、一
本鎖、二次および三次構造を含むRNA構造は直線配列で
蛋白質を作る情報を単にコードしているだけでなく重要
な生物学的機能を持っていることを示している。これら
の関係のいくつかは下記の報文に議論されている:I.Tin
oco,Jr.,P.W.Davis,C.C.Hardin,J.D.Puglisi,G.T.Walke
r,Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.52,135（1987）;
O.Resnekov,M.Kessler,Y.Aloni,J.Biol.Chem.,264,9953
（1989）;C.Tuerk,P.Gauss,C.Thermes.et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A,85,1364（1988）；およびD.E.Larso
n,B.H.Sells.Mol.Cell.Biochem,74,5（1987）。RNAにお
ける正確な構造情報はないという事実にもかかわらず、
多くの研究者は多数のRNAデュープレックス構造の結合
エネルギーを測定し、RNAの二次構造を予想するのに使
用できる法則の組を導き出した。J.A.Jaeger,D.H.Turne
r,M.Zuker,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,7706（1989）;
D.H.Turner,N.Sugimoto,Aunu.Rev.Biophys.Chem.17,167
（1988）。実験データと連結させてこれらの法則は重要
な生物学的機能を持つRNA構造要素の同定に有用であ
る。
天然のRNAの二次構造を乱すまたは干渉するオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を導入する
ことにより細胞中のRNAの活性の細胞が可能であること
が発見された。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド類似体はRNAおよびそれに結合する因子間の普通
の相互作用で干渉する。この方法は疾患、特にHIVおよ
び他のレトロウイルスの処置に使用できる。本発明に従
うと、生物学的に重要な顕著な構造特性を持つ生物RNA
分子に結合する組成物が提供される。本発明はこれらの
構造に結合するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体を用いる。本発明の文脈において、術語オ
リゴヌクレオチドは天然に存在する塩基およびシクロフ
ラノシル基が天然のホスホジエステル結合で結合される
ことにより形成された複数の結合ヌクレオチド単位を意
味している。この術語は実際上、天然に存在する化学種
または天然に存在するサブユニットから形成される合成
化学種を意味している。
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を導入する
ことにより細胞中のRNAの活性の細胞が可能であること
が発見された。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド類似体はRNAおよびそれに結合する因子間の普通
の相互作用で干渉する。この方法は疾患、特にHIVおよ
び他のレトロウイルスの処置に使用できる。本発明に従
うと、生物学的に重要な顕著な構造特性を持つ生物RNA
分子に結合する組成物が提供される。本発明はこれらの
構造に結合するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体を用いる。本発明の文脈において、術語オ
リゴヌクレオチドは天然に存在する塩基およびシクロフ
ラノシル基が天然のホスホジエステル結合で結合される
ことにより形成された複数の結合ヌクレオチド単位を意
味している。この術語は実際上、天然に存在する化学種
または天然に存在するサブユニットから形成される合成
化学種を意味している。
本発明に関連して使用される場合“オリゴヌクレオチ
ド類似体”はオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、
天然には存在しない部分を持つものを意味している。そ
れ故、オリゴヌクレオチド類似体は変更された糖部分ま
たは内部糖結合を持っていてもよい。これらの中の例と
しては本分野で使用することが知られているホスホロチ
オエートおよび他の硫黄含有種がある。それらはまた変
更された塩基単位または本発明の精神に一致する他の修
飾も含んでいてもよい。
ド類似体”はオリゴヌクレオチドと同様に機能するが、
天然には存在しない部分を持つものを意味している。そ
れ故、オリゴヌクレオチド類似体は変更された糖部分ま
たは内部糖結合を持っていてもよい。これらの中の例と
しては本分野で使用することが知られているホスホロチ
オエートおよび他の硫黄含有種がある。それらはまた変
更された塩基単位または本発明の精神に一致する他の修
飾も含んでいてもよい。
ある好適な実施態様に従うと、オリゴヌクレオチドの
ホスホジエステル結合の少くともいくつかは、その活性
が調節されるべきRNAが位置している細胞の領域内へ挿
入する組成物の能力を増強するように機能する構造へ置
換された。そのような結合が硫黄を含んでいるものが好
適である。そのような置換がホスホロチオエート結合を
含んでいるものが現在好適である。アルキル ホスホロ
チオエート結合、Ｎ−アルキルホスホロアミデート、ホ
スホロジチオエート、アルキルホスホネートおよび短鎖
アルキルまたはシクロアルキル構造のような他の結合も
また有用であろう。他の好適な実施態様に従うと、ホス
ホジエステル結合は、ただちに実質的に非イオン性およ
び非キラルである構造に置換される。当業者は本発明の
実施に使用するための他の結合を選択できるであろう。
ホスホジエステル結合の少くともいくつかは、その活性
が調節されるべきRNAが位置している細胞の領域内へ挿
入する組成物の能力を増強するように機能する構造へ置
換された。そのような結合が硫黄を含んでいるものが好
適である。そのような置換がホスホロチオエート結合を
含んでいるものが現在好適である。アルキル ホスホロ
チオエート結合、Ｎ−アルキルホスホロアミデート、ホ
スホロジチオエート、アルキルホスホネートおよび短鎖
アルキルまたはシクロアルキル構造のような他の結合も
また有用であろう。他の好適な実施態様に従うと、ホス
ホジエステル結合は、ただちに実質的に非イオン性およ
び非キラルである構造に置換される。当業者は本発明の
実施に使用するための他の結合を選択できるであろう。
本発明のいくつかの実施態様での使用において、オリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の少く
ともいくつかのサブユニット中の結合糖部分の２′位が
置換されていることが一般的に好適である。従って、O
H,SH,F,OCH3,OCN,OCHnCH3（式中ｎは１から約20であ
る）および類似体の性質を持つ他の置換基による２′置
換がいくつかの実施態様において有用であろう。
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の少く
ともいくつかのサブユニット中の結合糖部分の２′位が
置換されていることが一般的に好適である。従って、O
H,SH,F,OCH3,OCN,OCHnCH3（式中ｎは１から約20であ
る）および類似体の性質を持つ他の置換基による２′置
換がいくつかの実施態様において有用であろう。
オリゴヌクレオチド類似体または少くともある程度修
飾された塩基形を含む化学種を含むことができる。それ
故天然に普通に観察されるもの以外のプリンおよびピリ
ミジンもまた使用できる。同様に、ヌクレオチド サブ
ユニットのシクロフラノース部分上の修飾もまた本発明
の本質的教示内である限りは行うことができる。
飾された塩基形を含む化学種を含むことができる。それ
故天然に普通に観察されるもの以外のプリンおよびピリ
ミジンもまた使用できる。同様に、ヌクレオチド サブ
ユニットのシクロフラノース部分上の修飾もまた本発明
の本質的教示内である限りは行うことができる。
そのような類似体の天然のオリゴヌクレオチド（また
は天然の様式に沿って合成されたオリゴヌクレオチド）
と機械的に変換可能であるが、天然の構造とは一つたま
はそれ以上の相違を持つものとして最も良く説明され
る。そのような類似体はすべて、重要な機能の二次構造
を持つRNAの選択された部分に結合するように有効に機
能する限りは本発明に包含される。
は天然の様式に沿って合成されたオリゴヌクレオチド）
と機械的に変換可能であるが、天然の構造とは一つたま
はそれ以上の相違を持つものとして最も良く説明され
る。そのような類似体はすべて、重要な機能の二次構造
を持つRNAの選択された部分に結合するように有効に機
能する限りは本発明に包含される。
本発明に従ったオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌク
レオチド類似体は好適には約３から約100のサブユニッ
トを含む。そのようなオリゴヌクレオチドおよび類似体
は少くとも約６サブユニットを含むものが好適であり、
約８から約50サブユニットがより好適であり、もっと好
適であるのは約10から約20のサブユニットを持つもので
ある。サブユニットとはホスホジエステルまたは他の結
合を通して隣接するサブユニットに適切に結合されてい
る塩基および糖の組合せであることが理解されるであろ
う。
レオチド類似体は好適には約３から約100のサブユニッ
トを含む。そのようなオリゴヌクレオチドおよび類似体
は少くとも約６サブユニットを含むものが好適であり、
約８から約50サブユニットがより好適であり、もっと好
適であるのは約10から約20のサブユニットを持つもので
ある。サブユニットとはホスホジエステルまたは他の結
合を通して隣接するサブユニットに適切に結合されてい
る塩基および糖の組合せであることが理解されるであろ
う。
本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ
ド類似体は診断治療および研究試薬およびキットとして
使用できる。治療的使用のためにはオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド類似体かAIDSのようなウイル
スまたはレトロウイルス感染をうけている動物（特にヒ
ト）に投与される。
ド類似体は診断治療および研究試薬およびキットとして
使用できる。治療的使用のためにはオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド類似体かAIDSのようなウイル
スまたはレトロウイルス感染をうけている動物（特にヒ
ト）に投与される。
本発明に従った治療薬は経口、静脈内または筋肉内の
ように内部に応用するのが一般的に好適である。経皮、
局所または病変内のような他の形の投与もまた有用であ
りうる。座薬内に含ませるのもまた有用である。本発明
のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
を予防に使用するのもまた有用なようである。いくつか
の実施態様のためには薬学的に受容可能な担体の使用が
好適である。本発明に従うと、実施に有用であるオリゴ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はその二
次構造が干渉を受けるRNAにより最も良く説明される。
それ故、当業者は本発明により提供されるオリゴヌクレ
オチドおよび類似体は疾病状態に対し原因となるまたは
媒体する関係を持つ二次構造を含むRNAと結合できるも
のであることを理解するであろう。標的RNA構造のまた
はそれに隣接する二次構造に結合する限り、すべてその
ような類似体は本発明に含まれる。
ように内部に応用するのが一般的に好適である。経皮、
局所または病変内のような他の形の投与もまた有用であ
りうる。座薬内に含ませるのもまた有用である。本発明
のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
を予防に使用するのもまた有用なようである。いくつか
の実施態様のためには薬学的に受容可能な担体の使用が
好適である。本発明に従うと、実施に有用であるオリゴ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体はその二
次構造が干渉を受けるRNAにより最も良く説明される。
それ故、当業者は本発明により提供されるオリゴヌクレ
オチドおよび類似体は疾病状態に対し原因となるまたは
媒体する関係を持つ二次構造を含むRNAと結合できるも
のであることを理解するであろう。標的RNA構造のまた
はそれに隣接する二次構造に結合する限り、すべてその
ような類似体は本発明に含まれる。
本発明が治療上の有用性を提供するであろう多くのRN
A二次構造が最近同定された。別のものもまた同様に有
用であろう。これらのいくつかはHIV TAR構造を含んで
いる;S.Feug,E.C.Holland,Nature 334,165（1988）、Ra
tner L.により記載されているようなヌクレオチド配列
に従ったヌクレオチド１−59および60−104でのステム
ループを含む、L.Ratner;W.Haseltine,R.Patarca,K.J.L
ivak,B.Starcich,S.F.Josephs,Nature313 277（1985）;
HIVのEGP/OMP領域間の境界、S.Le,J.Chen,M.J.Braun,M.
A.Gouda,J.V.Maizel,Nucl Acids Res,16,5153（1988）;
HIVのTMP/env遺伝子間の境界、S.Le,J.Chen,M.J.Braun,
M.A.Gonda,J.V.Maizel,Nucl,Acids Res.16,5153（198
8）;HIV CAR構造,E.T.Dayton,D.M.Powell,A.I.Dayton,S
cience 246,1625（1989）;HIVgagおよびpol遺伝子間の
結合部でのステムループ構造（ヌクレオチド1629−167
4）;HIV CRS要素；およびヒト鉄応答性要素（IRE）,J.
L.Casey,M.W.Hentze,D.M.Koeller,et al,Science 240,9
24（1988）。
A二次構造が最近同定された。別のものもまた同様に有
用であろう。これらのいくつかはHIV TAR構造を含んで
いる;S.Feug,E.C.Holland,Nature 334,165（1988）、Ra
tner L.により記載されているようなヌクレオチド配列
に従ったヌクレオチド１−59および60−104でのステム
ループを含む、L.Ratner;W.Haseltine,R.Patarca,K.J.L
ivak,B.Starcich,S.F.Josephs,Nature313 277（1985）;
HIVのEGP/OMP領域間の境界、S.Le,J.Chen,M.J.Braun,M.
A.Gouda,J.V.Maizel,Nucl Acids Res,16,5153（1988）;
HIVのTMP/env遺伝子間の境界、S.Le,J.Chen,M.J.Braun,
M.A.Gonda,J.V.Maizel,Nucl,Acids Res.16,5153（198
8）;HIV CAR構造,E.T.Dayton,D.M.Powell,A.I.Dayton,S
cience 246,1625（1989）;HIVgagおよびpol遺伝子間の
結合部でのステムループ構造（ヌクレオチド1629−167
4）;HIV CRS要素；およびヒト鉄応答性要素（IRE）,J.
L.Casey,M.W.Hentze,D.M.Koeller,et al,Science 240,9
24（1988）。
加えて、蛋白結合のための部位として同定されてお
り、基本的には一本鎖領域と考えられているRNAの領域
がある。例えば配列５′−AUUUA−３′は蛋白質が結合
するための信号として同定されており、その結果RNAが
分解される。J.S.Malter,Science 246,664（1989）。こ
の領域の構造は未知である。しかしながら、その事はこ
の配列での本発明の実施を排除するものではない。いま
だ構造が未知である他のRNA要素もまた本発明の主題と
なり得る。
り、基本的には一本鎖領域と考えられているRNAの領域
がある。例えば配列５′−AUUUA−３′は蛋白質が結合
するための信号として同定されており、その結果RNAが
分解される。J.S.Malter,Science 246,664（1989）。こ
の領域の構造は未知である。しかしながら、その事はこ
の配列での本発明の実施を排除するものではない。いま
だ構造が未知である他のRNA要素もまた本発明の主題と
なり得る。
本発明を実施するために実際のRNA構造を絶対的に知
る必要はなく、特定のRNA配列がRNA結合要素により認識
される事およびこの相互作用が重要な生物学的結果を示
すことを知ることが必要なだけである。これに関し、ビ
リオン形成によりレトロウイルスの構造蛋白質により認
識されるウイルスRNA配列および構造は多くの他のもの
のことく本発明の主題であろう。本発明の応用を現在既
知の構造に制限するつもりはない。重要な生物学的機能
を持つRNA構造への結合は本発明の精神および範囲内に
含まれている。
る必要はなく、特定のRNA配列がRNA結合要素により認識
される事およびこの相互作用が重要な生物学的結果を示
すことを知ることが必要なだけである。これに関し、ビ
リオン形成によりレトロウイルスの構造蛋白質により認
識されるウイルスRNA配列および構造は多くの他のもの
のことく本発明の主題であろう。本発明の応用を現在既
知の構造に制限するつもりはない。重要な生物学的機能
を持つRNA構造への結合は本発明の精神および範囲内に
含まれている。
この開示はRNA構造要素の天然の機能に干渉するいく
つかの方法を提供し、ならびにその他の事は当業者には
明らかであろう。ワトソン−クリック バイブリダイゼ
ーションの法則および二次構造を含むRNAに相補的であ
るように設計されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド類似体のハイブリダイジェーションのための
自由エネルギー予測を用いるとオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体は安定なヘテロデュープレ
ックスを形成することにより内部RNA構造と拮抗するで
あろう事が発見された。ヘテロデュープレックス形成の
エネルギー障壁は標的RNA上の内部RNA構造よりもっと安
定なヘテロデュープレックスをオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド類似体が形成するように設計する
ことにより克服できる。
つかの方法を提供し、ならびにその他の事は当業者には
明らかであろう。ワトソン−クリック バイブリダイゼ
ーションの法則および二次構造を含むRNAに相補的であ
るように設計されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド類似体のハイブリダイジェーションのための
自由エネルギー予測を用いるとオリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体は安定なヘテロデュープレ
ックスを形成することにより内部RNA構造と拮抗するで
あろう事が発見された。ヘテロデュープレックス形成の
エネルギー障壁は標的RNA上の内部RNA構造よりもっと安
定なヘテロデュープレックスをオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド類似体が形成するように設計する
ことにより克服できる。
存在するRNAデュープレックスの鎖侵入の動力学的考
察もまたオリゴヌクレオチド設計に考慮された。塩基対
形成に関与しない標的RNAの領域に相補的な少くとも３
つの、好適にはそれ以上の塩基を持つように侵入鎖を設
計することにより侵入鎖により存在するRNAの二次構造
を破壊することが可能である。この事はヘテロデュープ
レックス形成の過程を開始させるための侵入鎖のために
動力学的“足場”を提供する。
察もまたオリゴヌクレオチド設計に考慮された。塩基対
形成に関与しない標的RNAの領域に相補的な少くとも３
つの、好適にはそれ以上の塩基を持つように侵入鎖を設
計することにより侵入鎖により存在するRNAの二次構造
を破壊することが可能である。この事はヘテロデュープ
レックス形成の過程を開始させるための侵入鎖のために
動力学的“足場”を提供する。
デュープレックスRNA構造に結合する三重鎖形成によ
りその構造を乱すことができることが記載されている。
ヘテロデュープレックス形成（RNA二次構造は侵入鎖に
より破壊される）と対照的に三重鎖形成は一般的に存在
するRNAデュープレックス水素結合パターンを保存する
が、更なる水素結合によりらせん状の溝に結合する。三
重鎖形成はしばらくの間限られた意味で知られていた現
象である。デュープレックスDNAとの三重鎖形成を記載
している一般的総説は次の文献である;J.C.Hanvey,M.Sh
imizu,R.D.Wells,Proc Natl.Acad.Sci.USA 85,6292（19
88）；およびS.Arnott,E.Selsing,J.Mol.Biol.88,509
（1974）。RNAポモポリマーとの三重鎖形成はすでに、
S.L.Broitman,D.D.Im,J.R.Fresco,Proc.Natl.Acad.Sci
USA 84,5120（1987）に記載されている。しかしなが
ら、これまでデュープレックス領域とオリゴヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド類似体の三重鎖形成による
結合によりRNAの機能が阻害されると記載したものはな
い。しかしながら、現在はステムループのステム領域中
のようなRNA二次構造の領域への結合は天然RNAおよびそ
れに結合する因子間の相互作用を乱し、従って遺伝子発
現を調節すると信じられている。
りその構造を乱すことができることが記載されている。
ヘテロデュープレックス形成（RNA二次構造は侵入鎖に
より破壊される）と対照的に三重鎖形成は一般的に存在
するRNAデュープレックス水素結合パターンを保存する
が、更なる水素結合によりらせん状の溝に結合する。三
重鎖形成はしばらくの間限られた意味で知られていた現
象である。デュープレックスDNAとの三重鎖形成を記載
している一般的総説は次の文献である;J.C.Hanvey,M.Sh
imizu,R.D.Wells,Proc Natl.Acad.Sci.USA 85,6292（19
88）；およびS.Arnott,E.Selsing,J.Mol.Biol.88,509
（1974）。RNAポモポリマーとの三重鎖形成はすでに、
S.L.Broitman,D.D.Im,J.R.Fresco,Proc.Natl.Acad.Sci
USA 84,5120（1987）に記載されている。しかしなが
ら、これまでデュープレックス領域とオリゴヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド類似体の三重鎖形成による
結合によりRNAの機能が阻害されると記載したものはな
い。しかしながら、現在はステムループのステム領域中
のようなRNA二次構造の領域への結合は天然RNAおよびそ
れに結合する因子間の相互作用を乱し、従って遺伝子発
現を調節すると信じられている。
本発明に従うと、術語“結合する”はオリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド類似体およびRNA部分ま
たは副部分間の相互作用を示し、いくつかの関連する意
味を持ってもよいことが理解されるであろう。従って本
発明はオリゴヌクレオチドまたは類似体とRNA部分の二
次構造を形成する少くとも１つの副部分との結合を含ん
でいる。オリゴヌクレオチドまたは類似体はRNA部分の
少くとも一つの含部分とワトソン−クリック様式で結合
し、局所的にRNA副部分とオリゴヌクレオチドまたは類
似体の間でヘテロデュープレックスを形成するであろう
ことが理解されるであろう。このヘテロデュープレック
ス形成はRNA部分の二次構造の変化を生じると信じられ
る。正確な機構およびこの影響の結果は確かには知られ
ていないが、オリゴヌクレオチドとRNA部分の一つまた
はそれ以上の副部分との結合によりRNA部分の正常二次
構造が徐々に置き換えられていると信じられる。新しい
ヘテロデュープレックスに伴われる電気的および立体的
因子は天然に存在するRNA部分のものと異なっているの
で、RNAから蛋白質を発生させる機能の有効性および性
質が干渉を受ける。結果として起こる欠陥蛋白質の形成
または蛋白質の喪失はそれ自身け総合的なRNAをコード
している遺伝子の発現の調節を明示ている。
チドまたはオリゴヌクレオチド類似体およびRNA部分ま
たは副部分間の相互作用を示し、いくつかの関連する意
味を持ってもよいことが理解されるであろう。従って本
発明はオリゴヌクレオチドまたは類似体とRNA部分の二
次構造を形成する少くとも１つの副部分との結合を含ん
でいる。オリゴヌクレオチドまたは類似体はRNA部分の
少くとも一つの含部分とワトソン−クリック様式で結合
し、局所的にRNA副部分とオリゴヌクレオチドまたは類
似体の間でヘテロデュープレックスを形成するであろう
ことが理解されるであろう。このヘテロデュープレック
ス形成はRNA部分の二次構造の変化を生じると信じられ
る。正確な機構およびこの影響の結果は確かには知られ
ていないが、オリゴヌクレオチドとRNA部分の一つまた
はそれ以上の副部分との結合によりRNA部分の正常二次
構造が徐々に置き換えられていると信じられる。新しい
ヘテロデュープレックスに伴われる電気的および立体的
因子は天然に存在するRNA部分のものと異なっているの
で、RNAから蛋白質を発生させる機能の有効性および性
質が干渉を受ける。結果として起こる欠陥蛋白質の形成
または蛋白質の喪失はそれ自身け総合的なRNAをコード
している遺伝子の発現の調節を明示ている。
本発明はまた二次構造を持つRNA部分とのトリプレッ
クスの形成を含んでいる。再びそのようなトリプレック
スの正確な性質は完全に理解されていないが、適切に構
築されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
類似体はある環境下、二次構造を持つRNAの部分と相互
作用できると信じられている。生じるトリプレックス形
成はRNAからの蛋白質の翻訳が非常に干渉を受けている
と信じられており、従ってRNAが誘導される遺伝子の発
現が調節される。
クスの形成を含んでいる。再びそのようなトリプレック
スの正確な性質は完全に理解されていないが、適切に構
築されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
類似体はある環境下、二次構造を持つRNAの部分と相互
作用できると信じられている。生じるトリプレックス形
成はRNAからの蛋白質の翻訳が非常に干渉を受けている
と信じられており、従ってRNAが誘導される遺伝子の発
現が調節される。
本発明に従うと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド類似体とRNA部分または副部分の相互作用
（２つの結合）により蛋白質の非形成または誤形成を生
じる必要はない。ある種の環境下では遺伝子発現プロト
コール中に重要な役割を持ついくつかの制御または他の
機能の中断はその発現の調節の有効な手段であろう。こ
の一つの例はHIV中のgag−pol座位に関係している。従
って蛋白質翻訳が停止されるかまたは欠陥蛋白質が産生
される必要性はない。むしろ、gag−pol領域への干渉に
より、HIV生物体に対して著しく重要な融合蛋白質の製
造を導くと信じられているフレームシフト化を妨げるこ
とが可能であると信じられている 簡単に記すと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体と二次構造を持つRNAとの相互作用また
は結合はRNA機能に干渉する能力を持ち、それ故RNAが誘
導される遺伝子の発現を調節すると信じられる。当業者
はここに特定的に示した方法以外のRNA二次構造に干渉
する他の手段を発見するであろう。しかしながら、すべ
てそのような手段は本発明に含まれる。
クレオチド類似体とRNA部分または副部分の相互作用
（２つの結合）により蛋白質の非形成または誤形成を生
じる必要はない。ある種の環境下では遺伝子発現プロト
コール中に重要な役割を持ついくつかの制御または他の
機能の中断はその発現の調節の有効な手段であろう。こ
の一つの例はHIV中のgag−pol座位に関係している。従
って蛋白質翻訳が停止されるかまたは欠陥蛋白質が産生
される必要性はない。むしろ、gag−pol領域への干渉に
より、HIV生物体に対して著しく重要な融合蛋白質の製
造を導くと信じられているフレームシフト化を妨げるこ
とが可能であると信じられている 簡単に記すと、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体と二次構造を持つRNAとの相互作用また
は結合はRNA機能に干渉する能力を持ち、それ故RNAが誘
導される遺伝子の発現を調節すると信じられる。当業者
はここに特定的に示した方法以外のRNA二次構造に干渉
する他の手段を発見するであろう。しかしながら、すべ
てそのような手段は本発明に含まれる。
多くの種類のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体が本発明の実施に有用であろうと信じられ
るが、二次構造を持つRNA部分の副部分の少くとも約６
つのサブユニットに結合するようなオリゴヌクレオチド
および類似体を設計することが好適であることが見い出
されている。別の好適な実施態様に従うと、オリゴヌク
レオチドは約６から約30で結合し、さらにより好適には
約10から約20のサブユニットである。前に議論したよう
に、HIVのTAR要素が本発明を使用するきわめて良好な標
的であると現在信じられている。従ってHIVのTAR領域の
一つまたはそれ以上の副部分に結合するためのオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の構造が好
適である。同様の考察がHIVのCAR要素の機能発現の干渉
に行われる。従って、その部分に干渉するオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の構造もまた好
適である。
オチド類似体が本発明の実施に有用であろうと信じられ
るが、二次構造を持つRNA部分の副部分の少くとも約６
つのサブユニットに結合するようなオリゴヌクレオチド
および類似体を設計することが好適であることが見い出
されている。別の好適な実施態様に従うと、オリゴヌク
レオチドは約６から約30で結合し、さらにより好適には
約10から約20のサブユニットである。前に議論したよう
に、HIVのTAR要素が本発明を使用するきわめて良好な標
的であると現在信じられている。従ってHIVのTAR領域の
一つまたはそれ以上の副部分に結合するためのオリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の構造が好
適である。同様の考察がHIVのCAR要素の機能発現の干渉
に行われる。従って、その部分に干渉するオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の構造もまた好
適である。
同様の様式で、HIVのgag−pol要素の干渉もまた本発
明のある種の実施態様の実施に従うと好適であろう。そ
のような場合、フレームシフト化が妨げられgag−polフ
ァミリーの必須蛋白質の誤形成または非形成が期待され
る。
明のある種の実施態様の実施に従うと好適であろう。そ
のような場合、フレームシフト化が妨げられgag−polフ
ァミリーの必須蛋白質の誤形成または非形成が期待され
る。
治療は本発明の特別な目的である。従って、薬学的に
受容可能な担体中の本発明に従ったオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド類似体を提供することは非常
に有用であろう。二次構造を持つRNAをコードしている
遺伝子の発現により特徴付けられる疾患を持つと疑われ
る動物の処置が望ましい。従って、そのよう疾患を持つ
と疑われた動物に、そのRNAの二次構造に結合するよう
に設計されているオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体が投与される。このことはAIDS疾患の処
置に特にあてはまっている。そのような場合、HIVのTA
R,CARまたはgag−pol要素を標的とするオリゴヌクレオ
チドまたは類似体を使用するのが現在好適である。
受容可能な担体中の本発明に従ったオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド類似体を提供することは非常
に有用であろう。二次構造を持つRNAをコードしている
遺伝子の発現により特徴付けられる疾患を持つと疑われ
る動物の処置が望ましい。従って、そのよう疾患を持つ
と疑われた動物に、そのRNAの二次構造に結合するよう
に設計されているオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体が投与される。このことはAIDS疾患の処
置に特にあてはまっている。そのような場合、HIVのTA
R,CARまたはgag−pol要素を標的とするオリゴヌクレオ
チドまたは類似体を使用するのが現在好適である。
全体では、前記の疾病状態にかかっていると疑われる
患者にそれらの疾患の総体的症状を減少させるのに有効
な量および処置スケジュールでそのままの形または担体
媒質に懸濁させてオリゴヌクレオチドまたは類似体を投
与することが好適である。そのような処置投与計画にお
いて、至適の用量および処置スケジュールを決定するこ
とは当業者の判断の範囲内である。
患者にそれらの疾患の総体的症状を減少させるのに有効
な量および処置スケジュールでそのままの形または担体
媒質に懸濁させてオリゴヌクレオチドまたは類似体を投
与することが好適である。そのような処置投与計画にお
いて、至適の用量および処置スケジュールを決定するこ
とは当業者の判断の範囲内である。
実施例1.HIV TAR要素 HIVゲノム中の制御要素の精巧に作り上げられた組
が、ウイルスが複製するかまたは休眼状態で残るかを決
定する。HIVゲノム中で同定された９の遺伝子のうちた
だの３つがコアおよびエンペロープからのものである。
W.A.Haseltine,F.Wong−Staal,Scientific Americon10
月号,52（1988）。他の６つの遺伝子はウイルス蛋白質
の産生の制御に含まれている。制御遺伝子はウイルスゲ
ノム上のどこか他の応答性要素と相互作用する蛋白質を
コードすることにより作用する。複製のバーストの開始
に関係する主な制御遺伝子はtat（トランス活性化）遺
伝子である。tat遺伝子の産物、tat蛋白質はTAR（トラ
ンス活性化応答性要素）として知られている短い配列要
素と相互作用する事により作用する。TAR配列はウイル
ス ロングターミナル リピーリ（LTR）中にコードさ
れており、それ故、すべてのHIV遺伝子からのmRNA中に
含まれている。
が、ウイルスが複製するかまたは休眼状態で残るかを決
定する。HIVゲノム中で同定された９の遺伝子のうちた
だの３つがコアおよびエンペロープからのものである。
W.A.Haseltine,F.Wong−Staal,Scientific Americon10
月号,52（1988）。他の６つの遺伝子はウイルス蛋白質
の産生の制御に含まれている。制御遺伝子はウイルスゲ
ノム上のどこか他の応答性要素と相互作用する蛋白質を
コードすることにより作用する。複製のバーストの開始
に関係する主な制御遺伝子はtat（トランス活性化）遺
伝子である。tat遺伝子の産物、tat蛋白質はTAR（トラ
ンス活性化応答性要素）として知られている短い配列要
素と相互作用する事により作用する。TAR配列はウイル
ス ロングターミナル リピーリ（LTR）中にコードさ
れており、それ故、すべてのHIV遺伝子からのmRNA中に
含まれている。
tat蛋白質の発現はtat遺伝子それ自身を含む他のHIV
遺伝子の発現を1,000倍まで増加させる。この自己制御
性陽性フィードバックおよびすべてのHIV転写体からのm
RNA中にTAR配列が含まれているという事実のため、tat
遺伝子が活性化された場合、莫大な量のウイルス遺伝子
発現が開始される。tat遺伝電子およびTAR要素間の相互
作用はそれ故、HIVの生活環に決定的であり、この相互
作用の特異的破壊はウイルスの増殖を中断させるようで
ある。
遺伝子の発現を1,000倍まで増加させる。この自己制御
性陽性フィードバックおよびすべてのHIV転写体からのm
RNA中にTAR配列が含まれているという事実のため、tat
遺伝子が活性化された場合、莫大な量のウイルス遺伝子
発現が開始される。tat遺伝電子およびTAR要素間の相互
作用はそれ故、HIVの生活環に決定的であり、この相互
作用の特異的破壊はウイルスの増殖を中断させるようで
ある。
tat蛋白質によるTAR含有遺伝子のトランス活性化の機
構は最近精力的に研究された。Phillip,A.Sharp.Rober
t,A.Marciniak,Cell,59,229（1989）。研究することは
まだたくさん残っているが、２つの重要な点が明らかに
なった;tatはウイルスmRNAの量およびその翻訳の効率の
両方を増加させることによりTAR含有遺伝子の発現を増
加させる事、およびTARはDNA構造というよりRNA構造と
して機能している事である。
構は最近精力的に研究された。Phillip,A.Sharp.Rober
t,A.Marciniak,Cell,59,229（1989）。研究することは
まだたくさん残っているが、２つの重要な点が明らかに
なった;tatはウイルスmRNAの量およびその翻訳の効率の
両方を増加させることによりTAR含有遺伝子の発現を増
加させる事、およびTARはDNA構造というよりRNA構造と
して機能している事である。
tatがTAR含有遺伝子の転写体を増加させ、RNA中のTAR
要素と相互作用することによりそれがなされるという普
通ではない結論は多くの観察から導かれている。Philli
p,A.Sharp,Robert,A.Marciniak,Cell,59,229（1989）。
トランス活性化を達成するためにはTAR要素は転写開始
部位のすぐ下流に位置していなければならない。さら
に、TARは配向依存性であり；もし逆の向きに挿入され
たら機能しない。
要素と相互作用することによりそれがなされるという普
通ではない結論は多くの観察から導かれている。Philli
p,A.Sharp,Robert,A.Marciniak,Cell,59,229（1989）。
トランス活性化を達成するためにはTAR要素は転写開始
部位のすぐ下流に位置していなければならない。さら
に、TARは配向依存性であり；もし逆の向きに挿入され
たら機能しない。
tatがRNA構造としてのTARとを相互作用するという最
も強い証拠のいくつかは突然変異発生実験から得られ
た。２つの株間のTAR領域中にはほとんど一次配列には
相同性がないにかかわらずHIV−２（ウイルスの異なっ
た株）のTAR領域を含むベクターをHIV−１からのtat蛋
白質がトランス活性化できるという観察によりTAR要素
に対する研究努力が刺激された。S.Feng,E.C.Holland,N
ature 334,165（1988）。しかしながら、HIV−１および
HIV−２からのTAR配列のRNA二次構造を予測するコンピ
ュータープログラムによる試験はHIV−１のTAR領域中に
１つのステムループを、HIV−２には３つのステムルー
プ構造のRNAステムループ構造の可能性を明らかにし
た。ステムの組成および長さはまちまちであったが、４
つすべてのループに図1Aおよび1Bに示したようなペンタ
ヌクレオチドCUGGGが含まれていた。突然変異発生実験
はループ中に存在するヌクレオチドの各々がtatによる
トランス活性化に絶対的に必須であるが、ステム構造が
維持される限り、ステム中の塩基置換は許容された。S.
Feng,E.C.Holland,Nature 334,165（1988）。
も強い証拠のいくつかは突然変異発生実験から得られ
た。２つの株間のTAR領域中にはほとんど一次配列には
相同性がないにかかわらずHIV−２（ウイルスの異なっ
た株）のTAR領域を含むベクターをHIV−１からのtat蛋
白質がトランス活性化できるという観察によりTAR要素
に対する研究努力が刺激された。S.Feng,E.C.Holland,N
ature 334,165（1988）。しかしながら、HIV−１および
HIV−２からのTAR配列のRNA二次構造を予測するコンピ
ュータープログラムによる試験はHIV−１のTAR領域中に
１つのステムループを、HIV−２には３つのステムルー
プ構造のRNAステムループ構造の可能性を明らかにし
た。ステムの組成および長さはまちまちであったが、４
つすべてのループに図1Aおよび1Bに示したようなペンタ
ヌクレオチドCUGGGが含まれていた。突然変異発生実験
はループ中に存在するヌクレオチドの各々がtatによる
トランス活性化に絶対的に必須であるが、ステム構造が
維持される限り、ステム中の塩基置換は許容された。S.
Feng,E.C.Holland,Nature 334,165（1988）。
天然TARステムループより更に安定であるRNA中の拮抗
二次構造を作ることによりステムループ構造に隣接する
配列が変えられた実験からTAR構造がRNAとして機能して
いる更なる証拠が得られた。B.Berkhout,Cell 59,273
（1989）。このことはTAR含有RNA内へステムループ構造
の５′部位に対してアンチセンスである追加の配列を導
入することにより達成された。改変TAR構造のトランス
活性化が失われ、TAR配列単独ではトランス活性化に十
分でなく、活性であるためには、これらの配列は適切な
二次構造へ折りたたまれなければならないことを示唆し
ている。TARステムループに対してアンチセンス配列は
天然RNA構造を破壊できることも示唆している。
二次構造を作ることによりステムループ構造に隣接する
配列が変えられた実験からTAR構造がRNAとして機能して
いる更なる証拠が得られた。B.Berkhout,Cell 59,273
（1989）。このことはTAR含有RNA内へステムループ構造
の５′部位に対してアンチセンスである追加の配列を導
入することにより達成された。改変TAR構造のトランス
活性化が失われ、TAR配列単独ではトランス活性化に十
分でなく、活性であるためには、これらの配列は適切な
二次構造へ折りたたまれなければならないことを示唆し
ている。TARステムループに対してアンチセンス配列は
天然RNA構造を破壊できることも示唆している。
TARステムループ構造の直接的生化学的証拠もまた得
られている。TAR RNAはインビトロで酵素的に合成され
ており、RNAの一本鎖領域を選択的に切断するがデュー
プレックス構造は切断しない酵素により証明された。酵
素切断パターンの結果はコンピューター予測RNA二次構
造と一致した。B.Berkhout,Cell 59,273（1989）。
られている。TAR RNAはインビトロで酵素的に合成され
ており、RNAの一本鎖領域を選択的に切断するがデュー
プレックス構造は切断しない酵素により証明された。酵
素切断パターンの結果はコンピューター予測RNA二次構
造と一致した。B.Berkhout,Cell 59,273（1989）。
要約すると、多くの研究から、HIVtat蛋白質は莫大な
量のウイルス遺伝子発現の開始の原因となる事、このこ
とは各々のHIVmRNA転写体内に取り込まれているTAR配列
との相互作用により起こる事、HIV TAR配列はRNA構造と
して機能する事、および正確なTAR RNA構造がtatトラン
ス活性化に必須である事に対しての強い直接的な証拠が
ある。
量のウイルス遺伝子発現の開始の原因となる事、このこ
とは各々のHIVmRNA転写体内に取り込まれているTAR配列
との相互作用により起こる事、HIV TAR配列はRNA構造と
して機能する事、および正確なTAR RNA構造がtatトラン
ス活性化に必須である事に対しての強い直接的な証拠が
ある。
TAR RNA構造に特異的に結合し、tatトランス活性化を
妨げる化合物はHIV感染のための治療薬として活性を持
っていることが発見された。HIVのすべての株は本発明
の精神および範囲内に含まれると考えられる。HIVの異
なった株は異なった構造に折りたたまれるであろう異な
ったTAR配列を持つことができる。本発明は別の株の構
造に相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チド類似体の配列に変更することにより別のHIVの株に
対しても実行できる。
妨げる化合物はHIV感染のための治療薬として活性を持
っていることが発見された。HIVのすべての株は本発明
の精神および範囲内に含まれると考えられる。HIVの異
なった株は異なった構造に折りたたまれるであろう異な
ったTAR配列を持つことができる。本発明は別の株の構
造に相補的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオ
チド類似体の配列に変更することにより別のHIVの株に
対しても実行できる。
TARおよびtat機能はHIVゲノムから遺伝子を除去し、
単離して細胞株中でそれらを研究することにより調べら
れた。tat蛋白質およびTAR要素間の相互作用を研究する
ためベクターが構築された。tat遺伝子はSV40プロモー
ター下に発現された。TAR領域は容易にアッセイできる
レポーター遺伝子、胎盤アルカリ生ホスファターゼ遺伝
子（PAP）と融合した別のプラスミドから発現された。
P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.Kadesch,P
roc.Natl.Acad,Sci USA 85,6342（1988）。細胞培養モ
デル中の酵素活性は、TAR領域の必須要素の存在およびt
at蛋白質の存在の両方に依存することが示された。P.Sh
arp,R.Marciniak,Cell 59,229（1989）;S.Feng,E.C.Hol
land,Nature 334,165（1988）;Michael,F.Laspia,Andre
w,P.Rice,Michael B.Mathews,Cell 59,283（1989）;J.
A.Garcia,D.Harrich,E.Soultanakis,F.Wu,R.Mitsuyasu,
R.B.Gaynor,EMBO J.8,765（1989）；およびB.BerkhoUt,
Cell 59,273（1989）。本質において、ベクター系はHIV
感染細胞で起こるtat−媒介TARトランス活性化を再構成
した。
単離して細胞株中でそれらを研究することにより調べら
れた。tat蛋白質およびTAR要素間の相互作用を研究する
ためベクターが構築された。tat遺伝子はSV40プロモー
ター下に発現された。TAR領域は容易にアッセイできる
レポーター遺伝子、胎盤アルカリ生ホスファターゼ遺伝
子（PAP）と融合した別のプラスミドから発現された。
P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.Kadesch,P
roc.Natl.Acad,Sci USA 85,6342（1988）。細胞培養モ
デル中の酵素活性は、TAR領域の必須要素の存在およびt
at蛋白質の存在の両方に依存することが示された。P.Sh
arp,R.Marciniak,Cell 59,229（1989）;S.Feng,E.C.Hol
land,Nature 334,165（1988）;Michael,F.Laspia,Andre
w,P.Rice,Michael B.Mathews,Cell 59,283（1989）;J.
A.Garcia,D.Harrich,E.Soultanakis,F.Wu,R.Mitsuyasu,
R.B.Gaynor,EMBO J.8,765（1989）；およびB.BerkhoUt,
Cell 59,273（1989）。本質において、ベクター系はHIV
感染細胞で起こるtat−媒介TARトランス活性化を再構成
した。
TAT/TAR トランス活性化はヒト胎盤アルカリ生ホス
ファターゼ遺伝子（PAP）を、エンハンサー、プロモー
ターおよびtar要素を含むHIV−1LTR配列の制御調整下に
置くことにより都合よくアッセイできる。HIV−1LTR、p
HIVCAT−０（S.Feng,E.C.Holland,Nature 334,165（198
8））を含んでいるプラスミドはHIV U3をそっくりその
まま、およびＲから＋78位（Hind III部位）までを含ん
でいる。このプラスミドをHind IIIおよびAat IIの組合
せで消化するとCATカセットをRNAのプロセシングに関与
するSV40配列と一緒に放出する。第２のプラスミド、pS
V2Apap、はPAPカセットをSV40プロモーターの転写制御
下の真核生物プロセシング信号と伴に含んでいる。P.He
nthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.Kadesch,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（1988）。PAPカセットおよ
びプロセシング配列はHind IIIおよびAat IIによる消化
によりプラスミドから放出される。新しいプラスミド,p
HIVPAPはHIV−1LTRおよびpHIVCAT−０からのベクター配
列をpSV2ApapからのHind III/Aat II PAPカセットに連
結させることにより製作される。
ファターゼ遺伝子（PAP）を、エンハンサー、プロモー
ターおよびtar要素を含むHIV−1LTR配列の制御調整下に
置くことにより都合よくアッセイできる。HIV−1LTR、p
HIVCAT−０（S.Feng,E.C.Holland,Nature 334,165（198
8））を含んでいるプラスミドはHIV U3をそっくりその
まま、およびＲから＋78位（Hind III部位）までを含ん
でいる。このプラスミドをHind IIIおよびAat IIの組合
せで消化するとCATカセットをRNAのプロセシングに関与
するSV40配列と一緒に放出する。第２のプラスミド、pS
V2Apap、はPAPカセットをSV40プロモーターの転写制御
下の真核生物プロセシング信号と伴に含んでいる。P.He
nthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.Kadesch,Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（1988）。PAPカセットおよ
びプロセシング配列はHind IIIおよびAat IIによる消化
によりプラスミドから放出される。新しいプラスミド,p
HIVPAPはHIV−1LTRおよびpHIVCAT−０からのベクター配
列をpSV2ApapからのHind III/Aat II PAPカセットに連
結させることにより製作される。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
の活性を試験するためにカルシウム／リン酸沈殿法によ
りヒーラ細胞内へpcDEBtatおよびpHIVPAPの同時トラン
スフェクションを行った。オリゴヌクレオチドおよびオ
リゴヌクレオチド類似体の効果は以下のようにして決定
された。トランスフェクションの前の日にヒーラ細胞を
1:8に分割し、６−ウェルの皿に入れた。各々の皿に対
し、１μｇのpHIVPAPおよび12μｇのpcDEBtatを50μ
のHBSおよび32μの2.5MCaCl2中で沈殿させた。CaPO4
沈殿物は６つのウエル間で均等に分割された。オリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は同様の方
法で沈殿され、図に示した濃度でウエルに添加した（容
量はウエル当り1.5mlの培地である）。沈殿は細胞上に2
0分間乗せておき、次に完全培地を加え、細胞はさらに
４時間インキュベートされた。細胞は次に10％グリセロ
ール含有HBSでショックを与えられた。図２に対しての
み、オリゴヌクレオチドはトランスフェクションに続い
てウエル当り10倍高い用量で培地へ添加された。48時間
後、細胞を採取し以下の改良を加えHenthorn et alによ
り記載されているように蛋白質およびPAPアッセイを実
験した。P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.K
adesch,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（1988）。細
胞は0.5mlのTBSに採用され、その0.1mlが蛋白質アッセ
イに使用された。残りの0.4mlの細胞懸濁液はペレット
化され、次に50μのTBSに再懸濁された。細胞を65℃
で30分間加熱することにより内因性のホスファターゼが
不活性化された。
の活性を試験するためにカルシウム／リン酸沈殿法によ
りヒーラ細胞内へpcDEBtatおよびpHIVPAPの同時トラン
スフェクションを行った。オリゴヌクレオチドおよびオ
リゴヌクレオチド類似体の効果は以下のようにして決定
された。トランスフェクションの前の日にヒーラ細胞を
1:8に分割し、６−ウェルの皿に入れた。各々の皿に対
し、１μｇのpHIVPAPおよび12μｇのpcDEBtatを50μ
のHBSおよび32μの2.5MCaCl2中で沈殿させた。CaPO4
沈殿物は６つのウエル間で均等に分割された。オリゴヌ
クレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は同様の方
法で沈殿され、図に示した濃度でウエルに添加した（容
量はウエル当り1.5mlの培地である）。沈殿は細胞上に2
0分間乗せておき、次に完全培地を加え、細胞はさらに
４時間インキュベートされた。細胞は次に10％グリセロ
ール含有HBSでショックを与えられた。図２に対しての
み、オリゴヌクレオチドはトランスフェクションに続い
てウエル当り10倍高い用量で培地へ添加された。48時間
後、細胞を採取し以下の改良を加えHenthorn et alによ
り記載されているように蛋白質およびPAPアッセイを実
験した。P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.K
adesch,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（1988）。細
胞は0.5mlのTBSに採用され、その0.1mlが蛋白質アッセ
イに使用された。残りの0.4mlの細胞懸濁液はペレット
化され、次に50μのTBSに再懸濁された。細胞を65℃
で30分間加熱することにより内因性のホスファターゼが
不活性化された。
熱安定性ヒト胎盤アルカリ性ホスファターゼ活性はPN
PP（0.5ml、5mMPNPP）を細胞懸濁液に添加し、37℃でイ
ンキュベートすることによりアッセイされた。活性は反
応混合物の150μを用い、405nmでの吸光度を を用いて測定することにより30分毎に決定した。PAP活
性はバイオラド蛋白質アッセイにより決定された各々の
ウエル中の総蛋白質に対して規格化された；採取した細
胞の1/5のTBS液（0.1μ）を30μのバイオ−ラド蛋
白質試薬に加え、室温で10分間インキュベートし、続い
てタイターテックプレートリーダーを用いて595nmでの
吸光度を測定した。
PP（0.5ml、5mMPNPP）を細胞懸濁液に添加し、37℃でイ
ンキュベートすることによりアッセイされた。活性は反
応混合物の150μを用い、405nmでの吸光度を を用いて測定することにより30分毎に決定した。PAP活
性はバイオラド蛋白質アッセイにより決定された各々の
ウエル中の総蛋白質に対して規格化された；採取した細
胞の1/5のTBS液（0.1μ）を30μのバイオ−ラド蛋
白質試薬に加え、室温で10分間インキュベートし、続い
てタイターテックプレートリーダーを用いて595nmでの
吸光度を測定した。
細胞は下記のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド類似体で処理された： 図２−４において、オリゴヌクレオチドまたは類似体は
番号、続いて文字（ＳまたはＮ）が付けられており、ホ
スホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドには“N"
が、すべてホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレ
オチド類似体には“S"が付いている。図２−４に示され
た結果は３回の別個の実験を表わしている。
オチド類似体で処理された： 図２−４において、オリゴヌクレオチドまたは類似体は
番号、続いて文字（ＳまたはＮ）が付けられており、ホ
スホジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドには“N"
が、すべてホスホロチオエート結合を含むオリゴヌクレ
オチド類似体には“S"が付いている。図２−４に示され
た結果は３回の別個の実験を表わしている。
実施例2.HIV CAR要素 ヒト免疫不全ウイルスの生活環中の制御事項の１つは
ラージビリオン構造RNAの蓄積であり、それはより短い
制御mRNAを犠牲にして蓄積される。本質において、ウイ
ルスは蛋白質の各々の組をコードするのに多量の同一RN
A物質を使用する。もしRNAがより広範囲にわたってスプ
ライスされると制御蛋白質が産生される。もしRNAが広
範囲にわたらないようにスプライスされると構造蛋白質
が産生される。W.A.Haseltine;F.Wong−Staal,Scientif
ic American10月号、52（1988）。これらの出来事はrev
遺伝子産物であるrevとして知られている蛋白質により
制御される。revの機能は細胞の核から細胞質へのRNAの
輸送を促進することである。revが存在しないとmRNAは
細胞の核中にとどまり、それらを制御蛋白質をコードし
ているmRNAへ変換する酵素によりスプライシングを受け
る。rev存在下ではmRNAはあまりスプライシングを受け
ずに細胞質へ輸送される。生じるより長いmRNAは構造蛋
白質をコードしている。
ラージビリオン構造RNAの蓄積であり、それはより短い
制御mRNAを犠牲にして蓄積される。本質において、ウイ
ルスは蛋白質の各々の組をコードするのに多量の同一RN
A物質を使用する。もしRNAがより広範囲にわたってスプ
ライスされると制御蛋白質が産生される。もしRNAが広
範囲にわたらないようにスプライスされると構造蛋白質
が産生される。W.A.Haseltine;F.Wong−Staal,Scientif
ic American10月号、52（1988）。これらの出来事はrev
遺伝子産物であるrevとして知られている蛋白質により
制御される。revの機能は細胞の核から細胞質へのRNAの
輸送を促進することである。revが存在しないとmRNAは
細胞の核中にとどまり、それらを制御蛋白質をコードし
ているmRNAへ変換する酵素によりスプライシングを受け
る。rev存在下ではmRNAはあまりスプライシングを受け
ずに細胞質へ輸送される。生じるより長いmRNAは構造蛋
白質をコードしている。
revはCAR要素として知られているRNA構造要素に結合
することにより機能する。E.T.Dayton,D.M.Pomell,A.I.
Dayton,Science 246,1625（1989）。この構造要素はま
たrre（rev応答性要素）としても称されてきた。機能性
RNAはenvRNA中の269pp領域（7358−7627）に局在化され
ている。L.Ratner,W.Haseltine,R.Patarca,K.J.Livak,
B.Starcich,S.F.Josephs,Nature,313,277（1985）。配
列は図５に示されている。便宜上、この配列をCAR要素
とする。CAR要素の二次構造は確実に現在知られていな
い。しかしながら、Zukerのプログラムのような当業者
に普通に使用されるコンピュータープログラムを用いて
CAR要素の二次構造を予測することが可能である。M.Zuk
er,Science 244,48（1989）。そのような分析の結果、
図６に示した結果が得られた。図６に示したステムルー
プ構造の各々がrev遺伝子産物と相互作用する可能性を
持ち、各々に本発明の一部であるオリゴヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチド類似体が結合できる。コンピュ
ータープログラムにより予測され、図６に図示された構
造は正確で疑う余地がないということでは決してない。
しかしながらこの事はCAR要素構造に対する本発明の実
施と制限するものではない。この場合（および実際のRN
A構造が不確かな他のすべての場合）本発明は配列に相
補的である一連のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体を製造することにより実施され、ここで
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
は、ここに示された束縛および考察を考慮して設計され
る。
することにより機能する。E.T.Dayton,D.M.Pomell,A.I.
Dayton,Science 246,1625（1989）。この構造要素はま
たrre（rev応答性要素）としても称されてきた。機能性
RNAはenvRNA中の269pp領域（7358−7627）に局在化され
ている。L.Ratner,W.Haseltine,R.Patarca,K.J.Livak,
B.Starcich,S.F.Josephs,Nature,313,277（1985）。配
列は図５に示されている。便宜上、この配列をCAR要素
とする。CAR要素の二次構造は確実に現在知られていな
い。しかしながら、Zukerのプログラムのような当業者
に普通に使用されるコンピュータープログラムを用いて
CAR要素の二次構造を予測することが可能である。M.Zuk
er,Science 244,48（1989）。そのような分析の結果、
図６に示した結果が得られた。図６に示したステムルー
プ構造の各々がrev遺伝子産物と相互作用する可能性を
持ち、各々に本発明の一部であるオリゴヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチド類似体が結合できる。コンピュ
ータープログラムにより予測され、図６に図示された構
造は正確で疑う余地がないということでは決してない。
しかしながらこの事はCAR要素構造に対する本発明の実
施と制限するものではない。この場合（および実際のRN
A構造が不確かな他のすべての場合）本発明は配列に相
補的である一連のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド類似体を製造することにより実施され、ここで
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体
は、ここに示された束縛および考察を考慮して設計され
る。
rev遺伝子産物の正常な機能を測定するためのアッセ
イは報告されている方法に従って実施できる。E.T.Dayt
on,D.M.Powell,A.I.Dayton,Science 246,1625（1989）;
Dayton et al.,J.Acq,Immune Deficiency Syndromes 1,
441（1988）。種々のプロモーターの制御調節下細胞中
でHIV mRNAを発現するベクターはrev蛋白質を発現する
ベクターと一緒る細胞内へトランスフェクトされる。re
vが細胞質へのmRNAの輸送を容易にするように正常に機
能する場合、輸送されたmRNAはgag蛋白質をコードして
おり、それは免疫吸着アッセイにより検出される。オリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体がこの
過程を妨げる場合、gag蛋白質の産生の減少が測定され
る。これらの実験を実施するために必要とされる試薬は
国立衛生研究所から入手可能である（エイズ リサーチ
アンド レファレンス リージェント プログラム,1
990カタログ国立アルレギーおよび感染疾患研究所）。
イは報告されている方法に従って実施できる。E.T.Dayt
on,D.M.Powell,A.I.Dayton,Science 246,1625（1989）;
Dayton et al.,J.Acq,Immune Deficiency Syndromes 1,
441（1988）。種々のプロモーターの制御調節下細胞中
でHIV mRNAを発現するベクターはrev蛋白質を発現する
ベクターと一緒る細胞内へトランスフェクトされる。re
vが細胞質へのmRNAの輸送を容易にするように正常に機
能する場合、輸送されたmRNAはgag蛋白質をコードして
おり、それは免疫吸着アッセイにより検出される。オリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体がこの
過程を妨げる場合、gag蛋白質の産生の減少が測定され
る。これらの実験を実施するために必要とされる試薬は
国立衛生研究所から入手可能である（エイズ リサーチ
アンド レファレンス リージェント プログラム,1
990カタログ国立アルレギーおよび感染疾患研究所）。
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体
の影響はトランスフェクション混合物へ化合物を直接加
えるかまたはトランスフェクションに続いて培地へ種々
への時間および濃度で化合物を添加し、トランスフェク
ション後24−48時間でアッセイする。以下のオリゴヌク
レオチドおよび類似体が検討されるであろう。
の影響はトランスフェクション混合物へ化合物を直接加
えるかまたはトランスフェクションに続いて培地へ種々
への時間および濃度で化合物を添加し、トランスフェク
ション後24−48時間でアッセイする。以下のオリゴヌク
レオチドおよび類似体が検討されるであろう。
実施例3.フレーム シフト化の阻害:HIVgag/polフレー
ム シフト領域 HIVおよび他のレトロウイルスはgagとして知られてい
る構造蛋白質との融合物の一部として逆転写酵素（po
l）をコードしている蛋白質を合成する。ウイルスはま
たgagおよびpol領域の融合蛋白質間を切断し遊離のpol
を放出する配列特異的プロテアーゼもまたコードしてい
る。現在まで試験されたすべてのレトロウイルスにおい
てgag−pol mRNAの遺伝子配列はmRNAのgag−pol融合蛋
白質への直接翻訳を防げる。mRNA上のgagおよびpol領域
間に読み枠内終止コドンがあるし、またgagおよびpol配
列は合図信号の同一の読み枠内には存在していない。T.
Jacks,M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,P.J.Bavr,H.
E.Varmus,Nature 331,280（1988）。HIVの場合、pol読
み枠はgagに比較して−１である。融合蛋白質を発現す
るにはmRNA上のgagおよびpol領域間の連結部でのリボソ
ーム“フレームシフト”および融合蛋白質の合成の完了
までのpolの読み枠中の連続的翻訳が必要である。
ム シフト領域 HIVおよび他のレトロウイルスはgagとして知られてい
る構造蛋白質との融合物の一部として逆転写酵素（po
l）をコードしている蛋白質を合成する。ウイルスはま
たgagおよびpol領域の融合蛋白質間を切断し遊離のpol
を放出する配列特異的プロテアーゼもまたコードしてい
る。現在まで試験されたすべてのレトロウイルスにおい
てgag−pol mRNAの遺伝子配列はmRNAのgag−pol融合蛋
白質への直接翻訳を防げる。mRNA上のgagおよびpol領域
間に読み枠内終止コドンがあるし、またgagおよびpol配
列は合図信号の同一の読み枠内には存在していない。T.
Jacks,M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,P.J.Bavr,H.
E.Varmus,Nature 331,280（1988）。HIVの場合、pol読
み枠はgagに比較して−１である。融合蛋白質を発現す
るにはmRNA上のgagおよびpol領域間の連結部でのリボソ
ーム“フレームシフト”および融合蛋白質の合成の完了
までのpolの読み枠中の連続的翻訳が必要である。
HIVおよび他のレトロウイルスにおいて、フレームシ
フト化の部位の近傍に顕著なRNA二次構造の形成の可能
性がある。コンピュータ予測HIV−１構造が図７に図示
されている。リボソームフレームシフト化の部位の近傍
のRNA二次構造の形成力は多数のウイルスgag−pol融合
体に存在する。T.Jacks,K.Townsley,H.E.Varmus,J.Majo
rs,Proc,Natl.Acad.Sci USA 84,4298（1987）;T.Jacks,
M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,P.J.Barr,H.E.Varmu
s,Nature 331,280（1988）；およびI.Brierley,P.Digar
d,S.C.Inglis,Cell 57,537（1989）。アンチセンス オ
リゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体によ
るHIVgagおよびpol遺伝子間の領域の標的化はgag−pol
融合蛋白質の発現の調節に効果的であることがここで発
見された。図７は本実施例で問題にしているmRNA領域を
示しており、フレームシフト化の部位の近傍の予測され
るステムループ構造およびフレームシフト部位の近傍の
gagおよびgag−pol融合蛋白質の予測されたアミノ酸配
列が含まれている。図８はリボソームフレームシフト化
および標的mRNAの翻訳が調節を受けると期待されるであ
ろう２つの代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチド類似体の配列を示している。こ
の部位へ以下の方法により結合させることにより遺伝子
発現の通常の経路を妨げることが可能であり、その結果
ウイルスを阻害する。
フト化の部位の近傍に顕著なRNA二次構造の形成の可能
性がある。コンピュータ予測HIV−１構造が図７に図示
されている。リボソームフレームシフト化の部位の近傍
のRNA二次構造の形成力は多数のウイルスgag−pol融合
体に存在する。T.Jacks,K.Townsley,H.E.Varmus,J.Majo
rs,Proc,Natl.Acad.Sci USA 84,4298（1987）;T.Jacks,
M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,P.J.Barr,H.E.Varmu
s,Nature 331,280（1988）；およびI.Brierley,P.Digar
d,S.C.Inglis,Cell 57,537（1989）。アンチセンス オ
リゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体によ
るHIVgagおよびpol遺伝子間の領域の標的化はgag−pol
融合蛋白質の発現の調節に効果的であることがここで発
見された。図７は本実施例で問題にしているmRNA領域を
示しており、フレームシフト化の部位の近傍の予測され
るステムループ構造およびフレームシフト部位の近傍の
gagおよびgag−pol融合蛋白質の予測されたアミノ酸配
列が含まれている。図８はリボソームフレームシフト化
および標的mRNAの翻訳が調節を受けると期待されるであ
ろう２つの代表的なアンチセンスオリゴヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチド類似体の配列を示している。こ
の部位へ以下の方法により結合させることにより遺伝子
発現の通常の経路を妨げることが可能であり、その結果
ウイルスを阻害する。
gag−polフレームシフト領域に特異的に結合し、翻訳
および／またはフレームシフト化に干渉する化合物はレ
トロウイルス感染のための治療薬としての活性を持って
いると信じられることが見い出された。gag−pol連結部
にRNA二次構造を持つすべてのレトロウイルスは本発明
の精神および範囲内に含まれることを意図する。レトロ
ウイルスの異なった株および型は異なった二次構造を持
つ異なったgag−pol連結部を持っているであろう。本発
明はレトロウイルスの異なった株または株の構造に相補
的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似
体の配列に変更することにより異なった株または型のレ
トロウイルスに対しても実施できる。細胞は以下のオリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体より処
理されるであろう： gag−polRNA構造は三重鎖形成（図９参照）による結合
形成により乱すことができることもまた記載されてい
る。侵入鎖によりRNA二次構造が破壊されるヘテロデュ
ープレックス形成と対象的に三重鎖形成は一般的に存在
するRNAデュープレックス水素結合パターンを保存し、
更なる水素結合によりラセン状溝中に結合する。
および／またはフレームシフト化に干渉する化合物はレ
トロウイルス感染のための治療薬としての活性を持って
いると信じられることが見い出された。gag−pol連結部
にRNA二次構造を持つすべてのレトロウイルスは本発明
の精神および範囲内に含まれることを意図する。レトロ
ウイルスの異なった株および型は異なった二次構造を持
つ異なったgag−pol連結部を持っているであろう。本発
明はレトロウイルスの異なった株または株の構造に相補
的なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似
体の配列に変更することにより異なった株または型のレ
トロウイルスに対しても実施できる。細胞は以下のオリ
ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体より処
理されるであろう： gag−polRNA構造は三重鎖形成（図９参照）による結合
形成により乱すことができることもまた記載されてい
る。侵入鎖によりRNA二次構造が破壊されるヘテロデュ
ープレックス形成と対象的に三重鎖形成は一般的に存在
するRNAデュープレックス水素結合パターンを保存し、
更なる水素結合によりラセン状溝中に結合する。
以下の配列のオリゴヌクレオチドが試験されるであろ
う： 式中Ｘは水素結合アクセプターを含むヘテロ環式塩基で
ある。翻訳およびリボソームフレームシフト化のための
アッセイはT.Jacks,M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,
P.J.Barr,H.E.Varmus,Nature 331,280（1988）に以前記
載されている。アッセイは上記オリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体を添加して前記のように実
施されるであろう。
う： 式中Ｘは水素結合アクセプターを含むヘテロ環式塩基で
ある。翻訳およびリボソームフレームシフト化のための
アッセイはT.Jacks,M.D.Power,F.R.Masiarz,P.A.Luciw,
P.J.Barr,H.E.Varmus,Nature 331,280（1988）に以前記
載されている。アッセイは上記オリゴヌクレオチドおよ
びオリゴヌクレオチド類似体を添加して前記のように実
施されるであろう。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ，ＵＳＡ．，85（1988）Ｐ．5507− 5511 Ｎａｔｕｒｅ，334（1988）Ｐ．165− 167 Ｐｒａｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．，85（1988）Ｐ．7079− 7083 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 A61K 48/00 Ｍｅｄｌｉｎｅ
Claims (8)
- 【請求項１】次のいずれかの配列： からなり、２次構造を形成しうるRNAの副部分と結合し
うる、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類
似体。 - 【請求項２】少なくとも約６個のサブユニットを有す
る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体。 - 【請求項３】少なくとも約８個から約50個のサブユニッ
トを有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド類似体。 - 【請求項４】少なくとも約10個から約50個のサブユニッ
トを有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチド類似体。 - 【請求項５】上記副部分とデュープレックスを形成しう
る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体。 - 【請求項６】上記２次構造とトリプレックスを形成しう
る、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体。 - 【請求項７】次のいずれかの配列： からなり、医学的に受容される担体中にあるオリゴヌク
レオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体。 - 【請求項８】HIV遺伝子の発現を変調させるための組成
物であって、次のいずれかの配列： からなるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド
類似体を含む組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US51892990A | 1990-05-04 | 1990-05-04 | |
| US518,929 | 1990-05-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05503633A JPH05503633A (ja) | 1993-06-17 |
| JP2800848B2 true JP2800848B2 (ja) | 1998-09-21 |
Family
ID=24066074
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3508620A Expired - Lifetime JP2800848B2 (ja) | 1990-05-04 | 1991-04-15 | Ｒｎａ二次構造への干渉による遺伝子発現の調節 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0529008B1 (ja) |
| JP (1) | JP2800848B2 (ja) |
| KR (1) | KR960015265B1 (ja) |
| AT (1) | ATE187771T1 (ja) |
| AU (1) | AU654816B2 (ja) |
| BR (1) | BR9106418A (ja) |
| CA (1) | CA2082044C (ja) |
| DE (1) | DE69131848T2 (ja) |
| HU (1) | HUT63650A (ja) |
| WO (1) | WO1991017246A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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