FI120722B - Jäädytettyyn vesipitoiseen kanta-aineeseen immobilisoituja kaasukuplasuspensioita - Google Patents

Description

Jäädytettyyn vesipitoiseen kanta-aineeseen immobilisoituja kaasukuplasuspensioita t

X

Tekninen alue 5 Keksintö koskee jäädytettyyn vesipitoiseen kantaja- aineeseen ixnmobilisoituja kaasukuplasuspensioita. Keksintö koskee myös menetelmää kaasukuplasuspensioiden kylmäsäilyt-tämiseksi ja niiden käyttöä varjo-aineina ihmisten ja eläinten kehon ultraäänikuvaukseen.

10 Tausta

Ultraäänivarjoaineiden nopea kehitys viime vuosina on synnyttänyt joukon erilaisia formuloita, jotka ovat käyttökelpoisia ihmisen tai eläimen kehon elinten ja kudoksen ultraäänikuvauksessa. Nämä aineet on suunniteltu käy-15 tettäviksi pääasiassa laskimon- tai valtimonsisäisesti injektoitavina aineina lääketieteellisten kaikukuvauslaittei-den käytön yhteydessä. Nämä laitteet ryhmitellään tyypillisesti B-moodikuvanmuodostuslaitteisiin (perustuvat kudosten takaisinsirontaominaisuuksien tilajakautumiseen) ja dopp-20 lersignaalin käsittelylaitteisiin [perustuvat ultraääni- kaikujen CW (Continuous Wave; vaimenematon aalto) tai puis- • · ·.**: sidoppler -käsittelyyn veri- tai nestevirtausparametrien ··· määrittämiseksi] . Muutkin ultraääni kuvausmenetelmät, kuten ulraäänitietokonetomografia (mittaa läpäisyn vaimenemista) ·*·*; 25 tai diffraktiotietokonetomografia (mittaa sironta- ja vai-• · . .*. menemisparametreja kulmaheijastuksessa) saattaisivat hyötyä ··· näistä aineista tulevaisuudessa. Nämä injektioformulat, jotka perustuvat kaasumikrokuplien suspensioihin vesipitoi- ... sissa nestekantajissa, voidaan jakaa kahteen perusryhmään: ♦ · · *„ 30 vesipitoiset suspensiot, joissa kaasumikrokuplia rajoittaa • m *·;** kaasu-nesterajapinta tai nopeasti häviävä kuori, jossa on *:**: mukana neste- ja pinta-aktiivisuusainemolekyylejä, jotka ·:··· ovat löyhästi sitoutuneina kaasu-nesterajapintaan, ja sus- .1. pensiot, joissa mikrokuplilla on aineelliset rajat tai • · ·**, 35 konkreettinen, luonnon- tai synteettisistä polymeereistä muodostettu kuori. Viimeksi mainitussa tapauksessa mikro- 2 kuplia kutsutaan mikropalioiksi. On olemassa vielä yksi muu ultraäänivarjoaineiden laji: suspensiot, jotka on muodos tettu huokoisista polymeeri- tai muista kiintoainehiukka-sista, jotka sisältävät kaasumikrokuplia mikrohiukkasten 5 huokosiin sulkeutuneina. Näitä varjoaineita pidetään tässä mikropallolajin yhtenä varianttina.

Vaikka nämä kaasumikrokuplalajit ovat fysikaalisesti erilaisia, molemmat ovat suspendoituina käyttökelpoisia ultraäänivarjoaineina. Näitä erilaisia formuloita kuvataan 10 tarkemmin EP-hakemusjulkaisussa 0 077 752 (Schering), EP-hakemusjulkaisussa 0 123 235 (Schering), EP-hakemusjulkaisussa 0 324 938 (Widder et ai.), EP-A 0 474 833 (Schneider et ai.). EP-hakemusjulkaisussa 0 458 745 (Bichon et ai.), US-patenttijulkaisussa 4 900 540 (Ruan), US-patentti-15 julkaisussa 5 230 882 (Unger) jne.

Tietyt edellä mainituista ultraäänivarjoaineista ovat kehittyneitä ja kaupallisesti saatavia, kun taas jotkut ovat kliinisten kokeiden eri vaiheissa. Olivatpa nämä tuotteet kaupallisesti saatavia tai kliinisten testien koh-20 teitä, ne kaikki kärsivät kuitenkin varastointiin liittyvistä ongelmista. Varastointiongelmat ovat luontaisia sus- • · *.**: pensioille, joille perusluonteensa vuoksi tapahtuu faasien ··» :...ϊ erottumista tai lajittumista, kaasukuplien aggregoitumista, :φ\: kaasun diffuusiota ja pitkien aikojen kuluttua jopa eri- 25 laisten lisäaineiden saostumista. Kaasumikrokuplien tai • * ; .·. -mikropallojen lajittuminen johtuu siitä, että suspensiot

«M

valmistetaan tyypillisesti kalibroimattomista mikrokuplis- ta, joiden koko vaihtelee suunnilleen alueella 1-50 pm.

t... Hyvin suuren osan tunnettujen suspensioiden kaasukuplista » » I.. 30 havaitaan olevan alueella 1 - noin 10 pm. Mikrokuplien ko- « · *"* kojakautuman vuoksi näissä suspensioissa tapahtuu varas- *"*: toinnin aikana lajittumista, jolloin suuremmat mikrokuplat ·:*·; kulkeutuvat yläosaan, kun taas pienemmät konsentroituvat y..' alempiin osiin, mikä usein johtaa täydelliseen faasien • · 35 erottumiseen. Yritykset ratkaista tämä ongelma käyttämällä viskositeettia nostavia aineita ovat osoittaneet, että la- • m 3 jittumisnopeutta voidaan pienentää, mutta lajittumista ei saada eliminoiduksi.

Kaasumikrokuplien aggregoituminen on prosessi, jonka aikana suuremmat kuplat absorboivat pienempiä ja kasva-5 vat siten. Tämä prosessi nopeutuu faasien erittymisen myötä, ja suspensioista, joissa mikrokuplien keskimääräinen koko on esimerkiksi 2-8 pm, voi hetken kuluttua kehittyä suspensioita, joissa mikrokuplien koko on esimerkiksi 5 - 12 pm tai suurempi. Tämä on erityisen epätoivottavaa 10 tapauksissa, joissa ovat kyseessä kalibroitujen mikrokuplien suspensiot ja sydämen vasemman puoliskon varjoaineiksi tarkoitetut suspensiot. Koon muutos ei pelkästään muuta varjoaineen kaiunmuodostusominaisuuksia vaan tekee myös aineesta käyttökelvottoman tiettyihin sovelluksiin, kuten 15 sellaisiin, jotka perustuvat mikrokuplien kulkuun keuhkojen läpi. Mikrokuplat, joiden koko on yli 10 pm, eivät todennäköisesti kulje keuhkojen hiussuonten läpi, ja mainitunlaiset suspensiot ovat siten, vaarallisten tilojen aiheuttamisen lisäksi, vähemmän sopivia sydämen vasemman puoliskon ku-20 vaamiseen.

Toinen kaasususpensioihin ja niiden varastointiin • · ·.**: liittyvä ongelma aiheutuu kaasun diffuusiosta, jota tapah- • * ϊ.,,ί tuu suhteellisen hitaasti, mutta joka nopeuttaa faasien it*.i erottumista. Kaasun väistämätön karkaaminen mikrokuplasus- ·*·*: 25 pensioista pahenee siten edelleen ja voi ääritapauksissa • * • ;*; johtaa kaasun täydelliseen poistumiseen väliaineesta. Näi-

• M

den erilaisten mekanismien yhteisvaikutus kaasususpensioi- • · · hin tuhoutumiseen johtaa siten aineen hyvin nopeaan pilaan- ... tumiseen.

• * * • · · 30 Joissakin ultraäänikuvauslähestymistavoissa yksi näi- • · **;·* den varjoaineiden toivottavista puolista on mikrokuplien *!**: tai kaasua sisältävien hiukkasten jakautuminen kapealle ko- ·:*·; koalueelle. Syy tähän esitetään seuraavassa. Näiden ainei- .!. den tehokkuus lääketieteellisillä ultraäänikuvauslaitteilla * m • m ***, 35 tuotettujen kuvien kontrastin parantajina perustuu pääasi assa tulevan ultraäänienergian suuresti tehostuneeseen si- 4 rontaan ja toissijaisesti näitä aineita sisältävien kudosten muuntuneisiin vaimennusominaisuuksiin. Kontrastilla tarkoitetaan sellaisilta alueilta saatavan signaalin suhteellista amplitudia, joille varjoaineen on määrä imeytyä, ver-5 rattuna sellaisilta alueilta saatavan signaalin amplitudiin, jotka eivät ota vastaan varjoainetta. Tehostuksella tarkoitetaan kontrastiarvon kasvua, joka havaitaan varjoaineen annon jälkeen, verrattuna ennen antoa havaittavaan kontrastiin. Kuten edellä mainittiin, näistä aineista suo-10 rimmin hyötyvä kuvauslaitteistotyyppi on kaikukuvauslait-teiden ryhmä (B-moodi tai doppler). Ainetta sisältävien kudosten erilaisia vaimennusominaisuuksia verrattuina ainetta sisältämättömiin kudoksiin voidaan myös hyödyntää kuvausme-nettelyn diagnostisen arvon parantamiseksi. Lisäksi voidaan 15 hyödyntää sekä aineen sironta- että vaimennusominaisuuksien riippuvuutta ultraäänivärähtelyn taajuudesta kudosten tilallisen erottumisen parantamiseksi edelleen. Näissä tapauksissa tämän taajuusriippuvuuden määräävät fysikaaliset lait riippuvat systemaattisesti mikrokuplien tai hiukkasten 20 koosta. Niinpä käytettävät algoritmit ovat tehokkaampia vaikuttaessaan kaikuihin, jotka ovat peräisin kokojakautu- • · *.**: maltaan kapeista mikrokuplista tai hiukkasista. Yhdessä • ti ί.,.ϊ mainitunlaisessa lähestymistavassa hyödynnetään esimerkiksi mikrokuplien epälineaarista oskillaatiota kaikutaajuuskom- ·***: 25 ponenttien detektoimiseksi peruseksitaatiotaajuuden toisel- • « • ;*j la yliaaltotaajuudella. Koska varjoainetta sisältämättömil- *·* lä kudoksilla ei ole samanlaista epälineaarista käyttäyty-mistä kuin mikrokuplilla, tällä menetelmällä pystytään pa-... rantamaan merkittävästi kontrastia varjoainetta sisältävien • Il I., 30 ja sisältämättömien alueiden välillä. Tämä parannus on ko~ • · *”·* rostuneempi, hiukkasmäärän tilavuusyksikköä kohden ollessa *"*: määrätty, kun kokojakautuma on kapea. Sellaisten tuotteiden ·;·*: valmistus, joilla on tällainen kapea kokojakautuma, on kui- ^.1.^ tenkin aikaavievää; näiden kalibroitujen suspensioiden vai- • ♦ ***. 35 miin lähteen tarjoaminen käyttöön helpottaisi suuresti tä män menetelmän jatkokehittämistä ja käyttöä. Mainitunlais- 5 ten valmisteiden luotettava säilytys kokojakautumaltaan muuttumattomina on siten myös suuren kiinnostuksen kohteena.

Lisävaikeuksia vesipitoisten kaasususpensioiden varastoinnissa koetaan sellaisten ultraäänivarjoaineiden yh-5 teydessä, jotka sisältävät fosfolipidejä mikrokuplien stabilointiaineina. Fosfolipidien hydrolyysin vuoksi stabilointiaineen (pinta-aktiivisuusaineen) pitoisuus pienenee jatkuvasti varastoinnin aikana, mikä aiheuttaa mikrokupla-sisällön häviämistä ja suspension kalunmuodostusominaisuuk-10 sien heikkenemistä. Niinpä kaasumikrokuplasuspensioita käsittävien ultraäänivarjoaineiden varastointiongelma on edelleen ratkaisematta.

Vesipitoisten kaasususpensioiden kylmäsäilytys jäädyttämällä on ollut melko pitkään tunnettua elintarvikete-15 ollisuudessa. Esimerkiksi US-patenttijulkaisussa 4 347 707 (General Foods Corp.) kuvataan sellaisen kaasutetun jään varastointia, jonka kaasupitoisuus on suuri ja varastointi-kestävyys hyvä, menetelmällä, jossa kaasutettu jää valmistetaan saattamalla vesipitoinen neste kosketukseen hydraa-20 tin muodostavien kaasujen kanssa sellainen paineen ja lämpötilan alaisena, että muodostuu nesteeseen suspendoitunut kaasu-hydraattikompleksi, ja alennetaan lämpötilaa ja pai- i l netta säädeltävissä olevalla tavalla, niin että muodostuu «·« ' :*·.· esimerkiksi karbonoitua jäätä, joka sisältää 85 - 110 mg • · •V. 25 C02:a/g. Kyseisen dokumentin mukaan kaasutetulla jäällä on . suuri kaasupitoisuus ja pitkäaikainen varastointikestävyys ··· .···. ja se soveltuu jaettavaksi kaupallisesti jäädytetyssä ti- • · « lassa ja antaa veteen laitettuna tulokseksi voimakkaan kuo- ... humisen.

• · » 30 Seurauksena on, ettei kaasususpensioiden jäädyttä- « · '*·** minen niiden säilyttämiseksi pitkäaikaisesti ja säilöttyjen *:*·; suspensioiden käyttö tarvittaessa soveltuisi ultraäänivar- ·;··· joaineille, koska suspendoidulla kaasulla on taipumus kara- ta kantaja-aineesta sulatuksen aikana. Lisävaikeutena jää- • « **\ 35 dytettyjen kaasumikrokuplasuspensioiden yhteydessä on se, että kantaja-aineen laajeneminen jäätymisen aikana synnyt- 6 tää sisäisiä voimia, jotka yksinkertaisesti tuhoavat tai rikkovat mikrokuplan kuoren ja vapauttavat sisään suljetun kaasun ja päästävät sen karkaamaan joko varastoinnin aikana tai myöhemmin suspension sulatuksen aikana.

5 Yhteenveto keksinnöstä

Lyhyesti esitettynä keksintö koskee jäädytettyyn vesipitoiseen väliaineeseen immobilisoitujen kaasukuplien jäädytettyjä suspensioita, joissa kantaja-aine, joka käsittää kaasukuplia tavanomaisine lisäaineineen, on fysiologi-10 sesti hyväksyttävä kantaja. Immobilisoidut kaasukuplat ovat mikrokuplia, joita rajoittaa nopeasti häviävä kuori, ja suspensiot ovat nestemäisessä muodossa ollessaan injektoitavissa eläviin olentoihin ja käyttökelpoisia varjoaineina ihmis- ja eläinpotilaiden veritilan ja kudoksen ultraääni-15 kuvauksessa.

Jäädytettyjen suspensioiden lämpötila on keksinnön mukaisesti alueella -1 ja -196 °C, edullisesti -10 ja -76 °C, ja kaasumikrokuplien koko on alle 50 pm ja edullisesti alle 10 pm. Erityisen käyttökelpoisia ovat suspensiot, joissa 20 mikrokuplien koko on alueella 2-9 pm, ja sellaisten mik- . rokuplien suspensiot, joiden koko on 3 - 5 pm, ovat vielä *„* käyttökelpoisempia.

• * '···* Kun otetaan huomioon biohajoavuusero suspensioiden, • · * '· *i jotka käsittävät kaasumikropalloja tai mikrokuplia, joilla : V 25 on konkreettinen kuori, jossa kalvo on valmistettu synteet- tisestä tai luonnonpolymeeristä tai proteiinista, ja sel- ί,ί ! laisten suspensioiden välillä, jotka käsittävät nopeasti häviävällä kuorella varustettuja kaasumikrokuplia, ovat tä~ :*·*; män keksinnön mukaiset jäädytetyt mikrokuplasuspensiot .·**. 30 edullisempia, erityisesti käytettäessä lamellaarisia fosfo- ··· , • 4 lipidejä yksi- tai monimolekyylikalvokerrosten muodossa.

Keksintö koskee myös menetelmää mikrokuplasuspensi- * * oiden valmistamiseksi, jossa suspensio sijoitetaan jäähdy- ·***· tyslaitteeseen, immobilisoidaan mikrokuplat kantaja-ainee- ··« 35 seen jäähdyttämällä lämpötilaan -1 ja -196 °C ja edullisemmin lämpötilaan alueella -10 ja -76 °C, ja pidetään yllä 7 jäädytysolosuhteet pitkiä aikoja. Jäädytetty suspensio voidaan mahdollisesti pitää atmosfäärissä, joka koostuu iner-tistä kaasusta tai kaasuseoksesta, jossa vähintään yksi kaasuista on mikrokupliin kapseloitu kaasu. Kaasu valitaan 5 edullisesti halogeenipitoisten kaasujen, ilman, hapen, typen, hiilidioksidin ja niiden seosten joukosta.

Myös keksinnön mukaisten injektoitavissa olevien suspensioiden käyttöä elinten ja kudoksen ultraäänikaikuku-vaukseen ja ultraäänivarjoaineiden valmistusta kuvataan.

10 Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on käyrä, joka kuvaa kuplapitoisuuden (lukumäärän) muutosta sulatetuissa suspensioissa, jotka käsittävät SFg-mikrokuplia ja ilmamikrokuplia, jotka sisältävät 5 % C5Fi2:a, vesipitoisessa kantaja-aineessa, varastointi-15 lämpötilan funktiona.

Kuvio 2 on käyrä, joka kuvaa sellaisten sulatettujen suspensioiden kokonaiskaasutilavuuden muutosta, jotka käsittävät SF6-mikrokuplia ja ilmamikrokuplia, jotka sisältävät 5 % C5Fi2:a, vesipitoisessa kantaja-aineessa, varas-20 tointilämpötilan funktiona.

Kuvio 3 on graafinen esitys, joka kuvaa sulatettu- • · « *· " jen mikrokuplasuspensioiden absorbanssin muutosta käytetyn • · · ulkoisen paineen ja varastointilämpötilan funktiona.

• ·

Kuvio 4 on diagrammi, joka esittää suhteellisen ab-: 25 sorbanssin muutosta sulatettuihin suspensioihin kohdistetun • ·’· ulkoisen paineen funktiona eri lämpötiloissa tapahtuneen varastoinnin jälkeen.

Kuvio 5 on diagrammi, joka esittää kalibroitujen #·;·, mikrokuplien lukumäärään (kuvio 5A) ja kaasutilavuuteen • » · 30 (kuvio 5B) perustuvaa kokojakautumaa keskimääräisen koon S * *” ollessa 3, 4 ja 6 pm.

*

Kuvio 6 on diagrammi, joka esittää mikrokuplien lu-*:··: kumäärään (kuvio 6A) ja kaasutilavuuteen (kuvio 6B) perus- tuvaa koko jakautumaa kalibroimattomia mikrokuplia käsittä- • i **\ 35 van näytteen ollessa kyseessä.

• · 8

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Keksinnön mukaisesti tarjotaan käyttöön kaasumikro-kuplien jäädytetty suspensio, jossa mikrokuplat ovat immobi-lisoituina jäädytettyyn vesipitoiseen kantaja-aineeseen läm-5 pötilassa välillä -1 °C ja -195 °C, joka sisältää mikrokup-lien lisäksi tavanomaisia lisäaineita. Vesipitoinen kantaja on fysiologisesti hyväksyttävä, ja suspensio on nestemäisessä muodossa ollessaan injektoitavissa eläviin olentoihin ja käyttökelpoinen ultraäänivarjoaineena ihmis- ja eläinpotilai-10 den veritilan ja kudoksen kuvaamisessa. Immobilisoidut kaasu-mikrokuplat, joita rajoittaa nopeasti häviävä vaippa, suljetaan molekyylien väliin jäädytettyyn kantaja-aineeseen, jonka lämpötila on alueella -1 ja -196 °C, edullisesti -10 ja -76 °C. Kulloinkin käytettävä lämpötila-alue riippuu 15 mikrokuplissa olevan kaasun valinnasta mutta myös käytettävien lisäaineiden lajista ja määrästä. Niinpä esimerkiksi ilman tai typen ollessa kyseessä lämpötila voi olla mikä tahansa alueella -1 ja -196 °C, kun taas CiFgin ollessa kyseessä lämpötila on alueella -1 ja -5 °C. Kun käytetään polyoksipro-20 peeni-polyoksieteenikopolymeerejä tai polyeteeniglykolia , , lisäaineina, voi korkein hyväksyttävä lämpötila olla sus- • · · **t/ pensiossa läsnä olevan kokonaismäärän mukaan -5 °C tai jopa *·*·* -10 °C -1 °C:n sijasta.

• · *. *ί Useimpien suspensiossa olevien mikrokuplien, koko on «· t • V 25 tyypillisesti alle 50 pmm mutta laskimonsisäisesti injektoisi^ tavien varjoaineiden ollessa kyseessä mikrokuplien koko on :*·*· edullisesti alle 10 pm.

Useimmissa sovelluksissa suspensiot, joissa mikro-/:*, kuplien koko jakautuma on alueella 2-9 pm, täyttäisivät ,···, 30 vaatimukset; kun kyseessä ovat kalibroitujen mikrokuplien • * “* suspensiot, koko voi kuitenkin olla mikä tahansa kyseisellä ***** alueella. Se voi olla esimerkiksi 2-4 pm, 3-5 pm, *ί**ϊ 4-6 pm, 5 - 7 pm tai 7-9 pm; kokoalueella 3 - 5 pm ole- ,···. va mikrokupla on kuitenkin edullinen.

• · *". 35 Niinpä keksintö tarjoaa käyttöön myös kokojakautu- • · maltaan hyvin kapeiden mikrokuplien jäädytettyjä suspensi- 9 oita. Kalibroitujen mikrokuplien suspensioiden tyypillisiä mikrokuplien kokojakautumia ovat sellaiset, joita valaistaan kuviossa 5, jossa jakautumat annetaan mikrokuplien lukumäärä jakautumana (määritettynä Coulter-laskurilla), kuvio 5 5A, ja mikrokuplien tilavuusjakautumana (määritettynä Coul ter-laskurilla) , kuvio 5B. Toisin kuin kalibroituja mikro-kuplia sisältävillä suspensioilla, kalibroimattomia kaasukuplia sisältävillä suspensioilla lukumäärään ja tilavuuteen perustuvat kokojakautumakäyrät ovat tyypillisesti kulo vioissa 6A ja 6B esitettyjen kaltaisia. Näiden kuvioiden perusteella on helppo ymmärtää, että kalibroiduista kaasu-mikrokuplista valmistettujen suspensioiden kaikukuvausvas-teet ovat yhtenäisempiä ja ne aiheuttavat vähemmän sirontaa ja antavat siten terävämpiä kuvia kuin kalibroimattomia 15 mikrokuplia sisältävät suspensiot. Kuten jo mainittiin, nämä kalibroidut suspensiot ovat hyvin toivottuja, mutta niiden käyttö on tähän asti ollut hyvin rajoitettua. Niinpä näitä toivottavia suspensioita on nyt helposti saatavissa muuttamalla yksinkertaisesti jäädytettyjä suspensioita, joita 20 voidaan varastoida matalissa lämpötiloissa pitkäaikaisesti niiden alkuperäisen kaiunmuodostuskyvyn häviämättä kohtuut- • · t *· *· tomasti.

·***· ·...* Keksinnön yksi lisäetu perustuu siihen, että kai- • · \**j kusignaalikomponenttien synnyttämiseksi kaksinkertaisella M · • *,! 25 taajuudella perustaajuuteen nähden kuvantaminen toisella : i|i yliaaltotaajuudella vaatii varjoaineen epälineaarista os- ·*·'· killaatiota. Mainitunlainen käyttäytyminen pakottaa ultra- äänieksitaatiotason ylittämään tietyn akustisen kynnyksen määrätyllä syvyydellä kudoksessa. Epälineaarisen oskillaa- • · t 30 tion aikana tapahtuu taajuusmuunnos, mikä aiheuttaa akusti- « · sen energian siirron peruseksitaatiotaajuudelta toiselle * ***** yliaaltotaajuudelle. Niinpä mikrokupliin tämäntyyppisen ku- vauksen aikana välittyvät merkittävät energiat vaativat ,···. riittävän kestäviä mikrokuplia näiden olosuhteiden sietämi- • * 35 seksi. Keksintö tarjoaa helpon ja kätevän tavan saada sus- • · pensioita, joissa on paineenvaihteluita hyvin kestäviä mik- 10 rokuplia, koska ne voidaan nyt valmistaa etukäteen, varastoida ja käyttää tarvittaessa.

Kuten jo mainittiin, keksinnön mukaiset jäädytetyt suspensiot sisältävät kaasumikrokuplien lisäksi lisäainei-5 ta, joihin kuuluvat erilaiset pinta-aktiivisuusaineet, viskositeettia nostavat aineet, stabilointiaineet jne. Pinta-aktiivisuusaineisiin, joihin voi kuulua kalvon muodostavia ja kalvoa muodostamattomia pinta-aktiivisuusaineita, kuuluvat lamellaarisessa eli levymäisessä muodossa olevat fosfo-10 lipidit, joiden tiedetään stabiloivan mikrokuplien nopeasti häviävää kaasu-nestekuorta. Lamellaariset fosfolipidit voivat olla yksi- tai monimolekyylikalvokerrosten tai li-posomien muodossa.

Mikrokuplien tyypin mukaan kantaja-aine voi sisäl-15 tää lisäaineina hydratoivia aineita ja/tai hydrofiilisiä stabiloivia yhdisteitä, kuten polyeteeniglykolia, hiilihydraatteja, kuten galaktoosia, laktoosia tai sakkaroosia, dekstraania, tärkkelystä ja muita polysakkarideja tai muita tavanomaisia lisäaineita, kuten polyoksipropeeniglykolia ja 20 polyoksieteeniglykolia ja niiden kopolymeerejä; rasva-alkoholien eettereitä polyoksialkeeniglykolien kanssa; ras- • · :.**i vahappojen estereitä polyoksialkyloidun sorbitaanin kanssa; il· saippuoita; glyserolipolyalkeenistearaattia; glyserolipoly- :*·.· oksieteenirisinoleaattia; polyalkeeniglykolien homo- ja ko- • · ·*·*· 25 polymeerejä; poletoksyloitua soijaöjyä ja risiiniöljyä sa- • * . .·. moin kuin niiden hydrattuja johdannaisia; sakkaroosin tai ,···, muiden hiilihydraattien eettereitä ja estereitä rasvahappo- 4 · · jen tai rasva-alkoholien kanssa, jotka ovat mahdollisesti ... polyoksialkyloituja; tyydyttyneiden ja tyydyttymättömien

• · I

**[/ 30 rasvahappojen mono-, di- ja triglyseridejä; myös soijaöljyn • · *·;·' ja sakkaroosin glyseridejä voidaan käyttää. Pinta- ·:··: aktiivisuusaineet voivat olla kalvon muodostavia ja kalvoa ····· muodostamattomia, ja niihin voi kuulua linoleyylilesitiinin .;. tai polyeteenidodekanoaatin tyyppisiä polymeroitavissa ole- • · **··, 35 via amfifiilisia yhdisteitä. Pinta-aktiivisuusaineet ovat edullisesti kalvon muodostavia ja edullisemmin fosfati- 11 diinihapon, fosfatidyylikoliinin, fosfatidyylietanoliamii-nin, fosfatidyyliseriinin, fosfatidyyliglyserolin, fosfati-dyyli-inositolin, kardiolipiinin, sfingomyeliinin ja niiden seosten joukosta valittavia fosfolipidejä. Mainittujen kal-5 von muodostavien pinta-aktiivisuusaineiden lisäksi suspensiot voivat sisältää korkeintaan 50 paino-% ei-lamellaa-risia pinta-aktiivisuusaineita, joina tulevat kyseeseen rasvahapot, rasvahappojen ja -alkoholien esterit ja eetterit polyolien, kuten polyalkeeniglykolien, polyalkylenoitu- 10 jen sokereiden ja muiden hiilihydraattien kanssa ja polyal-kylenoitu glyseroli. Erityisen sopiviin aineisiin kuuluvat disetyylifosfaatti, kolesteroli, ergosteroli, fytosteroli, sitosteroli, lanosteroli, tokoferoli, propyyligallaatti, askorbyylipalmitaatti ja butyloitu hydroksitolueeni.

15 Suspensioilla, joissa mikrokuplat on stabiloitu sorbitolilla tai ionittomilla pinta-aktiivisuusaineilla, kuten polyoksieteeni-polyoksipropeenikopolymeereillä (tunnetaan kaupallisesti nimellä PluronicR), on ollut yhtä hyvä kuva-uskyky varastoinnin jälkeen.

20 Keksinnön mukaisten suspensioiden yhteydessä käytet täviin lisäaineisiin voi lisäksi kuulua viskositeettia nosta- I « · *· *· via aineita ja/tai stabilointiaineita, joina tulevat kysee- !...: seen lineaariset ja silloitetut poly- ja oligosakkaridit, • · \**j sokerit, hydrofiiliset polymeerit ja jodatut yhdisteet. Mai- ·· « : *#! 25 nitunlaisessa tapauksessa näiden yhdisteiden suhde mukana : j*j oleviin pinta-aktiivisuusaineisiin on noin 1:5 - 100:1.

··· ·*·*· Keksinnön mukaiset ja erilaisia kaasuja tai kaa- suseoksia sisältäviksi valmistetut suspensiot sisältävät ,···, tavallisesti 107 - 108 mikrokuplaa/ml, 108 - 109 mikrokup- • · · 30 laa/ml tai 109 - 1010 mikrokuplaa/ml. Nämä pitoisuudet pysy- • · "* vät käytännöllisesti katsoen samoina pitkäaikaisessa varas- '·*** toinnissa, ts. muutamia kuukausia, ja jos suspensiot vai- *!*" niistetään käyttämällä SFe:a, C5F12:a tai niiden seoksia tai .···, ilman seoksia SFg:n tai C5Fi2:n kanssa, ne eivät muutu edes * f ***. 35 toistuvien jäädytys-sulatussyklien jälkeen.

• · 12

Vaikka soveltuvien pinta-aktiivisuusaineiden ja stabilointiaineiden yhteydessä halogeenipitoisia kaasuja, ilmaa, happea, typpeä tai hiilidioksidia voidaan käyttää yksinään, on vähän aikaa sitten ehdotettu käytettäviksi myös 5 halogeenipitoisten kaasujen seoksia ilman, hapen, typen ja hiilidioksidin kanssa. Halogeenipitoiset kaasut ovat kaasuja, joina tulevat kyseeseen rikkiheksafluoridi, tetrafluo-rimetaani, trifluorikloorimetaani, difluoridikloorimetaani, bromitrifluorimetaani, bromidifluorikloorimetaani, dibromi-10 difluorimetaani, tetrafluoridikloorietaani, pentafluorikloo- rietaani, heksafluorietaani, heksafluoripropeeni, oktafluo-ripropaani, heksafluoributadieeni, oktafluori-2-buteeni, ok-tafluorisyklobutaani, dekafluoributaani, perfluorisyklopen-taani, dodekafluoripentaani tai niiden seokset, edullisesti 15 rikkiheksafluoridi, tetrafluorimetaani, heksafluorietaani, heksafluoripropeeni, oktafluoripropaani, heksafluoributadieeni, oktafluori-2-buteeni, oktafluorisyklobutaani, dekafluoributaani, perfluorisyklopentaani tai dodekafluoripentaani.

Keksintö koskee myös menetelmää mikrokuplasuspensi-20 oiden valmistamiseksi, jossa suspensio sijoitetaan jäähdy- tysvälineeseen, kuten jäähdytyslaitteeseen, immobilisoidaan 9 · mikrokuplat kantaja-aineeseen jäähdyttämällä lämpötilaan f»» alueella -1 ja -196 °C ja edullisemmin lämpötilaan alueella -10 ja -76 °C, ja pidetään yllä jäädytysolosuhteet- pitkiä ·'·*: 25 aikoja. Jäädytetty suspensio voidaan mahdollisesti pitää • · . ·’; atmosfäärissä, joka koostuu inertistä kaasusta tai kaa- «·· ,’i\ suseoksesta, jossa vähintään yksi kaasuista on mikrokupliin kapseloitu kaasu. Kaasu valitaan edullisesti halogeenipi- t.··' toisten kaasujen, ilman, hapen, typen, hiilidioksidin ja • · · 30 niiden seosten joukosta.

• « **" On todettu, että keksinnön mukaiseen jäädytettyyn *"*· suspensioon käytettävien kaasujen tai kaasuseosten kiehu- *:**: mislämpötilan tulisi olla alle -18 °C. Tämä merkitsee, että suspensioilla, jotka on valmistettu käyttämällä halogenoi-.!!!: ^5 tuja kaasuja, kuten C4Fe;a tai CsFio:a, yksinään, on hyvin heikko varastointikestävyys ja ne menettävät kaiunmuodos- 13 tuskykynsä käytännöllisesti katsoen kokonaan jäädytyksen jälkeen. Tämä oli erityisen yllättävää, sillä kaikki muut halogenoidut kaasut antoivat tulokseksi hyvin stabiileja suspensioita, jotka kestivät muutamia jäädytys-sulatussyk-5 lejä kaiunmuodostuskyvyn häviämättä merkittävästi. Jopa näiden kaasujen "douppaus" pienillä määrillä muita halo-genoituja kaasuja tai jopa halogenoidun aineen, kuten C5Fi2:n, huoneenlämpötilassa nestemäisillä höyryillä on antanut tulokseksi seoksia, joita ei ole voitu säilyttää jää-10 dytettyinä. Ilman sekoittaminen tiettyjen määrien kanssa näitä kaasuja on sen sijaan antanut tulokseksi suspensioita, joilla on erittäin hyvin varastointikestävyys ja kaiun-muodostuskyky muutamien jäädytys-sulatussyklien jälkeen.

Kuten edellä mainittiin, keksinnön mukaiset injek-15 toitavissa olevat suspensiot ovat nestemäisessä tilassa ollessaan käyttökelpoisia varjoaineina elinten ja kudoksen ultraäänikuvauksessa. On selvää, että suspensiot sulatetaan ennen käyttöä, pidetään mahdollisesti huoneenlämpötilassa jokin aika ja annetaan sitten potilaalle. Potilas tutkitaan 20 sitten skannaamalla ultraäänianturilla ja tuotetaan kuva skannatusta alueesta.

» · \ " Keksinnön suoja-alan piiriin kuuluu myös keksinnön 0 · · mukaisten jäädytettyjen injektoitavissa olevien suspensioi- • « ϊ#*·ί den käyttö ultraäänikaikukuvausvarjoaineiden valmistamisek- I*·*· 25 si. Valmistuksella tarkoitetaan, että kalibroitujen tai ka- • ·** libroimattomien mikrokuplien kohtalaisen väkeviä suspensi- • ·· .·!*. oita (esimerkiksi lO10 - 1011 mikrokuplaa/ml) varastoidaan jäädytetyssä tilassa jokin aika, ja kun niitä tarvitaan, f...# sulatetut suspensiot laimennetaan mahdollisesti haluttuun • · * I», 30 pitoisuuteen lisäämällä samaa tai eri fysiologisesti hyväk-

S S

·" syttävää kantaja-ainetta. Ajatellaan myös, että tässä vai- ***** heessa voidaan lisätä muita lisä- tai säätelyaineita.

*:**: Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavin esimerkein.

•C. Esimerkki 1 • · · **'. 35 Liuotettiin 52 mg diarakidoyylifosfatidyylikoliinia (DAPC), 2,4 mg dipalmitoyylifosfatidiinihappoa (DPPA) (molem- 14 pien valmistaja Avanti Polar Lipids, USA) ja 3,94 g poly-eteeniglykolia (PEG 400, valmistaja Siegfried) lämpötilassa 60 °C t-butanoliin (20 ml) pyöreäpohjaisessa lasiastiassa. Kirkas liuos jäähdytettiin nopeasti lämpötilassa -45 °C ja 5 kylmäkuivattiin. Annoksia (25 mg) saatua valkoista kakkua laitettiin 10 ml:n lasipulloihin, Pullot suljettiin kumi-tulpilla, imettiin tyhjiksi ja täytettiin valituilla kaasuilla tai kaasuseoksilla (katso taulukko 1). Sitten injektoitiin fysiologista suolaliuosta (0,9 % NaClra) tulppien 10 läpi (5 ml pulloa kohden) ja lyofilsaatit liuotettiin ravistamalla voimakkaasti.

Mikrokuplasuspensiot vietiin kylmähuoneeseen (-18 °C) . Kolmen päivän kuluttua ne sulatettiin huoneenlämpötilassa (23 °C) ja analysoitiin kuplapitoisuus (käyttä-15 maila Coulter Multisizer -laitetta) ja suhteessa 1/50 laimennetun suspension absorbanssi aallonpituudella 700 nm. Aallonpituudella 700 nm mitattu absorbanssi on kuplasuspen-sion kokonaissameuden mitta.

• · • 1 · • ·· • · ··· ♦ 1 • · ··· • · ♦ · · ♦ · · • · «1 · « · · • 1 ♦ · • · 1 « · · *·· ·«· • · « • · · • · · • · · • · · ··· 9 · • · «·· • 1 • · • ·· * · • · • « · 15

Taulukko 1

Kaasu tai kaesuseoE Kiehumia- Vesiliu- Abeorbansei Kupla- lfimpötlla ("c) koisuue* (S lähtöarvoa ta) saanto (#)

Ilma -195 0,0167 33 14 SF6 - 63.8 0,005 57 23 C3Fe -36,7 <<0.005 59 54 c4f8 -6 0,016 U 8 C4F10 -1.7 <0.005 7 4

Ilma (+ 5 * C5F12;a) -195 0.0167 71 49

Ilma (<· 10 X C5F12:a) -195 0,0167 55 34

Ilma (4 10 % C4F8:a) -195 0,0167 50 30

Ilma (♦ 10 % C4F10:a) -195 0,016 52 32 SP6 (♦ 5 % C5F12:a) -63.8 0.005 62 41 C3F8 (♦ 5 * C5H12:a) -36,7 <<0,005 64 71 C4F8 (♦ 5 X "6 0,016 7 6 c4f10 5 * C5K12:a) -1.7 <0.005 1 1

Kaanon (* 5 X CjH^ia) -108.1 0,108 38 17 *Bunsen-kertoimena ilmoitettuna

Taulukossa 1 esitetyt tulokset osoittavat, että jää- 5 dytyksenkestävyys riippuu kaasun kiehumislämpötilasta ja ve~ siliukoisuudesta. Kuplasaanto on pienempi, kun kyseessä ovat kaasut, joiden kiehumislämpötila on yli -18 °C. Mitä tulee kaasuihin, joiden kiehumislämpötila on alle -18 °C, ;*·,· kuplasaanto on sitä suurempi, mitä pienempi on liukoisuus.

• · .·*·. 10 On myös kiintoisaa havaita, että lisättäessä pieni määrä ·#· ,·, ; kaasua, jonka moolimassa on suuri ja vesiliukoisuus alhai- • · · .!/ nen, kuten dodekafluoripentaania (C5F12), kuplasaanto sula- • · ‘ ; tuksen jälkeen paranee, kun kyseessä ovat kaasut, joiden kiehumislämpötila on alhainen, muttei sellaisten kaasujen • · · *·* * 15 kohdalla, joiden kiehumislämpötila on yli -18 °C. Lopuksi mainittakoon, että mikrokuplilla, jotka on täytetty pelkäl- ·»· V : lä C4H8:lla ja C4Hi0:lla tai niiden seoksilla pienten määrien f·» kanssa dodekafluoripentaania, on hyvin heikko jäädytyksen-sulatuksenkestavyys. Kun näitä kaasuja käytetään yhdessä • · 20 ilman kanssa, antavat näitä seoksia sisältävien mikrokup- • · . lien suspensiot kuitenkin parempia tuloksia kaiunmuodostus- ··· kyvyn tai mikrokuplahäviön suhteen kuin ilmamikrokuplia si-*:**i sältävät suspensiot.

16

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 kuvatulla valmistettuja SFg-mikrokup-lasuspensioita jäädytettiin hitaasti (noin 30 min:ssa) lämpötilaan -18 °C tai nopeasti (minuutissa) lämpötilaan 5 -45 °C. Muita SFg-mikrokuplasuspensioita pidettiin ensin huoneenlämpötilassa, kunnes kaikki kuplat olivat nousseet pintaan, ennen jäädytystä. Toisia jäädytettiin kuplien ollessa homogeenisesti jakautuneina liuokseen. Jäädytettyjä suspensioita varastoitiin lämpötiloissa -18 °C ja -45 °C 10 kuukausi ja ne sulatettiin sitten.

Taulukko 2

Testi Kuplapitoisuus Kuplatilavuus (% lähtöarvosta) (% lähtöarvosta) 15 Hidas jäädytys (-18 °C) 16 39

Nopea jäädytys (-45 °C) 24 51

Dekantoitu (-18 °C) 14 34

Homogeeninen (-18 °C) 24 61 20 Taulukossa 2 esitetyt tulokset osoittavat, että jää- , , dytysnopeudella on suhteellisen pieni vaikutus lopputulok- • ·· seen. Saanto on homogeenisten suspensioiden ollessa kysees- • · *··[ sä parempi kuin dekantoitujen mikrokuplien suspensioiden *. *: tapauksessa.

• *.· 25 Esimerkki 3 ψ ί.·.ϊ Valmistettiin multilamellaarisia liposomeja (MLV: itä) :T: liuottamalla 4,5 g hydrattua soijafosfatidyylikoliinia (HSPC, valmistaja Nattermann) ja 0,5 g disetyylifosfaattia (Fluka, Sveitsi) kloroformin ja metanolin seokseen (2:1) ja haih- * .·*·. 30 duttamalla sitten liuotteet kuiviin pyöreäpohjaisessa pul- *·*β lossa käyttämällä pyöröhaihdutinta. Lipidikalvojäännös kui- * * vattiin vakuumieksikkaattorissa. Kun oli lisätty 100 ml tis- *·**· lattua vettä, suspensiota inkuboitiin 30 min lämpötilassa .***. 70 °C sekoittaen. Liposomisuspension lopullinen lipidipi- ··· 35 toisuus säädettiin arvoon 25 mg/ml lisäämällä tislattua vettä.

17

Laitettiin annos liposomisuspensiota (100 ml) kaa-sutiiviiseen lasireaktoriin, joka oli varustettu suurino-peuksisella mekaanisella emulaattorilla (Polytron) . Reaktorissa oleva kaasufaasi oli ilmaa, joka sisälsi 5 % C5Fi2:a 5 (määritettynä tiheysmittauksella) . Homogenoinnin jälkeen (10 000 min"1, 1 min) saatu maitomainen suspensio laitettiin erotussuppiloon, 6 tunnin kuluttua liuoksen pinnalla oli nähtävissä valkoinen kuplakerros. Alempi (liposomeja sisältävä) faasi poistettiin, lisättiin pieni määrä tuoretta 10 vettä ja homogenoitiin mikrokuplakerros uudelleen. Menettely (dekantointi) toistettiin ja valmistettiin neljä näytettä, joissa mikrokuplien koko oli erilainen (katso WO94/09829). Näytteet jäädytettiin lämpötilassa -18 °C ja sulatettiin 24 tunnin kuluttua huoneenlämpötilaan.

15

Taulukko 3

Alkuperäinen Läpimitta Dn Kuplapitoisuus Absorbanssi, läpimitta Dn jäädytyksen (% lähtö- 700 nm (pm) ja sulatuk- arvosta) (% lähtö- 20 sen jälkeen arvosta) 2.5 2,5 19 20 4.6 4,5 60 68 .*·*. 6,0 6,2 86 100 7.6 8,1 76 91 * ·· :v. 25 • · I Saatujen tulosten (taulukko 3) perusteella näyttää • · · *" siltä, ettei jäädytys-sulatuskäsittelyllä ole vaikutusta 0 · · '·* * mikrokuplien keskimääräiseen läpimittaan. Kokeiden perus teella näyttää siltä, että läpimitaltaan suuremmat mikro- *«· V* 30 kuplat (> 2,5 pm) kestävät jäädytys-sulatuskäsittelyä pa-* · · remmin kuin läpimitaltaan pienemmät mikrokuplat. Lisäksi havaitaan, että tietyissä tapauksissa sulatusnopeus saattaa vaikuttaa näytteessä läsnä olevaan lopulliseen mikrokupla- • · ^ pitoisuuteen. Täsmällinen riippuvuus on edelleen epäselvä; 35 on kuitenkin olemassa viitteitä siitä, että mikrokuplahäviö **"*· on kääntäen verrannollinen sulatusnopeuteen. Alustavat tu lokset osoittavat, että saavutetaan parempia tuloksia sus- 18 pensioissa vallitsevan mikrokuplapitoisuuden (lukumäärän) ja kokonaiskaasutilavuuden suhteen tehtäessä nopeutettu sulatus, ts. sulatus vesihauteessa lämpötilassa 25 °C, kuin jätettäessä näytteet lämpötilaan 5 °C tai 20 °C sulamaan hi-5 taammin. Suurin kaasutilavuushäviö havaittiin lämpötilassa 5 °C sulatettujen näytteiden kohdalla.

Esimerkki 4

Toistettiin esimerkissä 3 kuvattu koe käyttämällä pinta-aktiivisuusaineiden seosta MLV:iden sijasta. Pinta-10 aktiivisuusaineseos valmistettiin liuottamalla 1 g dipalmi-toyylifosfatidyyliglyserolia (DPPG, Na-suola, valmistaja Avanti Polar Lipids, USA) ja 3 g PluronicR Fgg-'aa (polyoksi-eteenin ja polyoksipropeenin kopolymeeri, moolimassa 8 400) tislattuun veteen (80 ml). Kun oli tehty kuumennus suunnil-15 leen lämpötilassa 70 °C, saatiin kirkas liuos. Tämä liuos jäähdytettiin huoneenlämpötilassa ja säädettiin tilavuus 100 ml:ksi glyserolilla. Pinta-aktiivisuusaineliuos laitettiin Polytron-emulgaattorilla varustettuun kaasutiiviiseen reaktoriin. Homogenoinnin jälkeen (10 000 min-1, 1 min) saa-20 tiin maitomainen suspensio, jonka pinnalla oli vaahtoker- ros. Vaahto heitettiin pois ja alempi faasi, joka sisälsi • · · _ *· *· 109 mikrokuplaa/ml, otettiin talteen. Tämän faasin annet- ··» tiin seistä muutama tunti ennen valkean mikrokuplakerroksen • t ·,*·: talteenottoa. Talteen otetut mikrokuplat homogenoitiin uu- ϊ * : 25 delleen tislatussa vedessä, dekantoitiin toisen kerran ja i jäädytettiin ja sulatettiin edellä kuvatulla tavalla. Ver- • ·· ·*·*; rattaessa kuplien ominaisuuksia ennen jäädytystä ja sen jälkeen ei havaittu merkittävää muutosta kokonaiskuplapi-toisuudessa (ennen 1,3-108 kuplaa/ml, jälkeen 1,25-108 kup- • * * 30 laa/ml) eikä keskimääräisessä läpimitassa (ennen 4,0 pm, *!* jälkeen 3, 9 pm) .

*:**· Esimerkki 5 *ϊ**ί Valmistettiin SFö-kuplia esimerkissä 1 kuvatulla .···, tavalla ja dekantoitiin ne esimerkissä 3 kuvatulla tavalla.

• · 35 Alemman vesifaasin poiston aikana suppiloon lisättiin vas- * · taava tilavuus SF6~kaasua. Kuplakerros suspendoitiin uudel- 19 leen tislattuun veteen, 0,9-%:iseen NaCl-liuokseen, vesipitoiseen 3-%:iseen glyseroliliuokseen ja 100 mg/ml trehaloo-sia sisältävään liuokseen. Määritettiin kuplapitoisuus ja absorbanssi aallonpituudella 700 nm (laimennuksen jälkeen) 5 ennen jäädytys-sulatuskäsittelyä ja sen jälkeen.

Taulukossa 4 esitettävät tulokset osoittavat erinomaisen kuplasaannon riippumatta suspendointiväliaineesta. On tärkeää huomata, että mikrokuplasaanto on tässä yhteydessä alueella 66 - 96 %, mikä saattaa näyttää olevan ris-10 tiriidassa taulukoissa 1 ja 2 esitettyjen aiempien tulosten kanssa. Tässä tapauksessa kuplat ovat kuitenkin ensinnäkin kalibroituja, ts. stabiilimpia kuin kalibroimattomat, ja tässä käytettyjen kuplien koko on toisekseen yli 4 pm.

15 Taulukko 4

Suspendointiväliaine Absorbanssi, 700 nm Kuplapitoisuus (% lähtöarvosta) (% lähtöarvosta)

Tislattu vesi 69 66 0,9 % NaCl:a 86 92 20 3 % glyserolia 92 96 , , 100 mg/ml trehaloosia 89 73 • · * ·« • · • •t *···1 2 3 4 5 Esimerkki 6 • · *. 1: Valmistettiin dekantoituja SFg-mikrokuplia .esimer- ·· · I V 25 kissa 5 kuvatulla tavalla. Mikrokuplakerros suspendoitiin erilaisiksi kuplapitoisuuksiksi 0,9-%:iseen NaCl-liuokseen, jäädytettiin suspensio sitten lämpötilassa -18 °C, varastoitiin sitä noin 4 kuukautta ja sulatettiin se sitten huo-neenlämpötilassa.

• · · 30 Taulukko 5 • · • · ··· - • · Kuplapitoisuus (-lO°/ml) Kuplatilavuus (μΐ/ml) Kuplien läpimitta (pm) 2 • Alku- Jäädytys Alku- Jäädytys Alku- Jäädytys * peräinen ja sulatus peräinen ja sulatus peräinen ja sulatus 3 β 1,9 1,9 (1,9)1 6.Θ 6,0 (5,5)1 3,1 3,0 (2,9)1 4 *···1 3,9 3,7 (3,3) 14,7 11.5 (9,4) 3,1 2,8 (2,6) 5 5,9 5,7 (5,4) 22.6 20,4 (18,6) 3,1 3.0 (3,0) 7,7 7,6 (6,1) 28,3 24,6 (17,0) 3,0 2.9 (2,7) 20 *Suluissa toisen jäädytys-sulatuskäsittelyn jälkeen saadut tulokset

Taulukkoon 5 kootut tulokset osoittavat, ettei kup-lapitoisuudella ole merkittävää vaikutusta jäädytyksensula-5 tuksenkestoon. Edes toinen jäädytys-sulatuskäsittely, joka tehtiin varastoinnin jälkeen, ei vaikuttanut lopulliseen pitoisuuteen, mikä osoittaa, että nämä suspensiot kestävät toistuvia jäädytys-sulatussyklejä jopa varastoinnin jälkeen ilman suurta kuplalukumäärähäviötä ja näytteiden kaiunmuo-10 dostuskyvyn heikkenemistä.

Esimerkki 7

Toistettiin esimerkin 3 mukainen menettely käyttämällä SF6:a ja 5 % C5F12:a sisältävää ilmaa kaasufaasina ja jäädytettiin tuloksena olevasta suspensiosta otetut näyt-15 teet lämpötiloissa -18, -45, -76 ja -196 °C. Kun näytteitä oli varastoitu 30 päivää vastaavissa jäädytyslämpötiloissa, ne sulatettiin ja analysoitiin suspensiot. Saadut tulokset esitetään taulukossa 8. Näytteiden mikrokuplapitoisuus ennen jäädytystä oli ll,6-107/ml SF6:n ollessa kyseessä ja 20 9,8*107/ml ilman ja C5Fi2:n (5 %) seoksen ollessa kyseessä, ja näytteiden vastaavat kaasutilavuudet olivat ennen varas- • *.**: tointia 2,9 μΐ/ml ja 5,9 μΐ/ml. Mikrokuplien keskimääräinen • · a läpimitta oli näiden kahden kaasun kohdalla 2,3 pm ja 4,2 pm. ·**·· Tuloksista voidaan päätellä, että mitä alempi va- 25 rastointilämpötila on, sitä suurempi on mikrokuplapitoisuu- • * • den ja kokonaiskaasusaannon lasku sulatuksen jälkeen. Tu-··· .*:*. lokset osoittavat lisäksi, että SF6:a sisältävien sulatet- • · · tujen suspensionäytteiden ollessa kyseessä keskimääräinen ... läpimitta kasvaa ensin ja pienenee sitten nopeasti lämpöti- • « · 30 lan laskiessa- Ilman ja CsFi2:n (5 %) seoksen ollessa ky- • · *·"* seessä mikrokuplien läpimitta muuttuu suhteellisen vähän.

*:**: Tulokset osoittavat myös, että mikrokuplien keskimääräinen *···· läpimitta pienenee varastointilämpötilan laskiessa. Kuten .1. osoitetaan kuviossa 1, SFg-'a ja ilma-C5Fi2-seosta sisältävi- • * • · ·'*, 35 en suspensoiden alkuperäisestä mikrokuplapopulaatiosta saa daan talteen vain 51,7 % ja 52 % lämpötilassa -196 °C teh- 21 dyn varastoinnin jälkeen. Kuten nähdään kuviosta 2, varastoinnin jälkeen talteen saatu kokonaiskaasutilavuus on SF6:n kohdalla 21,1 % alkuperäisestä tilavuudesta, kun taas ilma-C5Fi2-seoksen tilavuussaanto on 46,5 %. Tämä osoittaa, 5 että mikrokuplien koko on muuttunut suspensioissa, jotka on valmistettu käyttämällä SF6:a, ts. talteen saatujen mikro-kuplien läpimitta on pienempi.

Taulukko 8

Kaasu Talteen Läpimitta Talteen Lämpö- Kaasuseos Talteen Läpimitta Talteen saatu Dn sula- saatu tila ilma + saatu Dn sula- saatu kaasu- tuksen kupla- 'C C5H12 kaasu- tukeen kupla- tilavuus Jälkeen pitoisuus tilavuus Jälkeen pitoisuus μΐ/ml -107 μΐ/ml ·107 SF6 2,3 2,4 10.0 -18 ilma/C5H12 5.5 4.6 7,7 SFg 2.B 2,6 7.9 -4S ilms/C5H12 4.2 4.5 6,2 SFg 1,8 2.5 6.7 -70 ilma/CsHlz 3,9 4,4 5,6 SF6 0,6 2,0 6.0 -196 ilma/C.H., 2,7 4,0 5,1 10

Kuviot 3 ja 4 valaisevat jäädytys- tai varastointi- lämpötilan vaikutusta sellaisten mikrokuplasuspensioiden kykyyn kestää paineen muutosta, jotka sisältävät ilman ja : CsHi2:n (5 %) seosta. Kuvion 3 diagrammissa esitetään absor- • *· 15 banssi (mitattu aallonpituudella 700 nm) 3 päivää eri läm- m ♦ Γ*. pötiloissa varastoituihin suspensioihin suunnatun paineen ,* .* funktiona. Tästä diagrammista nähdään, että varastointiläm- • · · • ·* pötilan alentamisella on sellainen vaikutus suspensioiden *·!·* ominaisuuksiin, että lämpötila-alueella -18 ja -76 °C va- V * 20 rastoitujen suspensioiden ominaisuuksien muutos on merkit tävä, kun taas lämpötila-alueella -76 ja -196 °C varastoi-:T: tujen suspensioiden ominaisuuksien muutos on suhteellisen ·***; pieni. Niinpä varastointilämpötilojen pitäminen -76 °C:n ··· ' . alapuolella ei näytä tarjoavan lisäetuja. Kun otetaan huo- ] 25 mioon kustannukset, -76 °C:n alapuolella olevien lämpötilo- * jen valinta saattaa olla oikeutettua vain poikkeustapauk- ··♦ ; j sissa.

♦·· ...·; Kuvio 4 osoittaa puolestaan, että jos mikrokup- lasuspensioita, jotka sisältävät ilman ja CsH^in (5 %) se- 22 osta, varastoidaan 3 päivää matalissa lämpötiloissa, niiden kyky kestää paineenvaihtelua säilyy muuttumattomana, kun taas sama suspensio, jota on pidetty sama aika lämpötilassa 25 °C, menettää noin 10 % alkuperäisestä kyvystään kestää 5 paineenvaihteluja.

Tarkkaa menettelyä ja kriittisen paineen merkitystä sekä absorbanssimittausta on selitetty EP-hakemusjulkaisus-sa 0 554 213, joka mainitaan tässä viitteenä.

Esimerkki 8 10 Tehtiin kaksiulotteinen kaikukardiografia käyttä mällä ACUSON 128 XP 5 -laitteistoa (Acuson Corp., USA) ja esimerkkien 1 ja 3 mukaisia valmisteita koe-eläiminä käytetyille pienoissioille ääreislaskimoon tehdyn injektoinnin (0,04 ml/painokilo) jälkeen. Määritettiin vasemman kammion 15 kaikukontrastin paraneminen alkuperäisten samoin kuin jäädytettyjen ja sulatettujen näytteiden ollessa kyseessä.

Merkittävien eroja ei havaittu edes sellaisten näytteiden kuin esimerkissä 7 kuvattujen albumiinimikropallojen ollessa kyseessä, mikä osoittaa, että jäljellä olevat kuplat 20 olivat suurelta osin riittäviä antamaan tulokseksi vahvan ja pitkäaikaisen kaiunvahvistuksen.

• * • · · • ·· • · • 00 • · 0 9 • 09 9 9 • · ♦ • ·· 9 0 • a 0 • 00 9 0 • 0 0 0 9 9 • 00 009 • 00 0 0 0 *00 0 900 0 0 0 • 90 9 0 00 • 9 • 9 009 0 0 9 0 9 9 0 0 • 00 9 9 • 9 009 0 0 0

Claims (22)

23

1. Jäädytettyyn vesipitoiseen kantaja-aineeseen lämpötilassa välillä -1 ja -196 °c immobi li soitu jäädytetty 5 kaasukuplasuspensio, jossa mainittu kaasukuplia ja tavanomaisia lisäaineita käsittävä kantaja-aine on fysiologisesti hyväksyttävä kantaja, tunnettu siitä, että immobili-soidut kaasukuplat sisältävät kaasuja tai kaasuseoksia, joiden kiehumispisteet ovat alle -18 °C ja ovat mikrokuplia, 10 joita rajoittaa nopeasti häviävä surfaktanttikaasu/neste-kuori, jonka koko on alle 10 pm, ja suspensio on nestemäisessä muodossa ollessaan injektointikelpoinen ja käyttökelpoinen varjoaineena elävien olentojen veritilan ja kudoksen ultraäänikuvauksessa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen suspensio, tun nettu siitä, että jäädytetyn väliaineen lämpötila on välillä -10 ja -76 °C.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen suspensio, tunnettu siitä, että mikrokuplien koko on 2 - 9 pm,

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen suspensio, tun- t nettu siitä, että mikrokuplien koko on 3 - 5 pm.

• · · " 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen suspensio, tunnettu siitä, että lisäaineisiin kuuluu pinta-aktiivi- • · *.*♦· suusaineina yksi- tai monimolekyylikalvokerrosten muodossa ! **i 25 olevia lamellaarisia fosfolipidejä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen suspensio, tun- • M ·*·*. nettu siitä, että lamellaariset fosfolipidit ovat ioni- tai multilamellaaristen liposomien muodossa.

.···, 7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen suspensio, tun- • · · U. 30 nettu siitä, että lamellaariset fosfolipidit ovat tyydyt-• · 'V tyneitä fosfolipidejä.

*·**: 8. Patenttivaatimuksen 6 tai 7 mukainen suspensio, ·:**: tunnettu siitä, että fosfolipidit valitaan fosfatidiha- ,··». pon, fosfatidyylikoliinin, fosfatidyylietanoliamiinin, fos- 35 fatidyyliseriinin, fosfatidyyliglyserolin, fosfatidyyli-ino- sitolin, kardiolipiinin, sfingomyeliinin ja niiden seosten joukosta. • · 24

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen suspensio, tunnettu siitä, että lisäaineisiin kuuluu disetyylifos- . faatin, kolesterolin, ergosterolin, fytosterolin, sitoste-rolin, lanosterolin, tokoferolin, propyyligallaatin, askor-5 byylipalmitaatin ja butyloidun hydroksitolueenin joukosta valittavia aineita.

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen suspensio, tunnettu siitä, että lisäaineisiin kuuluu sorbitoli tai ionittomia pinta-aktiivisuusaineita, kuten po lyoks ie teeni- 10 polyoksipropeenikopolymeerejä.

11. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mukainen suspensio, tunnettu siitä, että lisäaineisiin kuuluu viskositeettia nostavia aineita ja/tai stabilointiaineita, jotka valitaan lineaaristen ja silloitettujen po- 15 ly- ja oligosakkaridien, sokereiden, hydrofiilisten polymeerien ja jodattujen yhdisteiden joukosta, ja niiden massasuhde läsnä oleviin pinta-aktiivisuusaineisiin on noin 1:5 - 100:1.

12. Minkä tahansa edeltävän patenttivaatimuksen mu- 20 kainen suspensio, tunnettu siitä, että lisäaineet kä sittävät lisäksi korkeintaan 50 paino-% ei-laminaarisia * · · *· " pinta-aktiivisuusaineita, jotka valitaan rasvahappojen, · · rasvahappojen estereiden ja eettereiden ja polyoleja sisäl- • · \'·· tävien alkoholien joukosta. :**[: 25

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen suspensio, : tunnettu siitä, että polyolit ovat polyalkeeniglykole- ··· ;*·*; ja, polyalkylenoituja sokereita ja muita hiilihydraatteja tai polyalkylenoitua glyserolia.

14. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen suspensio, • · · 30 tunnettu siitä, että se sisältää 107 - 108 mikrokup- T laa/ml, 108 - 109 mikrokuplaa/ml tai 109 - 1010 mikrokup- laa/ml.

*:**: 15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen suspensio, tun- .···, nettu siitä, että kaasu valitaan halogeenipitoisten kaasu- • · 35 jen, ilman, hapen, typen, hiilidioksidin tai niiden seosten • φ joukosta. 25

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen suspensio, tunnettu siitä, että halogeenipitoinen kaasu valitaan SF6:n, CF4:n, C2F6:n, C2F8:n, C3F6:n C3F8:n, C4Fg:n, C4F8:n, C4Fi0:nm, C5Fi0:n, CsFi2:n ja niiden seosten joukosta.

17. Menetelmä patenttivaatimusten 1-16 mukaisten jäädytettyjen mikrokuplasuspensioiden valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) laitetaan mainittujen mikrokuplien nestemäinen suspensio vesipitoisessa kantajassa jäähdytyslaitteeseen; 10 b) immobilisoidaan mikrokuplat jäähdyttämällä läm pötilaan välillä —1 ja -196 °C ja edullisemmin lämpötilaan välillä -10 ja -76 °C, ja c) pidetään yllä jäädytysolosuhteet pitkiä aikoja.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että jäädytetty suspensio pidetään atmosfäärissä, joka koostuu inertistä kaasusta tai kaa-suseoksesta, jossa ainakin yksi kaasuista on mikrokupliin kapseloitu kaasu.

19, Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että mikrokuplat sisältävät kaasua tai kaasuseosta, jossa ainakin yhden kaasun kiehumislämpötila on alle -18 °C.

··♦ ·...*' 20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, • · *.*·* tunnettu siitä, että suspensio sulatetaan ja pidetään :***: 25 huoneenlämpötilassa jokin aika ennen käyttöään.

• · : ·*· 21. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukaisen • ft .***. jäädytetyn suspension käyttö injektoitavan suspension vai- mistamiseksi käytettäväksi elinten ja kudoksen ultraääni-·.. kuvauksessa. • · t • · · I.. 30

22. Jonkin patenttivaatimuksen 1-16 mukaisen • · *** jäädytetyn suspension käyttö injektoitavan suspension val- ***** mistamiseksi käytettäväksi ultraäänikaikukuvausvarjoainei- :·*: den valmistukseen. »·· • · • « ··« • · 26