WO2006022249A1

WO2006022249A1 - レトロウイルス組込み標的核酸

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Publication number: WO2006022249A1
Application number: PCT/JP2005/015255
Authority: WO
Inventors: Tatsuaki Tsuruyama
Original assignee: Kyoto University
Priority date: 2004-08-24
Filing date: 2005-08-23
Publication date: 2006-03-02
Also published as: EP1795593A4; JPWO2006022249A1; JP4631084B2; EP1795593A1; US20080032944A1

Abstract

　レトロウイルスの組込みの標的となりうる活性を有する核酸、この核酸を含む抗ウイルス剤、この核酸を含むベクター、レトロウイルス疾患の治療方法、ならびに簡便で再現性がよく感度の高いレトロウイルス組込み標的活性についての核酸の試験方法を提供する。　本発明の核酸は、モチーフ配列：５’－α１－α２－・・・－αｎ－Ｘ－βｎ－・・・－β２－β１－３’（式中、α１～αｎはそれぞれ配列５’－ＣＡＣＡＧＴＧ－３’又は５’－ＣＡＣＴＧＴＧ－３’のうち連続する４～７塩基からなる配列を表し、Ｘは０～１０個の塩基からなる任意の配列を表し、β１～βｎはそれぞれ前記配列α１～αｎに対して逆方向に実質的に相補的な４～７塩基からなる配列を表し、ｎは１以上の整数を表し、隣接する各α１～αｎ及びβ１～βｎの間にはそれぞれ１～数個の塩基からなる任意の配列が存在してもよい）と、その上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸である。

Description

レトロウイルス組込み標的核酸

技術分野

[0001] 本発明は、宿主ゲノムへのレトロウイルスの組込みの標的となる活性を有する核酸、この核酸を含むベクター、レトロウイルスに起因する疾患の予防又は治療のための抗ウィルス剤、及びレトロウイルス組込みの標的となる活性にっヽての核酸の試験方法に関する。

背景技術

[0002] レトロウイルスの感染に起因する疾病は、 AIDS、ヒト成人 T細胞白血病など、多数存在する。レトロウイルスの感染は、まず第一段階として細胞にウィルスが吸着されることにより始まる。次に、第二段階として細胞内でゲノム RNAから逆転写酵素により D NAのプロウィルスゲノムが形成される。そして、第三段階としてこの DNAが宿主染色体 DNAに組み込まれ、それによつて感染が成立する。こうして感染が成立することを第一歩として、さらにこれらの疾病の発病までの過程が進行する。

[0003] したがって、レトロウイルスによる疾病の予防又は治療は、ウィルスの細胞への吸着、逆転写、及び組込みのいずれかのプロセスを標的としてそれを阻害することによつて行うことができると考えられる。

[0004] このうち、現在開発されている抗ウィルス剤は、前記の第一又は第二の段階を阻止するものであり、組込み段階を阻止することによるレトロウイルス疾患の予防もしくは治療剤又は方法の開発は遅れている。これは、宿主染色体へのウィルスの組込み機構の解明それ自体が遅れて、るためである。

[0005] 従来、レトロウイルスの組込みのためのインテグレーションシグナル配列（ISS)として、 LTRには、組込み酵素 (インテグラーゼ）が認識する CAZGTの 2塩基対を含む 6塩基対が必須であることは知られていた。しかし、宿主 DNA側の挿入部位の配列には共通性がな、ため、宿主 DN Aへのウィルス遺伝子の組込みはランダムに起こると想定されていた。

[0006] たとえば、吉永らは、 U5LTRの末端を模して合成した 21塩基対のオリゴヌクレオチドを基質 (標的に組み込まれるべき DNA)かつ標的（基質の挿入を受けるべき DNA )として用いてインテグラーゼと反応させ、インビトロで組込みが起こったかどうかを検定するアツセィ法を開発した (非特許文献 (参考文献） 1)。しかし、このアツセィの結果によれば、標的 DNAのどこに基質 DNAが入るかは決まっていないとされた。

[0007] このように、組込みがランダムな部位に起こると考えられて、たため、組込み部位の構造的特異性を利用した特異的組込み阻害の機構の研究、及びそれに基づいた阻害試薬の開発はされてこな力つた。そのため、組込み阻害剤については、わずかに、少数のインテグラーゼ阻害作用を有する低分子化合物が報告されているにすぎない

[0008] したがって、組込み阻害による抗レトロウイルス剤又はレトロウイルスによる疾患を治療するための実用的な糸且成物又は治療方法は、現在までに実現されていない。

[0009] 一方、レトロウイルスがプロウィルス状態で潜伏する宿主細胞からウィルスが再生され、他の正常な細胞に再感染することを防止 (疾病の進展防止)することは、前記第一又は第二の段階を阻止することによる抗ウィルス剤では不可能であり、組込み阻害による第三段階の阻止を可能にする抗ウィルス剤が望まれていた。

[0010] 参考文献 1:「エイズ一発見から治療最前線まで」、畑中正一著、共立出版株式会社、 1999年 1月、特に 41〜47頁

参考文献 2:Hacem- Bey- Abma, b. et al., "LM02- associated clonal T cell prolifera tion in two patients after gene therapy for SCID- Xl,，， science 302, 415-419 (2003) 参考文献 3:Wu, X., Li, Y., Crise, B., and Burgess, S.M., "Transcriptional start re gions in the human genome are favored targets for MLV integration," Science 300, 1 749-1750 (2003)

発明の開示

[0011] 本発明は、宿主へのレトロウイルスの挿入機構に基づいて、初期感染においてウイルスゲノムが宿主ゲノムに組込まれることを阻害 (感染又は疾病の予防)することができ、また、レトロウイルスがプロウィルス状態で潜伏する宿主細胞からウィルスが再生され、他の正常な細胞に再感染することを防止 (疾病の進展防止）し得る、レトロウイルスの組込みの標的となりうる活性を有する核酸、この核酸を含む抗ウィルス剤、この核酸を含むベクター、レトロウイルス疾患の治療方法を提供することを目的とする。本発明はさらに、簡便で、再現性がよぐ感度の高い、レトロウイルス組込み標的活性につ 1ヽての核酸の試験方法を提供することを目的とする。

[0012] 本発明者は、マウスリンパ腫 DNAに対するレトロウイルスの組込み部位を多数解析し、さらに公開データベースに収録されているヒト、マウスのレトロウイルス組込み部位の塩基配列を解析することにより、哺乳類におけるレトロウイルス組込み部位の共通性を見出し、この知見に基づいて本発明を完成した。

[0013] すなわち、本発明は、

( 1) 以下のモチーフ配列：

5 ' - α - a a —X— β β — β 3，

1 2 η η 2 1

(式中、 (X 〜 a はそれぞれ配列 5 '—CACAGTG— 3 '又は 5 '—CACTGTG— 3 'のうち連続する 4〜7塩基力もなる配列を表し、 Xは 0〜 10個の塩基力もなる任意の配列を表し、 β 〜β はそれぞれ前記配列 α 〜α に対して逆方向に実質的に相補的な 4〜7塩基力なる配列を表し、 ηは 1以上の整数を表し、隣接する各 α 〜α 及び j8 〜β の間にはそれぞれ 1〜数個の塩基力なる任意の配列が存在してもよい）

と、それぞれ 2塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸；

(2) 前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列が、それぞれ 4個以上の塩基からなる、前記（1)記載の核酸；

(3) 前記上流側隣接配列中に TCC又は TTCが存在し、かつ、前記下流側隣接配列中に GGA又は GAAが存在する、前記（ 1)又は（2)記載の核酸；

(4) 前記回文配列が、長さ 36〜： LOO塩基である、前記（1)〜（3)のいずれか 1項記載の核酸；

(5) レトロウイルスインテグラーゼと結合しうる、前記（1)〜(4)のいずれか 1項記載の核酸；

(6) モチーフ配列が、配列番号 1、 2、及び 9のいずれか 1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る配列である、前記（1)〜（5)の、ずれか 1項記載の核酸；

(7) 回文配列が、配列番号 3、 5、及び 10のいずれか 1に記載の配列又はそれとストリンジヱントな条件下でノヽイブリダィズし得る配列である、前記（1)〜（6)の、ずれか 1項記載の核酸；

(8) ベクター中に担持された形態である、前記（1)〜（7)のいずれか 1項記載の核酸；

(9) 前記（1)〜（8)のいずれか 1項記載の核酸を含有する、抗ウィルス剤；

(10) デコイ型医薬、又はアンチセンス医薬である、前記（9)記載の抗ウィルス剤；

(11) 前記（1)〜（8)の!、ずれ力 1項記載のモチーフ配列中の 1以上の配列 ex及び Z又は j8中のいずれか 1塩基が置換された核酸をデコイとして含有する、抗ウィルス剤；

(12) 以下の工程を含むことを特徴とする、核酸のレトロウイルス組込み標的活性を試験する方法：

1)レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端及び 3'側末端にそれぞれ由来する、 5' 側に 2塩基の突出部を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、ィンテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、

2)前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の糸且込みの有無を検出する工程；

(13) 前記 1)の工程において、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とを、同時に、他の反応成分と一緒にする、前記（12)記載の方法；

(14) 前記 1)の工程において、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、これらの複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させる、前記（12)記載の方法；

(15) 標的配列が、少なくとも 100塩基対以上の長さである、前記（12)〜（14)のいずれか 1項記載の方法;及び ( 16) 組込みの有無の検出が、核酸増幅及びその後の配列解析によって行われる

、前記（12)〜（15)のいずれか 1項記載の方法、

である。

[0014] 本発明を説明するに際して、本発明の核酸に存在する、式（1)：

5 ' - α - a a —X— β β — β 3

1 2 η η 2 1 ，

で示される必須の配列を、「モチーフ配列」と呼ぶことがある。

[0015] 本発明に関して、「レトロウイルス組込み標的活性」とは、レトロウイルスゲノムの組込みが高頻度で起こり得る、すなわち、レトロウイルスゲノムの組込みの標的となり易い性質を指す。組込み標的活性が高い核酸は、インテグラーゼとの結合に関して他の核酸と競合する場合、他の核酸より有利にインテグラーゼと結合するため、結果として他の核酸とインテグラーゼとの結合を阻害し、さらに他の核酸へのレトロウイルスゲノムの糸且込みを阻害する能力が高い。

[0016] また、本発明に関して使用する場合、各用語は、基本的には、それぞれの属する技術分野において一般に使用されているとおりの通常の意味で使用される。以下に挙げる用語にっ、ては、特に次のような意義を有する。

[0017] 「回文配列」（又は「回文構造」）は、「パリンドローム配列」（又は「パリンドローム構造」）とも呼ばれ、一般的な意味で使用される。すなわち、二本鎖核酸の相補鎖をそれぞれ 5 '末端 (又は 3 '末端)から読むと同じ配列になっている配列 (又はそのような構造)をいう。回文配列を有する核酸は、回文配列の中心を境にして鎖内で相補的に結合し、潜在的にヘアピン構造を作ることができる。この場合、回文配列の中心位置に回文形成と関係のないランダムな配列の挿入があると、その部分は塩基対を形成せずにループ構造となる。言い換えれば、回文配列とは、ヘアピン構造又はヘアピンループ構造を潜在的に形成し得る配列である。

[0018] 回文配列、回文構造、ヘアピン又はヘアピンループ構造、塩基対の形成、配列の相補性等に関して、「実質的に (実質的な)」とは、関与する 2つの配列が完全には相補的ではなぐ一方又は他方の配列における 1個又は数個、例えば 2〜4個の塩基の欠失又は挿入によって相補性が不完全になって、る部分を有し、ある、はそのために塩基対又は特定の構造の形成が不完全になって!/、る部分を有するものの、全体としては相補的である又は塩基対もしくは特定の構造が形成されていると認められる場合を意味する。たとえば、 n個の塩基力もなる回文配列を有する核酸の中に、この核酸がヘアピン構造をとつた際に塩基対を形成しない 1個又は数個、例えば 2〜4 個の塩基が存在していても、 nの数がある程度大きければ、その核酸の配列は「実質的に」回文配列であるといえる。

[0019] 本発明によれば、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸が提供される。本発明の核酸は、各種レトロウイルスに共通する基本的な性質を利用しているため、本質的にあらゆるレトロウイルスに対して有効である。

[0020] 本発明の核酸は、そのままで又は他の成分と組み合わせて、抗ウィルス剤として使用することができる。また、特に、本発明の核酸は、アンチセンス医薬、デコイ型医薬の形態で使用することができ、それによつて、プロウィルス状態で潜伏する宿主細胞力ウィルスが再生され、他の正常な細胞に再感染することを防止 (疾病の進展防止 )することができる。すなわち、本発明の抗ウィルス剤は、生体内細胞へのレトロウイルスの再感染防止を可能にし、他の抗ウィルス剤 (感染細胞の殺傷効果を持つ薬剤 )との併用により、感染個体力レトロウイルスを完全に排除することを可能とする。

[0021] また、本発明の方法によれば、特定の配列の核酸について、レトロウイルス組込み標的活性の有無又はその活性の強弱を、簡便に、再現性よぐしかも高感度で試験することができる。本発明の方法においては、特に、最初から環状形態の標的配列核酸を使用することにより、標的配列の自己環状ィ匕が防止され、標的配列とインテグラーゼとの結合の有無 ·強弱を従来より明確に判定することができる。この効果は、比較的長い標的配列を使用することによって、さらに顕著となる。

[0022] さらに、本発明の方法によれば、基質核酸として、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5 '側末端由来の核酸と 3 '側末端由来の核酸との両方を使用することによって、基質核酸の 2種類の二本鎖に含まれる 4本の一本鎖と、インテグラーゼとの間でインテグラーゼの 2量体又は 4量体が形成され、組込み反応に有利になり、 5 '側又は 3 '側のいずれか一方を使用する従来の方法と比較して、組込み反応の検出感度が改善されている。

図面の簡単な説明

[0023] [図 1]は、配列番号 3に記載の回文配列が潜在的に形成するヘアピン構造を示す図である。

[図 2]は、本発明の方法の一態様を説明する概略図である。

[図 3]は、本発明の方法の実施例において得られた結果を、実施例で使用した標的配列と、その各位置への挿入の有無又は頻度とによって示す図である。

[図 4]は、実施例にお!ヽて使用された本発明の実施例及び比較例の核酸の配列を示す図である。

[図 5]は、図 4の配列を有する核酸に対するレトロウイルス核酸の組込み効率を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0024] 鍾

本発明の核酸は、式（1) :

5 ' - α - a a —X— β β — β 3，

1 2 η η 2 1

で示されるモチーフ配列と、それぞれ 2塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、かつ、レトロウィルス組込み標的活性を有するものである。すなわち、本発明の核酸は、潜在的にヘアピン構造又はヘアピンループ構造をとり得る実質的な回文配列を有し、そのような構造をとつた場合に、配列 α及び |8によつて

5 ' - CACAGTG - 3 '

3，一 GTGTCAC— 5 '

のうちの一部の塩基対がステム中に形成されることになる。この 7塩基対の配列は、免疫グロブリン遺伝子再構成シグナル配列（recombination signal sequence ;RSS)と呼ばれる配列と一致する。したがって、以下においてこの配列を「RSSエレメント」と呼ぶことがある。

[0026] 本発明の核酸における配列 α及び j8は、逆方向に実質的に相補的であって、潜在的なヘアピン又はヘアピンループ構造において基本的に塩基対を形成し得る力具体的には、対応する 1組の配列 α及び j8の短い方の塩基数の 50%以上が塩基対を形成すればよい。たとえば、対応する配列 α及び j8がいずれも 4塩基の長さを有する場合、その中で 2個以上の塩基対が形成されればよい。また、配列 aが 5塩基の長さであり、対応する配列 βが 4塩基の長さの場合も、 2個の塩基対が形成されれば、ここでいう「実質的に相補的」である。

[0027] 本発明の核酸において、モチーフ配列中の配列 α及び j8は、少なくとも 1組存在すればよいが、 2組以上存在していてもよい。 1組が存在する場合は、 5 ' - α -X- β —3 'となる。 2組以上存在する場合は、たとえば 5 ' - a - a —X— β ~ β ~

1 1 2 2 1

3 ' (ここで、 |8 は a に対して、 |8 は a に対して、それぞれ逆方向に実質的に相補

1 1 2 2

的である）、より一般的には式（1)：

5 ' - a - a a —X— β β — β 3，

1 2 η η 2 1

のように全体として回文配列になるように配置されて、ればよ!/、。

[0028] 本発明の核酸の回文配列をこの式で表す場合、 ηは 1以上の整数を表す力 ηは、一般的には 1〜10、有利には 1〜6の範囲内である。また、各 a及び j8はそれぞれ同一の配列でなくてもよぐ各々の間にそれぞれ 1〜数個の塩基力なる任意の配列が存在していてもよい。この任意の配列は、好ましくは潜在的ヘアピン構造においてそれぞれ対応する位置の同様の配列と塩基対を形成し得る。

[0029] 本発明の核酸において、配列 Xは、存在してもしなくてもよぐ存在する場合、その内部でステムのように塩基対を形成しうるものであってもよぐループを形成しうるものであってもよぐあるいはその両方を含んで、てもよ！/、。

[0030] 配列 Xは、好ましくは 0〜10個の塩基である力より好ましくは 0〜9個の塩基で構成され、たとえば 0〜6個の塩基で構成されて、てもよ、。

[0031] 前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列は、それぞれ 2塩基以上の長さを有し、これらの配列もまた、本発明の核酸の実質的な回文配列の一部を成す。したがって、本発明の核酸がヘアピン又はヘアピンループ構造を形成する場合、前記モチーフ配列によって形成され得る 2個以上の塩基対に加えて、上流側隣接配列及び下流側隣接配列によって形成される塩基対が存在することになる。たとえば、天然の配列に基づいて得られる本発明の核酸については、上流側隣接配列中に TCC又は TTCが存在し、前記下流側隣接配列中に GGA又は GAAが存在することが多ぐこれらが存在する場合、さらに 3個の塩基対が形成され得る。

[0032] モチーフ配列の隣接配列は、それぞれ、好ましくは 4個以上、さらに好ましくは 6個以上、より好ましくは 8個以上、最も好ましくは 10個以上の塩基力もなる。なかでも特に、モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列がそれぞれ 10〜50個の塩基力なるものが好都合である。

[0033] 上流側の隣接配列と下流側の隣接配列とは、同数の塩基力なりミスマッチのない完全な回文配列又は逆方向相補的配列ではなくてもよぐ長さが異なっていてもよい力本発明の核酸が実質的に回文配列を有するためには、両者を構成する塩基の数の差は少ない方が好ましぐたとえば 20個の塩基力もなる配列においては 10個以下、好ましくは 8個以下、より好ましくは 5個以下、さらに好ましくは 3個以下であり、最も好ましくは同じ長さである。

[0034] 本核酸のモチーフ配列は、最短で 8塩基の長さ（配列 a及び βがそれぞれ 4塩基であって Χ=0)である。上流側隣接配列及び下流側隣接配列は、最短でそれぞれ 2 塩基の長さであるが、好ましくはそれぞれ 6塩基以上の長さである。したがって、本発明の核酸の回文配列の全長は、最短で 12塩基の長さであるが、好ましくは 28塩基以上であり、たとえば 28〜124塩基の長さであり、さらに好ましくは 36〜： LOO塩基の長さである。あるいは、本発明の核酸の回文配列に含まれる塩基対の数については、最低 3塩基対である力好ましくは 7塩基対以上であり、たとえば 7〜62塩基対であり、さらに好ましくは 18塩基対以上であり、たとえば 18〜50塩基対である。あるいは、回文配列中の全塩基数力配列 Xの塩基数を引いた残りの数の半数のうち、好ましくは 50%以上、さらに好ましくは 60%以上、それよりさらに好ましくは 70%以上が塩基対を形成する。

[0035] 本発明の核酸は、上記のような配列を有する限りにお、て、 DNAであっても RNA であってもよい。また、本発明の核酸において、後述するレトロウイルス組込み標的活性が損なわれない限りにおいて、特に示さない限り、各塩基は、塩基類似体であってもよぐ塩基の修飾体であってもよぐまた、核酸自体が修飾又は改変されていてもよい。これらの塩基又は核酸の類似体、修飾、改変は当該技術分野で公知である。

[0036] なお、本発明の核酸は、上述のような配列を有することによって、ヘアピン又はヘアピンループ構造をとり得ることが認められればよぐある特定の条件下で実際にヘアピン又はヘアピンループ構造をとる力否かを問わない。本発明の核酸に関して、計算上、ヘアピン構造を形成する際の自由エネルギー変化は、負値で、絶対値が大きい方が好ましい。本発明の核酸は、ヘアピン構造を形成した場合、計算上、二本鎖について A G=— 5. OkcalZmol以下の自由エネルギーを有することが好ましい。この自由エネルギー変化は、より好ましくは A G=— 8. Okcal/mol以下、さらに好ましくは A G=— 12. Okcal/mol以下、最も好ましくは A G=— 15. Okcal/mol以下である。なかでも特に、 A G= - 18. 0〜― 20kcalZmolが好都合である。なお、自由エネルギーの計算は、 Santa Lucia John Jr.(1998), "A unified view of polymer, d umbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics " (Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA 95, 1460- 65)に基づき、 Michael Zuker (2003), "Mfold web server for n ucleic acid folding and hybridization prediction" (Nucleic Acids Res. 31(13), 3406-15 )にしたがって行うことができる。

[0037] 本発明の核酸のモチーフ配列の具体的な一例は、配列番号 1に記載されて、る配列（ 5 '— CACTGACATTATCACA— 3 ' )である。ここで、下線部は配列 α及び j8 に相当する。

[0038] また、配列 a及び βを 2組有するモチーフ配列の一例は、配列番号 2に記載されて V、る配列（5， - CAGTGGACACTGACATTATCACACTCCACT- 3， )である。下線部は、 5 '側から順に式（1)のひ、 a 、 β 、 β にそれぞれ相当する。配列番

1 2 2 1

号 2記載の配列においては、塩基番号 11〜12の「TG」と塩基番号 20〜21の「CA」及び塩基番号 2〜5の「AGTG」と塩基番号 27〜30の「CACT」力それぞれ回文配列になっており、潜在的に、塩基対を形成してヘアピン構造のステム部分を形成し得る。

[0039] また、配列番号 2記載のモチーフ配列を含む本発明の核酸の回文配列の一例は、配列番号 3に記載されて、る配列（5 '— GCTCACGCAGTGGACACTGACAT TATCACACTCCACTCGGAGC— 3 ' )である。この配列を有する核酸が潜在的に形成するヘアピン構造を、図 1に示す。

[0040] 配列番号 5に記載されてヽる配列（5，一 CGCAGTGGACACTGACATTATC ACACTCCACTCCG 3 ' )は、式（ 1)の配列 α及び βを 2組有するモチーフ配列を含む回文配列の別の例である。下線部は、上記と同様に 5 '側力も順に式（1)の α 、 a 、 β 、 β

1 2 2 1にそれぞれ相当する。

[0041] 配列番号 7に記載されて!ヽる配列（5， - ACACTG AC ATTATCACACT - 3， ) は、配列番号 1記載の ex -X- βモチーフ配列を含む力上流側隣接配列が 1塩基 (Α)、下流側隣接配列が 2塩基 (CT)であり、隣接配列間に形成される塩基対が 1対のみとなる例である。

[0042] これらは、 GENBANKの登録番号 AF049104 (Mus musculus signal transducer and transcription activator 5a (Stat5a) gene, partial cds.)の; ¾基番号 4420〜4520【こ相当する配列に基づヽて設計された配列である。

[0043] 本発明の回文配列を有する核酸の配列は、上記のように天然に存在する配列そのもの又はそれに基づいて改変された人工的な配列のいずれでもよぐさらには完全に人工的に設計された配列であってもよい。たとえば、配列番号 9に記載されている

)は、人工的に作製した、式（1)の配列 α及び j8を 2糸且有するモチーフ配列の例である。下線部は、 RSSエレメントの 7塩基を 2回反復した配列であり、 5'側力順に式（1 )の α 及び α 、 β 及び j8 にそれぞれ相当する。

1 2 2 1

[0044] 配列番号 10に記載されている配列（5， - GCTCCACAGTGCACAGTGGAC ATTATCACAGTGCACAGTGGAGC 3，）は、配列番号 9記載のモチーフ配列を含み、それぞれ 4塩基力なる上流及び下流隣接配列が 4個の塩基対を形成し得る、回文配列のさらに別の例である。

[0045] これらの人工配列は、天然配列に基づく配列と同等又はそれ以上の効率でレトロゥィルス組込み標的活性を有する。

[0046] なお、配列番号 4、配列番号 6、配列番号 8、及び配列番号 11に記載されて!、る配列は、それぞれ配列番号 3、配列番号 5、配列番号 7及び配列番号 10に記載されている回文配列を含む（実施例において使用した、）インサートの全長の配列である（図 4参照)。

[0047] 配列番号 1、 2、及び 9のいずれか 1に記載のモチーフ配列とストリンジェントな条件下でノ、イブリダィズし得る配列であって、式（1)の条件を満たすものもまた、本発明の核酸のモチーフ配列の例である。同様に、配列番号 3、 5、及び 10のいずれか 1に記載の回文配列とストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし得る配列であって、上述の回文配列の条件を満たすものもまた、本発明の核酸の回文配列の例である。ここで、ストリンジェントな条件下とは、 55°C、 0. 1 X SSC緩衝液中である。

[0048] 本発明の核酸は、当該技術分野で公知の化学的又は生化学的な方法によって合成することができる。たとえば、 DNA合成機による直接合成、 PCR法、及び/又はクローニングベクターを使用する方法等を、適宜単独で又は組み合わせて用いることができる。

[0049] 本発明の核酸は、インテグラーゼと結合してレトロウイルスゲノムの組込みを阻害することができる。インテグラーゼとの結合の有無、組込み標的活性の有無は、後述する方法によって確認することができる。たとえば、配列番号 4の配列を有する本発明の核酸は、後述する方法によって試験した場合、約 80%以上の効率で組込みが起こる。また、同じ配列を改変し、モチーフ配列中の TG及び Z又は CAを取り除いたものを同様にして試験すると、この配列へのウィルス遺伝子組込み効率は 10%以下に低下することがわ力つて、る。

[0050] 本発明の核酸のレトロウイルス組込み標的活性 (組込み効率）は、後述の方法によつて少なくとも 10個のクローンを調べた場合、好ましくは 40%以上 (すなわち 4個以上のクローンにおいて組込みが起こる）、さらに好ましくは 50%以上、それよりさらに好ましくは 60%以上であり、最も好ましくは 70%以上である。

[0051] 本発明の核酸は、ベクターに含有されていることができる。ベクターは、たとえば、本発明の核酸を目的（大量発現、医療用等）に応じて選択した市販のクローユングべクタ一のクロー-ング部位に組み込むことによって作製することができる。このようなべクタ一の設計'構築は、当業者には公知である。

[0052] 杭ウィルス剤

本発明の核酸は、レトロウイルスに起因する疾患の予防又は治療のために、それ自体で又は他の成分と一緒にして、抗ウィルス剤、特に、デコイ型医薬又はアンチセンス医薬として使用することができる。

[0053] ここで、「デコイ」又は「デコイ型医薬」とは、インテグラーゼが結合しうる染色体上の部位と同一又は類似の配列を有する核酸を指す。同一の配列を有するデコイとしては、本発明の核酸力なるものが挙げられる。また、類似の配列を有するデコイとしては、モチーフ配列中の配列 α及び Z又は βのいずれか 1塩基を置換してその置換された塩基がその周辺配列と新たな塩基対を作らな!/、ようにしたものが挙げられ、好ましくは、 TG又は GTの Gを Α又は Τに置換したもの及び CA又は ACの Cを Α又は丁に置換したものである。

[0054] デコイは、投与された場合、インテグラーゼとの結合に関して染色体上の部位と競合して、インテグラーゼと結合し、その結果、染色体上へのインテグラーゼの結合を阻害し、レトロウイルスの組込みを阻害することができる。

[0055] 本発明の抗ウィルス剤は、少なくとも 1つの本発明の核酸又は本発明の核酸を含むベクターと、薬学的に許容されうるキャリアとを含む。本発明の核酸がベクターの形態で使用される場合、本発明の核酸が挿入されるクローユング部位の 5 '側 (A)と 3'側（ B)とが実質的に逆方向相補的であるもの、たとえばベクターのクローユング部位が 5 ，一 GAANNNCCTTAAGGNNNTTC— 3，のようになつており、 TTAAの Tと Aとの間に本発明の核酸がクローユングされ、その両側の NNN同士が相補的であるようなものは、クロー-ング部位自身が回文配列の一部として潜在的なヘアピン構造のステムを構成するので好ましい。薬学的に許容されうるキャリアとしては、たとえば生理食塩水、水、緩衝液、デキストロース等が挙げられる。

[0056] 本発明の抗ウィルス剤は、さらに、当該技術分野で公知の他の成分、たとえば安定剤、賦形剤、希釈剤、担体等の成分、及び他の抗ウィルス性薬剤をも含むことができる。

[0057] 本発明の抗ウィルス剤は、経口又は非経口経路で投与することができる。具体的には、経口、皮下、筋内、静脈内、腹腔内、経皮、経粘膜等の経路が挙げられるが、これらに限定されない。

[0058] 本発明の抗ウィルス剤は、投与経路に応じて製剤の技術分野で公知の任意の剤型に処方されることができる。たとえば、錠剤、カプセル、顆粒、シロップ、液体、懸濁液、ゲル、リボソーム等の形態が挙げられる力これらに限定されない。これらの製剤は、当該分野で公知の方法によって製造することができる。

[0059] 本発明の抗ウィルス剤は、本発明の核酸を、その医学的な目的を達成するのに有効な量 (薬学的有効量)で含む。一般的には、 0. l〜lmgZkg程度であるが、具体的な量は、適当な動物モデル等を使用して公知の方法によって決定される。

[0060] 正確な用量及び投与スケジュールは、投与対象の個体の状況 (たとえば、年齢、体重、性別、感染又は疾患の程度等）、組み合わせて投与される他の薬剤又は治療法、特定の製剤の体内持続時間等に応じて、個別に決定される。

[0061] 本発明の核酸は、各種のレトロウイルスの基本的な性格を利用する一般的な作用機序によって作用するため、本質的にあらゆるレトロウイルスに対して同等に作用する。特に、哺乳類、たとえばマウス、ネコ、サル、ヒト、ゥシ、ブタ等を宿主とするレトロゥィルス、たとえばヒト免疫不全ウィルス（HIV— 1、 HIV— 2)、成人 T細胞白血病ウイルス（HTLV— 1)、ヘアリー細胞白血病ウィルス（HTLV— 11)、ヒト以外の動物の白血病ウィルス、肉腫ウィルス、乳癌ウィルス、サル免疫不全ウィルス (SIV)、ビスナウィルス、ゥマ伝染性貧血症ウィルス、フォーミーウィルス等に対して有効である。

[0062] レトロウイルス組认み標的活件の試験方法本発明の方法は、少なくとも、（1)レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端及び 3' 側末端にそれぞれ由来する、突出末端を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、インテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸前記標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、（2)前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の組込みの有無を検出する工程、を含む。

[0063] 本発明の方法において、標的配列は、環状の形態であり、好ましくは適切なベクタ一に連結されている。また、標的配列は、好ましくは 100塩基対以上の長さを有する。従来の組込みアツセィにおいては通常 20〜30塩基対の長さの線状オリゴヌクレオチドが標的配列として使用されていたが、本発明の方法においては、予め環状形態の標的配列を使用することにより、し力も比較的長い標的配列を使用することによつて、標的配列の自己環状ィ匕が防止され、標的配列とインテグラーゼとの結合の有無をより明確に判定することができる。

[0064] 本発明の方法においては、基質核酸として、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5 '側末端由来の核酸と 3 '側末端由来の核酸との両方を使用する。従来の方法にお!、ては、 5'側又は 3'側のいずれか一方が使用されていたが、本発明のように両方を使用すること〖こよって、基質核酸の 2種類の二本鎖に含まれる 4本の一本鎖と、インテグラーゼとの間でインテグラーゼの 2量体又は 4量体が形成され、組込み反応に有利になり、組込み反応の検出感度が向上する。

[0065] また、前記（1)の工程において、好ましくは、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5 '側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とは、同時に他の反応成分と一緒にされる。また、この工程は、さらに、（a)レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とをインテグラーゼと一緒にして、予め基質核酸とインテグラーゼとの複合体を形成させる工程、及び (b)前記複合体を、標的配列を含む環状核酸と一緒にする工程、のように二段階で行うことができる。たとえば、前記（1)の工程を、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて、予めインテグラーゼ複合体を形成させ、その後、この複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させることによつて行うことができる。このように先にインテグラーゼ一基質核酸複合体を形成させると、組込みが起こりやすい条件となり、頻度の低い組込みの検出感度が向上する。

[0066] LTR由来の核酸は、好ましくは、それぞれ 50塩基以上、より好ましくはそれぞれ 60 塩基以上、たとえば 50〜： LOO塩基の長さを有する。

[0067] また、標的配列は、好ましくは、 100塩基対以上の長さを有する。なお、標的配列を含む環状核酸力標的配列がクローユングベクターのクローユング部位に挿入された形態のものであり、そのクローユング部位がヘアピン構造のステム部分を形成しうる配列を有する場合は、標的配列は、それより 10〜20塩基対程度短くてもよぐ 80塩基対以上であればよい。したがって、標的配列の長さは、一般的には 80塩基対以上が好ましぐより好ましくは 100〜400塩基対、さらに好ましくは 150〜400塩基対、最も好ましくは 200〜400塩基対である。

[0068] 基質核酸の末端は、好ましくは、（+ )鎖及び Z (—）鎖の 5'の 2塩基が突出している。たとえば、 MuLVの場合は 5，一 AA、 HIVの場合は 5，一ACが突出していることが好ましい。さらに好ましくは各一本鎖核酸について、突出している 2塩基に続いて T Gがあり、 3'末端が CAである。

[0069] 組込みの有無の検出は、当該技術分野で公知のいずれの方法によって行ってもよい。一般的には、 PCR法等によって核酸を増幅し、続いてその反応産物の配列解析を行って挿入の有無及び挿入部位を特定する。

[0070] 図 2に、本発明の方法の一態様の概略を示す。ここでは、 3' 1^[¾由来及び5' ]^[¾ 由来の各一本鎖核酸 4種類をインテグラーゼと一緒にして予め基質核酸とインテグラーゼとの複合体 (インテグラーゼコンプレックス中間体)を形成させ、次にこれを標的配列（「stat5a DNA」）を含むベクターと一緒にしている。ここで標的配列のへアビン形成が起こり、基質核酸が標的配列中に挿入される。その後、標的配列近傍又は基質配列内の配列を有するプライマーを用いて標的配列部分を PCR増幅することによって挿入の有無を検出する。

実施例

[0071] 以下において、本発明を具体的な特定の実施例によってさらに詳しく説明する。

[0072] 1. MuLV (マウス白血病ウィルス： AKV— 1)インテグラーゼを用いたレトロウイルス

IXみ標的活件の試,験 1)標的 DNAの調製

GENEBANK登録番号 AF049104のネズミ転写因子 stat5a遺伝子塩基配列の一部（配列番号 12の塩基番号 31〜82)を、 TOPO—pCR2. 1ベクター（インビトロゲン社、カリフォルニア、製品番号 45— 0641)にサブクローユングし、 Svilと名付けた。さらに、インサート中の stat5a遺伝子の塩基配列を改変（配列番号 12の塩基番号 5 2に位置する Cを Gに変えたこと以外は同一のものを作製し、 MutSvi— 1と名付けた。同様に、同じ Cを Aに変えたものを作製し、 MutSvi— 2と名付けた。これらを標的 D NAとして用いた。

[0073] 2)組換え体インテグラーゼの調製

MuLVインテグラーゼを発現するベクターは、 AKV— 1のインテグラーゼ遺伝子（配列番号 13 ;GENBANK, MLOCG Q01998] AKV murine leukemia virus, complete proviral genome., murine leukemia virusの; ¾基番号 4626〜5840に相当)を、 pTrc His2-TOPO ベクター（Invitrogen社、 Version G、カタログ番号 K4400- 40)と連結して作製した。

[0074] 得られたベクターを ImM IPTGの存在下において大腸菌内で 37°Cで 5時間培養することによって発現させ、培養液中から MuLVインテグラーゼを回収し、 ProBond カラム (Invitrogen社)を製品添付のマニュアルにしたがって使用して精製した。

[0075] 3)レトロウイルスゲノム末端とインテグラーゼとの結合

75ngの AKV— 1の U5LTR由来 DNAほ己列番号 14； ( + ) TGAAAGACCCCT TCATAAGGCTTAGCCAGCTAAC TGCAGTAACGCCATTTTGCAAG GCATGGGAAAATACCAGAGCTGA及び配列番号 15； (―) AATCAGCTC

GGCT AAGCCTTATGAAGGGGTCTTTCA〕を、 10mLの反応緩衝液（25m M MnCl、 9% (VZV)グリセロール、 80mM グルタミン酸カリウム ·グルタミン酸

2

塩、 10mM メルカプトエタノール、 10% (V/V) DMSO、 35mM MOPS (pH7. 2) )中で 500ngの糸且換え体 MuLV—lインテグラーゼと、 30°Cで 1時間インキュベートした。上記の AKV—1の U5由来 DNAは、二本鎖の状態で（一）鎖側の 5 '末端にぉ、て AAの 2塩基が突出する（あるいは（+ )鎖側が 2塩基分短、)。 [0076] 同様に、 75ngの AKV— 1の U3LTR由来 DNAほ己列番号 16 ; ( + )AAATCGT

CCAGCCTGGGGGTCTTTCA及び配列番号 17； (-) TGAAAGACCCCCA

GAGACCACGAT〕を、組換え体 MuLV—インテグラーゼと、 30°Cで 1時間インキュペートした。上記の AKV— 1の U3由来 DNAは、二本鎖の状態で（+ )鎖側の 5，末端にお、て AAの 2塩基が突出する（ある、は（-)鎖側が 2塩基分短、)。

[0077] 4)標的 DNAとレトロウイルスゲノム末端 Zインテグラーゼ複合体との反応

前記 3)で用意した U5LTRZインテグラーゼ複合体及び U3LTRZインテグラーゼ複合体を、前記 1)で用意した 200ngの各標的 DNAと一緒にし、 30°Cで 1時間、インキュペートした。

[0078] 5)ウィルス標的 DNA挿入部位の PCR増幅

インキュベーション終了後、前記の反応物（5 μ L)の PCR増幅を、 AKV- 1の U3 LTRゲノムプライマー「MuLV U3— Stat5alF」（フォワード）（配列番号 18 ;TCC TCCGATAGA CTGAGT CG)、「MuLV U3— Stat5a2F」（ネステッドフォワード）（配列番号19 ;1^^八1^^八じ八01じじ八01じ GG)； U5LTRプライマー「 MuLV U5— Stat5alF」（フォワード）（配列番号 20 ;TTAGCACCAGAGCGA CTAGG)、「MuLV U5— Stat5a2F」（フォワード）（配列番号 21 ;CAGGAAAC AGCTATGACCATG)のいずれ力 1つと、 TOPOベクタープライマー（リバース）（酉己歹 IJ番号 22； CGTCTGTTGTGTGACTCTGG)とを用ヽて行った。

[0079] 温度サイクルは、 94°C、 2分を 1回の後、 95°C、 40秒； 58°C、 40秒； 72°C、 1分を 3 5サイクル行い、最後に 72°C、 5分のインキュベーションを 1回、であった。

[0080] 6)塩基配列解析

前記の工程で得られた PCR産物を、 TOPO— pCR2. 1ベクターにサブクローニングし、塩基配列分析を行った。

[0081] 結果を図 3に示す。上 (A)の DNAの配列は、 Svilの組込み部位を含む配列を示し、下（B)の DNAの配列は MutSvi—2の配列を示す。下の DNAの配列の下線部が置換された部分を示す。図 3において、各矢印の基部は組込み部位を示す。矢印の向きはウィルスゲノムの転写方向を表し、右向きのときは転写方向が標的配列（St at5a)のそれと一致し、左向きのときは逆方向である。また、「X」の後の数字はその位置に組込みが確認されたクローンの数を表す。

[0082] Svilを標的として用いた場合（図 3、（A)、「MuLV IN」）、調べたクローンの 90% 以上で挿入が起こっており、その挿入部位はランダムではなぐ特定箇所（「4468」及び「4472」と記した位置）に高頻度に入っていることがわ力つた。一方、 MutSvi— 2 (図 3、（B)、「MuLV IN」）を標的として用いた場合は、変異を導入した部分には挿入がほとんど起こって、なかった。 MutSvi— 1につ!/ヽても同様の結果が得られた ( MutSvi- 1のデータは示して!/ヽな!ヽ）。

2. HTV— ίインテグラーゼ用いたレトロウイルス釦认み標的活件の試,験

1)標的 DNA及び組換え体インテグラーゼ

標的 DNAとしては、上述の MuLVインテグラーゼを用いる場合と同じものを用いた。糸且換え体 HIV—1インテグラーゼとしては、市販のものを使用した（米国 US Biologic al社、カタログ番号： H6003- 15、「HIV- 1 pol p31, Met 737-1003, SF-2, Recombinant (Integrase, Human)」 )。

[0083] 2)レトロウイルスゲノム末端とインテグラーゼとの結合

75ngの HIV— 1の U5LTR由来 DNAほ己列番号 23； ( + ) TGTGTGCCCGTCT

TGTGGAAAATCTCTAGCAC,及び配列番号 24 ; (—） ACTGCTAGAGAT

GTCACACAACAGACGGGCACAC]を、 500ngの組換え体 HIV— 1インテグラーゼとともに 10mLの反応緩衝液中で 30°Cで 1時間インキュベートした。

[0084] 同様に、 75gの HIV— 1の U3LTR由来 DNAほ己列番号 25 ; ( + )ACTGGAAG

TCTATAACACACAAGGCTACTTCCCAG,及び配列番号 26 ; (—） CTGG

CCTTTGCTTGGA GTAAATTAAC CCTTCCA〕を、組換え体 HIV— 1インテグラーゼと、 30°Cで 1時間インキュベートした。なお、塩基配列は、南アフリカからの 99ZACM9 (GENEBANK Accession番号 AF411967)による。

[0085] 3)標的 DNAとレトロウイルスゲノム末端 Zインテグラーゼ複合体との反応

前記 2)で用意した U5LTRZインテグラーゼ複合体及び U3LTRZインテグラーゼ複合体を、前記 1)で用意した 200ngの各標的 DNAと一緒にし、 30°Cで 1時間、インキュペートした。

[0086] 4)ウィルス標的 DNA挿入部位の PCR増幅

インキュベーション終了後、前記の反応物（5 μ L)を、前記 MuLVの場合と同様に増幅した。用いたプライマーは、 HIV— 1の U5LTRゲノムプライマー「HIV— 1 U5 LTR」（リバース）（ffi [J# 27 ;CGTCTGTTGTGTGACTCTGG)、HIV—l U3LTRゲノムプライマー「HIV— 1 U3LTR」（リバース）（配列番号 28； GGGAAG TAGCCTTGTGTGTTATAG)、「HIV— Stat5alF」（フォワード）（配列番号 29 ; TTAGCACCAGAGCGACTAGG, 「HIV— Stat5a2F」（フォワード）（配列番号 30 ;CAGGGAAACAGCTATGACCATG)のいずれか 1つと、 TOPOベクタープライマーとのプライマーセットであった。

[0087] 6)塩基配列解析

前記の工程で得られた PCR産物を、前記の MuLVの場合と同様に TOPO— pCR 2. 1ベクターにサブクローユングし、塩基配列分析を行った。

[0088] 結果を図 3の「： HIV— 1 IN」に示す。 MuLVの場合と同様、 HIV— 1についても特定の位置に高頻度の組込みが起こり、モチーフ配列中の塩基を改変すると組込み頻度が劇的に低下する結果が得られた。

[0089] 3.各種配列のレトロウイルス組込み標的活性の測定

図 4に示す (a)〜（d)の配列を有するインサートを、上記の試験と同様に TOPO— p CR2. 1ベクターにサブクローユングして得た環状 DNAを標的 DNAとして用いて、上記で MuLVについて記載したのと同じ方法で MuLVインテグラーゼ又は HIVインテグラーゼを用いて標的核酸中への組込みの頻度を調べた。それぞれにつ、てランダムに選んだ 20個のクローンの塩基配列を解析した。

[0090] (a)〜（d)の配列は、それぞれ配列番号 4、 6、 8、 11に記載されて、る。これらの配列は、いずれも本発明の回文配列を含んでいるが、（c)の配列は上流及び下流隣接配列が短ぐ（c)の配列を有する核酸は、本発明の核酸の条件を満たさない比較例である。

結果を図 5に示す。（a)、（b)又は (d)の配列を有する核酸を標的核酸として用いた場合は、配列を調べたクローンの少なくとも 70%以上において組込みが起こっていた。一方、（c)の配列を有する核酸を標的核酸として用いた場合は組込みが起こったクローンが低頻度でしか見られな力つた。

Claims

請求の範囲

[1] 以下のモチーフ配列：

5 ' - α - a a —X— β β — β 3，

1 2 η η 2 1

と、それぞれ 2塩基以上の長さを有する前記モチーフ配列の上流隣接配列及び下流隣接配列とからなる実質的な回文配列を有し、レトロウイルス組込み標的活性を有する核酸。

[2] 前記モチーフ配列の上流側隣接配列及び下流側隣接配列が、それぞれ 4個以上の塩基からなる、請求の範囲 1記載の核酸。

[3] 前記上流側隣接配列中に TCC又は TTCが存在し、かつ、前記下流側隣接配列中に GGA又は GAAが存在する、請求の範囲 1又は 2記載の核酸。

[4] 前記回文配列が、長さ 36〜： LOO塩基である、請求の範囲 1〜3のいずれか 1項記載の核酸。

[5] レトロウイルスインテグラーゼと結合しうる、請求の範囲 1〜4のいずれ力 1項記載の核酸。

[6] モチーフ配列が、配列番号 1、 2、及び 9のいずれ力 1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る配列である、請求の範囲 1〜5の!、ずれ力 1項記載の核酸。

[7] 回文配列が、配列番号 3、 5、及び 10のいずれか 1に記載の配列又はそれとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得る配列である、請求の範囲 1〜6の!、ずれか 1 項記載の核酸。

[8] ベクター中に担持された形態である、請求の範囲 1〜7のいずれか 1項記載の核酸

[9] 請求の範囲 1〜8のいずれ力 1項記載の核酸を含有する、抗ウィルス剤。

[10] デコイ型医薬、又はアンチセンス医薬である、請求の範囲 9記載の抗ウィルス剤。

[11] 請求の範囲 1〜8のいずれ力 1項記載のモチーフ配列中の 1以上の配列 α及び Z 又は j8中のいずれか 1塩基が置換された核酸をデコイとして含有する、抗ウィルス剤

[12] 以下の工程を含むことを特徴とする、核酸のレトロウイルス組込み標的活性を試験する方法：

(1)レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端及び 3'側末端にそれぞれ由来する、 5 '側に 2塩基の突出部を有する二本鎖核酸又はそれらを形成し得る一本鎖核酸と、ィンテグラーゼと、被検対象の標的配列を含む環状核酸とを、共存させ、

(2)前記標的配列中への前記レトロウイルスゲノム由来配列の糸且込みの有無を検出する工程。

[13] 前記（1)の工程において、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とを、同時に、他の反応成分と一緒にする、請求の範囲 12記載の方法。

[14] 前記（1)の工程において、レトロウイルスゲノム LTR配列の 5'側末端由来の核酸と 3'側末端由来の核酸とを、それぞれ個別にインテグラーゼと反応させて予めインテダラーゼ複合体を形成させ、その後、これらの複合体を同時に前記環状核酸と一緒にして反応させる、請求の範囲 12記載の方法。

[15] 標的配列が、少なくとも 100塩基対以上の長さである、請求の範囲 12〜14のいずれか 1項記載の方法。

[16] 組込みの有無の検出が、核酸増幅及びその後の配列解析によって行われる、請求の範囲 12〜 15のいずれか 1項記載の方法。