CN1066965C - 超声用气体悬浮体及其贮存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了固定在含常用添加剂和稳定剂的冷冻含水载体介质中的微气泡悬浮液，其中载液是生理学上可接受的，被固定的微气泡是以暂时的包膜或有形的膜为界的微气泡。悬浮液在液体状态时是可注射的，用作机体血池和组织超声成象的造影剂，通过将平均大小在50μm以下、较佳为10μm以下、更佳为2-8μm之间的微气泡的悬浮液冷冻至-1℃和-76℃之间的温度，并长期维持在此温度下，将微气泡固定在载体中。微气泡可被诸如层状磷脂的表面活性剂所稳定，或可包含合成或天然聚合物或蛋白质组成的膜。本发明还揭示了微气泡悬浮液的冷藏及其应用。

Description

超声用气体悬浮体及其贮存方法
技术领域
本发明涉及固定在冷冻水性载体介质中的气泡悬浮液。本发明还涉及气泡悬浮液冷藏及用作人和动物超声成象造影剂的方法。
背景技术
近年来，超声造影剂的迅速发展产生了在人或动物体器官和组织超声成象上有用的许多不同的制剂。这些制剂的设计主要作为静脉内或动脉内的注射剂，和医用回波描记仪配合使用。这些仪器典型地分成B型成象(根据反向散射组织性质的空间分布)和多普勒(Doppler)信号处理(根据超声回波的连续波或脉冲多普勒处理以确定血液或流体参数)。将来，其它超声成象法也可得益于这些制剂，如计算机辅助的层面超声照相术(Ultrasound Computed Tomography，测量传输的衰减)或计算机辅助的层面衍射照相术(Diffraction Computed Tomography，测量角向反射的散射和衰减参数)。根据微气泡在水性载液中的悬浮液，这些可注射的制剂基本上可分为两类：一类水性悬浮液，其中微气泡被气/液界面约束，即被包括液体分子和被松弛地约束在气/液界面的表面活性剂的暂时的包膜所约束；另一类悬浮液，其中微气泡具有天然或合成聚合物形成的物质边界或有形包膜。在后一种情况下，微气泡被称为微气球。还有另一类超声造影剂：是聚合物或其它固体的多孔颗粒的悬浮液，它们携带在微粒的孔内截留的微气泡。这些造影剂在本文中被看作微气球类的变体。尽管物理学上不同，但这两类悬浮液中的微气泡均用作超声造影剂。这些不同制剂的更详细的情况可见EP-A-0 077 752(Schering),EP-A-0 123 235(Schering),EP-A-0 324 938(Widder et al.),EP-A-0 474 833(Schneider etal.),EP-A-0 458 745(Bichon et al.),US-A-4，900，540(Ryan),US-A-5,230,882(Unger),etc.
上述超声造影剂中有些已被开发并有市售，而其它的则处在临床试验的不同阶段。然而，不管是已有市售或正在临床试验中，这些产品都遇到与贮存有关联的问题。对于悬浮液来说，贮存问题是固有的，由于它们的特殊性质，这些悬浮液会发生相分离或离析、气泡聚集、气体扩散，在长期贮存后甚至还有各种添加剂的沉淀。微气泡或微气球的离析来自如下事实：悬浮液典型地由大小变化于约1μm至约50μm之间的未标准化(uncalibrated)微气泡构成。在已知的悬浮液中大量气泡大小在1μm和约10μm之间。由于微气泡大小的分布，这些悬浮液在贮存中经历着离析，其中较大的微气泡移至顶部，而较小的微气泡则浓集于较低部分，常导致完全的相分离。通过使用增稠剂解决此问题的尝试表明，离析率可降低但并未消除。
微气泡聚集是大气泡吸收小气泡从而增大体积的过程。随着相分离，此过程加速，微气泡平均大小在例如2-8μm之间的悬浮液一会儿可能演化为微气泡大小在例如5-12μm之间或更大的悬浮液。在涉及标准化微气泡的悬浮液和用于左心不透明化的悬浮液的情况下，这是特别不合需要的。大小的变化不仅改变了造影剂产生回波的性质，而且使制剂不能应用于某些用途，如基于微气泡通过肺的应用。大小超过10μm的微气泡未必能通过肺毛细血管，因此除增加危险性之外，这样的悬浮液也不大适合于左心成象。
气体悬浮液及其贮存的另一个问题出自气体扩散，它虽以较低速率出现，但随相分离而加速。气体从微气泡悬浮液中不可避免的逃逸因而进一步加重，且在极端情况下可导致介质中气体的完全排尽。因此，气体悬浮液的这些不同的破坏机制合并的效应导致制剂品质很快的降低。
在某些超声成象方法中，这些造影剂的一个合乎需要的方面是微气泡或含气体颗粒分布在严格的大小范围内。理由如下。这些制剂增强医用超声探测仪成象对比度的效果主要基于入射超声能量的散射大大增加，其次基于含这些制剂的组织的衰减性质得到改进。对比意味着测量灌注造影剂的区域与未接受造影剂的区域得到的相对信号幅度。增强意味着给予造影剂后观察到的对比值与给予前观察到的对比值有所增加。如前所述，最直接受益于这些制剂的成象仪的类型是回波描记仪这一类(B型或多普勒)。含该制剂的组织与不含该制剂的组织的不同衰减性也可用来改善成象方法的诊断价值。此外，制剂散射性和衰减性的超声频率依赖性也可用来进一步增加组织在空间的辨别力。在这些情况下，支配频率依赖性的物理定律严格依赖于微气泡或颗粒的大小。因此，所用的规律对来源于具有严格大小分布的微气泡或颗粒的回波起作用时，更为有效。作为例子，有一个这样的方法利用微气泡的非线性振动来检测基本激发频率的倍频回波频率成分。不含造影剂的组织并不显示与微气泡同样的非线性特性，因此这种方法能明显地增强含造影剂和不含造影剂的区域之间的对比度。当微气泡或颗粒大小分布狭窄时，对于每单位体积一定量的颗粒计数而言，这种增强就更为明显。但是，制备具有这样窄的大小分布的产品是费时的；假如能便利地供应这些标准化的悬浮液就会大大促进这一技术的进一步发展和使用。因此，可靠地、大小分布不变地贮存这些制剂也是受到很大关注的。
在贮存含磷脂作为微气泡稳定剂的气体水悬浮液的超声造影剂时遇到了另一些困难。在贮存中，由于磷脂的水解，稳定剂(表面活性剂)的浓度不断减小，引起微气泡含量减少，悬浮液产生回波的性能降低。因此，迄今含微气泡的悬浮液的超声造影剂的贮存问题仍有待解决。
在食品工业中，通过冷冻将气体水悬浮液冷藏已被人们知道相当一个时期了。例如，US-A-4,347,707(General Foods Corp.)公开了气体含量高、贮存稳定性好的充气冰的贮存法，在该方法中，充气冰的制备是通过将含水液体与会生成水合物的气体在加压和一定的温度下接触，此压力和温度能使悬浮在该液体中的气体水合物复合物得以形成，然后有控制地降低温度和压力，产生例如具有85-110ml CO2/g的充了碳酸气的冰。按照该文献，充气冰的气体含量高，在长时间内具有贮存稳定性，适于以冷冻状态商业销售，放在水中时，则产生强烈泡沫。
结果产生这样的情况，即为了贮存较长时间而将气体悬浮液冷冻，但需要时重新使用贮存的悬浮液，却不适合作为超声造影剂，因为解冻时悬浮的气体有从载体介质中逃逸的倾向。微气泡的冷冻气体悬浮液还有一个困难，在于冷冻时载体介质的膨胀会产生内力直接破坏或压破微气泡的包膜，在贮存中或以后在悬浮液解冻时释出所截留的气体，使其逃逸。这一问题对于具有实质性或有形包膜的微气泡悬浮液来说尤为严重。
发明的概述
简单地概括起来，本发明涉及固定在冷冻的含水载体介质中的气泡的冷冻悬浮液，其中含气泡和常用的添加剂的载体介质是生理上可接受的载体。被固定的气泡是以暂时的包膜或有形的膜为界的微气泡，悬浮液在液体状态时可注射于机体，用作人和动物患者血池和组织超声成象的造影剂。
按照本发明，冷冻的悬浮液的温度为-1℃至-196℃之间，以-10℃和-76℃之间为较佳，而微气泡的大小为50μm以下，以10μm以下为较佳。特别有用的微气泡大小在2μm和9μm之间的悬浮液，而微气泡大小在3μm和5μm之间的悬浮液更为有用。
鉴于在含由合成或天然聚合物或蛋白质形成的膜的有形包膜的气体微气球或微气泡的悬浮液和含具有瞬时的包膜的气体微气泡的悬浮液之间存在着生物降解性的差异，特别在使用单分子或多分子膜层形式的层状磷酯时，后者的冷冻悬浮液更为有利。
本发明还涉及贮存微气泡悬浮液的方法，其中，悬浮液放进冷却装置中，通过将温度冷却到悬浮液的凝固点之下，较佳为-1℃至-196℃之间的温度，更佳为-10℃至-76℃，将微气泡固定在载体介质中，并长时间维持冷冻条件。可任选地将冷冻的悬浮液保持在一种惰性气体或气体混合物的气氛中，其中至少一种气体是包封在微气泡中的气体。该气体较好的是选自含卤气体、空气、氧气、氮气、二氧化碳或它们的混合物。
本发明还揭示了本发明的可注射悬浮液在器官和组织超声回波成象上的应用及超声造影剂的制造。
附图的简要说明
图1是解冻后的SF6和含5％C5F12的空气的微气泡在含水载体介质中的悬浮液中气泡浓度(计数)的变化作为贮存温度的函数所作的图。
图2是解冻后的SF6和含5％C5F12的空气的微气泡在含水载体介质中的悬浮液中气体总体积的变化作为贮存温度的函数所作的图。
图3是解冻后的微气泡悬浮液的吸光度变化作为所加的外压和贮存温度的函数所作的图。
图4是相对吸光度变化作为对于不同温度贮存后解冻的悬浮液施加的外压的函数的曲线图。
图5是平均大小为3μm、4μm和6μm的标准化微气泡的微气泡大小的数量分布(图5A)和气体体积分布(图5B)的曲线图。
图6是一个非标准化微气泡样品的微气泡大小的数量分布(图6A)和气体体积分布(图6B)的曲线图。
发明的详述
按照本发明，提供一种气体微气泡的冷冻悬浮液，其中微气泡被固定在冷冻的含水载体介质中，该介质除了含微气泡之外还包括通常的添加剂。含水载体是生理学上可接受的，悬浮液在液体状态时可注射于机体中，用作人和动物患者血池或组织成象的超声造影剂。以瞬时的包膜或有形的膜束缚的固定的微气泡被截留在冷冻的载体介质的分子之间，载体介质的温度在-1℃和-196℃之间，以-10℃和-76℃之间为较佳。所用的确切温度范围取决于微气泡中气体的选择，也取决于所用添加剂的种类和数量。因此，例如在空气或氮气的情况下，温度可为-1℃和-196℃之间任一点，而在C4F8的情况下，温度可为-1℃和-5℃之间。当用聚氧丙烯/聚氧乙烯共聚物或聚乙二醇作为添加剂时，根据在悬浮液中的总量，最高可接受的温度可为-5℃或甚至-10℃而不是-1℃。
悬浮液中大多数微气泡的大小典型地是低于50μm，但对于可静脉注射的造影剂来说，微气泡大小以低于10μm为佳。
对于大多数应用，微气泡大小分布在2μm和9μm之间的悬浮液即可满足要求，但当处理标准化微气泡的悬浮液时，大小可在该范围中的任一点，例如，在2-4μm、3-5μm、4-6μm、5-7μm、6-8μm、7-9μm，而以大小范围在3μm和5μm之间的微气泡为佳。
因此，本发明还提供大小分布很窄的微气泡的悬浮液。标准化微气泡悬浮液的典型的微气泡大小分布如图5所示，其中图5A是微泡数目分布(用Coulter计数器测出)，图5B是微气泡体积分布(用Coulter计数器测出)。与含标准化微气泡的悬浮液相反，含非标准化气泡的悬浮液，其数目和体积的大小分布典型地与图6A和6B所示形式相似。从这些图容易理解，标准化微气泡制成的回波探测响应悬浮液将更为均匀，与非标准化微气泡的悬浮液相比提供较少发散因而轮廓更为鲜明的图象。正如早已提及的那样，这些标准化的悬浮液是非常令人满意的。但它们的使用至今很有限。这些令人满意的悬浮液目前可通过冷冻悬浮液的简单转化而方便地得到，冷冻悬浮液可在低温下长时间贮存而不使它们原来的产生回波的性质过分丧失。
本发明的另一个优点出自如下事实，即为了产生两倍于基本频率的回波信号成分，倍频成象需要造影剂具有非线性振动。这样的特性要求组织某一深度的超声激发水平超过一定的声波阈值。在非线性振动时，发生频率的转变，使声能从基本激发频率转变成倍频。在这类成象中，传递给微气泡的相当数量的能量要求微气泡有足够的抗性以在这些条件下能存在。本发明提供一个容易和方便的途径以得到具有对压力变化抗性良好的微气泡的悬浮液。因为它们现在能提前制备，贮存，并在需要时加以使用。
如所述的那样，除微气泡之外，本发明的冷冻悬浮液还含添加剂，它们包括各种表面活性剂、增稠剂、稳定剂等。可包括成膜和非成膜的表面活性剂的表面活性剂有层状或片状磷脂，它们已知可稳定微气泡的瞬时的气/液包膜。层状磷脂可以是单分子或多分子膜层的形式或可以是脂质体。
根据微气泡的类型，即具有暂时的包膜还是具有有形的膜，载体介质可包括作为添加剂的水合剂和/或亲水性稳定剂化合物，如聚乙二醇，碳水化合物如半乳糖、乳糖或蔗糖、葡聚糖、淀粉和其它多糖，或其它常规的添加剂，如聚氧丙二醇、聚氧乙二醇及其共聚物；脂肪醇和聚氧二醇的醚；脂肪酸和聚氧烷基化脱水山梨醇的酯；皂类；甘油-聚亚烷基硬脂酸酯；甘油-聚氧乙烯蓖麻醇酸酯；聚二醇的均聚物和共聚物；聚乙氧基化豆油和蓖麻油，以及氢化衍生物；蔗糖或其它碳水化合物与脂肪酸、脂肪醇的醚和酯，它们可任意地聚氧烷基化；饱和或不饱和脂肪酸的甘油一酯、二酯和三酯，也可用豆油的甘油酯和蔗糖。表面活性剂可以是成膜的和不成膜的，可包括亚油酰卵磷脂型可聚合的两亲化合物或聚乙二醇十二烷酸酯。表面活性剂以成膜的为佳，更佳的是选自磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂、鞘磷脂及其混合物的磷脂类。除了所述的成膜的表面活性剂之外，悬浮液还可包括最高达50％(重量)的非层状的表面活性剂，它们选自脂肪酸，脂肪酸和醇与多元醇的酯和醚，此多元醇如聚亚烷基二醇类、聚亚烷基化糖和其它碳水化合物，及聚亚烷基化甘油。特别合适的物质包括磷酸双十六烷酯、胆甾醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、棓酸丙酯、棕榈酸抗坏血酸酯和丁基化羟基甲苯。
可以理解，本发明不仅仅限于有暂时的包膜的微气泡的悬浮液。任何充满气体的合适颗粒，如多孔颗粒，脂质体，或具有磷脂、合成或天然聚合物或蛋白质形成的包膜的微气球，都可被方便地使用。已经确认，白蛋白制成的微气球，或脂质体囊可被成功地长期贮存于冷冻状态。解冻的含这些微气球的悬浮液已证明具有微气泡丢失相当少的满意的产生回波的性质。用山梨醇或诸如聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(市售品称作Pluronic_)的非离子型表面活性剂稳定的微气泡的悬浮液已证明在贮存后有同样好的成象能力。
本发明的悬浮液所用的添加剂还可包括选自线性或交联多糖和寡糖、糖、亲水性聚合物和磺化的化合物的增稠剂和/或稳定剂。在这种情况下，这些增稠剂和/或稳定剂与所含的表面活性剂的重量比在约1∶5至100∶1之间。
按本发明的用不同气体或气体混合物制成的悬浮液通常含微气泡107-108个/ml、108-109个/ml或109-1010个/ml。在长期贮存即几个月之后，这些浓度实际上保持相同，如果悬浮液用SF6、C3F8或其混合物，或用空气与SF6或C5F12的混合物制成，则甚至在反复进行冻融循环之后也不改变。
悬浮液中的微气泡具有有形的膜时，该膜由合成的或天然的聚合物或蛋白质制成。构成可注射的微气球的包膜或界膜的聚合物可选自大多数亲水性，可生物降解的、生理学上相容的聚合物。在这些聚合物中可列举低水溶性多糖、聚交酯和聚乙交酯及其共聚物、丙交酯和内酯的共聚物(如ε-己内酯、_-戊内酯)和多肽。选择合成聚合物时其多样性是有益的，因为对于变态反应患者，可能希望避免使用天然蛋白质(白蛋白、明胶)制成的微气球。其它合适的聚合物包括聚原酸酯、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚(DL)-丙交酯-共-_-己内酯)、聚(DL-丙交酯-共-_-戊内酯)、聚(DL-丙交酯-共-g-丁内酯)、聚氰基丙烯酸烷基酯；聚酰胺类，聚羟基丁酸；聚二噁烷酮；聚-β-氨基酮类，聚磷腈(polyphosphazenes)和聚酐类。还可使用聚氨基酸，如聚谷氨酸和聚天冬氨酸，以及它们的衍生物，即和低级醇类或二醇类的偏酯。这样的聚合物一个有用的例子是聚(谷氨酸叔丁酯)。
当膜由蛋白质类材料制成时，该蛋白质为白蛋白。
虽然可与合适的表面活性剂和稳定剂一起，可单独使用含卤气体、空气、氧气、氮气或二氧化碳，但近来也有人提出使用含卤气体与空气、氧气、氮气和二氧化碳的混合物。含卤气体是选自以下化合物的气体，它们是六氟化硫、四氟甲烷、氯三氟甲烷、二氯二氟甲烷、溴三氟甲烷、溴氯二氟甲烷、二溴二氟甲烷、二氯四氟乙烷、氯五氟乙烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁二烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷或它们的混合物，较佳的为六氟化硫、四氟甲烷、六氟乙烷、六氟丙烯、八氟丙烷、六氟丁二烯、八氟-2-丁烯、八氟环丁烷、十氟丁烷、全氟环戊烷、十二氟戊烷。
本发明还涉及贮存微气泡悬浮液的方法，其中，悬浮液放在冷却装置如冰箱中，通过将温度冷却到悬浮液的凝固点以下使微气泡固定在载体介质中，温度以-1℃和-196℃之间为佳，更佳为-10℃和-76℃之间，将这些冷冻条件长期维持。冷冻的悬浮液可任选地保持在惰性气体或气体混合物的气氛中，该气体混合物中至少一种是被封入微气泡中的气体。该气体较宜选自含卤气体、空气、氧气、氮气、二氧化碳或它们的混合物。
现已确认，用于本发明的冷冻悬浮液的气体或气体混合物应具有-18℃以下的沸点。这意味着用诸如C4F8和C5F10之类卤化的气体单独制成的悬浮液贮存稳定性会很差，在冷冻后实际上会失去它们的产生回波的全部性质。这是特别令人吃惊的，因为所有其它卤化的气体会产生很稳定的冷冻悬浮液，它们经几次冻/融循环仍然不明显失去产生回波的特性。甚至将这些气体掺杂少量其它的卤化气体或甚至在室温下是液体的卤化物如C5F12的蒸气，产生的混合物也不能冷冻贮存。另一方面，将空气与一定量的这些气体混合，产生的混合物有很好的贮存稳定性，在几次冻/融循环之后仍有很好的产生回波的性质。
如上所述，本发明的可注射的悬浮液在液体状态时作为器官和组织超声成象的造影剂是有用的。显然，在使用前将悬浮液解冻，并任意地在室温下保持一段时间，然后施用于患者。然后将患者用超声探头描扫，产生描扫区域的图象。
在本发明的范围内，还有从本发明的冷冻的可注射的悬浮液制备超声回波描记造影剂的方法。关于制备，意思是将标准化或未标准化的微气泡的浓悬浮液(例如1010-1011个微气泡/ml或更多)在冷冻状态贮存一段时间，需要时将解冻的悬浮液任意加入相同或不同的生理上可接受的液体载体，稀释成所需的浓度。还设想此时可加入另外的添加剂或调节剂。
本发明以如下实施例作进一步阐述。
                           实施例1
在一圆底玻璃容器中，将得自Avanti Polar Lipids(USA)的58mg二花生酰磷酯酰胆碱(DAPC)和2.4mg二棕榈酰磷脂酸(DPPA)及得自Siegfried公司的3.94g聚乙二醇(PEG4000)于60℃温度下溶于叔丁醇(20ml)。将此澄清的溶液迅速冷却至-45℃并冻干。将所得的白色饼状物的数份样品(25mg)放在10ml玻璃小瓶中，用橡皮塞塞住这些小瓶，抽成真空，充填选择的气体或气体混合物(见表1)。然后通过橡皮塞注入盐水(0.9％NaCl)(每瓶5ml)，剧烈振摇，使冻干物溶解。
将微气泡悬浮液放在冷藏室(-18℃)中。三天后，将它们在室温(23℃)下融化，分析气泡浓度(用Coulter Multisizer)和1/50稀释液在700nm处的吸光度。700nm处的吸光度是气泡悬浮液总浊度的度量。
                            表1
气体或气体混合物     沸点(℃) 水溶性* 吸光度(初始时的％) 回收的气泡(％)
    空气     -195     0.0167     33     14
    SF6     -63.8     0.005     57     23
    C3F8     -36.7     ＜＜0.005     59     54
    C4F8     -6     0.016     11     8
    C4F10     -1.7     ＜0.005     7     4
空气(+5％C5F12)     -195     0.0167     71     49
空气(+1 0％C5F12) -195 0.0167 55 34
空气(+10％C4F8)     -195     0.0167     50     30
空气(+10％C4F10)     -195     0.016     52     32
 SF6(+5％C5F12)     -63.8     0.005     62     41
 C3F8(+5％C5F12)     -36.7     ＜＜0.005     84     71
 C4F8(+5％C5F12)     -6     0.016     7     6
 C4F10(+5％C5F12)     -1.7     ＜0.005     1     1
氙(+5％C5F12)     -108.1     0.108     38     17
*表示为Bunscn系数
表1所给的结果表明，对冷冻的稳定性取决于气体的沸点和气体的水溶性。在气体沸点高于-18℃的情况下，回收的气泡较小。对于沸点低于-18℃的气体来说，在水中的溶解度越低，气泡的回收率越高。也非常有趣地注意到，加入少量高分子量、低水溶性的气体，如十二氟戊烷(C5F12)，能改善融化后低沸点气体的气泡回收率，而对沸点高于-18℃的气体则无作用。最后，充满C4F8和C4F10(单独，或与少量十二氟戊烷的混合物)的微气泡对冻/融的稳定性很差。然而，当这些气体与空气合用时，含这些混合物的微气泡的悬浮液显示出比含空气的微气泡的悬浮液更好的结果，表现在产生回波的能力或微气泡的丢失上。
                             实施例2
将如实施例1所述制得的SF6微气泡悬浮液缓缓(约30分钟)冷冻至-18℃或迅速(在1分钟内)冷冻至-45℃。将其它SF6微气泡悬浮液先保存在室温下直至所有气泡升至表面再冷冻。其它悬浮液在气泡均匀地分布在溶液中时冷冻。冷冻的悬浮液贮存于-18℃和-45℃一个月，然后解冻。
                           表2
    试验   气泡浓度(初始时的％)  气泡体积(初始时的％)
    缓慢冷冻(-18℃)     16     39
    迅速冷冻(-45℃)     24     51
    滗析的(-18℃)     14     34
    均匀的(-18℃)     24     61
表2结果表明，冷冻速度对最终结果影响较小。均匀的悬浮液比经滗析的微气泡的悬浮液回收率好。
                            实施例3
在氯仿-甲醇(2/1)中溶解4.5g氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC，得自Nat-termann公司)和0.5g磷酸双十六烷基酯(Fluka，Switzerland)，然后在圆底烧瓶中用旋转蒸发器将溶剂蒸发至干，制成多层脂质体(MLV8)。将留下的脂质膜在真空干燥器中干燥。加入100ml蒸馏水后，将悬浮液于70℃搅拌保温30分钟。加入蒸馏水将脂质体悬浮液调整到脂质的终浓度为25mg/ml。
将脂质体悬浮液的一份样品(100ml)加到装有高速机械乳化器(Polytron)的气密玻璃反应器中。反应器中的气相为含5％C5F12的空气(用密度测定法测定)。在均化(10,000rpm,1分钟)后，将所得乳状悬浮液引入滗析漏斗。6小时后，在溶液顶部可见白色气泡层。除去下层(含脂质体的)水相，加入少量新鲜水，将微气泡层再均化。重复此过程(滗析)，制得具有不同大小微气泡的4种样品(见WO94/09829)。将样品冷冻至-18℃,24小时后融化至室温。
                     表3
初始直径Dn(μm)   冻/融后直径Dn     气泡浓度(初始时的％)   吸光度700nm(初始时的％)
  2.5     2.5     19     20
  4.6     4.5     60     68
  6.0     6.2     86     100
  7.6     8.1     76     91
从所得结果(表3)看来，冻/融处理并不影响微气泡的平均直径。从实验中显示出，直径较大(＞2.5μm)的微气泡对冻/融处理的耐受性比直径较小的微气泡好。还观察到，在某些情况下，解冻速率可影响存在于样品中的微气泡的终浓度。确切的关系尚不清楚，但有亦象表明，微气泡的丢失与解冻速率成反比。初步结果表明，关于悬浮液中的微气泡浓度(计数)和气体总体积，加速解冻(例如在25℃水浴中进行解冻)比样品放在5℃或20℃逐渐解冻所得到的结果要好。气体体积的最大丢失见于5℃解冻的样品。
                           实施例4
用表面活性剂的混合物代替MLV8，重复实施例3所述实验。表面活性剂混合物是这样得到的：将1g二棕榈酰磷酯酰甘油(DPPG Na，得自Avanti PolarLipids,USA)和3g Pluronic_F68(分子量为8400的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物)溶解在蒸馏水(80ml)中。在约70℃加热后，得到澄清的溶液。将此溶液室温冷却，用甘油将体积补至100ml。将此表面活性剂溶液引入装有Polytron乳化器的气密反应器中。均化(10,000rpm,1分钟)后，得到顶部有一层泡沫的乳状悬浮液。弃去泡沫，回收含109个微气泡/ml的下层水相。将其放置几小时，然后收集白色微气泡层。将收集到的微气泡在蒸馏水中再均化，再次滗析，并如前所述进行冻/融。比较冷冻前后气泡的特性，未观察到气泡总浓度(冷冻前1.3×108个气泡/ml，冷冻后1.25×108个气泡/ml)或平均直径Dn(冷冻前4.0μm，冷冻后3.9μm)有显著变化。
                            实施例5
如实施例1所述制备SF6气泡，并如实施例3所述进行滗析。在除去下层水相时，在漏斗中导入等体积SF6气体。将气泡层再悬浮于蒸馏水、0.9％NaCl、3％甘油水溶液和100mg/ml海藻糖溶液。在冻-融处理前、后测定气泡浓度和700nm处的吸光度(稀释后测)。
表4的结果显示不管悬浮介质是什么，气泡回收率都很好。重要的是注意到此处微气泡回收率为66-96％之间，看来可能与前面表1、2报告的结果相矛盾。但是，在此例中，首先，微气泡是标准化的，即比未标准化的更为稳定，其次，此例所用的微气泡的大小在4μm以上。
                    表4
    悬浮介质 吸光度700nm(初始时的％)   气泡浓度(初始时的％)
    蒸馏水     69     66
    0.9％NaCl     86     92
    3％甘油     92     96
 100mg/ml海藻糖     89     73
                           实施例6
如实施例5所述，得到滗析过的SF6微气泡。以不同的气泡浓度将微气泡层悬浮在0.9％NaCl中，然后于-18℃冷冻，贮存约4个月，于室温下融化。
                             表5
气泡浓度(×108/ml) 气泡体积(μm/ml) 气泡直径(μm)
自然状态 冻/融 自然状态 冻/融 自然状态 冻/融
1.9 1.9(1.9)* 6.8 6.0(5.5)* 3.1 3.0(2.9)*
3.9 3.7(3.3) 14.7 11.5(9.4) 3.1 2.8(2.6)
5.9 5.7(5.4) 22.6 20.4(18.6) 3.1 3.0(3.0)
7.7 7.6(6.1) 28.3 24.6(17.0) 3.0 2.9(2.7)
*括号中是第二次冻/融处理后得到的结果
表5中收集的结果表明，气泡浓度对于对冻/融的耐受能力并无明显作用。甚至于贮存后进行的第二次冻/融处理也不影响终浓度，表明甚至在贮存后这些悬浮液对反复冻融循环仍具耐受力，气泡计数并无很大的丢失，对样品产生回波的性质也无损害。
                           实施例7
用EP-A-0 324 928(Widder)所述的方法制备声波均化的白蛋白微球。简言之，将5ml灭菌的5％人白蛋白溶液(得自the Blood Transfusion Service ofthe Swiss Red Cross，Bern Switzerland)吸入10ml经校准的注射器中。将声波发生仪探头(250型，购自Branson Ultrasonic Corp.USA)浸到4ml刻度处的溶液中。在能量调到7档时进行30秒钟声波均化。然后将声波发生仪探头升高到6ml刻度(即在液面之上)，以脉冲方式(0.3秒/周期)进行40秒钟声波均化。除去泡沫层后，得到每毫升含1.5×108个气泡、数均直径为3.6μm的白蛋白微球的悬浮液。将此悬浮液于-18℃冷冻并在此温度下放置过夜。次日将悬浮液于室温下融化。冻/融前后分析悬浮液，表明具有如下特性：
                        表6
  样品(含空气)    吸光度700nm  气泡浓度(×108/ml)    直径Dn(μm)
自然状态     0.25     1.4     3.6
冻/融后     0.13     0.4     6.3
表6结果表明，含空气的微气泡受冻融循环一定程度的破坏。用含约5％(体积)C5F12或C3F8的空气的混合物代替纯空气制备白蛋白微气泡时，微球抗冻/融引起气泡计数下降的稳定性显著改善(见表7)。用白蛋白微球得到的结果，也可以看到在空气微气泡的场合，冻/融循环对于微气泡群大小较小时是不利的，即平均大小约为5μm或更大的微气泡比较小的微气泡有较大的耐受能力和保存机会。
                          表7
    样品(空气+5％C5F12)     吸光度700nm  气泡浓度(×108/ml)    直径Dn(μm)
    自然状态     0.64     2.4     3.7
    冻/融后     0.39     1.1     4.3
                           实施例8
按制造商所推荐的那样，将3g市售的回声造影剂糖类微粒SHU-454(E-chovist_,Schering,Germany)在半乳糖溶液(8.5ml,200mg/ml)中再生并作冻/融处理，在融化后溶液中仅存在极少气泡。若在加入糖类微粒之前在半乳糖溶液中加入10mg/ml二棕榈酰磷脂酰甘油和Pluronic_F68(1∶5，W∶W)的混合物，则可得到浓度为2.5×108个气泡/ml的稳定微气泡。冷冻和融化后，气泡浓度约降低3个数量级，至2.3×105个/ml，表明在处理过程中微气泡丢失相当可观。但是，如果在再生前用含10％C5F12的空气混合物代替气相中的空气，气泡便更稳定，也更能耐受冻/融处理。在后一种情况下，微气泡的丢失仅2.3×108个，因为气泡浓度从3.9×108个/ml降至1.6×108个/ml。
                            实施例9
用EP-A-0 458 745(Bracco International)实施例4中描述的技术制备聚合物微气球。在此制备中所用的聚合物是US 4,888,398中描述的聚POMEG。将微气球以1.8×108颗粒/ml的浓度悬浮于蒸馏水、0.9％NaCl、5％右旋糖和3％甘油中。然后将这些悬浮液的每一种均冷冻，然后融化。融化后无论在总的颗粒浓度上还是平均粒径上均未观察到可检测的变化。
                            实施例10
在200ml圆底烧瓶中，将126mg数量的卵磷脂和27mg胆甾醇溶于9ml乙醚中。向此溶液中加入含离子载体A23187的0.2摩尔浓度的碳酸氢钠水溶液3ml，并将得到的两相系统进行声波均化直至变成均匀系统。将混合物在旋转蒸发器中蒸发至于，在含脂质沉积物的烧瓶中加入0.2摩尔浓度的碳酸氢盐水溶液3ml。
静置片刻后，将所得脂质体悬浮液对盐水透析以消除未截留的碳酸氢盐并酸化。过一会儿，用蒸馏水洗涤，然后通过阶式碳酸盐滤器数次。然后将大小低于50μm的脂质体悬浮液样品一分于-18℃冷冻，并贮存于此温度下。2周后将悬浮液于室温融化。冻/融前后分析悬浮液，显示产生回波的性质和微气泡计数仅有可接受的轻度降低。
                            实施例11
用SF6和含5％C5F12的空气作为气相，重复实施例3的方法，所得悬浮液样品于-18℃、-45℃、-76℃和-196℃冷冻。在相应的冷冻温度下贮存30天后，将样品解冻，分析悬浮液。所得结果见表8。SF6样品中微气泡的浓度在冷冻前为11.6×107个/ml，而空气/5％C5F12混合物的样品中为9.8×107个/ml，贮存前样品中各自的气体体积为2.9μl/ml和5.9μl/ml。两种气体的平均微气泡直径分别为2.3μm和4.2μm。
从结果显示，贮存的温度越低，解冻时微气泡浓度和回收的气体总量丢失得越多。结果还表明，含有SF6的悬浮液的解冻样品，其平均直径起初增加，然后当温度降低时明显减小。对于空气/5％C5F12混合物而言，微气泡直径的变化相当小。结果还表明，微气泡平均直径随贮存温度的降低而降低。如图1所示，对于含有SF6和空气/C5F12混合物的悬浮液，在-196℃贮存后只回收到初始微气泡量的51.7％和52％。然而，如图2所示，贮存后SF6悬浮液回收的气体总体积为初始时的21.1％，而空气/C5F12混合物悬浮液回收的体积为46.5％。这表明，在用SF6制成悬浮液的情况下，微气泡的大小发生变化，即回收的微气泡直径减小。
                           表8
气体  回收的气体体积μm/ml 融化后直径Dn  回收的气泡浓度×107 温度℃ 气体混合物空气+5％C5F12  回收的气体体积μm/ml 融化后直径Dn  回收的气泡浓度×107
 SF6     2.3     2.4     10.0 -18 空气/C5F12     5.5     4.6     7.7
 SF6     2.8     2.6     7.9 -45 空气/C5F12     4.2     4.5     6.2
 SF6     1.8     2.5     6.7 -70 空气/C5F12     3.9     4.4     5.6
 SF6     0.6     2.0     6.0 -196 空气/C5F12     2.7     4.0     5.1
图3和4表明冷冻或贮存温度对含空气+5％C5F12混合物的微气泡悬浮液的压力变化耐受性的影响。在图3的曲线中，吸光度(于700μm处测定)表示为在不同温度下贮存3天后施加到悬浮液上的压力的函数。此曲线图显示贮存温度的降低对悬浮液的性质有影响，贮存于-18℃和-76℃之间的温度下的悬浮液的性质改变明显，而贮存于-76℃和-196℃之间的样品的改变相当小。因此，维持贮存温度于-76℃以下看来不会提供更大的优点。鉴于所涉及的费用，选择-76℃以下的温度仅仅在特殊的情况下可被证明是有道理的。
图4另一方面还显示，如果将含空气/5％C5F12混合物的微气泡的悬浮液在低温下贮存3天，它们对压力变化的耐受性保持相对不变，而在25℃时保存同样时间的同样的悬浮液，其对压力变化的初始耐受性约降低10％。
临界压力和吸光度测量的确切方法和重要性已在本文引为参考的EP-A-0 554 213中加以阐述。
                           实施例12
用ACUSON 128XP 5型仪(Acuson Corp.USA)和实施例1、3和7的制品在实验小猪外周静脉注射0.04ml/kg体重后进行二维回波心动描记。评估自然状态及冻/融样品使用后对左心室回波对比度的增强作用。甚至在诸如实施例7关于白蛋白微球所述样品的情况下也未见明显差异，表明残留的气泡足以产生强的和长时间的回波增强作用。

Claims (29)

1．固定在-1℃至-196℃冷冻含水载体介质中的气泡的冷冻悬浮体，所述载体介质含气泡和常用的添加剂、是生理学上可接受的载体，其特征在于：被固定的气泡含沸点在-18℃以下的气体或气体混合物，是以瞬时的气体/液体包膜或10μm以下有形的合成或天然聚合物膜为界的微气泡，悬浮体在液体状态时可注射，用作机体血池和组织超声成象的造影剂。
2．如权利要求1所述的悬浮体，其中冷冻介质的温度在-10℃和-76℃之间。
3．如权利要求1所述的悬浮体，其中大多数微气泡的大小在50μm以下。
4．如权利要求3所述的悬浮体，其中微气泡的大小在10μm以下。
5．如权利要求4所述的悬浮体，其中微气泡的大小在2μm和9μm之间。
6．如权利要求5所述的悬浮体，其中微气泡的大小在3μm和5μm之间。
7．如权利要求1所述的悬浮体，其中添加剂包括单分子或多分子膜层形式的层状磷脂作为表面活性剂。
8．如权利要求7所述的悬浮体，其中层状磷脂是单层或多层脂质体的形式。
9．如权利要求7所述的悬浮体，其中层状磷脂是饱和的磷脂。
10．如权利要求7所述的悬浮体，其中磷脂选自磷脂酸、磷酯酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、心磷脂和鞘磷脂，或它们的混合物。
11．如权利要求1所述的悬浮体，其中添加剂包括选自磷酸双十六烷酯、胆甾醇、麦角甾醇、植物甾醇、谷甾醇、羊毛甾醇、生育酚、棓酸丙酯、棕榈酸抗坏血酸酯和丁基化羟基甲苯的物质。
12．如权利要求1所述的悬浮体，其中添加剂包括山梨醇或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物的非离子型表面活性剂。
13．如权利要求1所述的悬浮体，其中添加剂包括选自线性和交联多糖和寡糖、糖、亲水性聚合物和碘化的化合物的增稠剂和/或稳定剂，这些增稠剂和/或稳定剂与所含表面活性剂的重量比在1∶5和100∶1之间。
14．如权利要求1所述的悬浮体，其中添加剂还包含≤50％(重量)的选自脂肪酸、脂肪酸和醇与多元醇的酯和醚的非层状表面活性剂。
15．如权利要求14所述的悬浮体，其中多元醇是聚亚烷基二醇类、聚亚烷基化糖和其它碳水化合物，及聚亚烷基化甘油。
16．如权利要求1所述的悬浮体，它们包含107-108个微气泡/ml、l08-109个微气泡/ml或109-1010个微气泡/ml。
17．如权利要求1所述的悬浮体，其中膜由合成的或天然的聚合物或蛋白质组成。
18．如权利要求17所述的悬浮体，其中聚合物选自多糖、聚氨基酸及其酯、聚丙交酯和聚乙交酯及其共聚物、丙交酯和内酯的共聚物、多肽、聚原酸酯、聚二噁烷酮、聚-β-氨基酮类、聚磷腈、聚酐类、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚烯烃类、聚丙烯酸酯类、聚丙烯腈、不可水解的聚酯类、聚氨酯类和聚脲类、聚谷氨酸或聚天冬氨酸衍生物及它们与其它氨基酸的共聚物。
19．如权利要求17所述的悬浮体，其中蛋白质为白蛋白。
20．如权利要求1所述的悬浮体，其中气体选自含卤气体、空气、氧气、氮气、二氧化碳或它们的混合物。
21．如权利要求20所述的悬浮体，其中含卤气体选自SF6、CF4、C2F6、C2F8、C3F6、C3F8、C4F6、C5F10、C5F12和它们的混合物。
22．如权利要求20所述的悬浮体，其中气体选自C4F8、C4F10与空气的混合物。
23．贮存按权利要求1-22所述微气泡悬浮体的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)将悬浮液放进冷却装置中，
b)通过将温度冷却到悬浮液的凝固点之下，将微气泡固定，
c)维持冷冻条件。
24．如权利要求23所述的方法，其中步骤b)的温度为-1℃至-196℃之间。
25．如权利要求24所述的方法，其中步骤b)的温度为-10℃至-76℃之间。
26．如权利要求23所述的方法，其中冷冻的悬浮体保持在惰性气体或气体混合物的气氛中，而其中至少一种气体是封在微气泡中的气体。
27．如权利要求23所述的方法，其中微气泡含气体或气体混合物，其中至少一种气体的沸点在-18℃以下。
28．如权利要求23所述的方法，其中，悬浮体在使用前解冻并保持于室温下。
29．如权利要求1-22之一所述的可注射悬浮体在制造超声回波描记造影剂上的应用。
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