JP4631084B2 - レトロウイルス組込み標的核酸 - Google Patents
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Description
参考文献2:Hacein-Bey-Abina, S. et al., “LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1,” Science 302, 415-419 (2003)
参考文献3:Wu, X., Li, Y., Crise, B., and Burgess, S.M., “Transcriptional start regions in the human genome are favored targets for MLV integration,” Science 300, 1749-1750 (2003)
(1) 以下のモチーフ配列:
5’−α1−α2−・・・−αn−X−βn−・・・−β2−β1−3’
(式中、α1〜αnはそれぞれ配列5’−CACAGTG−3’又は5’−CACTGTG−3’のうち連続する4〜7塩基からなる配列を表し、Xは0〜10個の塩基からなる任意の配列を表し、β1〜βnはそれぞれ前記配列α1〜αnに対して逆方向に実質的に相補的な4〜7塩基からなる配列を表し、nは1以上の整数を表し、隣接する各α1〜αn及びβ1〜βnの間にはそれぞれ1〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい)
と、それぞれ2塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸;
(2) 前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列が、それぞれ4個以上の塩基からなる、前記(1)記載の核酸;
(3) 前記上流側隣接配列中にTCC又はTTCが存在し、かつ、前記下流側隣接配列中にGGA又はGAAが存在する、前記(1)又は(2)記載の核酸;
(4) 前記回文配列が、長さ36〜100塩基である、前記(1)〜(3)のいずれか1項記載の核酸;
(5) レトロウイルスインテグラーゼと結合しうる、前記(1)〜(4)のいずれか1項記載の核酸;
(6) モチーフ配列が、配列番号1、2、及び9のいずれか1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、前記(1)〜(5)のいずれか1項記載の核酸;
(7) 回文配列が、配列番号3、5、及び10のいずれか1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、前記(1)〜(6)のいずれか1項記載の核酸;
(8) ベクター中に担持された形態である、前記(1)〜(7)のいずれか1項記載の核酸;
(9) 前記(1)〜(8)のいずれか1項記載の核酸を含有する、抗ウイルス剤;
(10) デコイ型医薬、又はアンチセンス医薬である、前記(9)記載の抗ウイルス剤;
(11) 前記(1)〜(8)のいずれか1項記載のモチーフ配列中の1以上の配列α及び/又はβ中のいずれか1塩基が置換された核酸をデコイとして含有する、抗ウイルス剤;
(12) 以下の工程を含むことを特徴とする、核酸のレトロウイルス組込み標的活性を試験する方法:
1)レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端及び3’側末端にそれぞれ由来する、5’側に2塩基の突出部を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、
2)前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程;
(13) 前記1)の工程において、レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端由来の核酸と3’側末端由来の核酸とを、同時に、他の反応成分と一緒にする、前記(12)記載の方法;
(14) 前記1)の工程において、レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端由来の核酸と3’側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、これらの複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させる、前記(12)記載の方法;
(15) 標的配列が、少なくとも100塩基対以上の長さである、前記(12)〜(14)のいずれか1項記載の方法;及び
(16) 組込みの有無の検出が、核酸増幅及びその後の配列解析によって行われる、前記(12)〜(15)のいずれか1項記載の方法、
である。
5’−α1−α2−・・・−αn−X−βn−・・・−β2−β1−3’
(式中、α1〜αnはそれぞれ配列5’−CACAGTG−3’又は5’−CACTGTG−3’のうち連続する4〜7塩基からなる配列を表し、Xは0〜10個の塩基からなる任意の配列を表し、β1〜βnはそれぞれ前記配列α1〜αnに対して逆方向に実質的に相補的な4〜7塩基からなる配列を表し、nは1以上の整数を表し、隣接する各α1〜αn及びβ1〜βnの間にはそれぞれ1〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい)
で示される必須の配列を、「モチーフ配列」と呼ぶことがある。
本発明の核酸は、式(1):
5’−α1−α2−・・・−αn−X−βn−・・・−β2−β1−3’
(式中、α1〜αnはそれぞれ配列5’−CACAGTG−3’又は5’−CACTGTG−3’のうち連続する4〜7塩基からなる配列を表し、Xは0〜10個の塩基からなる任意の配列を表し、β1〜βnはそれぞれ前記配列α1〜αnに対して逆方向に実質的に相補的な4〜7塩基からなる配列を表し、nは1以上の整数を表し、隣接する各α1〜αn及びβ1〜βnの間にはそれぞれ1〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい)
で示されるモチーフ配列と、それぞれ2塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、かつ、レトロウイルス組込み標的活性を有するものである。
5’−CACAGTG−3’
:::::::
3’−GTGTCAC−5’
のうちの一部の塩基対がステム中に形成されることになる。この7塩基対の配列は、免疫グロブリン遺伝子再構成シグナル配列(recombination signal sequence;RSS)と呼ばれる配列と一致する。したがって、以下においてこの配列を「RSSエレメント」と呼ぶことがある。
5’−α1−α2−・・・−αn−X−βn−・・・−β2−β1−3’
のように全体として回文配列になるように配置されていればよい。
本発明の核酸は、レトロウイルスに起因する疾患の予防又は治療のために、それ自体で又は他の成分と一緒にして、抗ウイルス剤、特に、デコイ型医薬又はアンチセンス医薬として使用することができる。
本発明の方法は、少なくとも、(1)レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端及び3’側末端にそれぞれ由来する、突出末端を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸前記標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、(2)前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程、を含む。
1)標的DNAの調製
GENEBANK登録番号AF049104のネズミ転写因子stat5a遺伝子塩基配列の一部(配列番号12の塩基番号31〜82)を、TOPO−pCR2.1ベクター(インビトロゲン社、カリフォルニア、製品番号45−0641)にサブクローニングし、Svi1と名付けた。さらに、インサート中のstat5a遺伝子の塩基配列を改変(配列番号12の塩基番号52に位置するCをGに変えたこと以外は同一のものを作製し、MutSvi−1と名付けた。同様に、同じCをAに変えたものを作製し、MutSvi−2と名付けた。これらを標的DNAとして用いた。
MuLVインテグラーゼを発現するベクターは、AKV−1のインテグラーゼ遺伝子(配列番号13;GENBANK, MLOCG [JO1998] AKV murine leukemia virus, complete proviral genome., murine leukemia virusの塩基番号4626〜5840に相当)を、pTrcHis2−TOPO ベクター(Invitrogen社、Version G、カタログ番号K4400-40)と連結して作製した。
75ngのAKV−1のU5LTR由来DNA〔配列番号14;(+)TGAAAGACCCCTTCATAAGGCTTAGCCAGCTAAC TGCAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGGAAAATACCAGAGCTGA及び配列番号15;(−)AATCAGCTCTGGTATTTTCCCATGCCTTGCAAAATGGCGTTACTGCAGTTAGCTGGCT AAGCCTTATGAAGGGGTCTTTCA〕を、10mLの反応緩衝液(25mM MnCl2、9%(V/V)グリセロール、80mM グルタミン酸カリウム・グルタミン酸塩、10mM メルカプトエタノール、10%(V/V)DMSO、35mM MOPS(pH7.2))中で500ngの組換え体MuLV−1インテグラーゼと、30℃で1時間インキュベートした。上記のAKV−1のU5由来DNAは、二本鎖の状態で(−)鎖側の5’末端においてAAの2塩基が突出する(あるいは(+)鎖側が2塩基分短い)。
前記3)で用意したU5LTR/インテグラーゼ複合体及びU3LTR/インテグラーゼ複合体を、前記1)で用意した200ngの各標的DNAと一緒にし、30℃で1時間、インキュベートした。
インキュベーション終了後、前記の反応物(5μL)のPCR増幅を、AKV−1のU3LTRゲノムプライマー「MuLV U3−Stat5a1F」(フォワード)(配列番号18;TCC TCCGATAGA CTGAGT CG)、「MuLV U3−Stat5a2F」(ネステッドフォワード)(配列番号19;TTCATTCACACTCCACTC GG);U5LTRプライマー「MuLV U5−Stat5a1F」(フォワード)(配列番号20;TTAGCACCAGAGCGACTAGG)、「MuLV U5−Stat5a2F」(フォワード)(配列番号21;CAGGAAACAGCTATGACCATG)のいずれか1つと、TOPOベクタープライマー(リバース)(配列番号22;CGTCTGTTGTGTGACTCTGG)とを用いて行った。
前記の工程で得られたPCR産物を、TOPO−pCR2.1ベクターにサブクローニングし、塩基配列分析を行った。
2.HIV−1インテグラーゼを用いたレトロウイルス組込み標的活性の試験
1)標的DNA及び組換え体インテグラーゼ
標的DNAとしては、上述のMuLVインテグラーゼを用いる場合と同じものを用いた。組換え体HIV−1インテグラーゼとしては、市販のものを使用した(米国US Biological社、カタログ番号:H6003-15、「HIV-1 pol p31, Met 737-1003, SF-2, Recombinant (Integrase, Human)」)。
75ngのHIV−1のU5LTR由来DNA〔配列番号23;(+)TGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCTCAGACCTTTTTGGTAGTGTGGAAAATCTCTAGCAC、及び配列番号24;(−)ACTGCTAGAGATTTTCCACACTACCAAAAAGGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACAC〕を、500ngの組換え体HIV−1インテグラーゼとともに10mLの反応緩衝液中で30℃で1時間インキュベートした。
前記2)で用意したU5LTR/インテグラーゼ複合体及びU3LTR/インテグラーゼ複合体を、前記1)で用意した200ngの各標的DNAと一緒にし、30℃で1時間、インキュベートした。
インキュベーション終了後、前記の反応物(5μL)を、前記MuLVの場合と同様に増幅した。用いたプライマーは、HIV−1のU5LTRゲノムプライマー「HIV−1 U5LTR」(リバース)(配列番号27;CGTCTGTTGTGTGACTCTGG)、HIV−1のU3LTRゲノムプライマー「HIV−1 U3LTR」(リバース)(配列番号28;GGGAAGTAGCCTTGTGTGTTATAG)、「HIV−Stat5a1F」(フォワード)(配列番号29;TTAGCACCAGAGCGACTAGG、「HIV−Stat5a2F」(フォワード)(配列番号30;CAGGGAAACAGCTATGACCATG)のいずれか1つと、TOPOベクタープライマーとのプライマーセットであった。
前記の工程で得られたPCR産物を、前記のMuLVの場合と同様にTOPO−pCR2.1ベクターにサブクローニングし、塩基配列分析を行った。
図4に示す(a)〜(d)の配列を有するインサートを、上記の試験と同様にTOPO−pCR2.1ベクターにサブクローニングして得た環状DNAを標的DNAとして用いて、上記でMuLVについて記載したのと同じ方法でMuLVインテグラーゼ又はHIVインテグラーゼを用いて標的核酸中への組込みの頻度を調べた。それぞれについてランダムに選んだ20個のクローンの塩基配列を解析した。
Claims (13)
- 以下のモチーフ配列:
5’−α1−α2−・・・−αn−X−βn−・・・−β2−β1−3’
(式中、α1〜αnはそれぞれ配列5’−CACAGTG−3’又は5’−CACTGTG−3’のうち連続する4〜7塩基からなる配列を表し、Xは0〜10個の塩基からなる任意の配列を表し、β1〜βnはそれぞれ前記配列α1〜αnに対して逆方向に相補的な4〜7塩基からなる配列を表し、nは1以上の整数を表し、隣接する各α1〜αn及びβ1〜βnの間にはそれぞれ1〜数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい)
と、それぞれ2塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸。 - 前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列が、それぞれ4個以上の塩基からなる、請求項1記載の核酸。
- 前記上流側隣接配列中にTCC又はTTCが存在し、かつ、前記下流側隣接配列中にGGA又はGAAが存在する、請求項1又は2記載の核酸。
- 前記回文配列が、長さ36〜100塩基である、請求項1〜3のいずれか1項記載の核酸。
- レトロウイルスインテグラーゼと結合しうる、請求項1〜4のいずれか1項記載の核酸。
- モチーフ配列が、配列番号1、2、及び9のいずれか1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、請求項1〜5のいずれか1項記載の核酸。
- 回文配列が、配列番号3、5、及び10のいずれか1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る配列である、請求項1〜6のいずれか1項記載の核酸。
- ベクター中に担持された形態である、請求項1〜7のいずれか1項記載の核酸。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、核酸のレトロウイルス組込み標的活性を試験する方法:
(1)レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端及び3’側末端にそれぞれ由来する、5’側に2塩基の突出部を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、
(2)前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程。 - 前記(1)の工程において、レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端由来の核酸と3’側末端由来の核酸とを、同時に、他の反応成分と一緒にする、請求項9記載の方法。
- 前記(1)の工程において、レトロウイルスゲノムLTR配列の5’側末端由来の核酸と3’側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、これらの複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させる、請求項9記載の方法。
- 標的配列が、少なくとも100塩基対以上の長さである、請求項9〜11のいずれか1項記載の方法。
- 組込みの有無の検出が、核酸増幅及びその後の配列解析によって行われる、請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
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