JPH0832242B2 - ヒト免疫不全ウイルスのアンチセンス阻害薬 - Google Patents
ヒト免疫不全ウイルスのアンチセンス阻害薬Info
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- JPH0832242B2 JPH0832242B2 JP3509815A JP50981591A JPH0832242B2 JP H0832242 B2 JPH0832242 B2 JP H0832242B2 JP 3509815 A JP3509815 A JP 3509815A JP 50981591 A JP50981591 A JP 50981591A JP H0832242 B2 JPH0832242 B2 JP H0832242B2
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、療法、特にヒト免疫不ウイルス（HIV）の
感染の処置に関するものである。本発明は、HIVその他
のレトロウイルスの活性を阻害するオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド同族体の設計、合成および使
用に関するものである。
感染の処置に関するものである。本発明は、HIVその他
のレトロウイルスの活性を阻害するオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド同族体の設計、合成および使
用に関するものである。
発明の背景 本発明は、HIV RNAの活性を変調させるための材料お
よび方法に関するものである。本発明は一般に″アンチ
センス″配合物、すなわちRNAのヌクレオチド配列と特
異的にハイブリダイズしうる配合物に関するものであ
る。本発明は好ましい形態によれば、疾病の療法処置を
達成し、実験系における遺伝子発現を調節する方法を目
的とする。
よび方法に関するものである。本発明は一般に″アンチ
センス″配合物、すなわちRNAのヌクレオチド配列と特
異的にハイブリダイズしうる配合物に関するものであ
る。本発明は好ましい形態によれば、疾病の療法処置を
達成し、実験系における遺伝子発現を調節する方法を目
的とする。
感染疾患状態を含めて哺乳動物の身体状態は大部分が
蛋白質により影響されることは周知である。これらの蛋
白質は直接に、またはそれらの酵素機能を介して作用す
ることにより、動物およびヒトにおける多くの疾病に主
として関与する。古典的な療法は一般にこれらの蛋白質
との相互作用に注目し、それらが疾病を引き起こし、ま
たは疾病を増強する機能を緩和する努力を行ってきた。
しかし最近では、それらの合成を指示する分子、すなわ
ち細胞内RNAとの相互作用によりそれらの蛋白質の実際
の産生を調整する試みがなされている。蛋白質の産生に
干渉することにより最大の効果および最小の副作用にお
いて療法結果に効果を得ることが期待された。これらの
療法の一般的な目的は、望ましくない蛋白質の形成をも
たらす遺伝子発現を妨害その他の形で変調させることで
ある。
蛋白質により影響されることは周知である。これらの蛋
白質は直接に、またはそれらの酵素機能を介して作用す
ることにより、動物およびヒトにおける多くの疾病に主
として関与する。古典的な療法は一般にこれらの蛋白質
との相互作用に注目し、それらが疾病を引き起こし、ま
たは疾病を増強する機能を緩和する努力を行ってきた。
しかし最近では、それらの合成を指示する分子、すなわ
ち細胞内RNAとの相互作用によりそれらの蛋白質の実際
の産生を調整する試みがなされている。蛋白質の産生に
干渉することにより最大の効果および最小の副作用にお
いて療法結果に効果を得ることが期待された。これらの
療法の一般的な目的は、望ましくない蛋白質の形成をも
たらす遺伝子発現を妨害その他の形で変調させることで
ある。
ある程度受け入れられている特異的遺伝子発現阻害の
ための１方法は、特異的なターゲットメッセンジャーRN
A、mRNA、配列に相補的なオリゴヌクレオチド同族体を
用いる″アンチセンス″法である。多数の研究者がこの
ような試みを報告している。関連の総説には下記のもの
が含まれる：スタインおよびコーエン（C.A.Stein,J.S.
Cohen），Cancer Research,vol.48,p.2659−2668（198
8）；ワルダー（J.Walder），Genes & Development,vo
l.2,p.502−504（1988）；マーカス−セクラ（C.J.Marc
us−Sekura），Anal.Biochemistry,vol.172,289−295
（1988）；ゾン（G.Zon），Journal of Protein Chemis
try,vol.6,p.131−145（1987）；ゾン（G.Zon），Pharm
aceutical Research,vol.5,p.539−549（1988）；ファ
ン・デル・クロル、モルおよびストゥイチェ（A.R.Van
der Krol,J.Mol,A.R.Stuitje），BioTechniques,vol.6,
p.958−973（1988）およびルーズーミッチェル（D.S.Lo
ose−Mitchell）,TIPS,vol.9,p.45−47（1988）。以上
はそれぞれ一般的アンチセンス理論に関する背景および
先行技術を提示する。
ための１方法は、特異的なターゲットメッセンジャーRN
A、mRNA、配列に相補的なオリゴヌクレオチド同族体を
用いる″アンチセンス″法である。多数の研究者がこの
ような試みを報告している。関連の総説には下記のもの
が含まれる：スタインおよびコーエン（C.A.Stein,J.S.
Cohen），Cancer Research,vol.48,p.2659−2668（198
8）；ワルダー（J.Walder），Genes & Development,vo
l.2,p.502−504（1988）；マーカス−セクラ（C.J.Marc
us−Sekura），Anal.Biochemistry,vol.172,289−295
（1988）；ゾン（G.Zon），Journal of Protein Chemis
try,vol.6,p.131−145（1987）；ゾン（G.Zon），Pharm
aceutical Research,vol.5,p.539−549（1988）；ファ
ン・デル・クロル、モルおよびストゥイチェ（A.R.Van
der Krol,J.Mol,A.R.Stuitje），BioTechniques,vol.6,
p.958−973（1988）およびルーズーミッチェル（D.S.Lo
ose−Mitchell）,TIPS,vol.9,p.45−47（1988）。以上
はそれぞれ一般的アンチセンス理論に関する背景および
先行技術を提示する。
HIVウイルスを種々のアンチセンス法により阻害する
試みがこれまで多数の研究者によりなされた。ザメクニ
クおよび共同研究者らは、逆転写酵素ブライマー部位お
よびスプライスドナー／アクセプター部位をターゲット
とするホスホジエステルオリゴヌクレオチドを用いた。
ザメクニク、グッドチャイルド、タグチ、サリン（P.C.
Zamecnik,J.Goodchild,Y.Taguchi,P.S.Sarin），Proc.N
atl.Acad.Sci.USA83,4143（1986）。グッドチャィルド
および共同研究者らは、翻訳開始部位、キャップ部位、
ポリアデニル化シグナル、５′側反復領域、およびgag
遺伝子とpol遺伝子の間の部位をターゲットとするホス
ホジエステル配合物を調製した。グッドチャイルド、ア
グラワル、シベイラ、サリン、サン、ザメクニク（J.Go
odchild,S.Agrawal,M.P.Civeira,P.S.Sarin,D.Sun,P.C.
Zamecnik），Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,5507（198
8）。グッドチャイルドの研究において、ポリアデニル
化シグナルをターゲットとすることによって極めて高い
活性が達成された。アグラワルおよび共同研究者らは、
同様にキャップおよびスプライスドナー／アクセプター
部位をターゲットとする化学的に修飾されたオリゴヌク
レオチド同族体を用いることによりグッドチャイルドの
研究を拡張した。アガルワル、グッドチャイルド、シベ
イラ、ソーントン、サリン、ザメクニク（S.Agarwal,J.
Goodchild,M.P.Civeira,A.H.Thornton,P.S.Sarin,P.C.Z
amecnik），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7079（198
8）。これらのうちの１種類の一部はHIV TAR領域の一部
と重複していたが、例示となる作用を備えていることは
認められなかった。このオリゴヌクレオチドはいずれも
HIV TAR領域に干渉すべく設計されていなかった。アグ
ラワルおよび共同研究者らは、初期感染および慢性感染
状態の細胞において感染を阻害するために、スプライス
ドナー／アクセプター部位をターゲットとするオリゴヌ
クレオチド同族体を用いた。アグラワル、イケウチ、サ
ン、サリン、コノプカ、メイゼル（S.Agrawal,T.Ikeuch
i,D.Sun,P.S.Sarin,A.Konopka,J.Maizel），Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.86,7790（1989）。
試みがこれまで多数の研究者によりなされた。ザメクニ
クおよび共同研究者らは、逆転写酵素ブライマー部位お
よびスプライスドナー／アクセプター部位をターゲット
とするホスホジエステルオリゴヌクレオチドを用いた。
ザメクニク、グッドチャイルド、タグチ、サリン（P.C.
Zamecnik,J.Goodchild,Y.Taguchi,P.S.Sarin），Proc.N
atl.Acad.Sci.USA83,4143（1986）。グッドチャィルド
および共同研究者らは、翻訳開始部位、キャップ部位、
ポリアデニル化シグナル、５′側反復領域、およびgag
遺伝子とpol遺伝子の間の部位をターゲットとするホス
ホジエステル配合物を調製した。グッドチャイルド、ア
グラワル、シベイラ、サリン、サン、ザメクニク（J.Go
odchild,S.Agrawal,M.P.Civeira,P.S.Sarin,D.Sun,P.C.
Zamecnik），Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85,5507（198
8）。グッドチャイルドの研究において、ポリアデニル
化シグナルをターゲットとすることによって極めて高い
活性が達成された。アグラワルおよび共同研究者らは、
同様にキャップおよびスプライスドナー／アクセプター
部位をターゲットとする化学的に修飾されたオリゴヌク
レオチド同族体を用いることによりグッドチャイルドの
研究を拡張した。アガルワル、グッドチャイルド、シベ
イラ、ソーントン、サリン、ザメクニク（S.Agarwal,J.
Goodchild,M.P.Civeira,A.H.Thornton,P.S.Sarin,P.C.Z
amecnik），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,7079（198
8）。これらのうちの１種類の一部はHIV TAR領域の一部
と重複していたが、例示となる作用を備えていることは
認められなかった。このオリゴヌクレオチドはいずれも
HIV TAR領域に干渉すべく設計されていなかった。アグ
ラワルおよび共同研究者らは、初期感染および慢性感染
状態の細胞において感染を阻害するために、スプライス
ドナー／アクセプター部位をターゲットとするオリゴヌ
クレオチド同族体を用いた。アグラワル、イケウチ、サ
ン、サリン、コノプカ、メイゼル（S.Agrawal,T.Ikeuch
i,D.Sun,P.S.Sarin,A.Konopka,J.Maizel），Proc.Natl.
Acad.Sci.U.S.A.86,7790（1989）。
サリンおよび共同研究者らも、キャップおよびスプラ
イスドナー／アクセプター部位をターゲットとする化学
的に修飾されたオリゴヌクレオチド同族体を用いた。サ
リン、アグラワル、シベイラ、グッドチャイルド、イケ
ウチ、ザメクニク（P.S.Sarin,S.Agarwal,M.P.Civeira,
J.Goodchild,T.Ikeuchi,P.C.Zamecnik），Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.85,7448（1988）。ザイアおよび共同研究
者らも、HIVを阻害するためにスプライスアクセプター
部位をターゲットとするオリゴヌクレオチド同族体を用
いた。ザイア、ロッシ、ムラカワ、スパローン、ステフ
ェンス、カプラン（J.A.Zaia,J.J.Rossi,G.J.Murakawa,
P.A.Spallone,D.A.Stephens,B.E.Kaplan），J.Virol.6
2,3914（1988）。マツラクおよび共同研究者らは、rev
遺伝子mRNAの翻訳開始をターゲットとするオリゴヌクレ
オチド同族体を合成した。マツクラ、シノヅカ、ゾン
（M.Matsukura,K.Shinozuka,G.Zon）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84,7706（1987）；レットシンガー、ツァ
ン、サン、イケウチ、サリン（R.L.Letsinger,G.R.Zhan
g,D.K.Sun,T.Ikeuchi,P.S.Sarin），Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.86,6553（1989）。モリおよび共同研究者ら
は、マツクラと同じ領域をターゲットとする異なるオリ
ゴヌクレオチド同族体を用いた。モリ、ボイジャー、カ
ゼナブ（K.Mori,C.Boiziau,C.Cazenave）ら，Nucleic A
cids Res.17,8207（1989）。シバハラおよび共同研究者
らは、スプライスアクセプター部位および逆転写酵素プ
ライマー結合部位をターゲットとするオリゴヌクレオチ
ド同族体を用いた。シバハラ、ムカイ、モリサワ、ナカ
シマ、コバヤシ、ヤマモト（S.Shibahara,S.Mukai,H.Mo
risawa,H.Nakashima,S.Kobayashi,N.Yamamoto），Nucle
ic Acids Res.17,239（1989）。レットシンガーおよび
共同研究者らは、スプライス部位をターゲットとする、
結合コレステロールを含むオリゴヌクレオチド同族体を
合成し、試験した。モリ、ボイジャー、カゼナブ（K.Mo
ri,C.Boiziau,C.Cazenave）ら、Nucleic Acids Res.17.
8207（1989）。スティーブンソンおよびアイバーセン
は、スプライスドナーおよびtat遺伝子の第１エクソン
の５′末端をターゲットとするオリゴヌクレオチド同族
体にポリリジンを結合させた。スティーブンソン、アイ
バーセン（M.Stevenson,P.L.Iversen），J.Gen.Virol.7
0,2673（1989）。バックおよび共同研究者らは最近、HI
V mRNAおよびDNAをターゲットとするホスフェート−メ
チル化DNAオリゴヌクレオチド同族体の使用につき述べ
ている。バック、クーレ、ファン・ジェンダーセン、ス
ミス、グリーン、ジュリアーンスおよびゴウドスミット
（H.M.Buck,L.H.Koole,M,H.P.van Gendersen,L.Smith,
J.L.M.C.Green,S.Jurriaans,J.Goudsmit），Science 24
8,208−212（1990）。
イスドナー／アクセプター部位をターゲットとする化学
的に修飾されたオリゴヌクレオチド同族体を用いた。サ
リン、アグラワル、シベイラ、グッドチャイルド、イケ
ウチ、ザメクニク（P.S.Sarin,S.Agarwal,M.P.Civeira,
J.Goodchild,T.Ikeuchi,P.C.Zamecnik），Proc.Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.85,7448（1988）。ザイアおよび共同研究
者らも、HIVを阻害するためにスプライスアクセプター
部位をターゲットとするオリゴヌクレオチド同族体を用
いた。ザイア、ロッシ、ムラカワ、スパローン、ステフ
ェンス、カプラン（J.A.Zaia,J.J.Rossi,G.J.Murakawa,
P.A.Spallone,D.A.Stephens,B.E.Kaplan），J.Virol.6
2,3914（1988）。マツラクおよび共同研究者らは、rev
遺伝子mRNAの翻訳開始をターゲットとするオリゴヌクレ
オチド同族体を合成した。マツクラ、シノヅカ、ゾン
（M.Matsukura,K.Shinozuka,G.Zon）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 84,7706（1987）；レットシンガー、ツァ
ン、サン、イケウチ、サリン（R.L.Letsinger,G.R.Zhan
g,D.K.Sun,T.Ikeuchi,P.S.Sarin），Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.86,6553（1989）。モリおよび共同研究者ら
は、マツクラと同じ領域をターゲットとする異なるオリ
ゴヌクレオチド同族体を用いた。モリ、ボイジャー、カ
ゼナブ（K.Mori,C.Boiziau,C.Cazenave）ら，Nucleic A
cids Res.17,8207（1989）。シバハラおよび共同研究者
らは、スプライスアクセプター部位および逆転写酵素プ
ライマー結合部位をターゲットとするオリゴヌクレオチ
ド同族体を用いた。シバハラ、ムカイ、モリサワ、ナカ
シマ、コバヤシ、ヤマモト（S.Shibahara,S.Mukai,H.Mo
risawa,H.Nakashima,S.Kobayashi,N.Yamamoto），Nucle
ic Acids Res.17,239（1989）。レットシンガーおよび
共同研究者らは、スプライス部位をターゲットとする、
結合コレステロールを含むオリゴヌクレオチド同族体を
合成し、試験した。モリ、ボイジャー、カゼナブ（K.Mo
ri,C.Boiziau,C.Cazenave）ら、Nucleic Acids Res.17.
8207（1989）。スティーブンソンおよびアイバーセン
は、スプライスドナーおよびtat遺伝子の第１エクソン
の５′末端をターゲットとするオリゴヌクレオチド同族
体にポリリジンを結合させた。スティーブンソン、アイ
バーセン（M.Stevenson,P.L.Iversen），J.Gen.Virol.7
0,2673（1989）。バックおよび共同研究者らは最近、HI
V mRNAおよびDNAをターゲットとするホスフェート−メ
チル化DNAオリゴヌクレオチド同族体の使用につき述べ
ている。バック、クーレ、ファン・ジェンダーセン、ス
ミス、グリーン、ジュリアーンスおよびゴウドスミット
（H.M.Buck,L.H.Koole,M,H.P.van Gendersen,L.Smith,
J.L.M.C.Green,S.Jurriaans,J.Goudsmit），Science 24
8,208−212（1990）。
HIVをターゲットとするこれらの従来の試みは、大部
分はオリゴヌクレオチド同族体に用いる化学的修飾の性
質に注目していた。上記刊行物はそれぞれある程度はウ
イルスのある機能を阻害するのに成功したことを報告し
ているが、HIVその他のレトロウイルスをターゲットと
する一般的療法方式は見出されていなかった。従って効
果的に療法用アンチセンスとして使用しうるオリゴヌク
レオチドおよびオリゴヌクレオチド同族体を設計するこ
とが長年の要望であり、依然としてそうである。
分はオリゴヌクレオチド同族体に用いる化学的修飾の性
質に注目していた。上記刊行物はそれぞれある程度はウ
イルスのある機能を阻害するのに成功したことを報告し
ているが、HIVその他のレトロウイルスをターゲットと
する一般的療法方式は見出されていなかった。従って効
果的に療法用アンチセンスとして使用しうるオリゴヌク
レオチドおよびオリゴヌクレオチド同族体を設計するこ
とが長年の要望であり、依然としてそうである。
この長年の要望は、HIVその他のレトロウイルスおよ
びウイルスに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド療
法の分野の従来の研究によって満たされなかった。他の
研究者はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド同族体が妥当な使用率において療法上有効
であるターゲット部位を同定することができなかった。
びウイルスに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド療
法の分野の従来の研究によって満たされなかった。他の
研究者はアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド同族体が妥当な使用率において療法上有効
であるターゲット部位を同定することができなかった。
発明の目的 本発明の主な目的は、ヒトの疾患、特にヒトの免疫不
全ウイルスその他のヒトレトロウイルスに対する療法を
提供することである。
全ウイルスその他のヒトレトロウイルスに対する療法を
提供することである。
本発明の他の目的は、mRNAの構造を混乱させる分子、
特にオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド同族
体を提供することである。
特にオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド同族
体を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、細胞における遺伝子の発
現を変調させることである。
現を変調させることである。
他の目的は、RNA構造体とオリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド同族体との相互作用によりRNAの二
次構造に干渉することである。
オリゴヌクレオチド同族体との相互作用によりRNAの二
次構造に干渉することである。
本発明のこれらおよび他の目的は本明細書を参照する
ことによって明らかになるであろう。
ことによって明らかになるであろう。
発明の要約 HIVをターゲットとするアンチセンスに対する従来の
試みは、感染の成立にとって必須であると考えられるあ
る特定のウイルス蛋白質の合成を阻害することに注目し
ていた。本発明の場合、同一の目標（ウイルス遺伝子発
現の阻害）が達成されるが、HIVその他のレトロウイル
スRNA上の特定の部位をターゲットとすることによっ
て、より大きな、療法上重要な活性が得られる。本発明
において、重要な生物学的機能をもつターゲットRNAが
鍵部位であることが見出された。これらのRNA領域をタ
ーゲットとすることがオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド同族体を用いるアンチセンス療法の鍵であ
ると判定された。
試みは、感染の成立にとって必須であると考えられるあ
る特定のウイルス蛋白質の合成を阻害することに注目し
ていた。本発明の場合、同一の目標（ウイルス遺伝子発
現の阻害）が達成されるが、HIVその他のレトロウイル
スRNA上の特定の部位をターゲットとすることによっ
て、より大きな、療法上重要な活性が得られる。本発明
において、重要な生物学的機能をもつターゲットRNAが
鍵部位であることが見出された。これらのRNA領域をタ
ーゲットとすることがオリゴヌクレオチドおよびオリゴ
ヌクレオチド同族体を用いるアンチセンス療法の鍵であ
ると判定された。
tatRNA構造に特異的に結合し、tatトランス活性化（t
rans−activation）に干渉する配合物がHIV感染に対す
る療法薬としての活性をもつことが今回見出された。HI
Vのすべての株が本発明の精神および範囲に含まれるも
のとする。異なるHIV株は異なるtatRNA配列をもつ可能
性があるが、本発明はオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド同族体の配列を本発明方法に従って異なる
株の構造に相補的となるように変化させることにより、
異なるHIV株について実施することができる。
rans−activation）に干渉する配合物がHIV感染に対す
る療法薬としての活性をもつことが今回見出された。HI
Vのすべての株が本発明の精神および範囲に含まれるも
のとする。異なるHIV株は異なるtatRNA配列をもつ可能
性があるが、本発明はオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド同族体の配列を本発明方法に従って異なる
株の構造に相補的となるように変化させることにより、
異なるHIV株について実施することができる。
本発明によれば、遺伝子の発現を変調させる方法が提
供される。ターゲットとされるRNAまたはそれを含む細
胞を、そのRNAの少なくとも１部分と結合しうるオリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体と接触さ
せる。その遺伝子は一般に生物において疾病状態を引き
起こすと考えられるものであり、一般的にはウイルスま
たは好ましくはレトロウイルス、例えばHIVであるが、
ウイルスまたはレトロウイルス感染を伴う疑いのある動
物にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族
体を投与することにより他の感染性生物を同様に攻撃し
て、疾病状態を処置する療法を得ることができる。
供される。ターゲットとされるRNAまたはそれを含む細
胞を、そのRNAの少なくとも１部分と結合しうるオリゴ
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体と接触さ
せる。その遺伝子は一般に生物において疾病状態を引き
起こすと考えられるものであり、一般的にはウイルスま
たは好ましくはレトロウイルス、例えばHIVであるが、
ウイルスまたはレトロウイルス感染を伴う疑いのある動
物にオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族
体を投与することにより他の感染性生物を同様に攻撃し
て、疾病状態を処置する療法を得ることができる。
特にレトロウイルス、たとえばHIVに対して、感染を
軽減する効果をもつオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド同族体を設計しうることが今回見出された。
HIVに対しては、多数の有効な配列が見出されており、
当業者は他のものを容易に同定しうるであろう。これら
の配列は、HIVのtat領域を阻害するのに有効であり、HI
V療法が得られることが証明された最初の実際上有効な
アンチセンス配列である。従って本発明は、HIVのtatmR
NAの少なくとも１部分と結合しうるオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド同族体を提供する。これらの
オリゴヌクレオチドおよび同族体は下記のヌクレオチド
配列に相当することが認められた。
軽減する効果をもつオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌ
クレオチド同族体を設計しうることが今回見出された。
HIVに対しては、多数の有効な配列が見出されており、
当業者は他のものを容易に同定しうるであろう。これら
の配列は、HIVのtat領域を阻害するのに有効であり、HI
V療法が得られることが証明された最初の実際上有効な
アンチセンス配列である。従って本発明は、HIVのtatmR
NAの少なくとも１部分と結合しうるオリゴヌクレオチド
およびオリゴヌクレオチド同族体を提供する。これらの
オリゴヌクレオチドおよび同族体は下記のヌクレオチド
配列に相当することが認められた。
これらのオリゴヌクレオチドおよび同族体は、これらの
配列の、少なくとも約６の連続サブユニットを含むこと
が好ましく、約10が好ましく、約15がよりいっそう好ま
しい。ある形態については、オリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド同族体が実質的に上記配列に相当す
ることが好ましい。これはオリゴヌクレオチドまたは同
族体が上記配列のサブユニットまたは有効な置換体をす
べて含むことを意味する。たとえば野性型オリゴヌクレ
オチドにおいてＴの代わりにＵという置換がなされても
よい。さらにもちろん、本発明の精神から逸脱すること
なくオリゴヌクレオチド同族体を形成する他の化学的修
飾をなしうる。
配列の、少なくとも約６の連続サブユニットを含むこと
が好ましく、約10が好ましく、約15がよりいっそう好ま
しい。ある形態については、オリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチド同族体が実質的に上記配列に相当す
ることが好ましい。これはオリゴヌクレオチドまたは同
族体が上記配列のサブユニットまたは有効な置換体をす
べて含むことを意味する。たとえば野性型オリゴヌクレ
オチドにおいてＴの代わりにＵという置換がなされても
よい。さらにもちろん、本発明の精神から逸脱すること
なくオリゴヌクレオチド同族体を形成する他の化学的修
飾をなしうる。
上記の配列部分は効果をもつと思われる特定の配列内
のいずれの位置にあってもよい。オリゴヌクレオチドお
よび同族体、たとえば好ましいホスホロチオエート同族
体を、薬剤学的に受容しうるキャリヤー中において提供
してもよい。
のいずれの位置にあってもよい。オリゴヌクレオチドお
よび同族体、たとえば好ましいホスホロチオエート同族
体を、薬剤学的に受容しうるキャリヤー中において提供
してもよい。
遺伝子の発現、特にtat遺伝子の発現を阻害する方法
も見出された。この阻害は療法、診断または研究のため
に利用することができる。たとえばtat遺伝子発現を特
色とする疾病、特にエイズを伴う疑いのある動物の処置
法において、それらの動物を本発明によるオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド同族体と接触させるこ
とよりなる方法が見出された。
も見出された。この阻害は療法、診断または研究のため
に利用することができる。たとえばtat遺伝子発現を特
色とする疾病、特にエイズを伴う疑いのある動物の処置
法において、それらの動物を本発明によるオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド同族体と接触させるこ
とよりなる方法が見出された。
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体
が少なくとも約６サブユニットのRNA部分と結合しうる
ことが好ましい。８−50ユニットに結合しうることがよ
り好ましく、約10−約20サブユニットがよりいっそう好
ましい。
が少なくとも約６サブユニットのRNA部分と結合しうる
ことが好ましい。８−50ユニットに結合しうることがよ
り好ましく、約10−約20サブユニットがよりいっそう好
ましい。
好ましい形態によれば、オリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド同族体はRNAの部分と２重らせん構造
を形成しうる。相互作用の機構は確実には分かっていな
いが、それは多数の様式で遺伝子発現の変調を生じると
いうことが考えられる。
リゴヌクレオチド同族体はRNAの部分と２重らせん構造
を形成しうる。相互作用の機構は確実には分かっていな
いが、それは多数の様式で遺伝子発現の変調を生じると
いうことが考えられる。
好ましい形態によれば、干渉されるRNA部分はHIVのta
t mRNAの少なくとも１部分をなす。本発明によるオリゴ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド同族体はそれ自
体新規であると考えられる。たとえばtatRNAの部分と相
互作用しうるオリゴヌクレオチドが包含される。たとえ
ばその疾病を伴う疑いのある動物を、tatRNAと結合しう
るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体
と接触させる。特に本発明は哺乳動物、殊にヒトのHIV
感染の処置に有効であると考えられる。
t mRNAの少なくとも１部分をなす。本発明によるオリゴ
ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド同族体はそれ自
体新規であると考えられる。たとえばtatRNAの部分と相
互作用しうるオリゴヌクレオチドが包含される。たとえ
ばその疾病を伴う疑いのある動物を、tatRNAと結合しう
るオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体
と接触させる。特に本発明は哺乳動物、殊にヒトのHIV
感染の処置に有効であると考えられる。
図面の簡単な説明 第１図は、線状HIV−1 tat mRNA配列を示す。
第２図は、TAR/tatトランス活性化に関する細胞培養
アッセイにおける本発明による一連のオリゴヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチド同族体の活性を示す。
アッセイにおける本発明による一連のオリゴヌクレオチ
ドおよびオリゴヌクレオチド同族体の活性を示す。
好ましい形態の詳細な説明 細胞内のHIV−1 tat RNA活性を、そのtat mRNAに結合
するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族
体の導入により調節しうることが見出された。これらの
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体は
上記mRNAの正常な機能に干渉し、これらの方法は疾病、
特にHIVを処置するために採用しうる。
するオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族
体の導入により調節しうることが見出された。これらの
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体は
上記mRNAの正常な機能に干渉し、これらの方法は疾病、
特にHIVを処置するために採用しうる。
本発明に関してオリゴヌクレオチドという語は、天然
のホスホジエステル結合により結合した天然の塩基およ
びシクロフラノシル基から形成される複数の結合ヌクレ
オチド単位を意味する。この語は実際には天然種または
天然のサブユニットから形成された合成種を意味する。
のホスホジエステル結合により結合した天然の塩基およ
びシクロフラノシル基から形成される複数の結合ヌクレ
オチド単位を意味する。この語は実際には天然種または
天然のサブユニットから形成された合成種を意味する。
″オリゴヌクレオチド同族体″は、この語が本発明に
関して用いられる場合、オリゴヌクレオチドと同様に機
能するが、天然でない部分を含むものを意味する。たと
えばオリゴヌクレオチド同族体は変化した糖部分または
糖間結合を含みうる。これらの例には、当技術分野で用
いることが知られているホスホロチオエートその他のイ
オウ含有種が含まれる。それらは本発明の精神と一致す
る変化した塩基単位または他の修飾を含んでもよい。
関して用いられる場合、オリゴヌクレオチドと同様に機
能するが、天然でない部分を含むものを意味する。たと
えばオリゴヌクレオチド同族体は変化した糖部分または
糖間結合を含みうる。これらの例には、当技術分野で用
いることが知られているホスホロチオエートその他のイ
オウ含有種が含まれる。それらは本発明の精神と一致す
る変化した塩基単位または他の修飾を含んでもよい。
ある好ましい形態によれば、オリゴヌクレオチドのホ
スホジエステル結合の少なくとも若干は、その活性を変
調させるべきRNAが位置する細胞領域内へ組成物が透過
する能力を高める機能をもつ構造体により置換されてい
る。このような結合はイオウを含有することが好まし
い。このような置換がホスホロチオエート結合からなる
ことが現在では好ましい。他のもの、たとえばアルキル
ホスホチオエート結合、Ｎ−アルキルホスホルアミデー
ト、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、お
よび短鎖アルキルまたはシクロアルキル構造体も有用で
ある。他の好ましい形態によれば、ホスホジエステル結
合は同時に実質的に非イオン性かつ非キラル性である構
造体により置換されている。当業者は本発明の実施に際
して使用しうる他の結合を選択することができるであろ
う。
スホジエステル結合の少なくとも若干は、その活性を変
調させるべきRNAが位置する細胞領域内へ組成物が透過
する能力を高める機能をもつ構造体により置換されてい
る。このような結合はイオウを含有することが好まし
い。このような置換がホスホロチオエート結合からなる
ことが現在では好ましい。他のもの、たとえばアルキル
ホスホチオエート結合、Ｎ−アルキルホスホルアミデー
ト、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、お
よび短鎖アルキルまたはシクロアルキル構造体も有用で
ある。他の好ましい形態によれば、ホスホジエステル結
合は同時に実質的に非イオン性かつ非キラル性である構
造体により置換されている。当業者は本発明の実施に際
して使用しうる他の結合を選択することができるであろ
う。
本発明の形態に用いるためには、一般にオリゴヌクレ
オチドまたはオリゴヌクレオチド同族体の少なくとも若
干のサブユニットにおいて結合糖部分の２′位が置換さ
れていることが好ましい。たとえば２′置換基、たとえ
ばOH、SH、Ｆ、OCH3、OCN、OCHnCH3（式中のｎは１−約
20である）、および同様な特性をもつ他の置換基が若干
の形態においては有用である。
オチドまたはオリゴヌクレオチド同族体の少なくとも若
干のサブユニットにおいて結合糖部分の２′位が置換さ
れていることが好ましい。たとえば２′置換基、たとえ
ばOH、SH、Ｆ、OCH3、OCN、OCHnCH3（式中のｎは１−約
20である）、および同様な特性をもつ他の置換基が若干
の形態においては有用である。
オリゴヌクレオチド同族体には、少なくとも若干の修
飾された塩基形を含む種も含まれる。たとえば普通に天
然に見られるもの以外のプリン類およびピリミジン類も
このように用いることができる。同様に、本発明の本質
的見解が固守される限り、ヌクレオチドサブユニットの
シクロフラノース部分における修飾も起こりうる。
飾された塩基形を含む種も含まれる。たとえば普通に天
然に見られるもの以外のプリン類およびピリミジン類も
このように用いることができる。同様に、本発明の本質
的見解が固守される限り、ヌクレオチドサブユニットの
シクロフラノース部分における修飾も起こりうる。
このような同族体は、機能的には天然のオリゴヌクレ
オチド（または天然の系列に沿った合成オリゴヌクレオ
チド）と互換性があるが、天然の構造体とは１または２
以上の相異をもつものであると記述するのが最良であ
る。このような同族体はすべて、それらがtat RNAの選
ばれた部分に効果的に結合する機能をもつ限り、本発明
に包含される。
オチド（または天然の系列に沿った合成オリゴヌクレオ
チド）と互換性があるが、天然の構造体とは１または２
以上の相異をもつものであると記述するのが最良であ
る。このような同族体はすべて、それらがtat RNAの選
ばれた部分に効果的に結合する機能をもつ限り、本発明
に包含される。
本発明によるオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド同族体は、好ましくは約３−約100サブユニット
からなる。このようなオリゴヌクレオチドおよび同族体
が少なくとも約６サブユニットからなることが好まし
く、約８−約50サブユニットがより好ましく、約10−約
20サブユニットを含むことがよりいっそう好ましい。自
明のとおり、サブユニットはホスホジエステルその他の
結合により隣接サブユニットに適切な状態で結合した塩
基と糖の組み合わせである。
オチド同族体は、好ましくは約３−約100サブユニット
からなる。このようなオリゴヌクレオチドおよび同族体
が少なくとも約６サブユニットからなることが好まし
く、約８−約50サブユニットがより好ましく、約10−約
20サブユニットを含むことがよりいっそう好ましい。自
明のとおり、サブユニットはホスホジエステルその他の
結合により隣接サブユニットに適切な状態で結合した塩
基と糖の組み合わせである。
本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチ
ド同族体は、診断、療法に、ならびに研究用試薬、およ
びキットとして使用しうる。療法に用いるためには、ウ
イルス性またはレトロウイルス性感染、たとえばエイズ
に冒された動物、特にヒトに、上記のオリゴヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド同族体を投与する。
ド同族体は、診断、療法に、ならびに研究用試薬、およ
びキットとして使用しうる。療法に用いるためには、ウ
イルス性またはレトロウイルス性感染、たとえばエイズ
に冒された動物、特にヒトに、上記のオリゴヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド同族体を投与する。
一般に本発明による療法薬を体内に、たとえば経口
的、静脈内または筋肉内に付与することが好ましい。他
の投与形態、たとえば経皮、局所または病巣内投与も有
用である。坐剤に含有させることも有用である。予防に
おける本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド同族体の使用も有用であると思われる。若干の形
態については薬剤学的に受容しうるキャリヤーの使用も
好ましい。
的、静脈内または筋肉内に付与することが好ましい。他
の投与形態、たとえば経皮、局所または病巣内投与も有
用である。坐剤に含有させることも有用である。予防に
おける本発明のオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレ
オチド同族体の使用も有用であると思われる。若干の形
態については薬剤学的に受容しうるキャリヤーの使用も
好ましい。
本発明によればオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチド同族体とRNAの部分またはサブポーション（sub
portion）との相互作用を意味する語″結合する（to bi
nd）″が数種の関連をもちうることは理解されるであろ
う。たとえば本発明には、オリゴヌクレオチドまたは同
族体とtatRNAの少なくとも１部分との結合が含まれる。
オリゴヌクレオチドまたは同族体がRNA部分の少なくと
も１部分とワトソン−クリック様式で結合して、局部的
にそのRNA部分とオリゴヌクレオチドまたは同族体との
間でヘテロ２本鎖を形成することは理解されるであろ
う。このヘテロ２本鎖の形成によりそのRNA部分の構造
または機能が変化すると考えられる。この作用の厳密な
機構および結果は正確には分かっていないが、そのRNA
部分の正常な構造または機能がRNAの１または２以上の
部分とオリゴヌクレオチドが結合することにより次第に
置換されると考えられる。新たなヘテロ２本鎖に伴う電
子的および立体的因子はその天然のRNA部分のものと異
なるので、そのRNAから蛋白質を産生する機能の効率お
よび性質が干渉される。その結果生じる蛋白質産生の欠
損または喪失自体が全体として、RNAをコードする遺伝
子の発現の変調として現れる。
レオチド同族体とRNAの部分またはサブポーション（sub
portion）との相互作用を意味する語″結合する（to bi
nd）″が数種の関連をもちうることは理解されるであろ
う。たとえば本発明には、オリゴヌクレオチドまたは同
族体とtatRNAの少なくとも１部分との結合が含まれる。
オリゴヌクレオチドまたは同族体がRNA部分の少なくと
も１部分とワトソン−クリック様式で結合して、局部的
にそのRNA部分とオリゴヌクレオチドまたは同族体との
間でヘテロ２本鎖を形成することは理解されるであろ
う。このヘテロ２本鎖の形成によりそのRNA部分の構造
または機能が変化すると考えられる。この作用の厳密な
機構および結果は正確には分かっていないが、そのRNA
部分の正常な構造または機能がRNAの１または２以上の
部分とオリゴヌクレオチドが結合することにより次第に
置換されると考えられる。新たなヘテロ２本鎖に伴う電
子的および立体的因子はその天然のRNA部分のものと異
なるので、そのRNAから蛋白質を産生する機能の効率お
よび性質が干渉される。その結果生じる蛋白質産生の欠
損または喪失自体が全体として、RNAをコードする遺伝
子の発現の変調として現れる。
要約すると、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレ
オチド同族体とtatRNAとの相互作用または結合はいずれ
も、RNAの機能に干渉し、従ってそのRNAが由来する遺伝
子の発現を変調させる可能性をもつと考えられる。ター
ゲットの部分に対応するオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド同族体が感染細胞に投与された場合にHI
V活性の全体的低下を示すtatRNAターゲットが見出され
た。
オチド同族体とtatRNAとの相互作用または結合はいずれ
も、RNAの機能に干渉し、従ってそのRNAが由来する遺伝
子の発現を変調させる可能性をもつと考えられる。ター
ゲットの部分に対応するオリゴヌクレオチドまたはオリ
ゴヌクレオチド同族体が感染細胞に投与された場合にHI
V活性の全体的低下を示すtatRNAターゲットが見出され
た。
多様なオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド
同族体が本発明の実施に際して有用であると考えられる
が、それらのオリゴヌクレオチドおよび同族体を少なく
とも６サブユニットのRNA部分と結合すべく設計するの
が好ましいことが認められた。他の好ましい形態によれ
ば、約６−約30、よりいっそう好ましくは約10−約20サ
ブユニットと結合するオリゴヌクレオチドが好ましい。
前記のように、現在ではHIVのtatRNAが本発明に用いる
ための卓越したターゲットであると考えられる。従って
HIVのtatRNA領域の１または２以上の部分とと結合する
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体を
調製することが好ましい。
同族体が本発明の実施に際して有用であると考えられる
が、それらのオリゴヌクレオチドおよび同族体を少なく
とも６サブユニットのRNA部分と結合すべく設計するの
が好ましいことが認められた。他の好ましい形態によれ
ば、約６−約30、よりいっそう好ましくは約10−約20サ
ブユニットと結合するオリゴヌクレオチドが好ましい。
前記のように、現在ではHIVのtatRNAが本発明に用いる
ための卓越したターゲットであると考えられる。従って
HIVのtatRNA領域の１または２以上の部分とと結合する
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド同族体を
調製することが好ましい。
療法は本発明の特別な目的である。従って薬剤学的に
受容しうるキャリヤー中における本発明によるオリゴヌ
クレオチドおよびオリゴヌクレオチド同族体を提供する
ことは極めて有用である。これは疾病エイズの処置に関
して特にそうである。
受容しうるキャリヤー中における本発明によるオリゴヌ
クレオチドおよびオリゴヌクレオチド同族体を提供する
ことは極めて有用である。これは疾病エイズの処置に関
して特にそうである。
全体として、前記の疾病状態を伴う疑いのある患者に
その疾病の症状を軽減するのに有効である量の、かつそ
の処置計画に基づいた量のオリゴヌクレオチドまたは同
族体を、そのままの形で、またはキャリヤー媒質中に懸
濁して投与することが好ましい。このような処置法に最
適な用量および処置計画を決定することは当業者が容易
になしうる範囲のものである。
その疾病の症状を軽減するのに有効である量の、かつそ
の処置計画に基づいた量のオリゴヌクレオチドまたは同
族体を、そのままの形で、またはキャリヤー媒質中に懸
濁して投与することが好ましい。このような処置法に最
適な用量および処置計画を決定することは当業者が容易
になしうる範囲のものである。
HIVゲノム中の複雑な１組の制御要素が、そのウイル
スが複製されるか、または潜伏状態を維持するかを決定
する。HIVゲノム中に同定された９遺伝子のうち３遺伝
子のみがコアおよびエンベロープに由来する。ヘイゼル
タイン、ワン−スタール（W.A.Haseltine,F.Wong−Staa
l），Scientific American 10月52（1988）。他の６遺
伝子はウイルス蛋白質の産生の調節に関与する。調節遺
伝子は、ウイルスゲノム上の他のいずれかの位置にある
応答性要素と相互作用する蛋白質をコードすることによ
り作動する。複製バーストの開始に関与する主要な調節
遺伝子はtat（トランスアクチベーター）遺伝子であ
る。第１図はHIV中のtat領域のcDNAに関する配列であ
る。tat遺伝子の産物であるtat蛋白質は、TAR（トラン
ス作用性応答要素）として知られる短い配列の要素と相
互作用することにより作動する。TAR配列はウイルスの
長末端反復（LTR）中にコードされ、従ってあらゆるHIV
遺伝子からのmRNAに含まれる。
スが複製されるか、または潜伏状態を維持するかを決定
する。HIVゲノム中に同定された９遺伝子のうち３遺伝
子のみがコアおよびエンベロープに由来する。ヘイゼル
タイン、ワン−スタール（W.A.Haseltine,F.Wong−Staa
l），Scientific American 10月52（1988）。他の６遺
伝子はウイルス蛋白質の産生の調節に関与する。調節遺
伝子は、ウイルスゲノム上の他のいずれかの位置にある
応答性要素と相互作用する蛋白質をコードすることによ
り作動する。複製バーストの開始に関与する主要な調節
遺伝子はtat（トランスアクチベーター）遺伝子であ
る。第１図はHIV中のtat領域のcDNAに関する配列であ
る。tat遺伝子の産物であるtat蛋白質は、TAR（トラン
ス作用性応答要素）として知られる短い配列の要素と相
互作用することにより作動する。TAR配列はウイルスの
長末端反復（LTR）中にコードされ、従ってあらゆるHIV
遺伝子からのmRNAに含まれる。
tat蛋白質の発現により、tat遺伝子自身を含めて他の
HIV遺伝子の発現が最高1,000倍増大する。この自動制御
による正のフィードバック、およびTAR配列があらゆるH
IV転写体からのmRNAに含まれるという事実のため、tat
遺伝子が活性化されると膨大な量の遺伝子発現の引き金
が引かれる。従ってtat遺伝子とTAR要素の相互作用はHI
Vのライフサイクルにとって極めて重要であり、この相
互作用を特異的に混乱させることによりこのウイルスの
増殖が妨害されと思われる。
HIV遺伝子の発現が最高1,000倍増大する。この自動制御
による正のフィードバック、およびTAR配列があらゆるH
IV転写体からのmRNAに含まれるという事実のため、tat
遺伝子が活性化されると膨大な量の遺伝子発現の引き金
が引かれる。従ってtat遺伝子とTAR要素の相互作用はHI
Vのライフサイクルにとって極めて重要であり、この相
互作用を特異的に混乱させることによりこのウイルスの
増殖が妨害されと思われる。
tat蛋白質によるTAR含有遺伝子のトランス活性化の機
構が最近熱心に研究された。シャープ、マルシニアク
（Philip,A.Sharp,Robert,A.Marciniak），Cell 59,229
（1989）。研究すべきことは多数残されてはいるが、重
要な２点が明らかになった；すなわちtatはウイルスmRN
Aの量およびその翻訳の効率の双方を高めることによりT
AR含有遺伝子の発現を高めるという点、ならびにTARはD
NA構造体としてではなくRNA構造体として機能するとい
う点である。
構が最近熱心に研究された。シャープ、マルシニアク
（Philip,A.Sharp,Robert,A.Marciniak），Cell 59,229
（1989）。研究すべきことは多数残されてはいるが、重
要な２点が明らかになった；すなわちtatはウイルスmRN
Aの量およびその翻訳の効率の双方を高めることによりT
AR含有遺伝子の発現を高めるという点、ならびにTARはD
NA構造体としてではなくRNA構造体として機能するとい
う点である。
tatはTAR含有遺伝子の転写を高めるが、これはRNA中
のTAR要素との相互作用により行われるという異例の結
論は、多数の所見から導かれた。シャープ、マルシニア
ク（Philip,A.Sharp,Robert,A.Marciniak），Cell 59,2
29（1989）。トランス活性化を達成するためには、TAR
要素は転写開始部位のすぐ下流に位置しなければならな
い。さらにTARは配向依存性であり；逆配向で挿入され
た場合、それは機能し得ない。
のTAR要素との相互作用により行われるという異例の結
論は、多数の所見から導かれた。シャープ、マルシニア
ク（Philip,A.Sharp,Robert,A.Marciniak），Cell 59,2
29（1989）。トランス活性化を達成するためには、TAR
要素は転写開始部位のすぐ下流に位置しなければならな
い。さらにTARは配向依存性であり；逆配向で挿入され
た場合、それは機能し得ない。
tatがRNA構造体としてのTARと相互作用するという極
めて協力な幾つかの証拠は、突然変異誘発実験により得
られた。HIV−１からのtat蛋白質がHIV−２（異なるウ
イルス株）のTAR領域を含むベクターを、これら２株間
にTAR領域の一次配列相同性がごくわずかしかないにも
かかわらずトランス活性化し得たという所見によって、
TAR要素を研究する活動が促進された。フェン、ホラン
ド（S.Feng,E.C.Holland），Nature 334,165（1988）。
しかしRNAを予想するコンピータープログラムによるHIV
−１およびHIV−２からのTAR配列の調査は、HIV−１のT
AR領域における１個のステム・ループ、およびHIV−２
における３個のステム・ループ構造を含む、RNAステム
・ループ構造の可能性を二次的に明らかにした。ステム
の組成および長さは異なるが、４ループはすべて1Aおよ
び1B図に示されるようにペンタヌクレオチドCUGGGを含
んでいた。ループ内に存在するヌクレオチドはソレゾレ
tatによるトランス活性化に絶対的に必須であるが、ス
テム構造が維持される限りステム内における塩基の置換
はある程度は許容されるということが、突然変異誘発実
験により明らかになった。フェン、ホランド（S.Feng,
E.C.Holland），Nature 334,165（1988）。
めて協力な幾つかの証拠は、突然変異誘発実験により得
られた。HIV−１からのtat蛋白質がHIV−２（異なるウ
イルス株）のTAR領域を含むベクターを、これら２株間
にTAR領域の一次配列相同性がごくわずかしかないにも
かかわらずトランス活性化し得たという所見によって、
TAR要素を研究する活動が促進された。フェン、ホラン
ド（S.Feng,E.C.Holland），Nature 334,165（1988）。
しかしRNAを予想するコンピータープログラムによるHIV
−１およびHIV−２からのTAR配列の調査は、HIV−１のT
AR領域における１個のステム・ループ、およびHIV−２
における３個のステム・ループ構造を含む、RNAステム
・ループ構造の可能性を二次的に明らかにした。ステム
の組成および長さは異なるが、４ループはすべて1Aおよ
び1B図に示されるようにペンタヌクレオチドCUGGGを含
んでいた。ループ内に存在するヌクレオチドはソレゾレ
tatによるトランス活性化に絶対的に必須であるが、ス
テム構造が維持される限りステム内における塩基の置換
はある程度は許容されるということが、突然変異誘発実
験により明らかになった。フェン、ホランド（S.Feng,
E.C.Holland），Nature 334,165（1988）。
RNAとして機能するTAR構造に関する他の証拠は、ステ
ム・ループ構造をフランクする配列を変化させて天然の
TARステム・ループより安定なRNAの競合性二次構造体を
形成する実験により得られた。バークハウト（B.Berkho
ut），Cell 59,273（1989）。これは、ステム・ループ
構造の５′側にTAR側に対してアンチセンスである付加
的な配列をTAR含有RNA内へ導入することにより達成され
た。この修飾されたTAR構造体のトランス活性化は消失
した。これはTAR配列のみではトランス活性化に十分で
はなく、活性であるためにはこれらの配列が適正な二次
構造に折り畳まれていなければならないことを示唆す
る。これはTARステム・ループに対するアンチセンス配
列が天然のRNA構造体を混乱させうることをも示唆す
る。
ム・ループ構造をフランクする配列を変化させて天然の
TARステム・ループより安定なRNAの競合性二次構造体を
形成する実験により得られた。バークハウト（B.Berkho
ut），Cell 59,273（1989）。これは、ステム・ループ
構造の５′側にTAR側に対してアンチセンスである付加
的な配列をTAR含有RNA内へ導入することにより達成され
た。この修飾されたTAR構造体のトランス活性化は消失
した。これはTAR配列のみではトランス活性化に十分で
はなく、活性であるためにはこれらの配列が適正な二次
構造に折り畳まれていなければならないことを示唆す
る。これはTARステム・ループに対するアンチセンス配
列が天然のRNA構造体を混乱させうることをも示唆す
る。
TARステム・ループ構造に関する直接の生化学的証拠
も得られた。TAR RNAがインビトロで酵素により合成さ
れ、RNAの１本鎖領域を選択的に開裂させるが２本鎖構
造は開裂させない酵素を用いて証明された。この酵素開
裂パターンの結果は、コンピュータが予想したRNA二次
構造と一致した。バークハウト（B.Berkhout），Cell 5
9,273（1989）。
も得られた。TAR RNAがインビトロで酵素により合成さ
れ、RNAの１本鎖領域を選択的に開裂させるが２本鎖構
造は開裂させない酵素を用いて証明された。この酵素開
裂パターンの結果は、コンピュータが予想したRNA二次
構造と一致した。バークハウト（B.Berkhout），Cell 5
9,273（1989）。
要約すると、HIV tat蛋白質は膨大な量のウイルス遺
伝子発現の引き金を引くことに関与し、これがあらゆる
HIV mRNA転写体に含まれるTAR配列との相互作用により
起こり、HIV TAR配列はRNA構造として機能し、そして適
正なTAR RNA構造がtatトランス活性化にとって必須であ
るという強力かつ直接的な証拠が多数の研究から得られ
た。
伝子発現の引き金を引くことに関与し、これがあらゆる
HIV mRNA転写体に含まれるTAR配列との相互作用により
起こり、HIV TAR配列はRNA構造として機能し、そして適
正なTAR RNA構造がtatトランス活性化にとって必須であ
るという強力かつ直接的な証拠が多数の研究から得られ
た。
HIVゲノムから遺伝子を取り出し、それらを細胞系内
で隔離して調べることにより、TARおよびtatの機能が研
究された。tat蛋白質とTAR要素の相互作用を調べるため
にベクターが構成された。tat遺伝子はSV40プロモータ
ーの下で発現される。TAR領域は、容易にアッセイされ
るリポーター遺伝子、胎盤性アルカリホスファターゼ遺
伝子（PAP）、に融合した別個のプラスミドから発現さ
れる。ヘンソーン、ゼルボス、ラデューチャ、ハリス、
カデシュ（P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,
T.Kadesch），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（198
8）。細胞培養モデルにおける酵素活性はTAR領域の本質
的要素の存在およびtat蛋白質の存在の双方に依存する
ことが示された。シャープ、マルシニアク、（P.Sharp,
R.Marciniak），Cell 59,229（1989）；フェン、ホラン
ド（S.Feng,E.C.Holland），Nature 334,165（1988）；
ラプシア、ライス、マシューズ（Michael,F.Laspia,And
rew,P.Rice,Michael,B.Mathews），Cell 59,283（198
9）；ガルシア、ハリッヒ、サウルタナキス、ウー、ミ
ツヤス、ガイノー（J.A.Garcia,D.Harrich,E.Soultanak
is,F,Wu,R.Mitsuyasu,R.B.Gaynor），EMBO J.8,765（19
89）；およびバークハウト（B.Berkhout），Cell 59,27
3（1989）。本質的にこのベクター系はHIV感染細胞内で
起こるtat仲介TARトランス活性化の事象を再構成する。
で隔離して調べることにより、TARおよびtatの機能が研
究された。tat蛋白質とTAR要素の相互作用を調べるため
にベクターが構成された。tat遺伝子はSV40プロモータ
ーの下で発現される。TAR領域は、容易にアッセイされ
るリポーター遺伝子、胎盤性アルカリホスファターゼ遺
伝子（PAP）、に融合した別個のプラスミドから発現さ
れる。ヘンソーン、ゼルボス、ラデューチャ、ハリス、
カデシュ（P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,
T.Kadesch），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（198
8）。細胞培養モデルにおける酵素活性はTAR領域の本質
的要素の存在およびtat蛋白質の存在の双方に依存する
ことが示された。シャープ、マルシニアク、（P.Sharp,
R.Marciniak），Cell 59,229（1989）；フェン、ホラン
ド（S.Feng,E.C.Holland），Nature 334,165（1988）；
ラプシア、ライス、マシューズ（Michael,F.Laspia,And
rew,P.Rice,Michael,B.Mathews），Cell 59,283（198
9）；ガルシア、ハリッヒ、サウルタナキス、ウー、ミ
ツヤス、ガイノー（J.A.Garcia,D.Harrich,E.Soultanak
is,F,Wu,R.Mitsuyasu,R.B.Gaynor），EMBO J.8,765（19
89）；およびバークハウト（B.Berkhout），Cell 59,27
3（1989）。本質的にこのベクター系はHIV感染細胞内で
起こるtat仲介TARトランス活性化の事象を再構成する。
TAT/TARトランス活性化は、ヒト胎盤性アルカリホス
ファターゼ遺伝子（PAP）をHIV−1 LTR配列−−エンハ
ンサー、プロモーターおよびtar要素を含む−−の制御
下におくことにより簡便にアッセイしうる。HIV−1 LTR
を含むプラスミド、pHIVCAT−０（フェン、ホランド
（S.Feng,E.C.Holland），Nature 334,165（1988））は
HIV U3の全体、および＋78位（HindIII部位）までのＲ
を含む。このプラスミドをHindIIIおよびAatlllで消化
すると、このRNAのプロセシングに関与するSV40配列と
共にCATカセットが放出される。第２のプラスミド、pSV
2Apapは、SV40プロモーターの転写制御下にある、真核
生物プロセシングシグナルを有するPAPカセットを含
む。ヘンソーン、ゼルボス、ラデューチャ、ハリス、カ
デシュ（P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.K
adesch），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（1988）。
PAPカセットおよびプロセシング配列は、HindIIIおよび
AatIIで消化することによりこのプラスミドから放出さ
れる。新規なプラスミド、pHIVPAPが、pHIVCAT−０から
のHIV−1 LTRおよびベクター配列を含むHindIII/AatIII
フラグメントを、pSV2ApapからのHindIII/AatII PAPカ
セットにリゲートさせることにより形成された。
ファターゼ遺伝子（PAP）をHIV−1 LTR配列−−エンハ
ンサー、プロモーターおよびtar要素を含む−−の制御
下におくことにより簡便にアッセイしうる。HIV−1 LTR
を含むプラスミド、pHIVCAT−０（フェン、ホランド
（S.Feng,E.C.Holland），Nature 334,165（1988））は
HIV U3の全体、および＋78位（HindIII部位）までのＲ
を含む。このプラスミドをHindIIIおよびAatlllで消化
すると、このRNAのプロセシングに関与するSV40配列と
共にCATカセットが放出される。第２のプラスミド、pSV
2Apapは、SV40プロモーターの転写制御下にある、真核
生物プロセシングシグナルを有するPAPカセットを含
む。ヘンソーン、ゼルボス、ラデューチャ、ハリス、カ
デシュ（P.Henthorn,P.Zervos,M.Raducha,H.Harris,T.K
adesch），Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6342（1988）。
PAPカセットおよびプロセシング配列は、HindIIIおよび
AatIIで消化することによりこのプラスミドから放出さ
れる。新規なプラスミド、pHIVPAPが、pHIVCAT−０から
のHIV−1 LTRおよびベクター配列を含むHindIII/AatIII
フラグメントを、pSV2ApapからのHindIII/AatII PAPカ
セットにリゲートさせることにより形成された。
オリゴヌクレオチド同族体の活性を試験するために、
pcDEBtatおよびpHIVPAPをHeLa細胞内へカルシウム／ホ
スフェート沈殿法により同時にトランスフェクトした。
選ばれたオリゴヌクレオチド同族体の効果は下記により
測定された。HeLa細胞をトランスフェクションの前日に
1:8で６−ウェルディッシュ内へ分配した。各ディッシ
ュにつき1ugのpHIVPAPおよび12ugのpcDEBtatを500μｌ
のHBSおよび32μｌの2.5MCaCl2中で沈殿させた。CaPO4
沈殿を６個のウェルに均一に分配した。オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド同族体を同様にして沈殿
させ、図に示した濃度で細胞に添加した。沈殿を細胞上
に20分間沈着させ、次いで培地全部を添加し、細胞をさ
らに４時間インキュベートした。次いで細胞にHBS中の1
0％グリセリンでショックを与えた。
pcDEBtatおよびpHIVPAPをHeLa細胞内へカルシウム／ホ
スフェート沈殿法により同時にトランスフェクトした。
選ばれたオリゴヌクレオチド同族体の効果は下記により
測定された。HeLa細胞をトランスフェクションの前日に
1:8で６−ウェルディッシュ内へ分配した。各ディッシ
ュにつき1ugのpHIVPAPおよび12ugのpcDEBtatを500μｌ
のHBSおよび32μｌの2.5MCaCl2中で沈殿させた。CaPO4
沈殿を６個のウェルに均一に分配した。オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチド同族体を同様にして沈殿
させ、図に示した濃度で細胞に添加した。沈殿を細胞上
に20分間沈着させ、次いで培地全部を添加し、細胞をさ
らに４時間インキュベートした。次いで細胞にHBS中の1
0％グリセリンでショックを与えた。
48時間後に細胞を採取し、蛋白質およびPAPのアッセ
イをヘンソーンらの方法：ヘンソーン、ゼルボス、ラデ
ューチャ、ハリス、カデシュ（P.Henthorn,P.Zervos,M.
Raducha,H.Harris,T.Kadesch），Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 85,6342（1988）により、下記の修正を行って実施し
た。細胞を0.5mlのTBS中に採取し、そのうち0.1mlを蛋
白質アッセイに用いた。残り0.4mlの細胞懸濁液をペレ
ット化し、次いで50μｌのTBSに再懸濁した。細胞を65
℃に30分間加熱することにより内在ホスファターゼを失
活させた。細胞懸濁液にPNPP（0.5ml、5mM PNPP）を添
加し、次いでこれを37℃でテンキュベートすることによ
り、熱安定性ヒト胎盤性アルカリファターゼ活性をアッ
セイした。活性は、30分間隔で150μｌアリコートの反
応混合物を用い、405nmにおける吸光度をタイターテク
・マルチスキャンMCC＼340 ELISAプレート読取り装置で
測定することにより判定された。PAP活性は各ウェル中
の全蛋白質に対して正規化された。蛋白質はバイオーラ
ッド蛋白質アッセイにより測定され、その際TBS（0.1μ
ｌ）中に採取した細胞の１＼５を30μｌのバイオ−ラッ
ド蛋白質アッセイ試薬に添加し、次いで室温で10分間イ
ンキュベートしたのち、595nmにおける吸光度をタイタ
ーテクプレート読取り装置で測定した。
イをヘンソーンらの方法：ヘンソーン、ゼルボス、ラデ
ューチャ、ハリス、カデシュ（P.Henthorn,P.Zervos,M.
Raducha,H.Harris,T.Kadesch），Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 85,6342（1988）により、下記の修正を行って実施し
た。細胞を0.5mlのTBS中に採取し、そのうち0.1mlを蛋
白質アッセイに用いた。残り0.4mlの細胞懸濁液をペレ
ット化し、次いで50μｌのTBSに再懸濁した。細胞を65
℃に30分間加熱することにより内在ホスファターゼを失
活させた。細胞懸濁液にPNPP（0.5ml、5mM PNPP）を添
加し、次いでこれを37℃でテンキュベートすることによ
り、熱安定性ヒト胎盤性アルカリファターゼ活性をアッ
セイした。活性は、30分間隔で150μｌアリコートの反
応混合物を用い、405nmにおける吸光度をタイターテク
・マルチスキャンMCC＼340 ELISAプレート読取り装置で
測定することにより判定された。PAP活性は各ウェル中
の全蛋白質に対して正規化された。蛋白質はバイオーラ
ッド蛋白質アッセイにより測定され、その際TBS（0.1μ
ｌ）中に採取した細胞の１＼５を30μｌのバイオ−ラッ
ド蛋白質アッセイ試薬に添加し、次いで室温で10分間イ
ンキュベートしたのち、595nmにおける吸光度をタイタ
ーテクプレート読取り装置で測定した。
下記のホスホロチオエート骨格をもつオリゴヌクレオ
チド同族体で細胞を処理した： これらのデータを第２図にグラフで示す。HIV LTRか
らの遺伝子発現の直接的尺度であるPAP活性の有意の低
下が、コード番号461、462、463、464および465を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチド同族体により
示された。オリゴヌクレオチド466および対照オリゴヌ
クレオチド−−tat mRNAに対して相補的に設計されなか
ったもの−−はこのアッセイにおいて有意の活性をしめ
さなかった。対照オリゴヌクレオチドおよび配合物番号
466に関する1uM用量におけるPAP活性の見かけ上の上昇
は、トランスフェクションの時点でオリゴヌクレオチド
がプラスミドの取込みを促進するキャリヤー効果により
生じたものと考えられる。活性オリゴヌクレオチドを用
いる実験においてはこの効果は存在するであろうが、こ
れらの配合物の特異的阻害活性により遮蔽された。
チド同族体で細胞を処理した： これらのデータを第２図にグラフで示す。HIV LTRか
らの遺伝子発現の直接的尺度であるPAP活性の有意の低
下が、コード番号461、462、463、464および465を有す
るホスホロチオエートオリゴヌクレオチド同族体により
示された。オリゴヌクレオチド466および対照オリゴヌ
クレオチド−−tat mRNAに対して相補的に設計されなか
ったもの−−はこのアッセイにおいて有意の活性をしめ
さなかった。対照オリゴヌクレオチドおよび配合物番号
466に関する1uM用量におけるPAP活性の見かけ上の上昇
は、トランスフェクションの時点でオリゴヌクレオチド
がプラスミドの取込みを促進するキャリヤー効果により
生じたものと考えられる。活性オリゴヌクレオチドを用
いる実験においてはこの効果は存在するであろうが、こ
れらの配合物の特異的阻害活性により遮蔽された。
Claims (3)
- 【請求項１】HIVのtatmRNAの少なくとも一部分と結合し
うるホスホロチオエートオリゴヌクレオチドであって、
下記のいずれかのヌクレオチド配列： からなるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】HIVのtat遺伝子の発現を変調させる方法で
あって、HIVに感染した細胞もしくはヒトを除く動物
を、請求項１記載のオリゴヌクレオチドと接触させるこ
とを含む方法。 - 【請求項３】HIVのtat遺伝子の発現を変調させるための
組成物であって、請求項１記載のオリゴヌクレオチドお
よび薬学的に許容しうる担体を含む組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US521,907 | 1990-05-11 | ||
| US07/521,907 US5166195A (en) | 1990-05-11 | 1990-05-11 | Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus phosphorothioate oligonucleotides |
| PCT/US1991/002734 WO1991018004A1 (en) | 1990-05-11 | 1991-04-22 | Antisense inhibitors of the human immunodeficiency virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06500005A JPH06500005A (ja) | 1994-01-06 |
| JPH0832242B2 true JPH0832242B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=24078638
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3509815A Expired - Lifetime JPH0832242B2 (ja) | 1990-05-11 | 1991-04-22 | ヒト免疫不全ウイルスのアンチセンス阻害薬 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5166195A (ja) |
| EP (1) | EP0527916B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0832242B2 (ja) |
| KR (1) | KR0149680B1 (ja) |
| AT (1) | ATE181960T1 (ja) |
| AU (1) | AU651593B2 (ja) |
| BR (1) | BR9106440A (ja) |
| CA (1) | CA2082631A1 (ja) |
| DE (1) | DE69131422T2 (ja) |
| FI (1) | FI925103A (ja) |
| HU (1) | HUT62912A (ja) |
| NO (1) | NO924258D0 (ja) |
| WO (1) | WO1991018004A1 (ja) |
Families Citing this family (155)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1223831A (en) | 1982-06-23 | 1987-07-07 | Dean Engelhardt | Modified nucleotides, methods of preparing and utilizing and compositions containing the same |
| US6589734B1 (en) * | 1989-07-11 | 2003-07-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of HIV |
| US5856088A (en) * | 1989-07-11 | 1999-01-05 | Gen-Probe Incorporated | Detection of human immunodeficiency virus type 1 |
| US20040142899A1 (en) * | 1990-01-11 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals |
| US5620963A (en) * | 1991-10-15 | 1997-04-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating protein kinase C having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5635488A (en) * | 1991-10-15 | 1997-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds having phosphorodithioate linkages of high chiral purity |
| US5587361A (en) * | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5959096A (en) * | 1992-03-16 | 1999-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against human protein kinase C |
| US6339066B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-01-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C |
| US6753423B1 (en) | 1990-01-11 | 2004-06-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals |
| US5248670A (en) * | 1990-02-26 | 1993-09-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides for inhibiting herpesviruses |
| US6034233A (en) * | 1990-05-04 | 2000-03-07 | Isis Pharmaceuticals Inc. | 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome |
| US5138045A (en) * | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
| GB9016973D0 (en) * | 1990-08-02 | 1990-09-19 | Medical Res Council | Viral growth inhibition |
| BR9106747A (pt) * | 1990-08-14 | 1993-07-20 | Isis Pharmaceuticals Inc | Oligonucleotideo ou analogo de oligonucleotideo e processo para tratamento de um animal suspeito de estar infectado por virus da influenza |
| GB9020541D0 (en) * | 1990-09-20 | 1990-10-31 | Medical Res Council | Viral growth inhibition |
| US5786145A (en) * | 1990-09-20 | 1998-07-28 | Medical Research Council | Oligonucleotide competitors for binding of HIV RRE to REV protein and assays for screening inhibitors of this binding |
| US6369209B1 (en) | 1999-05-03 | 2002-04-09 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US7119184B2 (en) * | 1991-08-12 | 2006-10-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having A-DNA form and B-DNA form conformational geometry |
| US5607923A (en) * | 1991-10-15 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating cytomegalovirus having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5599797A (en) * | 1991-10-15 | 1997-02-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5661134A (en) * | 1991-10-15 | 1997-08-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5576302A (en) * | 1991-10-15 | 1996-11-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US5654284A (en) * | 1991-10-15 | 1997-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating RAF kinase having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
| US6335434B1 (en) | 1998-06-16 | 2002-01-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc., | Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates |
| US8153602B1 (en) | 1991-11-19 | 2012-04-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids |
| AU3249793A (en) | 1991-12-24 | 1993-07-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating beta -amyloid |
| US5922686A (en) * | 1992-03-16 | 1999-07-13 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide modulation of protein kinase C |
| US6117847A (en) * | 1992-03-16 | 2000-09-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression |
| US5916807A (en) * | 1992-03-16 | 1999-06-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against human protein kinase C |
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