HU211514A9 - Fr 901228 substance and preparation thereof - Google Patents

Description

A találmány tárgya biológiailag aktív új vegyület, az FR901 228 anyag. Az FR901 228 anyag antimikrobiális és tumorellenes hatású. A találmány további tárgya FR901 228 anyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény.

Az FR901 228 anyagot a Chromobacterium nemzetségbe tartozó, FR901 228 anyagot termelő törzzsel állítjuk elő, mint amilyen a Chromobacterium violaceum WB968.

A fermentációs eljárást az alábbiakban részletezzük.

(1) Az FR9O1228 anyagot termelő mikroorganizmusjellemzése.

A WB968 törzs taxonómiai vizsgálata:

A WB968 törzset Yamagata-kenben (Japán) gyűjtött talajmintából izolálták. Arendszertani vizsgálatok lényegében a „Bergey’s manual of systematic bacteriology” (1. kötet) kézikönyvben leírt módszerek alapján történt.

(i) Alaktani jellemzés:

A morfológiai sajátosságok megfigyelése tápagaron, 30°C hőmérsékleten nőtt. 20 órás tenyészetben történt fény- és elektronmikroszkóp segítségével.

A WB968 mikroorganizmus gram negatív, mozgó baktérium. A sejt pálcika-alakú, mérete: 0,5-0,6x 1,2-1,8 μ.ηι

A morfológiai sajátosságait az 1. táblázatban foglaltuk össze.

1. táblázat

r- A WB968 törzs morfológiai sajátosságai
gram festés	negatív
a telep színe	szürkés narancssárga
sejtalak	pálca
sejtméret	0,5-0,6X1,2-1,8 pm
spóra	negatív
mozgás	pozitív
flagellum	egyetlen poláris flagellum

fii) Élettani sajátosságok:

A WB968 törzs élettani tulajdonságait a II. táblázatban foglaltuk össze. A tenyésztés hőmérséklettartománya: 15-40 ’C.

A WB968 törzs oxidáz pozitív, kataláz pozitív és O-F teszt fermentatív. A kazeint hidrolizálja, az eszkulint nem A glükózt, fruktóztés a trehalózt hasznosítja. Az indol-teszt negatív. A Voges-Preskauer teszt negatív.

Ugyancsak negatív a β-galaktozidáz próba is (ONPG teszt).

II. Táblázat

A WB968 törzs fiziológiai tulajdonságai

! növekedési hőmérséklettartomány	15—40 C
i növekedés levegőn	+
növekedés peptonos vízben nátrium-
i klorid nélkül
növekedés 69^-os NaCl-ban	-

növekedési hőmérséklettartomány	15^10’C
növekedés kálium-cianidos táptalajon	+
ibolyaszínű festékanyag	-
kataláz	+
oxidáz	+
O-F teszt	fermentatív
gáz glükózból	-
0/129 érzékenység (10,150 gg)	+
nitrát reakció
Tween 50 észteráz	+
kénhidrogén-tenmelés (TSI)	-
indol	-
MR	-
VP	—
Simon citrát	+
ONPG teszt (β-galaktozidáz)	-
ureáz	+
DN-áz	+
keményítőhidrolízis	-
zselatinelfolyósítás	+
kazeinhidrolízis	+
eszkulinhidrolízis
lizin-dekarboxiláz
omitin-dekarboxiláz	-
arginin-dihidroláz	+
DNS G+C tartalma	62,7 mól%
a fő celluláris zsírsav	C16:1
kinontípus	Q-8
savképzés az alábbi cukrokból	+
D-glükóz	+
L-arabinóz	-
D-mannitol	-
D-fruktóz
D-galaktóz	-
D-szorbitol	-
D-trehalóz	+
szukróz	-
lakióz	-
szalicin	-
maltóz	-
cél lobi óz	-

HU 211 514 A9 (iii) Rendszertani azonosítás:

A „Bergey's manual of systemalic bacteriology” (1. kötet) szerint a WB968 törzs a Chromobacterium violaceummal azonos.

A Chromobacterium violaceum WB968 törzsei a Budapesti Egyezmény szerint helyeztük el FERM1968 szám alatt a Fermentation Research Institute Agency of Industnal Science and Technology (1-3, Higashi 1 chome Tsukuba-shi, IBARAKI, 305 Japán) intézménynél 1988. július 20-án. A letétbehelyezés idején a WB968 törzs még mint Aeromonas sp. volt meghatározva.

(2) Az FR901228 anyag termelése:

FR901228 anyagot termelő Chromobacterium nemzetségbe tartozó törzset (például Chromobacterium violaceum WB968) asszimilálható szén- és nitrogénforrást tartalmazó táptalajon, aerob körülmények között tenyésztve (például rázott lombikban, süllyesztett kultúrában, stb.), a találmány szerinti FR901228 anyagot állítjuk elő.

Előnyös szénfonás a táptalajban a szénhidrát, például glükóz, keményítő, fruktóz vagy glicerin.

Előnyös nitrogénforrás a húsleves, élesztőkivonat, peptonliszt, gyapotmagliszt, szójaliszt, kukoricalekvár, szárított élesztő, búzacsíra, stb., valamint a szervetlen és szerves nitrogéntartalmú vegyületek (pl. ammónium-nilrát, ammónium-szulfát. ammónium-foszfát, karbamid vagy aminosavak).

A szén- és nitrogénforrásnak nem szükséges tiszta állapotban lenniük, ugyanúgy használhatók a kevésbé tisztított anyagok is, annál is inkább, mert a növekedési faktorok és az ásványi tápkomponensek megfelelő mennyiségét tartalmazzák.

Ha szükséges a táptalajhoz ásványi sókat - nátriumvagy kálium-karbonát, nátrium- vagy kálium-foszfát, nátrium- vagy kálium-klorid. nátrium- vagy kálium-jodid. magnézium-sók, rézsók, vagy kobaltsók - adunk.

Ha szükséges, különösen, ha a tápközeg erősen habzik, habzásgátlóként folyékony paraffint, állati, növényi vagy ásványi olajat vagy szilikonolajat adhatunk hozzá.

Mint általában a biológiailag aktív anyagok nagyobb mennyiségben történő előállításánál, az FR901228 anyag előállításánál is előnyös süllyesztett, aerob tenyészkörülményeket alkalmazni.

Kis mennyiség előállításához használhatunk rázott lombikos tenyészeteket is.

Nagy tankfermentorban történő termelésnél előnyös oltóanyagként vegetatív sejteket használni, hogy ezzel elkerüljük a termelési folyamat lag fázisát. Ezért egy viszonylag kisebb térfogatú táptalajt baktériumsejtekkel beoltva és növesztve a baktérium vegetatív tenyészetét állítjuk elő, és ezt a vegetatív tenyészetet visszük át a nagy fermentorba. Az oltóanyag tápközege a termelőtenyészet táptalajával azonos összetételű vagy attól eltérő is lehet.

A tenyészet keverését és levegőztetését különböző módon oldhatjuk meg. A keverés történhet lapátos vagy hasonló mechanikus keverőberendezéssel, a fermentor forgatásával vagy rázatásával, különféle pumpaberendezésekkel vagy steril levegőnek a táptalajon való átvezetésével. A hatékony levegőztetést úgy oldhatjuk meg, hogy steril levegőt vezetünk át a fermentleven.

A fermentációt általában 10—40 C hőmérséklettartományban végezzük, előnyösen 25-35 °C hőmérsékleten. A fermentációs idő 15-50 óra, ez függ a fermentációs körülményektől és a méretektől.

A fermentáció befejezésekor az FR901 228 anyagot kinyerjük a fermentléből olyan ismert eljárással, amit általánosan használnak a biológiailag aktív anyagok kinyerésére és tisztítására, például megfelelő oldószeres extrahálással, ahol az oldószer például forró víz. acélon, etil-acetát vagy ezek elegye lehet.

Az extraktumot a szokásos módon kezeljük, hogy hozzájussunk az FR901 228 anyaghoz, például betöményítjük bepárlással vagy desztillációval és az FR901 228 anyagot tartalmazó maradékot tovább tisztítjuk, például kromatografálással, alkalmas oldószerből vagy oldószerei egyből történő átkristályosítással.

Az FR901 228 anyag fizikai-kémiai tulajdonságai:

A fenti fermentációs eljárással előállított FR901 228 anyag az alábbi fizikai-kémiai tulajdonságokkal bír:

megjelenés: színtelen, prizma-alakú kristályok; kémiai jellege: semleges; olvadáspont: 235-245 “C (bomlik); tapasztalati képlet: C₂₄H₃₆N₄O₆S₂;

Elemanalízis a C₂₄H₃₆N₄O₆S₂CH₃CN képlet alapján: számított:

C: 53,68 H: 6,76 N: 12,04, S: 11,02% mért:

C: 53,68, H:6,71, N; 11,80, S: 11,09% molekulasúly: 540,72; FAB-MS m/z: 541 (M+H)⁺; oldhatóság: oldható - kloroformban, etil-acetátban.

rosszul oldódik - metanolban, etanolban, oldhatatlan vízben, hexánban;

színreakció: pozitív - a cérium-szulfátos, kénsavas, jódgőzös reakciók negatív - a ninhidrines, vas(IIl)-kloridos reakciók, az Ehrlich reakció és a Molish reakció;

vékonyrétegkromatográfia:

adszorbens: szilikagél lemez (Kieselgel 60 F₂₅₄

Merck) futtatóelegy: diklór-metán/metanol, 10:1 R_rérték: 0,65;

ultraibolya elnyelési spektrum: végelnyelés (metanolban), infravörös elnyelési spektrum;

KBr v_max = 3360, 3320, 2950, 2910, 1740, 1690, 1660. 1650, 1630, 1520, 1460, 1440, 1400, 1390, 1370, 1350, 1300, 1250, 1220, 1170, 1100, 1040, 1020. 1000, 980, 910 cm-', lásd az 1. ábrán;

Ή-mágneses magrezonancia spektrum: [CDC1₃CD,OC (10:1), 400 MHz], delta: 8,41 (1H, s, cserélhető), 8,25 (1H, d, J = 4Hz, cserélhető), 7,80 (1H, d, J = 6,5 Hz, cserélhető), 7,66 (1H, d, J = 8Hz, cserélhető), 6,31 (1H, q, J = 7Hz), 5,76 (1H, m), 5,705,63 (2H, m), 4,69 (1H, m), 4,51 (1H, m), 3,97 (1H.

HU 211 514 A9 dd. J = 6 és 4Hz), 3,20-3,07 (3H, m), 2,95 (1H, m), 2,83 (1H, dd, J = 14 és 1,5 Hz), 2,66 (IH, dd, J = 14 és 6Hz, 2,65-2,60 (2H, m), 2,37 (1H, m), 2,22 (1H, m), 1,72 (3H, d, J = 6,5 Hz), 1,10 (3H, d, J = 7 Hz), 1,08 (3,H, d, J = 7 Hz), 1,00 (3H, d, J = 6,5 Hz), 0,97 (3H, d, J = 7 Hz), ppm, lásd a 2. ábrán;

^L,C mágneses magrezonancia spektrum: (CDCI3-CD3OD (10:1) 100 MHz) delta: 172,34 (s), 171,43 (s), 169,17 (s), 168,37 (s), 165,59 (s), 130,36 (d), 129,64 (d), 129,62 (s), 129,04 (d), 70,15 (d), 62,42 (d), 58,10 (d), 56,67 (d), 37,75 (t), 37,56 (t), 34, 46 (t), 31,65 (d), 30,02 (t), 28,88 (d), 19,09 (q), 18,96 (q), 18,29 (q), 18,03 (q), 13,04 (q) ppm, lásd a 3, ábrán.

Aminosavanalízis: 4 mg FR901 228 anyagot 110 ’C hőmérsékleten hidrolizálunk 20 órán 2 ml 6n sósavban egy lezárt csőben. A hidrolizátumot automata analizátorral elemezzük. Az FR901 228 anyag aminosavanalízise szerint valin és ammónia van jelen (a valin:ammónia arány 2:1).

A fenti fizikai-kémiai adatok, valamint az

FR901 228 anyag származékainak és magának az FR901 228 anyagnak a kémiai szerkezetvizsgálata alapján az anyag szerkezetét az (I) képlettel adhatjuk meg.

Az FR901 228 anyagból származékokat állítottunk elő.

1. előállítás

A 4. ábrán feltüntetett reakciófolyamat szerint állítjuk elő az FR901 228 anyagból az FR123392 és

FR125441 jelű szármzékait.

mg FR901 228 anyagot feloldunk 2 ml metanolban és hozzáadunk 200 ml In nátrium-hidroxid vizes oldatot. 12 órás, szobahőmérsékleten történő kevertetés után vizes sósavval az oldat kémhatását pH=l értékre állítjuk be, és etil-acetáttal extrahálunk. Az extraktumot magnézium-szulfáttal szárítjuk, szűrjük, az oldószert elpároljuk. A bepárlási maradékot metanolban oldjuk és hozzáadunk 1 ml trimetil-szilil-diazo-metánt. 5 perc múlva 1 csepp ecetsavat adunk a reakciókeverékhez. és az oldószert elpároljuk. A maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiával (0,5 mmx2) tisztítjuk, eluensként 10% metanolt tartalmazó kloroformot használva. 15 mg FR123 392 és 10 mg FR125 441 anyagot kapunk.

FR123 392 anyag:

Ή-mágneses magrezonancia-spektrum:

[CDClj-CD, OD (10:1), 200 MHz] delta: 0,98 (12H, m). 1,74 (3H d, J = 7 Hz), 2,0-2,9 (10H. m). 3,05 (IH, dd, J = 4 és 14 Hz), 3,71 (3H, s). 4,13 (1H, d, J = 8 Hz), 4,37 (2H, m), 4,57 (IH, dd. J = 5 és 10 Hz), 5,6 (2H. m), 6,64 (IH, q, J = 7 Hz). 7.48 (IH, d, J= 10 Hz).

IR elnyelési spektrum: KBr \’,_nax = 3260, 2920, 2400, 1720, 1620, 15)0, 1430, 1260, 1200, 1010 cm-'.

FAB-tömegspektrum (m/z): 541 (M+H)⁺

FR125 441 anyag:

Ή-mágnese magrezonancia-spektrum:

CDC1,-CD, OD (10:1), 400 MHz] delta: 0,95 (12H, m), 1,76 (3H, d, J = 7 Hz), 2,0 (IH, m), 2,35 (3H, m), 2,7 (4H, in), 2,98 (1H, dd, J = 13 és 8 Hz). 3,08 (IH, dd, J = 13 és 4,5 Hz), 3,72 (3H, s), 4,14 (IH, d, J = 6 Hz), 4,35 (IH, d, J = 7 Hz), 4,43 (2H, m), 5,67 (IH, dd, J = 6 és 15 Hz), 5,78 (IH, dt, J = 15 és 6 Hz), 6,70 (IH, q, J = 7 Hz). FAB-tömegspektrum (m/z): (M+H)⁺.

2. előállítás

Az 5. ábra reakciófolyamata szerint az FR 125 441 anyagból FR123 393 anyagot készítünk.

mg FR125 441 anyagot feloldunk 0,8 ml piridinben és hozzáadunk 0,4 ml ecetsavanhidridet. 12 órán át kevertetjük szobahőmérsékleten, majd az oldószert elpároljuk. A bepárlási maradékot preparatív rétegen kromatografáljuk (0,5 mmxl) eluensként 5% metanolt tartalmazó kloroformot használva. 10 mg FR123 393 anyagot kapunk.

FR123 393 anyag:

Ή-mágneses magrezonancia-spektrum: [

CDClj-CDjOD (10:1), 200 MHz] delta: l,0(12H.m), 1,75 (3H, d, J= 7 Hz), 2,05 (3H, s),

1,9-3,3 (10H, m), 3,70 (3H, s), 4,20 (IH, d, J = 8

Hz), 4,34 (IH, d, J = 7 Hz), 4,84 (IH, m), 5,5 (2H, m), 5,84 (IH, dt, J = 15 és 7 Hz), 6,65 (IH, q, J = 7 Hz).

IR elnyelési spektrum: KBr v_max = 3280, 2950. 2430.

1720, 1630, 1500, 1425, 1360, 1225, 1010, 960 cm*¹.

FAB-tömegspektrum (m/z): 615 (M+H)⁺.

3. előállítás

A 6. ábra reakciója szerint az FR901 228 anyagból FR 123 395 származékát állítjuk elő.

mg FR901 228 anyagot feloldunk 2 ml dioxánban és hozzáadunk 55 mg trifenil-foszfint. 72 órán át kevertetünk szobahőmérsékleten, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk. A bepárlási maradékot preparatív vékonyrétegkromatográfiával tisztítjuk (0,5 mmx2), eluensként 2% metanolt tartalmazó kloroformot használva. 10 mg FR123 395 anyagot kapunk.

FR123395:

Ή-mágneses magrezonancia-spektrum: [

CDC1,-CD-,OD (10:1), 200 MHz] delta: 1,0 (12H, m), 1,5 (IH, m), 1,85 (3H, d, J = 7

Hz), 2,1-3,1 (9H, m), 3,90 (IH, d, J = 8 Hz), 4,45 (IH, d, JH = 7 Hz), 5,65-6,0 (4H, m), 6,24 (IH, q

J = 7 Hz).

IR elnyelési spektrum KBr v_nlax = 3300, 2920, 2470, 1730, 1640, 1500, 1420 cm¹.

Az FR901 228 anyag biológiai aktivitásának jellemzésére az alábbiakban néhány vizsgálatot adunk meg.

(1) vizsgálati eljárás - az FR901 228 antimikrobiális hatás

A vizsgálatot Sabouraud közegben végezzük az agarhígításos módszerrel.

“C hőmérsékleten történő 48 órás inkubáció után a minimális gátlást koncentrációi (MIC) pg/ml értékben adjuk meg (III. táblázat).

HU 211 514 A9

III. Táblázat

A; FR901 228 anyag antimikrobiális aktivitása

mikroorganizmus	MIC (Jlg/ml)
Shizosaccharomyces pombe	10
Aureobasidium pullulans IFO 4466	10
Aspergillus niger	100

(2) vizsgálati eljárás - FR901 228 anyag in vitro humán tumorsejtnövekedés gátlása

A citoloxicitásos vizsgálatot mikrotiter lemezen végezzük, melynek mindegyik helye 3x10^{3 * *} tumorsejtet tartalmaz. A sejtek 100 μΐ Dulbecco-féle minimál közegben vannak, melyet 10% borjúembrió szérummal, milliliterenként 50 egység penicillinnel és 50 egység streptomicinnel egészítünk ki. A sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 4 napon át, és Mosmann módszerével [J. Immunoi Methods, 65: 55-63 (1982)] az MTT színreakció segítségével (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)2.5-difenil-tetrazólium-bromid; Sigma) értékelünk. Az MTT-ből 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk foszfátpufferben, az oldatot sterilre szűrjük és eltávolítjuk a kevés nem oldódó részt. Miután a humán tumorsejtek tenyésztése befejeződik, 10 μΙ MTT oldatot adunk 100 μΐ közeghez és a lemezt tovább inkubáljuk 37 'C hőmérsékleten 4 órán ál. 100 μΙ savas izopropanolt (0.04 n sósav izopropanolban) adunk minden egyes lyukba, és a keveréket alaposan összekeverjük, hogy a sötétkék kristályok feloldódjanak. Miután valamennyi kristály feloldódott, a lemezeket kéthullámhosszú mikrotiterlemez fotométerén (Model MTP-22; Corona Electric Co., Ltd., Katsuta, Japán) kiértékeljük 550 nm-en, a referens hullámhossz 660 nm. A vizsgálati anyagot metanolban oldjuk, Dulbecco-féle minimál tápoldatban hígítjuk, és annyit adunk a tenyészethez, hogy a végső koncentráció 1 pg vagy az alatt legyen milliméterenként. Az eredményeket a IV. táblázatban foglaltuk össze.

IV. Táblázat

Humán tumorsejlek in vitro növekedésgátlása FR901 228 anyaggal

humán tumorsejt	IC50 (ng/ml)
A549 (tüdőrák)	0,82
MCF-7 (mellrák)	0,99
SW480 (vastagbélrák)	0,57

(3) vizsgálati eljárás -FR901 228 anyag tumorellenes hatása egér/patkány P388 leukémiával szemben.

Az FR901 228 anyag tumorellenes hatását egér/patkány tumorrendszeren határozzuk mg. P388 leukémiasejteket (1 x 10⁶) juttatunk be intraperitoneálisan 8 hetes, nőstény BDF, egérbe. 24 órával a tumorsejtek beültetése után FR901 228 anyagot adunk be intraperitoneálisan naponta egyszer az állatnak további három napon keresztül. Az FR901 228 anyagot 0,9%os sóoldatban szuszpendáljuk. A kontrollállatok 0.9%os sóoldatot kapnak intraparitoneálisan.

Az eredményeket az V. táblázatban foglaltuk össze. A tumorellenes aktivitást a csoport átlagos túlélési idejével és a T/C %-kal jellemeztük.

A T/C %-ot megkapjuk, ha a kezelt csoport átlagos túlélési idejét osztjuk a kontroll csoport átlagos túlélési idejével és a kapott értéket szorozzuk százzal.

V TÁBLÁZAT

Az FR90I 228 anyag tumorellenes aktivitása egér/patkány P388 leukémiával szemben

dózis (mg/kg/nap)	n	átlagos túlélési idő (nap)	T/C %
kontroll	4	9,0	100
1,0	4	12,25	169,4
0,32	4	14,25	158,3

(4) vizsgálati eljárás - az FR901 228 anyag akut toxieitása

Az FR901 228 anyag akut toxieitása BDF, egérnek intraperitoneálisan beadva: 5,6 mg/kg.

A fenti vizsgálatok bizonyítják, hogy az FR901 228 anyag biológiai aktivitással rendelkezik.

A találmány szerinti, hatóanyagként FR901 228 csoportot tartalmazó gyógyszerkészítmény lehet szilárd, félszilárd vagy folyékony állapotban. A készítmény a hatóanyag mellett szerves vagy szervetlen hordozó vagy adalékanyagot tartalmaz, mely lehetővé teszi külsőleges, szájon át történő, vagy parenterális alkalmazását. A tabletták, pirulák, kapszulák, kúpok, oldatok, emulziók, szuszpenziók és más készítmények összeállításához a szokásos, nem-toxikus, gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagokat használjuk. Ha szükséges, további adalékanyagot, stabilizáló, sűrűsítő, színező, szagosító anyagot is adhatunk a készítményhez. A készítmény annyi FR901 228 hatóanyagot tartalmaz, amely a kellő tumorellenes hatást fejti ki a betegség folyamatára, állapotára.

Ember esetében előnyös a készítményt intravénásán, intramuszkulárisan vagy orálisan alkalmazni. Noha a hatóanyag dózisa egyénileg függ a kezelendő ember korától és állapotától, az egyes beviteli módnál általában testsúlykilogrammonként az alábbi dózisokat alkalmazzuk: intravénásán napi 0,1-100 mg, intramuszkulárisan napi 0,1-100 mg, orálisan 0,1-100 mg.

Amint fentebb már megállapítottuk, az FR901 228 anyag származékainak ugyancsak van tumorellenes hatása.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, így a találmány oltalmi körét nem korlátozzák.

1. példa

Fermentáció: 500 ml Erlenmeyer lombikban 120 °C hőmérsékleten 30 percen át sterilizálunk 160 ml táptalajt, melynek összetétele: 1% glükóz és 1/ húsleves (bouillon). Mindegyik lombikot beoltjuk egy kacsnyi

HU 211 514 A9

Chromobacterium violaceum WB968 tenyészettel ferdeagarról. A tenyészetektet 30 'C hőmérsékleten 20 órán át rázatjuk körkörös rázógépen. A nyer tenyészettel beoltunk 12 harmincliteres fermentort, mely 15 liter táptalajt tartalmaz. A táptalaj összetétele: 1% glükóz, 1 % húsleves, 0,05% Adekanol habzásgátló (Asahi Denka Kogyo Co.). Előzőleg a fermentorokat a táptalajjal 120 C hőmérsékleten sterilezzük, 30 percen át. A fermentálás 30 °C hőmérsékleten történik 24 órán keresztül 20 liter/perc levegőztetés és 200-as percenkénti fordulatszámú kevertetés mellett.

Kinyerés és tisztítás: miután a fermentáció befejeződött, a fermentleveket 120 °C hőmérsékleten sterilizáljuk 30 percen keresztül. 10 kg diatomaföld segítségével a fermentlevet leszűrjük. A szűrletet (150 liter) kétszer extraháljuk azonos térfogatnyi etil-acetáttal. Az extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk, az olajos maradékot 500 g szilikagéllel (Kieselgel 60, 70230 mesh. E. Merck.) összekeverjük és metanolban elkeverjük. Az oldószer elpárolása után a szilárd port ugyanilyen szilikagélen oszlopkromatografáljuk. 0.5 liter szllikagélből n-hexánban készítjük el az oszlopot. Az oszlopot az alábbi eluensekkel és sorrendben eluáljuk. 2 liter n-hexán; 3 liler-n-hexán/etil-acetál, 3:1; 3 liter n-hexán/elil-acetát 1:1; 3 liter n hexán/etil-acetát, 1:2 és végül 5 liter etil-acetát.

A kívánt anyagot tartalmazó frakciókat egyesítjük, csökkentett nyomáson bepároljuk halvány sárga por alakjában megkapva az FR901 228 anyagot. Ezt a port 10 ml diklór-metán/metanol, 10:1 elegyben oldjuk, az oldathoz hozzáadunk 20 ml acetonitrilt. Hagyjuk szobahőmérsékleten állni, mialatt 920 mg tisztított FR901 228 válik ki színtelen kristályos anyagként.

Claims (5)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Az (I) képletű FR901 228 anyag.
2. 2. Az (I) képletű FR901 228 anyag előállítása, azzal jellemezve, hogy a Chromobacterium nemzetséghez tartozó FR901 228 anyagot termelő törzset vizes tápközegben, aerob körülmények között tenyésztjük és az FR901 228 anyagot a fermentléből kinyerjük.
3. 3. A 2. igénypont szerinti anyag, azzal jellemezve, hogy a Chromobacterium törzs a Chromobacterium violaceum WB968 (FERM BP-1968).
4. 4. A Chromobacterium violaceum VB968 (FERM BP-1968) biológiailag tiszta tenyészete.
5. 5. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként FR901 228 anyagot és nem-toxikus, gyógyászati szempontból alkalmazahtó vivőanyagot tartalmaz.